KR20030022921A

KR20030022921A - 소테이즈 변형체 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR20030022921A
Application number: KR1020010055772A
Authority: KR
Inventors: 조중명; 이태규; 노성구; 전영호; 황광연; 김진환
Original assignee: 크리스탈지노믹스(주)
Priority date: 2001-09-11
Filing date: 2001-09-11
Publication date: 2003-03-19

Abstract

본 발명은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 소테이즈(sortase) 단백질의 N 말단이 결손된 소테이즈 변형체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 소테이즈 변형체는 소테이즈의 기능과 활성을 유지하면서도 결정화도가 우수하여 이의 3차 구조를 이용한 신약개발에 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

소테이즈 변형체 및 이의 제조 방법{SORTASE VARIANT AND METHOD FOR THE PREPARATION THEREOF}

본 발명은 새로운 항생제 표적 단백질인 소테이즈의 변형체 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 X-선과 NMR로 소테이즈의 3차 구조를 규명하고자 할 때, 구조분석이 용이하도록 N 말단 부위의 소수성 부위인 세포막 삽입 부분(transmembrane region)과 기타 단백질 결정 형성을 방해하는 불필요한 부분을 제거한 소테이즈 변형체 및 이를 대장균에서 발현시켜 제조하는 방법에 관한 것이다.

병원균의 항생제에 대한 내성 문제는 심각한 상황으로 병원에서 분리되는 임상 균주들은 대부분의 항생제에 대해 내성을 갖고 있어 이들에 의한 감염증을 치료하기가 매우 힘들게 되었다(Gold, S. H., 1996,N. Engl. J.Med. 335:1445). 더우기 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스 (MRSA)와 메티실린-내성 응고효소-음성 스타필로코커스(MRSE)로 대표되는 내성 균주들은 이제 이들의 감염증에 유일하게 사용되는 반코마이신에 대해서도 내성을 나타내고 있다(Sieradzki, K.등, 1999, N.Engl. J. Med., 340:517). 그러므로, 이들 내성 병원균의 약제 저항성을 극복할 새로운 개념의 치료제 개발이 절실하다고 하겠다.

항생제 내성을 많이 나타내는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)등의 그램 양성균은 펩티도글리칸(peptidoglycan)이라는 세포벽으로 둘러싸여 있는데, 이 세포벽에는 세포벽에 부착되어 표면으로 발현되는 여러 종류의 표면단백질(surface protein)이 있는 것으로 알려져 있다. 이 단백질들은 이들 병원균이 인체에 감염될 때 필수적인 역할을 하는데, 인체 세포와의 접촉을 도와 주며 면역계를 피할 수 있게 함으로써 감염이 쉽도록 하여 발병을 일으키게 한다고 한다 (Navarre, W.W. 및 Schneewind, O., 1999,Microbial. Mol. Biol. Rev., 63:174). 이들 표면 단백질은 N 말단의 시그널펩티드(signal peptide)와 C 말단의 소팅 시그널(sorting signal)로 구성된 상호 유사한 구조를 가지고 있다. 특히, C 말단의 소팅 시그널(sorting signal)은 LPXTG라는 공통 모티프(motif) 즉, 20여 개의 아미노산으로 이루어진 소수성 부분 그리고 양전하를 띠는 아미노산으로 이루어져 있다. 스타필로코커스 아우레우스에는 LPXTG 모티프를 가진 표면 단백질이 약 10가지 정도 있는 것으로 보고가 되어 있으며, 예를 들면 단백질 A, 클럼핑 인자(clumping factor), 피브로넥틴-결합 단백질(fibronectin-binding protein) 등이 있고(Josefsson, E. 등, 1998,Microbiology, 144:3387), 그램 양성균은 전체적으로는 약 60여가지가 발견되었으며 그 수가 점차 증가하고 있는 것으로 보고되어 있다 (Navarre, W.W. 및 Schneewind, O., 1999,Microbial. Mol. Biol. Rev.,63:174). 표면단백질이 세포 표면으로 이동되어 세포벽에 부착되는 메커니즘(sorting reaction mechanism)은 이미 알려져 있는데 소팅될 단백질이 세포막을 통과할 때 양전하를 띤 아미노산 부분이 정지 신호 역할을 하여 통과를 멈추게 하고 소수성 부분은 세포막에 고착되게 된다. 표면단백질의 C 말단이 고정된 후 트랜스펩티데이션(transpeptidation) 반응이 일어나는데, 효소에 의해 LPXTG 모티프의 트레오닌(threonine)과 글리신(glycine) 사이의 아미드 결합이 끊어지고 이렇게 해서 생긴 트레오닌의 유리 카복실기와 세포벽 펩티도글리칸의 가교 역할을 하는 펜타글리신 등의 유리 아미노기가 결합을 하여 표면 단백질을 세포벽에 부착하게 된다(Schneewind, O., 1995,Science268:103). 이때 LPXTG 모티프의 트레오닌과 글리신 사이의 아미드 결합을 끊어주고 세포벽에 이어주는 역할을 하는 효소가 바로 srtA(surface protein sorting A)라고 하는 소테이즈 (Sortase)이다.

