KR20010043797A - 세포 분리 장치 및 분리 방법 - Google Patents

세포 분리 장치 및 분리 방법 Download PDF

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KR20010043797A
KR20010043797A KR1020007013223A KR20007013223A KR20010043797A KR 20010043797 A KR20010043797 A KR 20010043797A KR 1020007013223 A KR1020007013223 A KR 1020007013223A KR 20007013223 A KR20007013223 A KR 20007013223A KR 20010043797 A KR20010043797 A KR 20010043797A
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seq
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amino acid
ser
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KR1020007013223A
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미쯔하루 오노
다까유끼 소까
찌까오 모리모또
고이찌 미야무라
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아사히 메디칼 가부시키가이샤
야마모토 카즈모토
아사히 가세이 가부시키가이샤
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
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Abstract

본 발명은 인간 조혈 미분화 세포의 CD (Cluster differentitation) 양성 세포를 분리하는 장치와 분리 또는 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 항CD4 항체 또는 항CD34 항체의 유전자를 단리하여 발현시킴으로써 얻어지는, 이들 CD 분자를 인식하는 재조합 항체를 이용하여 이들 CD 양성 세포를 분리하는 장치와 분리 또는 검출 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 조혈 미분화 세포의 수집, 골수 이식용 세포로부터 림프구의 제거, 백혈병 세포의 검출 등 의료 분야에서 효과적으로 이용된다. 또한, 상기 항체를 이용하여 자기면역 질환용 의약 조성물을 제조할 수 있다.

Description

세포 분리 장치 및 분리 방법 {Cell Separation Device and Separation Method}
＜110＞ ASAHIKASEI KOGYO KABUSHIKI KAISHA
ASAHI MEDICAL CO., LTD.
＜120＞ Separating apparatus of cells and separating method
＜130＞ ASAHI-1
＜150＞ 　JP 10/159957
　　　　JP 10/163023
＜151＞ 1998-5-25
　　　　1998-5-26
＜160＞ 48
＜210＞ 1
＜211＞ 5
＜212＞ 　PRT
＜213＞ 　mouse
＜400＞ 1
Asp Tyr Val Ile Asn
1 5
＜210＞ 　2
＜211＞ 17
＜212＞ 　PRT
＜213＞ mouse
＜400＞ 2
Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Glu Met Phe Lys
1 5 10 15
Gly
＜210＞ 　3
＜211＞ 　9
＜212＞ 　PRT
＜213＞ mouse
＜400＞ 　3
Arg Gly Thr Gly Thr Gly Phe Ala Tyr
1 5
＜210＞ 　4
＜211＞ 　15
＜212＞ 　PRT
＜213＞ 　mouse
＜400＞ 　4
Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn
1 5 10 15
＜210＞ 　5
＜211＞ 　7
＜212＞ 　PRT
＜213＞ 　mouse
＜400＞ 　5
Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
＜210＞ 　6
＜211＞ 　9
＜212＞ 　PRT
＜213＞ 　mouse
＜400＞ 　6
Gln Gln Ser Ser Glu Asp Pro Pro Thr
1 5
＜210＞ 　7
＜211＞ 　330
＜212＞ 　DNA
＜213＞ 　mouse
＜400＞ 　7
CCT GAG CTG GTG AAG CCT GGG GCT TCA GTG AAG ATG TCC TGC AAG GCT 48
Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala
1 5 10 15
TCT GGA TAC ACA TTC ACT GAC TAT GTT ATA AAC TGG TTG AAC CAG AGA 96
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Val Ile Asn Trp Leu Asn Gln Arg
20 25 30
ACT GGA CAG GGC CTT GAG TGG ATT GGA GAG ATT TAT CCT GGA AGT GGT 144
Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly
35 40 45
AGT GCT TAC TAC AAT GAG ATG TTC AAG GGC AAG GCC ACA CTG ACT GCA 192
Ser Ala Tyr Tyr Asn Glu Met Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala
50 55 60
GAC AAA TCC TCC AAC ACA GCC TAC ATG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT 240
Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser
65 70 75 80
GAG GAC TCT GCG GTC TAT TTC TGT GCA AGA CGC GGA ACT GGG ACG GGG 288
Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Gly Thr Gly Thr Gly
85 90 95
TTT GCT TAC TGG GGC CGA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA 330
Phe Ala Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
100 105 110
＜210＞ 　8
＜211＞ 　309
＜212＞ 　DNA
＜213＞ 　mouse
＜400＞ 　8
GCT TCT TTG GCT GTG TCT CTA GGG CAG AGG GCC ACC ATC TCC TGC AAG 48
Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys
1 5 10 15
GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AAC TGG TAC 96
Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr
20 25 30
CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATC TAT GCT GCA TCC 144
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser
35 40 45
AAT CTA GAA TCT GGG ATC CCA GCC AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG 192
Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
50 55 60
ACA GAC TTC ACC CTC AAC ATC CAT CCT GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA 240
Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala
65 70 75 80
ACC TAT TAC TGT CAG CAA AGT AGT GAG GAT CCT CCG ACG TTC GGT GGA 288
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly
85 90 95
GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA 309
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100
＜210＞ 　9
＜211＞ 　925
＜212＞ 　DNA
＜213＞ 　mouse
＜400＞ 　9
ATG AAA TAC CTG CTG CCG ACC GCT GCT GCT GGT CTG CTG CTC CTC GCG 48
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAC ATT GTG CTG ACC CAA TCT CCA GCT TCT 96
Ala Gln Pro Ala Met Ala Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser
20 25 30
TTG GCT GTG TCT CTA GGG CAG AGG GCC ACC ATC TCC TGC AAG GCC AGC 144
Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser
35 40 45
CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AAC TGG TAC CAA CAG 192
Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
AAA CCA GGA CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATC TAT GCT GCA TCC AAT CTA 240
Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu
65 70 75 80
GAA TCT GGG ATC CCA GCC AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC 288
Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
TTC ACC CTC AAC ATC CAT CCT GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT 336
Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr
100 105 110
TAC TGT CAG CAA AGT AGT GAG GAT CCT CCG ACG TTC GGT GGA GGC ACC 384
Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr
115 120 125
AAG CTG GAA ATC AAA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCC GGA 432
Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
GGT GGC GGA TCG CAG GTT CAG CTG CAG CAG TCT GGA CCT GAG CTG GTG 480
Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val
145 150 155 160
AAG CCT GGG GCT TCA GTG AAG ATG TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC ACA 528
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
165 170 175
TTC ACT GAC TAT GTT ATA AAC TGG TTG AAC CAG AGA ACT GGA CAG GGC 576
Phe Thr Asp Tyr Val Ile Asn Trp Leu Asn Gln Arg Thr Gly Gln Gly
180 185 190
CTT GAG TGG ATT GGA GAG ATT TAT CCT GGA AGT GGT AGT GCT TAC TAC 624
Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr
195 200 205
AAT GAG ATG TTC AAG GGC AAG GCC ACA CTG ACT GCA GAC AAA TCC TCC 672
Asn Glu Met Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser
210 215 220
AAC ACA GCC TAC ATG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCG 720
Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala
225 230 235 240
GTC TAT TTC TGT GCA AGA CGC GGA ACT GGG ACG GGG TTT GCT TAC TGG 768
Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Gly Thr Gly Thr Gly Phe Ala Tyr Trp
245 250 255
GGC CGA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA GCG GCC GCA GAC TAC AAG 816
Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ala Ala Asp Tyr Lys
260 265 270
GAT GAC GAT GAC AAA GGC TCG AGC GAG CAG AAG CTG ATC AGC GAA GAG 864
Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
275 280 285
GAT CTG GGC TCG AGG TCG ACC CAC CAT CAT CAT CAC CAC GGG TCG ACC 912
Asp Leu Gly Ser Arg Ser Thr His His His His His His Gly Ser Thr
290 295 300
AAA TGA TAA GCT T 925
Lys
305
＜210＞ 10
＜211＞ 925
＜212＞ DNA
＜213＞ mouse
＜400＞ 10
ATG AAA TAC CTG CTG CCG ACC GCT GCT GCT GGT CTG CTG CTC CTC GCG 48
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTT CAG CTG CAG CAG TCT GGA CCT GAG 96
Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu
20 25 30
CTG GTG AAG CCT GGG GCT TCA GTG AAG ATG TCC TGC AAG GCT TCT GGA 144
Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly
35 40 45
TAC ACA TTC ACT GAC TAT GTT ATA AAC TGG TTG AAC CAG AGA ACT GGA 192
Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Val Ile Asn Trp Leu Asn Gln Arg Thr Gly
50 55 60
CAG GGC CTT GAG TGG ATT GGA GAG ATT TAT CCT GGA AGT GGT AGT GCT 240
Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala
65 70 75 80
TAC TAC AAT GAG ATG TTC AAG GGC AAG GCC ACA CTG ACT GCA GAC AAA 288
Tyr Tyr Asn Glu Met Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys
85 90 95
TCC TCC AAC ACA GCC TAC ATG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC 336
Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
100 105 110
TCT GCG GTC TAT TTC TGT GCA AGA CGC GGA ACT GGG ACG GGG TTT GCT 384
Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Gly Thr Gly Thr Gly Phe Ala
115 120 125
TAC TGG GGC CGA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA GGT GGA GGC GGT 432
Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly
130 135 140
TCA GGC GGA GGT GGC TCC GGA GGT GGC GGA TCG GAC ATT GTG CTG ACC 480
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr
145 150 155 160
CAA TCT CCA GCT TCT TTG GCT GTG TCT CTA GGG CAG AGG GCC ACC ATC 528
Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile
165 170 175
TCC TGC AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG 576
Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met
180 185 190
AAC TGG TAC CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATC TAT 624
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
195 200 205
GCT GCA TCC AAT CTA GAA TCT GGG ATC CCA GCC AGG TTT AGT GGC AGT 672
Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
210 215 220
GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC AAC ATC CAT CCT GTG GAG GAG GAG 720
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu
225 230 235 240
GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT CAG CAA AGT AGT GAG GAT CCT CCG ACG 768
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Glu Asp Pro Pro Thr
245 250 255
TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA GCG GCC GCA GAC TAC AAG 816
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ala Ala Ala Asp Tyr Lys
260 265 270
GAT GAC GAT GAC AAA GGC TCG AGC GAG CAG AAG CTG ATC AGC GAA GAG 864
Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
275 280 285
GAT CTG GGC TCG AGG TCG ACC CAC CAT CAT CAT CAC CAC GGG TCG ACC 912
Asp Leu Gly Ser Arg Ser Thr His His His His His His Gly Ser Thr
290 295 300
AAA TGA TAA GCT T 925
Lys
305
＜210＞ 　11
＜211＞ 　28
＜212＞ 　DNA
＜213＞ 　Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single strand DNA primer for PCR
＜400＞ 11
AAGCTTATGA ACCGGGGAGT CCCTTTTA 28
＜210＞ 12
＜211＞ 56
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single strand DNA primer for PCR
＜400＞ 　12
GCGGCCGCTC ACTTGTCATC GTCGTCCTTG TAGTCTGGCT GCACCGGGGT GGACCA
56
＜210＞ 　13
＜211＞ 　34
＜212＞ 　DNA
＜213＞ 　Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single strand DNA primer for PCR
＜400＞ 　13
GGGAATTCAT GRAATGSASC TGGGTYWTYC TCTT 34
＜210＞ 　14
＜211＞ 　35
＜212＞ 　DNA
＜213＞ 　Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single strand DNA primer for PCR
＜400＞ 　14
CCCAAGCTTC CAGGGRCCAR KGGATARACN GRTGG 35
＜210＞ 　15
＜211＞ 　29
＜212＞ 　DNA
＜213＞ 　Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single strand DNA primer for PCR
＜400＞ 　15
TGTGCCCTCG AGCTNACNCA RAGYCCNGC 29
＜210＞ 　16
＜211＞ 　28
＜212＞ DNA
＜213＞ 　Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single strand DNA primer for PCR
＜400＞ 　16
ATGGATACTA GTGGTGCAGC ATCAGCCC 28
＜210＞ 　17
＜211＞ 　33
＜212＞ 　DNA
＜213＞ 　Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single strand DNA primer for PCR
＜400＞ 　17
GGGAATTCAT GGAGACAGAC ACACTCCTGC TAT 33
＜210＞ 　18
＜211＞ 　21
＜212＞ 　DNA
＜213＞ 　Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single strand DNA primer for PCR
＜400＞ 　18
CGTCGGAGGA TCCTCACTAC T 21
＜210＞ 　19
＜211＞ 　27
＜212＞ 　DNA
＜213＞ 　Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single strand DNA primer for PCR
＜400＞ 　19
CAGGATCCGC TGCAGCAGTC TGGACCT 27
＜210＞ 　20
＜211＞ 　27
＜212＞ 　DNA
＜213＞ 　Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single strand DNA primer for PCR
＜400＞ 　20
TGGGCCCGTC GTTTTGGCTG CAGAGAC 27
＜210＞ 　21
＜211＞ 　56
＜212＞ DNA
＜213＞ 　Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single strand DNA primer for PCR
＜400＞ 　21
TCATGAAATA CCTGCTGCCG ACCGCTGCTG CTGGTCTGCT GCTCCTCGCG GCCCAG
56
＜210＞ 　22
＜211＞ 　56
＜212＞ 　DNA
＜213＞ 　Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single strand DNA primer for PCR
＜400＞ 　22
TGCGGCCGCA GCCATGGTGT TTGCGGCCAT CGCCGGCTGG GCCGCGAGGA GCAGCA
56
＜210＞ 　23
＜211＞ 　56
＜212＞ 　DNA
＜213＞ 　Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single strand DNA primer for PCR
＜400＞ 　23
TGCGGCCGCA GACTACAAGG ATGACGATGA CAAAGGCTCG AGCGAGCAGA AGCTGA
56
＜210＞ 　24
＜211＞ 　57
＜212＞ 　DNA
＜213＞ 　Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single strand DNA primer for PCR
＜400＞ 　24
GGTGGGTCGA CCTCGAGCCC AGATCCTCTT CGCTGATCAG CTTCTGCTCG CTCGAGC
57
＜210＞ 　25
＜211＞ 23
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single strand DNA primer for PCR
＜400＞ 　25
TGCGGCCGCA GACTACAAGG ATG 23
＜210＞ 　26
＜211＞ 　56
＜212＞ 　DNA
＜213＞ 　Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single strand DNA primer for PCR
＜400＞ 26
TAAGCTTATC ATTTGGTCGA CCCGTGGTGA TGATGATGGT GGGTCGACCT CGAGCC
56
＜210＞ 　27
＜211＞ 　38
＜212＞ 　DNA
＜213＞ 　Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single strand DNA primer for PCR
＜400＞ 　27
AGCCGGCCAT GGCCGACATT GTGCTGACCC AATCTCCA 38
＜210＞ 　28
＜211＞ 　58
＜212＞ 　DNA
＜213＞ 　Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single strand DNA primer for PCR
＜400＞ 　28
CTCCGGAGCC ACCTCCGCCT GAACCGCCTC CACCTTTGAT TTCCAGCTTG GTGCCTCC
58
＜210＞ 　29
＜211＞ 　40
＜212＞ 　DNA
＜213＞ 　Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single strand DNA primer for PCR
＜400＞ 　29
CTCCGGAGGT GGCGGATCGC AGGTTCAGCT GCAGCAGTCT 40
＜210＞ 　30
＜211＞ 　31
＜212＞ 　DNA
＜213＞ 　Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single strand DNA primer for PCR
＜400＞ 　30
TGCGGCCGCT GCAGAGACAG TGACCAGAGT C 31
＜210＞ 　31
＜211＞ 　35
＜212＞ 　DNA
＜213＞ 　Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single strand DNA primer for PCR
＜400＞ 　31
AGCCGGCCAT GGCCCAGGTT CAGCTGCAGC AGTCT 35
＜210＞ 　32
＜211＞ 　56
＜212＞ 　DNA
＜213＞ 　Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single strand DNA primer for PCR
＜400＞ 　32
CTCCGGAGCC ACCTCCGCCT GAACCGCCTC CACCTGCAGA GACAGTGACC AGAGTC
56
＜210＞ 　33
＜211＞ 　43
＜212＞ 　DNA
＜213＞ 　Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single strand DNA primer for PCR
＜400＞ 　33
CTCCGGAGGT GGCGGATCGG ACATTGTGCT GACCCAATCT CCA 43
＜210＞ 　34
＜211＞ 　33
＜212＞ 　DNA
＜213＞ 　Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Single strand DNA primer for PCR
＜400＞ 　34
TGCGGCCGCT TTGATTTCCA GCTTGGTGCC TCC 33
＜210＞ 　35
＜211＞ 　118
＜212＞ 　PRT
＜213＞ 　mouse
＜400＞ 　35
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Val Ile Asn Trp Leu Asn Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Glu Met Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Thr Gly Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Arg Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
＜210＞ 　36
＜211＞ 　111
＜212＞ 　PRT
＜213＞ 　mouse
＜400＞ 　36
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser
85 90 95
Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
＜210＞ 　37
＜211＞ 　354
＜212＞ 　DNA
＜213＞ 　mouse
＜400＞ 　37
CAG GTT CAG CTG CAG CAG TCT GGA CCT GAG CTG GTG AAG CCT GGG GCT 48
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
TCA GTG AAG ATG TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC ACA TTC ACT GAC TAT 96
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
GTT ATA AAC TGG TTG AAC CAG AGA ACT GGA CAG GGC CTT GAG TGG ATT 144
Val Ile Asn Trp Leu Asn Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
GGA GAG ATT TAT CCT GGA AGT GGT AGT GCT TAC TAC AAT GAG ATG TTC 192
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Glu Met Phe
50 55 60
AAG GGC AAG GCC ACA CTG ACT GCA GAC AAA TCC TCC AAC ACA GCC TAC 240
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
ATG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCG GTC TAT TTC TGT 288
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
GCA AGA CGC GGA ACT GGG ACG GGG TTT GCT TAC TGG GGC CGA GGG ACT 336
Ala Arg Arg Gly Thr Gly Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Arg Gly Thr
100 105 110
CTG GTC ACT GTC TCT GCA 354
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
＜210＞ 　38
＜211＞ 　333
＜212＞ 　DNA
＜213＞ 　mouse
＜400＞ 　38
GAC ATT GTG CTG ACC CAA TCT CCA GCT TCT TTG GCT GTG TCT CTA GGG 48
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
CAG AGG GCC ACC ATC TCC TGC AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT 96
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
GGT GAT AGT TAT ATG AAC TGG TAC CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC 144
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
AAA CTC CTC ATC TAT GCT GCA TCC AAT CTA GAA TCT GGG ATC CCA GCC 192
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC AAC ATC CAT 240
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
CCT GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT CAG CAA AGT AGT 288
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser
85 90 95
GAG GAT CCT CCG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA 333
Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
＜210＞ 　39
＜211＞ 　351
＜212＞ DNA
＜213＞ 　mouse
＜400＞ 　39
CAG GTG CAG CTG AAG CAG TCA GGA CCT GGC CTA GTG CAG CCC TCA CAG 48
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
5 10 15
AGC CTG TCC TTC ATC TGC ACA GTC TCT GGT TTC TCA TTA ACT AGT CAT 96
Ser Leu Ser Phe Ile Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser His
20 25 30
GGT GTA CAC TGG GTT CGC CAG TCT CCA GGA AAG GGT CTG GAG TGG CTG 144
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
GGA GTG ATA TGG GGT GCT GGA AGG ACA GAC TAT AAT GCA GCT TTC ATA 192
Gly Val Ile Trp Gly Ala Gly Arg Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile
50 55 60
TCC AGA CTG AGC ATC AGC AGG GAC ATT TCC AAG AGC CAA GTT TTC TTT 240
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Ile Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
AAG ATG AAC AGT CTG CAA GTT GAT GAC ACA GCC ATA TAT TAC TGT GCC 288
Lys Met Asn Ser Leu Gln Val Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
AGA AAT AGG TAC GAG AGC TAC TTT GAC TAC TGG GGC CAA GGC ACC ACT 336
Arg Asn Arg Tyr Glu Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
TCC CTC ACA GTC TCC 　　 351
Leu Thr Val Ser Ser
115
＜210＞ 　40
＜211＞ 　339
＜212＞ DNA
＜213＞ 　mouse
＜400＞ 　40
GAT GTT GTG ATG ACC CAA ACT CCA CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTT GGA 48
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
5 10 15
GAT CAG GCC TCC ATC TCT TGC AGA TCT AGT CAG AAC CTT GTA CAC AGT 96
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Leu Val His Ser
20 25 30
AAT GGA AAT ACC TAT TTA CAT TGG TAC CTG CAG AAG CCA GGC CAG TCT 144
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
CCA AAT CTC CTG ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT TCT GGG GTC CCA 192
Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAA TTC ACA CTC AAG ATC 240
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT TTC TGC TCT CAA AGT 288
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
ACA CAT GTT CCG CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG GTG GAG CTG AAA 336
Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys
100 105 110
CGG 339
Arg
＜210＞ 　41
＜211＞ 　879
＜212＞ 　DNA
＜213＞ 　mouse
＜400＞ 　41
ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TTT GGA GCC TTT TTT TTG GAG ATT TTC 　 48
Met Thr Met Ile Thr Pro Ser Phe Gly Ala Phe Phe Leu Glu Ile Phe
　　　　　　　　 5 10 15
AAC GTG AAA AAA TTA TTA TTC GCA ATT CCT TTA GTT GTT CCT TTC TAT 　 96
Asn Val Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr
20 25 30
GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTG AAG CTG CAG CAG TCT GGA CCT 　144
Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro
35 40 45
GGC CTA GTG CAG CCC TCA CAG AGC CTG TCC TTC ATC TGC ACA GTC TCT 192
Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Phe Ile Cys Thr Val Ser
50 55 60
GGT TTC TCA TTA ACT AGT CAT GGT GTA CAC TGG GTT CGC CAG TCT CCA 240
Gly Phe Ser Leu Thr Ser His Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro
65 70 75 80
GGA AAG GGT CTG GAG TGG CTG GGA GTG ATA TGG GGT GCT GGA AGG ACA 288
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ala Gly Arg Thr
85 90 95
GAC TAT AAT GCA GCT TTC ATA TCC AGA CTG AGC ATC AGC AGG GAC ATT 336
Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Ile
100 105 110
TCC AAG AGC CAA GTT TTC TTT AAG ATG AAC AGT CTG CAA GTT GAT GAC 384
Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Val Asp Asp
115 120 125
ACA GCC ATA TAT TAC TGT GCC AGA AAT AGG TAC GAG AGC TAC TTT GAC 432
Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Arg Tyr Glu Ser Tyr Phe Asp
130 135 140
TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT 480
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATC GAG CTC ACT 528
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr
165 170 175
CAG TCT CCA CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTT GGA GAT CAG GCC TCC ATC 576
Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile
180 185 190
TCT TGC AGA TCT AGT CAG AAC CTT GTA CAC AGT AAT GGA AAT ACC TAT 624
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
195 200 205
TTA CAT TGG TAC CTG CAG AAG CCA GGC CAG TCT CCA AAT CTC CTG ATC 672
Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Asn Leu Leu Ile
210 215 220
TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT TCT GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGC 720
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
225 230 235 240
AGT GGA TCA GGG ACA GAA TTC ACA CTC AAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT 768
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
245 250 255
GAG GAT CTG GGA GTT TAT TTC TGC TCT CAA AGT ACA CAT GTT CCG CTC 816
Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Leu
260 265 270
ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG GTG GAG CTG AAA CGG GCG GCC GCA GGT 864
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys Arg Ala Ala Ala Gly
　　　 275 280 285
GCG CCG GTG CCG TAT CCG GAT CCG CTG GAA CCG CGT GCC GCA TAG 909
Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Ala Ala
　　290 　　　　　　　　295 　　　　　　　　300
＜210＞ 　42
＜211＞ 　918
＜212＞ 　DNA
＜213＞ 　mouse
＜400＞ 　42
ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TTT GGA GCC TTT TTT TTG GAG ATT TTC 　 48
Met Thr Met Ile Thr Pro Ser Phe Gly Ala Phe Phe Leu Glu Ile Phe
　　　　　　　　 5 10 15
AAC GTG AAA AAA TTA TTA TTC GCA ATT CCT TTA GTT GTT CCT TTC TAT 　 96
Asn Val Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr
20 25 30
GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTG AAG CTG CAG CAG TCT GGA CCT 　144
Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro
35 40 45
GGC CTA GTG CAG CCC TCA CAG AGC CTG TCC TTC ATC TGC ACA GTC TCT 192
Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Phe Ile Cys Thr Val Ser
50 55 60
GGT TTC TCA TTA ACT AGT CAT GGT GTA CAC TGG GTT CGC CAG TCT CCA 240
Gly Phe Ser Leu Thr Ser His Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro
65 70 75 80
GGA AAG GGT CTG GAG TGG CTG GGA GTG ATA TGG GGT GCT GGA AGG ACA 288
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ala Gly Arg Thr
85 90 95
GAC TAT AAT GCA GCT TTC ATA TCC AGA CTG AGC ATC AGC AGG GAC ATT 336
Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Ile
100 105 110
TCC AAG AGC CAA GTT TTC TTT AAG ATG AAC AGT CTG CAA GTT GAT GAC 384
Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Val Asp Asp
115 120 125
ACA GCC ATA TAT TAC TGT GCC AGA AAT AGG TAC GAG AGC TAC TTT GAC 432
Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Arg Tyr Glu Ser Tyr Phe Asp
130 135 140
TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT 480
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATC GAG CTC ACT 528
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr
165 170 175
CAG TCT CCA CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTT GGA GAT CAG GCC TCC ATC 576
Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile
180 185 190
TCT TGC AGA TCT AGT CAG AAC CTT GTA CAC AGT AAT GGA AAT ACC TAT 624
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
195 200 205
TTA CAT TGG TAC CTG CAG AAG CCA GGC CAG TCT CCA AAT CTC CTG ATC 672
Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Asn Leu Leu Ile
210 215 220
TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT TCT GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGC 720
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
225 230 235 240
AGT GGA TCA GGG ACA GAA TTC ACA CTC AAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT 768
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
245 250 255
GAG GAT CTG GGA GTT TAT TTC TGC TCT CAA AGT ACA CAT GTT CCG CTC 816
Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Leu
260 265 270
ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG GTG GAG CTG AAA CGG GCG GCC GCA GGT 864
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys Arg Ala Ala Ala Gly
　　　 275 280 285
GCG CCG GTG CCG TAT CCG GAT CCG CTG GAA CCG CGT GCC GCA AAG 909
Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Ala Ala Lys
　　290 　　　　　　　　295 　　　　　　　　300
AAG AAG TAG 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　918
Lys Lys
　　305
＜210＞ 43
＜211＞ 5
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Amino acid sequence of heavy chain CDR-1
＜400＞ 43
Ser His Gly Val His
＜210＞ 44
＜211＞ 16
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Amino acid sequence of heavy chain CDR-2
＜400＞ 44
Val Ile Trp Gly Ala Gly Arg Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser
1 　　　　　　　5 　　　　　　　　 10 　　　　　　　　 15
＜210＞ 　45
＜211＞ 　9
＜212＞ 　PRT
＜213＞ 　Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Amino acid sequence of heavy chain CDR-3
＜400＞ 　45
Asn Arg Tyr Glu Ser Tyr Phe Asp Tyr
＜210＞ 　46
＜211＞ 　16
＜212＞ 　PRT
＜213＞ 　Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Amino acid sequence of light chain CDR-1
＜400＞ 46
Arg Ser Ser Gln Asn Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 　　　　　　　5 　　　　　　　　 10 　　　　　　　　 15
＜210＞ 　47
＜211＞ 　13
＜212＞ 　PRT
＜213＞ 　Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Amino acid sequence of light chain CDR-2
＜400＞ 　47
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
＜210＞ 48
＜211＞ 　9
＜212＞ 　PRT
＜213＞ 　Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Amino acid sequence of light chain CDR-3
＜400＞ 　48
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Leu Thr
인간 혈액 세포의 표면 항원에 대한 항체를 사용함으로써, 혈액 세포군들 중에서 특정한 세포만 분리하거나, 제거하거나, 회수하거나 또는 검출할 수 있다. 예를 들면, CD4 양성 세포를 제거하면 자기면역 질환 환자의 증상을 개선시키며, CD34 양성 세포를 회수하면 이식에 이용할 수 있는 조혈 전구 세포를 농축시킬 수 있다.
