WO1999061629A1 - Dispositif pour la separation cellulaire et procede de separation - Google Patents

Dispositif pour la separation cellulaire et procede de separation Download PDF

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WO1999061629A1
WO1999061629A1 PCT/JP1999/002711 JP9902711W WO9961629A1 WO 1999061629 A1 WO1999061629 A1 WO 1999061629A1 JP 9902711 W JP9902711 W JP 9902711W WO 9961629 A1 WO9961629 A1 WO 9961629A1
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antibody
seq
cdr
amino acid
acid sequence
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PCT/JP1999/002711
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Mitsuharu Ono
Takayuki Soka
Ikuo Morimoto
Koichi Miyamura
Original Assignee
Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha
Asahi Medical Co., Ltd.
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
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    • C07K16/2812—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD4
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    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to a cell separation device using a novel recombinant antibody and a cell separation or cell detection method using the same.
  • a method for separating and detecting human CD4 or CD34-positive cells using a novel recombinant antibody against human CD4 (Cluster di fermentation) antigen or CD34 antigen The present invention relates to an apparatus for separating cells.
  • the present invention relates to an antibody having particularly high affinity and specificity for human CD4 antigen or a pharmaceutical composition containing this antibody, which is useful for antigen quantification and detection, and application to pharmaceuticals and medical devices.
  • CD4-positive cells By using an antibody against the surface antigen of human blood cells, specific cells can be separated, removed, recovered, and detected from a blood cell group. For example, removal of CD4-positive cells can improve the condition of autoimmune disease patients, and recovery of CD34-positive cells can enrich hematopoietic progenitor cells that can also be used for transplantation.
  • Human CD4 is a glycoprotein with a molecular weight of 55kD, exists as a monomer on the cell membrane, and is mainly expressed on T cells.
  • T cells expressing CD4 (approximately 65% of peripheral T cells) have the properties of helper T cells and recognize antigens presented by class I IMHC molecules. It is also known that ⁇ 04 binds to 11 (human immunodeficiency virus: AIDS virus) and acts as a receptor during infection.
  • Herba T cells in the immune system are essential for proper response to antigens and are essential for most B cell antibody responses.
  • Helper T cells are activated mainly when they recognize non-self antigens bound to the surface of antigen-presenting cells, and secrete inter-kinin 2 to stimulate T cell proliferation, which helps to activate B cells. And promotes the production of antibodies. In addition to assisting the luminous ball, There are also helper T cells that activate macrophages by secreting interferon.
  • lymphocyte clones containing autoreactive antigen receptors are removed (clonal deletion), their inactivity is reduced (clonal anergy), and their functions are suppressed (suppression).
  • lymphocyte clones with autoreactive antigen receptors are not only CD4 expressing T helper cells, the importance of T helper cells in autoimmune diseases is recognized.
  • JP-A-3-32680 discloses that peptides or lipids having affinity for T lymphocytes are fixed.
  • the normalized separation material also has affinity for CD4 positive cells in JP-A-6-154316, JP-A-6-154317, JP-A-6-218051, and JP-A-6-269663.
  • CD4 positive cell-collecting materials in which the peptide is immobilized on a non-woven fabric are disclosed respectively. Power ⁇ Both have problems with the affinity and specificity of the peptide used as the ligand for the antigen, and sufficient cells Can not expect adsorption capacity.
  • the latter uses a partial peptide of the complementarity determining region ⁇ CDR '' and a part of the framework region ⁇ framework '' interposed therebetween, which is closely related to the formation of the antigen-binding site of the anti-CD4 antibody. Then, effective antigen binding cannot be expected.
  • CDRs have three regions called “CDR-1”, “CDR-2” and “CD-3” from the N-terminal side for each of the H chain and L chain.
  • human CD34 has been reported as a cell surface antigen of hematopoietic undifferentiated cells, and a MY10 antibody-producing hybridoma has been known as a cell producing an antibody recognizing the human CD34 molecule (USP 4965204, and J. Immunology, 133, 157, 1984). Since then, a number of anti-human CD34 antibodies have been reported, and they have been applied to the separation of undifferentiated hematopoietic cells in the medical field such as bone marrow transplantation. In order to make effective use of such medical applications, it has become necessary to efficiently produce anti-human CD34 antibodies and develop medical devices using them.
  • the CD34 molecule is known as an antigen marker for undifferentiated cells expressed on undifferentiated cells of blood, and its application to the isolation of undifferentiated cells has been reported (S. Sael and et al., Bl. od magazine, Vol. 72, p. 1580, 1988).
  • medical devices are being developed to separate undifferentiated cells from differentiated cells and cancer cells using a combination of anti-CD34 antibody and biotin, avidin, or magnetic beads (Dreger Et al., Ex pHematol. Magazine, Vol. 23, p. 147, 1995).
  • Antibodies are generally known to have strong binding to antigens and high specificity. The use for is expected. However, the cost of antibody production has become an issue when creating medical devices. It is necessary to produce antibodies efficiently and apply them to medical devices. Therefore, as a method for efficiently producing antibodies, it is expected that technology for producing recombinant antibodies will be established and applied to medical devices.
  • An object of the present invention is to provide a recombinant antibody capable of reducing antigenicity, increasing the amount of antibody produced, and reducing production cost.
  • antibodies that had previously been obtained from mouse ascites or cell culture can now be produced by bacteria, etc., creating the possibility of supplying medical devices at low cost.
  • Monoclonal antibody production usually begins with isolation of B lymphocytes from animals immunized with the antigen of interest and fusion with myeloma cells to produce hybridomas. Next, screening using the target antigen is performed to obtain antibody-producing hybridomas. At this time, a large number of cells must be screened in order to obtain a hybridoma that produces an antibody that has strong binding to the antigen and high specificity. It requires a lot of labor.
  • CDR-1, CDR-2 and CDR-3 of the variable region of the H chain extracted from the anti-CD4 antibody-producing hybridoma 4H5 were sequence numbers 1, 2 and 3, respectively, in the sequence listing. 3 wherein the CDRs, CDR-2 and CDR-3 of the L chain variable region are the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 4, 5 and 6, respectively.
  • the antibody was found to have particularly high affinity and specificity for the antigen.
  • the 4-5 antibody-producing hybridoma Mouse-Mouse hybridoma 4H5
  • FERM BP-6729 The 4-5 antibody-producing hybridoma, Mouse-Mouse hybridoma 4H5
  • variable region an antigen-binding site (variable region) (or “V region”), and certain “constant regions” (or “Fc”) for each antibody class. ).
  • the variable region is further divided into a complementarity-determining region “CDR” which is particularly closely related to formation of an antigen-binding site, and a framework region “framework” interposed therebetween. It is known that CDR has three regions called “CDR-1”, “CDR-2” and “CDR-3” from the N-terminal side for each of the H chain and the L chain.
  • Figure 1 shows a schematic diagram of the IgG structure.
  • the number of amino acids constituting the variable region of an antibody often differs depending on the antibody.
  • the amino acid sequence of the variable region of the H chain of the 4H5 antibody is shown in SEQ ID NO: 35 in Sequence Listing.
  • Amino acid positions 1 to 30 of SEQ ID NO: 35 are framework 1
  • positions 31 to 35 are CDR-1
  • positions 36 to 49 are framework 2
  • positions 50 to 66 are CDR-2
  • position 67 And 98 show framework 3
  • 99 to 107 show CDR-3
  • 108 to 118 show framework 4.
  • the amino acid sequence of the variable region of the L chain of the 4H5 antibody is shown in SEQ ID NO: 36 in Sequence Listing.
  • Amino acids 1 to 23 of SEQ ID NO: 36 are framework 1
  • positions 24 to 38 are CDR-1
  • positions 39 to 53 are framework 2
  • positions 54 to 60 are CDR-2
  • position 61 The 92nd position indicates framework 3
  • 93rd to 101st positions indicate CDR-3
  • 102th to 111th positions indicate framework 4.
  • the boundaries between these frameworks and the CDRs are based on the mouse antibody variable region gene sequences described in Sequences of Proteins of Immunological Interies, 5th edition, 1991 (USA NIH). Determined with reference.
  • SEQ ID NO: 7 in the sequence listing shows a nucleic acid base sequence corresponding to amino acids 9 to 118 of SEQ ID NO: 35 in the sequence listing.
  • SEQ ID NO: 8 in the sequence listing shows a nucleic acid base sequence corresponding to amino acids 9 to 111 of SEQ ID NO: 36 in the sequence listing.
  • SEQ ID NO: 39 shows the gene sequence of the variable region of the H chain of the anti-MY10 antibody, which is an antibody that binds to the anti-CD34 antigen, and the amino acid sequence encoded thereby.
  • Amino acid positions 1 to 30 of SEQ ID NO: 39 are framework 1
  • positions 31 to 35 are CDR-1
  • 36 to 49 are Framework 2
  • 50 to 65 are CDR-2
  • 66 to 97 are Framework 3
  • 98 to 106 are CDR-3
  • 107 to 117 are Framework 4. Show.
  • SEQ ID NO: 40 The gene sequence of the variable region of the L chain of the MY10 antibody and the amino acid sequence encoded thereby are shown in SEQ ID NO: 40 in the Sequence Listing.
  • Amino acid positions 1 to 23 of SEQ ID NO: 40 are framework 1
  • positions 24 to 39 are CDR-1
  • positions 40 to 54 are framework 2
  • positions 55 to 61 are CDR-2
  • Position 93 indicates framework 3
  • positions 94 to 102 indicate CDR-3
  • positions 103 to 113 indicate framework 4.
  • Positions 1 to 39 include a sequence containing a signal for secretion from Escherichia coli, positions 40 to 156 are variable regions of the H chain, positions 157 to 171 are phosphorus potential, positions 172 to 284 Position is the variable region of the L chain, and positions 285 to 302 show the sequence containing E-tag.
  • PCANTAB5E Plasmid provides a linker sequence containing a part of the H chain and L chain, that is, positions 140 to 169, and the present invention utilizes this sequence.
  • the linker that binds to the H chain and the L chain is included in the plasmid of the present invention, but may be used without being limited to such a sequence.
  • a single-chain antibody can be isolated from a hybridoma using a Recombinant Phage Antibody System Kit (Pharmacia) or the like. Without the human CD34 antigen required for tanning, the kit cannot be used effectively and requires a lot of work.
  • the present invention relates to the following cell separation device and a method for separating or detecting cells using the same.
  • CDR-1 of the H chain variable region is Asp Tyr Val lie Asn (SEQ ID NO: 1) and CDR-2 is Glu He Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Glu Met Phe Lys Gly SEQ ID NO: 2), CDR-3 is an amino acid sequence represented by Arg Gly Thr Gly Thr Gly Phe Ala Tyr (SEQ ID NO: 3), and CDR-1 of the L chain variable region is Lys
  • CDR-1 of the H chain variable region is Asp Tyr Val lie Asn (SEQ ID NO: 1)
  • CDR-2 is Glu lie Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Glu Met Phe Lys Gly SEQ ID NO: 2)
  • CDR-3 is an amino acid sequence represented by Arg Gly Thr Gly Thr Gly Phe Ala Tyr (SEQ ID NO: 3)
  • CDR-1 of the L chain variable region is Lys
  • CDR-1 of the H chain variable region is Asp Tyr Val He Asn (SEQ ID NO: 1)
  • CDR-2 is Glu He Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Glu Met Phe Lys Gly SEQ ID NO: 2)
  • CDR-3 is an amino acid sequence represented by Arg Gly Thr Gly Thr Gly Phe Ala Tyr (SEQ ID NO: 3)
  • CDR-1 of the L chain variable region is Lys
  • CDR-2 is Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser (SEQ ID NO: 5)
  • CDR-3 is Gin Gin Ser Ser Glu Amino acid represented by Asp Pro Pro Thr (SEQ ID NO: 6)
  • CDR-1 is Asp Tyr Val He Asn (SEQ ID NO: 1)
  • CDR-2 is Glulie Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Glu Met Phe Lys Gly (Sequence list sequence) No.
  • CDR-3 is an amino acid sequence represented by Arg Gly Thr Gly Thr Gly Phe Ala Tyr (SEQ ID NO: 3), and CDR-1 of the L chain variable region is Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn (SEQ ID NO: 4), CDR-2 is Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser (SEQ ID NO: 5), CDR-3 is Gin Gin Ser Ser Glu Asp Pro Pro Thr ( A method for separating or detecting human CD4-positive cells using a single-chain antibody containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6) in the Sequence Listing.
  • the present invention also relates to the following cell separation device and a method for separating or detecting cells using the same.
  • a CD34-positive cell separation device using a chimeric antibody, a single-chain antibody, or a combination thereof that binds to the CD34 molecule (1) A CD34-positive cell separation device using a chimeric antibody, a single-chain antibody, or a combination thereof that binds to the CD34 molecule.
  • CDR-1 of the H chain variable region is Ser-His-Gly-Vat His (SEQ ID NO: 43), and CDR-2 is Va-lie-Trp-Gly-Ala-Gly-Arg-Thr- Asp-Tyr-Asn-Ala-Ala-Phe-lie-Ser (SEQ ID NO: 44) and CDR-3 are Asn-Arg-Tyr-Glu-Ser-Tyr-Phe-Asp-Tyr (SEQ ID NO: 45) ), Wherein CDR-1 of the L chain variable region is Arg-Ser-Ser-Gin-Asn-Leu-Vat His- Ser-Asn-Gly-Asn-Thr-Tyr-Leu-His.
  • CDR-2 is Lys-Vat Ser-Asn-Arg-Phe- Ser-Gly-Vat Pro-Asp-Arg-Phe (SEQ ID NO: 47)
  • CDR-3 is Ser -Separation of CD34-positive cells using an antibody with an amino acid sequence represented by Gin- Ser- Thr- His- Val- Pro- Leu- Thr (SEQ ID NO: 48) and a human Fc region apparatus.
  • CDR-1 of the H chain variable region is Ser-His-Gly-Vat His (SEQ ID NO: 43)
  • CDR-2 is Va-lie-Trp-Gly-Ala-Gly-Arg-Thr- Asp Tyr- Asn- Ala Ala- Phe- lie- Ser ( SEQ ID NO: 44)
  • CDR-3 is an amino acid sequence represented by Asn-Arg-Tyr-Glu-Ser-Tyr-Phe-Asp-Tyr (SEQ ID NO: 45), and CDR of an L chain variable region.
  • CDR-1 is Arg-Ser-Ser-Gln-Asn-Leu-Val-His-Ser-Asn-Gly-Asn-Thr-Tyr-Leu-His (SEQ ID NO: 46)
  • CDR-2 is Lys -Val-Ser-Asn-Arg-Phe-Ser-Gly-Val-Pro-Asp-Arg-Phe (SEQ ID NO: 47)
  • CDR-3 is Ser-Gln-Ser-Thr-His-Val-Pro Of CD34-positive cells using a single-chain antibody with the amino acid sequence represented by -Leu-Thr (SEQ ID NO: 48)
  • CDR-1 of the H chain variable region is Ser-His-Gly-Val-His (SEQ ID NO: 43), and CDR-2 is Va-lie-Trp_Gly-Ala-Gly-Arg-Thr.
  • -Asp-Tyr-Asn-Ala-Ala-Phe_Ile-Ser SEQ ID NO: 44
  • CDR-3 are Asn-Arg-Tyr-Glu-Ser-Tyr-Phe-Asp-Tyr (SEQ ID NO: 45)
  • CDR-1 of the light chain variable region is Arg- Ser-Ser-Gln-Asn-Leu-Val-His-Ser-Asn-Gly-Asn-Thr-Tyr-Leu- His (SEQ ID NO: 46)
  • CDR-2 is Lys-Val-Ser-Asn-Arg-Phe-Ser-Gly-Val-Pro-Asp-Arg-Phe (
  • CDR-1 of the H chain variable region is Ser-His-Gly-Val-His (SEQ ID NO: 43), and CDR-2 is Vapor lie-Trp-Gly_Ala-Gly-Arg-Thr.
  • -Asp-Tyr-Asn-Ala-Ala-Phe-ly-Ser SEQ ID NO: 44
  • CDR-3 are Asn-Arg-Tyr-Glu-Ser-Tyr-Phe Asp-Tyr (SEQ ID NO: 45)
  • CDR-1 of the L chain variable region is Arg- Ser- Ser- Gin- Asn- Leu- VatoHis- SerAsn- Gly_Asn- Thr- Tyr- LeuHis (Sequence number of Sequence Listing 46)
  • CDR-2 is Lys-Vat Ser-Asn-Arg-Phe- Ser-Gly-Val-Pro-Asp-Arg-Phe (SEQ ID NO: 47)
  • CDR-3 is Ser-Gin
  • the present invention relates to the following antibody, a nucleic acid encoding the antibody, a method for producing an antibody using the nucleic acid, and a pharmaceutical composition comprising the antibody.
  • CDR-1 of the H chain variable region CDR-2 and CDR-3 are respectively SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
  • nucleic acid according to (4) which comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 or 8 in the sequence listing.
  • a recombinant antibody which can be obtained by the method of the above (6) and has an affinity for the CD4 antigen.
  • a pharmaceutical composition comprising the antibody according to any one of (1) to (3) above and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • antibody refers to a molecule containing at least one antigen-binding site formed by a variable region of an H chain or L chain of an antibody or a combination thereof in addition to an antibody which is usually present in a living body.
  • a peptide containing only the variable region of the H chain a Fab consisting of one set of H chain fragment and L chain fragment, (Fab ') 2 consisting of two sets of H chain fragment and L chain fragment,
  • Fab ' single-chain antibodies “ScFv” in which chain fragments are linked in series on the same peptide.
