JPH0767660A - アメリカヤマゴボウの抗ウィルス性タンパク質を発現す る微生物 - Google Patents
アメリカヤマゴボウの抗ウィルス性タンパク質を発現す る微生物Info
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- JPH0767660A JPH0767660A JP5337947A JP33794793A JPH0767660A JP H0767660 A JPH0767660 A JP H0767660A JP 5337947 A JP5337947 A JP 5337947A JP 33794793 A JP33794793 A JP 33794793A JP H0767660 A JPH0767660 A JP H0767660A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は、アメリカヤマゴボウの抗ウィルス
性タンパク質（ＰＡＰ：Phytolacca antiviral protei
n）遺伝子を含み、微生物においてＰＡＰを発現させる
ことができる組換え発現ベクター、該組換え発現ベクタ
ーで形質転換された微生物、および、前記の組換え発現
ベクターで形質転換された微生物を培養することによっ
てＰＡＰを製造する方法に関する。 【効果】 本発明の組換え発現ベクターを利用して、Ｐ
ＡＰを発現できる形質転換微生物を製造することがで
き、この微生物を用いてＰＡＰをより大量により容易に
生産することができる。このＰＡＰは、ＡＩＤＳなどの
治療に使用される免疫結合体などの製造に使用すること
ができる。
性タンパク質（ＰＡＰ：Phytolacca antiviral protei
n）遺伝子を含み、微生物においてＰＡＰを発現させる
ことができる組換え発現ベクター、該組換え発現ベクタ
ーで形質転換された微生物、および、前記の組換え発現
ベクターで形質転換された微生物を培養することによっ
てＰＡＰを製造する方法に関する。 【効果】 本発明の組換え発現ベクターを利用して、Ｐ
ＡＰを発現できる形質転換微生物を製造することがで
き、この微生物を用いてＰＡＰをより大量により容易に
生産することができる。このＰＡＰは、ＡＩＤＳなどの
治療に使用される免疫結合体などの製造に使用すること
ができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗ウィルス性タンパク
質の発現ベクター及びこれにより形質転換された微生物
に関する。より具体的に説明すれば、本発明はアメリカ
ヤマゴボウ（Phytolacca americana L. ) から発現され
る抗ウィルス性タンパク質（Phytolacca americana ant
iviral protein、以下、「ＰＡＰ」と記す）をコードす
る遺伝子を含む組換え発現ベクター及びこれによって形
質転換された微生物に関するものである。
質の発現ベクター及びこれにより形質転換された微生物
に関する。より具体的に説明すれば、本発明はアメリカ
ヤマゴボウ（Phytolacca americana L. ) から発現され
る抗ウィルス性タンパク質（Phytolacca americana ant
iviral protein、以下、「ＰＡＰ」と記す）をコードす
る遺伝子を含む組換え発現ベクター及びこれによって形
質転換された微生物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】数多くの種々の植物種に由来する抗ウィ
ルス性タンパク質に関する研究は、アメリカヤマゴボウ
の粗抽出物から単離されたＰＡＰの発見に端を発した
［参照：Irvin, J.D., Arch. Biochem. Biophys., 169:
522-528(1975)］。ＰＡＰに加えて、いくつかの植物か
ら数種の抗ウィルス性タンパク質が分離されているが、
その代表的な例として、リシヌスコミューニス(Ricinus
communis)から分離したリシン(Ricin) (Halling. K.C.
et al., Nucleic Acid Res., 13:8019-8033(1985)) 、
白粉花に由来するミラビリス抗ウィルス性タンパク質
（ＭＡＰ：Mirabilisantiviral protein) (Kataoka,
J. et al., J. Biol. Chem., 266:8426-8430(1991)) 及
びトリコサンテスキリロイ（Trichosanthes kirilowii)
にあるα−トリコサンチン（α-trichosanthin) (Zhan
g, X. et al., Nature, 321:477-478(1986)) などが挙
げられる。これらの抗ウィルス性タンパク質は、ＲＮＡ
Ｎ−グリコシダーゼ活性を有するリボソーム不活性化
タンパク質（ＲＩＰ：ribosomeinactivating protein)
であると報告されている［参照：Endo, Y. et al., J.B
iol. Chem., 263:8735-8739(1988)］。
ルス性タンパク質に関する研究は、アメリカヤマゴボウ
の粗抽出物から単離されたＰＡＰの発見に端を発した
［参照：Irvin, J.D., Arch. Biochem. Biophys., 169:
522-528(1975)］。ＰＡＰに加えて、いくつかの植物か
ら数種の抗ウィルス性タンパク質が分離されているが、
その代表的な例として、リシヌスコミューニス(Ricinus
communis)から分離したリシン(Ricin) (Halling. K.C.
et al., Nucleic Acid Res., 13:8019-8033(1985)) 、
白粉花に由来するミラビリス抗ウィルス性タンパク質
（ＭＡＰ：Mirabilisantiviral protein) (Kataoka,
J. et al., J. Biol. Chem., 266:8426-8430(1991)) 及
びトリコサンテスキリロイ（Trichosanthes kirilowii)
にあるα−トリコサンチン（α-trichosanthin) (Zhan
g, X. et al., Nature, 321:477-478(1986)) などが挙
げられる。これらの抗ウィルス性タンパク質は、ＲＮＡ
Ｎ−グリコシダーゼ活性を有するリボソーム不活性化
タンパク質（ＲＩＰ：ribosomeinactivating protein)
であると報告されている［参照：Endo, Y. et al., J.B
iol. Chem., 263:8735-8739(1988)］。
【０００３】一般に、アメリカヤマゴボウ由来のＰＡＰ
は、ＰＡＰ−Ｉ、ＰＡＰ−II及びＰＡＰ−Ｓの三つの類
型に分類され、これらは春葉、夏葉及び種子中に、それ
ぞれ存在し、またこれらのＰＡＰの抗血清反応は互いに
異なることが報告されている［参照：Irvin, J.D. et a
l., Arch. Biochem. Biophys., 200:418-425(1980)］。
は、ＰＡＰ−Ｉ、ＰＡＰ−II及びＰＡＰ−Ｓの三つの類
型に分類され、これらは春葉、夏葉及び種子中に、それ
ぞれ存在し、またこれらのＰＡＰの抗血清反応は互いに
異なることが報告されている［参照：Irvin, J.D. et a
l., Arch. Biochem. Biophys., 200:418-425(1980)］。
【０００４】また、ＭＡＰは合成された後、液胞で区画
化（compartmentation) されるが、ＰＡＰは合成された
後、細胞質に存在せず、細胞壁基質へ移動されることが
知られている［参照：Ready, M.P. et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A., 83:5053-5056(1986)］。アメリ
カヤマゴボウのリボソームはＰＡＰのＲＮＡ Ｎ−グリ
コシダーゼ活性により脱プリン化されると報告されてい
る。
化（compartmentation) されるが、ＰＡＰは合成された
後、細胞質に存在せず、細胞壁基質へ移動されることが
知られている［参照：Ready, M.P. et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A., 83:5053-5056(1986)］。アメリ
カヤマゴボウのリボソームはＰＡＰのＲＮＡ Ｎ−グリ
コシダーゼ活性により脱プリン化されると報告されてい
る。
【０００５】一方、ＰＡＰとＣＤ４またはＣＤ１９に対
するモノクローナル抗体との免疫結合体(immunoconjuga
te) は、人の免疫欠乏ウィルスタイプ−１ (human immu
no-deficiency virus type-1)の複製を抑制することが
報告されているので(Jansen,B. et al., Cancer Res.,
52:406-412(1992); Kim, Y.W. et al., J.Immunol.,14
4:1257-1267(1990); Myers, D.E. et al., J.Immunol.
Methods, 136:221-238(1991)) 、人間の後天性免疫不全
症候群（Acquired Immuno Deficiency Syndrome ：以下
“ＡＩＤＳ”と称する）の治療にこのＰＡＰを応用でき
ることが支持されている。
するモノクローナル抗体との免疫結合体(immunoconjuga
te) は、人の免疫欠乏ウィルスタイプ−１ (human immu
no-deficiency virus type-1)の複製を抑制することが
報告されているので(Jansen,B. et al., Cancer Res.,
52:406-412(1992); Kim, Y.W. et al., J.Immunol.,14
4:1257-1267(1990); Myers, D.E. et al., J.Immunol.