소테이즈는 206개의 아미노산으로 이루어진 단백질로 이미 그 기능과 속성은 쉬니빈트(Schneewind) 그룹의 여러 실험을 통해 밝혀지고 확인되었다 (P. N. A. S.,1999, 96:12424;Science,1999, 285:760;J.B.C., 2000, 275:9876). 소테이즈는 데이터베이스 검색을 통해 스타필로코커스외에 스트렙토코커스, 엔테로코커스 등 대부분의 그램 양성균에서 유사 시퀀스가 발견되었고 효소 활성에 매우 중요하다고 밝혀진 184번 아미노산 위치의 시스테인기 또한 공통적으로 가지고 있는 것이 밝혀졌다 (Cossart, P. 및 Jonquieres, R., 2000,P. N. A. S.,97:5013). 그리고 동물 실험을 통해 소테이즈가 없는 스타필로코커스 아우레우스는 동물에서의 감염력이 현저히 떨어짐을 보고하여 스타필로코커스 아우레우스를 포함한 모든 그램 양성균에 필수적인 효소임이 밝혀졌고, 따라서 그램 양성균에 대한 새로운 항생제에 훌륭한 표적 단백질이 될 것으로 여겨지고 있다 (Mazmanian, S. 등, 2000,P. N. A. S., 97:5510).

전세계적으로 심각한 문제인 항생제 내성 문제를 해결하기 위해서는 대규모로 항생제 후보 물질을 스크리닝하는 종래의 무작위적인 접근 방법에서 벗어나 새로운 항생제 표적 단백질의 발굴과 함께 표적 단백질의 구조와 반응 원리를 규명하여 보다 효과적인 치료제를 설계하는 체계적인 접근 방식으로 발전해 나가야 할 것이다 (Trias, J 등, 1997,Curr. Opin. Biotechnol., 8:757).

신약 후보 물질을 설계하기 위해서는 단백질의 3차 구조를 밝히는 것이 필수적이며 단백질의 3차 구조를 알기 위해서는 먼저 좋은 물성을 가진 단백질을 만드는 것이 필요하다.

이에 본 발명자들은 항생제 내성 문제를 극복할 수 있는 신개념의 항생제 표적 단백질인 소테이즈의 3차 구조를 규명하고자 소테이즈의 3차 구조와 기능에 나쁜 영향을 주지 않는 범위에서 단백질의 N 말단 부위를 제거하여 단백질의 물성을 증진시키고자 하여 본 발명에 이르게 되었다.

지금까지 소테이즈 단백질의 결정 형성에 대해서는 전 세계적으로 보고된 바가 없다.

본 발명의 목적은 소테이즈 기능과 활성 부위의 3차원 구조를 유지하면서 결정화도가 우수한 소테이즈 변형체 및 이를 코드하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 벡터 및 이 벡터로 형질 전환된 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환된 미생물을 이용하여 소테이즈 변형체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 소테이즈 유전자를 본 발명의 대장균 발현벡터 pQE30-SrtAN30, pQE30-SrtAN44 또는 pQE30-SrtAN66로 클로닝한 과정을 도시한 것이고,

도 2는 본 발명의 대장균 발현벡터 pQE30-SrtAN30, pQE30-SrtAN44 또는 pQE30-SrtAN66로 형질 전환된 대장균을 배양하여 얻은 세포 침전물을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기 영동한 결과를 나타낸 것이고,