  • human CD4 antigen refers to a helper T cell expressed on lymphocytes, which is reported by Parnes, JR (Adv. I. References, 44, 265, 1989). Known as an antigen marker. In humans, the CD4 antigen is also expressed on monocytes, macrophages and the like.
  • Various vectors can be used for the secretory expression of antibodies by C0S7 cells (Whittle, N. and Adair, J. et al. (1987), Protein Eng., 1 (6), 499- 505 .; Sutter, KD and Feys, V. et al. (1992), Gene 113, 223-30.), Using human antibody-expressing plasmid (pGl), human-mouse chimeric anti-human A plasmid pG14H5 capable of expressing the human CD4 antibody and a plasmid pGlMylO capable of expressing the human CD34 antibody were prepared. This can be transfected into C0S7 cells to produce human anti-CD4 antibody.
  • the human chimeric mouse antibody refers to an antibody produced by a gene whose variable region is a mouse gene sequence derived from a hybridoma and whose constant region is composed of a human-derived gene sequence.
  • pGl is secreted into the body like a normal antibody by removing the transmembrane domain (TM) added to the sequence of the human C ⁇ 1 of pSE plasmid described in International Publication WO095 / 15393.
  • TM transmembrane domain
  • Reference Example 1 it is a plasmid that has a gene sequence encoding a human constant region and can express a human mouse chimeric antibody by connecting a mouse variable region gene.
  • chimeric antibody refers to an antibody obtained by artificially combining amino acid sequences of antibodies of different animal species.
  • an antibody containing a CDR derived from a mouse hybridoma and an amino acid sequence derived from a human antibody in the constant region is shown.
  • the framework can include an amino acid sequence derived from human.
  • human CD34 antigen as used in the present invention has been reported by Civin et al. (USP-4965204, and J. Immunology, 133, 157, 1984) and is expressed on undifferentiated cells of blood. It is known as an antigen marker for hematopoietic undifferentiated cells.
  • substantially the same function means that the epitope on the antigen molecule and the binding force to the antigen are substantially the same. It is known that even with amino acid substitutions in the framework of the variable region or in the constant region, they often produce antibodies with essentially the same performance. It has been shown by humanization of mouse antibodies that the antigen specificity of the antibody and the strength of the binding to the antigen are determined mainly by the amino acid sequence of the CDR (Gussow, D. and Seemann, G. , Methods in Enzymology, 203: 99-121 (1991); Glaser, SM et al., J. Immunology 149: 2607-2614 (1992)).
  • C0S7 cells using conventional 10% ⁇ Shi fetal serum (FBS) pressurized Dulbecco 's Modified Eagle's Med ium (DMEM medium) and cultured in 5% C0 2 present under 37 ° C.
  • FBS 10% ⁇ Shi fetal serum
  • DMEM medium Dulbecco 's Modified Eagle's Med ium
  • Methods for gene transfer into C0S7 cells and breeding and production of cells after gene transfer are described in Biomanual Series 4 Gene transfer and expression / analysis methods: Tatsuo Yokota, Kenichi Arai, Yodosha (1994), etc. Has been described.
  • Methods for gene transfer into C0S7 cells include the electroporation method and the DEAE dextran method (Bebbington, CR (1991); METHODS: A Companion to Methods in Enzymology, 2 (2), 136-45.). Is also good.
  • each clone was expressed as IgGl because the constant region gene integrated into pGl was C ⁇ 1.
  • the anti-CD4 antibody secreted into the culture supernatant in this manner can be easily purified by, for example, a general IgG antibody purification method using protein A or protein G.
  • CH0 cells and myeloma Sp 2/0 cells are well known (Xiang, J. et al. (1990) Mol. Immun., 27, 809; Bebbington, CR et al, ( 1992) Bio / technology, 10, 169; Larrick, JW and Wallace, EF et al. (1992) Imunol. Rev. 130, 69-85 .; Deyev, SM and Lieber, A. et al. (1994) Appl. Biochem Biotechnol. 47 (2-3), 143-54.).
  • a human mouse chimeric antibody When a human mouse chimeric antibody is used as a drug, the antigenicity in the human body is extremely reduced as compared to the mouse antibody, and the safety is further improved. Even when an ordinary antibody is converted into F (ab ') 2 by degrading it with a protease such as pepsin, a fragment using human Fc is more safe than a mouse. In addition, even when applied to medical devices, antibodies used as ligands may be decomposed by proteases and released in trace amounts. Can be said to be highly safe.
  • Single-chain antibodies are expected to have the effect of reducing antigenicity by reducing the molecular weight.
  • Antibodies prepared by treating the antibody with papain or other protease to form Fabs still contain the mouse constant region, whereas single-chain antibodies exclude those, and can have very low antigenicity.
  • a method for isolating a single-chain antibody from a hybridoma can be achieved by using a Recombinant Phage Antibody System kit (Pharmacia) or the like. If the antibody is toxic and kills E. coli or degrades the single-chain antibody, The kit cannot be used effectively, and much effort is required.
  • a single-chain antibody can be prepared by examining an inducible vector such as PSE380 plasmid (Invitrogen) or pET24d (+) plasmid (Novadin) and a host bacterial strain.
  • an inducible vector such as PSE380 plasmid (Invitrogen) or pET24d (+) plasmid (Novadin) and a host bacterial strain.
  • eukaryotic cell expression systems, insect cell expression systems, and yeast cell expression systems can be effectively used in addition to the above-described methods.
  • the linker that links the H and L chains used (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) x 15 repeats of 15 amino acids, but is not limited to this sequence and can be used can do.
  • CD4-positive cells can be separated. According to the present invention, it is possible to efficiently separate CD4-positive cells from a blood cell suspension in vitro or from blood by extracorporeal circulation, and a group of cells from which the separated cells or CD4-positive cells have been removed, It can be used for treatment of various diseases.
  • a cell mixture from which CD4 positive cells have been removed, a blood product, or a cell suspension containing CD4 positive cells as a main component; a CD4 positive cell product can be easily prepared. Removal of CD4 positive cells is expected to improve symptoms such as autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, and systemic lupus erythematosus.
  • the produced antibody molecule can be used as it is, but Fab, F (ab ') 2 -v, Fd, etc., which are fragments containing the antigen binding site obtained by various protease treatments, are also applied. be able to. These fragments are described in “Introduction to Antibody Science” (Chijinshokan).
  • Fab, F (ab ') 2 -v, Fd, etc. which are fragments containing the antigen binding site obtained by various protease treatments, are also applied. be able to. These fragments are described in “Introduction to Antibody Science” (Chijinshokan).
  • Fab, F (ab ') 2 -v, Fd, etc. which are fragments containing the antigen binding site obtained by various protease treatments, are also applied. be able to. These fragments are described in “Introduction to Antibody Science” (Chijinshokan).
  • a portion other than the variable region is converted into a human antibody
  • Monoclonal antibodies can be produced by the usual method of growing hybridomas in the abdominal cavity of mice and recovering the antibodies produced from ascites, or by obtaining them from the culture supernatant in a serum-free medium. Good. In the case of fragment peptides, they can be obtained by enzymatic treatment of antibody molecules Bacteria, yeasts, etc. can also be produced by genetic engineering techniques. By combining the monoclonal antibody, the antibody fragment derived from the monoclonal antibody, the peptide, and the like obtained by these methods, stronger binding is produced.
  • a method for separating cells a method for specifically separating only target cells using an antibody is being developed.
  • a fluorescent antibody-labeled cell separation method a method in which a ligand having an affinity for a target cell is immobilized on a water-insoluble carrier, and the target cell is directly or indirectly bound to the ligand, separation using an immunoadsorption column, and immunomagnetic beads. Separation methods.
  • the fluorescent antibody-labeled cell separation method involves first incubating the cell mixture with a fluorescently labeled monoclonal antibody that recognizes the membrane antigen expressed on the target cells, and then treating the treated cells with a cell sorter. This method separates cells to which fluorescent antibodies have been bound by applying the fact that only cells to which antibodies are bound emit fluorescence by irradiating a single laser beam.
  • International Patent Publication WO087-04628 describes a method of treating the cells with a cell separation device on which a ligand such as an anti-immunoglobulin antibody that binds to an antibody on the cell surface is immobilized.
  • Cell separation is a cell separation method in which the antigen-positive cells are directly or indirectly bound to a monoclonal antibody immobilized on a carrier or a device.
  • the antibody is separated on a plastic petri dish on which the antibody is immobilized.
  • the cell mixture is first poured on the plastic petri dish on which the antibody is immobilized, and the antibody and the membrane antigen on the target cell are bound. It is incubated to make it happen. After the incubation, wash the plastic dish to remove unbound cells and separate.
  • the immunosorbent ram method is a method in which a ligand such as an antibody against a membrane antigen on a target cell is immobilized on the surface of a bead, and this is filled in a column to perform cell separation.
  • target cells are labeled with magnetic beads by first incubating the cell mixture with magnetic beads to which antibodies are bound. After labeling, the labeled cells are separated from the unlabeled cells using a magnetic device.
  • a water-insoluble carrier can be used as one of the carriers for directly immobilizing two or more antibodies that recognize the same cell.
  • Fus in (CXCR-4) (Feng, Y et al., Science, 272), a CD4 molecule and other molecules expressed on CD4-positive cells, such as G protein-coupled receptors, acting as second receptors for HIV infection. (5263), 872-877, 1996), and CCR-5 (Deng, H et al., Nature, 381 (6584), 661-666, 1996), which also acts as a second receptor for HIV infection. Combinations are also possible. These molecules have low expression frequency and poor separation efficiency. However, by combining an antibody recognizing the CD4 molecule and an antibody recognizing these molecules at the same time, these expressing cells can be isolated.
  • a carrier on which two or more antibodies that recognize different antigen molecules on the same cell are directly immobilized can be used.
  • the CD34 molecule and other molecules expressed in undifferentiated cells such as the receptor for SCF c-kit (Yarden et al., EMBO J., 6, 3341 (1987)), the receptor FLK-2 (Mathews et al., Cell, 65, 1143, 1991), interleukin-13 receptor chain (Kitamura et al., Cell, 66, 1165, 1991), etc. is there.
  • SCF c-kit Yamabisulf-1 (Smith et al., EMBO J., 6, 3341 (1987)
  • the receptor FLK-2 Mothews et al., Cell, 65, 1143, 1991
  • interleukin-13 receptor chain Keramura et al., Cell, 66, 1165, 1991
  • these molecules Although the expression frequency is very low and the separation efficiency is low, these expressing cells can be isolated by combining the antibody with
  • binding biotin or magnetic beads to an antibody to be immobilized on cells in advance and then reacting with a substance that easily binds to the biotin or magnetic beads, such as a water-insoluble carrier that binds or contains avidin-magnetism.
  • a substance that easily binds to the biotin or magnetic beads such as a water-insoluble carrier that binds or contains avidin-magnetism.
  • the target hematopoietic undifferentiated cells are allowed to react with the CD34 antibody, and then reacted with the water-insoluble carrier to which the anti-immunoglobulin antibody is bound, and the water-insoluble carrier is washed or recovered to selectively produce the target cells. Only isolation can be achieved.
  • an antibody immobilized on a magnetic bead which is a water-insoluble carrier
  • the efficiency of separation can be increased by a magnet or the like.
  • the shape of the container used in the present invention include a column filled with a water-insoluble carrier, a flask, or a flask having a water-insoluble carrier filled with a water-insoluble carrier.
  • a separator for hematopoietic undifferentiated cells can be prepared by combining these container shapes with an insoluble carrier in which these antibodies are directly or indirectly immobilized.
  • these separators can be made highly utilizable as a cell separation system by combining with a pump for flowing a cell suspension, physiological saline, or the like.
  • Examples of the shape of the container used in the present invention include a column filled with a water-insoluble carrier, a flask or a flask-like case filled with a water-insoluble carrier.
  • a CD4-positive cell separator can be prepared by combining these container shapes with an insoluble carrier to which these antibodies are directly or indirectly immobilized.
  • these separators can be made highly utilizable as a cell separation system by combining with a pump for flowing a cell suspension or a physiological saline solution.
  • the antibody When the antibody is immobilized on a water-insoluble carrier, it is also useful to bond the antibody and the water-insoluble carrier via a spacer. Further, if necessary, the water-insoluble carrier and the compound may be bound via a molecule of any length (square). For details on spacers, see, for example, “Affinity Chromatography” (Kenichi Kasai et al. Tokyo Kagaku Dojin Press, 1991, pp. 105-108). Examples of the spacer include a polymethylene chain and a polyethylene glycol chain. The length of the spacer is preferably 500 A or less, more preferably 200 or less.
  • a method of binding a compound to a water-insoluble carrier through a spacer for example, when agarose is used as a water-insoluble carrier, hexamethylene diisocyanana used as a spacer and a hydroxyl group of agarose is used.
  • a method of reacting and bonding one of the isocyanate groups on one side and reacting and bonding the remaining isocyanate group with the amino group, hydroxyl group or carboxyl group of the antibody and the like can be mentioned.
  • the water-insoluble carrier in the present invention refers to a carrier in a solid state in an aqueous solution at normal temperature, and may have any shape.
  • the shape include a spherical shape, a cubic shape, a flat shape, a chip shape, a fibrous shape, a flat film shape, a sponge shape, and a hollow fiber shape.
  • spherical, granular, and fine particles are required because of the tightness of close packing, the relatively easy retention of antibodies on the surface, the relatively large effective area, and the flow of cell suspension.
  • a fiber shape is desirable.
  • the material of the water-insoluble carrier can be any inorganic or organic compound as long as it can retain the antibody on the surface.However, there is little eluate when it comes in contact with the cell suspension, and it is easier to control the shape. Therefore, an organic polymer compound is desirable.
  • examples of such polymers include polymers and copolymers of vinyl compounds such as polypropylene, polystyrene, polymethacrylate ester, polyacrylate ester, polyacrylic acid, and polyvinyl alcohol or derivatives thereof, and polyamides such as nylon 6 or 66. And the like.
  • Compounds, polyester compounds such as polyethylene terephthalate, and plant-derived polysaccharide compounds such as cellulose are exemplified. Further, by combining these with a magnet, it is also possible to facilitate the recovery of these water-insoluble carriers.
  • Modification of the water-insoluble carrier to impart hydrophilicity to the surface is also suitably used in the present invention.
  • hydrophilicity can be imparted to the surface of the water-insoluble carrier.
  • a synthetic functional group that imparts water a polyethylene glycol chain having a repeating unit of 2 to 1500, a hydroxyl group, an amide group, an ether group, and an ester group correspond thereto.
  • the polyethylene glycol chain and the hydroxyl group may be bonded or may be present separately.
  • Examples of monomers having a polyethylene glycol chain that imparts hydrophilicity include terminal methacrylate methacrylates such as methoxydiethylene glycol methacrylate and methoxytriethylene glycol methacrylate, methoxyethylene glycol acrylate, and methoxy. Terminal methacrylates such as triethylene glycol acrylate, and methacrylates and acrylates having terminal hydroxyl groups bonded to hydrogen instead of methyl groups, and one or more polymerizable functional groups at the terminals
  • Examples of monomers having other substituents that impart hydrophilicity include, but are not limited to, vinylpyrrolidone.
  • one or more polymerizable functional groups may be present.
  • the polymerizable functional group refers to a functional group that can be polymerized singly or by two or more functional groups.
  • a vinyl group, an acetylene group, a carbon multiple bond such as a gen group, an epoxy group, an oxen group And the like, but are not limited thereto.
  • a non-ionic functional group may be present together with the above functional group.
  • examples thereof include a dimethyl amide group, a getyl amide group, and a diisopropyl amide, each of which is a non-ionic functional group particularly for improving hydrophilicity.
  • Groups such as amide groups, polyethylene terephthalate chains, aromatic polyester chains such as polybutylene terephthalate chains, polyester chains such as aliphatic polyester chains, methylene glycol chains, polyether chains such as propylene glycol, and polycarbonate chains. It includes an ionizable hydrophilic functional group or a nonionic functional group such as an alkyl chain, an alkyl fluoride chain, and an aryl chain for imparting hydrophobicity.
  • any of the above functional groups may coexist, but it is preferable to have a nonionic hydrophilic functional group.
  • modifying the water-insoluble carrier to impart hydrophilicity to the surface such as covalent bonding, ion bonding, radiation or plasma grafting, physical adsorption, embedding, or precipitation insolubilization on the substrate surface.
  • a method can also be used. Therefore, surface modification is carried out by a known method such as graft polymerization of a polymer compound or its monomer using radiation or plasma, or covalent bond (JP-A 1-249063; -50 2094) is suitably used in the present invention.
  • the antibody can be immobilized on the surface of the water-insoluble carrier by covalently binding the antibody to the surface of the water-insoluble carrier by a chemical or radiation or electron beam grafting method, or by a chemical method.
  • a method of covalent bonding through a functional group on the surface is preferable because there is no danger of elution of the antibody during use.
  • the water-insoluble carrier has a coating layer, it can be insolubilized on the surface of the coating layer.
  • a method for obtaining an active group for immobilizing an antibody on the surface of a water-insoluble carrier or its coating layer a cyanogen halide method, an epichlorohydrin method, a bisepoxide method, a bromoacetyl bromide method, a halogenated acetoamide method Etc.
  • Specific examples include an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group, a thiol group, an acid anhydride, a succinylimido group, a substitutable halogen group, an aldehyde group, an epoxy group, and a tresyl group.