Methods, 136:221-238(1991)) 、人間の後天性免疫不全
症候群（Acquired Immuno Deficiency Syndrome ：以下
“ＡＩＤＳ”と称する）の治療にこのＰＡＰを応用でき
ることが支持されている。
【０００６】最近、アメリカヤマゴボウの夏葉からのＰ
ＡＰのｃＤＮＡの塩基配列が明らかになっており（Lin,
Q. et al., Plant Mol. Biol., 17:609-614(1991)) 、
ゲノムライブラリーから分離したＰＡＰの塩基配列も明
らかになるなど、ＰＡＰに対する分子生物学的な研究が
盛んに進められている。これによって、ＰＡＰの生物学
的活性の正確な作用機能の解明、トランスジェニック植
物の構築及び免疫結合体の製造への利用に多くの関心が
寄せられるようになった。
ＡＰのｃＤＮＡの塩基配列が明らかになっており（Lin,
Q. et al., Plant Mol. Biol., 17:609-614(1991)) 、
ゲノムライブラリーから分離したＰＡＰの塩基配列も明
らかになるなど、ＰＡＰに対する分子生物学的な研究が
盛んに進められている。これによって、ＰＡＰの生物学
的活性の正確な作用機能の解明、トランスジェニック植
物の構築及び免疫結合体の製造への利用に多くの関心が
寄せられるようになった。
【０００７】このような状況下で、発明者らは、最初
に、ＰＡＰを発現するトランスジェニック植物を開発
し、そのＰＡＰ発現ベクターについて１９９２年８月１
９日付で大韓民国特許出願第９２−１４８９５号『ヤマ
ゴボウ抗ウィルス性タンパク質の発現ベクター及びそれ
により形質転換されたトランスジェニック植物体の製造
方法』として出願した（USSN 08/049,175;欧州特許出願
No.93 110 445.9; 特願平5-128222) 。しかしながら、
先行技術であるこれらの出願に記載の発明においては、
植物遺伝子の発現に一般に使用するＣａＭＶ３５Ｓプロ
モータを採用していることから、この発現ベクターは植
物体にウィルス耐性を付与するように形質転換すること
を目的として設計されているだけであることが明らかで
ある。
に、ＰＡＰを発現するトランスジェニック植物を開発
し、そのＰＡＰ発現ベクターについて１９９２年８月１
９日付で大韓民国特許出願第９２−１４８９５号『ヤマ
ゴボウ抗ウィルス性タンパク質の発現ベクター及びそれ
により形質転換されたトランスジェニック植物体の製造
方法』として出願した（USSN 08/049,175;欧州特許出願
No.93 110 445.9; 特願平5-128222) 。しかしながら、
先行技術であるこれらの出願に記載の発明においては、
植物遺伝子の発現に一般に使用するＣａＭＶ３５Ｓプロ
モータを採用していることから、この発現ベクターは植
物体にウィルス耐性を付与するように形質転換すること
を目的として設計されているだけであることが明らかで
ある。
【０００８】従って、ＰＡＰ遺伝子を発現させるための
宿主生物が植物に限定されるので、微生物において高い
発現レベルでＰＡＰを生産することができる発現ベクタ
ーを開発する必要性が絶えず存在していた。
宿主生物が植物に限定されるので、微生物において高い
発現レベルでＰＡＰを生産することができる発現ベクタ
ーを開発する必要性が絶えず存在していた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明に従い、本発明
者らは、始めて、形質転換した微生物中でＰＡＰ遺伝子
を発現できる組換えベクターを開発した。したがって、
本発明の目的は、アメリカヤマゴボウのｃＤＮＡライブ
ラリーから単離されたＰＡＰ遺伝子を含む新規な組換え
発現ベクターであって、このＰＡＰ遺伝子が微生物中で
高収率で発現されうるベクターを提供することである。
者らは、始めて、形質転換した微生物中でＰＡＰ遺伝子
を発現できる組換えベクターを開発した。したがって、
本発明の目的は、アメリカヤマゴボウのｃＤＮＡライブ
ラリーから単離されたＰＡＰ遺伝子を含む新規な組換え
発現ベクターであって、このＰＡＰ遺伝子が微生物中で
高収率で発現されうるベクターを提供することである。
【００１０】本発明のもうひとつの目的は、ＰＡＰ遺伝
子を大量に発現させる前記の組換え発現ベクターで形質
転換された微生物を提供することである。
子を大量に発現させる前記の組換え発現ベクターで形質
転換された微生物を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】添付の図面とともに以下
の記載により、本発明を詳細に説明する。本発明者ら
は、アメリカヤマゴボウのｃＤＮＡライブラリーから単
離したＰＡＰ遺伝子を含み、形質転換された微生物中で
組換えＰＡＰを産生する組換え発現ベクターｐＭＪ１２
を開発した。
の記載により、本発明を詳細に説明する。本発明者ら
は、アメリカヤマゴボウのｃＤＮＡライブラリーから単
離したＰＡＰ遺伝子を含み、形質転換された微生物中で
組換えＰＡＰを産生する組換え発現ベクターｐＭＪ１２
を開発した。
【００１２】ＰＡＰ遺伝子を単離するために、韓国で得
たアメリカヤマゴボウの葉から全細胞性ｍＲＮＡを分離
して精製し、これよりｃＤＮＡライブラリーを以下のよ
うにして作製する。抗−ＰＡＰ抗体を用いて免疫検索法
（immunoscreening)によりＰＡＰ遺伝子を選択する。そ
して、単離したＰＡＰ遺伝子をエレイズ−ア−ベース・
システム（Erase-a-Base system, Promega, U.S.A.) を
利用して欠失変異体(deletion mutant) を作製する。Ｐ
ＡＰ遺伝子を含むｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列をサン
ガーのジデオキシ鎖終結方法（dideoxy chain terminat
ion. method)により決定する［参照：Sanger, F., Scie
nce, 214:1205-1210(1981)］。
たアメリカヤマゴボウの葉から全細胞性ｍＲＮＡを分離
して精製し、これよりｃＤＮＡライブラリーを以下のよ
うにして作製する。抗−ＰＡＰ抗体を用いて免疫検索法
（immunoscreening)によりＰＡＰ遺伝子を選択する。そ
して、単離したＰＡＰ遺伝子をエレイズ−ア−ベース・
システム（Erase-a-Base system, Promega, U.S.A.) を
利用して欠失変異体(deletion mutant) を作製する。Ｐ
ＡＰ遺伝子を含むｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列をサン
ガーのジデオキシ鎖終結方法（dideoxy chain terminat
ion. method)により決定する［参照：Sanger, F., Scie
nce, 214:1205-1210(1981)］。
【００１３】単離したＰＡＰ遺伝子を微生物中で発現さ
せるために、商業的に入手できるＦＬＡＧTMベクター
（International Biotechnologies Inc., U.S.A.) を利
用する。ＩＢＩ ＦＬＡＧバイオシステムは、簡素化さ
れた発現、大腸菌における組換えタンパク質の検出およ
び精製に本質的なすべての鍵となる成分を提供する。Ｆ
ＬＡＧ技法は、ｐＦＬＡＧ−１TM発現ベクター（図８）
により発現される組換えタンパク質のＮ末端に低分子量
（１ｋＤ）親水性ＦＬＡＧマーカーペプチドを融合させ
ることに集中される。得られたＦＬＡＧ融合タンパク質
は、穏やかな非変性条件下で、アガロースに共有結合し
たマウス抗−ＦＬＡＧTMＩｇＧ Ｍ１モノクローナル抗
体を用いるアフィニティクロマトグラフィーにより一工
程で迅速に精製される。アフィニティ精製に続いて、エ
ンテロキナーゼを用いてＦＬＡＧペプチドを特異的にか
つ効率的にタンパク質分解することによって除去するこ
とにより、真正のタンパク質が生物学的に活性な形で回
収される。この抗−ＦＬＡＧＭ１モノクローナル抗体は
また、その発現を通してウェスタンスロットまたはドッ
トブロットによるＦＬＡＧ融合タンパク質の特異的かつ
効率的な検出、アフィニティ精製およびＦＬＡＧマーカ
ー除去に使用される。このＦＬＡＧペプチドは、融合タ
ンパク質の表面に容易に接近できるように完全に設計さ
れた。この性質により、アフィニティ精製、またはスロ
ット、ドットもしくはウェスタンブロットによる免疫検
出の間、抗−ＦＬＡＧ Ｍ１モノクローナル抗体に効率
的に結合できるようになる。表面に接近可能なことによ
り、また、エンテロキナーゼによるＦＬＡＧペプチドの
タンパク質分解による除去が容易になる。さらに、タン
パク質配列分析により、このＦＬＡＧペプチドは表面確
率（surface probability)、親水性、およびトロンビン
またはＸａ因子認識部位よりも高い抗原インデックスを
有することが明らかとなった。これにより、融合タンパ
ク質からのＦＬＡＧペプチドのより効率的な検出、アフ
ィニティ精製および除去が可能となる。ＦＬＡＧは、Ｆ
ＬＡＧ融合タンパク質の他の領域により越えることがで
きない高い親水性のためにタンパク質表面に生じること
が事実上保証されている。ＦＬＡＧのような親水性のペ
プチド配列は、また、抗体による検出のために高い抗原
性を示すことが証明されている。