도 3은 본 발명의 대장균 발현벡터 pQE30-SrtAN30, pQE30-SrtAN44 그리고 pQE30-SrtAN66으로 형질 전환된 대장균을 배양하여 얻은 세포 침전물로부터 소테이즈 단백질을 정제한 후 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기 영동한 결과를 나타낸 것이며,

도 4는 정제된 소테이즈 단백질의 활성 여부를 알아보기 위해 효소 역가를 측정한 그림이고,

도 5는 정제된 소테이즈 단백질 중 N66으로부터 얻어진 단백질 결정 사진이다.

본 발명은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 소테이즈(sortase) 단백질의 N 말단이 결손된 소테이즈 및 이를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

추가적으로, 대장균을 소테이즈 발현에 적합한 조건에서 배양하고, 소테이즈가 발현된 대장균 세포를 완충용액에서 파쇄하고, 원심분리한 상층액을 니켈-니트릴로트리아세틱액시드(Ni-NTA) 칼럼과 젤-필트레이션 칼럼을 이용하여 정제함으로써 소테이즈 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 소테이즈 변형체는 소테이즈 N-말단의 소수성(hydrophobic) 및 유동성(flexible)의 물성을 개선시킬 목적으로 소테이즈의 N 말단으로부터 세포막 삽입부분과 기타 불필요한 부분을 포함하는 아미노산 잔기를 결손시킨 것이며, 28개 내지 72개의 아미노산을 결손시키는 것이 바람직하다.

본 발명의 실시예에서 제조된, N 말단으로부터 각각 29개, 43개, 65개의 아미노산이 결손된 변형체들을 예시할 수 있다.

N 말단의 결손 정도를 결정하기 위해 더블트위스트(DoubleTwist)사의 펩툴(Peptool) 프로그램을 이용하여 단백질의 2차 예상 구조와 각종 데이터베이스, 즉 ExPASy, NCBI, ERGO(http://wit.integratedgenomics.com/Igwit)에서 얻은 단백질 도메인 분석 자료, 그리고 바실러스(Bacillus), 클로스트리디움(Clostridium), 락토바실러스(Lactobacillus), 스트렙토코커스(Streptococ cus), 악티노마이세스(Actinomyces) 등의 여러 균주에서 아미노산 유사성을 비교하여 소수성 부분과 아미노산 유사성이 떨어지는 비공통 부분을 제거할 수 있다.

상기 소테이즈 변형체를 코드하는 폴리뉴클레오티드는 공지된 스트렙토코커스 아우레우스로부터 소테이즈 유전자의 정보를 이용하여 각각의 변형체를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 5-말단과 3-말단에 대응하는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, 이하 PCR이라 함)용 프라이머(primer)를 고안하여 합성한 후, 스트렙토코커스 아우레우스의 소테이즈 유전자를 주형으로 한 PCR에 의하여 제조할 수 있다.

폴리뉴클레오티드의 5-말단에 대응하는 프라이머는 대장균 발현 벡터로 클로닝(cloning)이 용이하도록 제한효소인지 부위가 존재하고 3-말단에 대응하는 프라이머에는 제한효소인지 부위와 종료 코돈을 만들어 단백질 합성이 인위적으로 종료하도록 만든다. 이때 5-말단에 대응하는 프라이머는 N-말단의 아미노산을 제거하도록 제조한다. 즉 srtA 유전자의 코돈(codon)을 토대로 N 30은 아미노산이 아스파틱산-아스파라진-티로신으로 시작하도록 하고 N 44는 글루타민-티로신-아스파틱산으로 시작하도록 하며 N 66은 프롤린-라이신-아스파틱산으로 시작하도록 프라이머를 제조한다.

스트렙토코커스 아우레우스의 cDNA를 주형으로 하여 PCR 반응에 의해 소테이즈 변형체를 코드하는 DNA를 증폭한다. 증폭된 DNA를 제한효소로 절단하여 얻은 유전자 단편을 적절한 대장균 발현 벡터, 예를 들어, pQE30 (Quiagen사, USA)에 삽입한다. 이렇게 하여 만든 재조합 벡터로 적절한 숙주 대장균, 예를 들어, 대장균 BL21(DE3)(Novagen Inc. USA)을 형질전환시킨 후 유전자의 발현에 적당한 조건에서대장균을 배양한다. 단백질의 생성여부는 통상적으로 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동이나 웨스턴블롯팅 방법으로 확인한다.