  • the Bromcian method, the N-hydrosuccinimide group method, and the halogenated acetoamide method are particularly desirable as the method for immobilizing antibodies.
  • haloacetaminomethylating agent used for the active group examples include N-hydroxymethylchloroacetamide, N-hydroxymethylfluoroacetamide, N-hydroxymethyl butylacetamide, N-hydroxymethyl chloride acetoamide, and the like. Is used well. Among them, N-hydroxymethyl bromoacetamide, N-hydroxymethyl chloroacetamide, and the like are preferably used in terms of economy and stability.
  • the fluoro group and chloro group introduced into the water-insoluble carrier can be easily treated with a solution of potassium iodide or bromo bromide after the introduction of the active group, so that the iodine group or Can be converted to a bromine group.
  • the acid catalyst used in the production of the water-insoluble carrier into which these active groups have been introduced may be any acid as long as it is a strong acid, in particular, protic acid.
  • a strong acid in particular, protic acid.
  • trifluoromethane, methane, benzene, toluene Sulfonic acid derivatives such as Sulfuric acid, sulfuric acid, zinc chloride, aluminum chloride, tin tetrachloride and the like are preferably used.
  • a toxin is conjugated to an antibody produced by the gene of the present invention, and administered to patients with rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus, etc., to obtain a CD4-positive lymphocyte clone having an autoreactive antigen receptor. Can be reduced.
  • modified antibodies can also be used in peripheral blood and peripheral blood leukocyte suspensions of patients collected by apheresis.
  • genes of variable regions derived from other antibodies it becomes possible to produce bispecific antibodies and multispecific antibodies.
  • the present invention further provides a pharmaceutical composition comprising the above-described monoclonal antibody of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the anti-CD4 antibody gene of the present invention thus obtained enables the efficient production of anti-CD4 antibodies, and provides various forms of therapeutic preparations.
  • the recombinant antibody thus produced can be used in a pharmaceutical composition together with a substance used to maintain the activity of the antibody upon administration to the human body, such as a carrier or a stabilizer having a pharmaceutically acceptable composition. May be included.
  • a pharmaceutically acceptable composition includes human serum albumin, gelatin and the like.
  • Pharmaceutically acceptable means that there are no undesirable side effects associated with administration, such as nausea, vertigo, nausea, etc., and no immune response to the formulation at the time of frequent administration.
  • a liquid pharmaceutical composition dissolved with a suitable pharmaceutically acceptable solvent, diluent or stabilizer may be used.
  • a pharmaceutical composition containing a sustained-release implant such as a microsphere or liposome for the purpose of adjusting the concentration in a living body may be used.
  • chimeric antibody and single-chain antibody are The appropriate amount is about g to lmg / kg body weight. When treating cells outside the body, about 0.1 to lmg / ml is appropriate.
  • multispecific refers to an antibody having at least two or more antigen-binding sites that recognize different antigens or epitopes.
  • bispecific refers to an antibody having two or more antigen binding sites that recognize different antigens or epitopes.
  • one antigen-binding site of a normal antibody that recognizes the CD4 antigen or CD34 antigen and the other antigen-binding site is bis-specific to the T lymphocyte antigen CD3, etc. Lymphocytes can be more strongly recognized by 4-positive T lymphocytes or CD34-positive leukemia cells, and the effect of removing leukemia cells can be induced.
  • pan-lymphocyte markers such as CD2, CD5, CD6, and CD7 can be used. If these are combined and expressed as IgM, bispecific and multispecific antibodies can be produced. In addition to producing a bispecific antibody during such production, a monoclonal antibody can be produced and purified, and then the antibodies can be combined to produce a bispecific or multispecific antibody.
  • anti-CD4 antibodies can combine not only different antigens, but also different peptides within the same molecule, eg different anti-CD4 antibodies.
  • Several anti-CD4 antibodies have been reported. For example, Leu_3a antibody, Leu-3b antibody (Becton Deckinson), 0KT4 antibody, 0KT4A antibody (Ortho), T4 antibody (Coulter), MT310 antibody (Dako), F101-69 antibody, 16P25 antibody (Biosys) ), Edu-2 Antibody, cafe M-115 Antibody (Simbas Biotechnology, Inc.), 7E14 Antibody (Exalfiako) (Polysion), BL4 antibody, 13B8.2 antibody (Imnotech), KT69-7 antibody (Labvision Corporation), B-F51 antibody (Progen Biotechnic), B-TH4 antibody (SunBio BV) ), 94B1 antibody, L197 antibody, L80 antibody, L93 antibody, L201 antibody, L34 antibody, L202 antibody, L200 antibody, L
  • anti-CD34 antibodies can combine not only different antigens, but also different epitopes within the same molecule, such as different anti-CD34 antibodies.
  • anti-CD34 antibodies have been reported. For example, anti-HPCA-2 antibody (Becton Dectonson), anti-HPCA-1 antibody (Becton Dectonson), 4A1 (Nichirei), B1.3C5 (Katz et al., Leuk. Res., 9 Vol.
  • a peptide consisting of only the H chain or only the L chain can be used.
  • Such antibody species can be selected depending on the intended use, and can be selected based on the binding strength, antigenicity, and the like.
  • amino acid sequence of the single-chain antibody is shown in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 in Sequence Listing. Examples of the nucleic acid sequence encoding the same are shown together with the amino acid sequence.
  • Amino acid sequence Nos. 1 to 22 of the sequence listing SEQ ID NO: 9 are sequences containing signals for secretion from E. coli. Rows, positions 23 to 133 are the variable region of the L chain, positions 134 to 148 are the linker, positions 149 to 266 are the variable region of the H chain, positions 267 to 305 are FLAG-tags (from position 270 Sequences containing 277), c-myc-tag (positions 281 to 290), and His X6-tag (positions 296 to 301) are shown.
  • Positions 1 to 22 include a signal for secretion from Escherichia coli, positions 23 to 140 are heavy chain variable regions, positions 141 to 155 are linkers, positions 156 to 266 Position is the variable region of the L chain, positions 267 to 305 are FLAG-tag (positions 270 to 277), c-myc-tag (positions 281 to 290), Hi sx 6-tag (positions 296 to 3 (Position 01).
  • amino acid sequence from position 1 to position 20 of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 it is also possible to delete the amino acid sequence from position 1 to position 20 of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 to express a single-chain antibody in E. coli cells.
  • the amino acid sequence from position 267 to position 305 in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 are sequences for detecting and purifying a single-chain antibody, and may be deleted or replaced with any sequence.
  • the preparation of a vector containing a secretion signal from E. coli and a sequence for detection and purification is shown as Reference Example 2.
  • the linkers at positions 134 to 148 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and positions 141 to 155 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 substantially change the three-dimensional structure of the variable region of the L chain and the H chain with the 4H5 antibody. Any sequence can be substituted as long as it can be maintained equivalently.
  • the Lys residue at position 305 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 in the Sequence Listing is effective in acting such as aligning the orientation of single-chain antibody molecules when immobilized on a water-insoluble carrier. Multiple Lys residues can be introduced to increase the immobilization efficiency. It is also effective to introduce a Cys residue. Such modifications as described above can be easily performed by genetic engineering techniques.
  • each clone is expressed as igGi.
  • the anti-CD34 antibody secreted into the culture supernatant in this way is It can be easily purified by the general purification method of IgG using mouth tin A and protein G.
  • CH0 cells and Mye-ichima Sp 2/0 cells are well known (Xiang, J. et al. (1990) Mol. Immun., 27, 809; Beb bington, CR et al.
  • the produced antibody molecule can be used as it is, but Fab, F (ab ') 2 , Fv or Fd, which is a fragment containing an antigen binding site obtained by various protease treatments, etc. Can also be applied. These fragments are described in “Introduction to Antibody Engineering” (Kanmitsu, p20-22, Jinjinshokan).
  • the present invention is applied to extracorporeal circulation of the blood in a human body, the portion other than the variable region is converted into a human antibody in consideration of the side effects when the antibody is released into the blood and antigenicity. It is also useful to use such a chimeric antibody.
  • Monoclonal antibodies are usually produced by growing hybridomas in the abdominal cavity of mice and collecting antibodies produced from ascites fluid, or by obtaining culture supernatants cultured in serum-free medium. Is fine.
  • fragment peptides they can be obtained by enzymatic treatment of antibody molecules and can be produced in bacteria, yeast, etc. by genetic engineering techniques. By combining the monoclonal antibody, the antibody fragment derived from the monoclonal antibody, the peptide, and the like obtained by these methods, stronger binding is generated.
  • the CD34 molecule was reported by Civin et al. (USP-4965204, and J.I. 133, 157, 1984), and are known as antigen markers for undifferentiated cells that are specifically expressed on blood undifferentiated cells. Attempts to isolate undifferentiated cells using this antigen marker have been reported (S. Saeland et al., Blood, 72, 1580, 1988, etc.). In addition, medical devices are being developed that combine anti-CD34 antibody with biotin, avidin, or magnetic beads to separate undifferentiated cells from differentiated cells and cancer cells (Dreger et al., ExpHematol. , 23, 147, 1995).
  • Hematopoietic undifferentiated cells isolated according to the present invention are cells that can be proliferated by a specific stimulus, and include a group of mature cells such as erythrocytes, monocytes, granulocytes, lymphocytes, and macrophages. Shows cells that can differentiate into more than one type.
  • erythrocytes erythrocytes
  • monocytes monocytes
  • granulocytes lymphocytes
  • macrophages Shows cells that can differentiate into more than one type.
  • it when cultured in a semi-solid medium in the presence of an appropriate growth factor, it includes undifferentiated blood cells that form colonies and hematopoietic stem cells that have the ability to differentiate into all lineages and have the ability to self-proliferate.
  • the cells are abundant in bone marrow and cord blood.
  • the cells are also contained in peripheral blood, but can also be induced in peripheral blood by administering a cytotoxic agent such as granulocyte colony forming factor (G-CSF).
  • G-CSF granulocyte colony forming factor
  • a cell suspension containing these hematopoietic undifferentiated cells can be a material for separating hematopoietic undifferentiated cells according to the present invention.
  • Hematopoietic undifferentiated cells can be separated by using the cell separation device of the present invention as a medical device. Hematopoietic undifferentiated cells can be efficiently separated from the blood cell suspension outside the body or from the blood by extracorporeal circulation, and the separated cells can be used for treatment of various diseases.
  • Isolating or enriching the necessary hematopoietic undifferentiated cells from a solution containing various cell types, such as blood, or removing unnecessary cells is an effective means to enhance medical effects.
  • Bone marrow transplantation is used to treat normal hematopoietic undifferentiated cells in cancer patients such as leukemia patients who have had myeloablation, and patients with innate immune diseases such as aplastic anemia. This is a method of transplantation and is becoming established as one of the effective treatments for these patients. More recently, hematopoietic undifferentiated cells are obtained not only from bone marrow but also from peripheral blood and cord blood.
  • Allogeneic bone marrow transplantation is a method of injecting bone marrow fluid collected from healthy individuals with almost the same leukocyte type, HLA type, into patients whose bone marrow has been destroyed by anticancer drugs or radiation. It causes GVHD (graft host disease). Therefore, isolation of hematopoietic undifferentiated cells to prevent autologous bone marrow transplantation, which is used in the treatment of hematopoietic malignancies and cancers in recent years, or to prevent transplant-versus-host disease (GVHD) caused by allogeneic bone marrow transplantation Demand is increasing.
  • GVHD transplant-versus-host disease
  • One feature of the present invention is that a recombinant antibody is used.
  • the antibody By using the recombinant antibody, the antibody can be modified into a screen antibody immobilized on an insoluble carrier.
  • the peptide By adding an amino acid sequence to the C-terminus or N-terminus of a peptide constituting an antibody, the peptide can be efficiently immobilized on a substrate such as an insoluble carrier.
  • a sequence containing a basic or acidic amino acid should be added as a sequence not present in the original antibody at the C-terminus or N-terminus of the H-chain or L-chain, or a combination thereof. It is. Even when the sequence is genetically modified to a basic or acidic amino acid in the middle of the Fc portion, the C-terminal side including the modified portion can be regarded as an added amino acid sequence. Not only human mouse chimeric antibodies but also binding of the Fc portion to an insoluble carrier and shrinking are suitable for preparing a separator and the like.
  • amino acid contained in the sequence to be added a sequence containing a basic amino acid or an acidic amino acid is desirable, but if it is intended to be immobilized on a substrate, it is included in the present invention, and lysine is used as a basic amino acid. , Hydroxylysine, arginine, histidine And the like.
  • acidic amino acid include aspartic acid and glutamic acid. In particular, it is more efficient to use lysine, glutamic acid, and aspartic acid.
  • the length of the sequence is not particularly limited, but it is also effective to add one amino acid such as lysine, aspartic acid or glumic acid. However, it is more effective to add a sequence containing a plurality of these amino acids.
  • an antibody with a small molecular weight such as a single-chain antibody
  • by adding a somewhat longer sequence steric hindrance when the antibody binds to the antigen after immobilization to the substrate is reduced, and it is used as a separator. The effect of is expected more.
  • FIG. 1 schematically shows the structure of IgG.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of plasmid pGl.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of the plasmid pSE380ScFv.
  • FIG. 4 is a schematic diagram of plasmid pET24ScFv.
  • FIG. 5 is a diagram showing the antigen-binding affinities of the 4H5 antibody and the MT310 antibody, and is shown by a correlation between the antibody concentration used and the quantitative value (ABS) by ELISA.
  • FIG. 6 shows the binding of the chimeric antibody to KGla cells.
  • the transmembrane region (TM) of the expression vector pSE International Publication W095 / 15393 for the expression of a membrane-bound human antibody was removed to prepare a vector capable of secreting and expressing the human antibody.
  • the expression vector pSE was digested with the restriction enzyme Sail, and the cut ends were blunt-ended. This reaction was performed using DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) according to the attached protocol. After digesting the expression vector pSE that has been treated as described above with the restriction enzyme Apal, electrophoresis is performed on a 0.7% agarose gel, and the Ca1 gene and transmembrane region
  • the pSE vector DNA from which the gene region containing (TM) was deleted was extracted and purified. This reaction was performed using GeneClean Kit (Bio101) according to the attached protocol.
  • the restriction enzyme cleaved end of the extracted pSE vector was treated with alkaline phosphatase (Takara Shuzo Co., Ltd.) to prevent self-cyclization.
  • plasmid DNA pUCCGl into which the full length of the human Ca1 gene had been incorporated was digested with the restriction enzyme Kpnl (Takara Shuzo), the cut ends were blunt-ended, and then digested with the restriction enzyme Apal. This reactant
  • Electrophoresis was performed on a 0.7% agarose gel, and a DNA fragment containing the full length of the C ⁇ 1 gene was extracted and purified. This DNA fragment was ligated to the previously treated pSE vector using Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo), and the ligation product was introduced into Escherichia coli DH5 strain. Several colonies were selected from the appearing colonies and cultured, and plasmid DNA was extracted and purified according to a conventional method. The cleavage pattern of these plasmids was examined using the appropriate restriction enzymes present in the pSE vector, and those that matched the expected pattern were selected. The plasmid obtained by the above operation was designated as pGl.
  • Figure 2 shows a diagram of pGl plasmid.
  • Vectors that produce single-chain antibodies must be prepared with a plasmid containing a secretory signal from E. coli and a sequence encoding the tag for purification and detection before introducing the anti-CD4 antibody gene. went.
  • the secretion signal (Pel B protein signal sequence) from Escherichia coli was obtained according to SEQ ID NO: 21 (5 'TCATGAAATACCTGCTGC CGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCGGCCCAG 3 ′) and SEQ ID NO: 22 (5 ′ TGCGGCCGCAGC CATGGTGTTTGCGGCCATCGCCGGCTGGGCCGCGAGGAGCAGCA 3 ′) were mixed in equal amounts, 94 ° C for 5 minutes, heat denaturation at 65 ° C for 5 minutes, and 72 minutes at 72 ° C.
  • An extension reaction was performed with polymerase using GeneAmp PCR Reagent Kit AmpliTaq DNA Polymerase (Takara Shuzo). This fragment was cloned using TA cloning kit (Invitrogen). As a result, cDNA encoding the secretory signal from E. coli was
  • the sequence encoding the tag for purification and detection can be obtained by using SEQ ID NO: 23 (5 'TGCGGC CGCAGACTACAAGGATGACGATGACAAAGGCTCGAGCGAGCAGAAGCTGA 3') and SEQ ID NO: 24 (5 GGTGGGTCGACCTCGAGCCCAGATCCTCTTCGCTGATCAGCTTCTGCTCGCTCGAGC 3, 94, etc. After heat denaturation, the mixture was annealed at 60 ° C for 5 minutes, and extended at 72 ° C for 10 minutes using GeneAmp PCR Reagent Kit Ampli Taq DNA Polymerase (Takara Shuzo) using a polymerase.
  • a PCR reaction was further performed using the following primers, and the amplified fragment was cloned using TA clone kit (Invitrogen). As a result, cDNA encoding the tag for purification and detection was obtained.
  • the primers used were SEQ ID NO: 25 (5 TGCGGCCGCAGACTACAAGGATG 3,) in the Sequence Listing and SEQ ID NO: 26 (5 TAAGCTTATCATTTGGTC GA CCCGTGGTGATGATGATGGTGGGTCGACCTCGAGCC 3 ′).
  • the PCR was performed using GeneAm P PCR Reagent Kit AmpliTaq DNA Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) for 18 cycles at 94 ° C for 1 minute, 62 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute.