せるために、商業的に入手できるＦＬＡＧTMベクター
（International Biotechnologies Inc., U.S.A.) を利
用する。ＩＢＩ ＦＬＡＧバイオシステムは、簡素化さ
れた発現、大腸菌における組換えタンパク質の検出およ
び精製に本質的なすべての鍵となる成分を提供する。Ｆ
ＬＡＧ技法は、ｐＦＬＡＧ−１TM発現ベクター（図８）
により発現される組換えタンパク質のＮ末端に低分子量
（１ｋＤ）親水性ＦＬＡＧマーカーペプチドを融合させ
ることに集中される。得られたＦＬＡＧ融合タンパク質
は、穏やかな非変性条件下で、アガロースに共有結合し
たマウス抗−ＦＬＡＧTMＩｇＧ Ｍ１モノクローナル抗
体を用いるアフィニティクロマトグラフィーにより一工
程で迅速に精製される。アフィニティ精製に続いて、エ
ンテロキナーゼを用いてＦＬＡＧペプチドを特異的にか
つ効率的にタンパク質分解することによって除去するこ
とにより、真正のタンパク質が生物学的に活性な形で回
収される。この抗−ＦＬＡＧＭ１モノクローナル抗体は
また、その発現を通してウェスタンスロットまたはドッ
トブロットによるＦＬＡＧ融合タンパク質の特異的かつ
効率的な検出、アフィニティ精製およびＦＬＡＧマーカ
ー除去に使用される。このＦＬＡＧペプチドは、融合タ
ンパク質の表面に容易に接近できるように完全に設計さ
れた。この性質により、アフィニティ精製、またはスロ
ット、ドットもしくはウェスタンブロットによる免疫検
出の間、抗−ＦＬＡＧ Ｍ１モノクローナル抗体に効率
的に結合できるようになる。表面に接近可能なことによ
り、また、エンテロキナーゼによるＦＬＡＧペプチドの
タンパク質分解による除去が容易になる。さらに、タン
パク質配列分析により、このＦＬＡＧペプチドは表面確
率（surface probability)、親水性、およびトロンビン
またはＸａ因子認識部位よりも高い抗原インデックスを
有することが明らかとなった。これにより、融合タンパ
ク質からのＦＬＡＧペプチドのより効率的な検出、アフ
ィニティ精製および除去が可能となる。ＦＬＡＧは、Ｆ
ＬＡＧ融合タンパク質の他の領域により越えることがで
きない高い親水性のためにタンパク質表面に生じること
が事実上保証されている。ＦＬＡＧのような親水性のペ
プチド配列は、また、抗体による検出のために高い抗原
性を示すことが証明されている。
【００１４】小サイズのＦＬＡＧマーカーペプチドによ
り天然のタンパク質のコンフォメーションの崩壊を最小
にすることができ、生物学的に活性な形のクローン化さ
れたタンパク質の回収がより確実となる。抗−ＦＬＡＧ
Ｍ１モノクローナル抗体の抗原部位は小さい４アミノ
酸ペプチドで、これは低分子量ＦＬＡＧオクタペプチド
の設計を可能にする５アミノ酸エンテロキナーゼ切断部
位と重複する。ＦＬＡＧマーカーペプチドの使用によ
り、融合タンパク質の精製のために過去によく使用され
ていた大分子量のマーカー配列の使用は不可能になる。
これらのマーカーは、タンパク質のコンフォメーション
を崩壊し、生物学的活性を減少させるかまたはなくす可
能性が高い。この低分子量ＦＬＡＧペプチドに融合した
タンパク質は、典型的には、高められた生物学的活性を
保持するかまたは示す。また、タンパク質の再生の妨害
を最小にするＦＬＡＧペプチドの高い表面確率により、
生物学的活性の回復が保証される。
り天然のタンパク質のコンフォメーションの崩壊を最小
にすることができ、生物学的に活性な形のクローン化さ
れたタンパク質の回収がより確実となる。抗−ＦＬＡＧ
Ｍ１モノクローナル抗体の抗原部位は小さい４アミノ
酸ペプチドで、これは低分子量ＦＬＡＧオクタペプチド
の設計を可能にする５アミノ酸エンテロキナーゼ切断部
位と重複する。ＦＬＡＧマーカーペプチドの使用によ
り、融合タンパク質の精製のために過去によく使用され
ていた大分子量のマーカー配列の使用は不可能になる。
これらのマーカーは、タンパク質のコンフォメーション
を崩壊し、生物学的活性を減少させるかまたはなくす可
能性が高い。この低分子量ＦＬＡＧペプチドに融合した
タンパク質は、典型的には、高められた生物学的活性を
保持するかまたは示す。また、タンパク質の再生の妨害
を最小にするＦＬＡＧペプチドの高い表面確率により、
生物学的活性の回復が保証される。
【００１５】以下に、ｐＦＬＡＧ−１発現ベクターのマ
ーカーを示す。 表 ｐＦＬＡＧ−１発現ベクターのマーカー マップ位置（塩基対）マーカー 記載 ２９−５７ tac プロモーター trp プロモーターの-35 領域と プリブノーボックスの-10 領域 ６３ lacI結合 lacIレプレッサー結合部位 IPTGによる抑制解除 ９０ RBS シャインダルガーノリボソーム結合 部位 １０１−１６３ ompA FLAG融合タンパク質を周縁質空間に 分泌するためのシグナルペプチド １６４−１８７ FLAG 抗-FLAG モノクローナル抗体結合の 結合およびエンテロキナーゼ切断の ためのオクタペプチド １８５−２２６ MCS コーディング配列をpFLAG-1 へ挿入 するための多重クローニング部位 ２６１−６３１ T 1 T 2 リボソームRNA オペロンからのrrnB 化合物転写ターミネーター ５３６７−１６ Ｎ・26 Ｎ・26順向配列決定プライマー(N・ 26 forward sequencing primer) の 結合部位 ２３０−２５３ Ｃ・24 Ｃ・24逆向配列決定プライマー(C・ 24 reverse sequencing primer) の 結合部位 ７２３−１５８２ amp r 宿主細胞へのアンピシリン耐性 ２３３９ pBR322ori pFLAG-1 の二本鎖複製 ２５７７−３０４０ fl・ori M13K07ヘルパーファージによる重感 染を介した陽性鎖の一本鎖複製 ３６９８−４８７１ lacI tac.LacIレプレッサータンパク質の 抑制は突然変異したlacIq プロモー ターから過剰生産される。IPTGによ る抑制解除 単離したＰＡＰ遺伝子はシグナルペプチドを有するの
で、合成したＮ−末端プライマーとＣ−末端プライマー
を使用するThermal Cycler（商標) により成熟ＰＡＰの
コーディング領域を増幅させる。このようにして増幅さ
れたＤＮＡを電気溶出してＨｉｎｄIII で切断し、ＦＬ
ＡＧTMに連結して、組換え発現ベクターｐＭＪ１２を構
築する。該ｐＭＪ１２は１９９３年６月３０日付で、国
際寄託機関である社団法人韓国種菌協会付設韓国微生物
保存センタ（ＫＣＣＭ）に寄託番号（ＫＣＣＭ １００
３７）で寄託された。
ーカーを示す。 表 ｐＦＬＡＧ−１発現ベクターのマーカー マップ位置（塩基対）マーカー 記載 ２９−５７ tac プロモーター trp プロモーターの-35 領域と プリブノーボックスの-10 領域 ６３ lacI結合 lacIレプレッサー結合部位 IPTGによる抑制解除 ９０ RBS シャインダルガーノリボソーム結合 部位 １０１−１６３ ompA FLAG融合タンパク質を周縁質空間に 分泌するためのシグナルペプチド １６４−１８７ FLAG 抗-FLAG モノクローナル抗体結合の 結合およびエンテロキナーゼ切断の ためのオクタペプチド １８５−２２６ MCS コーディング配列をpFLAG-1 へ挿入 するための多重クローニング部位 ２６１−６３１ T 1 T 2 リボソームRNA オペロンからのrrnB 化合物転写ターミネーター ５３６７−１６ Ｎ・26 Ｎ・26順向配列決定プライマー(N・ 26 forward sequencing primer) の 結合部位 ２３０−２５３ Ｃ・24 Ｃ・24逆向配列決定プライマー(C・ 24 reverse sequencing primer) の 結合部位 ７２３−１５８２ amp r 宿主細胞へのアンピシリン耐性 ２３３９ pBR322ori pFLAG-1 の二本鎖複製 ２５７７−３０４０ fl・ori M13K07ヘルパーファージによる重感 染を介した陽性鎖の一本鎖複製 ３６９８−４８７１ lacI tac.LacIレプレッサータンパク質の 抑制は突然変異したlacIq プロモー ターから過剰生産される。IPTGによ る抑制解除 単離したＰＡＰ遺伝子はシグナルペプチドを有するの
で、合成したＮ−末端プライマーとＣ−末端プライマー
を使用するThermal Cycler（商標) により成熟ＰＡＰの
コーディング領域を増幅させる。このようにして増幅さ
れたＤＮＡを電気溶出してＨｉｎｄIII で切断し、ＦＬ
ＡＧTMに連結して、組換え発現ベクターｐＭＪ１２を構
築する。該ｐＭＪ１２は１９９３年６月３０日付で、国
際寄託機関である社団法人韓国種菌協会付設韓国微生物
保存センタ（ＫＣＣＭ）に寄託番号（ＫＣＣＭ １００
３７）で寄託された。
【００１６】このように構築された組換え発現ベクター
を微生物に形質導入する。宿主として、形質転換可能な
好ましい微生物は大腸菌である。これに関して、大腸菌
宿主細胞株ＨＢ１０１においてＰＡＰを発現させること
に成功した。上記のようにして構築されたｐＭＪ１２を
コンピテントな大腸菌ＨＢ１０１に形質導入した後、ｐ
ＭＪ１２で形質転換されたコロニーを選択する。その
後、ＩＰＴＧ（isoproply-β-D-thiogalactoside) およ
びアンピシリンを含有するＬＢ肉汁培地で上記コロニー
を培養して、組換えＰＡＰを６時間で誘導する。組換え