인간 CD4는 분자량 55 kD의 당단백질로서, 세포막 상에 단량체로서 존재하고 주로 T 세포에서 발현된다. CD4를 발현하는 T 세포 (말초 T 세포의 약 65%)는 헬퍼 T 세포로서의 성질을 갖고, 클래스 II MHC 분자에 의해 제시된 항원을 인식한다. 또한, CD4는 HIV (인간 면역결핍 바이러스: AIDS 바이러스)와 결합하여 감염시 수용체로서 기능하는 것도 알려져 있다. 면역계에서 헬퍼 T 세포는 항원에 대해 적절히 응답하는데 있어서 불가결한 요소이며, B 세포의 대부분의 항체 응답에 대해 필수적이다. 헬퍼 T 세포는 주로 항원 제시 세포의 표면에 결합한 비자기 항원을 인식했을 때 활성화되어 인터루킨-2를 분비하여 T 세포 증식을 자극하며, 이는 B 세포의 활성화를 보조하고 나아가 항체 생산을 촉진시킨다. 림프구를 보조할 뿐만 아니라 γ-인터페론을 분비하여 마크로파지를 활성화시키는 헬퍼 T 세포도 또한 존재한다.
건강한 사람들은 자기 장애를 방지하기 위해, 자기 반응성 항원 수용체를 갖는 림프구의 클론 제거(clonal deletion), 이들의 무반응성화(clonal anergy)와 그 기능의 억제(suppression)와 같은 다양한 기전을 갖추고 있다 (면역 관용). 자기면역 질환의 발생에 관한 기전은 아직 충분히 밝혀지지 않았지만, 이러한 면역 관용 기전의 이상이 자기면역 질환의 원인으로 여겨진다. 자기 반응성 항원 수용체를 갖는 림프구 클론이 CD4를 발현하는 헬퍼 T 세포 뿐만은 아니지만 헬퍼 T 세포가 자기면역 질환에 있어서 중요하다고 인식되고 있다.
일종의 자기면역 질환의 치료 방법으로서 그 증상의 정도에 따라 부신 피질 호르몬제 투여, 비장 적출 및 면역 억제제 투여 등이 적용된다. 그러나, 이러한 약물 요법이나 비장 적출술을 시행하여도 효과적으로 회복되지 않는 증례가 많다. 이러한 환자에 대한 치료 방법에 대해 절대적인 것이 확립되지 않은 것이 현실이며, 그에 대한 대책이 시급히 요망되고 있다.
자기면역 질환의 다른 치료 방법으로서 면역흡착 칼럼을 사용하여 혈액의 체외 순환에 의해 자기 항체를 흡착 제거하는 것이 여러가지로 시도되고 있다. 예를 들면, 면역글로불린에 결합성이 있는 프로테인 A를 담체에 고정화시킨 칼럼의 적용이 검토되고 있다. 그러나, 프로테인 A는 고가이며 흡착 특이성의 면에서도 그다지 우수하지 않으며, 나아가 부작용이 발생한 사례도 보고되어 있어, 이러한 의료용 기재에 이용하기에는 여러가지 문제점이 남아 있었다.
최근에는 혈액에서 액성 인자의 제거 뿐만 아니라 혈액 세포 분리 기술이 보고되고 있다. 그러나, 사용된 리간드에 따라 항원과의 결합성이 약하고, 항원과의 반응 특이성이 낮은 등의 문제 때문에 충분한 세포 제거를 기대할 수 없거나, 또는 비표적 세포가 비특이적으로 흡착되는 등의 문제가 있었다.
일본 특허 공개(평)3-32680호 공보에는 T 림프구에 친화성이 있는 펩티드 또는 지질을 고정화시킨 분리재가 개시되어 있고, 또한 일본 특허 공개(평)6-154316호 공보, 일본 특허 공개(평)6-154317호 공보, 일본 특허 공개(평)6-218051호 공보와 일본 특허 공개(평)6-269663호 공보에는 CD4 양성 세포에 친화성이 있는 펩티드를 부직포에 고정화시킨 CD4 양성 세포 수집재가 각각 개시되어 있지만, 이들은 모두 리간드로서 사용한 펩티드 항원에 대한 친화성과 특이성이 불충분한 문제가 있어서 충분한 세포 흡착력을 기대할 수 없다. 특히, 후자는 항CD4 항체의 항원 결합 부위 형성에 밀접히 관련되는 상보성 결정 영역 "CDR"과 이들 사이에 개재된 틀 영역 "프레임워크(framework)" 중의 펩티드의 일부를 사용하는데, 단지 일부만으로는 효과적인 항원 결합을 제공할 수 없다. CDR에는 H쇄와 L쇄 각각에 대해 N 말단측으로부터 "CDR-1", "CDR-2"와 "CD-3"으로 불리는 3개의 영역이 존재하는 것이 알려져 있으며, H쇄 또는 L쇄 중 적어도 하나의 "CDR-1", "CDR-2" 및 "CDR-3"의 입체 배치가 항체와 실질적으로 동일하게 유지되는 것이 효과적인 항원 결합을 기대하는데 있어서 필수적이다.
종래에 인간 CD34는 조혈 미분화 세포의 세포 표면 항원으로 보고되어 있고, 이 인간 CD34 분자를 인식하는 항체를 생산하는 세포로서는 항MY10 항체 생산 하이브리도마가 알려져 있다 [미국 특허 제4,965,204호; 및 J. Immunology, 133, 157 (1984)]. 그 후, 항-인간 CD34 항체가 다수 보고되었고, 또한 골수 이식 등의 의료 분야에 있어서 조혈 미분화 세포의 분리 등으로 응용하는 것이 모색되고 있다. 이러한 의료에 관한 응용을 효과적으로 활용하기 위해, 항-인간 CD34 항체를 효율적으로 생산하며, 이를 이용하는 의료 기기를 개발하는 것이 필요하게 되었다.
CD34 분자는 혈액의 미분화 세포 상에 발현하는 미분화 세포의 항원 마커로서 알려져 있고, 미분화 세포 분리에 응용하는 것이 보고되어 있다 [S. Saeland 등, Blood, 72, 1580 (1988) 등]. 또한, 항CD34 항체와 비오틴, 아비딘 또는 자기 비드(magnetic beads)와의 조합 등을 이용하여, 분화된 세포군과 암 세포로부터 미분화 세포를 분리하는 의료 기기가 개발되고 있다 [Dreger 등, Exp. Hematol., 23, 147 (1995)].
항체는 일반적으로 항원과의 결합성이 강하고 동시에 특이성이 높은 것이 알려져 있어서 의료에서의 이용이 기대되고 있다. 그러나, 의료 기기의 제작시 항체 제조에 드는 비용이 문제가 된다. 항체를 효율적으로 생산하여 이를 의료 기기에 응용하는 것이 필요하다. 따라서, 항체를 효율적으로 생산하는 방법으로서 재조합 항체를 제조하는 기술을 확립하고, 이들을 의료 기기에 응용하는 것이 기대된다.
본 발명은 신규한 재조합 항체를 사용한 세포 분리 장치와 이를 이용한 세포 분리 또는 검출 방법에 관한 것이다. 보다 구체적인 예로서, 본 발명은 인간 CD (Cluster differentiation) 4 항원 또는 CD34 항원에 대해 신규한 재조합 항체를 사용하는 CD4 또는 CD34 양성 세포의 분리 또는 검출 방법 및 이들 세포의 분리 장치에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 항원의 정량 또는 검출과 의약품 및 의료 기기로 응용하기에 유용한, 인간 CD4 항원에 대해 특히 높은 친화성과 높은 특이성을 갖는 항체 또는 이 항체를 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다.
도 1은 IgG 구조를 나타내는 도식도.
도 2는 플라스미드 pG1의 개략도.
도 3은 플라스미드 pSE380ScFv의 개략도.
도 4는 플라스미드 pET24ScFv의 개략도.
도 5는 4H5 항체와 MT310 항체의 항원 결합 친화성을 사용된 항체 농도와 ELISA에서의 정량치 (ABS)와의 상관 관계로 나타낸 도면.
도 6은 키메라 항체의 KG 1a 세포에의 결합성을 나타내는 도면으로서, (1)은 마우스 CD34 항체를 반응시킨 포지티브 대조군을 나타내고, (2)는 재조합 항체가 CD34 양성 세포인 KG 1a 세포를 염색할 수 있는 것을 나타낸다. 흑색 피크는 네가티브 대조군인 백색 피크에 비교하여 염색된 것을 나타낸다.
본 발명에서는 항체가 갖는 인간 CD4 항원에 대한 높은 친화성과 특이성을 유지하면서, 유전 공학 기술에 의해 인간-마우스 키메라의 형성과 단쇄 형성 등의 변화를 시행하여 항원성의 저하, 항체 생산량의 향상, 생산 비용의 감소를 가능하게 하는 재조합 항체를 제공한다.
생체 내에 존재하는 통상의 항체에는 항원 특이적인 가변 영역 염기 서열과 정상(定常) 영역 유전자가 2가지 모두 필요하다. 정상 영역 유전자에는 소수의 클래스만 알려져 있지만, H쇄와 L쇄의 가변 영역 염기 서열은 다양성이 매우 높아서, 목적하는 가변 영역 염기 서열을 얻기 위해서는 매우 많은 노력이 요구된다. 그러나, 본 발명자들은 유전자 증폭(PCR), 항원을 이용한 효소 면역측정법(EIA) 및 플로우 사이토미터(flow cytometer)에 의해 결합 실험을 구사함으로써, 하이브리도마 중의 복수의 항체 유전자들 중에서 목적하는 인간 CD4 항체와 인간 CD34 항원에 대한 유전자를 얻기에 이르러, 다음과 같이 이들의 서열과 기능을 결정하였다. 또한, 이 유전자를 재조합하여 인간-마우스 키메라 항체와 단쇄 항체를 대량 생산할 수 있게 되었다.
이들 재조합 항체를 이용함으로써, 종래에 마우스의 복수(腹水)나 세포 배양에 의해서 얻었던 항체를 세균 등에 의해 생산할 수 있게 되고, 저렴한 의료 기기를 공급할 수 있게 되었다.
모노클론 항체의 제작은 일반적으로 목적하는 항원으로 면역화시킨 동물로부터 B 림프구를 분리하여 이를 골수종 세포와 융합시킴으로써 하이브리도마를 제작하는 것에서 시작한다. 이어서, 목적하는 항원을 이용하여 스크리닝하여 항체 생산 하이브리도마를 얻는다. 이 경우에는, 항원과의 결합성이 강하고 동시에 특이성이 높은 항체를 생산하는 하이브리도마를 얻기 위해 수많은 세포를 스크리닝해야 하므로 많은 노력이 요구된다.
본 발명자들이 예의 검토한 결과, 항CD4 항체 생산 하이브리도마 4H5로부터 얻은 H쇄 가변 영역의 CDR-1, CDR-2 및 CDR-3이 각각 서열 목록에서 서열 1, 2 및 3으로 기재한 아미노산 서열이고, L쇄 가변 영역의 CDR-1, CDR-2 및 CDR-3이 각각 서열 목록에서 서열 4, 5 및 6으로 기재한 아미노산 서열인 항체가 인간 CD4 항원에 대해 특히 높은 친화성과 높은 특이성을 갖는 항체임을 발견하기에 이르렀다.
일례를 들면 항-인간 CD4 항체로 알려져 있는 0KT4A 항체의 인간 CD4 항원에 대한 결합 친화성은 KA = 4×108M-1인 것으로 보고되어 있으며 [Virginia L. Pulito 등, The Journal of Immunology, 156: 2840-2850 (1996)], 따라서 해리 상수(KD: 이 값이 낮을수록 결합 친화성은 더 높다)는 KD = 2.5×10-9M {1/KA = KD로부터}이다. 한편, 본 명세서의 실시예에 기재한 바와 같이 4H5 항체의 인간 CD4 항원에 대한 해리 상수는 KD = 8.08×10-10M (실시예 5)이다. 이는 4H5 항체가 인간 CD4 항원에 대하여 0KT4A 항체보다 더 강하게 결합할 수 있다는 것을 나타낸다.
4H5 항체를 생산하는 하이브리도마인 마우스-마우스 하이브리도마(Mouse-Mouse hybridoma) 4H5는 일본국 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 (NIBH)에 기탁 번호: FERM BP-6729로서 기탁되었다.
생체 내에 존재하는 통상의 항체에는 항원 특이적인 가변 영역 염기 서열과 정상 영역 유전자의 2가지 모두가 필요하다. 정상 영역 유전자에는 소수의 클래스가 알려져 있지만, H쇄와 L쇄의 가변 영역 염기 서열은 다양성이 매우 높아서, 목적하는 가변 영역 염기 서열을 얻기 위해서는 매우 많은 노력이 요구된다. 그러나, 본 발명자들은 유전자 증폭 (PCR) 또는 항원을 이용한 효소 면역측정법 (EIA)에 의한 결합 실험을 구사함으로써, 하이브리도마 중의 복수의 항체 유전자들 중에서 목적하는 인간 CD4 항원에 대한 항체 유전자를 얻기에 이르러, 이 유전자를 재조합하여 인간-마우스 키메라 항체와 단쇄 항체를 대량 생산할 수 있게 되었다.
통상의 항체는 큰 것과 작은 것의 2종류의 폴리펩티드로 이루어지며, 이 중 큰 것의 서브유닛을 "H쇄"라 하고 작은 것의 서브유닛을 "L쇄"라고 한다. 또한, 각각의 펩티드는 N 말단측에 존재하여 항원 결합 부위를 형성하는 "가변 영역" (또는 "V 영역")과 항체 클래스별로 일정한 "정상 영역" (또는 "Fc")으로 이루어져 있다. 가변 영역은 또한 특히 항원 결합 부위 형성에 밀접히 관련되는 상보성 결정 영역 "CDR"과 이들 사이에 개재된 틀 영역 "프레임워크"로 나누어진다. CDR에는 H쇄와 L쇄 각각에 대해 N 말단측으로부터 "CDR-1", "CDR-2"와 "CDR-3"으로 불리는 1개의 영역이 존재하는 것이 알려져 있다. 도 1에 IgG 구조의 도식도를 나타냈다.
항체의 가변 영역을 구성하는 아미노산의 수는 항체에 따라 다른 경우가 많다. 4H5 항체의 H쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 목록에서 서열 35에 나타냈다. 서열 35에서 아미노산 1위 내지 30위는 프레임워크 1을, 아미노산 31위 내지 35위는 CDR-1을, 아미노산 36위 내지 49위는 프레임워크 2를, 아미노산 50위 내지 66위는 CDR-2를, 아미노산 67위 내지 98위는 프레임워크 3을, 아미노산 99위 내지 107위는 CDR-3을, 아미노산 108위 내지 118위는 프레임워크 4를 나타낸다. 4H5 항체의 L쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 목록에서 서열 36에 나타냈다. 서열 36에서 아미노산 1위 내지 23위는 프레임워크 1을, 아미노산 24위 내지 38위는 CDR-1을, 아미노산 39위 내지 53위는 프레임워크 2를, 아미노산 54위 내지 60위는 CDR-2를, 아미노산 61위 내지 92위는 프레임워크 3을, 아미노산 93위 내지 101위는 CDR-3을, 아미노산 102위 내지 111위는 프레임워크 4를 나타낸다. 이들 프레임워크와 CDR의 경계는 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, 1991 (USA NIH 발행)에 게재된 마우스 항체 가변 영역의 유전자 서열을 참고하여 결정하였다.
서열 목록에서 서열 7에는 서열 35의 아미노산 9위 내지 118위에 상응하는 핵산 염기 서열을 나타냈다. 서열 8에는 서열 36의 아미노산 9위 내지 111위에 상응하는 핵산 염기 서열을 나타냈다.
서열 39에는 항CD34 항원에 결합하는 항체인 항MY10 항체의 H쇄의 가변 영역의 유전자 서열과 이것이 코드하는 아미노산 서열을 나타냈다. 서열 39에서 아미노산 1위 내지 30위는 프레임워크 1을, 아미노산 31위 내지 35위는 CDR-1을, 아미노산 36위 내지 49위는 프레임워크 2를, 아미노산 50위 내지 65위는 CDR-2를, 아미노산 66위 내지 97위는 프레임워크 3을, 아미노산 98위 내지 106위는 CDR-3을, 아미노산 107위 내지 117위는 프레임워크 4를 나타낸다.
또한, 서열 40에는 MY10 항체의 L쇄의 가변 영역의 유전자 서열과 이것이 코드하는 아미노산 서열을 나타냈다. 서열 40에서 아미노산 1위 내지 23위는 프레임워크 1을, 아미노산 24위 내지 39위는 CDR-1을, 아미노산 40위 내지 54위는 프레임워크 2를, 아미노산 55위 내지 61위는 CDR-2를, 아미노산 62위 내지 93위는 프레임워크 3을, 아미노산 94위 내지 102위는 CDR-3을, 아미노산 103위 내지 113위는 프레임워크 4를 나타낸다.
서열 41에는 단쇄 항체의 유전자 서열과 이것이 코드하는 아미노산 서열을 나타냈다. 서열 41에서 아미노산 1위 내지 39위는 대장균(Escherichia coli)으로부터의 분비 시그널을 포함하는 서열을, 아미노산 40위 내지 156위는 H쇄의 가변 영역을, 아미노산 157위 내지 171위는 링커를, 아미노산 172위 내지 284위는 L쇄의 가변 영역을, 아미노산 285위 내지 302위는 E-tag를 포함하는 서열을 나타낸다.
pCANTAB5E 플라스미드 (파마시아(Pharmacia))에는 링커로서 H쇄와 L쇄 중 일부를 포함하는 서열, 즉 아미노산 140위 내지 169위가 준비되어 있으며, 본 발명에서는 이 서열을 이용하였다.
H쇄 및 L쇄에 결합하는 링커는 본 발명에서의 플라스미드에 포함되지만 이러한 서열에 한정되지 않고 이용할 수 있다. 하이브리도마로부터 단쇄 항체를 단리하는 방법은 재조합 파지 항체 시스템(Recombinant Phage Antibody System) 키트 (파마시아) 등을 이용할 수도 있지만, 본 발명에서와 같이 스크리닝에 필요한 인간 CD34 항원이 없는 경우에는 키트를 효과적으로 사용할 수 없어서 많은 연구가 필요하였다.
본 발명은 다음의 세포 분리 장치 및 이를 이용하는 세포 분리 방법 또는 검출 방법에 관한 것이다.
(1) CD4 분자에 결합하는 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 이들을 조합한 항체 중에서 선택된 항체를 이용하는 CD4 양성 세포 분리 장치.
(2) H쇄 가변 영역의 CDR-1이 Asp Tyr Val Ile Asn (서열 1)로, CDR-2가 Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Glu Met Phe Lys Gly (서열 2)로, CDR-3이 Arg Gly Thr Gly Thr Gly Phe Ala Tyr (서열 3)으로 각각 표시되는 아미노산 서열이고, L쇄 가변 영역의 CDR-1이 Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn (서열 4)로, CDR-2가 Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser (서열 5)로, CDR-3이 Gln Gln Ser Ser Glu Asp Pro Pro Thr (서열 6)으로 각각 표시되는 아미노산 서열이며, Fc 영역이 인간형인 키메라 항체를 이용하는 CD4 양성 세포 분리 장치.
(3) H쇄 가변 영역의 CDR-1이 Asp Tyr Val Ile Asn (서열 1)로, CDR-2가 Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Glu Met Phe Lys Gly (서열 2)로, CDR-3이 Arg Gly Thr Gly Thr Gly Phe Ala Tyr (서열 3)으로 각각 표시되는 아미노산 서열이고, L쇄 가변 영역의 CDR-1이 Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn (서열 4)로, CDR-2가 Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser (서열 5)로, CDR-3이 Gln Gln Ser Ser Glu Asp Pro Pro Thr (서열 6)으로 각각 표시되는 아미노산 서열인 단쇄 항체를 이용하는 CD4 양성 세포 분리 장치.
(4) CD4 분자에 결합하는 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 이들을 조합한 항체 중에서 선택된 항체를 이용하는 인간 CD4 양성 세포의 분리 또는 검출 방법.
(5) H쇄 가변 영역의 CDR-1이 Asp Tyr Val Ile Asn (서열 1)로, CDR-2가 Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Glu Met Phe Lys Gly (서열 2)로, CDR-3이 Arg Gly Thr Gly Thr Gly Phe Ala Tyr (서열 3)으로 각각 표시되는 아미노산 서열이고, L쇄 가변 영역의 CDR-1이 Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn (서열 4)로, CDR-2가 Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser (서열 5)로, CDR-3이 Gln Gln Ser Ser Glu Asp Pro Pro Thr (서열 6)으로 각각 표시되는 아미노산 서열이며, Fc 영역이 인간형인 키메라 항체를 이용하는 인간 CD4 양성 세포의 분리 또는 검출 방법.
(6) H쇄 가변 영역의 CDR-1이 Asp Tyr Val Ile Asn (서열 1)로, CDR-2가 Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Glu Met Phe Lys Gly (서열 2)로, CDR-3이 Arg Gly Thr Gly Thr Gly Phe Ala Tyr (서열 3)으로 각각 표시되는 아미노산 서열이고, L쇄 가변 영역의 CDR-1이 Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn (서열 4)로, CDR-2가 Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser (서열 5)로, CDR-3이 Gln Gln Ser Ser Glu Asp Pro Pro Thr (서열 6)으로 각각 표시되는 아미노산 서열인 단쇄 항체를 이용하는 인간 CD4 양성 세포의 분리 또는 검출 방법
또한, 본 발명은 다음의 세포 분리 장치 및 이를 이용하는 세포 분리 방법 또는 검출 방법에 관한 것이다.
(1) CD34 분자에 결합하는 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 이들을 조합한 항체 중에서 선택된 항체를 이용하는 CD34 양성 세포 분리 장치.