재조합 소테이즈 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 대장균을 엠피실린이 함유된 루리아 배지에서 진탕 배양하여 일정한 세포 농도(600nm에서의 흡광도가 0.5에서 1.0 사이)에 이르렀을 때, IPTG (isopropyl-β-D-galactopyranoside)를 첨가하여 소테이즈의 발현을 유도한다. 상기 배양액을 원심분리하여 대장균 세포를 침전시킨 후, 대장균을 적당한 완충용액에 현탁한 후 파쇄한다. 단백질이 녹아 있는 상층액을 원심분리한 후, 이온 교환 수지 컬럼, 친화성 결합 수지 컬럼, 겔 여과 컬럼, 크기-배제 컬럼 등을 이용한 통상적인 크로마토그래피 기술들을 적절히 이용하여 소테이즈 변형체를 분리할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 좀더 상세히 설명하고자 한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 위한 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 소테이즈 N30(SrtAN30) 유전자의 증폭 및 발현

단계 1: 소테이즈 N30(SrtAN30) 유전자의 증폭

스타필로코커스 아우레우스의 소테이즈에 대한 서열정보(ExPASy Accession Number Q9S446; 서열번호 1 및 2)를 근거로 하여 N-말단이 아미노산 30번(아스파르트산)으로부터 시작되는 SrtAN 30의 유전자를 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, 이하 PCR)을 통해 합성하고 증폭하기 위해 2개의 프라이머 올리고 뉴클레오티드를 다음과 같은 과정으로 고안하여 핵산 합성기를 이용하여 합성하였다.

서열번호 3 : 5-GGCCGGATCCGATAATTATCTTCACGATAAAGATAAAGATG-3'

서열번호 3의 염기서열을 가지는 시발체는 BamHI 제한효소 인지부위(밑줄)에 해당하는 염기서열을 포함하고, 서열번호 4의 염기서열을 가지는 시발체는 종결 코돈(박스), 제한효소 SalI 인지부위(밑줄)에 해당하는 염기서열을 포함한다.

스타필로코커스 아우레우스(ATCC 6538P)의 cDNA를 주형으로 하기와 같은 과정으로 PCR을 수행하였다.

스타필로코커스 아우레우스 DNA 1㎕, 2㎕의 10mM dNTP(최종농도: 0.2mM), 각 3㎕의 5 μM 서열번호 3 및 서열번호 4의 시발체(최종농도: 0.3μM), HotStarTaq DNA 중합효소 0.5㎕ (5U/㎕, Quiagen, U.S.A), 10㎕ PCR 완충용액(Quiagen)에 80.5㎕의 증류수를 넣어 반응액을 제조하였다. 상기 반응액을 95℃에서 15분 동안 반응시키고, 94℃에서 1분 30초, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초의 반응을 30회 반복한 후, 72℃에서 10분간 추가로 반응시켰다. 반응용액을 1% 아가로즈 젤에서 전기영동법으로 분리하여 약 500 염기쌍의 SrtAN30 유전자를 용출하여 얻었다. 이 용출액 16㎕에 10배의 제한효소 반응 완충용액 2㎕와 제한효소 BamHI과 SalI을 1㎕씩 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후 이 반응용액을 1% 아가로즈 젤에서 전기영동법으로 분리하여 원하는 DNA 절편을 추출한 후 50 ㎕의 증류수용액에 용존시켰다 (이하 "SrtN30-D B/S"라 함).