  • a DNA Thermal Cycler 480 PerkinElmer
  • the cDNA encoding the secreted signal from E. coli was digested with the restriction enzymes BspHI (New England Biolabs) and Not I (Takara Shuzo), and the cDNA encoding the tag for purification and detection was cloned.
  • pET24d (+) plasmid (Novagen)
  • the restriction enzyme Not! site in the multicloning site was previously removed from the restriction enzyme Bpull02i site.
  • the pET24d (+) plasmid was eliminated using the restriction enzyme Notl (Takara Shuzo) and the restriction enzyme Bpull02I (Takara Shuzo), and then using lenow fragment (New England Biolabs) and dNTP mixture (Takara Shuzo). The ends were blunt-ended according to the attached protocol.
  • This plasmid DNA fragment was electrophoresed on a 1% agarose gel, cut out and extracted. This was self-cyclized to obtain pET24d (+) plasmid from which the restriction enzyme site had been removed.
  • the Leige One Ver. 2 kit (Takara Shuzo) was used. Extraction of fragment A from agarose gel was performed using GeneCleanll Kit (Bio 101).
  • PSE380 plasmid (Invitrogen) or pET24d (+) plasmid from which the above restriction enzyme sites have been removed are digested with restriction enzymes Ncol (Takara Shuzo) and Hindi 11 (Takara Shuzo), and electrophoresed on 0.8% agarose gel. Electrophoresis was performed to extract and purify the vector DNA fragment.
  • the cMA encoding the secretion signal from E. coli digested with the restriction enzyme and the cDNA encoding the tag for purification and detection were ligated to this vector fragment.
  • a ligature Ver. 2 kit (Takara Shuzo) was used. Extraction of DNA fragments from agarose gel was performed using GeneCleanll Kit (Bio 101).
  • the plasmid vectors for ScFv antibody production prepared by the above procedure were designated as pSE380ScFv and pET24ScFv.
  • Figures 3 and 4 show schematic diagrams of each.
  • human soluble CD4 was produced and purified. 15 ml of peripheral blood was collected from a healthy subject, made up to 30 ml with Hanks balanced saline (Gibco), and gently layered in 13 ml tubes into two centrifuge tubes into which 10 ml of Ficoll pack (Pharmacia) was dispensed. 800 rpm / 20 minutes The cells were separated and the cells in the mononuclear cell layer were collected. The collected cells were washed with Hanks' solution. From 1 ⁇ 10 7 cells, mRNA was isolated using QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia) according to the attached instructions.
  • an Is strand cDNA was synthesized. This was performed using the cDNA Synthesis Kit (Pharmacia) according to the attached instructions. Then, by PCR, amplify from the start codon of the target gene to just before the transmembrane region (TM), add a Hindi II site at the 5 'end, a FLAG-tag sequence at the 3' end, and a stop codon. The Notl site was added.
  • the primers used are SEQ ID NO: 11 (5 'AAGCTTATGAACCGGGGAGTCCCTTTTA 3') and SEQ ID NO: 12 (5 'GCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCTGGCTGCACCGGGGTGG ACCA 3').
  • the PCR was performed using GeneAmp PCR Reagent Kit with AmliTaq DNA Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) for 30 cycles of 94 ° C for 1 minute, 57 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 2 minutes.
  • a DNA Thermal Cycler 480 Perkin Elmer
  • the amplified gene fragment was cloned using a TA cloning kit (Invitrogen).
  • the nucleotide sequence was determined by DNA Sequencer Ver. 1, 2.0,
  • the obtained human soluble CD4 expression plasmid was subjected to the DEAE dextran method (Beb_bington, CR (1991); METHODS: A Compa- nion to Methods in Enzymology, 2 (2), 136-45.). Each was introduced into C0S7 cells. Four days prior to gene integration, approximately 6.1 x 10 5 per day before gene integration in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 10% fetal serum (FBS) The cells were replated so as to be Cel ls / 10ml and cultured.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • FBS fetal serum
  • Example 2 Three days after the start of production, the culture supernatant was collected, and production was continued for about two weeks thereafter.
  • the obtained culture supernatant was collected and purified by anti-FLAG-M2 gel (Eastman Chemical Co., Ltd.) column chromatography to obtain a purified human soluble CD4 sample. (Example 2)
  • Anti-human CD4 antibody-producing hybridoma 4H5 (Accession No. FERM BP-6729) was cultured in DMEM medium (GIBC0) supplemented with 10% FBS (ICN). Hypridoma is cloned in advance by the limiting dilution method, and then the culture supernatant is immobilized with human soluble CD4 (Lipligen). I chose a clone. From 1 ⁇ 10 7 cells, mRNA was isolated using QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia) according to the attached instructions. Using the obtained mRNA as type III, 1st strand cDNA was synthesized. This was performed using the cDNA Synthesis Kit (Pharmacia) according to the attached instructions. Then, the target gene was amplified by PCR using the cDNA obtained above as a template.
  • the primer uses the Mouse Ig-Prime Kit (Novadin) and has the sequences of SEQ ID NO: 13 (5 'GGGAATTCATGRAATGSASCTGGGTYWTYCTCTT 3') and SEQ ID NO: 14 (5 'CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACNGRTGG 3,)
  • the gene was amplified from the primer.
  • the PCR conditions were 30 cycles using the GeneAmp PCR Reagent Kit with AmpliTaq DNA Polymerase (Takara Shuzo) at 94 ° C for 1 minute, 50 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 2 minutes.
  • the PCR device used was a DNA Thermal Cycler 480 (Packin Elma).
  • the amplified gene fragment was cloned using a TA cloning kit (Invitrogen).
  • the N-terminal amino acid sequence of the L chain peptide was determined in advance by a protein sequencer (492 Protein Sequencer, Applied Biosystems) according to the attached protocol.
  • the sense primer synthesized a plurality of base sequences that could be encoded based on the N-terminal amino acid sequence.
  • the antisense primer is based on the sequence of a mouse antibody gene cDNA that can be synthesized by referring to the mouse antibody variable region gene sequence published in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, 1991 (USA NIH). Multiple were synthesized. A PCR method combining these sense primers and antisense primers was performed.
  • the L chain variable region gene (partial length) was amplified from the primer having the sequence of No. 15 (5′TGTGCCCTCGAGCTNACNCARAGYCCNGC 3,) and SEQ ID No. 16 (5 ′ ATGGATACTA GTGGTGCAGCATCAGCCC 3 ′).
  • the PCR was performed using GeneAmp PCR Reagent Kit with AmliTaq DNA Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) for 30 cycles at 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 2 minutes.
  • a DNA Thermal Cycler 480 Perkin-Elmer
  • the amplified gene fragment was cloned using a TA cloning kit (Invitrogen).
  • variable region (partial length) base sequence of the H chain and L chain of these obtained genes was determined.
  • the nucleotide sequence was determined using the DNA Sequencer Ver. 1.2.0, Model373A (Applied Biosystems) according to the manufacturer's protocol.
  • the labeling reaction was performed using PRISM Ready Reaction on Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystemssc) with Universal M13 Reverse primer (Invitrogen) or Universal M13 Forward primer (Invitrogen) as the primer. I followed the protocol. For staining, a labeling kit from ABI was used.
  • the target gene was amplified again by the PCR method in order to acquire the unacquired region at the N-terminal.
  • the primer was prepared using the mouse Ig-Prime Kit (Novagen) and the base sequence complementary to the obtained light chain “CDR-3” cDNA.
  • SEQ ID NO: 17 (5 'GGGAATTCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT 3') and SEQ ID NO:
  • the gene was amplified from a primer having a sequence of 18 (5 'CGTCGGAGGATCCTCACTACT 3').
  • the PCR was performed using GeneAmp PCR Reagent Kit with AmpliTaq DNA Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) for 30 cycles of 94 ° C for 1 minute, 50 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 2 minutes.
  • a DNA Thermal Cycler 480 Perkin Elmer was used as a PCR device.
  • the amplified gene fragment was cloned using a TA cloning kit, and the nucleotide sequence of the variable region (N-terminal) of the L chain was determined in the same manner.
  • variable region (partial length) of the L chain cloned on pCR2.1 plasmid (attached to TA cloning kit) L-chain variable region (N-terminal) and L-chain variable region (partial length) recombination using restriction enzyme site and Hindlll site, L-chain variable region (full length) gene
  • Restriction enzyme ⁇ was from New England Biolabs
  • restriction enzyme Hindi 11 was from Takara Shuzo.
  • Extraction and purification after agarose gel electrophoresis were performed using Gene Cleanll Kit (Bio101) according to the attached protocol.
  • Lüge Kit Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) was used to ligate these two DNAs.
  • the 4H5 antibody H chain variable region (full length) gene sequence and amino acid sequence determined by the above procedure are shown in SEQ ID NO: 37, and the L chain variable region (full length) gene sequence is also shown in the amino acid sequence together with amino acid sequence. Number 38.
  • the gene fragment containing the variable region nucleotide sequence of the H chain (amino acids 4 to 118) and the L chain (amino acids 4 to 111) of the anti-human CD4 antibody (4H5 antibody) obtained in Example 2 was converted to pGl
  • a plasmid capable of expressing the anti-CD4 human mouse chimeric antibody by incorporating the plasmid into the plasmid was prepared.
  • the PCR was carried out using GeneAmp PCR Reagent Kit with AmpliTaq DNA Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) for 30 cycles at 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 2 minutes.
  • a DNA Thermal Cycler 480 Perkin Elmer was used as a PCR device.
  • the amplified fragment was cloned using a TA cloning kit (Invitrogen).
  • the DNA fragment containing the H chain (amino acids 4 to 118) variable region base sequence is digested with restriction enzymes Apal (Takara Shuzo) and BamHI (Takara Shuzo), developed on a 2% agarose gel, and cut out. Extracted. Extraction of DNA fragments from agarose electrophoresis gel was performed using GeneCleanll Kit (Bio 101) according to the attached protocol. Next, the vector pGl was digested with the restriction enzymes Apal and BamHI, and ligated with a 0.7% agarose gel electrophoresis gel similarly cut out and extracted. Ligation reaction was performed using E. coli JM.
  • Ligation Kit ver. 2 (Takara Shuzo) was used for this ligation reaction.
  • the transformed Escherichia coli was inoculated on an LB plate containing ampicillin and cultured overnight. Several colonies were selected from the colonies that appeared, and plasmid DNA was extracted and purified according to a conventional method. These were digested with Apal and BamHU restriction enzymes used for integration, and those into which a fragment containing the H chain variable region nucleotide sequence was inserted were selected.
  • the DNA fragment containing the base sequence of the L chain variable region was extracted and extracted on a 1% agarose electrophoresis gel. Extraction of DNA fragments from agarose gel was performed using GeneCleanl Kit (Bio101) according to the attached protocol.
  • the vector -pGl into which the DNA fragment containing the H chain variable region nucleotide sequence was inserted was digested with the restriction enzymes Xhol and Spel, and then ligated to a 0.7% agarose gel similarly extracted and extracted.
  • the ligation reaction was introduced into E. coli strain JM109. Ligation Kit ver. 2 (Takara Shuzo) was used for this ligation reaction.
  • the transformed Escherichia coli was inoculated on an LB plate containing ampicillin and cultured overnight. Several colonies were selected from the colonies that appeared, and plasmid DNA was extracted and purified according to a conventional method. These were digested with the restriction enzymes Xhol and Apal used for integration, and those into which a fragment containing the H chain and L chain variable region nucleotide sequences were inserted were selected.
  • the plasmid expressing the secretory antibody obtained by the above method was designated as pG14H5.
  • the secretory antibody-expressing plasmid PG14H5 obtained in Example 3 was purified by the DEAE dextran method (Beb-bington, CR (1991); ETHODS: A Compa- tion to Methods in Enzyme). mology, 2 (2), 136-45.).
  • C0S7 cells 10% ⁇ Shi fetal serum (FBS) pressurized Dulbecco 's Modified Eagle's Medium (DMEM), so as to be about 6.1X10 5 Cells / lOml per Di Mesh with a diameter of 100 noodles to 4 days before the inclusive genetically only They were replated and cultured.
  • FBS Shi fetal serum
  • DMEM Dulbecco 's Modified Eagle's Medium
  • chimeric 4H5 antibody a human mouse chimeric anti-CD4 antibody
  • the amine-coupling method was carried out by sending 4 solutions of this human soluble CD (250 // g / ml, 20 ⁇ 1) to different lanes of the sensor-chip CM5 (Falmana) at 5 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ l / niin. To fix human soluble CD4 I got a chip.
  • the 4H5 antibody or chimeric 4H5 antibody (prepared in Example 4) was buffer-replaced with HBSbuffeK Pharmacia using Superdex 200 gel filtration column (Pharmacia) and SMARTsystem (Pharmacia). Using a BIA-core2000 (Pharmacia), this 4H5 antibody solution or chimeric 4H5 antibody solution (50 zg / nd, 201) was analyzed on one chip of the human soluble CD4 immobilized sensor prepared earlier. As a sample, liquid was sent to each lane at 5 zl / min to obtain a sensorgram at the time of binding.
  • CH0 cells and myeloma Sp2 / 0 cells are well known (Xiang, J. et al. (1990) Mol. Izun., 27, 809; Bebbington, CR et al. al. (199 2) Bio / technology, 10, 169; Larrick, JW and Wallace, EF et al. (199 2) imunol. Rev. 130, 69-85 .; Deyev, SM and Lieber, A. et al. (1994) App 1. Biochem. Biotec nol.
  • Real here 10 ⁇ g of pG14H5 plasmid prepared in Example 3 and pSV2dhfr plasmid (ATCC N 0.337146) 1 / were mixed and cooled with ice for 5 minutes. 3 F, give 0.55kV electric pulse,
  • F12 medium (GIBC0 companies) to transferred to medium 10ml supplemented with 10% FBS, and cultured overnight at 37 ° C, 5% C0 2 under the for 100mm tissue culture di sh (FALCON Corp.).
  • the cells were detached from the dish using a trypsin-EDTA solution (GIBC0), transferred to DMEM medium (GIBC0) supplemented with 10% dialyzed FBS (GIBC0) medium 120 nil, and then transferred to a 150 mm tissue culture dish.
  • the seeds were sowed on four sheets.
  • the medium was replaced with the same medium every 2 to 3 days. In about two weeks, colonies of cells are formed to the extent that they can be observed with the naked eye.
  • the concentration of chimeric 4H5 antibody in the culture supernatant of the clones that finally acquired the ⁇ MTX drug resistance was determined using the human immunogl obul in G (IgG) subclass E IA kit (The Binding si te Co., Ltd.) and selected a stable, high-producing strain of chimeric 4H5 antibody.
  • IgG human immunogl obul in G
  • a stable expression strain producing chimeric 4H5 antibody at a ratio of S ⁇ g / lO ⁇ cels / s was prepared.
  • PCR was performed using the primers containing the restriction enzyme sequence and the linker sequence with the genes described in Example 2, SEQ ID NO: 37 and SEQ ID NO: 38, obtained in Example 2. Amplified by method.
  • the primers for the L chain are as follows: SEQ ID NO: 27 (5 'AGCCGGCCATGGCCGACATTGTGCTGACCCAATCTCCA 3') and SEQ ID NO: 28 (5 'CTCCGGAGC CCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTCC 3') As a primer, SEQ ID NO: 29 (5 ′ CTCCGGAGGTGGCGGATCGCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCT 3,) and SEQ ID NO: 30 (5′TGCGGCCGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTC 3,) were used.
  • the PCR was performed using GeneAmp PCR Reagent Kit with AmliTaq DNA Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) for 18 cycles at 94 ° C for 45 seconds, 58 ° C for 45 seconds, and 72 ° C for 1 minute.
  • a DNA Thermal Cycler 480 Perkin Elmer was used as a PCR device.
  • Each of the amplified fragments was cloned using a TA cloning kit (Invitrogen).
  • the L chain is digested with the restriction enzymes Nael (Takara Shuzo) and Mrol (Toyobo), and the H chain is digested with the restriction enzymes Mrol (Toyobo) and Notl (Takara Shuzo), followed by 2% agarose gel. Each DNA fragment was cut out and extracted by electrophoresis. Extraction of DNA fragments from agarose gel was performed using Gene Cleanll Kit (Bio 101).
  • Transformed Escherichia coli cells derived from the pSE380ScFv vector are plated on LB plates containing ampicillin, or those derived from the pET24ScFv vector are plated on LB plates containing kanamycin and cultured, and several colonies are selected from the appearing colonies.
  • Plasmid DNA was extracted and purified according to a conventional method. The cleavage patterns of these plasmids were examined using appropriate restriction enzymes, and those that matched the expected patterns were selected.
  • Plasmids expressing the 4H5ScFv (N-terminal VL-linker-VHC C-terminal type: hereinafter referred to as LH type) antibody having the sequence of the anti-CD4 antibody obtained by the above operation were designated as pSE380ScFv4H5LH or pET24ScFv4H5LH, respectively.
  • SEQ ID NO: 9 the nucleic acid base sequence encoding the amino acid sequence of the single-chain antibody (ScFv4H5LH) This is shown together with one example.
  • the primers containing the restriction enzyme sequence and the linker sequence were used by combining the genes shown in SEQ ID NO: 37 and SEQ ID NO: 38 obtained in Example 2 with a primer. Amplified by PCR.