(2) H쇄 가변 영역의 CDR-1이 Ser-His-Gly-Val-His (서열 43)으로, CDR-2가 Val-Ile-Trp-Gly-Ala-Gly-Arg-Thr-Asp-Tyr-Asn-Ala-Ala-Phe-Ile-Ser (서열 44)로, CDR-3이 Asn-Arg-Tyr-Glu-Ser-Tyr-Phe-Asp-Tyr (서열 45)로 각각 표시되는 아미노산 서열이고, L쇄 가변 영역의 CDR-1이 Arg-Ser-Ser-Gln-Asn-Leu-Val-His-Ser-Asn-Gly-Asn-Thr-Tyr-Leu-His (서열 46)으로, CDR-2가 Lys-Val-Ser-Asn-Arg-Phe-Ser-Gly-Val-Pro-Asp-Arg-Phe (서열 47)로, CDR-3이 Ser-Gln-Ser-Thr-His-Val-Pro-Leu-Thr (서열 48)로 각각 표시되는 아미노산 서열이며, Fc 영역이 인간형인 키메라 항체를 이용하는 CD34 양성 세포 분리 장치.
(3) H쇄 가변 영역의 CDR-1이 Ser-His-Gly-Val-His (서열 43)으로, CDR-2가 Val-Ile-Trp-Gly-Ala-Gly-Arg-Thr-Asp-Tyr-Asn-Ala-Ala-Phe-Ile-Ser (서열 44)로, CDR-3이 Asn-Arg-Tyr-Glu-Ser-Tyr-Phe-Asp-Tyr (서열 45)로 각각 표시되는 아미노산 서열이고, L쇄 가변 영역의 CDR-1이 Arg-Ser-Ser-Gln-Asn-Leu-Val-His-Ser-Asn-Gly-Asn-Thr-Tyr-Leu-His (서열 46)으로, CDR-2가 Lys-Val-Ser-Asn-Arg-Phe-Ser-Gly-Val-Pro-Asp-Arg-Phe (서열 47)로, CDR-3이 Ser-Gln-Ser-Thr-His-Val-Pro-Leu-Thr (서열 48)로 각각 표시되는 아미노산 서열인 단쇄 항체를 이용하는 CD34 양성 세포 분리 장치.
(4) 항체의 아미노산 서열의 C 말단, N 말단 또는 양쪽 모두에 염기성 아미노산 또는 산성 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 부가시킨 항체를 이용하는, 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 CD34 양성 세포 분리 장치.
(5) CD34 분자에 결합하는 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 이들을 조합한 항체 중에서 선택된 항체를 이용하는 인간 CD34 양성 세포의 분리 또는 검출 방법.
(6) H쇄 가변 영역의 CDR-1이 Ser-His-Gly-Val-His (서열 43)으로, CDR-2가 Val-Ile-Trp-Gly-Ala-Gly-Arg-Thr-Asp-Tyr-Asn-Ala-Ala-Phe-Ile-Ser (서열 44)로, CDR-3이 Asn-Arg-Tyr-Glu-Ser-Tyr-Phe-Asp-Tyr (서열 45)로 각각 표시되는 아미노산 서열이고, L쇄 가변 영역의 CDR-1이 Arg-Ser-Ser-Gln-Asn-Leu-Val-His-Ser-Asn-Gly-Asn-Thr-Tyr-Leu-His (서열 46)으로, CDR-2가 Lys-Val-Ser-Asn-Arg-Phe-Ser-Gly-Val-Pro-Asp-Arg-Phe (서열 47)로, CDR-3이 Ser-Gln-Ser-Thr-His-Val-Pro-Leu-Thr (서열 48)로 각각 표시되는 아미노산 서열이며, Fc 영역이 인간형인 키메라 항체를 이용하는 인간 CD34 양성 세포의 분리 또는 검출 방법.
(7) H쇄 가변 영역의 CDR-1이 Ser-His-Gly-Val-His (서열 43)으로, CDR-2가 Val-Ile-Trp-Gly-Ala-Gly-Arg-Thr-Asp-Tyr-Asn-Ala-Ala-Phe-Ile-Ser (서열 44)로, CDR-3이 Asn-Arg-Tyr-Glu-Ser-Tyr-Phe-Asp-Tyr (서열 45)로 각각 표시되는 아미노산 서열이고, L쇄 가변 영역의 CDR-1이 Arg-Ser-Ser-Gln-Asn-Leu-Val-His-Ser-Asn-Gly-Asn-Thr-Tyr-Leu-His (서열 46)으로, CDR-2가 Lys-Val-Ser-Asn-Arg-Phe-Ser-Gly-Val-Pro-Asp-Arg-Phe (서열 47)로, CDR-3이 Ser-Gln-Ser-Thr-His-Val-Pro-Leu-Thr (서열 48)로 각각 표시되는 아미노산 서열인 단쇄 항체를 이용하는 인간 CD34 양성 세포의 분리 또는 검출 방법.
(8) 항체의 아미노산 서열의 C 말단, N 말단 또는 양쪽 모두에 염기성 아미노산 또는 산성 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 부가시켜 사용하는, 상기 (5) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 인간 CD34 양성 세포의 분리 또는 검출 방법.
또한, 본 발명은 다음의 항체, 이 항체를 코드하는 핵산, 이 핵산을 사용하는 항체 생산 방법 및 이 항체를 함유하는 의약 조성물에 관한 것이다.
(1) H쇄 가변 영역의 CDR-1, CDR-2 및 CDR-3이 각각 서열 1, 2 및 3에 기재된 아미노산 서열이고, CD4 항원에 대하여 친화성이 있는 항체.
(2) L쇄 가변 영역의 CDR-1, CDR-2 및 CDR-3이 각각 서열 4, 5 및 6에 기재된 아미노산 서열이고, CD4 항원에 대하여 친화성이 있는 항체.
(3) 기탁 번호가 FERM BP-6729인 하이브리도마 4H5에 의해 생산되는, CD4 항원에 대한 모노클론 항체.
(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 항체를 코드하는 핵산.
(5) 서열 7 및 서열 8에 기재된 염기 서열을 함유하는, 상기 (4)에 기재된 핵산.
(6) 상기 (4) 또는 (5)에 기재된 핵산을 이용하는 항체 생산 방법.
(7) 상기 (6)의 방법에 의해 얻을 수 있는, CD4 항원에 대해 친화성이 있는 재조합 항체.
(8) 항체의 Fc 영역이 인간형인 상기 (7)에 기재된 재조합 항체.
(9) 항체가 단쇄 항체인 상기 (7)에 기재된 재조합 항체.
(10) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 항체와 의약적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물.
(11) 상기 (7) 내지 (9) 중 어느 하나에 기재된 재조합 항체와 의약적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물.
본 발명에서 말하는 "항체"는 통상적으로 생체 내에 존재하는 형태의 항체 이외에, 항체의 H쇄 또는 L쇄의 가변 영역 또는 그의 조합으로 형성되는 항원 결합 부위를 적어도 1개 갖는 분자를 포함한다. 예를 들면, H쇄의 가변 영역만 포함하는 펩티드, 1조의 H쇄 단편과 L쇄 단편으로 이루어진 Fab, 2조의 H쇄 단편과 L쇄 단편으로 이루어진 (Fab')2, H쇄 단편과 L쇄 단편이 동일 펩티드 상에 직렬로 결합된 단쇄 항체 "ScFv" 등도 포함된다.
본 발명에서 말하는 "인간 CD4 항원"은 파르네스(Parnes, J.R.)에 의해 보고되었고 [Adv. Immunology, 44, 265 (1989)], 림프구 상에 발현하는 헬퍼 T 세포에 대한 항원 마커로서 알려져 있다. 또한, CD4 항원은 인간에서는 그 외에 단핵세포, 마크로파지 등에서도 발현된다.
항체의 항원 특이성과 항원에의 결합 강도가 주로 CDR의 아미노산 서열에 의해 결정되는 것은 마우스 항체의 인간화에 의해 나타난다 [Gussow, D. 및 Seemann, G., Methods in Enzymology, 203: 99-121 (1991); Glaser, S.M. 등, J. Immunology 149: 2607-2614 (1992)].
C0S7 세포에 의한 항체의 분비와 발현에는 여러가지 벡터를 사용할 수 있지만 [Whittle, N. 및 Adair, J. 등 (1987), Protein Eng., 1(6), 499-505; Sutter, K.D. 및 Feys, V. 등 (1992), Gene 113, 223-30], 인간 항체 발현 플라스미드 (pG1)를 이용하여 인간-마우스 키메라 항-인간 CD4 항체를 발현할 수 있는 플라스미드 pG14H5와 인간 CD34 항체를 발현할 수 있는 플라스미드 pGlMy10을 제조한다. 이것을 C0S7 세포로 유전자 도입시켜 인간 항CD4 항체를 생산할 수 있다. 여기에서 말하는 인간-마우스 키메라 항체는 하이브리도마 유래된 마우스 유전자 서열을 갖는 가변 영역과 인간 유래된 유전자 서열을 갖는 정상 영역으로 구성되는 유전자에 의해 생산된 항체를 나타낸다. pG1은 국제 특허 공개 공보 제W0 95/15393호에 기재된 pSE 플라스미드의 인간 Cγ1의 서열에 부가된 막 통과 도메인 (TM)을 제거하여, 통상적인 항체와 같이 생체에서 분비되도록 개량시킨 플라스미드이다. 상세한 제작 방법은 참고예 1에 나타냈다. 즉, 이는 인간 정상 영역을 코드하는 유전자 서열을 갖고 있으며, 마우스 가변 영역 유전자를 연결함으로써 인간-마우스 키메라 항체를 발현할 수 있는 플라스미드이다.
본 발명에서 말하는 "키메라 항체"는 상이한 동물종의 항체의 아미노산 서열들을 인위적으로 조합하여 얻은 항체를 나타낸다. 예를 들면, 마우스 하이브리도마 유래된 CDR을 포함하며 정상 영역에 인간 항체 유래된 아미노산 서열을 포함하는 항체를 나타낸다. 또한, 그의 프레임워크에 인간 유래된 아미노산 서열을 포함시킬 수도 있다.
본 발명에서 말하는 "인간 CD34 항원"은 시빈(Civin) 등에 의해 보고되었고 [미국 특허 제4,965,204호 및 J. Immunology, 133, 157 (1984)], 혈액에서 미분화 세포 상에 발현된, 조혈 미분화 세포의 항원 마커로서 알려져 있다.
본 발명에서 말하는 "실질적으로 동일한 기능"은 항원 분자 상의 에피톱 및 항원과의 결합력이 실질적으로 동일한 것을 말한다. 가변 영역의 프레임워크나 정상 영역에서 아미노산 치환이 있더라도, 종종 본질적으로 동일한 성능의 항체가 생산되는 것으로 알려져 있다. 항체의 항원 특이성과 항원에의 결합 강도가 주로 CDR의 아미노산 서열에 의해 결정되는 것은 마우스 항체의 인간화에 의해 나타난다 [Gussow, D. 및 Seemann, G., Methods in Enzymology, 203: 99-121 (1991); Glaser, S.M. 등, J. Immunology 149: 2607-2614 (1992)].
COS7 세포는 통상적으로 10% 소 태아 혈청(FBS) 함유 둘베코 개질 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium; DMEM 배지)를 사용하여 5% C02의 존재 하에 37℃에서 배양한다. COS7 세포로의 유전자 도입법과 유전자 도입 후 세포의 육종 생산법은 문헌[T. Yokota 및 K. Arai: Bio Manual Series 4, Gene Transfer and Expression Analysis Method, Yodosha (1994)] 등의 실험서에 기재되어 있다. COS7 세포 내로의 유전자 도입법으로는 전기천공법 이외에 DEAE 덱스트란법 [Bebbington, C.R. (1991); METHODS: A Companion to Methods in Enzymology, 2(2), 136-45]을 사용할 수도 있다.
본 발명에서는 pG1에 삽입된 정상 영역 유전자가 Cγ1이기 때문에 각 클론은 IgG1로서 발현하였다. 항체 생산시에는 혈청 유래된 소 항체의 혼입을 피하기 위해, 무혈청 DMEM 배지에서 배양하는 것이 바람직하다. 이와 같이 배양 상청액 중에 분비된 항CD4 항체는 예를 들면 프로테인 A 또는 프로테인 G를 이용하는 일반적인 IgG 항체 정제법으로 쉽게 정제할 수 있다.
공업적 생산의 경우, 숙주로서는 CH0 세포와 골수종 Sp 2/0 세포가 잘 알려져 있다 [Xiang, J. 등 (1990) Mol. Immun., 27, 809; Bebbington, C.R. 등 (1992) Bio/technology, 10, 169; Larrick, J.W. 및 Wallace, E.F. 등 (1992) Imunol. Rev. 130, 69-85; Deyev, S.M. 및 Lieber, A. 등 (1994) Appl. Biochem. Biotechnol. 47 (2-3), 143-54]. 예를 들면, CH0 세포의 경우 MTX 등의 약제를 사용하여 생산성이 높은 클론을 선택하는 방법이 보고되었으며 [Bebbington, C.R. (1991) METHODS: A Companion to Methods in Enzymology, 2(2), 136-45], 안정한 고생산 세포주를 얻을 수 있으면, 이 세포주를 재조합 항-인간 CD4 항체의 공업적 생산에 이용할 수 있다.
인간-마우스 키메라 항체는 의약품으로서 사용하는 경우에 인간의 체내에서 항원성이 마우스 항체에 비해 매우 낮으므로 안전성이 보다 향상된다. 통상의 항체를 펩신 등의 프로테아제로 분해시켜 F(ab')2화시킨 경우에도 인간 Fc를 이용한 단편은 마우스의 것에 비해 안전성이 높다. 또한, 의료 기기로 응용할 때에도 리간드로서 이용되는 항체가 프로테아제 등에 의해 분해되어 미량 유리할 가능성이 있지만 이러한 분해 산물에 관해서도 인간화된 것은 안정성이 보다 높다고 할 수 있다.
단쇄 항체에 있어서는 저분자화함으로써 항원성을 저하시킬 수 있는 효과를 기대할 수 있다. 항체를 파파인 등의 프로테아제로 처리하여 Fab화시킨 항체는 마우스 정상 영역을 여전히 포함하지만, 단쇄 항체는 이들을 제외시킨 것으로서 항원성을 매우 낮게 할 수 있다. 하이브리도마로부터 단쇄 항체를 단리하는 방법으로는 재조합 파지 항체 시스템 키트 (파마시아) 등을 이용하는 방법이 가능할 수도 있지만, 생산 숙주인 대장균에 대해 상기 단쇄 항체가 독성을 가져 대장균을 사멸시키거나, 상기 단쇄 항체의 분해가 일어나는 경우에는 키트를 효과적으로 사용할 수 없어서 많은 연구가 필요하다. 단쇄 항체는 pSE380 플라스미드 (인비트로젠 (Invitrogen))와 pET24d(+) 플라스미드 (노바젠 (Novagen)) 등의 유도성 벡터와 숙주가 되는 균종을 검토함으로써 제조할 수 있다. 또한, 생산에 있어서 상술한 방법 외에 진핵세포 발현계, 곤충 세포 발현계 및 효모 세포 발현계도 효과저가으로 이용할 수 있다. H쇄와 L쇄를 결합하는 링커는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)×3회 반복의 15 잔기의 아미노산을 사용했지만 이 서열에 한정되지 않고 사용할 수 있다.
본 발명에 의해 생산된 항체를 이용하여 CD4 양성 세포를 분리할 수 있다. 본 발명에 의해, 체외에서 혈액 세포 현탁액으로부터 또는 체외 순환에 의해 혈액으로부터 CD4 양성 세포를 효율적으로 분리할 수 있으며, 분리된 세포 또는 CD4 양성 세포를 제거한 세포군을 각종 질환의 치료에 사용할 수 있다. CD4 양성 세포를 제거한 세포 혼합액 또는 혈액 제제의 제조, 또는 CD4 양성 세포를 주성분으로 포함하는 세포 현탁액; 또는 CD4 양성 세포 제제의 제조를 쉽게 수행할 수 있다. CD4 양성 세포를 제거함으로써 자기면역 질환인 만성 관절 류마티즘, 다발성 경화증 및 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus) 등의 증상의 개선을 기대할 수 있다.
항체 형상으로는 생산된 항체 분자를 그대로 사용할 수도 있지만, 각종 프로테아제로 처리하여 얻어지는 항원 결합 부위를 포함하는 단편인 Fab, F(ab')2, Fv 또는 Fd 등도 적용할 수 있다. 이들 단편에 대해서는 문헌["Introduction to Antibody Engineering" (Chijinshokan)] 등에 설명되어 있다. 이 외에도 본 발명을 인간 체내 혈액의 체외 순환에 응용하는 경우에는, 항체가 혈액 중에 유리되는 경우의 부작용과 항원성 등을 고려하여 가변 영역 이외의 부분을 인간형 항체로 만든 키메라 항체를 사용하는 것이 유용하다. 이들 항체의 제조 방법은 특히 한정되지는 않지만, 고순도로 정제된 것을 사용해야 한다. 모노클론 항체의 생산 방법으로는 통상적으로 행해지는 바와 같이 하이브리도마를 마우스 복강에서 증식시켜 생산된 항체를 복수로부터 회수하는 방법, 또는 무혈청 배지에서 배양 상청액으로부터 항체를 얻는 방법을 사용할 수 있다. 단편 펩티드의 경우에는 항체 분자를 효소 처리하여 얻을 수 있지만, 유전 공학 기술에 의해 세균, 효모 등에서 생산할 수도 있다. 이들 방법으로 얻은 모노클론 항체, 모노클론 항체 유래된 항체 단편, 펩티드 등을 조합함으로써 결합성을 보다 강하게 할 수 있다.
현재, 세포의 분리 방법으로는 항체를 이용하여 표적 세포만을 특이적으로 분리시키는 방법이 개발되고 있다. 예를 들면, 형광 항체로 표식한 세포의 분리법, 수불용성 담체 상에 표적 세포에 친화성이 있는 리간드를 고정화시키고 여기에 표적 세포를 직접 또는 간접적으로 결합시키는 방법, 면역 흡착 칼럼에 의한 분리법 및 면역 자기 비드를 이용하는 분리법 등이 있다.
형광 항체로 표식한 세포의 분리법은 먼저 세포 혼합액을 표적 세포 상에 발현되는 막 항원을 인식하는 형광 표식된 모노클론 항체와 함께 인큐베이트한 후 처리된 세포에 셀 소터(cell sorter) 등으로 레이저광을 조사하여, 항체가 결합된 세포만 발광하는 것을 이용하여 형광 항체가 결합된 세포를 분리하는 방법이다.
국제 특허 공개 공보 제W0 87-04628호에는 표적 세포의 막 표면에 존재하는 항원에 대한 모노클론 항체를 분리 장치의 표면에 직접 고정화시켜 이용하는 방법과, 먼저 세포 혼합액을 표적 세포 상의 막 항원에 결합하는 모노클론 항체와 함께 인큐베이트한 후, 세포 표면 상의 항체에 결합하는 항-면역글로불린 항체와 같은 리간드를 고정화시킨 세포 분리 장치에서 처리하는 방법이 기재되어 있다. 세포 분리는 담체 또는 장치에 고정화시킨 모노클론 항체에 대해 상기 항원 양성 세포가 직접 또는 간접적으로 결합하여 수행되는 세포 분리 방법이다. 이들 방법에서는 항체를 고정화시킨 플라스틱 샬레 상에서 분리가 일어나며, 세포 혼합액을 최초 항체를 고정화시킨 플라스틱 샬레 상에 붓고, 항체를 표적 세포 상의 막 항원과 결합시키기 위해 인큐베이트시킨다. 인큐베이트시킨 후, 플라스틱 샬레를 세정하여 결합하지 않은 세포를 제거하여 분리시킨다. 면역흡착 칼럼법은 표적 세포 상의 막 항원에 대한 항체 등의 리간드를 비드 표면에 고정화시키고, 이것을 칼럼에 충전시켜 여기에서 세포 분리를 수행하는 것이다.
국제 특허 공개 공보 제W0 91-16116호에는 표적 세포 상의 막 항원에 대해 비오틴 표식한 항체를 세포 혼합액 중에 첨가하여 인큐베이트함으로써 세포-항체-비오틴 결합을 형성한 후, 다공질 아크릴아미드 겔에 아비딘을 고정화시킨 비드를 충전시킨 칼럼을 통해 통과시킴으로써, 비오틴-아비딘의 강한 결합을 이용하여 표적 세포를 칼럼 내에 결합시켜 분리하는 방법이 기재되어 있다.
면역 자기 비드법에서는 먼저 세포 혼합액을 항체가 결합된 자기 비드와 함께 인큐베이트하여 표적 세포를 자기 비드로 표식시킨다. 표식시킨 후, 자기 장치를 이용하여 표식되지 않은 세포로부터 표식된 세포를 분리한다.
그러나, 이들 방법에 의해 세포 분리를 실행하기 위해서는 다량의 항체 분자가 필요하며, 특히 의료 현장에 응용할 때에는 비용이 문제가 된다. 본 발명에 의해 생산된 재조합 항체에 의해 이 비용을 쉽게 감소시킬 수 있다.
동일 세포를 인식하는 2종류 또는 2종류 이상의 항체를 직접 고정화시킨 담체 중 하나로서 수불용성 담체를 이용할 수 있다. CD4 분자와 그 밖의 CD4 양성 세포에서 발현하는 다른 분자, 예를 들면 G 단백 공액형 수용체로서, HIV 감염의 제2 수용체로서 기능하는 Fusin (CXCR-4) [Feng, Y 등, Science, 272(5263), 872-877 (1996)]과 HIV 감염의 제2 수용체로서 또한 기능하는 CCR-5 [Deng, H 등, Nature, 381(6584), 661-666 (1996)] 등과의 조합도 가능하다. 이들 분자는 발현 빈도가 낮고 분리 효율이 나쁘지만, CD4 분자를 인식하는 항체와 동시에 이들 분자를 인식하는 항체를 조합함으로써, 이들 발현된 세포를 단리할 수 있다.
유사하게, 동일한 세포 상의 상이한 항원 분자들을 인식하는 2종류 또는 2종류 이상의 항체를 직접 고정화시킨 담체를 이용할 수도 있다. CD34 분자와 그 밖의 미분화 세포에서 발현되는 다른 분자, 예를 들면 SCF 수용체인 c-키트 [Yarden 등, EMBO J., 6, 3341 (1987)], 수용체 FLK-2 [Mathews 등, Cell, 65, 1143 (1991)]와 인터루킨-3 수용체의 α쇄 [Kitamura 등, Cell, 66, 1165 (1991)] 등과의 조합도 가능하다. 이들 분자도 발현 빈도가 매우 낮고 분리 효율이 나쁘지만, CD34 분자와 동시에 항체를 조합함으로써, 이들 발현된 세포를 단리할 수 있다.
예를 들면, 비오틴 또는 자기 비드를 미리 세포에 고정화시킬 항체에 결합시킨 후, 비오틴 또는 자기 비드에 결합하기 쉬운 물질, 예를 들면 아비딘 또는 자석에 결합하거나 이를 포함하는 수불용성 담체를 반응시킴으로써 세포가 결합된 수불용성 담체를 쉽게 회수할 수 있다. 또한, 표적 조혈 미분화 세포에 CD34 항체를 반응시킨 후, 항-면역글로불린 항체가 결합된 수불용성 담체와 반응시키고 수불용성 담체를 세정하거나 회수함으로써, 표적 세포만을 선택적으로 분리할 수 있다. 수불용성 담체인 자기 비드에 고정화시킨 항체를 이용하면, 자석 등에 의해 보다 효율적으로 분리할 수도 있다. 본 발명에 사용되는 용기 형상으로는 수불용성 담체를 충전한 칼럼, 수불용성 담체를 충전한 플라스크형 또는 플라스크형 케이스가 예시된다. 이러한 용기 형상과 항체를 직접 또는 간접적으로 고정화시킨 불용성 담체를 조합함으로써 조혈 미분화 세포 분리 장치를 제작할 수 있다. 또한, 이들 장치는 세포 현탁액, 생리식염수 등을 흘려보내는 펌프와 조합함으로써 세포 분리 시스템으로서 이용성을 높일 수 있다.
본 발명에 사용되는 용기 형상으로는 수불용성 담체를 충전한 칼럼, 수불용성 담체를 충전한 플라스크형 또는 플라스크형 케이스가 예시된다. 이러한 용기 형상과 항체를 직접 또는 간접적으로 고정화시킨 불용성 담체를 조합함으로써 CD4 양성 세포 분리 장치를 제작할 수 있다. 또한, 이들 장치는 세포 현탁액, 생리식염수 등을 흘려보내는 펌프와 조합함으로써 세포 분리 시스템으로서 이용성을 높일 수 있다.
항체를 수불용성 담체에 고정화시킬 때, 항체와 수불용성 담체 사이에 스페이서를 개재하여 결합시키는 것도 유용하다. 또한, 필요에 따라 수불용성 담체와 화합물을 임의의 길이의 분자 (스페이서)를 통해 서로 결합시킬 수도 있다. 스페이서에 관한 상세한 내용은 예를 들면, 문헌["Affinity Chromatography" K. Kasai등, Tokyo Kagaku Dojin Publishing (1991) p.105-108]를 참조할 수 있다. 스페이서의 예로서는 폴리메틸렌 사슬과 폴리에틸렌글리콜 사슬 등을 들 수 있다. 스페이서의 길이는 500Å 이하인 것이 바람직하고, 200Å 이하인 것이 더 바람직하다. 화합물을 스페이서를 통해 수불용성 담체에 결합시키는 방법으로서는 예를 들면 수불용성 담체로서 아가로스를 사용하는 경우, 아가로스의 히드록실기와 스페이서로서 사용하는 헥사메틸렌 디이소시아네이트의 한쪽 이소시아네이트기를 반응시켜 결합시키고, 남은 이소시아네이트기와 항체의 아미노기, 히드록실기 또는 카르복실기 등을 반응시켜 결합시키는 방법 등을 들 수 있다.