ＰＡＰの誘導の後、上記のようにして培養した細胞を回
収して、燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：０．０１Ｍ Ｎ
ａＨ2ＰＯ4 、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で
２回洗浄し、ドライアイス−メタノール浴槽で凍らせ、
３７℃で溶かす工程を繰り返して細胞ペレットを溶解す
る。その後、細胞溶解産物を遠心分離してその上澄液を
回収する。上記のようにして得た上澄液の１０μｌをＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、クマシーブリリアントブルー
Ｒで染色し、組換えＰＡＰの産生をウェストンブロット
分析で測定する。組換えＰＡＰを精製するために、上記
の上澄液を抗−ＦＬＡＧ Ｍ１アフィニティカラムにか
け、１．０ｍＭ ＣａＣｌ2 を含有するＰＢＳ溶液で溶
出する。組換えＰＡＰの生物学的活性は in vitro翻訳
法により測定する。
を微生物に形質導入する。宿主として、形質転換可能な
好ましい微生物は大腸菌である。これに関して、大腸菌
宿主細胞株ＨＢ１０１においてＰＡＰを発現させること
に成功した。上記のようにして構築されたｐＭＪ１２を
コンピテントな大腸菌ＨＢ１０１に形質導入した後、ｐ
ＭＪ１２で形質転換されたコロニーを選択する。その
後、ＩＰＴＧ（isoproply-β-D-thiogalactoside) およ
びアンピシリンを含有するＬＢ肉汁培地で上記コロニー
を培養して、組換えＰＡＰを６時間で誘導する。組換え
ＰＡＰの誘導の後、上記のようにして培養した細胞を回
収して、燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：０．０１Ｍ Ｎ
ａＨ2ＰＯ4 、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で
２回洗浄し、ドライアイス−メタノール浴槽で凍らせ、
３７℃で溶かす工程を繰り返して細胞ペレットを溶解す
る。その後、細胞溶解産物を遠心分離してその上澄液を
回収する。上記のようにして得た上澄液の１０μｌをＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、クマシーブリリアントブルー
Ｒで染色し、組換えＰＡＰの産生をウェストンブロット
分析で測定する。組換えＰＡＰを精製するために、上記
の上澄液を抗−ＦＬＡＧ Ｍ１アフィニティカラムにか
け、１．０ｍＭ ＣａＣｌ2 を含有するＰＢＳ溶液で溶
出する。組換えＰＡＰの生物学的活性は in vitro翻訳
法により測定する。
【００１７】
【実施例】以下の実施例によって本発明をより具体的に
説明する。これらの実施例は単に本発明を説明するため
のものであって、本発明の範囲はこれらの実施例に限定
されるものではない。
説明する。これらの実施例は単に本発明を説明するため
のものであって、本発明の範囲はこれらの実施例に限定
されるものではない。
【００１８】
【実施例１】 ｃＤＮＡライブラリーからのＰＡＰ遺伝子の単離 ＰＡＰをアービンの方法［参照：J.D.Irvin. et al.,Ar
ch. Biochem. Biophys., 169:522-528(1975)］に従って
単離した。４８０μｇのＰＡＰをＰＢＳ溶液に溶解し、
フロイント完全アジュバントと１：１(v/v) の比で混合
して、体重約３ｋｇのウサギに筋肉内投与した。
ch. Biochem. Biophys., 169:522-528(1975)］に従って
単離した。４８０μｇのＰＡＰをＰＢＳ溶液に溶解し、
フロイント完全アジュバントと１：１(v/v) の比で混合
して、体重約３ｋｇのウサギに筋肉内投与した。
【００１９】３週間後にウサギから回収した小量の血液
中の抗体形成を検出し、追加免疫（boosting) のために
７５０μｇのＰＡＰをフロイント不完全アジュバントと
１：１(v/v) の比で混合した。これより約１週間後に採
血して、この血液から血漿を遠心分離により分画し、プ
ロテイン−Ａ アガロースカラムクロマトグラフィーに
より抗血漿を単離した。抗体の形成の有無は免疫拡散法
により、単離された抗−ＰＡＰ抗体の均質性は電気泳動
法により、それぞれ測定した。精製された抗−ＰＡＰ抗
体は、−７０℃で保存して、ｃＤＮＡライブラリーから
ＰＡＰ遺伝子を単離するために使用した。
中の抗体形成を検出し、追加免疫（boosting) のために
７５０μｇのＰＡＰをフロイント不完全アジュバントと
１：１(v/v) の比で混合した。これより約１週間後に採
血して、この血液から血漿を遠心分離により分画し、プ
ロテイン−Ａ アガロースカラムクロマトグラフィーに
より抗血漿を単離した。抗体の形成の有無は免疫拡散法
により、単離された抗−ＰＡＰ抗体の均質性は電気泳動
法により、それぞれ測定した。精製された抗−ＰＡＰ抗
体は、−７０℃で保存して、ｃＤＮＡライブラリーから
ＰＡＰ遺伝子を単離するために使用した。
【００２０】アメリカヤマゴボウの葉からｍＲＮＡを単
離するために、葉組織を液体窒素を利用して摩砕し、摩
砕物に全ＲＮＡ単離用緩衝液を添加して遠心分離した。
上澄液を取り、ＬｉＣｌ沈澱によりその上澄液から全細
胞性ＲＮＡを単離した。このように単離されたＲＮＡか
ら、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムクロマトグラフィ
ーを利用してｍＲＮＡを単離し、単離したｍＲＮＡをｃ
ＤＮＡ合成に使用した。
離するために、葉組織を液体窒素を利用して摩砕し、摩
砕物に全ＲＮＡ単離用緩衝液を添加して遠心分離した。
上澄液を取り、ＬｉＣｌ沈澱によりその上澄液から全細
胞性ＲＮＡを単離した。このように単離されたＲＮＡか
ら、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムクロマトグラフィ
ーを利用してｍＲＮＡを単離し、単離したｍＲＮＡをｃ
ＤＮＡ合成に使用した。
【００２１】鋳型ｍＲＮＡから、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵
素を利用して、第一鎖(1st strand)のｃＤＮＡを合成
し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼにより第二鎖（２nd str
and)ｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡをＥｃｏ
ＲＩアダプターに結合させ、セファクリルＳ−４００ス
パンカラムにかけて、ｃＤＮＡの分子量に従ってＤＮＡ
断片を分画した。分画されたｃＤＮＡをＵｎｉ−Ｚａｐ
ＸＲベクター（Stratagene. U.K.) に連結させ、パッ
ケージング抽出装置（packaging extract)を使用して、
in vitroパッケージングを行なった。その後、抗−ＰＡ
Ｐ抗体を用いる免疫検索を行なって、上記のようにして
作製されたｃＤＮＡライブラリーからＰＡＰ遺伝子を単
離した。大腸菌ＳＵＲＥにファージ感染させたところ、
２×１０4 ｐｆｕのプラークが形成された。３７℃にお
いて１５分間上記の細菌を培養した後、３ｍｌのトップ
アガロース（top agarose)と混ぜて塗布し、４２℃にお
いて３．５時間さらに培養した。その後、培養されたプ
レート上にハイボンドＮ＋（Hybond-N+, Amersham, U.
K.)を載せて、５時間インキュベートした。インキュベ
ーション後、ハイボンドＮ＋を牛血清アルブミンでブロ
ックし、５ｍｇ／ｍｌの抗−ＰＡＰ抗体で処理した。結
合しなかった遊離の抗−ＰＡＰ抗体を除去した後、ペル
オキシダーゼ結合二次抗体(peroxidase conjugated 2nd
antibody)を抗−ＰＡＰ抗体と反応させ、クロロナフト
ル（chloronaphthol) で処理して、抗原−抗体複合体を
検出した。
素を利用して、第一鎖(1st strand)のｃＤＮＡを合成
し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼにより第二鎖（２nd str
and)ｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡをＥｃｏ
ＲＩアダプターに結合させ、セファクリルＳ−４００ス
パンカラムにかけて、ｃＤＮＡの分子量に従ってＤＮＡ
断片を分画した。分画されたｃＤＮＡをＵｎｉ−Ｚａｐ
ＸＲベクター（Stratagene. U.K.) に連結させ、パッ
ケージング抽出装置（packaging extract)を使用して、
in vitroパッケージングを行なった。その後、抗−ＰＡ
Ｐ抗体を用いる免疫検索を行なって、上記のようにして
作製されたｃＤＮＡライブラリーからＰＡＰ遺伝子を単
離した。大腸菌ＳＵＲＥにファージ感染させたところ、
２×１０4 ｐｆｕのプラークが形成された。３７℃にお
いて１５分間上記の細菌を培養した後、３ｍｌのトップ
アガロース（top agarose)と混ぜて塗布し、４２℃にお
いて３．５時間さらに培養した。その後、培養されたプ
レート上にハイボンドＮ＋（Hybond-N+, Amersham, U.