단계 2: SrtAN30를 포함하는 발현벡터의 제조

플라스미드 pQE30(5U/㎕, Quiagen, USA)을 제한효소 BamHI과 SalI를 이용하여 완전히 절단하고 1% 아가로즈 젤 상에서 약 3400 염기쌍 절편을 분리하였다(이하 "pQE30 B/S"라 함). 단계 1에서 얻은 SrtN30-D B/S 6㎍을 위의 플라스미드 벡터 pQE30 B/S 3㎍과 함께 반응튜브에 넣은 후, 2㎕의 10배 연결반응용액 (500mM 트리스-염산, pH 7.8, 100mM 염화마그네슘, 100mM DTT, 10mM ATP), 10U의 T4 DNA 리가제를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 이 반응용액을 대장균 DH5α 컴피턴트(competent) 세포에 첨가하여 형질 전환시킨 다음, 50㎍/ml의 LB를 포함하는 암피실린 배지(1% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% 염화나트륨)에 평판하여 대장균 형질전환체를 선별하였다. 이들로부터 플라스미드를 추출하고 제한효소 및 염기서열 분석에 의해 플라즈미드 pQE30-SrtAN30을 얻었다.

상기에서 얻은 재조합 플라스미드에 클로닝된 SrtAN30 유전자의 염기서열 확인은 Sanger 등 (Sanger, F., et al. (1977). PNAS U.S.A, 74, 5463)의 방법에 따라 Big-Dye Cycle Sequencing System (Applied Biosystems, U.S.A)을 이용하여 수행하였고 ABI 377 DNA 염기서열 분석기에 의해 분석하였다.

단계 3: SrtAN30의 대장균에서의 발현

상기 단계 2에서 얻은 발현 벡터 pQE30-SrtAN30을 발현 숙주인 대장균 BL21(DE3)(Novagen Inc. USA)에 형질전환시켰다.

형질전환된 대장균 균주를 100㎍/ml의 암피실린이 함유된 LB 배지에서 12시간 동안 진탕 배양한 후 이중 1ml을 100ml의 LB 배지(100 ㎍/ml의 암피실린 함유)에 옮겨 37℃에서 배양액의 흡광도가 600nm에서 약 0.5 정도가 될 때 IPTG를 최종농도가 1mM이 되도록 첨가하였다. IPTG 첨가전과 첨가한 지 4시간 후에 각각 1ml씩 취하고 10,000g에서 2분간 원심분리하여 각각 세포 침전물을 수거하였다 (도 1).

수거한 침전물을 램리 등의 방법(Laemmli 등, 1970,Nature, 227: 680)에 따라 15 % SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동시킨 후 쿠마지블루(Coomasie Brilliant Blue, Bio-Rad 161-0400)로 단백질을 염색하여 분석하였다. 그 결과는 도 2의 2열에 나타나 있고, 이로부터 소테이즈 N30의 발현을 확인하였다.

실시예 2: 소테이즈 N44(SrtAN44) 및 N66(SrtAN66) 유전자의 증폭 및 발현

스타필로코커스 아우레우스의 소테이즈에 대한 서열정보를 근거로 하여 N-말단이 아미노산 44번(글루타민)으로부터 시작되는 소테이즈 N44의 유전자와 N-말단이 아미노산 66번(프롤린)으로부터 시작되는 소테이즈 N66의 유전자를 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, 이하 PCR)을 통해 합성하고 증폭하기 위해 각각의 프라이머 올리고 뉴클레오타이드를 다음과 같은 과정으로 핵산 합성기를 이용하여 합성하였다.

서열번호 5 : 5-GGCCGGATCCCAATATGATAAAAATGTAAAAGAACAGG-3'

서열번호 6 : 5- GGCCGGATCCCCGAAAGATAAATCGAAAGTGGCAGGCTAT-3'

서열번호 5와 6의 염기서열을 가지는 시발체는 BamHI 제한효소 인지부위(밑줄)에 해당하는 염기서열을 포함한다.