  • the primers for the H chain are as follows: SEQ ID NO: 31 (5'AGCCGGCCATGGCCCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCT 3 ') and SEQ ID NO: 32 (5, CT CCGGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTC 3,) ,), And SEQ ID NO: 34 (5 'TGCGGCCGCTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTCC 3,) were used.
  • the PCR conditions were 18 cycles using GeneAmp PCR Reagent KitAminTliAq DNA Polymerase (Takara Shuzo) with 94 ° C for 45 seconds, 58 ° C for 45 seconds, and 72 ° C for 1 minute as one cycle.
  • the PCR device used was DNA Thermal Cycler 480 (PerkinElmer).
  • Each of the amplified fragments was cloned using TA cloning kit (Invitrogen).
  • the H chain is digested with the restriction enzymes Nael (Takara Shuzo) and ro l (Toyobo), and the L chain is digested with the restriction enzymes Mrol (Toyobo) and Notl (Takara Shuzo).
  • Each DNA fragment was cut out and extracted by electrophoresis on an agarose gel. Extraction of DNA fragments from agarose gel was performed using GeneCleanl Kit (Bio101).
  • coli derived from pSE380ScFv vector is derived from ampicillin-containing LB plate or pET24ScFv vector These were seeded on a kanamycin-containing LB plate and cultured, and several colonies were selected from the appeared colonies, and plasmid DNA was extracted and purified according to a conventional method. The cleavage patterns of these plasmids were examined using appropriate restriction enzymes, and those that matched the expected patterns were selected.
  • Plasmids expressing the 4H5ScFv (N-terminal VH-1 inker-VLC-terminal type: hereinafter referred to as HL type) antibody having the sequence of the anti-CD4 antibody obtained by the above operation were designated as pSE380ScFv4H5HL or pET24ScFv4H5HL, respectively.
  • SEQ ID NO: 10 the amino acid sequence of the single-chain antibody (ScFv4H5HL) is shown together with one example of the nucleic acid base sequence encoding it.
  • Escherichia coli DH5 strain transformed with pSE380ScFv4H5LH plasmid of Example 7 was supplemented with lOO ⁇ g / ml ampicillin and 1% glycerol in 2X YT medium (1.6% Bacto tryptone, 1% Bactoist extract, (0.5% NaCl). The next day, add a portion of this to the 10-fold volume of the above medium, incubate for 1 hour, remove the supernatant, replace with an equivalent volume of 2X YT medium supplemented with ImM IPTG, 100 g / ml ampicillin and 1% glycerol.
  • the obtained crude antibody fraction was purified by column chromatography using anti-FLAG-M2 gel (Yeastman Chemical Co.) and further purified by TALON metal affinity gel (Clontech). Each column chromatography was performed according to the protocol attached to the gel. This was used as a purified sample of anti-human CD4 single-chain antibody (ScFv4H5LH).
  • the PBS (-) solution (5.2 zg / ml) of human soluble CD4 prepared in Example 1 was dispensed into a 96-well polystyrene plate at 50 1 each, and the solution was incubated at 4 ° C- ⁇ . The original was immobilized. After removing the supernatant, the cells were washed with PBS (-) (PBS-T) 250III supplemented with 0.05% Tween20. Blocking was performed by dispensing 100 l of Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) into individual gels and allowing to stand at room temperature for 1 hour. After removing the supernatant of each gel, it was washed twice with PBS-T250 ⁇ 1.
  • an anti-human CD4 single-chain antibody (ScFv4H5LH) prepared above was dispensed in a PBS (-) solution (10 g / ml, 50 l) and allowed to stand at room temperature for 2 hours. . After removing the supernatant, the cells were washed three times with PBS-T 250 / il. After removing the supernatant, 50 ⁇ 1 of horseradish peroxidase-dose-labeled anti-myc antibody (Invitrogen) diluted 1000-fold with PBS-T is dispensed into individual gels, and allowed to stand at room temperature for 2 hours. Was placed.
  • N-hydroxymethyl chloride acetoamide which is an active group for immobilizing antibodies that can be introduced into a water-insoluble carrier.
  • sulfuric acid, 7.2 ml of nitrobenzene and 0.0363 g of paraformaldehyde were added to a glass flask, and after dissolution with stirring, 0.58 g of N-hydroxymethyl chloride acetoamide was added and stirred.
  • a nonwoven fabric made of polypropylene (average fiber diameter: 3.3 zm) was added thereto and reacted at room temperature overnight. After the reaction, the nonwoven fabric was taken out, washed with pure water, and dried under vacuum to obtain a nonwoven fabric into which an active group for immobilizing antibodies was introduced.
  • This nonwoven fabric was cut into circles with a diameter of 0.7 cm, and four of each were dissolved in PBS (-) and prepared in an anti-human CD4 antibody (4H5 antibody) solution (17.7 g / 400 zl) or Example 9.
  • the anti-human CD4 single-chain antibody (ScFv4H5LH) solution (17.7 zg / 4001) was immersed at room temperature for 2.5 hours to immobilize the antibody.
  • Example 1 cells in the mononuclear cell layer were collected from blood of healthy humans by density gradient centrifugation using Ficoll Pack (Pharmacia). The collected cells were washed with PBS (-) and adjusted to 1.2 ⁇ 10 6 cells / ml. 4 ml of this mononuclear cell suspension was fed using a syringe pump at a flow rate of lm 1 / min, and then flowed from the inlet of the column prepared above. The treated liquid was recovered from the column outlet. At this time, the ratio of CD4-positive cells was measured by a known flow cytometry method (FACS). The staining of the cells during the FACS analysis was measured using a FITC-labeled anti-CD4 antibody (Pharmingin) and a FACSCalibur (Beckton 'Dickinson).
  • FACS flow cytometry method
  • Table 1 shows the ratio of CD4-positive cells to other cells (CD4-negative cells) before and after passing through the column.
  • the removal rate of CD4 positive cells after passing through the 4H5 antibody-immobilized column was 100%, and the removal rate of CD4 positive cells after passing through the ScFv4H5LH-immobilized column was 99.9%.
  • the blood was layered on Ficoll Hypak, centrifuged, the mononuclear leukocyte layer was collected, and the fraction enriched for CD4 lymphocytes was obtained by immunoprecipitating and removing CD8-positive cells with anti-CD8 antibody. Obtained. Further, the cell fraction was stimulated with PHA lectin (WiLab Laboratories) to prepare immunization cells. After washing the cells with DMEM medium (Gibco), the cells are mixed with an adjuvant, Tita-Max (CytRx), and about 2 X 107 cells per mouse are injected into Balb / c mice (Charles River Japan) peritoneal cavity. It was administered within and immunized. Booster immunizations were performed every two weeks after the initial immunization. Three months after the initial immunization, cells prepared in the same manner were boosted intravenously.
  • PHA lectin WiLab Laboratories
  • the NS1 cell line (ATCC TIB-18), which is a myeloma cell line derived from a BALB / c mouse, was subcultured in a DMEM medium (Gibco) supplemented with 20% FCS.
  • the spleen obtained from the immunized mouse was loosened, filtered through a mesh while washing with a DMEM medium, and centrifuged to separate spleen cells.
  • the spleen cells were mixed with the grown NS1 cell line, followed by centrifugation. The mixed cells were suspended so that the final concentration of polyethylene glycol (Boehringer Mannheim) was 30%.
  • the cells were separated by centrifugation, and the mouse spleen cells were used as a feeder and gradually dispersed in a DMEM tissue culture medium (Gibco) containing 20% fetal bovine serum. Then add 106 per well to a flat-bottomed 96-well microtiter plate (Nunc). Cells were seeded at a cell count of 1/100 1 and cultured at 37 ° C. in 5% carbon dioxide.
  • HAT medium (16.1 ⁇ g / ml hypoxanthine, 3.88 / zg / ml thymidine and 0.18 ⁇ M aminopterin to the growth medium described above).
  • HAT medium 16.1 ⁇ g / ml hypoxanthine, 3.88 / zg / ml thymidine and 0.18 ⁇ M aminopterin.
  • Hybridoma (fused cell) clones were cultured and maintained in HT medium (HAT medium without aminopterin).
  • hybridomas described above were subcloned by the limiting dilution method. The number of cells of these hybridomas was counted by trypan blue exclusion and a hemocytometer. Then, these hybridomas were suspended at a ratio of 0.5 viable cells per 100 l of HT medium, and dispensed at a ratio of 100 ⁇ per well of a 96-well flat bottom microplate. The medium was changed every two to three days to grow hybridomas.
  • the culture supernatant of the obtained hybridoma was reacted with human leukocytes, and an antibody recognizing CD4-positive cells of human leukocytes was detected by FACScan (Becton Dickinson). By this operation, we succeeded in obtaining 4H5 cells with excellent specificity and binding from the obtained antibody group.
  • the 4H5 antibody was produced and purified.
  • Anti-human CD4 antibody-producing hybridoma 4H5 (Accession No. FERM BP-6729) was cultured in DMEM medium (GIBC0) supplemented with 10% fetal calf serum (FBSXICN).
  • the hybridomas were cloned in advance by the limiting dilution method, and the culture supernatant was used to bind human soluble CD4 by ELISA using human soluble CD4 (Lipridin). High clones were selected.
  • the 4H5 hybridoma clone was transplanted into the abdominal cavity of Balb / c mice, proliferated, and the ascites obtained was purified by affinity mouth chromatography using ProteinA Sepharose (Falmana). An antibody purified sample was obtained. (Example 13)
  • the PBS (-) solution of human soluble CD4 (5.2 2/1111) prepared in Example 1 was dispensed 50/1 each into a polystyrene 96-well plate (NUNC) and allowed to stand at 4 ° C. Thus, the antigen was immobilized. After removing the supernatant, the wells were washed with 250 l of 0.05% Tween20-added PBS (-) (hereinafter PBS-T). Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) 100 1 was dispensed into individual pellets, and left at room temperature for 1 hour to perform blocking. After removing the supernatant of each well, the wells were washed twice with PBS-T250 // 1.
  • FIG. 5 shows the relationship between the antibody concentration (4H5 antibody or MT310 antibody) used and the absorbance.
  • the 4H5 antibody was able to detect 4 CD molecules at a lower concentration than the MT310 antibody, revealing that it was an antibody with higher affinity for 4 human CDD molecules.
  • the antibody solution (100 ⁇ g / ml, 70 ⁇ l) was immobilized by the amine coupling method by sending it to different lanes of the sensor chip CM5 (Pharmacia) at 5 zl / min.
  • a human CD4 antibody-immobilized sensor chip was obtained (the human soluble CD4 prepared in Example 1 was then purified using a Superdex 200 gel filtration column).
  • a stable anti-CD4 antibody containing formulation was produced.
  • Example 17 A stable human mouse chimeric anti-CD4 antibody-containing preparation was produced.
  • a stable single-chain anti-CD4 antibody-containing formulation was produced.
  • hybridoma Anti-My-10 (ATCC HB-8483) was cultured in RPMI-1640 medium (Gibco) supplemented with 10% fetal calf serum (Flow). Preliminarily, clones of the hybridoma were separated by the ultradilution method, and the culture supernatant was measured to select a clone having high binding to human acute myeloid leukemia cell KG-la.
  • mRNA was isolated from the separated RNA using the QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia). Using the obtained mRNA as type III, 1st strand cDNA was synthesized. This was performed using the cDNA Synthesis Kit (Pharmacia) according to the attached instructions. Then, the target gene was amplified by the PCR method.
  • primers refer to the gene sequence of the mouse antibody variable region published in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, 1991 (published by USA NIH) for the sequence detection that mouse antibody gene cDNA can synthesize. Then, PCR was performed by combining the primers.
  • Nucleic acid sequences (5 'GTCCCAGGATCCTCTGAAGCAGTC AGGCCC3') and (5'0800 060 (( ⁇ 01 ⁇ 0171700 ( ⁇ 1 ⁇ 200 03 ')) for obtaining the H chain, (5' TGTGCCCTCGAGGTGACTCAAACTCCACTCTC3 ') and ( The gene was amplified from the primer having the sequence of 5 'ATGGATACTAGTGGTGCAGCATCAGC CC3'). Was cloned using TAdoning kit (Invitrogen). The variable region base sequences of the H chain and L chain of these obtained genes were determined. The nucleotide sequence was determined using DNA Sequencer Ver. 1.2.0, Model373A (Applied Biosystems) according to the manufacturer's protocol.
  • the labeling reaction use the PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (C Applied Biosystems) as the primer for the H chain as a primer and the nucleic acid sequence (5 'CTCTTGGAGGAGGGTGCCAG3') as the primer for the nucleic acid sequence (5, CCAGATTTCAACTGCTCATCAGA3 ').
  • a labeling kit from ABI was used for c- staining according to the protocol.
  • the gene fragment obtained from the H chain primer was shown in SEQ ID NO: 39 in the Sequence Listing
  • the gene fragment obtained from the primer in the L chain was shown in SEQ ID NO: 40 in the Sequence Listing.
  • the gene fragment containing the H chain L chain variable region nucleotide sequence of the anti-CD34 antibody obtained in Example 18 was incorporated into pGl plasmid to prepare a plasmid capable of expressing the anti-CD34 antibody.
  • a plasmid capable of expressing the anti-CD34 antibody After digesting the L chain of the plasmid DNA of the clone with restriction enzymes Xhol (Takara Shuzo) and SpeK Takara Shuzo), expand it on a 0.7% agarose electrophoresis gel and cut out a DNA fragment containing the base sequence of the L chain variable region. Extracted. Extraction of DNA fragments from agarose gel was performed using GeneCleanll Kit (Funakoshi) according to the attached protocol.
  • pGl of the vector was digested with restriction enzymes Xhol and Spel, and ligated to a similarly extracted and extracted with 0.7% agarose gel.
  • a DNA fragment containing the H chain variable region base sequence of the plasmid DNA of the clone was cut out and extracted with restriction enzymes Apa K (Takara Shuzo) and BamHI (Takara Shuzo). Extraction of DNA fragments from agarose electrophoresis gels was performed using GeneCleanll K (Funakoshi) according to the attached protocol.
  • the vector pG1 into which the DNA fragment containing the H chain variable region nucleotide sequence was inserted as described above was digested with the restriction enzymes Apal and BamHI, and then ligated to a vector similarly extracted and extracted from a 0.7% agarose electrophoresis gel. Then, the ligated product was introduced into E. coli JM109 strain. The ligation kit is used for this ligation reaction. ver.2 (Takara Shuzo) was used. The transformed Escherichia coli was sown on an LB plate containing ampicillin and cultured overnight. Several colonies were selected from the colonies that appeared, and plasmid DNA was extracted and purified according to a conventional method.
  • the secretory antibody expression plasmid obtained by the above method was designated as pGlMylO.
  • the secretory antibody-expressing plasmid pGlMylO obtained in Example 19 was purified by the DEAE dextran method (Beb-bington, R. (1991); METHODS: ACompa-nion to Methods in Enzymology, 2 (2), 136). -45.) was introduced into C0S7 cells. Four days prior to gene integration, C0S7 cells were replated with Dulbecco's Modified Eagle's Medium CDMEM (supplemented with 10% fetal serum (FCS)) at a rate of approximately 6.lxlO 5 cells / 10 ml per 100 thigh diameter dish 4 days before gene integration, and cultured. did.
  • CDMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • Binding of the purified sample to the CD34 antigen was confirmed by the following method. 1. Prepare 6 lxlO of cultured cells KGla in a 5 ml tube and wash twice with cell suspension (PBS (-) with 2% FCS). The cell suspension was added to the washed cells and suspended. To this was added 1 g of the purified sample, and the mixture was allowed to stand on ice for 30 minutes. Thereafter, the cells are further washed three times with the cell suspension, and then 500 cells of the cell suspension are added and suspended. To this, 1 g of FITC-labeled goat anti-human IgG (Fc) antibody (1/20 dilution Immunotec) was added, and the mixture was allowed to stand on ice for 30 minutes.
  • Fc FITC-labeled goat anti-human IgG
  • FIG. 6 shows the binding of the purified sample to the CD34 antigen.
  • the purified preparation derived from the anti-CD34 antibody pGlMYlO was confirmed to retain the binding activity to the CD34 antigen, and the human and mouse chimeric anti-CD34 antibodies must have the binding activity to the CD34 antigen. Has been demonstrated. In addition, it was confirmed that CD34-positive cells could be detected with this purified sample.
  • the gene obtained in Example 19 was amplified by PCR using primers containing a restriction enzyme sequence.
  • the nucleic acid sequence of the H chain primer is (5, GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGAAGCAGTCAG 3 ') and (5' AGACGGTGACCGTGGTGCCTTGGCCCC3 '). ) It was used.
  • PCR conditions were as follows: GeneAmp PCR Reagent Kit AmpliTaq DNA Polymerase (Takara Shuzo), 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, 72 ° C for 2 minutes. For 30 cycles.
  • the PCR device used was a DNA Thermal Cycler 480 (PerkinElmer).
  • the H chain is digested with the restriction enzymes SfiK Toyobo and BstP (Takara Shuzo), and the L chain is digested with the restriction enzymes SacK Takara Shuzo and Notl (Takara Shuzo). Then, each DNA fragment was cut out and extracted. Extraction of the DNA fragment from the agarose gel was performed using Gene Cleanll Kit (Funakoshi).
  • a plasmid for producing any antibody gene was prepared in advance. Using the Recombinant Phage Antibody System Kit (Pharmacia), an arbitrary antibody-producing hybridoma gene was incorporated. The vector was prepared according to the instructions attached to this kit.