본 발명에서 말하는 수불용성 담체는 실온의 수용액 중에서 고형 상태인 것을 말하며 어떠한 형상이어도 좋다. 형상의 예로는 구형, 입방형, 평면형, 칩형, 섬유형, 평막형, 스폰지형, 중공사형 등을 들 수 있다. 이들 중에서 세밀한 충전이 쉽고, 항체를 표면에 비교적 균질하게 유지시킬 수 있고, 실유효 면적을 비교적 많이 확보할 수 있으며 세포 현탁액의 유동성의 면에서 구형, 입자형 및 섬유형의 것이 바람직하다.
수불용성 담체의 재질은 표면에 항체를 유지할 수 있으면 무기 화합물이거나 유기 화합물이거나 상관없지만, 세포 현탁액과 접촉시 용출물이 적고, 형상 제어가 보다 쉽다는 점에서 유기 고분자 화합물이 바람직하다. 그 예로는 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트 에스테르, 폴리아크릴레이트 에스테르, 폴리아크릴산, 폴리비닐알코올 등의 비닐계 화합물 또는 그의 유도체의 중합체 및 공중합체; 나일론 6 또는 나일론 66 등의 폴리아미드계 화합물; 폴리에틸렌 테레프탈레이트 등의 폴리에스테르계 화합물; 셀룰로오스 등의 식물 유래 다당류계 화합물 등을 들 수 있다. 또한, 이들과 자석을 조합함으로써 이들 수불용성 담체를 쉽게 회수할 수도 있다.
수불용성 담체를 수식하고 표면에 친수성을 부여하는 것도 본 발명에서 바람직하게 이용된다. 알부민, 글로브린 등의 생체 유래 단백질을 고정화시키고, 합성 관능기를 도입함으로써 수불용성 담체 표면에 친수성을 부여할 수 있다. 친수성을 부여하는 합성 관능기의 예로는 반복 단위 2 내지 1500의 폴리에틸렌글리콜 사슬, 히드록실기, 아미드기, 에테르기 및 에스테르기를 포함한다. 단, 폴리에틸렌글리콜 사슬과 히드록실기는 서로 결합할 수 있거나 별도로 존재할 수 있다. 친수성을 부여하는 폴리에틸렌글리콜 사슬을 갖는 단량체의 예로는 메톡시디에틸렌글리콜 메타크릴레이트, 메톡시트리에틸렌글리콜 메타크릴레이트 등의 말단 메톡시메타크릴레이트; 메톡시디에틸렌글리콜 아크릴레이트, 메톡시트리에틸렌글리콜 아크릴레이트 등의 말단 메톡시아크릴레이트; 및 메틸기 대신 수소 원자가 결합된 말단 히드록실기를 갖는 메타크릴레이트 및 아크릴레이트; 또는 말단에 중합성 관능기를 1개 이상 갖는 반복 단위 2 내지 1500의 폴리에틸렌글리콜 사슬을 갖는 단량체 전반을 들 수 있다. 또한, 담체에 직접 결합시키는 경우, 반복 단위 2 내지 1500의 폴리에틸렌글리콜 유도체도 포함된다. 친수성을 부여하는 그 밖의 다른 치환기를 갖는 단량체의 예로는 비닐피롤리돈 등을 들 수 있지만 이것으로 한정되는 것은 아니다. 또한, 중합성 관능기가 1개 이상 존재할 수도 있다. 중합성 관능기는 단독 또는 2개 이상의 관능기에 의해 중합할 수 있는 관능기를 나타내며, 그 예로는 비닐기, 아세틸렌기, 디엔기 등의 탄소-탄소 다중 결합과 에폭시기, 옥세탄기 등의 환 구조 등을 들 수 있지만 이것으로 한정되는 것은 아니다.
또한, 비이온성 관능기가 상기 관능기와 함께 존재할 수도 있으며, 그 예로는 비이온성 관능기, 특히 친수성 향상을 목적으로 한 디메틸아미드기, 디에틸아미드기, 디이소프로필아미드기 등의 아미드기; 폴리에틸렌 테레프탈레이트 사슬, 폴리부틸렌 테레프탈레이트 사슬 등의 방향족 폴리에스테르 사슬 및 지방족 폴리에스테르 사슬 등의 폴리에스테르 사슬; 메틸렌글리콜 사슬 및 프로필렌글리콜 사슬과 같은 폴리에테르 사슬; 폴리카르보네이트 사슬 등의 비이온성 친수성 관능기, 또는 소수성 부여를 목적으로 한 알킬 사슬, 불화알킬 사슬, 알릴 사슬 등의 비이온성 관능기 전반을 포함한다. 이상의 임의의 관능기가 공존할 수도 있지만, 바람직하게는 비이온성 친수성 관능기를 갖는 경우가 우수한 결과를 제공한다.
수불용성 담체를 수식하고 그 표면에 친수성을 부여하는 방법으로는 공유 결합, 이온 결합, 방사선 또는 플라즈마에 의한 그래프트법; 물리 흡착; 임베딩 (embedding); 또는 기재 표면으로의 침전물의 불용화 등 모든 공지된 방법을 사용할 수 있다. 따라서, 방사선 또는 플라즈마 등을 사용하여 고분자 화합물 또는 그 단량체를 그래프트 중합시키거나 또는 공유 결합을 형성하는 등의 공지된 방법에 의해 표면 개질 (일본 특허 공개(평)1-249063호 공보, 일본 특허 공개(평)3-502094호 공보)을 수행하는 방법이 본 발명에 바람직하게 이용된다.
수불용성 담체의 표면에 항체를 고정화시키는 방법으로는 수불용성 담체 표면에 항체를 화학적 수단이나 방사선 또는 전자선을 이용한 그래프트법에 의해 공유 결합시키는 방법, 또는 화학적 수단에 의해 수불용성 담체의 표면 상의 관능기를 통해 공유 결합시키는 방법 등이 있다. 이 중에서 관능기를 통한 공유 결합 방법이 사용시 항체 용출의 위험이 없어 바람직하다. 수불용성 담체가 피복층을 갖는 경우, 항체를 피복층 표면 상에 불용화시킬 수도 있다.
수불용성 담체 또는 그의 피복층의 표면에 항체 고정화를 위한 활성기를 얻는 방법의 일례로서 할로겐화 시안법, 에피클로로히드린법, 비스에폭시드법, 브로모아세틸브로마이드법, 할로겐화 아세트아미드법 등이 있다. 구체적으로는 아미노기, 카르복실기, 히드록실기, 티올기, 산무수화물, 숙시닐아미드기, 치환성 할로겐기, 알데히드기, 에폭시기, 트리실기 등을 들 수 있다. 항체 고정화의 용이성의 면에서 브로모시안법, N-히드로숙신이미드기법, 할로겐화 아세트아미드법이 특히 바람직하다.
활성기에 사용되는 할로아세트아미노메틸화제로서는 N-히드록시메틸클로로아세트아미드, N-히드록시메틸플루오로아세트아미드, N-히드록시메틸브로모아세트아미드, N-히드록시메틸요오도아세트아미드 등을 유리하게 사용할 수 있다. 이 중에서도 경제성과 안정성의 면에서 바람직하게는 N-히드록시메틸브로모아세트아미드, N-히드록시메틸요오도아세트아미드 등을 유리하게 사용할 수 있다. 수불용성 담체에 도입된 플루오로기 또는 클로로기는 활성기를 도입시킨 후, 요오드화칼륨 또는 브롬화칼륨 용액으로 처리함으로써 쉽게 요오드기 또는 브롬기로 전환시킬 수 있다. 이들 활성기를 도입시킨 수불용성 담체의 제조에 사용되는 산 촉매로는 강산 특히 프로톤산이면 어떤 것도 좋지만, 비제한적인 예로는 트리플루오로메탄, 메탄, 벤젠, 톨루엔 등의 술폰산 유도체; 및 황산, 염화아연, 염화알루미늄, 사염화주석 등의 프리델-크래프츠(Friedel-Crafts) 촉매 등을 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 유전자에 의해 생산된 항체에 독소를 결합시켜 만성 관절 류마티즘, 다발성 경화증, 전신성 홍반성 낭창 등의 환자에게 투여하여, 자기 반응성 항원 수용체를 갖는 CD4 양성 림프구 클론을 감소시킬 수 있다. 또한, 이러한 수식된 항체는 혈액분리반출법(haemapheresis)에 의해 회수한 환자의 말초혈과 말초혈 백혈구 현탁액에도 이용할 수 있다. 또한, 다른 항체에서 유래된 가변 영역의 유전자를 조합함으로써 2중 특이적 항체 및 다중 특이적 항체의 생산도 가능하다.
또한, 본 발명은 상기 기재한 본 발명의 모노클론 항체와 의약적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물을 제공한다.
이와 같이 얻은 본 발명의 항CD4 항체 유전자로 항CD4 항체를 효율적으로 생산할 수 있으며 다양한 형태의 치료 제제를 제공한다. 이와 같이 생산된 재조합 항체는 인체에 투여할 때 이 항체의 활성을 유지시키기 위해 사용되는 물질, 예를 들면 의약적으로 허용되는 조성의 담체 또는 안정화제 등과 함께 의약 조성물 중에 포함될 수도 있다. 이러한 담체나 안정화제로서는 인간 혈청 알부민, 젤라틴 등을 예시할 수 있다. 의약적으로 허용된다는 것은 오심, 현기증, 구역질 등 투여에 수반되는 바람직하지 못한 부작용이나, 다수 투여시 제제에 대한 면역 응답 등이 일어나지 않는 것을 의미한다. 또한, 의약적으로 허용되는 적당한 용제, 희석제 또는 안정화제와 함께 용해된 액상 의약 조성물 형태일 수도 있다. 또한, 상기 의약 조성물에 추가로 생체 내에서 농도 조절을 목적으로 하는 마이크로스피어, 리포좀 등의 서방형 이식체를 포함하는 의약 조성물일 수도 있다.
본 발명에 있어서 비경구 투여(주사)하는 경우에는, 키메라 항체와 단쇄 항체는 10 ㎍/kg(체중) 내지 1 ㎎/kg(체중) 정도의 양이 적당하다. 또한, 체외에서 세포를 처리하는 경우에는 O.1 ㎍/㎖ 내지 1 ㎎/㎖ 정도의 양이 적당하다.
다른 항체에서 유래된 가변 영역의 유전자를 조합함으로써 2중 특이적 항체 및 다중 특이적 항체의 생산도 가능하다. 다중 특이적은 상이한 항원 또는 에피톱을 인식하는 항원 결합 부위를 적어도 2종류 이상 갖는 항체를 의미한다. 이 중에서 2중 특이적은 상이한 항원 또는 에피톱을 인식하는 항원 결합 부위를 2종류 이상 갖는 항체를 나타낸다. 예를 들면, 통상적인 항체의 항원 결합 부위들 중 하나는 CD4 항원 또는 CD34 항원을 인식하고, 다른 하나의 항원 결합 부위는 T 림프구 항원 CD3 등을 인식하도록 2중 특이화한 항체는 CD4 양성 T 림프구 또는 CD34 양성 백혈병 세포 내의 림프구를 보다 강하게 인식할 수 있어서, 백혈병 세포 등을 제거하는 효과를 유도할 수 있다. CD3 이외에도 일반 림프구 마커, 예를 들면 CD2, CD5, CD6, CD7 등을 이용할 수 있다. 이들을 조합하여 IgM으로 발현시킴으로써 2중 특이적 또는 다중 특이적인 항체를 제작할 수 있다. 이러한 생산시에 2중 특이화하는 것 이외에, 모노클론 항체를 생산하여 정제한 후 항체들을 서로 결합시킴으로써 2중 특이화 또는 다중 특이화할 수 있다.
단쇄 항체의 경우, 생산시에 2중 특이화 또는 다중 특이화가 가능하며, 2중 특이적 또는 다중 특이적 항체는 1개 펩티드 내에 복수의 항원 인식 부위의 조합의 H쇄와 L쇄를 반복적으로 배열함으로써 생산할 수 있다. 생산하여 정제한 후 결합시킬 수도 있다.
이들을 상이한 항원에 대해서 뿐만 아니라, 동일 분자 내의 상이한 에피톱에 조합시킬 수 있으며, 예를 들면 상이한 항CD4 항체를 조합시킬 수도 있다. 항CD4 항체로는 몇 가지 보고되어 있다. 예를 들면, Leu-3a 항체, Leu-3b 항체 (벡톤 디킨슨(Becton Dickison)), 0KT4 항체, 0KT4A 항체 (오르소(Ortho)), T4 항체 (콜터(Coulter)), MT310 항체 (다코(Dacco)), F101-69 항체, 16P25 항체 (바이오시스(Biosys)), Edu-2 항체, MEM-115 항체 (신바스 바이오테크놀로지(Synbas Biotechnology)), 7E14 항체 (엑셜피아 코포레이션(Exulfia Corporation)), BL4 항체, 13B8.2 항체 (이뮤노텍크(Immunotec)), KT69-7 항체 (랩 비젼 코포레이션(Lab Vision Corporation)), B-F51 항체 (프로겐 바이오테크닉(Progen Biotechnique)), BL-TH4 항체 (선 바이오 BV (Sun Bio BV)), 94B1 항체, L197 항체, L80 항체, L93 항체, L201 항체, L34 항체, L202 항체, L200 항체, L252 항체, 73F11 항체, 72G4 항체, NUTH1 항체, L71 항체, RFT4 항체, MT151 항체, MT321 항체 [D.G. Healey 등, Eur. J. Immunol., 21, 1491 (1991)], 0KT4B 항체, OKT4C 항체, 0KT4D 항체, 0KT4E 항체, 0KT4F 항체, Q6D3 항체, L77 항체, L104 항체, L83 항체, L190 항체, L122 항체, L120 항체 [Matthias Merkenschlager 등, The J. Immunol., 145, 2839 (1990)] 등이 알려져 있고, 이들 항체 유전자를 단리하여 생산에 이용할 수 있다.
마찬가지로 이들을 상이한 항원에 대해서 뿐만 아니라, 동일 분자 내의 상이한 에피톱에 조합시킬 수 있으며, 예를 들면 상이한 항CD34 항체를 조합시킬 수도 있다. 항CD34 항체로는 몇 가지 보고되어 있다. 예를 들면, 항HPCA-2 항체 (벡톤 디킨슨), 항HPCA-1 항체 (벡톤 디킨슨), 4A1 (니치레이(Nichirei)), B1.3C5 [Katz 등, Leuk. Res. 9, 191 (1985)], 12.8, 115.2 [Andrews 등, Blood, 67, 842 (1986)], ICH3 [Watt 등, Leukaemia, 1, 417 (1987)], Tuk3 [Unchanska-Ziegler 등, Tissue Antigens, 33, 230 (1989)], QBEND10 [Fina 등, Blood, 75, 2417 (1990)], CD34(Ab-1) (온코젠 사이언스(Oncogene Sciences)), Immu-133 [Barrande 등, Hybridoma, 12, 203 (1993)] 등이 알려져 있으며, 이들의 항체 유전자를 단리하여 생산에 이용할 수 있다.
H쇄와 L쇄의 조합에 의해서만이 아니라, H쇄 또는 L쇄만의 펩티드를 이용할 수도 있다. 이러한 항체종은 이용하는 용도에 따라 선택할 수 있으며, 결합 강도, 항원성 등에 의해 선택할 수 있다.
단쇄 항체의 아미노산 서열을 서열 목록에서 서열 9와 서열 10에 나타냈다. 또한, 이들을 코드하는 핵산 서열의 예를 아미노산 서열과 함께 나타냈다. 서열 9에서 아미노산 서열 1위 내지 22위는 대장균으로부터의 분비 시그널을 포함하는 서열을, 아미노산 23위 내지 133위는 L쇄의 가변 영역을, 아미노산 134위 내지 148위는 링커를, 아미노산 149위 내지 266위는 H쇄의 가변 영역을, 아미노산 267위 내지 305위는 FLAG-tag (아미노산 270위 내지 277위), c-myc-tag (아미노산 281위 내지 290위) 및 HisX6-tag (아미노산 296위 내지 301위)를 포함하는 서열을 나타낸다. 서열 10에서 아미노산 서열 1위 내지 22위는 대장균으로부터의 분비 시그널을 포함하는 서열을, 아미노산 23위 내지 140위는 H쇄의 가변 영역을, 아미노산 141위 내지 155위는 링커를, 아미노산 156위 내지 266위는 L쇄의 가변 영역을, 아미노산 267위 내지 305위는 FLAG-tag (아미노산 270위 내지 277위), c-myc-tag (아미노산 281위 내지 290위) 및 HisX6-tag (아미노산 296위 내지 301위)를 포함하는 서열을 나타낸다.
서열 9와 서열 10에 기재한 아미노산 서열의 1위 내지 20위를 결실(缺失)시켜 대장균 세포 내에서 단쇄 항체를 발현시킬 수도 있다. 또한, 서열 9와 서열 10에 기재한 아미노산 서열의 267위 내지 305위는 단쇄 항체의 검출 및 정제를 위한 서열이며, 결실시키거나 임의의 서열로 치환시킬 수 있다. 대장균으로부터의 분비 시그널과 검출 및 정제를 위한 서열을 포함하는 벡터의 제작은 참고예 2에 나타냈다. 서열 9의 아미노산 서열 134위 내지 148위와 서열 10의 아미노산 서열 141위 내지 155위의 링커는 L쇄와 H쇄의 가변 영역의 입체 구조를 4H5 항체와 실질적으로 동일하게 유지할 수 있는 것이면 어떠한 서열로도 치환할 수 있다. 서열 9와 서열 10에 기재한 아미노산 서열의 305위에서 Lys 잔기는 수불용성 담체에 고정화시킬 때 단쇄 항체 분자의 방향성을 정리하는 등으로 유효하게 기능하지만, 고정화 효율을 보다 높이기 위해 Lys 잔기를 다수 도입시킬 수도 있다. 또한, Cys 잔기를 도입하는 것도 유효하다. 상술한 바와 같은 개질은 유전 공학 기술에 의해 쉽게 실시할 수 있다.
본 발명의 실시에서, 발현 플라스미드 pG1에 삽입된 정상 영역 유전자는 Cγ1이기 때문에 각 클론은 IgG1로서 발현한다. 항체 생산시에는 혈청 유래된 소 항체의 혼입을 피하기 위해, 무혈청 DMEM 배지에서 배양하는 것이 바람직하다. 이와 같이 배양 상청액 중에 분비된 항CD34 항체는 예를 들면 프로테인 A 또는 프로테인 G를 이용하는 일반적인 IgG 항체 정제법으로 쉽게 정제할 수 있다. 공업적 생산의 경우, 숙주로서는 CHO 세포와 골수종 Sp 2/0 세포가 잘 알려져 있다 [Xiang, J. 등 (1990) Mol. Immun., 27, 809; Bebbington, C.R. 등 (1992) Bio/technology, 10, 169: Larrick, J.W. 및 Wallace, E.F. 등 (l992) Imunol. Rev. 130, 69-85; Deyev, S.M. 및 Lieber, A. 등 (1994) Appl. Biochem. Biotechnol. 47(2-3), 143-54].
예를 들면, CH0 세포의 경우 MTX 등의 약제를 사용하여 생산성이 높은 클론을 선택하는 방법도 보고되었으며 [Bebbington, C.R. (1991) METHODS: A Companion to Methods in Enzymology, 2(2), 136-45], 안정한 고생산 세포주를 얻을 수 있으면, 이 세포주를 재조합 항-인간 CD34 항체의 공업적 생산에 이용할 수 있다.
항체 형상으로는 생산된 항체 분자를 그대로 사용할 수도 있지만, 각종 프로테아제로 처리하여 얻어지는 항원 결합 부위를 포함하는 단편인 Fab, F(ab')2, Fv 또는 Fd 등도 적용할 수 있다. 이들 단편에 대해서는 문헌["Introduction to Antibody Engineering", Kanemitsu, p.20-22 (Chijinshokan)] 등에 설명되어 있다. 이 외에도 본 발명을 인간 체내 혈액의 체외 순환에 응용하는 경우에도, 항체가 혈액 중에 유리되는 경우의 부작용과 항원성 등을 고려하여 가변 영역 이외의 부분을 인간형 항체로 만든 키메라 항체를 사용하는 것이 유용하다. 이들 항체의 제작 방법은 특히 한정되지는 않지만, 고순도로 정제된 것을 사용해야 한다. 모노클론 항체의 생산 방법은 통상적으로 행해지는 바와 같이 하이브리도마를 마우스 복강에서 증식시켜 생산된 항체를 복수로부터 회수하는 방법, 또는 무혈청 배지에서 배양한 배양 상청액으로부터 항체를 얻는 방법이 있다. 단편 펩티드의 경우에는 항체 분자를 효소 처리하여 얻을 수 있지만, 유전 공학 기술에 의해 세균, 효모 등에서 생산할 수도 있다. 이들 방법으로 얻은 모노클론 항체, 모노클론 항체 유래된 항체 단편, 펩티드 등을 조합함으로써 결합성을 보다 강하게 할 수 있다.
CD34 분자는 시빈(Civin) 등에 의해 보고되어 [미국 특허 제4,965,204호 및 J. Immunology, 133, 157 (1984)], 혈액의 미분화 세포 상에 특이적으로 발현하는 미분화 세포의 항원 마커로서 알려져 있다. 이 항원 마커를 사용하여 미분화 세포를 분리하는 시도가 보고되었다 [S. Saeland 등, Blood, 72, 1580 (1988) 등]. 또한, 항CD34 항체와 비오틴 및 아비딘 또는 자기 비드를 조합하여, 분화된 세포군과 암 세포로부터 미분화 세포를 분리하는 의료 기기가 개발되고 있다 [Dreger 등, Exp. Hematol., 23, 147 (1995)].
본 발명에 의해 분리되는 조혈 미분화 세포 (CD34 양성 세포)는 특정한 자극에 의해 증식할 수 있는 세포로서, 적혈구, 단핵세포, 과립구, 림프구, 마크로파지 등의 성숙한 세포군을 이들 중 1종류 이상으로 분화할 수 있는 세포를 나타낸다. 특히, 반고형 배지에서 적당한 증식 인자의 존재 하에 배양했을 때 콜로니를 형성하는 미분화된 혈액 세포와 모든 계열로의 분화능과 자기 증식능을 갖는 조혈 간(杆)세포를 포함한다. 이 세포는 골수와 제대혈(臍帶血)에 풍부하게 포함되어 있다. 또한, 이 세포는 말초혈 중에도 포함되어 있지만, 과립구 콜로니 형성 인자 (G-CSF) 등의 사이토카인을 투여하여 말초혈 중에서 유도할 수도 있다. 또한, 이들 세포를 배양함으로써 체외에서 조혈 미분화 세포를 증식시키는 기술도 보고되고 있다. 이들 조혈 미분화 세포를 함유하는 세포 현탁액은 본 발명에 의해 조혈 미분화 세포를 분리하기 위한 재료로서 사용할 수 있다.
본 발명의 세포 분리 장치를 의료 기기로서 사용하여 조혈 미분화 세포를 분리할 수 있다. 체외에서 혈액 세포 현탁액으로부터 또는 체외 순환에 의해 혈액으로부터 조혈 미분화 세포를 효율적으로 분리할 수 있으며, 분리된 세포는 각종 질환의 치료에 사용할 수 있다.
혈액과 같이 여러가지 세포종을 함유하는 용액으로부터 필요한 조혈 미분화 세포를 단리 또는 농축하거나, 또는 필요하지 않은 세포를 제거하는 것은 의료 효과를 높이는데 있어서 효과적인 수단이다. 골수 이식은 골수가 파괴된 백혈병 환자 등의 암 환자와 재생불량성 빈혈 등의 선천성 면역 질환 환자에게 정상적인 조혈 미분화 세포를 이식하는 방법으로서, 이들 환자에 대한 효과적인 치료법 중 하나로서 정착하고 있다. 최근에는, 조혈 미분화 세포를 골수에서 뿐만 아니라, 말초혈 또는 제대혈로부터 얻는 방법이 사용된다. 동종 골수 이식은 백혈구형인 HLA 형이 거의 일치하는 건강한 사람에게서 회수한 골수액을 항암제나 방사선에 의해 골수가 파괴된 환자에게 투여하는 방법인데, 이 방법의 문제점은 거절 반응의 일종인 GVHD (이식편 대 숙주병)을 일으키는 것이다. 따라서, 최근 조혈계의 악성 종양이나 암 치료에서 행해지는 자가 골수 이식법 또는 동종 골수 이식법의 결과로서 야기되는 이식편 대 숙주병(GVHD)을 예방하기 위해, 조혈 미분화 세포의 분리 수요가 증가하고 있다.
본 발명의 특징 중 하나는 재조합 항체를 이용하는 것이며, 재조합 항체를 이용함으로써 불용성 담체에 고정화하기 쉬운 항체로 개질시킬 수 있다. 항체를 구성하는 펩티드의 C 말단 또는 N 말단에 아미노산 서열을 부가함으로써 항체를 불용성 담체 등의 기재에 효과적으로 고정할 수 있다.