실시예 1에서 제조한 발현 벡터 pQE30-SrtAN30을 주형으로 해서 다음의 과정으로 PCR을 수행하였다. SrtAN44의 경우에는 pQE30-SrtAN30 1㎕, 2㎕의 10mM dNTP(최종농도:0.2mM), 각 3㎕의 5μM 서열번호 5 및 서열번호 4의 시발체(최종농도: 0.3 μM), HotStarTaq DNA 중합효소 0.5㎕ (5U/㎕, Quiagen, USA), 10㎕ PCR 완충용액(Quiagen)에 80.5㎕의 증류수를 넣어 반응액을 제조하였고, SrtAN66의 경우에는 같은 조건에서 시발체 5만 시발체 6으로 대치하여 반응액을 제조하였다. 상기 반응액을 95℃에서 15분 반응시키고, 94℃에서 1분 30초; 55℃에서 1분; 72℃에서 1분 30초의 반응을 30회 반복하였다. 반응용액을 1% 아가로즈 젤에서 전기영동법으로 분리하여 각각 약 500 과 400 염기쌍의 소테이즈의 유전자를 얻었다. 증류수에 녹인 소테이즈 단편 16㎕에 10배의 제한효소 반응 완충용액 2㎕와 제한효소 BamHI과 SalI을 1㎕씩 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후 이 반응용액을 1% 아가로즈 젤에서 전기영동법으로 분리하여 원하는 DNA 절편을 추출한 후 50㎕의 증류수 용액에 용존시켰다(이하 "SrtN44-D B/S"와 "SrtN66-D B/S"라 함).

상기와 같은 공정을 통하여 얻어진 SrtN44-D B/S 와 SrtN66-D B/S DNA 단편을 이용하여 실시예 1의 단계 2 및 3과 같이 발현 벡터를 제조하고 대장균에 형질전환 시킨 후 배양하여 SDS-PAGE로 발현을 확인하였다. 그 결과는 도 2의 4열 및 6열에 나타나 있고, 이로부터 소테이즈 N44 및 N66의 발현을 확인하였다.

실시예 3: 소테이즈 (SrtAN30, SrtN44 and SrtN66) 단백질의 정제

단계 1: 대장균 세포의 배양 및 파쇄

실시예 1 및 2에서 제조된 소테이즈를 발현하는 대장균 세포들을 각각 실시예 1의 단계 3과 같은 방법으로 2 리터 규모로 배양한 후, 원심 분리기를 이용하여6,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 대장균 세포 침전물을 수거하고 50mM Tris-염산완충액(pH 7.5), 150mM 염화나트륨 조성의 완충용액에 현탁시킨 다음, 얼음중탕에서 초음파 분쇄기(Sonic Dismembrator, Fisher, 미국)를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 이 용액을 원심분리기로 16,000rpm에서 30분간 원심 분리한 후 그 상층액을 다음 과정에 이용하였다.

단계 2: 컬럼 크로마토그래피에 의한 정제

단계 1에서 얻은 상층액을 상기의 완충용액으로 미리 평형된 니켈-니트릴로트리아세트 산(Ni-NTA) 칼럼(파마시아, 미국)에 결합시킨 후, 상기 완충액을 용출액으로 하고, 0-0.5M 이미다졸 농도구배를 이용하여 용출한 후, SDS-PAGE로 소테이즈 단백질을 함유하는 분획을 확인하여 모은 후 다음 과정에 이용하였다. 상기 과정에서 얻은 소테이즈 단백질 분획을 5ml 정도로 농축하여 50mM Tris pH 7.5, 150mM 염화나트륨, 10% 글리세롤, 3mM DDT 조성의 완충용액으로 평형된 여과 칼럼(Superdex 75, 26/60, 파마시아)에 주입시킨 후, 상기 완충액으로 용출시켜 단백질의 분자량에 의해 분리하였다. SDS-PAGE로 소테이즈 단백질을 함유하는 분획을 확인한 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서, M 은 표준 분자량 크기이며, 1 - 4 열은 대장균에서 발현을 확인한 그림으로 1열은 IPTG로 유도(induction)하기 전의 전체세포용해물이며, 2, 3, 4열은 각각 IPTG로 유도한 후 3시간 경과 후의 SrtAN30, SrtN44, SrtN66의 발현 그림이며, 5-7열은 각각 고순도로 정제된 SrtAN30, SrtN44, SrtN66 단백질의 그림이다.