K.)を載せて、５時間インキュベートした。インキュベ
ーション後、ハイボンドＮ＋を牛血清アルブミンでブロ
ックし、５ｍｇ／ｍｌの抗−ＰＡＰ抗体で処理した。結
合しなかった遊離の抗−ＰＡＰ抗体を除去した後、ペル
オキシダーゼ結合二次抗体(peroxidase conjugated 2nd
antibody)を抗−ＰＡＰ抗体と反応させ、クロロナフト
ル（chloronaphthol) で処理して、抗原−抗体複合体を
検出した。
【００２２】一次免疫検索法により得たクローンのう
ち、１５個のクローンを二次免疫検索法に使用した。二
次免疫検索法は前記のような方法で実施したが、プラー
ク数を５×１０3 ｐｆｕに調整して行なった。二次免疫
検索法により得たクローンを用いて、三次免疫検索法を
行なった。単離された８個のプラークについて、次の実
験を行なった。
ち、１５個のクローンを二次免疫検索法に使用した。二
次免疫検索法は前記のような方法で実施したが、プラー
ク数を５×１０3 ｐｆｕに調整して行なった。二次免疫
検索法により得たクローンを用いて、三次免疫検索法を
行なった。単離された８個のプラークについて、次の実
験を行なった。
【００２３】三次免疫検索法により得た８個の組換えＵ
ｎｉ−Ｚａｐ ＸＲファージのファージミド（phagemi
d) を大腸菌株に移入するために、Ｒ４０８ヘルパーフ
ァージを利用する生体内切断（in vivo excision) を行
なった。４個のコロニーから、アルカリ変成方法（Mani
atis et al., Molecular Clonig: A Laboratory Manua
l, pp368-369, Cold Spring Harbor Laboratory(1982))
によってファージミドを単離し、制限酵素切断法によ
り、ＰＡＰ ｃＤＮＡ挿入物を有しているコロニーをス
クリーニングした。
ｎｉ−Ｚａｐ ＸＲファージのファージミド（phagemi
d) を大腸菌株に移入するために、Ｒ４０８ヘルパーフ
ァージを利用する生体内切断（in vivo excision) を行
なった。４個のコロニーから、アルカリ変成方法（Mani
atis et al., Molecular Clonig: A Laboratory Manua
l, pp368-369, Cold Spring Harbor Laboratory(1982))
によってファージミドを単離し、制限酵素切断法によ
り、ＰＡＰ ｃＤＮＡ挿入物を有しているコロニーをス
クリーニングした。
【００２４】上記のようにスクリーニングしたクローン
中２個のクローンからプラスミドを単離して、ジデオキ
シ鎖終結方法でＰＡＰのｃＤＮＡ挿入物の配列決定を行
なった。ＰＡＰ遺伝子の全ヌクレオチド配列を決定する
ために、ＰＡＰ遺伝子を有している微生物からＤＮＡを
精製した。精製したＤＮＡをＳａｃIIおよびＢａｍＨＩ
で消化し、エレイズ−ア−ベースシステム(promega, U.
S.A.) を利用して間欠性ＥｘｏIII 切断反応により、欠
失（deletion) を行なった。欠失したＤＮＡをＴ4 ＤＮ
Ａリガーゼで互いに連結して、得られたものをＣａＣｌ
2 溶液の処理により作製したコンピテントＸＬ−ＢＬＵ
Ｅ細胞に形質導入した。分子量で分画した欠失変異体(d
eletion mutant) を使用して、ＤＮＡ配列決定を行なっ
た。
中２個のクローンからプラスミドを単離して、ジデオキ
シ鎖終結方法でＰＡＰのｃＤＮＡ挿入物の配列決定を行
なった。ＰＡＰ遺伝子の全ヌクレオチド配列を決定する
ために、ＰＡＰ遺伝子を有している微生物からＤＮＡを
精製した。精製したＤＮＡをＳａｃIIおよびＢａｍＨＩ
で消化し、エレイズ−ア−ベースシステム(promega, U.
S.A.) を利用して間欠性ＥｘｏIII 切断反応により、欠
失（deletion) を行なった。欠失したＤＮＡをＴ4 ＤＮ
Ａリガーゼで互いに連結して、得られたものをＣａＣｌ
2 溶液の処理により作製したコンピテントＸＬ−ＢＬＵ
Ｅ細胞に形質導入した。分子量で分画した欠失変異体(d
eletion mutant) を使用して、ＤＮＡ配列決定を行なっ
た。
【００２５】ＰＡＰ遺伝子の全塩基配列は、アルカリ変
性法により一本鎖を作製した後、プライマーとしてＴ7
プロモータープライマーまたは万能逆プライマー(unive
rsalreverse primer)を使用して、シーケナーゼ（ＳＥ
ＱＵＥＮＡＳＥ）バージョン２．０(United States Bio
chemical, U.S.A.) により決定した。図１に示すよう
に、ＰＡＰ ｃＤＮＡは、１１９５ｂｐのひとつのオー
プンリーディングフレームを含み、ＰＡＰのｃＤＮＡ挿
入物は、３１３個のアミノ酸残基をコードし、そのうち
の２２個の残基はシグナルペプチドとして機能する。
性法により一本鎖を作製した後、プライマーとしてＴ7
プロモータープライマーまたは万能逆プライマー(unive
rsalreverse primer)を使用して、シーケナーゼ（ＳＥ
ＱＵＥＮＡＳＥ）バージョン２．０(United States Bio
chemical, U.S.A.) により決定した。図１に示すよう
に、ＰＡＰ ｃＤＮＡは、１１９５ｂｐのひとつのオー
プンリーディングフレームを含み、ＰＡＰのｃＤＮＡ挿
入物は、３１３個のアミノ酸残基をコードし、そのうち
の２２個の残基はシグナルペプチドとして機能する。
【００２６】
【実施例２】 発現ベクターｐＭＪ１２の作製 ＰＡＰ遺伝子を大腸菌ＨＢ１０１中で発現させるため
に、商業的に入手できるＦＬＡＧTM（International Bi
otechnologies Inc., U.S.A.) ベクターを採用した。Ｄ
ＮＡ合成機（ＤＮＡ synthesizer; Applied Biosystems
Inc., U.S.A.)により合成した５′−ＣＣＡＡＧＣＴＴ
ＧＴＧＡＡＴＡＣＡＡＴＣＡＡＣ−３′および５′−Ｇ
ＧＡＡＧＣＴＴＴＧＡＴＣＡＧＡＡＴＣＣＴＴＣＡＡＡ
−３′のようなプライマーを、それぞれ、Ｎ末端プライ
マーおよびＣ末端プライマーとして使用し、ＶｅｎｔTM
ＤＮＡポリメラーゼ（New England Bio-lab., U.S.A.)
を使用し、ポリメラーゼ連鎖反応により成熟ＰＡＰ遺伝
子を増幅した。ＤＮＡ熱循環機（Cetus/Perkin-Elmer,
U.S.A.) を使用して、変性（９５℃、３０秒）、アニー
リング（５５℃、３０秒）、伸長（７２℃、３０秒）を
３０回サイクル行なった。増幅させたＰＡＰ遺伝子をＨ
ｉｎｄIII で切断し、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼの助けをかり
てＨｉｎｄIII で切断したＰＡＰ遺伝子をＨｉｎｄIII
で切断したＦＬＡＧTMと連結して、本発明の発現ベクタ
ーを構築した。このようにして構築された発現ベクター
をｐＭＪ１２と命名した。前記のｐＭＪ１２の段階的構
築過程を図２に示した。図２おいて、ＳはＳａｃＩ；Ｅ
はＥｃｏＲＩ；ＸはＸｈｏＩ；及びＫはＫｐｎＩの制限
酵素を各々示しており、黒ベタ領域はシグナルペプチド
を示す。このように構築したｐＭＪ１２をＣａＣｌ2 溶
液で処理して作製したコンピテント大腸菌ＨＢ１０１に
形質導入させた。そして、５０μｇ／ｍｌアンピシリン
を含有するＬＢ培地で培養したコロニーから、アルカリ
溶血方法を用いるプラスミドＤＮＡ単離法に基づいて、
ｐＭＪ１２を有する形質転換体を選択した。形質転換さ
れた大腸菌ＨＢ１０１は、１９９３年６月３０日付で、
国際寄託機関である社団法人韓国種菌協会付設韓国微生
物保存センタ（ＫＣＣＭ）に寄託番号（ＫＣＣＭ １０
０３７）で寄託された。
に、商業的に入手できるＦＬＡＧTM（International Bi
otechnologies Inc., U.S.A.) ベクターを採用した。Ｄ
ＮＡ合成機（ＤＮＡ synthesizer; Applied Biosystems
Inc., U.S.A.)により合成した５′−ＣＣＡＡＧＣＴＴ
ＧＴＧＡＡＴＡＣＡＡＴＣＡＡＣ−３′および５′−Ｇ
ＧＡＡＧＣＴＴＴＧＡＴＣＡＧＡＡＴＣＣＴＴＣＡＡＡ
−３′のようなプライマーを、それぞれ、Ｎ末端プライ
マーおよびＣ末端プライマーとして使用し、ＶｅｎｔTM
ＤＮＡポリメラーゼ（New England Bio-lab., U.S.A.)