  • the plasmid containing the desired antibody gene is digested with restriction enzymes Sacl (Takara Shuzo) and Notl (Takara Shuzo), and then electrophoresed on 0.8% agarose gel to extract and purify the vector DNA fragment lacking the L chain region. did.
  • This DNA fragment was ligated to the L chain gene of the previously prepared anti-CD34 antibody to incorporate the L chain gene.
  • the plasmid in which the L chain was replaced was digested with the restriction enzymes Sfil (Toyobo) and BstPK Takara Shuzo, and then electrophoresed on a 0.8% agarose gel to remove the vector DNA fragment lacking the H chain region. It was extracted and purified.
  • This DNA fragment was ligated to the H chain gene of the previously prepared anti-CD34 antibody to incorporate the H chain gene.
  • the LIGIGATION VER2 kit (Takara Shuzo) was used. Extraction of DNA fragments from agarose gel was performed using GeneCleanll Kit (Funakoshi).
  • the plasmid obtained by the above operation was introduced into Escherichia coli HB215 (Pharmacia).
  • the transformed Escherichia coli was seeded on a 2xYT plate containing 2% Glucose containing ampicillin and cultured overnight. Several colonies were selected from the colonies that appeared, and plasmid DNA was extracted and purified according to a conventional method.
  • the cleavage patterns of these plasmids were examined using appropriate restriction enzymes, and those that matched the expected patterns were selected.
  • Anti-CD obtained by the above operation
  • the plasmid expressing the ScFv antibody having the sequence of the 34 antibody was designated as pCANMYlO.
  • the Escherichia coli transformed with the above plasmid was cultured in an SB medium (3.5% pakt-tryptone, 2% bacteriose toxin, 0.5% NaCl) supplemented with 2% Glucose and 100 zg / ml ampicillin. The next day, add a portion of this to the 10 times volume of the above medium, incubate for 1 hour, centrifuge, remove the supernatant, and replace with an equal volume of lmM IPTG and SB medium supplemented with 100 ig / ml ampicillin. After further culturing for 3 hours, the cells were treated according to the protocol of the RPAS Purification Module (Pharmacia) to collect the antibody in the periplasm. The obtained antibody crude fraction was purified with an Etag antibody column (Pharmacia). Purification by this column was carried out using the attached reagent according to the attached protocol. By the above operation, a purified ScFv antibody was obtained.
  • SB medium 3.5% pakt
  • the proteins in the gel were transferred to a PVDF membrane (BioRad).
  • the transfer was performed at 100 V for 1 hour using a 25 mM Tris 192 mM glycine buffer and an Electrophoresis power Supply-EPS 600 device (Pharmacia).
  • the filters were blocked with 10% skim milk in PBS (-) for 1 hour at room temperature. This filter was washed with PBS (-) containing 0.05% Tween-20, and reacted with 15 ⁇ g / ml single-chain antibody for 1 hour.
  • an anti-E-tag antibody (Pharmacia was reacted at 5 ⁇ 3 / ⁇ 1 for 1 hour. Further, after washing, a peroxidase-labeled anti-mouse Fc antibody was reacted as a tertiary antibody at 5 ⁇ g / ml for 1 hour. After washing the filter, the band of the electrophoresis bound to the primary antibody was emitted with an ECL solution (Amersham) and detected with a high-sensitivity film (Hyperfil_ECL: Amersham). As a result, a band of CD34 molecule was detected at a position of about 120 K dalton as in the positive control.
  • a filter using an anti-HPCA-1 antibody (Becton Dickinson) as a primary antibody and a peroxidase-labeled anti-mouse Fc antibody as a secondary antibody was similarly colored.
  • the same treatment was performed except that only the single-chain antibody as the primary antibody was used as a negative control.
  • the 120K dalton band could not be detected. Therefore, it was confirmed that the anti-CD34 single-chain antibody detected the CD34 molecule.
  • the remaining cells were reacted with anti-HPCA-2 antibody (Becton) on ice for 30 minutes, washed with cold saline containing 2% fetal calf serum, and collected by centrifugation. The cells were measured for CD34 positivity using a Coulter flow cytometer.
  • C The D34 positive rate was defined as the purity of the CD34 cells, and the number of cells obtained by multiplying the CD34 positive rate by the number of recovered cells was defined as the number of recovered CD34 positive cells.
  • the recovery rate of CD34-positive cells was calculated from the number of positive cells before separation and the number of collected positive cells. As a result, CD34-positive cells had a purity of 80.4% and a recovery rate of 45.3%. This indicated that the human mouse chimeric antibody produced in Example 20 separated CD34-positive cells.
  • An antibody column to which the human mouse chimeric antibody produced in Example 20 was bound was prepared using CNBr-activated Sepharose4B (Pharmacia). The method for binding the antibody to the Sepharose4B beads was in accordance with the attached instruction manual. A human chimera antibody solution was reacted with 4.0 ml of the gel to prepare an affinity gel with an efficiency of 99.5%. A glass column (2 cm 2 ⁇ 3 cm) in which a small amount of glass wool was fixed in the lower portion of the column was siliconized, and a gel column for cell separation was prepared by packing this column with 1 ml of the previously prepared gel.
  • the ml cell suspension containing 2.1 ⁇ 10 7 cells was placed in the antibody column, and reacted at 4 ° C. for 1 hour with gentle stirring.
  • the column was washed by flowing Hanks balanced saline containing 10% fetal calf serum, 100 units / ml of benicillin, and 100 ⁇ g / ml of streptomycin.
  • To this column add 2 ml of MEM medium (Gibco) containing 10% fetal calf serum, 100 units / ml of benicillin, and 100 ⁇ g / inl of streptomycin for 13 hours at 37 ° C in a carbon dioxide gas incubator. Cultured.
  • the gel was agitated slightly more and the medium was recovered from the column.
  • 5 ml of 10% fetal bovine serum, 100 nit / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomy Hank's balanced saline containing Shin was flushed, and the liquid was also collected.
  • the cells in these collected liquids were collected by centrifugation. The number of these cells was counted.
  • the remaining cells were reacted with anti-HPCA-2 antibody (Becton) on ice for 30 minutes, washed with cold saline containing 2% fetal calf, and collected by centrifugation.
  • the cells were measured for CD34 positive rate using a Coulter flow cytometer.
  • the CD34 positive rate was defined as the purity of the CD34 cells, and the number of cells obtained by multiplying the CD34 positive rate and the number of recovered cells was defined as the number of recovered CD34 positive cells. As a result, a purity of 45.2% and a recovery rate of 62.6% were obtained. From this, it was confirmed that a device for separating and separating hematopoietic undifferentiated cells consisting of a column device packed with gel was effective.
  • the remaining cells were reacted with anti-HPCA-2 antibody (Becton) on ice for 30 minutes, washed with cold saline containing 2% fetal calf serum, and collected by centrifugation. The cells were measured for CD34 positivity using a Coulter flow cytometer.
  • the CD34 positive rate is defined as the purity of the CD34 cells.
  • the number of multiplied cells was defined as the number of collected CD34-positive cells. As a result, the purity was 36.1% and the recovery rate was 35.3%. This indicated that the single-chain antibody produced in the production of Example 21 separated CD34-positive cells.
  • An antibody column to which the single-chain antibody produced in Example 21 was bound was prepared using CNBr-activated Sepha rose4B (Pharmacia). The method of binding the antibody to Sepharose4B beads was in accordance with the attached instruction manual. The single-chain antibody solution was reacted with 4.0 ml of the gel to prepare an affinity gel with a coupling efficiency of 99.0%.
  • the CD34 positive rate was defined as the purity of CD34 cells, and the number of cells obtained by multiplying the CD34 positive rate by the number of recovered cells was defined as the number of recovered CD34 cells. As a result, a result with a purity of 52.8% and a recovery rate of 41.0% was obtained. From this, it was confirmed that a device for separating and separating hematopoietic undifferentiated cells consisting of a column device packed with gel was effective.
  • the pCANMYlO vector prepared in Example 21 was modified to prepare an antibody capable of improving the binding to a water-insoluble carrier. Following the E-tag sequence at the carboxyl terminus of the single-chain antibody, three amino acid lysine residues were introduced. Using a restriction enzyme site of the pCANMY10 vector, a sequence containing a lysine residue was introduced by the PCR method. The sequence is shown in Sequence Listing 4.
  • This vector was introduced into E. coli HB2151 cells, and a single-chain antibody was prepared in the same manner as in Example 21.
  • the obtained antibody was prepared using a CNB r-activated Separose 4B (Pharmacia) with an antibody column to which a single-chain antibody was bound.
  • the method of binding the antibody to Sepharose4B beads was in accordance with the attached instruction manual.
  • the single-chain antibody solution was reacted with 4.0 ml of the gel to prepare an affinity gel.
  • the CD34 positive rate was defined as the purity of the CD34 cells, and the number of cells obtained by multiplying the CD34 positive rate by the number of recovered cells was defined as the number of recovered CD34 positive cells.
  • a result having a purity of 71.0% and a recovery rate of 52.0% was obtained.