실시예 4: 소테이즈 (SrtAN30, SrtN44 and SrtN66) 단백질의 역가 측정

실시예 3에서 얻은 정제된 소테이즈 효소의 활성 유지 여부를 알아보기 위해 효소 역가를 측정하였다. 50mM Tris pH 7.5, 150mM 염화나트륨, 5mM 염화칼슘의 반응 완충액에 반응기질인 형광 펩타이드(Dapsyl-QALPETGEE -Edans)를 10μM 넣었다. 여기에 소테이즈를 15 μM를 넣고 형광 측정기안에서 37℃의 온도를 유지하면서 50분간 반응시키며 형광을 측정하였다. 이때 여기/방출 주파수(Exitation/Emission wavelength)는 355nm/485nm이었다. 양성 대조군으로 이미 역가가 증명된 N26 소테이즈(JBC 2000, 275, p9876)를 사용하였고 N26과 실시예 3에서 정제된 소테이즈 단백질의 역가를 비교하였다. 그 결과 소테이즈의 N30, N44 및 N66은 N26과 유사한 역가를 보였고 N-말단 결손이 역가에는 아무 영향을 미치지 않음을 확인하였다 (도 4).

실시예 5. 소테이즈 단백질(Srt N66)의 정제 및 결정화

N-말단 결손이 효소 역가에는 영향을 미치지 않고 효소 활성을 유지하면서도 단백질 결정 형성에 유리함을 입증하기 위하여, 실시예 3에서 얻은 정제된 소테이즈 단백질(Srt N66)을 얻은 후, 다음과 같은 방울 혼합 증기 평형법에 의해 결정화하였다.

50 mM Tris-HCl (pH 7.2), 150 mM NaCl, 3 mM DTT로 구성된 용액에 소테이즈를 넣고 단백질 농도를 20mg/ml로 조절하여 단백질 용액을 제조하였다. 최종 단백질 농도는 브랫포드 방법에 의해 결정하였다.

구체적으로는 실리콘으로 코팅된 유리 슬라이드 표면에 소테이즈 단백질 용액 2㎕와 저수조 용액, 0.1M 초산 완충액(pH 5.6) 및 2.6M 황산 암모늄2㎕의 혼합용액을 접촉시키고, 이 슬라이드를 저수조 용액 0.5 ml가 들어 있는 플레이트 위에 덮어 22℃ 항온 상태에서 보관하였다. 3일 후에 시드(seed) 결정이 생기고 일주일 후에 그 결정의 크기가 0.4 x 0.15 x 0.15 mm로 자랐으며 모양은 육각 피라미드 모양으로 공간군이 육각형 공간군을 나타내었다. 생성된 결정 사진을 니콘 카메라로 찍은 사진은 도 5에 나타내었다.

본 발명의 소테이즈 변형체는 소테이즈의 기능과 활성을 유지하면서 결정화도가 우수하여, 이의 3차 구조를 이용한 신약 개발에 효과적으로 이용될 수 있다.

Claims

스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 소테이즈(sortase) 단백질의 N 말단이 결손된 소테이즈 변형체.
제 1 항에 있어서,

소테이즈 단백질의 N말단으로부터 28개 내지 72개의 아미노산이 결손된 소테이즈 변형체.
제 1 항에 있어서,

소테이즈 단백질의 N말단 29개 아미노산이 결손된 소테이즈 변형체.
제 1 항에 있어서,

소테이즈 단백질의 N말단 43개 아미노산이 결손된 소테이즈 변형체.
제 1 항에 있어서,

소테이즈 단백질의 N말단이 65개 아미노산이 결손된 소테이즈 변형체.
제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한항의 변형체를 코드하는 폴리뉴클레오티드.
제 6 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 소테이즈 발현 벡터.
제 7 항에 있어서,

발현 벡터 pQE30-SrtAN30, pQE30-SrtAN44 및 pQE30-SrtAN66로 이루어진 군으로부터 선택된 발현 벡터.
제 7 항의 발현 벡터로 형질전환된 대장균.
제 9 항에 있어서,

대장균 BL21(DE3) pQE30-SrtAN30, 대장균 BL21(DE3) pQE30-SrtAN44 및 대장균 BL21(DE3) pQE30-SrtAN66로 이루어진 군으로부터 선택된 대장균.
제 9 항의 대장균을 소테이즈 발현에 적합한 조건에서 배양하고, 대장균 세포를 완충용액에서 파쇄하고, 원심분리한 상층액을 니켈-니트릴로트리아세트산 (Ni-NTA)칼럼과 젤-여과 칼럼을 이용한 크로마토그래피에 의해 정제하는 단계를 포함하는, 제1항의 소테이즈 변형체를 제조하는 방법.