を使用し、ポリメラーゼ連鎖反応により成熟ＰＡＰ遺伝
子を増幅した。ＤＮＡ熱循環機（Cetus/Perkin-Elmer,
U.S.A.) を使用して、変性（９５℃、３０秒）、アニー
リング（５５℃、３０秒）、伸長（７２℃、３０秒）を
３０回サイクル行なった。増幅させたＰＡＰ遺伝子をＨ
ｉｎｄIII で切断し、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼの助けをかり
てＨｉｎｄIII で切断したＰＡＰ遺伝子をＨｉｎｄIII
で切断したＦＬＡＧTMと連結して、本発明の発現ベクタ
ーを構築した。このようにして構築された発現ベクター
をｐＭＪ１２と命名した。前記のｐＭＪ１２の段階的構
築過程を図２に示した。図２おいて、ＳはＳａｃＩ；Ｅ
はＥｃｏＲＩ；ＸはＸｈｏＩ；及びＫはＫｐｎＩの制限
酵素を各々示しており、黒ベタ領域はシグナルペプチド
を示す。このように構築したｐＭＪ１２をＣａＣｌ2 溶
液で処理して作製したコンピテント大腸菌ＨＢ１０１に
形質導入させた。そして、５０μｇ／ｍｌアンピシリン
を含有するＬＢ培地で培養したコロニーから、アルカリ
溶血方法を用いるプラスミドＤＮＡ単離法に基づいて、
ｐＭＪ１２を有する形質転換体を選択した。形質転換さ
れた大腸菌ＨＢ１０１は、１９９３年６月３０日付で、
国際寄託機関である社団法人韓国種菌協会付設韓国微生
物保存センタ（ＫＣＣＭ）に寄託番号（ＫＣＣＭ １０
０３７）で寄託された。
【００２７】一方、図３はＨｉｎｄIII で消化したｐＭ
Ｊ１２の０．８％アガロースゲル電気泳動パターンを示
す写真である。図３において、Ｍは分子量マーカーレー
ン、すなわちＨｉｎｄIII で消化したλＤＮＡであり、
ｐＭＪ１２レーンは本発明の発現ベクターｐＭＪ１２を
示す。図３に示すように、ｐＭＪ１２ベクターの分子量
は約０．８ｋｂと測定された。
Ｊ１２の０．８％アガロースゲル電気泳動パターンを示
す写真である。図３において、Ｍは分子量マーカーレー
ン、すなわちＨｉｎｄIII で消化したλＤＮＡであり、
ｐＭＪ１２レーンは本発明の発現ベクターｐＭＪ１２を
示す。図３に示すように、ｐＭＪ１２ベクターの分子量
は約０．８ｋｂと測定された。
【００２８】
【実施例３】 ｐＭＪ１２で形質転換された微生物の増殖抑制 リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）の一種である
リシン（ricin)は、宿主微生物の増殖に影響を及ぼさな
いと報告されているが、ミラビリス抗ウィルス性タンパ
ク質（ＭＡＰ）の発現は、その形質転換体の増殖を抑制
する。そのような状況下で、発現ベクターｐＭＪ１２か
ら生産された組換えＰＡＰが形質転換体の増殖を抑制す
るかどうかを宿主生物の細胞増殖パターンを通じて検討
した：５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ液
体培地に形質転換されていない大腸菌ＨＢ１０１、ｐＦ
ＬＡＧで形質転換された大腸菌ＨＢ１０１またはｐＭＪ
１２で形質転換された大腸菌ＨＢ１０１を各々接種し
て、一晩インキュベートした。その後、同じ細胞濃度の
各培養物をピペットで移し、０．７ｍＭのＩＰＴＧを含
有するＬＢ液体培地に接種して、３７℃で２００ｒｐｍ
で振盪培養機上で培養し、３０分ごとに６００ｎｍ吸光
度を測定して各培養物の細胞濃度を測定した。図４に明
示されるように、形質転換されていない大腸菌ＨＢ１０
１（△−△）およびｐＦＬＡＧで形質転換された大腸菌
ＨＢ１０１（□−□）の増殖は正常であったのに対し、
組換えＰＡＰを産生するｐＭＪ１２を有する大腸菌ＨＢ
１０１（○−○）の増殖は著しく抑制された。したがっ
て、組換えＰＡＰがそのＲＮＡＮ−グリコシダーゼ活性
により、ｐＭＪ１２で形質転換された大腸菌ＨＢ１０１
の増殖を抑制することがわかった。
リシン（ricin)は、宿主微生物の増殖に影響を及ぼさな
いと報告されているが、ミラビリス抗ウィルス性タンパ
ク質（ＭＡＰ）の発現は、その形質転換体の増殖を抑制
する。そのような状況下で、発現ベクターｐＭＪ１２か
ら生産された組換えＰＡＰが形質転換体の増殖を抑制す
るかどうかを宿主生物の細胞増殖パターンを通じて検討
した：５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ液
体培地に形質転換されていない大腸菌ＨＢ１０１、ｐＦ
ＬＡＧで形質転換された大腸菌ＨＢ１０１またはｐＭＪ
１２で形質転換された大腸菌ＨＢ１０１を各々接種し
て、一晩インキュベートした。その後、同じ細胞濃度の
各培養物をピペットで移し、０．７ｍＭのＩＰＴＧを含
有するＬＢ液体培地に接種して、３７℃で２００ｒｐｍ
で振盪培養機上で培養し、３０分ごとに６００ｎｍ吸光
度を測定して各培養物の細胞濃度を測定した。図４に明
示されるように、形質転換されていない大腸菌ＨＢ１０
１（△−△）およびｐＦＬＡＧで形質転換された大腸菌
ＨＢ１０１（□−□）の増殖は正常であったのに対し、
組換えＰＡＰを産生するｐＭＪ１２を有する大腸菌ＨＢ
１０１（○−○）の増殖は著しく抑制された。したがっ
て、組換えＰＡＰがそのＲＮＡＮ−グリコシダーゼ活性
により、ｐＭＪ１２で形質転換された大腸菌ＨＢ１０１
の増殖を抑制することがわかった。
【００２９】
【実施例４】 ベクターｐＭＪ１２で形質転換された大腸菌ＨＢ１０１
からの組換えＰＡＰの発現 ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する５０ｍｌのＬ
Ｂ培地で大腸菌ＨＢ１０１（ＫＣＣＭ １００３７）を
培養して、培養物のＯＤ600 値が１．０に達した時、Ｉ
ＰＴＧ（０．７５ｍＭ）を添加して組換えＰＡＰを誘導
した。６時間ＰＡＰを誘導した後、細胞を遠心分離して
回収した後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：０．０１
Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4 ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．
４）で２回洗浄し、ドライアイス−メタノール浴槽で凍
らせ、３７℃で溶かした。０．２５ｍｇ／ｍｌリゾチー
ムを含有するＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ８．４）で細胞溶解
産物を懸濁させた後、さらにドライアイス−メタノール
浴槽で凍らせて、３７℃で溶かす工程を３回繰り返して
行なった。上記の溶液を１０分間おきに振盪し、３７℃
に３０分間維持した後、４℃で２５, ０００×ｇで４５
分間遠心分離して上澄液を得た。得られた上澄液の１０
μｌを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、クマシーブリ
リアントブルーＲで染色し、脱色溶液で脱色し、組換え
ＰＡＰの産生を実施例６に開示されたウェストンブロッ
ト分析により測定した。
からの組換えＰＡＰの発現 ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する５０ｍｌのＬ
Ｂ培地で大腸菌ＨＢ１０１（ＫＣＣＭ １００３７）を
培養して、培養物のＯＤ600 値が１．０に達した時、Ｉ
ＰＴＧ（０．７５ｍＭ）を添加して組換えＰＡＰを誘導
した。６時間ＰＡＰを誘導した後、細胞を遠心分離して
回収した後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：０．０１
Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4 ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．
４）で２回洗浄し、ドライアイス−メタノール浴槽で凍
らせ、３７℃で溶かした。０．２５ｍｇ／ｍｌリゾチー
ムを含有するＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ８．４）で細胞溶解
産物を懸濁させた後、さらにドライアイス−メタノール
浴槽で凍らせて、３７℃で溶かす工程を３回繰り返して
行なった。上記の溶液を１０分間おきに振盪し、３７℃
に３０分間維持した後、４℃で２５, ０００×ｇで４５
分間遠心分離して上澄液を得た。得られた上澄液の１０
μｌを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、クマシーブリ
リアントブルーＲで染色し、脱色溶液で脱色し、組換え
ＰＡＰの産生を実施例６に開示されたウェストンブロッ
ト分析により測定した。
【００３０】
【実施例５】 ベクターｐＭＪ１２で形質転換された大腸菌ＨＢ１０１
からの組換えＰＡＰの単離 本発明の発現ベクターｐＭＪ１２で形質転換された大腸
菌ＨＢ１０１（ＫＣＣＭ １００３７）から産生された
組換えＰＡＰを、次のような方法で、４℃の低温下で単
離した。実施例４で分画した全タンパク質に、ＣａＣｌ
2 の最終濃度が１．０ｍＭとなるように１Ｍ ＣａＣｌ
2 溶液を添加した。上記の溶液を５ｍｌグリシン−塩酸
（ｐＨ３．０）及びＰＢＳ溶液で３回洗浄した後、抗−
ＦＬＡＧＭ１アフィニティゲルカラムにかけた。その
後、１２ｍｌＰＢＳ／Ｃａ溶液（１．０ｍＭ ＣａＣｌ
2 を含有するＰＢＳ溶液）で３回洗浄した。組換えＰＡ
Ｐが結合したカラム中で、５００μｌのＰＢＳ／ＥＤＴ
Ａ溶液（２．０ｍＭ ＥＤＴＥを含有するＰＢＳ溶液）
を３０分間維持した後、溶剤として５００μｌのＰＢＳ
／ＥＤＴＡ溶液を使用して１０分間おきに分画分離し
た。上記のようにして単離した組換えＰＡＰの量及び純
度を、それぞれ、ブラッドフォード法［参照：Bradfor
d, Anal. Biochem., 72:248(1976); Anal. Biochem., 8
6:142(1978)］及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により測定し
た。上記組換えＰＡＰの発現レベルは、培養物１リット