인간-마우스 키메라 항체의 경우에는, H쇄와 L쇄의 C 말단, N 말단 또는 이들의 조합에서 원래 항체가 갖고 있지 않던 서열로서 염기성 또는 산성 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 부가한다. Fc 부분의 도중에 서열을 유전학적으로 개질하여 염기성 또는 산성 아미노산으로 하는 경우에도, 개질된 부분을 포함시킨 C 말단측은 부가된 아미노산 서열이라고 볼 수 있다. 인간-마우스 키메라 항체에 한정되지 않고, Fc 부분을 불용성 담체에 쉽게 결합하도록 하는 것이 분리 장치 등을 제작하는데 적합하다.
단쇄 항체에 있어서는, 펩티드의 C 말단 또는 N 말단에 펩티드를 기재에 고정화하기 위한 서열을 부가하는 것이 바람직하다.
부가되는 서열에 포함된 아미노산으로서 염기성 아미노산 또는 산성 아미노산을 포함하는 서열이 바람직하지만, 항체를 기재에 고정화시키는 것을 목적으로 하는 것이면 어떠한 아미노산이라도 본 발명에 포함된다.
염기성 아미노산으로는 리신, 히드록시리신, 아르기닌, 히스티딘 등을 들 수 있다. 산성 아미노산으로는 아스파라긴산, 글루타민산 등을 들 수 있다. 특히, 리신, 글루타민산, 아스파라긴산을 사용하는 것은 보다 효율적이다.
서열의 길이는 특별히 한정되지는 않지만, 리신, 아스파라긴산, 글루타민산 등의 1개의 아미노산을 부가하는 것이라도 효과적이다. 그러나, 이들 아미노산을 다수 포함시킨 서열을 부가하는 것이 보다 효과적이다. 단쇄 항체의 경우와 같이 저분자량의 항체에 부가하는 경우에는, 비교적 긴 서열을 부가함으로써 기재에 고정화된 후 항체가 항원에 결합할 때 입체 장해가 적어지므로 분리 장치로서 보다 큰 효과가 기대된다.
본 발명의 서열에 부가된 항체는 검출용 색소 등과 쉽게 결합하기 때문에, 항원에 결합된 항체를 검출함으로써 항원을 검출 및 측정할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 설명하지만, 이들 실시예는 구체적인 예로서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하는 것으로 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
＜참고예 1＞
pG1 플라스미드를 제작하였다. 막 결합형 인간 항체의 발현 벡터 pSE (국제 특허 공개 공보 제W0 95/15393호)의 막 관통 영역(TM)을 제거하여, 인간 항체를 분비 발현할 수 있는 벡터를 제작하였다. 우선 발현 벡터 pSE를 제한 효소 SalI로 소화시킨 후 절단 말단을 평활화하였다. 이 반응은 DNA 블런팅 (Blunting) 키트 (다까라 슈조(TaKaRa Shuzo))를 사용하여 첨부된 프로토콜에 따라 조작하였다. 상기한 바와 같이 처리한 발현 벡터 pSE를 제한 효소 ApaI로 소화시킨 후, 0.7% 아가로스 겔에서 전기영동하여, Cγ1 유전자와 막 관통 영역(TM)을 포함하는 유전자 영역이 결실된 pSE 벡터 DNA를 추출하여 정제하였다. 이 반응은 GeneClean II 키트 (Bio 101)를 사용하여 첨부된 프로토콜에 따라 조작하였다. 추출한 pSE 벡터의 제한 효소로 절단한 말단은 소 알칼리 포스파타제 (다까라 슈조)로 처리하여 자기 환화(ligation)가 일어나지 않도록 하였다. 이어서, 전체 길이의 인간 Cγ1 유전자가 삽입된 플라스미드 DNA pUCCG1을 제한 효소 KpnI (다까라 슈조)로 소화시키고 절단 말단을 평활 말단으로 만든 후, 제한 효소 ApaI로 소화시켰다. 이 반응물을 0.7% 아가로스 겔에서 전기영동하여, 전체 길이의 Cγ1 유전자를 포함하는 DNA 단편을 추출 정제하였다. 이 DNA 단편과 앞서 처리한 pSE 벡터를 라이게이션 (ligation) 키트 ver.2 (다까라 슈조)를 사용하여 결찰하고, 결찰된 산물을 대장균 DH5 균주에 도입하였다. 출현한 콜로니 중에서 몇개를 선정하여 배양하고, 통상의 방법에 따라 플라스미드 DNA를 추출 정제하였다. pSE 벡터에 존재하는 적당한 제한 효소를 이용하여 이들 플라스미드의 절단 패턴을 조사하여, 예상된 패턴과 일치하는 것을 선택하였다. 이상의 조작으로 얻어진 플라스미드를 pG1이라고 하였다. 도 2에 pG1 플라스미드를 나타냈다.
＜참고예 2＞
단쇄 항체 (ScFv 항체)를 생산하는 벡터로는 항CD4 항체 유전자를 도입하기 전에 미리 대장균으로부터의 분비 시그널과 정제 및 검출용 태그를 코드하는 서열을 포함하는 플라스미드를 제작하였다. 대장균으로부터의 분비 시그널 (PelB 단백질의 시그널 서열)은 서열 목록의 서열 21 (5'TCATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCGGCCCAG3')과 서열 22 (5'TGCGGCCGCAGCCATGGTGTTTGCGGCCATCGCCGGCTGGGCCGCGAGGAGCAGCA3') 2종을 등량 혼합하여 94℃에서 5분간 열변성시킨 후 65℃에서 5분간 어닐링시키고, 72℃에서 10분간 AmpliTaq DNA 폴리머라제를 갖는 GeneAmp PCR 시약 키트 (GeneAmp PCR Reagent Kit with AmpliTaq DNA Polymerase; 다까라 슈조)를 사용하여 폴리머라제에 의해 신장 반응을 수행함으로써 얻었다. 이 단편을 TA 클로닝 키트 (인비트로젠)를 사용하여 클로닝하였다. 이렇게 하여 대장균으로부터의 분비 시그널을 코드하는 cDNA를 얻었다.
정제 및 검출용 태크를 코드하는 서열은 서열 목록의 서열 23 (5'TGCGGCCGCAGACTACAAGGATGACGATGACAAAGGCTCGAGCGAGCAGAAGCTGA3')과 서열 24 (5'GGTGGGTCGACCTCGAGCCCAGATCCTCTTCGCTGATCAGCTTCTGCTCGCTCGAGC3') 2종을 등량 혼합하여 94℃에서 5분간 열변성시킨 후 60℃에서 5분간 어닐링시키고, 72℃에서 10분간 AmpliTaq DNA 폴리머라제를 갖는 GeneAmp PCR 시약 키트 (다까라 슈조)를 사용하여 폴리머라제에 의해 신장 반응을 수행함으로써 얻었다. 반응 후 샘플을 템플레이트로 사용하고 더욱 이하에 나타낸 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하고, 증폭된 단편을 TA 클로닝 키트 (인비트로젠)를 사용하여 클로닝하였다. 이렇게 하여 정제 및 검출용 태그를 코드하는 cDNA를 얻었다. 프라이머로서는 서열 목록에서 서열 25 (5'TGCGGCCGCAGACTACAAGGATG3')와 서열 26 (5'TAAGCTTATCATTTGGTCGACCCGTGGTGATGATGATGGTGGGTCGACCTCGAGCC3')을 사용하였다. PCR 조건은 AmpliTaq DNA 폴리머라제를 갖는 GeneAmp PCR 시약 키트 (다까라 슈조)를 사용하여 94℃에서 1분, 62℃에서 1분, 72℃에서 1분을 1 사이클로 하여 18회 반복하였다. PCR 장치로는 모델명 DNA Thermal Cycler 480 (퍼킨엘머 (Perkin Elmer))을 사용하였다. 클로닝된 유전자를, 대장균으로부터의 분비 시그널을 코드하는 cDNA는 제한 효소 BspHI (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))와 NotI (다까라 슈조)로 소화시키고, 정제 및 검출용 태크를 코드하는 cDNA는 제한 효소 HindIII (다까라 슈조)와 NotI (다까라 슈조)로 소화시킨 후, 3.5% 아가로스 겔에서 전기영동하여 각 DNA 단편을 절단하여 추출하였다. 아가로스 겔로부터의 DNA 단편 추출에는 PCRprep (프로메가(Promega))를 사용하였다.
pET24d(+) 플라스미드 (노바젠)는 멀티클로닝 자리 중에서 제한 효소 NotI 자리로부터 제한 효소 Bpu1102I 자리까지 미리 제거하였다. pET24d(+) 플라스미드를 제한 효소 NotI (다까라 슈조)와 제한 효소 Bpu1102I (다까라 슈조)로 소화시키고, 클레나우 단편(Klenow fragment; 뉴 잉글랜드 바이오랩스)와 dNTP 믹스쳐 (다까라 슈조)를 사용하여 첨부된 프로토콜에 따라 평활 말단화시켰다. 이들 플라스미드 DNA 단편을 1% 아가로스 겔에서 전기영동하고 절단하여 추출하였다. 이를 자기 환화시켜, 제한 효소 자리를 제거한 pET24d(+) 플라스미드를 얻었다. 자기 환화에는 라이게이션 ver.2 키트 (다까라 슈조)를 사용하였다. 또한, 아가로스 겔로부터의 DNA 단편 추출에는 GeneClean II 키트 (Bio 101)를 사용하였다.
pSE380 플라스미드 (인비트로젠) 또는 상기 제한 효소 자리를 제거한 pET24d(+) 플라스미드를 제한 효소 NcoI (다까라 슈조)과 HindIII (다까라 슈조)로 소화시키고 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동하여, 벡터 DNA 단편을 추출 정제하였다. 상기한 제한 효소로 소화시킨 대장균으로부터의 분비 시그널을 코드하는 cDNA와 정제 및 검출용 태그를 코드하는 cDNA를 이 벡터 단편에 결찰시켰다. 각 결착에는 라이게이션 ver.2 키트 (다까라 슈조)를 사용하였다. 또한, 아가로스 겔로부터의 DNA 단편 추출에는 GeneClean II 키트 (Bio 101)를 사용하였다.
상기 조작에 의해 제작한 ScFv 항체 생산용 플라스미드 벡터들을 각각 pSE380ScFv 및 pET24ScFv라고 하였다. 도 3과 도 4에 이들 각각의 개략도를 나타냈다.
＜실시예 1＞
각종 항체와 인간 CD4와의 결합 친화성을 평가하기 위해 인간 가용성 CD4를 생산하고 정제하였다. 건강한 사람의 말초혈 15 ㎖를 채혈하여, 행크스 균형 생리식염수 (깁코(Gibco))를 첨가하여 30 ㎖로하고, 피-콜팩 (Ficoll-Paque; 파마시아)를 10 ㎖씩 나누어 넣은 원심관 2개에 각각 13 ㎖씩 조심스럽게 중층시키고, 800 rpm (회전/분) 및 20분의 조건에서 분리시켜, 단핵 세포층의 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 행크스액으로 세정하였다. 이 세포 1×1O7개로부터 QuickPrep mRNA 정제 키트 (파마시아)를 사용하여 첨부된 설명서에 따라 mRNA를 단리하였다. 얻어진 mRNA를 템플레이트로 사용하여 제1쇄 cDNA를 합성하였다. 이는 cDNA 합성 키트 (파마시아)를 사용하여 첨부된 설명서에 따라 수행하였다. 그 후, PCR법으로 목적하는 유전자의 개시 코돈에서 막 관통 영역(TM) 이전까지 증폭시키고, 5' 말단 측에 HindIII 자리를 부가하고 3' 말단 측에 FLAG-tag 서열, 정지 코돈 및 NotI 자리를 부가하였다. 프라이머로는 서열 11 (5'AAGCTTATGAACCGGGGAGTCCCTTTTA3')과 서열 12 (5'GCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCTGGCTGCACCGGGGTGGACCA3')를 사용하였다.
PCR 조건은 AmpliTaq DNA 폴리머라제를 갖는 GeneAmp PCR 시약 키트 (다까라 슈조)를 사용하여 94℃에서 1분, 57℃에서 1분, 72℃에서 2분을 1 사이클로 하여 30회 반복하였다. PCR 장치로는 모델명 DNA Thermal Cycler 480 (퍼킨엘머)을 사용하였다. 증폭된 유전자 단편을 TA 클로닝 키트 (인비트로젠)를 사용하여 클로닝하였다. 염기 서열의 결정은 DNA 시퀀서(Sequencer) ver.1.2.0, Model 373A (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems))를 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 표식 반응은 프라이머로서 유니버설 M13 역방향 프라이머 (Universal M13 Reverse primer; 인비트로젠) 또는 유니버설 M13 전방향 프라이머 (Universal M13 Forward primer; 인비트로젠)를 사용하고 PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminator Cycle 시퀀싱 키트 (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 방법은 첨부된 프로토콜에 따라 수행하였다. 염색은 ABI의 라벨링 키트를 사용하여 수행하였다. 얻어진 유전자 서열을 확인한 후, 진핵세포 발현 벡터인 pcDNA3 플라스미드 (인비트로젠)와 클로닝된 인간 가용성 CD4cDNA를 갖는 플라스미드를 제한 효소 HindIII (다까라 슈조)와 제한 효소 NotI (다까라 슈조)로 소화시키고, 통상의 방법에 따라 아가로스 겔에서 전기영동한 후, 벡터와 인간 가용성 CD4cDNA를 추출 정제하였다. 이 반응은 GeneClean II 키트 (Bio 101)를 사용하여 첨부된 프로토콜에 따라 조작하였다. 이들 2가지 DNA를 라이게이션 키트 ver.2 (다까라 슈조)를 사용하여 결찰시키고, 결찰된 산물을 대장균 DH5 균주에 도입하였다. 출현한 콜로니 중에서 몇개를 선정하여 배양하고, 통상의 방법에 따라 플라스미드 DNA를 추출 정제하였다. pcDNA3에 존재하는 적당한 제한 효소를 사용하여 이들 플라스미드의 절단 패턴을 조사하여, 예상된 패턴과 일치하는 것을 선택하였다.
이어서, 얻어진 인간 가용성 CD4 발현 플라스미드를 DEAE 덱스트란법 [Bebbington, C.R. (1991); METHODS: A Companion to Methods in Enzymology, 2(2), 136-45]에 의해 각각 C0S7 세포에 도입하였다. 유전자 도입 4일 전에, C0S7 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS) 함유 둘베코 개질 이글 배지 (DMEM)에 직경 10O ㎜ 디쉬(dish) 당 약 6.1×105개 세포/10 ㎖로 접종하여 배양하였다. 4일 후, 먼저 상청액을 제거하고, PBS(-)로 세포를 조심스럽게 세정한 후, 10% FBS 함유 DMEM 4 ㎖을 첨가한 다음, DEAE 덱스트란/인간 가용성 CD4 발현 플라스미드 혼합액을 세포 상에 균일하게 뿌리고 37℃에서 4시간 인큐베이트하였다. 이 혼합액은 20 ㎎/㎖ DEAE 덱스트란 (파마시아) 수용액과 TBS(-) (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.15M NaCl) 중 인간 가용성 CD4 발현 플라스미드의 0.17 ㎍/㎕ 용액을 2:1비(v/v)로 혼합한 것으로 디쉬 당 180 ㎕를 첨가한다. 인큐베이션한 후, 상청액을 제거하고 10% 디메틸술폭시드(DMSO) 함유 PBS(-) 5 ㎖를 첨가하여 1분간 정치시켰다. 이어서, 상청액을 제거하고 PBS(-)로 세정한 후, 100 μM 클로로퀸 (시그마 (Sigma))을 함유하는 2% FBS 함유 DMEM 7 ㎖를 첨가하고, 37℃에서 3시간 인큐베이트하였다. 그 후, 상청액을 제거하고 PBS(-)로 세정한 후, 1O% FBS 함유 DMEM 10 ㎖를 첨가하여 배양하였다. 다음 날, PBS(-)와 DMEM으로 FBS 함유 DMEM을 충분히 제거한 후, 무혈청 DMEM 10 ㎖를 첨가하여 생산을 개시하였다.
생산 개시로부터 3일 후 배양 상청액을 회수한 후, 약 2주간 생산을 계속하였다. 얻어진 배양 상청액을 모아 항FLAG-M2 겔 (이스트만 케미컬 (Eastman Chemical)) 칼럼 크로마토그래피로 정제하여, 이것을 인간 가용성 CD4의 정제 표준품으로 하였다.
＜실시예 2＞
항-인간 CD4 항체 생산 하이브리도마 4H5 (기탁 번호 FERM BP-6729)를 10% FBS (ICN)를 첨가한 DMEM 배지 (깁코)에서 배양하였다. 하이브리도마는 미리 한계 희석법으로 클론을 분리한 후, 배양 상청액을 인간 가용성 CD4 (리프리젠 (Repligen))를 고정화시킨 ELISA법으로 처리하여 인간 가용성 CD4에 대한 결합성이 높은 클론을 선택하였다. 이 세포 1×1O7개로부터 mRNA를 QuickPrep mRNA 정제 키트 (파마시아)를 사용하여 첨부된 설명서에 따라 단리하였다. 얻어진 mRNA를 템플레이트로 사용하여 제1쇄 cDNA를 합성하였다. 이는 cDNA 합성 키트 (파마시아)를 사용하여 첨부된 설명서에 따라 수행하였다. 그 후, 상기에서 얻은 cDNA를 템플레이트로서 사용하여 PCR법을 실시하여 목적하는 유전자를 증폭시켰다.
H쇄의 취득에 있어서는, 프라이머로서 Mouse Ig-Prime 키트 (노바젠)를 사용하고, 각각 서열 13 (5'GGGAATTCATGRAATGSASCTGGGTYWTYCTCTT3')과 서열 14 (5'CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACNGRTGG3')의 서열을 갖는 프라이머로부터 유전자를 증폭시켰다. PCR 조건은 AmpliTaq DNA 폴리머라제를 갖는 GeneAmp PCR 시약 키트 (다까라 슈조)를 사용하여 94℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 2분을 1 사이클로 하여 30회 반복하였다. PCR 장치로는 모델명 DNA Thermal Cycler 480 (퍼킨엘머)를 사용하였다. 증폭된 유전자 단편은 TA 클로닝 키트 (인비트로젠)를 사용하여 클로닝하였다.
L쇄의 취득에 있어서는, L쇄 펩티드의 N 말단 아미노산 서열을 프로테인 시퀀서 (어플라이드 바이오시스템즈, 492 Protein Sequencer)에 의해 첨부된 프로토콜에 따라 N 말단으로부터 15 잔기를 미리 결정하였다. 센스 프라이머로서는, N 말단 아미노산 서열을 기초로 코드할 수 있는 염기 서열을 다수 합성하였다. 안티센스 프라이머로서는, 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5판, 1991 (USA NIH 발행)]에 기재된 마우스 항체 가변 영역의 유전자 서열을 참고하여, 마우스 항체 유전자 cDNA를 합성할 수 있는 후보 서열을 다수 합성하였다. 이들 센스 프라이머와 안티센스 프라이머를 조합하여 사용하여 PCR법을 수행하였다. 각각 서열 15 (5'TGTGCCCTCGAGCTNACNCARAGYCCNGC3')와 서열 16 (5'ATGGATACTAGTGGTGCAGCATCAGCCC3')의 서열을 갖는 프라이머로부터 L쇄 가변 영역 유전자 (부분 길이)가 증폭되었다. PCR 조건은 AmpliTaq DNA 폴리머라제를 갖는 GeneAmp PCR 시약 키트 (다까라 슈조)를 사용하여 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분을 1 사이클로 하여 30회 반복하였다. PCR 장치로는 모델명 DNA Thermal Cycler 480 (퍼킨엘머)를 사용하였다. 증폭된 유전자 단편은 TA 클로닝 키트 (인비트로젠)를 사용하여 클로닝하였다.
이들 얻어진 유전자의 H쇄와 L쇄의 가변 영역 (부분 길이)의 염기 서열을 결정하였다. 염기 서열의 결정은 DNA 시퀀서 ver.1.2.0, Model 373A (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 표식 반응은 프라이머로서 유니버설 M13 역방향 프라이머 (인비트로젠) 또는 유니버설 M13 전방향 프라이머 (인비트로젠)를 사용하고 PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Terminator Cycle 시퀀싱 키트 (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 방법은 첨부된 프로토콜에 따라 수행하였다. 염색은 ABI의 라벨링 키트를 사용하여 수행하였다.
또한, L쇄의 취득에 관하여, N 말단부의 미취득 영역을 얻기 위해 PCR법으로 목적하는 유전자를 다시 증폭시켰다. 프라이머로는 Mouse Ig-Prime 키트 (노바젠)와 얻어진 L쇄 "CDR-3" cDNA에 상보적인 염기 서열을 사용하고, 각각 서열 17 (5'GGGAATTCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT3')과 서열 18 (5'CGTCGGAGGATCCTCACTACT3')의 서열을 갖는 프라이머로부터 유전자가 증폭되었다. PCR 조건은 AmpliTaq DNA 폴리머라제를 갖는 GeneAmp PCR 시약 키트 (다까라 슈조)를 사용하여 94℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 2분을 1 사이클로 하여 30회 반복하였다. PCR 장치로는 모델명 DNA Thermal Cycler 480 (퍼킨엘머)를 사용하였다. 증폭된 유전자 단편은 TA 클로닝 키트를 사용하여 클로닝하고, 유사하게 L쇄의 가변 영역 (N 말단부)의 염기 서열을 결정하였다. 먼저, pCR2.1 플라스미드 (TA 클로닝 키트에 첨부) 상에 미리 클로닝된 L쇄의 가변 영역 (부분 길이) 중의 제한 효소 Pf1MI 자리와 HindIII 자리를 이용하고, L쇄의 가변 영역 (N 말단부)과 L쇄의 가변 영역 (부분 길이)의 유전자들을 재조합하여 L쇄 가변 영역 (완전 길이)의 유전자 단편을 구축하였다. 제한 효소 Pf1MI는 뉴 잉글랜드 바이오랩스로부터, 제한 효소 HindIII는 다까라 슈조로부터 입수하였다. 아가로스 겔에서 전기영동한 후 추출 정제는 GeneClean II 키트 (Bio 101)를 사용하여 첨부된 프로토콜에 따라 조작하였다. 이들 2개의 DNA의 결찰에는 라이게이션 키트 ver.2 (다까라 슈조)를 사용하였다.
이상의 조작에 의해 결정한 4H5 항체 H쇄 가변 영역 (완전 길이)의 유전자 서열을 그의 아미노산 서열과 함께 서열 37에 나타내고, L쇄 가변 영역 (완전 길이)의 유전자 서열을 그의 아미노산 서열과 함께 서열 38에 나타냈다.
＜실시예 3＞
실시예 2에서 얻은 항-인간 CD4 항체 (4H5 항체)의 H쇄 (아미노산 4위 내지 118위)와 L쇄 (아미노산 4위 내지 111위) 가변 영역의 염기 서열을 포함하는 유전자 단편을 pG1 플라스미드에 삽입하여, 항CD4 인간-마우스 키메라 항체를 발현할 수 있는 플라스미드를 제작하였다. H쇄 가변 영역의 유전자 단편을 포함하는 클론의 플라스미드 DNA를 템플레이트로서 사용하고 각각 서열 19 (5'CAGGATCCGCTGCAGCAGTCTGGACCT3')와 서열 20 (5'TGGGCCCGTCGTTTTGGCTGCAGAGAC3')의 서열을 갖는 프라이머를 사용하여, ApaI 및 BamHI 제한 효소 자리를 새롭게 도입시킨 H쇄 가변 영역 단편을 PCR법으로 제작하였다. PCR 조건은 AmpliTaq DNA 폴리머라제를 갖는 GeneAmp PCR 시약 키트 (다까라 슈조)를 사용하여 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분을 1 사이클로 하여 30회 반복하였다. PCR 장치로는 모델명 DNA Thermal Cycler 480 (퍼킨엘머)를 사용하였다. 증폭된 단편을 TA 클로닝 키트 (인비트로젠)를 사용하여 클로닝하였다. H쇄 (아미노산 4위 내지 118위) 가변 영역 염기 서열을 포함하는 DNA 단편을 제한 효소 ApaI (다까라 슈조)와 BamHI (다까라 슈조)로 소화시킨 후, 2% 아가로스 전기영동 겔에서 전개시켜 절단하고 추출하였다. 아가로스 전기영동 겔로부터의 DNA 단편 추출은 GeneClean II 키트 (Bio 101)를 사용하여 첨부된 프로토콜에 따라 조작하였다.