  • the present invention relates to the fields of collecting T lymphocytes having an autoreactive antigen receptor for the treatment of autoimmune diseases and the like, removing lymphocytes from cells for bone marrow transplantation, and the like. It is effective in fields such as collecting hematopoietic undifferentiated cells for medical purposes and removing lymphocytes from cells for bone marrow transplantation. References to deposited microorganisms

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Description

明 細 書
細胞の分離装置及び分離方法
技術分野
本発明は、 新規な組換え抗体を用いた細胞分離装置及びそれを利用した細胞分 離あるいは細胞検出方法に関する。 より具体的例示としてヒ ト C D (Clus ter di_ f ferent iat i on) 4抗原または C D 34抗原に対する新規な組換え抗体を用いたヒ ト CD 4または C D 34陽性細胞の分離方法、 検出方法及びこれらの細胞の分離装置に 関する。
さらに本発明は、 抗原の定量、 検出、 医薬品及び医療機器への応用に有用な、 ヒ ト C D 4抗原に対して特に高い親和性と特異性をもつ抗体あるいはこの抗体を 含む医薬組成物に関する。
背景技術
ヒ ト血液細胞の表面抗原に対する抗体を用いることで血液細胞群の中から特定 の細胞だけ分離、 除去、 回収、 検出することができる。 例えば C D 4陽性細胞の 除去は、 自己免疫疾患患者の病状を改善し、 C D 3 4陽性細胞の回収は、 移植に も利用できる造血前駆細胞を濃縮しうる。
ヒ ト C D 4は分子量 55kDの糖タンパク質で、 モノマーとして細胞膜上に存在し、 主として T細胞に発現されている。 C D 4を発現している T細胞 （末梢 T細胞の 約 65%) はヘルパー T細胞としての性質をもち、 クラス I IMHC 分子によって提示 された抗原を認識する。 また、 〇0 4は11 (human immunodef i ci ency vi rus ： エイズウイルス） と結合し、 感染の際に受容体として働く ことも知られている。 免疫系においてへルバ一 T細胞は抗原に対して適切に応答するのに不可欠であり、 B細胞のほとんどの抗体応答に必須のものである。 ヘルパー T細胞は主として抗 原提示細胞の表面に結合した非自己抗原を認識した場合活性化され、 インター口 ィキン 2を分泌して T細胞の増殖を刺激してこれが B細胞の活性化を補助してお り、 さらには抗体の産生を促している。 またリ ンパ球を補助するだけでなく アイ ンタ一フヱロンを分泌することによりマクロファ一ジを活性化するヘルパー T細 胞も存在する。
健常人では自己障害を防ぐために、 自己反応性抗原受容体を持ったリンパ球ク ローンの除去 （clonal delet ion), それらの無反応性化 （clonal anergy). その 働きの抑制 （suppression)といった様々な機構を用意している （免疫寛容） 。 自 己免疫疾患の発生に関するメカニズムはまだ十分には解明されていないが、 この ような免疫寛容機構の異常が自己免疫疾患の原因となると考えられている。 自己 反応性抗原受容体を持ったリンパ球クローンは C D 4を発現しているヘルパー T 細胞だけではないが、 ヘルパー T細胞の自己免疫疾患における重要性は認識され ている。
ある自己免疫疾患の治療方法としては、 その症状の程度に応じて副腎皮質ホル モン剤の投与， 脾臓の摘出， 免疫抑制剤の投与などが適用される。 しかしこうし た薬物療法ゃ摘脾手術を行なっても、 効果的に回復しない症例も多く存在してい る。 こうした患者に対する治療方法についても絶対的なものは確立されていない のが現状であり対策が急がれている。
自己免疫疾患の他の治療方法として、 免疫吸着カラムを用いた血液の体外循環 による自己抗体の吸着除去も種々試みられている。 たとえば免疫グロプリンと結 合性を有するプロティン Aを担体に固定化したカラムの適用も検討されている。 しかしプロテイン Aは高価であり、 吸着特異性の点でもあまり優れず、 さらには 副作用の生じた症例も報告されており、 こう した医療用機材に利用するには種々 の問題点が残されている。
近年においては、 液性因子の血液からの除去のみならず、 血液細胞分離技術が 報告されている。 しかし、 用いるリガンドによっては抗原との結合性が弱い、 抗 原との反応特異性が低いなどの問題により、 十分な細胞除去を期待できない、 あ るいは目的以外の細胞が非特異的に吸着されるといつた問題がある。
特開平 3- 32680号公報に Tリンパ球に親和性を有するぺプチドまたは脂質を固 定化した分離材が、 また、 特開平 6-154316号公報、 特開平 6-154317号公報、 特開 平 6- 218051号公報、 特開平 6-269663号公報には C D 4陽性細胞に親和性を有する ぺプチドを不織布に固定化した C D 4陽性細胞捕集材がそれぞれ開示されている 力^ いずれもリガンドに用いているペプチドの抗原に対する親和性、 特異性に問 題があり、 十分な細胞吸着能力を期待できない。 特に後者は抗 C D 4抗体の抗原 結合部位の形成に密接に関係している、 相補性決定領域 「CDR」 とその間に介在 する枠組領域 「フレームワーク」 の一部分のペプチドを用いており、 一部分だけ では効果的な抗原結合は望めない。 CDR には、 H鎖と L鎖のそれぞれについて、 N末端側から 「CDR- 1」 「CDR- 2」 「CD- 3」 と呼ばれる 3つの領域が存在すること が知られており、 少なくとも H鎖あるいは L鎖の 「CDR-1」 「CDR- 2」 「CDR-3」 の立体配置が抗体と実質的に同様に保たれていることが効果的な抗原結合を望む 上で必須である。
従来ヒ ト C D 34は、 造血未分化細胞の細胞表面抗原として報告され、 そのヒ ト C D 34分子を認識する抗体の産生細胞として扰 M Y 10抗体産生ハイプリ ドーマが 知られてきた（USP 4965204、 及び J. Immuno l ogy誌、 133 巻、 157 頁、 1984年） 。 その後、 抗ヒ ト C D 34抗体は多数報告され、 また、 骨髄移植などの医療分野にお いて造血未分化細胞の分離などへの応用が図られている。 こうした医療に向けた 応用を有効に活用するため抗ヒ ト C D 34抗体を効率よく生産し、 それを利用した 医療機器開発の必要が生じてきている。
C D 34分子は、 血液の未分化細胞上に発現する未分化細胞の抗原マーカ一とし て知られ、 未分化細胞の分離への応用が報告されてきている（S. Sae l andら、 B l oo d 誌、 72巻、 1580頁、 1988年など） 。 さらに、 抗 C D 34抗体と、 ピオチンやアビ ジン、 または磁気ビーズとの組み合わせなどを利用し、 未分化細胞を分化した細 胞群および癌細胞から分離する医療機器の開発が行われつつある （Dregerら、 Ex pHemato l . 誌、 23卷、 147 頁、 1995年) 。
抗体は、 一般に抗原との結合性が強く、 かつ特異性が高いことが知られ、 医療 への利用が期待されている。 しかし、 医療機器作成に際し、 抗体の製造に掛かる 費用が問題となっている。 抗体を効率よく生産し、 医療機器への応用を行うこと が必要である。 そのため、 抗体を効率よく生産する方法として、 組換え抗体を作 成する技術を確立し、 それを医療機器へ応用することが期待される。
発明の開示
本発明はこれらの抗体が持つヒ ト C D 4抗原に対しての高い親和性と特異性を 保持したまま、 遺伝子工学的手法によりヒ トマウスキメラ抗体化、 1本鎖抗体化 などの改変を行い、 抗原性の低下、 並びに抗体生産量の向上、 生産費用の低減を 可能とした組換え抗体を提供することにある。
生体内に存在する通常の抗体は、 抗原特異的な可変領域塩基配列及び定常領域 遺伝子の 2つが必要である。 定常領域遺伝子には少数のクラスが知られるが、 H 鎖 L鎖の可変領域塩基配列は極めて多様性が高く、 目的とする可変領域塩基配列 の取得は非常に労力を要する。 しかしながら、 本発明者らは、 遺伝子増幅 （P C R) 、 抗原を用いた酵素免疫測定法 （EIA)やフローサイ トメ一ターによる結合実 験を駆使することにより、 ハイプリ ドーマ中の複数の抗体遺伝子の中から目的で あるヒ ト C D 4抗体およびヒ ト C D 34抗原に対する遺伝子を取得するに至り、 次 の通りその配列と機能を決定した。 さらに、 その遺伝子を組み換えてヒ トマウス キメラ抗体、 1本鎖抗体を大量に生産することを可能にした。
これらの組み換え抗体を利用することにより、 従来マウスの腹水や細胞培養に より得ていた抗体が、 細菌等により生産できるようになり、 低価格での医療機器 の供給の可能性を生み出した。
モノクローナル抗体の作製は、 通常目的の抗原を免疫した動物より Bリンパ球 を分離し、 ミエローマ細胞と融合することによりハイプリ ドーマを作製すること に始まる。 次に目的の抗原を用いたスクリーニングを行い、 抗体産生ハイプリ ド —マを取得する。 この際に抗原との結合性が強く、 かつ特異性が高い抗体を産生 するハイプリ ドーマを取得するためには数多くの細胞をスク リーニングしなけれ ばならず多大な労力を要する。
本発明者らが鋭意検討した結果、 抗 CD 4抗体生産ハイプリ ドーマ 4 H 5から とりだした H鎖可変領域の CDR- 1、 CDR-2 および CDR- 3がそれぞれ配列表配列番 号 1、 2および 3に記載のアミノ酸配列であり、 L鎖可変領域の CDR-1、 CDR-2 および CDR- 3がそれぞれ配列表配列番号 4、 5および 6に記載のァミノ酸配列で ある抗体がヒ ト CD 4抗原に対して特に高い親和性と特異性をもつ抗体であるこ とを見出した。
1例を例示すれば、 抗ヒ ト CD 4抗体として知られる 0KT4A抗体のヒ ト C D 4 抗原に対する結合親和性は、 KA= 4 XIO —1と報告されており（Virginia L. Pul ito ら、 The Journal of Immunology, 156 ： 2840-2850 (1996))、 故に解離定数
( D： この値が低いほど結合親和性は高い） は、 KD= 2.5X101 (1/KA =KDよ り） 。 一方、 本明細書中の実施例に記載の通り、 4H5抗体のヒ ト CD 4抗原に対 する解離定数は、 KD==8. ΟδΧΐΟ-^Μ (実施例 5) である。 これは 0ΚΤ4Α抗体より
4Η5抗体の方がヒ ト C D 4抗原に対してより強く結合しうることを示している。
4Η5抗体を産生するハイブリ ドーマ、 Mouse- Mouse hybridoma 4H5は、 日本国 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、 受託番号： FERM BP- 6729とし て寄託されている。
生体内に存在する通常の抗体は、 抗原特異的な可変領域塩基配列及び定常領域 遺伝子の 2つが必要である。 定常領域遺伝子には少数のクラスが知られるが、 H 鎖 L鎖の可変領域塩基配列は極めて多様性が高く、 目的とする可変領域塩基配列 の取得は非常に労力を要する。 しかしながら、 遺伝子増幅 （PCR)や抗原を用いた 酵素免疫測定法 （EIA)による結合実験を駆使することにより、 ハイプリ ドーマ中 の複数の抗体遺伝子の中から目的であるヒ ト CD 4抗原に対する抗体遺伝子を取 得するに至り、 その遺伝子を組み換えてヒ トマウスキメラ抗体、 1本鎖抗体を大 量に生産することを可能にした。
通常の抗体は大小 2種類のポリぺプチドからなり、 その大きい方のサブュニッ トを 「H鎖」 といい、 小さい方のサブュニッ トを 「L鎖」 という。 また、 それぞ れのペプチドは N末端側に存在して抗原結合部位を形成する 「可変領域」 （また は 「V領域」 ） と、 抗体のクラス別に一定の 「定常領域」 （または 「Fc」 ) から なっている。 可変領域は、 更に、 特に抗原結合部位の形成に密接に関係している 相補性決定領域 「CDR 」 とその間に介在する枠組領域 「フレームワーク」 に分け られる。 CDR には、 H鎖と L鎖のそれぞれについて、 N末端側から 「CDR- 1」 「C DR- 2」 「CDR-3」 と呼ばれる 3つの領域が存在することが知られている。 第 1図 に I gG の構造模式図を示す。
抗体の可変領域を構成するアミノ酸数は、 抗体により異なることが多い。 4H5 抗体の H鎖の可変部位のアミノ酸配列は、 配列表配列番号 35に示した。 配列表配 列番号 35のアミノ酸 1位から 30位はフレームワーク 1、 31位から 35位は CDR- 1 、 36位から 49位はフレームワーク 2、 50位から 66位は CDR- 2 、 67位から 98位はフレ ームワーク 3、 99位から 107位は CDR- 3、 108 位から 118位はフレームワーク 4 を示す。 4H5抗体の L鎖の可変部位のアミノ酸配列は、 配列表配列番号 36に示し た。 配列表配列番号 36のアミノ酸 1位から 23位はフレームワーク 1、 24位から 38 位は CDR- 1、 39位から 53位はフレームワーク 2、 54位から 60位は CDR- 2 、 61位か ら 92位はフレームワーク 3、 93位から 101位は CDR- 3、 102 位から 111位はフレ —ムワーク 4を示す。 これらのフレームワークと CDR の境は、 Sequences o f Pro te i ns of Immuno l og i cal Interes t, 5 th ed i t i on, 1991 (USA N IH 発行） に掲載 されたマウス抗体可変領域の遺伝子配列を参考にして決定した。
配列表配列番号 7には、 配列表配列番号 35のァミノ酸 9位から 118位に相当す る核酸塩基配列を示した。 配列表配列番号 8 には、 配列表配列番号 36のアミノ酸 9位から 111位に相当する核酸塩基配列を示した。
抗 C D 34抗原に結合する抗体である抗 M Y 10抗体の H鎖の可変部位の遺伝子配 列およびそれがコ一ドするアミノ酸配列を、 配列表配列番号 39に示す。 配列表配 列番号 39のアミノ酸 1位から 30位はフレームワーク 1、 31位から 35位は CDR- 1 、 36位から 49位はフレームワーク 2、 50位から 65位は CDR- 2、 66位から 97位はフレ ームワーク 3、 98位から 106 位は CDR- 3、 107 位から 117 位はフレームワーク 4 を示す。
また、 M Y 10抗体の L鎖の可変部位の遺伝子配列およびそれがコードするアミ ノ酸配列を、 配列表配列番号 40に示す。 配列表配列番号 40のアミノ酸 1位から 23 位はフレームワーク 1、 24位から 39位は CDR- 1、 40位から 54位はフレームワーク 2、 55位から 61位は CDR- 2、 62位から 93位はフレームワーク 3、 94位から 102 位 は CDR-3 、 103 位から 113 位はフレームワーク 4を示す。
1本鎖抗体の遺伝子配列およびそれがコ一ドするアミノ酸配列を、 配列表配列 番号 41に示す。 配列表配列番号 41のァミノ酸配列 1位から 39位は大腸菌から分泌 用シグナルを含む配列、 40位から 156 位は H鎖の可変領域、 157 位から 171 位は リン力一、 172 位から 284 位は L鎖の可変領域、 285 位から 302 位までは E- tag を含む配列を示す。
PCANTAB5E プラスミ ド （フアルマシア社） は、 リンカ一として H鎖 L鎖の一部 を含む配列つまり 140 位から 169 位が用意されており、 本発明ではその配列を利 用し 7こ。
H鎖及び L鎖と結合するリ ンカ一は、 本発明におけるプラスミ ドに含まれるが、 このような配列に限定されずに利用することができる。 ハイプリ ドーマから 1本 鎖抗体を単離する方法は、 Recomb i nan t Phage An t i body Sys tem キッ ト （フアル マシア社） などを利用することが可能な場合もあるが、 本発明のようにスクリー ニングに必要なヒ ト C D 34抗原が無い場合、 キッ トを有効に使用できず多くのェ 夫を要する。
本発明は、 次の細胞分離装置及びこれを使用する細胞の分離方法、 あるいは検 出方法に関する。
(1) C D 4分子に結合するキメラ抗体、 1本鎖抗体、 またはそれらを組み合わ せた抗体を用いた C D 4陽性細胞分離装 g。 (2) H鎖可変領域の CDR- 1が Asp Tyr Val lie Asn (配列表配列番号 1 ) 、 C DR- 2が Glu He Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Glu Met Phe Lys G ly (配列表配列番号 2) 、 CDR- 3が Arg Gly Thr Gly Thr Gly Phe Ala Tyr (配 列表配列番号 3) で表されるアミノ酸配列であり、 L鎖可変領域の CDR-1が Lys
Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn (配列表配列番号 4) 、 CDR-2 が Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser (配列表配列番号 5 ) 、 CDR-3 が
Gin Gin Ser Ser Glu Asp Pro Pro Thr (配列表配列番号 6 ) で表されるアミノ 酸配列であり、 F c領域がヒト型であるキメラ抗体を用いた CD 4陽性細胞分離
(3) H鎖可変領域の CDR- 1が Asp Tyr Val lie Asn (配列表配列番号 1 ) 、 C DR - 2が Glu lie Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Glu Met Phe Lys G ly (配列表配列番号 2) 、 CDR- 3が Arg Gly Thr Gly Thr Gly Phe Ala Tyr (配 列表配列番号 3) で表されるアミノ酸配列であり、 L鎖可変領域の CDR-1が Lys
Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn (配列表配列番号 4 ) 、 CDR- が Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser (配列表配列番号 5) 、 CDR-3 が Gin Gin Ser Ser Glu Asp Pro Pro Thr (配列表配列番号 6 ) で表されるァミノ 酸配列である 1本鎖抗体を用いた C D 4陽性細胞分離装置。
(4) CD 4分子に結合するキメラ抗体、 1本鎖抗体、 またはそれらを組み合わ せた抗体を用いたヒ ト CD 4陽性細胞の分離または検出方法。
(5) H鎖可変領域の CDR- 1が Asp Tyr Val He Asn (配列表配列番号 1 ) 、 C DR- 2が Glu He Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Glu Met Phe Lys G ly (配列表配列番号 2) 、 CDR- 3が Arg Gly Thr Gly Thr Gly Phe Ala Tyr (配 列表配列番号 3) で表されるアミノ酸配列であり、 L鎖可変領域の CDR- 1が Lys
Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn (配列表配列番号 4) 、 CDR-2 が Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser (配列表配列番号 5 ) 、 CDR-3 が Gin Gin Ser Ser Glu Asp Pro Pro Thr (配列表配列番号 6 ) で表されるアミ ノ 酸配列であり、 Fc 領域がヒ ト型であるキメラ抗体を用いたヒ ト CD 4陽性細胞 の分離または検出方法。
(6) H鎖可変領域の CDR - 1が Asp Tyr Val He Asn (配列表配列番号 1 ) 、 CDR- 2が Glu lie Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Glu Met Phe Lys Gly (配列表配列番号 2) 、 CDR-3が Arg Gly Thr Gly Thr Gly Phe Ala Tyr ( 配列表配列番号 3) で表されるアミノ酸配列であり、 L鎖可変領域の CDR- 1が L ys Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn (配列表配列番 号 4) 、 CDR- 2 が Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser (配列表配列番号 5 ) 、 CDR-3 が Gin Gin Ser Ser Glu Asp Pro Pro Thr (配列表配列番号 6 ) で表れれるアミ ノ酸配列を含有する 1本鎖抗体を用いたヒ ト CD 4陽性細胞の分離または検出方 法。
また、 本発明は、 次の細胞分離装置及びこれを使用する細胞の分離方法あるい は検出方法に関する。
(1) CD34分子に結合するキメラ抗体、 1本鎖抗体、 またはそれらを組合せた 抗体を用いた CD34陽性細胞分離装置。
(2) H鎖可変領域の CDR-1が Ser- His- Gly- Va卜 His (配列表配列番号 43) 、 CD R-2 が Va卜 lie- Trp- Gly- Ala- Gly- Arg- Thr- Asp- Tyr- Asn- Ala- Ala- Phe- lie- Ser ( 配列表配列番号 44) 、 CDR-3 が Asn-Arg- Tyr- Glu- Ser- Tyr- Phe- Asp- Tyr (配列表 配列番号 45) で表されるアミノ酸配列であり、 L鎖可変領域の CDR- 1が Arg-Ser -Ser- Gin- Asn- Leu- Va卜 His- Ser- Asn- Gly- Asn- Thr-Tyr- Leu- His (配列表配列番号 46) 、 CDR-2 が Lys- Va卜 Ser- Asn- Arg- Phe- Ser- Gly- Va卜 Pro- Asp- Arg- Phe (配列 表配列番号 47) 、 CDR-3 が Ser- Gin- Ser- Thr- His- Val-Pro- Leu- Thr (配列表配列 番号 48) で表されるアミノ酸配列であり、 F c領域がヒ ト型である抗体を用いた CD 34陽性細胞分離装置。