ル当たり４０ｍｇと測定され、これは他のＲＩＰと比較
して比較的高い発現である。図５は前記のような方法に
よって精製した組換えＰＡＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥパター
ンを示している写真である。図５において、Ｍは低分子
量マーカー（Pharmacia, U.S.A.)を示しているレーン
で；右側レーンは発現された組換えＰＡＰを示してい
る。また、実施例６に開示された方法を用いるウェスト
ンブロットを行なった結果、上記の組換えＰＡＰは一つ
の単一バンドであることを確認し直すことができる。
からの組換えＰＡＰの単離 本発明の発現ベクターｐＭＪ１２で形質転換された大腸
菌ＨＢ１０１（ＫＣＣＭ １００３７）から産生された
組換えＰＡＰを、次のような方法で、４℃の低温下で単
離した。実施例４で分画した全タンパク質に、ＣａＣｌ
2 の最終濃度が１．０ｍＭとなるように１Ｍ ＣａＣｌ
2 溶液を添加した。上記の溶液を５ｍｌグリシン−塩酸
（ｐＨ３．０）及びＰＢＳ溶液で３回洗浄した後、抗−
ＦＬＡＧＭ１アフィニティゲルカラムにかけた。その
後、１２ｍｌＰＢＳ／Ｃａ溶液（１．０ｍＭ ＣａＣｌ
2 を含有するＰＢＳ溶液）で３回洗浄した。組換えＰＡ
Ｐが結合したカラム中で、５００μｌのＰＢＳ／ＥＤＴ
Ａ溶液（２．０ｍＭ ＥＤＴＥを含有するＰＢＳ溶液）
を３０分間維持した後、溶剤として５００μｌのＰＢＳ
／ＥＤＴＡ溶液を使用して１０分間おきに分画分離し
た。上記のようにして単離した組換えＰＡＰの量及び純
度を、それぞれ、ブラッドフォード法［参照：Bradfor
d, Anal. Biochem., 72:248(1976); Anal. Biochem., 8
6:142(1978)］及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により測定し
た。上記組換えＰＡＰの発現レベルは、培養物１リット
ル当たり４０ｍｇと測定され、これは他のＲＩＰと比較
して比較的高い発現である。図５は前記のような方法に
よって精製した組換えＰＡＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥパター
ンを示している写真である。図５において、Ｍは低分子
量マーカー（Pharmacia, U.S.A.)を示しているレーン
で；右側レーンは発現された組換えＰＡＰを示してい
る。また、実施例６に開示された方法を用いるウェスト
ンブロットを行なった結果、上記の組換えＰＡＰは一つ
の単一バンドであることを確認し直すことができる。
【００３１】
【実施例６】 ベクターｐＭＪ１２で形質転換された大腸菌ＨＢ１０１
からの組換えＰＡＰの測定 形質転換されていない大腸菌ＨＢ１０１、ｐＦＬＡＧで
形質転換された大腸菌ＨＢ１０１またはｐＭＪ１２で形
質転換された大腸菌ＨＢ１０１の全タンパク質を実施例
４に開示された方法で各々単離して、ウェストンブロッ
ト分析を行なった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画された
タンパク質をハイボンド−Ｃエキストラ（Hybond-C ext
ra) (Amersham, U.K.)へ移した後、０．１％ツイン（Tw
een)２０と２％ＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液でブロッキ
ングを行なった。上記のタンパク質をＰＢＳ溶液（０．
１％ツイン２０を含有する）で５分間２回洗浄し、２μ
ｇ／ｍｌ抗−ＰＡＰ抗体で室温にて１時間処理した。そ
の後、得られたタンパク質を前記緩衝溶液で２回洗浄
し、ウサギペルオキシダーゼ結合２次抗体で室温にて１
時間処理し、４−クロロ−１−ナフトールで染色した。
図６のウェスタンブロット分析の結果に示されるよう
に、ｐＭＪ１２で形質転換された大腸菌ＨＢ１０１（第
３レーン）にはたった一つのバンドが検出され、形質転
換されていない大腸菌ＨＢ１０１（第１レーン）及びｐ
ＦＬＡＧで形質転換された大腸菌ＨＢ１０１（第２レー
ン）ではいかなるバンドも検出されなかった。なお、図
６の第３および４レーンは、それぞれ、単離された全タ
ンパク質およびそれから精製されたアメリカヤマゴボウ
タンパク質のウェスタンブロット分析結果である。
からの組換えＰＡＰの測定 形質転換されていない大腸菌ＨＢ１０１、ｐＦＬＡＧで
形質転換された大腸菌ＨＢ１０１またはｐＭＪ１２で形
質転換された大腸菌ＨＢ１０１の全タンパク質を実施例
４に開示された方法で各々単離して、ウェストンブロッ
ト分析を行なった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画された
タンパク質をハイボンド−Ｃエキストラ（Hybond-C ext
ra) (Amersham, U.K.)へ移した後、０．１％ツイン（Tw
een)２０と２％ＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液でブロッキ
ングを行なった。上記のタンパク質をＰＢＳ溶液（０．
１％ツイン２０を含有する）で５分間２回洗浄し、２μ
ｇ／ｍｌ抗−ＰＡＰ抗体で室温にて１時間処理した。そ
の後、得られたタンパク質を前記緩衝溶液で２回洗浄
し、ウサギペルオキシダーゼ結合２次抗体で室温にて１
時間処理し、４−クロロ−１−ナフトールで染色した。
図６のウェスタンブロット分析の結果に示されるよう
に、ｐＭＪ１２で形質転換された大腸菌ＨＢ１０１（第
３レーン）にはたった一つのバンドが検出され、形質転
換されていない大腸菌ＨＢ１０１（第１レーン）及びｐ
ＦＬＡＧで形質転換された大腸菌ＨＢ１０１（第２レー
ン）ではいかなるバンドも検出されなかった。なお、図
６の第３および４レーンは、それぞれ、単離された全タ
ンパク質およびそれから精製されたアメリカヤマゴボウ
タンパク質のウェスタンブロット分析結果である。
【００３２】
【実施例７】 組換えＰＡＰの活性測定 タンパク質合成を阻害する精製した組換えＰＡＰの活性
を測定するために、ウサギ網状赤血球溶血システム（Pr
omega, U.S.A.)を利用したin vitro翻訳を行なった。ま
ず、組換えＰＡＰを前記実施例５に開示された方法で単
離し、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ ２ Ｍｅｍｂｒａｎｅ
（Spectrum, U.S.A.) 系により脱イオン水に対して透析
した後、活性測定のために使用した。３５μｌのウサギ
網状赤血球溶血物、メチオニンが含まれていない１ｍＭ
アミノ酸混合物、１μｌの35Ｓ−メチオニン（１０ｍＣ
ｉ／ｍｌ）、１μｌのＲＮａｓｉｎ（４０Ｕ／μｌ）、
２μｌのルシフェラーゼＲＮＡ（０．５μｇ／μｌ）、
及び１１μｌの組換えＰＡＰ（８０ｐモル）からなるin
vitro翻訳用の反応混合物５０μｌを３０℃で９０分間
反応させた。また、対照として、１１μｌの組換えＰＡ
Ｐ（８０ｐモル）の代わりに１１μｌの水を含有する以
外は上記と同じ組成の反応混合物を同じ条件下で反応さ
せた。合成されたタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
を使用して分画し、ゲルドライヤーで乾燥した後、Ｘ線
フィルムでタンパク質の合成程度を測定した。図７は、
in vitro翻訳実験後のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写
真である。図７に明示されるように、対照群（第１レー
ン）では、６２ｋＤａのルシフェラーゼのタンパク質の
合成が検出されるが、組換えＰＡＰ処理群（第２レー
ン）ではいかなるタンパク質も検出されない。
を測定するために、ウサギ網状赤血球溶血システム（Pr
omega, U.S.A.)を利用したin vitro翻訳を行なった。ま
ず、組換えＰＡＰを前記実施例５に開示された方法で単
離し、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ ２ Ｍｅｍｂｒａｎｅ
（Spectrum, U.S.A.) 系により脱イオン水に対して透析
した後、活性測定のために使用した。３５μｌのウサギ
網状赤血球溶血物、メチオニンが含まれていない１ｍＭ
アミノ酸混合物、１μｌの35Ｓ−メチオニン（１０ｍＣ
ｉ／ｍｌ）、１μｌのＲＮａｓｉｎ（４０Ｕ／μｌ）、
２μｌのルシフェラーゼＲＮＡ（０．５μｇ／μｌ）、
及び１１μｌの組換えＰＡＰ（８０ｐモル）からなるin
vitro翻訳用の反応混合物５０μｌを３０℃で９０分間
反応させた。また、対照として、１１μｌの組換えＰＡ
Ｐ（８０ｐモル）の代わりに１１μｌの水を含有する以
外は上記と同じ組成の反応混合物を同じ条件下で反応さ
せた。合成されたタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
を使用して分画し、ゲルドライヤーで乾燥した後、Ｘ線
フィルムでタンパク質の合成程度を測定した。図７は、
in vitro翻訳実験後のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写
真である。図７に明示されるように、対照群（第１レー
ン）では、６２ｋＤａのルシフェラーゼのタンパク質の
合成が検出されるが、組換えＰＡＰ処理群（第２レー
ン）ではいかなるタンパク質も検出されない。
【００３３】
【発明の効果】以上に詳細に説明したように、本発明に
より、ＰＡＰの新規な発現ベクター及び該ＰＡＰ発現ベ
クターで形質転換された微生物が提供された。本発明に
従って、生物学的に活性なＰＡＰを、本発明の発現ベク
ターで形質転換させた微生物から大量により容易に生産
することが可能になった。この組換えＰＡＰは、種々の
分野、例えばＰＡＰの分子研究および免疫結合体を使用
するＡＩＤＳの治療に応用されうる。
より、ＰＡＰの新規な発現ベクター及び該ＰＡＰ発現ベ
クターで形質転換された微生物が提供された。本発明に
従って、生物学的に活性なＰＡＰを、本発明の発現ベク
ターで形質転換させた微生物から大量により容易に生産