이어서, 벡터 pG1를 제한 효소 ApaI와 BamHI로 소화시킨 후, 유사하게 O.7% 아가로스 전기영동 겔로부터 절단하여 추출한 것과 결찰시켰다. 결찰 산물을 대장균 JM109 균주에 도입하였다. 결찰 반응은 라이게이션 키트 ver.2 (다까라 슈조)를 사용하여 수행하였다. 형질전환된 대장균을 암피실린 함유 LB 평판에 접종하여 하룻밤 배양하고, 출현한 콜로니 중에서 몇개를 선정하여 통상의 방법에 따라 플라스미드 DNA를 추출 정제하였다. 이들을 삽입에 사용한 제한 효소 ApaI와 BamHI로 소화시키고, H쇄 가변 영역 염기 서열을 포함하는 단편이 삽입된 것을 선택하였다. 이어서, L쇄에 관해서는, 각각 실시예 2에서 얻은 서열 13 (5'TGTGCCCTCGAGCTNACNCARAGYCCNGC3')과 서열 14 (5'ATGGATACTAGTGGTGCAGCATCAGCCC3')의 서열을 갖는 프라이머로부터 유전자를 증폭시킨 클론의 플라스미드 DNA (L쇄 (아미노산 4위 내지 111위) 가변 영역 염기 서열을 포함하는 유전자 단편)를 제한 효소 XhoI (다까라 슈조)와 SpeI (다까라 슈조)로 소화시킨 후, 1% 아가로스 전기영동 겔에서 전개시켜 L쇄 가변 영역 염기 서열을 포함하는 DNA 단편을 절단하여 추출하였다. 아가로스 겔로부터의 DNA 단편 추출은 GeneClean II 키트 (Bio 101)를 사용하여 첨부된 프로토콜에 따라 조작하였다. 이어서, H쇄 가변 영역 염기 서열을 포함하는 DNA 단편이 삽입된 벡터 pG1를 제한 효소 XhoI와 SpeI로 소화시킨 후, 유사하게 0.7% 아가로스 겔에서 절단하여 추출한 것과 결찰시키고, 결찰 산물을 대장균 JM109 균주에 도입하였다. 이 결찰 반응에는 라이게이션 키트 ver. 2 (다까라 슈조)를 사용하였다. 형질전환된 대장균을 암피실린 함유 LB 평판에 접종하여 하룻밤 배양하고, 출현한 콜로니 중에서 몇개를 선정하여, 통상의 방법에 따라 플라스미드 DNA를 추출 정제하였다. 이들을 도입에 사용한 제한 효소 XhoI와 ApaI로 소화시키고, H쇄 및 L쇄 가변 영역 염기 서열을 포함하는 단편이 삽입된 것을 선택하였다. 이상의 방법으로 얻은 분비형 항체 발현 플라스미드를 pG14H5라고 하였다.
＜실시예 4＞
실시예 3에서 얻은 분비형 항체 발현 플라스미드 pG14H5를 DEAE 덱스트란법 [Bebbington, C.R. (1991); METHODS: A Companion to Methods in Enzymology, 2(2), 136-45]에 의해 C0S7 세포에 도입하였다. 유전자 도입 4일 전에, C0S7 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS) 함유 둘베코 개질 이글 배지(DMEM)에서 직경 100 ㎜ 디쉬 당 약 6.1×105개 세포/10 ㎖로 접종하여 배양하였다. 4일 후, 먼저 상청액을 제거하고 PBS(-)로 세포를 조심스럽게 세정한 후, 10% FBS 함유 DMEM 4 ㎖을 첨가한 다음, DEAE 덱스트란/분비형 항체 발현 플라스미드 혼합액을 세포 상에 균일하게 뿌리고 37℃에서 4시간 인큐베이트하였다. 이 혼합액은 20 ㎎/㎖의 DEAE 덱스트란 (파마시아) 수용액과 TBS(-) (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.15 M NaCl) 중 분비형 항체 플라스미드의 0.17 ㎍/㎕ 용액을 2:1비(V/V)로 혼합한 것으로 디쉬 당 180 ㎕를 첨가한다. 인큐베이션한 후, 상청액을 제거하고 10% 디메틸술폭시드 (DMSO) 함유 PBS(-) 5 ㎖을 첨가하여 1분간 정치시켰다.
이어서, 상청액을 제거하고 PBS(-)로 세정한 후, 100 μM 클로로퀸 (시그마)를 함유하는 2% FBS 함유 DMEM 7 ㎖를 첨가하여 37℃에서 3시간 인큐베이트하였다. 그 후, 상청액을 제거하고 PBS(-)로 세정한 후, 1O% FBS 함유 DMEM 10 ㎖를 첨가하여 배양하였다. 다음 날, PBS(-)와 DMEM으로 FBS 함유 DMEM을 충분히 제거한 후, 무혈청 DMEM 10 ㎖를 첨가하여 생산을 개시하였다.
생산 개시로부터 3일 후 배양 상청액을 회수한 후, 약 2주간 생산을 계속하였다. 얻어진 배양 상청액을 모아 프로테인 G 세파로스 칼럼 크로마토그래피로 정제하여, 이것을 인간-마우스 키메라 항CD4 항체의 정제 표준품으로 하였다 (이하 키메라 4H5 항체라고 한다).
＜실시예 5＞
실시예 1에서 제조한 인간 가용성 CD4를 Superdex 200 겔 여과 칼럼 (파마시아)과 SMARTsystem (파마시아)를 사용하여 1O mM 아세트산 완충액 pH=5.0로 버퍼 치환하였다. 이 인간 가용성 CD4액 (250 ㎍/㎖, 20 ㎕)을 센서 칩 (Sensor Chip) CM5 (파마시아)가 각각 다른 레인에 5 ㎕/분의 속도로 공급하여, 아민 커플링법으로 고정화시켜 인간 가용성 CD4 고정화 센서 칩을 얻었다.
4H5 항체 또는 키메라 4H5 항체 (실시예 4에서 제조)를 Superdex 200 겔 여과 칼럼 (파마시아)과 SMARTsystem (파마시아)를 사용하여 HBSbuffer (파마시아)로 버퍼 치환하였다. BIA-core2000 (파마시아)를 사용하여, 이 4H5 항체액 또는 키메라 4H5 항체액 (50 ㎍/㎖, 20 ㎕)을 분석물로서 앞서 제작한 인간 가용성 CD4 고정화 센서 칩 상에 5 ㎕/분의 속도로 각 레인에 공급하여, 결합시 센서-그람 (sensor-gram)을 얻었다. 그 후, HBSbuffer만을 5 ㎕/분의 속도로 센서 칩의 각 레인에 공급하여 해리시 센서-그람을 얻었다. 이 센서그람을 해석하여 인간 가용성 CD4와 항-인간 CD4 항체와의 해리 상수 (KD: 이 값이 낮을수록 결합 친화성이 높다)를 얻었다. 그 결과, 4H5 항체의 KD = 8.08×10-10M (Kon= 6.60×103M-1.S-1, Koff= 5.33×10-6S-1)이고 키메라 4H5 항체의 KD = 1.24×10-9M (Kon= 2.36×104M-1.S-1, Koff= 2.92×10-5S-1)으로서, 이들이 인간 CD4 항원에 강하게 결합할 수 있는 것이 밝혀졌다.
＜실시예 6＞
키메라 4H5 항체의 공업적 생산에 사용할 수 있는 안정한 고생산 세포주를 얻었다. 공업적 생산에 사용하는 숙주로서는 CHO 세포와 골수종 Sp 2/0 세포가 잘 알려져 있다 [Xiang, J. 등 (1990) Mol. Immun., 27, 809; Bebbington, C.R. 등 (1992) Bio/technology, 10, 169; Larrick, J.W. 및 Wallace, E.F. 등 (1992) Imuno1. Rev. 130, 69-85; Deyev, S.M. 및 Lieber, A. 등 (1994) App1. Biochem. Biotechnol. 47(2-3), 143-54]. 예를 들면, CHO 세포에서는 MTX 등의 약제를 사용하여 생산성이 높은 클론을 선택하는 방법이 보고되어 있으며 [Bebbington, C.R. (1991) METHODS: A Companion to Methods in Enzymology, 2(2), 136-45], 이 방법을 참고하여 키메라 4H5 항체를 생산하는 안정한 고생산 세포주를 얻었다.
즉, CHOdhfr-세포주 (ATCC CRL-9096)를 전기천공법용 완충액 (272 mM 수크로스, 7 mM 인산 완충액, 1 mM MgCl2, pH=7.4) 중에 1.0×107개 세포/㎖의 농도로 제조하고, 전기천공법용 큐베트 (바이오라드 (Bio-rad))에 500 ㎕을 나누어 넣고 빙냉시켰다. 여기에 실시예 3에서 제작한 pG14H5 플라스미드 10 ㎍과 pSV2dhfr 플라스미드 (ATCC No. 37146) 1 ㎍를 혼합하여 5분간 빙냉시켰다. 3 ㎌, O.55 ㎸의 전기 펄스를 적용하여 1분간 빙냉시켰다. 다시 3 ㎌, 0.55 ㎸의 전기 펄스를 적용하여 5분간 빙냉시켰다. 이 전기 펄스의 부하는 바이오라드의 진 펄서(Gene Pulser)를 사용하여 수행하였다. 세포를 F12 배지 (깁코)에 10% FBS를 첨가한 배지 1O ㎖로 옮기고, 100 ㎜ 조직 배양용 디쉬 (팔콘(FALCON))에서 37℃에서 5%의 CO2하에 하룻밤 배양하였다. 이 세포를 트립신-EDTA액 (깁코)를 사용하여 디쉬에서 박리하고, DMEM 배지 (깁코)에 1O% 투석 FBS (깁코)를 첨가한 배지 120 ㎖에 옮겨 150 ㎜ 조직 배양용 디쉬 4개에 접종하였다. 2 내지 3일마다 배지를 동일 배지로 교환하였다. 약 2주만에 육안으로 관찰할 수 있을 정도로 세포 콜로니가 형성되었다.
수십개의 콜로니를 단리하여 MTX (Amethopterin; 시그마) 20 nM을 첨가한 DMEM 배지+10% 투석 FBS (깁코)에서 각각 배양하였다. 2 내지 3일마다 배지를 동일 배지로 교환하여 1개월 배양하였다. MTX 약제 내성을 획득한 클론 (동일 배지 중에서 증식할 수 있는 클론)을 각각 MTX 1OO nM을 첨가한 DMEM 배지+1O% 투석 FBS 배지에서 배양하였다. 2 내지 3일마다 배지를 동일 배지로 교환하여 1개월 배양하였다. 최종적으로 100 nM MTX 약제 내성을 획득한 클론 (동일 배지 중에서 증식할 수 있는 클론)의 배양 상청액 중의 키메라 4H5 항체의 농도를 IgG1용의 인간 면역글로불린 G (IgG) 서브클래스 EIA 키트 (더 바인딩 사이트(The Binding site))를 사용하여 측정하고, 안정한 키메라 4H5 항체의 고생산 세포주를 선택하였다. 이들 방법으로 키메라 4H5 항체를 5 ㎍/106개 세포/일의 비율로 생산하는 안정한 발현 세포주를 제작하였다.
＜실시예 7＞
항체 유전자를 ScFv 항체 생산 벡터에 도입시키기 위해, 실시예 2에서 얻은 서열 37과 서열 38에 기재된 유전자들을 제한 효소 서열과 링커 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 PCR법으로 증폭시켰다. L쇄용 프라이머로는 서열 27 (5'AGCCGGCCATGGCCGACATTGTGCTGACCCAATCTCCA3')과 서열 28 (5'CTCCGGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTCC3')을 사용하고, H쇄용 프라이머로는 서열 29 (5'CTCCGGAGGTGGCGGATCGCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCT3')와 서열 30 (5'TGCGGCCGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTC3')를 사용하였다. PCR 조건은 AmpliTaq DNA 폴리머라제를 갖는 GeneAmp PCR 시약 키트 (다까라 슈조)를 사용하여 94℃에서 45초, 58℃에서 45초, 72℃에서 1분을 1 사이클로 하여 18회 반복하였다. PCR 장치로는 모델명 DNA Thermal Cycler 480 (퍼킨엘머)를 사용하였다. 증폭된 단편을 각각 TA 클로닝 키트 (인비트로젠)를 사용하여 클로닝하였다. 이 유전자의 L쇄는 제한 효소 NaeI (다까라 슈조)와 MroI (도요보(Toyobo))로 소화시키고, H쇄는 제한 효소 MroI (도요보)와 NotI (다까라 슈조)로 소화시킨 후, 2% 아가로스 겔에서 전기영동시켜 각각의 DNA 단편을 절단하여 추출하였다. 아가로스 겔로부터의 DNA 단편 추출에는 GeneClean II 키트 (Bio 101)를 사용하였다.
참고예 2에서 제조한 pSE380ScFv 또는 pET24ScFv 벡터를 제한 효소 NaeI (다까라 슈조) 및 NotI (다까라 슈조)로 소화시킨 후, 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 각각의 DNA 단편을 절단하여 추출하였다. 이를 상기 제한 효소로 소화시킨 L쇄 및 H쇄 DNA 단편과 결찰하였다. 결찰에는 라이게이션 ver. 2 키트 (다까라 슈조)를 사용하였다. 또한, 아가로스 겔로부터의 DNA 단편 추출에는 GeneClean II 키트 (Bio 101)를 사용하였다. 이상의 조작에 의해 얻은 플라스미드를 각각 대장균 DH5 균주에 도입시켰다. 형질전환된 대장균을 pSE380ScFv 벡터에서 유래된 것은 암피실린 함유 LB 평판에 접종하고, pET24ScFv 벡터에서 유래된 것은 카나마이신 함유 LB 평판에 접종하여 하룻밤 배양하고, 출현한 콜로니 중에서 몇개를 선택하여 통상의 방법에 따라 플라스미드 DNA를 추출 정제하였다. 적당한 제한 효소를 사용하여 이들 플라스미드의 절단 패턴을 조사하여, 예상된 패턴과 일치하는 것을 선택하였다. 이상의 조작에 의해 얻은 항CD4 항체의 서열을 갖는 4H5ScFv (N 말단 VL-링커-VH C 말단형: 이하 LH형) 항체를 발현하는 플라스미드를 각각 pSE380ScFv4H5LH 또는 pET24ScFv4H5LH로 하였다. 또한, 단쇄 항체 (ScFv4H5LH)의 아미노산 서열을 이를 코드하는 핵산 염기 서열의 예와 함께 서열 9에 나타냈다.
＜실시예 8＞
항체 유전자를 ScFv 항체 생산 벡터에 도입시키기 위해, 실시예 2에서 얻은 서열 37과 서열 38에 기재된 유전자들을 제한 효소 서열과 링커 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 PCR법으로 증폭시켰다. H쇄용 프라이머로는 서열 31 (5'AGCCGGCCATGGCCCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCT3')과 서열 32 (5'CTCCGGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTC3')를 사용하고, L쇄용 프라이머로는 서열 33 (5'CTCCGGAGGTGGCGGATCGGACATTGTGCTGACCCAATCTCCA3')와 서열 34 (5'TGCGGCCGCTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTCC3')를 사용하였다. PCR 조건은 AmpliTaq DNA 폴리머라제를 갖는GeneAmp PCR 시약 키트 (다까라 슈조)를 사용하여 94℃에서 45초, 58℃에서 45초, 72℃에서 1분을 1 사이클로 하여 18회 반복하였다. PCR 장치로는 모델명 DNA Thermal Cycler 480 (퍼킨엘머)를 사용하였다. 증폭된 단편을 각각 TA 클로닝 키트 (인비트로젠)를 사용하여 클로닝하였다. 이 유전자의 H쇄는 제한효소 NaeI (다까라 슈조)와 MroI (도요보)로 소화시키고, L쇄는 제한 효소 MroI (도요보)와 NotI (다까라 슈조)로 소화시킨 후, 2% 아가로스 겔에서 전기영동하여 각각의 DNA 단편을 절단하여 추출하였다. 아가로스 겔로부터의 DNA 단편 추출에는 GeneClean II 키트 (Bio 101)를 사용하였다.
참고예 2에서 제조한 pSE380ScFv 또는 pET24ScFv 벡터를 제한 효소 NaeI (다까라 슈조)와 NotI (다까라 슈조)로 소화시킨 후, 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 각각의 DNA 단편을 절단하여 추출하였다. 이를 상기에서 제한 효소로 소화시킨 H쇄 및 L쇄 DNA 단편과 결찰하였다. 결찰에는 라이게이션 ver. 2 키트 (다까라 슈조)를 사용하였다. 또한, 아가로스 겔로부터의 DNA 단편 추출에는 GeneClean II 키트 (Bio 101)를 사용하였다. 이상의 조작에 의해 얻은 플라스미드를 각각 대장균 DH5 균주에 도입하였다. 형질전환된 대장균을 pSE380ScFv 벡터에서 유래된 것은 암피실린 함유 LB 평판에 접종하고, pET24ScFv 벡터에서 유래된 것은 카나마이신 함유 LB 평판에 접종하여 하룻밤 배양하고, 출현한 콜로니 중에서 몇개를 선택하여 통상의 방법에 따라 플라스미드 DNA를 추출 정제하였다. 적당한 제한 효소를 사용하여 이들 플라스미드의 절단 패턴을 조사하여, 예상된 패턴과 일치하는 것을 선택하였다. 이상의 조작에 의해 얻은 항CD4 항체의 서열을 갖는 4H5ScFv (N 말단 VH-링커-VL C 말단형: 이하 HL형) 항체를 발현하는 플라스미드를 각각 pSE380ScFv4H5HL 또는 pET24ScFv4H5HL로 하였다. 또한, 단쇄 항체 (ScFv4H5HL)의 아미노산 서열을 이를 코드하는 핵산 염기 서열의 예와 함께 서열 10에 나타냈다.
＜실시예 9＞
실시예 7의 pSE380ScFv4H5LH 플라스미드로 형질전환시킨 대장균 DH5 균주를 100 ㎍/㎖ 암피실린과 1% 글리세롤 첨가 2×YT 배지 (1.6% 박토트립톤, 1% 박토효모 추출물, 0.5% NaCl)에서 배양하였다. 다음 날, 그 일부를 10배량의 상기 배지에 첨가하여 1시간 배양한 후, 상청액을 제거하고 동량의 1 mM의 IPTG, 100 ㎍/㎖의 암피실린 및 1% 글리세롤 첨가 2×YT 배지로 교체하여 3시간 더 배양한 후, 배양 상청액을 제거한 균체를 배양 용적의 1/10 양의 빙냉시킨 TES액 (20O mM Tris-HCl (pH=8.0), 0.5 mM EDTA, 0.5 M 수크로스)에 현탁시켰다. 빙온에서 10분간 방치한 후, 14000 rpm으로 4℃에서 20분간 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 배양 용적의 1/10 양의 빙냉시킨 TE액 (1O mM Tris-HCl (pH=8.0), 0.5 mM EDTA)에 현탁시켰다. 빙온에서 30분간 방치한 후, 14000 rpm으로 4℃에서 20분간 원심분리함으로써 세포질 중의 항체를 회수하였다. 얻어진 항체 조분획을 항FLAG-M2 겔 (이스트만 케미컬) 칼럼 크로마토그래피로 정제하고, TALON 금속 친화도 겔 (metal affinity) 겔 (클론테크 (Clontech))로 더 정제하였다. 칼럼 크로마토그래피는 각각의 겔에 첨부된 프로토콜에 따라 수행하였다. 이것을 항-인간 CD4 단쇄 항체 (ScFv4H5LH)의 정제 표준품으로 하였다.
실시예 1에서 제조한 인간 가용성 CD4의 PBS(-) 용액 (5.2 ㎍/㎖)을 폴리스티렌 96웰 평판에 50 ㎕/웰씩 나누어 넣고, 4℃에서 하룻밤 정치시켜 항원을 고정화하였다. 상청액을 제거한 후, 0.05% Tween 20 함유 PBS(-) (이하 PBS-T라 함) 250 ㎕로 세정하였다. 블록 에이스(Block Ace; 다이닛본 세야꾸(Dainippon Seiyaku)) 100 ㎕를 각 웰에 나누어 넣고 실온에서 1시간 정치시켜 블로킹하였다. 각 웰의 상청액을 제거한 후, PBS-T 250 ㎕로 2회 세정하였다. 상청액을 제거한 후, 상기 제조한 항-인간 CD4 단쇄 항체 (ScFv4H5LH)의 10 ㎍/㎖ PBS(-)용액 50 ㎕을 나누어 넣고 실온에서 2시간 정치하여 반응하였다. 상청액을 제거한 후, PBS-T 250 ㎕로 3회 세정하였다. 상청액을 제거한 후, PBS-T로 1O00배 희석한 양고추냉이 퍼옥시다제 표식한 항myc 항체 (인비트로젠) 50 ㎕를 각 웰에 나누어 넣고 실온에서 2시간 정치시켰다. 상청액을 제거한 후, PBS-T 250 ㎕로 3회 세정하였다. 상청액을 제거한 후, 오르토페닐렌디아민 (시그마)의 PBS(-) 용액에 O.O1% H2O2를 첨가한 발색액 50 ㎕를 첨가하여 실온에서 7분간 반응시킨 후, 2N 황산액 50 ㎕를 첨가하여 효소 반응을 정지하였다. 평판의 490 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 이 때 흡광도는 0.574였다. 또한, 인간 가용성 CD4의 고정화 조작만 수행하지 않고 동일 실험을 수행했더니 흡광도는 0.109였다. 이들 결과는 항-인간 CD4 단쇄 항체 (ScFv4H5LH)가 인간 CD4를 인식하며 친화성이 있다는 것을 나타낸다.
＜실시예 10＞
2-요오도아세트아미드 (도꾜 가세이(Tokyo Kasei)) 50 g을 증류수 100 ㎖에 현탁하고, 37% 포름알데히드 (와꼬 쥰야꾸 고교 (WAKO Pure Chemicals Industries, Ltd.)) 20 ㎖을 첨가하여 50℃에서 교반하에 용해하였다. 탄산칼륨 25.2 g을 서서히 첨가하여 교반기로 10분간 교반한 후, 실온에서 2시간 방치하였다. 또한, 4℃에서 하룻밤 정치한 후, 상청액을 기울어 따루어 제거하고 증류수 40 ㎖을 첨가한 후, 50℃에서 침전을 용해시키고 실온에서 2시간 방치하고 4℃에서 하룻밤 더 정치시켰다. 이 조작을 다시 한번 반복한 후, 생성된 침전을 G-3 유리 필터 (필터 직경 30 ㎜: 닛본 리까가꾸 기까이(주)(Nippon Rikagaku Kikai Co., Ltd.))에 통과시킴으로써 회수하여, 1시간 흡인기로 흡인 건조한 후 24시간 동결 건조하여, 수불용성 담체에 도입할 수 있는 항체 고정화용 활성기인 N-히드록시메틸요오도아세트아미드를 제조하였다.
유리 플라스크에 황산 5.7 ㎖, 니트로벤젠 7.2 ㎖ 및 파라포름알데히드 O.0363 g을 첨가하고 교반하면서 용해시킨 후, N-히드록시메틸요오도아세트아미드 0.58 g을 첨가하고 교반하였다. 여기에 폴리프로필렌 부직포 (평균 섬유 직경 3.3 ㎛) 0.3 g을 넣어 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 반응시킨 후, 부직포를 꺼내어 순수로 세정하고, 진공 건조시켜 항체 고정화용 활성기가 도입된 부직포를 얻었다. 부직포를 직경 0.7 ㎝의 원으로 절단하여, 각 4매씩을 PBS(-)에 용해시킨 항-인간 CD4 항체 (4H5 항체) 용액 (17.7 ㎍/400 ㎕) 또는 실시예 9에서 제조한 항-인간 CD4 단쇄 항체 (ScFv4H5LH)의 용액 (17.7 ㎍/400 ㎕)에 실온에서 2.5시간 침액시켜 항체를 고정화시켰다. 2.5시간 후, PBS(-)로 세정하였다. 입구와 출구가 있는 용량 1 ㎖ 용기에 4매를 충전하여 칼럼을 제작하였다. 또한, 비교 대조군으로서 소 혈청 알부민 (BSA; 피어스(Pierce) 알부민 표준품)을 항체 대신 동일하게 고정화한 칼럼을 제작하였다.
실시예 1과 마찬가지로 피콜-팩 (파마시아)를 이용하여 밀도 구배 원심법에 의해 건강한 사람의 혈액으로부터 단핵 세포층의 세포를 회수하였다. 회수한 세포를 PBS(-)로 세정하여 1.2×1O6개 세포/㎖로 조정하였다. 이 단핵구 현탁액 4 ㎖를 시린지 펌프를 사용하여 유속 1 ㎖/분으로 전달하여 상기 제작한 칼럼 입구로부터 흘려보냈다. 칼럼 출구에서 처리 후의 액을 회수하였다. 이 때 CD4 양성 세포의 비율을 공지된 플로우 사이토미터법 (FACS)으로 측정하였다. FACS 해석시 세포 염색은 FITC 표식된 항CD4 항체 (퍼민젠(Fermingen))를 사용하고, FACSCalibur (벡톤 디킨슨)를 사용하여 측정하였다.
하기 표 1에 칼럼 통과 전후의 CD4 양성 세포와 다른 세포들 (CD4 음성 세포)의 비율을 나타냈다. 또한, 이 실시예에서 4H5 항체 고정화 칼럼 통과 후 CD4 양성 세포의 제거율은 100%이고, ScFv4H5LH 고정화 칼럼 통과 후 CD4 양성 세포의 제거율은 99.9%였다. 이들 결과로부터 항-인간 CD4 단쇄 항체 (ScFv4H5LH)는 4H5 항체에 비교하면 CD4 양성 세포에 대한 결합 친화성과 특이성이 4H5 항체와 실질적으로 동일한 기능임이 밝혀졌다.