することが可能になった。この組換えＰＡＰは、種々の
分野、例えばＰＡＰの分子研究および免疫結合体を使用
するＡＩＤＳの治療に応用されうる。
【図１】図１は、アメリカヤマゴボウのｃＤＮＡライブ
ラリーから単離されたＰＡＰ遺伝子のヌクレオチド配列
である。
ラリーから単離されたＰＡＰ遺伝子のヌクレオチド配列
である。
【図２】図２は、本発明の発現ベクターｐＭＪ１２を段
階的に構築するための戦略を表すスキームである。
階的に構築するための戦略を表すスキームである。
【図３】図３は、発現ベクターｐＭＪ１２の電気泳動パ
ターンを示す写真である。
ターンを示す写真である。
【図４】図４は、ｐＭＪ１２を有する大腸菌ＨＢ１０１
の増殖パターンを示すグラフである。
の増殖パターンを示すグラフである。
【図５】図５は、ｐＭＪ１２を有する大腸菌ＨＢ１０１
から精製したＰＡＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す
写真である。
から精製したＰＡＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す
写真である。
【図６】図６は、ｐＭＪ１２を有する大腸菌ＨＢ１０１
から精製されたＰＡＰのウェストンブロット分析を示す
写真である。
から精製されたＰＡＰのウェストンブロット分析を示す
写真である。
【図７】図７は、ウサギ網状赤血球溶血系を使用した、
ルシフェラーゼＲＮＡのin vitro翻訳のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅパターンを示す写真である。
ルシフェラーゼＲＮＡのin vitro翻訳のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅパターンを示す写真である。
【図８】図８は、ｐＦＬＡＧ−１TM発現ベクターを示
す。
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＹ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 崔 奎煥 大韓民国ソウル特別市江西区登村洞ワール ド エイピーティー，４棟507号 (72)発明者 李 寛鎬 大韓民国ソウル特別市永登浦区堂山洞江南 マンション エイピーティー，19棟506号 (72)発明者 金 萬根 大韓民国ソウル特別市永登浦区文来洞菊花 エイピーティー，２棟1007号
Claims (5)
- 【請求項１】 アメリカヤマゴボウの抗ウィルス性タン
パク質遺伝子を含み、微生物においてアメリカヤマゴボ
ウの抗ウィルス性タンパク質遺伝子を発現させることが
できる組換え発現ベクター。 - 【請求項２】 組換え発現ベクターがｐＭＪ１２であ
る、請求項１記載の組換え発現ベクター。 - 【請求項３】 請求項１記載の組換え発現ベクターで形
質転換された大腸菌ＨＢ１０１。 - 【請求項４】 請求項３記載の大腸菌ＨＢ１０１を培養
し、培養物からアメリカヤマゴボウの抗ウィルス性タン
パク質を採取することを特徴とする、アメリカヤマゴボ
ウの抗ウィルス性タンパク質の製造方法。 - 【請求項５】 請求項４記載の製造方法で製造されたこ
とを特徴とする、アメリカヤマゴボウの組換え抗ウィル
ス性タンパク質。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR93-12360 | 1993-07-02 | ||
| KR1019930012360A KR960015747B1 (ko) | 1993-07-02 | 1993-07-02 | 양자리공의 항바이러스성 단백질(pap)을 발현하는 미생물 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0767660A true JPH0767660A (ja) | 1995-03-14 |
| JP2531930B2 JP2531930B2 (ja) | 1996-09-04 |
Family
ID=19358572
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5337947A Expired - Lifetime JP2531930B2 (ja) | 1993-07-02 | 1993-12-28 | アメリカヤマゴボウの抗ウィルス性タンパク質を発現する微生物 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5648234A (ja) |
| EP (1) | EP0637591A3 (ja) |
| JP (1) | JP2531930B2 (ja) |
| KR (1) | KR960015747B1 (ja) |
| AU (1) | AU662844B2 (ja) |
| CA (1) | CA2102859C (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR970001565B1 (ko) * | 1993-08-28 | 1997-02-11 | 장기하 | 섬자리공 항바이러스성 단백질(pip) 유전자 및 이를 발현하는 미생물 |
| KR970007864B1 (ko) * | 1994-07-21 | 1997-05-17 | 진로 주식회사 | 섬자리공의 항바이러스성 단백질(pip)을 발현하는 식물체의 제조방법 |
| KR970074934A (ko) * | 1996-05-22 | 1997-12-10 | 문상목 | 섬자리공 항바이러스성 단백질의 신규한 유전자 및 그를 발현하는 재조합 미생물 |
| CN110016470A (zh) * | 2019-05-09 | 2019-07-16 | 江苏森瑞谱生物制药有限公司 | 一种从商陆中提取纯化商陆抗病毒蛋白的方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57106625A (en) * | 1980-12-22 | 1982-07-02 | Teijin Ltd | Cytotoxic protein complex and its preparation |
| US5101025A (en) * | 1989-04-04 | 1992-03-31 | Genelabs Incorporated | Recombinant trichosanthin and coding sequence |
| AU8842291A (en) * | 1990-10-09 | 1992-04-28 | American Biosciences, Inc | A plant protein useful for treating tumors and hiv infection |
| US5376546A (en) * | 1991-11-04 | 1994-12-27 | Xoma Corporation | Analogs of ribosome-inactivating proteins |
| KR970001565B1 (ko) * | 1993-08-28 | 1997-02-11 | 장기하 | 섬자리공 항바이러스성 단백질(pip) 유전자 및 이를 발현하는 미생물 |
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1993
- 1993-07-02 KR KR1019930012360A patent/KR960015747B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1993-11-10 CA CA002102859A patent/CA2102859C/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-11-11 AU AU50642/93A patent/AU662844B2/en not_active Ceased
- 1993-11-26 EP EP93119118A patent/EP0637591A3/en not_active Withdrawn
- 1993-12-28 JP JP5337947A patent/JP2531930B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-11-21 US US08/342,786 patent/US5648234A/en not_active Expired - Fee Related
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| Title |
|---|
| BIOTECHNIQUES=1992 * |
| HYBRIDOMA=1992 * |
| PLANT MOLECULAR BIOLOGY=1991 * |
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|---|---|
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| AU5064293A (en) | 1995-01-19 |
| KR950003445A (ko) | 1995-02-16 |
| JP2531930B2 (ja) | 1996-09-04 |
| AU662844B2 (en) | 1995-09-14 |
| EP0637591A3 (en) | 1995-05-24 |
| US5648234A (en) | 1997-07-15 |
| CA2102859A1 (en) | 1995-01-03 |
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| EP0637591A2 (en) | 1995-02-08 |
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