CD4 양성 세포의 비율 다른 세포의 비율
칼럼 통과전 39.3% 60.7%
4H5 항체 고정화 칼럼 통과후 0.3% 99.7%
ScFv4H5LH 고정화 칼럼 통과후 2.6% 97.4%
소 혈청 알부민 고정화 칼럼 통과후 45.0% 55.0%
＜실시예 11＞
4H5 하이브리도마는 다음와 같이 하여 얻었다.
혈액을 피콜 하이 팩(Ficoll-High-Paque)에 중층하여 원심분리한 후 단핵 백혈구층을 회수하고, 더욱 항CD8 항체를 사용하는 면역 침강법으로 CD8 양성 세포를 제거하여 CD4 림프구를 농축시킨 분획을 얻었다. 또한, 이 세포 분획을 PHA 렉틴 (이와이라보라트리(E.Y. Laboratory))으로 자극하여 면역용 세포를 제조하였다. 이 세포를 DMEM 배지 (깁코)로 세정한 후, 세포를 부형제인 타이터 맥스 (Titer Max; CytRx)와 혼합하여 Balb/c 마우스 (닛본 찰스리버 (Japan Charles River))에 마우스 당 약 2×107개의 세포를 복강내 투여하여 면역시켰다. 최초 면역에서 시작하여 2주마다 부스터(booster) 면역을 수행하였다. 그 후, 최초 면역으로부터 3개월 후 동일하게 제조한 세포를 정맥 주사하여 부스터 면역시켰다.
BALB/c 마우스 유래된 골수종 세포주인 NS1 세포주 (ATCC TIB-18)을 20% FCS 첨가 DMEM 배지 (깁코)에서 계대배양시켰다.
상기 면역 동물 마우스로부터 얻은 비장을 풀어 DMEM 배지로 세정하면서 메쉬를 통해 여과한 후, 원심분리하여 비장 세포를 분리하였다. 비장 세포와 상기 증식시킨 NS1 세포주를 혼합한 후 원심분리하였다. 혼합한 세포에 대해 폴리에틸렌글리콜 (베링거만하임 (Boehringer-Mannheim))을 최종 농도 30%로 현탁시켰다.
세포를 원심분리하여 분리하고, 공급처(feeder)로서 마우스 비장 세포를 사용하여 20% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM 조직 배양 배지 (깁코)에 서서히 분산시켰다. 이어서, 평저 96웰 마이크로타이터 평판 (누크(Nunc))의 웰에 1웰 당 106개 세포/100 ㎕의 세포를 접종하여, 5% 이산화탄소 중에서 37℃에서 배양하였다.
세포 융합 후 1일째에, 각 웰에 HAT 배지 (상기 증식 배지에 13.61 ㎍/㎖ 하이포잔틴, 3.88 ㎍/㎖ 티미딘 및 0.18 ㎛ 아미노프테린을 함유하도록 보충함) 100 ㎕를 첨가하였다. 그 후, 3일 동안 매일 약 1/2의 HAT 배지를 새로운 HAT 배지로 교환하고, 그 후 2 내지 3일마다 동일한 방식으로 배지를 교환하였다. 하이브리도마 (융합 세포)의 클론을 HT 배지 (아미노프테린을 함유하지 않는 HAT 배지)에서 배양하여 보존하였다.
상기한 하이브리도마 중 몇개를 한계 희석법으로 서브클로닝하였다. 이들 하이브리도마의 세포수를 트리판 블루 염료 배제법과 혈구계로 계수하였다. 이어서, 이들 하이브리도마를 HT 배지 100 ㎕ 당 0.5개 생육 세포수의 비로 현탁시키고, 평저 96웰 마이크로평판에 1웰 당 100 ㎕씩 나누어 넣었다. 2 내지 3일마다 배지를 교환하여 하이브리도마를 증식시켰다.
얻어진 하이브리도마의 배양 상청액을 인간 백혈구와 반응시켜, 인간 백혈구의 CD4 양성 세포를 인식하는 항체를 FACScan (벡톤 디킨슨)로 검출하였다. 본 조작에 의해, 얻어진 항체군으로부터 특이성과 결합성이 보다 우수한 4H5 세포를 성공적으로 얻었다.
＜실시예 12＞
4H5 항체의 생산과 정제를 수행하였다. 항-인간 CD4 항체 생산 하이브리도마 4H5 (기탁 번호 FERM BP-6729)를 10% 소 태아 혈청(FBS) (ICN)을 첨가한 DMEM 배지 (깁코)에서 배양하였다. 하이브리도마를 미리 한계 희석법으로 처리하여 클론을 분리한 후, 배양 상청액을 인간 가용성 CD4 (리프리젠) 고정화 ELISA법으로 처리하여 인간 가용성 CD4에 대한 결합성이 높은 클론을 선택하였다. 이 4H5 하이브리도마 클론을 Balb/c 마우스 복강 내에 이식한 후 증식시켜 얻은 복수를 프로테인 A 세파로오스 (파마시아)를 사용한 친화도-크로마토그래피로 정제하여 4H5 항체의 정제 표준품을 얻었다.
＜실시예 13＞
실시예 1에서 제조한 인간 가용성 CD4의 PBS(-) 용액 (5.2 ㎍/㎖)을 폴리스티렌 96웰 평판 (누크)에 50 ㎕씩 나누어 넣고 4℃에서 하룻밤 정치하여 항원을 고정화하였다. 상청액을 제거한 후, 0.05% Tween 20 함유 PBS(-) (이하 PBS-T라 함) 250 ㎕로 세정하였다. 블록 에이스 (다이닛본 세야꾸) 100 ㎕를 각 웰에 나누어 넣고 실온에서 1시간 정치시켜 블로킹하였다. 각 웰에서 상청액을 제거한 후 PBS-T 250 ㎕로 2회 세정하였다. 상청액을 제거한 후, 다양한 농도로 조정한 4H5 항체 (실시예 12에서 제조, 아이소타입은 IgG1-κ) 또는 MT310 항체 (다코(DACCO), 아이소타입은 IgGl-κ)의 PBS(-) 용액을 각각 50 ㎕씩 나누어 넣고 실온에서 2시간 정치하여 반응시켰다. 상청액을 제거한 후 PBS-T 250 ㎕로 3회 세정하였다. 상청액을 제거한 후, PBS-T로 200배 희석한 비오틴 표식된 항-마우스 IgG(H+L) 항체 (벡토르 (VECTOR)) 50 ㎕를 각 웰에 나누어 넣고 실온에서 1시간 정치시켰다. 상청액을 제거한 후 PBS-T 250 ㎕로 3회 세정하였다. 상청액을 제거한 후, PBS-T로 100배 희석한 벡타스테인 엘리트 스탠다드(vectastain Elite standard) 키트 (벡토르)의 A액과 B액의 등량 혼합액 50 ㎕를 각 웰에 나누어 넣고 실온에서 1시간 정치시켰다. 상청액을 제거한 후 PBS-T 250 ㎕로 6회 세정하였다. 상청액을 제거한 후, 오르토페닐렌디아민 (시그마)의 PBS(-) 수용액에 O.O1% H2O2를 첨가한 발색액 5O ㎕를 첨가하여 실온에서 3분간 반응시킨 후, 2N 황산액 50 ㎕를 첨가하여 효소 반응을 정지하였다. 이 평판의 490 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다.
사용한 항체 (4H5 항체 또는 MT310 항체)의 농도와 흡광도의 상관관계를 도 5에 나타냈다. 4H5 항체가 MT310 항체보다 더 낮은 농도에서 CD4 분자를 검출할 수 있고, 인간 CD4 분자에 대하여 친화성이 더 높다는 것이 밝혀졌다.
＜실시예 14＞
4H5 항체 (실시예 12에서 제조, 아이소타입은 IgG1-κ)와 13B8.2 항체 (이뮤노테크, 아이소타입은 IgG1-κ)를 Superdex 200 겔 여과 칼럼 (파마시아)과 SMARTsystem (파마시아)를 사용하여 1O mM 아세트산 완충액 pH=5.0에 버퍼 치환하였다. 항체액 (100 ㎍/㎖, 70 ㎕)을 센서 칩 CM5 (파마시아)의 각각 다른 레인에 5 ㎕/분의 속도로 공급하여 아민 커플링법으로 고정화시켜, 항-인간 CD4 항체 고정화 센서 칩을 얻었다. 이어서, 실시예 1에서 제조한 인간 가용성 CD4 항체를 Superdex 200 겔 여과 칼럼 (파마시아)과 SMARTsystem (파마시아)를 사용하여 HBSbuffer (파마시아)에 버퍼 치환하였다. BIA-core 2000 (파마시아)를 사용하여, 분석물로서 이 인간 가용성 CD4액 (15.2 ㎍/㎖, 20 ㎕)을 앞서 제작한 항체 고정화 센서 칩 상에 센서 칩의 각 레인에 5 ㎕/분의 속도로 공급하여 결합시 센서그람을 얻었다. 그 후, HBSbuffer만을 센서 칩의 각 레인에 5 ㎕/분의 속도로 공급하여 해리시 센서그람을 얻었다. 이 센서그람을 해석하여 인간 가용성 CD4와 항-인간 CD4 항체와의 해리 상수 (KD: 이 값이 낮을수록 결합 친화성이 높다)를 얻었다.
그 결과, 4H5 항체의 KD = 1.71×10-9M (Kon= 1.35×105M-1.S-1, Koff= 2.31×10-4S-1)이고, 13B8.2 항체의 KD = 7.58×10-9M (Kon= 1.82×104M-1.S-1, Koff= 1.38×10-4S-1)였다. 해리 상수를 비교하여, 4H5 항체가 13B8.2 항체보다 인간 가용성 CD4에 대한 결합 친화성이 약 4.4배 높다는 것을 알았다.
＜실시예 15＞
안정한 항CD4 항체 함유 제제를 제조하였다. 실시예 12에서 얻은 4H5 항체를 겔 여과에 의해 10O mM 염화나트륨을 함유하는 20 mM 인산 완충액, pH=7.4 (PBS)로 무균적으로 치환하고, 이 4H5 항체 1 ㎎과 인간 혈청 알부민 20O ㎎을 PBS와 혼합하여 2 ㎖로 하여 유리 바이알에 무균적으로 주입하고 마개를 막았다.
＜실시예 16＞
안정한 인간-마우스 키메라 항CD4 항체 함유 제제를 제조하였다. 실시예 4에서 얻은 키메라 4H5 항체를 겔 여과에 의해 10O mM 염화나트륨을 함유하는 20 mM 인산 완충액, pH=7.4 (PBS)로 무균적으로 치환하고, 이 키메라 4H5 항체 1 ㎎과 인간 혈청 알부민 20O ㎎을 PBS와 혼합하여 2 ㎖로 하여 유리 바이알에 무균적으로 주입하고 마개를 막았다
＜실시예 17＞
안정한 단쇄 항CD4 항체 함유 제제를 제조하였다. 실시예 9에서 얻은 항-인간 CD4 단일 항체 (ScFv4H5LH)를 겔 여과에 의해 100 mM 염화나트륨을 함유하는 20 mM 인산 완충액, pH=7.4 (PBS)로 무균적으로 치환하고, 이 단쇄 항체 500 ㎍과 인간 혈청 알부민 200 ㎎을 PBS와 혼합하여 2 ㎖로 하여 유리 바이알에 무균적으로 주입하고 마개를 막았다.
＜실시예 18＞
항체 유전자를 단리하기 위해 하이브리도마 Anti-My-10 (ATCC HB-8483)을 10% 소 태아 혈청 (Flow)을 첨가한 RPMI-1640 배지 (깁코)에서 배양하였다. 하이브리도마를 미리 한계 희석법으로 처리하여 클론을 분리하고, 배양 상청액을 분석하여 인간 급성 골수 백혈병 세포 KG-1a에 대한 결합성이 높은 클론을 선택하였다. 이 세포 6×107개로부터 전체 RNA를 AGPC법 [Chomczynski, P. 및 Sacchi, N. (1987) Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-PhOH-chloroform extraction, Anal. Biochem. 162, 156-159]으로 분리하였다. 또한, 분리된 RNA으로부터 mRNA를 QuickPrep mRNA 정제 키트 (파마시아)를 사용하여 단리하였다. 얻어진 mRNA를 템플레이트로 사용하여 제1쇄 cDNA를 합성하였다. 이는 cDNA 합성 키트 (파마시아)를 사용하여 첨부된 프로토콜에 따라 수행하였다.
그 후, PCR법으로 목적하는 유전자를 증폭시켰다. 프라이머로서는, 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5판, 1991 (USA NIH 발행)]에 기재된 마우스 항체 가변 영역의 유전자 서열을 참고하여 마우스 항체 유전자 cDNA를 합성할 수 있는 후보 서열을 다수 합성하고, 이들 프라이머를 조합하여 PCR법을 수행하였다. 유전자는 H쇄의 취득에 관하여는 핵산 서열 (5'GTCCCAGGATCCTCTGAAGCAGTCAGGCCC3')와 (5'ACAGTGGGCCCGTCGTTTTGGCTGAGGAGA3')을, L쇄의 취득에 관하여는 핵산 서열 (5'TGTGCCCTCGAGGTGACTCAAACTCCACTCTC3') 및 (5'ATGGATACTAGTGGTGCAGCATCAGCCC3')을 갖는 프라이머로부터 증폭되었다. 증폭된 유전자 단편을 TA 클로닝 키트 (인비트로젠)를 사용하여 클로닝하였다. 얻어진 유전자의 H쇄 및 L쇄 가변 영역의 염기 서열을 결정하였다. 염기 서열의 결정은 DNA 시퀀서 ver.1.2.0, Model 373A (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 표식 반응은 프라이머로서 H쇄에 대해 핵산 서열 (5'CTCTTGGAGGAGGGTGCCAG3')를 사용하고, κ쇄에 대해 핵산 서열 (5'CCAGATTTCAACTGCTCATCAGA3')를 사용하여 PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Terminator Cycle 시퀀싱 키트 (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 방법은 첨부된 프로토콜에 따라 수행하였다. 염색은 ABI의 라벨링 키트를 사용하여 수행하였다. 그 결과, H쇄의 프라이머로부터 얻은 유전자 단편을 서열 39에 나타내고, L쇄의 프라이머로부터 얻은 유전자 단편을 서열 40에 나타냈다.
＜실시예 19＞
실시예 18에서 얻은 항CD34 항체의 H쇄와 L쇄 가변 영역의 염기 서열을 포함하는 유전자 단편을 pG1 플라스미드에 도입시키고, 항CD34 항체를 발현할 수 있는 플라스미드를 제작하였다. 클론의 플라스미드 DNA의 L쇄를 제한 효소 XhoI (다까라 슈조)와 및 SpeI (다까라 슈조)로 소화시킨 후, 0.7% 아가로스 전기영동 겔에서 전개하여 L쇄 가변 영역 염기 서열을 포함하는 DNA 단편을 절단하여 추출하였다. 아가로스 겔로부터의 DNA 단편 추출은 GeneClean II 키트 (프나코시(Funakoshi))를 사용하여 첨부된 프로토콜에 따라 조작하였다. 이어서, 벡터 pG1를 제한 효소 XhoI와 SpeI로 소화시킨 후, 0.7% 아가로스 겔에서 유사하게 절단하여 추출한 것과 결찰시켰다. 이어서, 클론의 플라스미드 DNA의 H쇄 가변 영역 염기 서열을 포함하는 DNA 단편을 제한 효소 ApaI (다까라 슈조)와 BamHI (다까라 슈조)로 절단하여 추출하였다. 아가로스 전기영동 겔로부터의 DNA 단편 추출은 GeneClean II 키트 (프나코시)를 사용하여 첨부된 프로토콜에 따라 조작하였다. 이어서, 상기한 바와 같이 H쇄 가변 영역 염기 서열을 포함하는 DNA 단편을 삽입시킨 벡터 pG1를 제한 효소 ApaI와 BamHI로 소화시킨 후, 0.7% 아가로스 전기영동 겔로부터 유사하게 절단하여 추출한 것과 결찰시키고, 결찰 반응물을 대장균 JM109 균주에 도입하였다. 결찰 반응에는 라이게이션 키트 ver.2 (다까라 슈조)를 사용하였다. 형질전환된 대장균을 암피실린 함유 LB 평판에 접종하여 하룻밤 배양하고, 출현한 콜로니 중에서 몇개를 선택하여 통상의 방법에 따라 플라스미드 DNA를 추출 정제하였다. 이들을 도입시 사용한 제한 효소 XhoI와 ApaI로 소화시키고, H쇄와 L쇄 가변 영역 염기 서열을 포함하는 단편이 삽입된 것을 선택하였다. 이상의 방법으로 얻은 분비형 항체 발현 플라스미드를 pG1My10으로 하였다.
＜실시예 20＞
실시예 19에서 얻은 분비형 항체 발현 플라스미드 pG1My10을 DEAE 덱스트란법 [Bebbington, C.R. (1991); METHODS: A Companion to Methods in Enzymology, 2(2), 136-45]로 각각 C0S7 세포에 도입시켰다. 유전자 도입 4일 전에, C0S7 세포를 10% 소 태아 혈청(FCS) 함유 둘베코 개질 이글 배지(DMEM)에서 직경 100 ㎜ 디쉬 당 약 6.1×105개 세포/1O ㎖로 접종하여 배양하였다. 4일 후, 먼저 상청액을 제거한 후, 인산 완충 생리식염수 (칼슘과 마그네슘 불포함) (PBS(-))로 세포를 조심스럽게 세정하고, 10% FCS 함유 둘베코 개질 이글 배지(DMEM) 4 ㎖을 첨가한 다음, DEAE 덱스트란/분비형 항체 발현 플라스미드 혼합액을 세포 상에 균일하게 뿌리고 37℃에서 4시간 인큐베이트하였다. 이 혼합액은 DEAE 덱스트란 (파마시아 코드 번호 1703 50-01, 로트 PF97323) 20 ㎎/㎖ 수용액과 TBS(-) (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.15M NaCl) 중 분비형 항체 플라스미드의 0.17 ㎍/㎕ 용액을 2:1비 (v/v)로 혼합한 것으로 디쉬 당 180 ㎕를 첨가한다. 인큐베이션한 후, 상청액을 제거하고 1O% 디메틸술폭시드 (DMSO) 첨가 PBS(-)를 5 ㎖ 첨가하여 1분간 정치시켰다. 이어서, 상청액을 제거하고 PBS(-)로 세정한 후, 100 μM 클로로퀸 (시그마 No. C6628)을 함유하는 2% FCS 첨가 DMEM 7 ㎖를 첨가하여 37℃에서 3시간 인큐베이트하였다. 그 후, 상청액을 제거한 후, PBS(-)로 세정하고 1O% FCS 첨가 DMEM 10 ㎖를 첨가하여 배양하였다. 다음 날, PBS(-)와 DMEM으로 FCS 첨가 DMEM을 충분히 제거한 후, 무혈청 DMEM 1O ㎖를 첨가하여 생산을 개시하였다.
생산 개시로부터 3일 후 배양 상청액을 회수하고, 이후 약 2주간 생산을 계속하였다. 얻어진 배양 상청액을 모아 프로테인 G 세파로스 칼럼 크로마토그래피로 정제하여, 이를 인간-마우스 키메라 항CD34 항체의 정제 표준품으로 하였다.
CD34 항원으로의 정제 표준품의 결합은 다음 방법으로 확인하였다. 1.5 ㎖ 튜브에 배양 세포 KG 1a를 1×106개로 제조하고 세포 세정액 (2% FCS 첨가 PBS(-))으로 2회 세정하였다. 세정한 세포에 세포 세정액 50 ㎕ 첨가하여 현탁시켰다. 여기에 정제 표준품 1 ㎍을 첨가하여 얼음 중에서 30분간 정치시켰다. 그 후, 세포 세정액으로 3회 더 세정한 후, 세포 세정액 50 ㎕을 첨가하여 현탁시켰다. 여기에 FITC 표식된 염소 항-인간 IgG (Fc) 항체 (1/20 희석, 이뮤노테크) 1 ㎍을 첨가하고 얼음 중에서 30분간 정치시켰다. 그 후, 세포 세정액으로 3회 더 세정한 후, 세포 세정액 300 ㎕을 첨가하여 현탁시켰다. 이렇게 처리한 세포에 플로우 사이토미터 (벡톤 디킨슨)로 레이저광을 조사하여 세포 상에 결합된 항체량을 형광으로 측정하였다. 대조군으로서 정제 표준품 대신 골수종 유래된 인간 IgG 항체 1 ㎍을 첨가하여 동일하게 조작하여 세포를 처리하였다. 도 6에 정제 표준품의 CD34 항원에 대한 결합을 나타냈다. 항CD34 항체 pG1MY10 유래된 정제 표준품은 CD34 항원에 대한 결합 활성을 유지하는 것이 확인되며, 본 발명의 인간-마우스 키메라 항CD34 항체는 CD34 항원에 대한 결합 활성이 있는 것이 입증되었다. 또한, 본 발명의 정제 표준품으로 CD34 양성 세포를 검출할 수 있는 것을 확인하였다.
＜실시예 21＞
항체 유전자를 ScFv 항체 생산 벡터에 도입시키기 위해, 실시예 19에서 얻은 유전자를 제한 효소 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 PCR법으로 증폭시켰다. H쇄에 대한 프라이머의 핵산 서열로는 서열 (5'GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGAAGCAGTCAG3')과 (5'AGACGGTGACCGTGGTGCCTTGGCCCC3')를, L쇄에 대한 프라이머의 핵산 서열로는 서열 (5'TCGAGCTCACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCT3')와 (5'CACCTGCGGCCGCCCGTTTCAGCTC3')를 사용하였다. PCR 조건은 AmpliTaq DNA 폴리머라제를 갖는 GeneAmp PCR 시약 키트 (다까라 슈조)를 사용하여 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분을 1 사이클로 하여 30회 반복하였다. PCR 장치로는 모델명 DNA Thermal Cycler 480 (퍼킨엘머)를 사용하였다. 증폭된 유전자의 H쇄는 제한 효소 SfiI (도요보)와 BstPI (다까라 슈조)로 소화시키고, L쇄는 제한 효소 SacI (다까라 슈조)와 NotI (다까라 슈조)로 소화시킨 후, 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동하여 각 DNA 단편을 절단하여 추출하였다. 아가로스 겔로부터의 DNA 단편 추출에는 GeneClean II 키트 (프나코시)를 사용하였다.
ScFv 항체를 생산하는 벡터는 항CD34 항체 유전자를 도입하기 전에 미리 임의의 항체 유전자를 생산하는 플라스미드를 제작하였다. 재조합 파지 항체 시스템 키트 (파마시아)를 사용하여 항체를 생산하는 하이브리도마의 임의의 유전자를 조합하였다. 이 벡터의 제작 방법은 키트에 첨부된 프로토콜에 따랐다.
이 임의의 항체 유전자를 포함하는 플라스미드를 제한 효소 SacI (다까라 슈조)와 NotI (다까라 슈조)로 소화시킨 후, 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동하여 L쇄 영역이 결실된 벡터 DNA 단편을 추출 정제하였다. 이 DNA 단편과 앞서 제조한 항CD34 항체의 L쇄 유전자를 결찰시켜 L쇄 유전자를 조합시켰다. 이어서, L쇄가 교체된 플라스미드를 제한 효소 SfiI (도요보)와 BstPI (다까라 슈조)로 소화시킨 후, 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동하여 H쇄 영역이 결실된 벡터 DNA 단편을 추출 정제하였다. 이 DNA 단편과 앞서 제조한 항CD34 항체의 H쇄 유전자를 결찰시켜 H쇄 유전자를 조합시켰다. 각 결찰에는 라이게이션 ver.2 키트 (다까라 슈조)를 사용하였다. 또한, 아가로스 겔로부터의 DNA 단편 추출에는 GeneClean II 키트 (프나코시)를 사용하였다. 이상의 조작으로 얻은 플라스미드를 대장균 HB2151 (파마시아)에 도입하였다. 형질전환된 대장균을 암피실린 함유 2% 글루코오스 함유 2xYT 평판에 접종하여 하룻밤 배양하고, 출현한 콜로니 중에서 몇개를 선택하여 통상의 방법에 따라 플라스미드 DNA를 추출 정제하였다. 적당한 제한 효소를 사용하여 이들 플라스미드의 절단 패턴을 조사하여, 예상된 패턴과 일치하는 것을 선택하였다. 이상의 조작으로 얻은 항CD34 항체의 서열을 갖는 ScFv 항체를 발현하는 플라스미드를 pCANMY10이라고 하였다.
상기 플라스미드로 형질전환시킨 대장균을 2% 글루코오스를 첨가한 100 ㎍/㎖ 암피실린 첨가 SB 배지 (3.5% 박토트립톤, 2% 박토효모 추출물, 0.5% NaCl)에서 배양하였다. 다음 날, 그 일부를 상기 배지 10배량에 첨가하여 1시간 배양한 후, 원심분리하고 상청액을 제거하여 동량의 1 mM IPTG, 1OO ㎍/㎖ 암피실린 첨가 SB 배지로 교체하여 3시간 더 배양한 후, 균체를 RPAS 정제 모듈(Module) (파마시아)의 프로토콜에 따라 처리함으로써 세포질 중의 항체를 회수하였다. 얻어진 항체 조분획을 Etag 항체 칼럼 (파마시아)으로 정제하였다. 칼럼에 의한 정제는 첨부된 프로토콜에 따라 부속된 시약을 사용하여 수행하였다. 이상의 조작에 의해 ScFv 항체의 정제 표준품을 얻었다.
＜실시예 22＞
실시예 21에서 얻은 항CD 34ScFv 항체의 정제 표준품을 사용하여 인간 CD34 항원을 검출하였다. 1×107개의 KG-1a 세포를 0.O5% Triton×100 (나카라이 테스크(Nakaria Tesc))를 포함하는 PBS(-) 1 ㎖로 얼음 상에서 1O분간 처리하여, 세포막에서 단백질을 추출하였다. 사용한 KG-1a 세포는 10% 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 추출액 10 ㎕를 머캅토에탄올의 존재 하에 3분간 비등 처리하였다. 이 액을 SDS 폴리아크릴아미드 전기영동 겔 (ACI)를 사용하여 전개시켰다. 전기영동은 겔에 첨부된 프로토콜에 기재된 조건에 따라 수행하였다. 전기영동한 후, 겔 중의 단백질을 PVDF 막 (바이오라드)에 옮겼다. 이 작업은 25 mM 트리스 192 mM 글리신 버퍼와 전기영동 전원 (Electrophoresis power Supply)-EPS 600 장치 (파마시아)를 사용하여 10O V에서 1시간 수행하였다. 필터를 실온에서 1O% 탈지유 첨가 PBS(-)로 1시간 블로킹하였다. 필터를 0.05% Tween-20을 포함하는 PBS(-)로 세정한 후, 단쇄 항체 15 ㎍/㎖에서 1시간 반응시켰다.
이어서, 필터를 세정한 후, 2차 항체로서 항E-tag 항체 (파마시아) 5 ㎍/㎖에서 1시간 반응시켰다. 또한, 세정한 후, 3차 항체로서 퍼옥시다제 표식된 항-마우스 Fc 항체 5 ㎍/㎖에서 1시간 반응시켰다. 필터를 세정한 후, 1차 항체가 결합된 전기영동 밴드를 ECL액 (아메르샴(Amersham))으로 발광시키고, 고감도 필름 (Hyperfilm-ECL: 아메르샴)으로 검출하였다. 그 결과, 포지티브 대조군과 동일하게 약 120 kD 위치에서 CD34 분자의 밴드가 검출되었다. 포지티브 대조군으로는 1차 항체로서 항HPCA-1 항체 (벡톤 디킨슨)를, 2차 항체로서 퍼옥시다제 표식된 항-마우스 Fc 항체를 사용하여 필터를 동일한 방식으로 발색시켰다. 또한, 네가티브 대조군으로서 1차 항체인 단쇄 항체만 제외하고 동일하게 처리하였다. 120 kD의 밴드는 검출되지 않았다. 따라서, 항CD34 단쇄 항체는 CD34 분자를 검출할 수 있다는 것을 확인하였다.
＜실시예 23＞
제대혈 29 ㎖을 행크스 균형 생리식염수 (깁코)로 48 ㎖로 하고, 피콜-팩 (파마시아)를 각각 3 ㎖씩 나누어 넣은 원심관 4개에 12 ㎖씩 나누어 넣고, 800 rpm에서 20분의 조건으로 분리시켜 단핵 세포층의 세포를 회수하였다. 회수한 세포를 행크스액으로 세정하였다. 이 세포 2.O×107개에 실시예 20에서 생산한 인간-마우스 키메라 항체 5 ㎍을 첨가하여 1 ㎕/㎖로 하여 얼음 상에서 30분간 반응시켰다. 이것을 행크스액으로 세정한 후, 다이나 비드(Dyna bead) (다이날 (Dynal)) 항-인간 Ig 비드 9×106개를 첨가하여 얼음 상에서 1시간 반응시켰다. 다이나 비드의 분리는 부속된 매뉴얼에 따라 조작하였다. 얻어진 세포를 10% 소 태아 혈청 첨가 둘베코 MEM 배지에서 37℃에서 5% 탄산가스 분위기 하에 14시간 배양하였다. 배양한 후, 피펫팅하여 세포와 비드를 완전히 분리시키고, 다이나 비드에 부속된 매뉴얼에 따라 자석으로 비드를 제거하였다. 회수한 세포의 일부를 사용하여 세포수를 측정하여 회수된 세포수로 하였다. 나머지 세포를 항HPCA-2 항체 (벡톤)에서 30분간 얼음 상에서 반응시키고, 차갑게 한 2% 소 태아 혈청을 포함하는 생리식염수로 세정하고 원심분리하여 회수하였다. 얻어진 세포를 플로우 사이토미터 (콜터)로 CD34 양성 세포율을 측정하였다. CD34 양성 세포율을 CD34 세포의 순도로 하여, CD34 양성 세포율과 회수된 세포수를 곱하여 얻은 세포수를 회수된 CD34 양성 세포수로 하였다. 분리 전 양성 세포수와 회수한 양성 세포수로부터 CD34 양성 세포 회수율을 산출하였다. 그 결과, CD34 양성 세포는 순도가 80.4%이고 회수율이 45.3%였다. 이는 실시예 20에서 생산한 인간-마우스 키메라 항체가 CD34 양성 세포를 분리시켰다는 것을 나타낸다.
＜실시예 24＞
실시예 20에서 생산한 인간-마우스 키메라 항체를 결합시킨 항체 칼럼을 CNBr 활성화 세파로스(Sepharose) 4B (파마시아)를 사용하여 제작하였다. 항체를 세파로스 4B 비드에 결합시키는 방법은 첨부된 프로토콜에 따랐다. 겔 4.0 ㎖과 인간-마우스 키메라 항체액을 반응시켜, 커플링 효율 99.5%로 친화도-겔을 제작하였다. 유리솜 소량을 칼럼내 하부에 고정시킨 유리 칼럼 (2 ㎠×3 ㎝)을 실리콘화하고, 칼럼에 앞서 제조한 겔 1 ㎖을 채워 세포 분리용 겔 칼럼을 제작하였다.
제대혈 32 ㎖에 실리카액 (가부시끼가이샤 멘에끼 세부쯔 겡뀨쇼 (Immune Biology Research Institute Co., Ltd.)) 3 ㎖을 첨가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이트하였다. 이 세포 현탁액을 행크스 균형 생리식염수 (깁코)로 48 ㎖로 하고, 피콜-팩 (파마시아)를 3 ㎖씩 나누어 넣은 원심관 4개에 이 현탁액을 12 ㎖씩 나누어 넣고, 800 rpm에서 20분의 조건으로 분리시켜 단핵 세포층의 세포를 회수하였다. 회수한 세포를 행크스액으로 세정하였다. 이 세포 2.1×107개를 포함하는 세포 현탁액 1 ㎖을 상기 항체 칼럼에 넣고, 4℃에서 약하게 교반하면서 1시간 반응시켰다. 칼럼에 1O% 소 태아 혈청, 1OO 유닛/㎖ 페니실린, 1OO ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 행크스 균형 생리식염수를 흘려넣어 세정하였다. 이 칼럼에 1O% 소 태아 혈청, 1OO 유닛/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 MEM 배지 (깁코) 2 ㎖을 첨가하고, 탄산가스 배양기 내에서 37℃에서 13시간 배양하였다. 이 칼럼을 상하로 움직여 겔을 다소 강하게 교반하고, 칼럼에서 배지를 회수하였다. 또한, 칼럼에 1O% 소 태아 혈청, 1OO 유닛/㎖ 페니실린, 1OO ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 행크스 균형 생리식염수 5 ㎖를 흘려넣고, 이 액도 회수하였다. 이들 회수한 액 중의 세포를 원심분리하여 회수하였다. 이들 세포수를 계수하였다. 남은 세포를 항HPCA-2 항체 (벡톤)에서 얼음 상에서 30분간 반응시키고, 차갑게 한 2% 소 태아 혈청을 포함하는 생리식염수로 세정하고, 원심분리기로 회수하였다. 이 세포를 플로우 사이토미터 (콜터)로 CD34 양성 세포율을 측정하였다. CD34 양성 세포율을 CD34 세포의 순도로 하여, CD34 양성 세포율과 회수된 세포수를 곱하여 얻은 세포수를 회수된 CD34 양성 세포수로 하였다. 그 결과, 순도는 45.2%이고 회수율은 62.6%이었다. 이로부터 겔을 채운 칼럼 장치로 이루어진 조혈 미분화 세포 분리 장치가 효과적이라는 것을 확인하였다.
＜실시예 25＞
제대혈 29 ㎖를 행크스 균형 생리식염수 (깁코)로 48 ㎖로 하고, 피콜-팩 (파마시아)을 3 ㎖씩 나누어 넣은 원심관 4개에 12 ㎖씩 나누어 넣고, 800 rpm에서 20분의 조건으로 분리시켜 단핵 세포층의 세포를 회수하였다. 회수한 세포를 행크스액으로 세정하였다. 이 세포 2.0×107개에 실시예 21에서 생산한 단쇄 항체 25 ㎍을 첨가하여 5 ㎕/㎖로 하고 얼음 상에서 1시간 반응시켰다. 이를 행크스액으로 세정한 후, 항Etag 항체 (파마시아)에서 30분간 반응시켰다. 세정한 후, 9×106개의 다이나 비드 (다이날) 항-마우스 IgG 비드를 첨가하여 얼음 상에서 1시간 반응시켰다. 부속된 다이나 비드의 매뉴얼에 따라 비드에 흡착된 세포와 함께 비드를 분리하였다. 얻어진 세포를 10% 소 태아 혈청 첨가 둘베코 MEM 배지에서 5% 탄산가스 분위기 하에 37℃에서 12시간 배양하였다. 배양한 후, 피펫팅하여 세포와 비드를 완전히 분리시키고, 다이나 비드 부속의 매뉴얼에 따라 자석으로 비드를 제거하였다. 회수한 세포는 일부를 사용하여 세포수를 측정하여 회수된 세포수로 하였다. 남은 세포를 항HPCA-2 항체 (벡톤)에서 얼음 상에서 30분간 반응시키고, 차갑게 한 2% 소 태아 혈청을 포함하는 생리식염수로 세정하고 원심분리기로 회수하였다. 이 세포를 플로우 사이토미터 (콜터)로 CD34 양성 세포율에 대해 측정하였다. CD34 양성 세포율을 CD34 세포의 순도로 하여, CD34 양성 세포율과 회수된 세포수를 곱하여 얻은 세포수를 회수된 CD34 양성 세포수로 하였다. 그 결과, 순도는 36.1%이고 회수율은 35.3%였다. 이는 실시예 21에서 생산한 단쇄 항체가 CD34 양성 세포를 분리시켰다는 것을 나타낸다.
＜실시예 26＞
실시예 21에서 생산한 단쇄 항체를 결합시킨 항체 칼럼을 CNBr 활성화 세파로스 4B (파마시아)를 이용하여 제작하였다. 항체를 세파로스 4B 비드에 결합시키는 방법은 첨부된 프로토콜에 따랐다. 겔 4.0 ㎖에 단쇄 항체액을 반응시켜 커플링 효율 99.0%로 친화도 겔을 제작하였다. 유리솜 소량을 칼럼내 하부에 고정한 유리 칼럼 (2 ㎠×4 ㎝)을 실리콘화하고, 이 칼럼에 앞서 제조한 겔 1 ㎖을 채워 겔 칼럼 세포 분리 장치를 제작하였다.
제대혈 28 ㎖에 실리카액 (가부시끼 가이샤 멘에끼 세부쯔 겡뀨쇼) 3 ㎖을 첨가하고 37℃에서 1시간 인큐베이트하였다. 이 세포 현탁액을 행크스 균형 생리식염수 (깁코)를 첨가하여 48 ㎖로 하고, 피콜-팩 (파마시아)를 3 ㎖씩 나누어 넣은 원심관 4개에 이 현탁액을 12 ㎖씩 나누어 넣고 800 rpm에서 20분의 조건으로 분리시켜 단핵 세포층의 세포를 회수하였다. 회수한 세포를 행크스액으로 세정하였다. 이 세포 1.8×107개를 포함하는 세포 현탁액 1 ㎖을 상기 항체 칼럼에 넣고, 4℃에서 약하게 교반하면서 1시간 동안 반응시켰다. 칼럼에 1O% 소 태아 혈청, 1OO 유닛/㎖ 페니실린, 1OO ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 행크스 균형 생리식염수를 흘려넣어 세정하였다. 이 칼럼을 1O% 소 태아 혈청, 1OO 유닛/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 MEM 배지 (깁코) 2 ㎖을 첨가하여 탄산가스 배양기 내에서 37℃에서 13시간 배양하였다. 칼럼을 상하로 움직여 겔을 다소 강하게 교반하고, 칼럼으로부터 배지를 회수하였다. 또한, 칼럼에 1O% 소 태아 혈청, 1OO 유닛/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 행크스 균형 생리식염수 5 ㎖를 흘려넣어, 이 액도 회수하였다. 이들 회수액 중의 세포를 원심분리하여 회수하였다. 이들 세포수를 계수하였다. 남은 세포는 항HPCA-2 항체 (벡톤)에서 얼음 상에서 30분 반응시키고, 차갑게 한 2% 소 태아 혈청을 포함하는 생리식염수로 세정하고 원심분리기로 회수하였다. 이 세포를 플로우 사이토미터 (콜터)로 CD34 양성 세포율을 측정하였다. CD34 양성 세포율을 CD34 세포의 순도로 하여, CD34 양성 세포율과 회수된 세포수를 곱하여 얻은 세포수를 회수된 CD34 양성 세포수로 하였다. 그 결과, 순도는 52.8%이고 회수율은 41.0%이었다. 이로부터 겔을 채운 칼럼 장치로 이루어진 조혈 미분화 세포의 분리 장치가 효과적이라는 것을 확인하였다.
＜실시예 27＞
실시예 21에서 제작한 pCANMY10 벡터를 개량하여 수불용성 담체로의 결합성을 향상시킬 수 있는 항체를 제작하였다. 단쇄 항체의 카르복실 말단에 있는 E-tag 서열 뒤에 아미노산 리신 잔기 3개를 도입하였다. pCANMY10 벡터의 제한 효소 자리를 이용하여 리신 잔기를 포함하는 서열을 PCR법에 의해 도입하였다. 이 서열을 서열 42에 나타냈다.
이 벡터를 대장균 HB2151 세포에 도입하고, 실시예 21과 동일하게 단쇄 항체를 제작하였다.
CNBr 활성화 세파로스 4B (파마시아)를 이용하여 얻어진 단쇄 항체를 결합시킨 항체 칼럼을 제작하였다. 항체를 세파로스 4B 비드에 결합시키는 방법은 첨부된 프로토콜에 따랐다. 겔 4.0 ㎖에 단쇄 항체액을 반응시켜 친화도 겔을 제작하였다. 유리솜 소량을 칼럼내 하부에 고정한 유리 칼럼 (2 ㎠×3 ㎝)을 실리콘화하고, 이 칼럼에 앞서 제조한 겔 1 ㎖을 채워 겔 칼럼 세포 분리 장치를 제작하였다.
제대혈 32 ㎖에 실리카액 (가부시끼 가이샤 멘에끼 세부쯔 겡뀨쇼) 3 ㎖을 첨가하고 37℃에서 1시간 인큐베이트하였다. 이 세포 현탁액에 행크스 균형 생리식염수 (깁코)를 첨가하여 48 ㎖로 하고, 피콜0팩 (파마시아 제조)를 3 ㎖씩 나누어 넣은 원심관 4개에 이 현탁액을 12 ㎖씩 나누어 넣고 800 rpm에서 20분의 조건으로 분리하여 단핵 세포층의 세포를 회수하였다. 회수한 세포를 행크스액으로 세정하였다. 이 세포 2.1×l07개를 포함하는 세포 현탁액 1 ㎖을 상기 항체 칼럼에 넣고 4℃에서 약하게 교반하면서 1시간 반응시켰다. 칼럼에 1O% 소 태아 혈청, 1OO 유닛/㎖ 페니실린, 1OO ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 행크스 균형 생리식염수를 흘려넣어 세정하였다. 이 칼럼에 10% 소 태아 혈청, 100 유닛/㎖ 페니실린, 1OO ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 MEM 배지 (깁코) 2 ㎖를 첨가하여 37℃의 탄산가스 배양기 내에서 14시간 배양하였다. 이 칼럼을 상하로 움직여 겔을 다소 강하게 교반하고, 칼럼으로부터 배지를 회수하였다. 또한, 칼럼에 10% 소 태아 혈청, 100 유닛/㎖ 페니실린, 1OO ㎍/㎖ 스트렙토마이신를 포함하는 행크스 균형 생리식염수 5 ㎖를 흘려넣고, 이 액도 회수하였다. 이들 회수액 중의 세포를 원심분리하여 회수하였다. 이들 세포수를 계수하였다. 남은 세포를 항HPCA-2 항체 (벡톤)에서 얼음 상에서 30분간 반응시키고, 차갑게 한 2% 소 태아 혈청을 포함하는 생리식염수로 세정하고, 원심분리기로 회수하였다. 이 세포를 플로우 사이토미터 (콜터)로 CD34 양성 세포율에 대해 측정하였다. CD34 양성 세포율을 CD34 세포의 순도로 하여, CD34 양성 세포율과 회수 세포수를 곱하여 얻은 세포수를 회수된 CD34 양성 세포수로 하였다. 그 결과, 순도는 71.0%이고 회수율 52.0%이었다. 이는 겔을 채운 칼럼 장치로 이루어진 조혈 미분화 세포의 분리 장치가 효과적이라는 것을 확인함과 동시에 카르복실 말단에 리신 잔기를 도입시킨 재조합 항체가 세포를 보다 효율적으로 분리할 수 있다는 것을 나타낸다.
본 발명에 따라 CD4 양성 세포와 CD34 양성 세포를 특이적으로 및 효율적으로 분리시킬 수 있다. 본 발명은 자기면역 질환 등의 치료를 목적으로, 자기 반응성 항원 수용체를 갖는 T 림프구의 수집, 골수 이식용 세포로부터 림프구의 제거 등의 분야에서 효과적이고, 또한 본 발명은 백혈병 등을 치료하는 의료 목적으로, 조혈 미분화 세포의 수집, 골수 이식용 세포로부터 림프구의 제거 등의 분야에서 효과적이다.
＜기탁된 미생물에 대한 언급＞
가. 해당 미생물을 기탁한 기탁 기관의 명칭과 주소
기탁 기관: 일본국 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소
주소: 일본국 이바라끼껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1-3
나. 기탁 기관에 기탁한 일자
평성 10년(1998년) 5월 14일
다. 기탁 기관에 기탁과 관련하여 주어진 기탁 번호
FERM BP-6729
주의: 본 기탁은 평성 10년(1998년) 5월 14일에 기탁된 원기탁 (기탁 번호:비고우껭낀끼 제P-16807호)으로부터 평성 11년(1999년) 5월 21일에 부타페스트 조약에 기초한 기탁으로 이관된 것이다.

Claims (28)

  1. 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 이들을 조합한 항체 중에서 선택된 항체를 이용하는 세포 분리 장치.
  2. CD4 분자에 결합하는 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 이들을 조합한 항체 중에서 선택된 항체를 이용하는 CD4 양성 세포 분리 장치.
  3. H쇄 가변 영역의 CDR-1이 서열 1로, CDR-2가 서열 2로, CDR-3이 서열 3으로 각각 표시되는 아미노산 서열이고, L쇄 가변 영역의 CDR-1이 서열 4로, CDR-2가 서열 5로, CDR-3이 서열 6으로 각각 표시되는 아미노산 서열이며, Fc 영역이 인간형인 키메라 항체를 이용하는 CD4 양성 세포 분리 장치.
  4. H쇄 가변 영역의 CDR-1이 서열 1로, CDR-2가 서열 2로, CDR-3이 서열 3으로 각각 표시되는 아미노산 서열이고, L쇄 가변 영역의 CDR-1이 서열 4로, CDR-2가 서열 5로, CDR-3이 서열 6으로 각각 표시되는 아미노산 서열인 단쇄 항체를 이용하는 CD4 양성 세포 분리 장치.
  5. CD34 분자에 결합하는 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 이들을 조합한 항체 중에서 선택된 항체를 이용하는 CD34 양성 세포 분리 장치.
  6. H쇄 가변 영역의 CDR-1이 서열 43으로, CDR-2가 서열 44로, CDR-3이 서열 45로 각각 표시되는 아미노산 서열이고, L쇄 가변 영역의 CDR-1이 서열 46으로, CDR-2가 서열 47로, CDR-3이 서열 48로 각각 표시되는 아미노산 서열이며, Fc 영역이 인간형인 키메라 항체를 이용하는 인간 CD34 양성 세포 분리 장치.
  7. H쇄 가변 영역의 CDR-1이 서열 43으로, CDR-2가 서열 44로, CDR-3이 서열 45로 각각 표시되는 아미노산 서열이고, L쇄 가변 영역의 CDR-1이 서열 46으로, CDR-2가 서열 47로, CDR-3이 서열 48로 각각 표시되는 아미노산 서열인 단쇄 항체를 이용하는 인간 CD34 양성 세포 분리 장치.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 아미노산 서열의 C 말단, N 말단, 또는 이들 둘 모두에 염기성 아미노산 또는 산성 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 부가한 항체를 이용하는 세포 분리 장치.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리프로필렌 부직포에 할로아세트아미노메틸화제를 반응시켜 이루어진 활성기에 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 이들을 조합한 항체 중에서 선택된 항체를 결합시킨 세포 분리 장치.
  10. 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 이들을 조합한 항체 중에서 선택된 항체를 이용하는 세포 분리 또는 검출 방법.
  11. CD4 분자에 결합하는 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 이들을 조합한 항체 중에서 선택된 항체를 이용하는 인간 CD4 양성 세포의 분리 또는 검출 방법.
  12. H쇄 가변 영역의 CDR-1이 서열 1로, CDR-2가 서열 2로, CDR-3이 서열 3으로 각각 표시되는 아미노산 서열이고, L쇄 가변 영역의 CDR-1이 서열 4로, CDR-2가 서열 5로, CDR-3이 서열 6으로 각각 표시되는 아미노산 서열이며, Fc 영역이 인간형인 키메라 항체를 이용하는 인간 CD4 양성 세포의 분리 또는 검출 방법.
  13. H쇄 가변 영역의 CDR-1이 서열 1로, CDR-2가 서열 2로, CDR-3이 서열 3으로 각각 표시되는 아미노산 서열이고, L쇄 가변 영역의 CDR-1이 서열 4로, CDR-2가 서열 5로, CDR-3이 서열 6으로 각각 표시되는 아미노산 서열인 단쇄 항체를 이용하는 인간 CD4 양성 세포의 분리 또는 검출 방법.
  14. CD34 분자에 결합하는 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 이들을 조합한 항체 중에서 선택된 항체를 이용하는 인간 CD34 양성 세포의 분리 또는 검출 방법.
  15. H쇄 가변 영역의 CDR-1이 서열 43으로, CDR-2가 서열 44로, CDR-3이 서열 45로 각각 표시되는 아미노산 서열이고, L쇄 가변 영역의 CDR-1이 서열 46으로, CDR-2가 서열 47로, CDR-3이 서열 48로 각각 표시되는 아미노산 서열이며, Fc 영역이 인간형인 키메라 항체를 이용하는 인간 CD34 양성 세포의 분리 또는 검출 방법.
  16. H쇄 가변 영역의 CDR-1이 서열 43으로, CDR-2가 서열 44로, CDR-3이 서열 45로 각각 표시되는 아미노산 서열이고, L쇄 가변 영역의 CDR-1이 서열 46으로, CDR-2가 서열 47로, CDR-3이 서열 48로 각각 표시되는 아미노산 서열인 단쇄 항체를 이용하는 인간 CD34 양성 세포 분리 또는 검출 방법.
  17. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 아미노산 서열의 C 말단, N 말단 또는 이들 둘 모두에 염기성 아미노산 또는 산성 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 부가한 항체를 이용하는 세포 분리 또는 검출 방법.
  18. H쇄 가변 영역의 CDR-1, CDR-2 및 CDR-3이 각각 서열 1, 2 및 3에 기재된 아미노산 서열인, CD4 항원에 대해 친화성이 있는 항체.
  19. L쇄 가변 영역의 CDR-1, CDR-2 및 CDR-3이 각각 서열 4, 5 및 6에 기재된 아미노산 서열인, CD4 항원에 대해 친화성이 있는 항체.
  20. 기탁 번호 FERM BP-6729의 하이브리도마 4H5에 의해 생산되는 CD4 항원에 대한 모노클론 항체.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항 기재의 항체를 코드하는 핵산.
  22. 제21항에 있어서, 서열 7과 서열 8에 기재한 염기 서열을 갖는 핵산.
  23. 제21항 또는 제22항 기재의 핵산을 이용하는 항체 생산 방법.
  24. 제23항에 따른 방법으로 얻을 수 있는, CD4 항원에 대해 친화성이 있는 재조합 항체.
  25. 제24항에 있어서, 항체의 Fc 영역이 인간형인 재조합 항체.
  26. 제24항에 있어서, 항체가 단쇄 항체인 재조합 항체.
  27. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항 기재의 항체와 의약적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물.
  28. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항 기재의 재조합 항체와 의약적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물.
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