(3) H鎖可変領域の CDR - 1が Ser- His- Gly- Va卜 His (配列表配列番号 43) 、 CD R-2 が Va卜 lie- Trp-Gly- Ala- Gly- Arg- Thr- Asp Tyr- Asn- Ala Ala- Phe- lie- Ser ( 配列表配列番号 44) 、 CDR-3 が Asn-Arg-Tyr-Glu-Ser-Tyr-Phe-Asp-Tyr (配列表 配列番号 45) で表されるアミノ酸配列であり、 L鎖可変領域の CDR-1が Arg-Ser -Ser-Gln-Asn-Leu-Val-Hi s-Ser-Asn-Gl y-Asn-Thr-Tyr-Leu-Hi s (配列表配列番号 46) 、 CDR-2 が Lys-Val-Ser-Asn-Arg-Phe-Ser-Gly-Val-Pro-Asp-Arg-Phe (配列 表配列番号 47) 、 CDR-3 が Ser-Gln-Ser-Thr-Hi s-Val-Pro-Leu-Thr (配列表配列 番号 48) で表されるアミノ酸配列である 1本鎖抗体を用いた C D 34陽性細胞分離
(4) 抗体のアミノ酸配列の C末端、 N末端またはそれらの両者に、 塩基性アミ ノ酸または酸性ァミノ酸を含むァミノ酸配列を付加した抗体を用いた前記 （1)〜 (3) のいずれかの C D 34陽性細胞分離装置。
(5) C D 34分子に結合するキメラ抗体、 1本鎖抗体、 またはそれらを組合せた 抗体を用いたヒ ト C D 34陽性細胞の分離または検出方法。
(6) H鎖可変領域の CDR-1が Ser-Hi s-Gly-Val-Hi s (配列表配列番号 43) 、 CD R-2 が Va卜 l ie- Trp_Gly- Ala- Gly- Arg- Thr- Asp- Tyr- Asn- Ala- Ala- Phe_I le- Ser ( 配列表配列番号 44) 、 CDR-3 が Asn-Arg-Tyr- Glu- Ser-Tyr-Phe- Asp- Tyr (配列表 配列番号 45) で表されるアミノ酸配列であり、 L鎖可変領域の CDR- 1が Arg- Ser -Ser-Gln-Asn-Leu-Val-Hi s-Ser-Asn-Gly-Asn-Thr-Tyr-Leu-Hi s (配列表配列番号 46) 、 CDR-2 が Lys-Val-Ser-Asn-Arg-Phe-Ser-Gly-Val -Pro-Asp-Arg-Phe (配列 表配列番号 47) 、 CDR-3 が Ser-Gln-Ser-Thr-Hi s-Val-Pro-Leu-Thr (配列表配列 番号 48) で表されるアミノ酸配列であり、 F c領域がヒ ト型である抗体を用いた ヒ ト C D 34陽性細胞の分離または検出方法。
(7) H鎖可変領域の CDR- 1が Ser-Hi s-Gly-Val-Hi s (配列表配列番号 43) 、 CD R-2 が Va卜 l i e- Trp- Gly_Ala- Gly- Arg- Thr- Asp- Tyr- Asn- Ala- Ala- Phe- l ie- Ser ( 配列表配列番号 44) 、 CDR-3 が Asn- Arg-Tyr- Glu- Ser- Tyr- Phe Asp- Tyr (配列表 配列番号 45) で表されるアミノ酸配列であり、 L鎖可変領域の CDR- 1が Arg- Ser - Ser- Gin- Asn- Leu- Va卜 Hi s- Ser Asn- Gl y_Asn- Thr- Tyr- Leu Hi s (配列表配列番号 46) 、 CDR-2 が Lys- Va卜 Ser- Asn- Arg- Phe- Ser- Gly- Val- Pro- Asp- Arg- Phe (配列 表配列番号 47) 、 CDR-3 が Ser- Gin- Ser- Thr- His- Val- Pro-Leu- Thr (配列表配列 番号 48) で表されるアミノ酸配列を含有する 1本鎖抗体を用いたヒト C D34陽性 細胞の分離または検出方法。
(8) 抗体のアミノ酸配列の C末端、 N末端またはそれらの両者に、 塩基性アミ ノ酸または酸性アミノ酸を含むアミノ酸配列を付加して用いた前記 （5)〜(7) の いずれかのヒト C D 34陽性細胞の分離または検出方法。
さらに本発明は、 次の抗体、 抗体をコードする核酸、 この核酸を用いる抗体の 生産方法、 この抗体よりなる医薬組成物に関する。
(1) H鎖可変領域の CDR-1、 CDR- 2および CDR-3がそれぞれ配列表配列番号 1、
2および 3に記載のァミノ酸配列であり、 CD4抗原に対して親和性を有する抗体。
(2) L鎖可変領域の CDR-1、 CDR-2および CDR- 3がそれぞれ配列表配列番号 4、 5 および 6に記載のァミノ酸配列であり、 CD4抗原に対して親和性を有する抗体。
(3) 受託番号が FERM BP- 6729であるハイプリ ドーマ 4H5 により産生される、 C D 4抗原に対するモノクローナル抗体。
(4) 前記（1) から（3) のいずれかに記載の抗体をコードする核酸。
(5) 配列表配列番号 7および 8に記載の塩基配列を含有する、 前記（4) に記載 の核酸。
(6) 前記 (4) または（5) に記載の核酸を用いた抗体の生産方法。
(7) 前記（6) の方法によって得ることができ、 C D 4抗原に対して親和性を有 する組換え抗体。
(8) 抗体の Fc領域がヒト型である前記 (7) に記載の組換え抗体。
(9) 抗体が 1本鎖抗体である前記 (7) に記載の組換え抗体。
(10) 前記（1) から（3) のいずれかに記載の抗体と、 医薬的に許容しうる担体と からなる医薬組成物。
(11) 前記 (7) から（9) のいずれかに記載の組換え抗体と、 医薬的に許容しうる 担体とからなる医薬組成物。
本発明でいう 「抗体」 とは、 通常生体内に存在する形の抗体の他に、 抗体の H 鎖もしくは L鎖の可変領域もしくはその組み合わせで形成される抗原結合部位を 少なくとも 1つ含む分子を含む。 例えば、 H鎖の可変領域のみ含むぺプチド、 1 組の H鎖断片と L鎖断片からなる Fab 、 2組の H鎖断片と L鎖断片からなる （Fa b')2、 H鎖断片と L鎖断片が同一ペプチド上に直列に結合した 1本鎖抗体 「ScFv 」 なども含まれる。
本発明でいう 「ヒ ト CD 4抗原」 とは、 Parnes, J. R.によりに報告（Adv. I誦 u nology誌、 44巻、 265頁、 1989年） され、 リンパ球上に発現するヘルパー T細胞 の抗原マ一カーとして知られている。 また CD 4抗原はヒ トでは他に単球、 マク 口ファージなどにも発現されている。
抗体の抗原特異性と抗原への結合の強さが、 主に CDR のアミノ酸配列によって 決定されることはマウス抗体のヒ ト化で示されている （Gussow, D. and Seemann ， G.， Methods in Enzymology, 203:99-121 (1991) ； Glaser, S.M. et al.， J. I誦画 logy 149:2607-2614 (1992))。
C0S7細胞による抗体の分泌発現には、 種々のべクタ一が使用可能であるが （Wh ittle, N. and Adair, J. et al. (1987)， Protein Eng. , 1 (6)， 499-505. ； S utter, K. D. and Feys, V. et al. (1992), Gene 113， 223-30.)、 ヒ ト抗体の発 現プラスミ ド （pGl)を利用し、 ヒ ト ·マウスキメラ抗ヒ ト CD 4抗体を発現し得 るプラスミ ド pG14H5、 及びヒ ト CD34抗体を発現し得るプラスミ ド pGlMylO を作 成した。 これを C0S7細胞へ遺伝子導入し、 ヒ ト抗 CD 4抗体の生産を行える。 こ こで言う、 ヒ ト 'マウスキメラ抗体とは、 可変領域がハイプリ ドーマ由来のマウ ス遺伝子配列であり、 定常領域がヒ ト由来の遺伝子配列から構成される遺伝子に よって生産された抗体を示す。 pGl は、 国際公開公報 W095/15393に記載の pSE プ ラスミ ドのヒ ト Cァ 1 の配列に付加された膜通過ドメイン （TM) を除去して、 通 常の抗体の様に生体内に分泌される様改良したプラスミ ドである。 その作成の詳 細は、 参考例 1として示してある。 つまり、 ヒ ト定常領域をコードする遺伝子配 列を有しており、 マウス可変領域遺伝子をつなぐことにより、 ヒ トマウスキメラ 抗体を発現しうるプラスミ ドである。
本発明でいう 「キメラ抗体」 とは、 異なる動物種の抗体のアミノ酸配列を人為 的に組み合わせた抗体を示す。 例えば、 マウスハイプリ ドーマ由来の CD Rを含 み、 定常領域にヒ ト抗体由来アミノ酸配列を含む抗体を示す。 さらに、 フレーム ワークにヒ ト由来のアミノ酸配列を含めることもできる。
本発明でいう 「ヒ ト CD34抗原」 とは、 Civin らによりに報告（USP- 4965204、 及び J. Immunology誌、 133 巻、 157 頁、 1984年） され、 血液の未分化細胞上に発 現する造血未分化細胞の抗原マーカーとして知られている。
本発明でいう 「実質的に同じ機能」 とは、 抗原分子上のェピト一プ、 抗原との 結合力が実質上同じであることをいう。 可変領域のフレームワークや定常領域に おけるアミノ酸置換があつたとしても、 しばしば本質的に同じ性能の抗体を生成 することが知られている。 抗体の抗原特異性と抗原への結合の強さが、 主に CD Rのァミノ酸配列によって決定されることはマウス抗体のヒ ト化で示されている (Gussow, D. and Seemann, G. , Methods in Enzymology, 203:99-121(1991) ;Glaser, S.M. et al., J. Immunology 149:2607-2614(1992))。
C0S7細胞は通常 10%ゥシ胎児血清 （FBS)加 Dulbecco' s Modified Eagle's Med ium (DMEM培地） を用い、 5 % C02存在下 37°Cで培養する。 C0S7細胞への遺伝子 導入法や、 遺伝子導入後の細胞の育種生産法は、 バイオマニュアルシリーズ 4遺 伝子導入と発現 ·解析法；横田 祟、 新井 賢一 羊土社 （1994) 等の実験書に 記載されている。 C0S7細胞への遺伝子導入法は、 電気穿孔法の他、 DEAEデキスト ラン法 （Bebbington, C. R. (1991) ； METHODS ： A Companion to Methods in En zymology, 2 (2)， 136-45.) であっても良い。
本発明では、 pGlに組み込まれた定常領域遺伝子が Cァ 1 であるため、 各クロ —ンは IgGlとして発現した。 抗体の生産時には、 血清由来のゥシ抗体の混人を避 けるために、 無血清の DMEM培地によって培養することが望ましい。 こうして培養 上清中に分泌された抗 CD 4抗体は、 例えばプロティン Aやプロティン Gを用い る一般的な I gG抗体の精製法によつて容易に精製することができる。
工業生産の場合の宿主としては CH0 細胞、 ミエローマ Sp 2/0細胞がよく知られ ている (Xiang, J. et al. (1990) Mol. Immun. , 27, 809 ； Bebbington, C. R. et al, (1992) Bio/technology, 10， 169 ； Larrick, J. W. and Wallace, E. F. et al. (1992) Imunol. Rev. 130, 69-85. ； Deyev, S. M. andLieber, A. et al . (1994) Appl. Biochem. Biotechnol. 47 (2-3), 143-54.)。 例えば CH0 細胞で は、 ΜΠ 等の薬剤により生産性の高いクローンを選択する方法も報告されており (Bebbington, C. R. (1991) METHODS ： A Companion to Methods in Enzymology ， 2 (2)， 136-45.) 、 安定な高生産株が取得できれば、 その株を組換え抗ヒ ト C D 4抗体の工業的生産に利用できる。
ヒ トマウスキメラ抗体は、 医薬品として利用した場合、 ヒ ト体内での抗原性が マウス抗体に較べ極度に低下しており、 より安全性が向上している。 通常の抗体 をペプシンなどのプロテア一ゼで分解した F (ab')2 化した場合でもヒ ト Fcを利 用した断片は、 マウスのものに較べ安全性が高い。 また、 医療機器への応用に際 しても、 リガンドとして利用されている抗体がプロテアーゼ等の分解を受け微量 に遊離してくる可能性があるカ^ そうした分解産物に関してもヒ ト化されたもの は、 安全性が高いといえる。
1本鎖抗体においては、 低分子化することにより抗原性を低下させ得る効果が 期待される。 抗体をパパインなどのプロテア一ゼ処理し Fab化した抗体は、 マウ スの定常領域を依然として含むが、 1本鎖抗体はそれらを除いたものであり、 抗 原性が非常に低くすることができ得る。 ハイプリ ドーマから 1本鎖抗体を単離す る方法は、 Recombinant Phage Antibody System キッ ト （フアルマシア社） など を利用することが可能な場合もある力く、 生産宿主となる大腸菌にとつて該 1本鎖 抗体が毒性を持ち、 大腸菌の死滅、 該 1本鎖抗体の分解を起こすような場合には、 キッ トを有効に使用できず多くの工夫を要する。 1本鎖抗体は、 PSE380プラスミ ド （インビトロジヱン社） や pET24d(+) プラスミ ド （ノバジヱン社） などの誘導 性のベクタ一と宿主となる菌種を検討することにより、 調製し得る。 また、 生産 においては、 上述の方法の他、 真核細胞発現系、 昆虫細胞発現系、 酵母細胞発現 系も有効に利用しうる。 H鎖及び L鎖を結合するリンカ一は、 （Gl y- Gl y- Gly-Gl y-Ser) x 3回繰り返しの 1 5残基のアミノ酸を使用したが、 本配列に限定されず に利用することができる。
本発明で生産した抗体を利用し、 C D 4陽性細胞の分離を行うことができる。 本発明により、 体外において血液細胞懸濁液から、 もしくは体外循環により血液 から効率よく C D 4陽性細胞を分離することが可能となり、 分離した細胞もしく は C D 4陽性細胞を除去した細胞群は、 種々の疾患の治療に用いうる。 C D 4陽 性細胞を除去した細胞混合液、 血液製剤の作成、 もしくは C D 4陽性細胞を主た る成分とした細胞懸濁液； C D 4陽性細胞製剤の作成を容易に行うことができる。 C D 4陽性細胞除去により自己免疫疾患である慢性関節リゥマチ、 多発性硬化症、 全身性エリテマトーデスなどの症状の改善が期待される。
抗体の形状として、 生産抗体分子をそのまま利用することも可能であるが、 各 種プロテアーゼ処理により得られる抗原結合部位を含む断片である Fab、 F(ab' ) 2- vあるいは Fdなども適用することができる。 これらの断片については、 「抗体ェ 学入門」 （地人書館） などに説明がされている。 その他にも本発明をヒ ト体内の 血液の体外循環に応用する場合には抗体が血液中に遊離した際の副作用， 抗原性 などを考慮して可変領域以外の部分をヒ 卜型抗体にするようなキメラ抗体を用い ることも有用である。 これら抗体の作製方法は特に限定されるものではないが、 高純度に精製されたものを用いなければならない。 モノクロナ一ル抗体の生産方 法は、 通常行なわれているハイプリ ドーマをマウスの腹腔で増殖させ腹水から生 産された抗体を回収する方法、 もしくは、 無血清培地による培養上清から得る方 法でよい。 断片べプチドの場合には抗体分子の酵素処理により得ることができる 力^ 遺伝子工学的な手法により細菌， 酵母などに産生させることも可能である。 これらの方法により得たモノクローナル抗体、 モノクローナル抗体由来抗体断片、 ぺプチド等を組み合わせることにより、 より強固な結合性を生じる。
現在、 細胞の分離方法として、 抗体を利用して特異的に目的の細胞だけを分離 する方法が開発されつつある。 例えば、 蛍光抗体標識細胞分離法， 水不溶性担体 に目的細胞と親和性を有するリガンドを固定化しこれに目的細胞を直接的または 間接的に結合させる方法、 免疫吸着カラムによる分離および免疫磁気ビーズによ る分離法などがある。
蛍光抗体標識細胞分離法は、 最初に細胞混合液を目的とする細胞に発現されて いる膜抗原を認識する蛍光標識したモノクローナル抗体とインキュべ一トした後、 処理した細胞にセルソ一ターなどでレーザ一光を照射することにより抗体が結合 した細胞のみが蛍光を発することを応用して、 蛍光抗体が結合した細胞を分離す る方法である。
目的細胞の膜表面に存在する抗原に対するモノクローナル抗体を直接分離装置 表面に固定化して用いる方法、 および最初に細胞混合液を目的細胞上の膜抗原に 結合するモノクロ一ナル抗体とインキュべ一トして、 それから細胞表面上の抗体 に結合する抗ィムノグロプリン抗体のようなリガンドを固定化した細胞分離装置 で処理される方法が国際公開公報 W087- 04628に記載されている。 細胞分離は担体 または装置に固定化されたモノクローナル抗体に対して、 該抗原陽性細胞が直接 もしくは、 間接的に結合することで行なわれる細胞分離方法である。 これらの方 法は、 抗体を固定化したプラスチックシャーレ上で分離されるもので、 細胞混合 液は最初抗体を固定化したプラスチックシャーレ上に注がれ、 抗体と目的細胞上 の膜抗原とを結合させるためにィンキュベ一卜される。 ィンキュベ一ト後プラス チックシャーレを洗浄して結合していない細胞を除去して分離する。 免疫吸着力 ラム法は目的細胞上の膜抗原に対する抗体などのリガンドをビーズ表面に固定化 しこれをカラムに充塡して細胞分離を行なうものである。 目的細胞上の膜抗原に対する抗体をピオチン標識したものを細胞混合液中に加 えて、 ィンキュベー卜することにより細胞—抗体—ピオチン結合を形成させた後 、 多孔質アクリルアミ ドゲルにアビジンを固定化したビーズを充填したカラムを 通過させピオチン一アビジンの強力な結合を利用して目的細胞をカラム内に結合 させて分離する方法が国際公開公報 W091-16116に記載されている。
免疫磁気ビーズ法は最初に細胞混合液を抗体の結合した磁気ビーズとインキュ ベー卜することにより目的細胞を磁気ビーズで標識する。 標識後磁気装置を用い て標識されていない細胞から標識細胞を分離する。
しかし、 これらの方法により細胞分離を実行するためには多量の抗体分子を必 要とし、 特に医療現場への応用に際してはそのコストが問題となる。 本発明によ り生産される組換え抗体によりそのコストを容易に下げることができる。
同じ細胞を認識する 2種類または、 2種類以上の抗体を直接固定化する担体の 一つとして、 水不溶性の担体を利用できる。 C D 4分子と、 その他の C D 4陽性 細胞に発現する分子、 例えば Gタンパク共役型レセプターで、 HIV 感染のセカン ドレセプタ一として働く、 Fus i n (CXCR-4) (Feng, Y ら、 Sci ence 、 272 (5263) 巻、 872-877， 1996年） や、 同じく HIV感染のセカンドレセプターとして働く、 CC R-5 (Deng, Hら、 Nature, 381 (6584)巻、 661 - 666， 1996年） 等と組合せも可能で ある。 これらの分子は発現頻度が少なく、 分離効率が悪いが、 C D 4分子を認識 する抗体と同時にこれらの分子を認識する抗体を組み合わせることにより、 これ らの発現細胞を単離しうる。
同様にこれらの同じ細胞上の異なる抗原分子を認識する 2種類または 2種類以 上の抗体を直接固定化した担体を利用することもできる。 C D 3 4分子と、 その 他の未分化細胞に発現する分子、 例えば S C Fのリセプターである c- ki t (Yarden ら、 EMBO J. 、 6巻、 3341頁、 1987年） 、 リセプタ一 FLK-2 (Mathewsら、 Ce l l誌 、 65巻、 1143頁、 1991年） 、 インタ一ロイキン一 3 リセプター 鎖 （Ki tamuraら 、 Ce l l誌、 66巻、 1165頁、 1991年） 等との組合せも可能である。 これらの分子も 非常に発現頻度が少なく、 分離効率が悪いが、 C D 3 4分子と同時に抗体を組み 合わせることにより、 これらの発現細胞を単離しうる。
例えば、 あらかじめ細胞に固定化させる抗体にピオチンや、 磁気ビーズを結合 させておき、 次にそのピオチンや磁気ビーズと結合しやすい物質、 例えばァビジ ンゃ磁気を結合または含む水不溶性担体と反応させることにより、 容易に細胞が 結合した水不溶性担体を回収することができる。 また、 目的の造血未分化細胞に C D 3 4抗体を反応させておき、 抗ィムノグロブリ ン抗体を結合した水不溶性担 体と反応させ、 水不溶性担体を洗浄または回収することで選択的に目的の細胞だ けを分離することができる。 水不溶性担体である磁気ビ一ズに固定化した抗体を 利用すれば、 磁石等により分離を効率化することもできる。 本発明に用いられる 容器形状として、 水不溶性担体を充塡したカラム、 フラスコ状あるいは、 フラス コ状ケースに水不溶性担体を充塡したものが例示される。 これらの容器形状とこ れらの抗体を直接または、 間接的に固定化した不溶性担体との組み合わせにより 造血未分化細胞の分離器を作成しうる。 また、 これらの分離器は、 細胞懸濁液や、 生理食塩水などを流すポンプと組み合わせることにより、 細胞分離システムとし て利用性の高いものにすることができる。
本発明に用いられる容器形状として、 水不溶性担体を充塡したカラム、 フラス コ状あるいは、 フラスコ状ケースに水不溶性担体を充塡したものが例示される。 これらの容器形状とこれらの抗体を直接または、 間接的に固定化した不溶性担体 との組み合わせにより C D 4陽性細胞の分離器を作製しうる。 また、 これらの分 離器は、 細胞懸濁液や、 生理食塩水などを流すポンプと組み合わせることにより、 細胞分離システムとして利用性の高いものにすることができる。
抗体を水不溶性担体に固定化する際に、 抗体と水不溶性担体との間にスぺ一サ —を介して結合することも有用である。 更に、 必要に応じて水不溶性担体と化合 物を任意の長さの分子 （スぺ一ザ一） を介して結合させてもよい。 スぺーサ一の 詳細に関しては、 例えば、 「ァフィニティクロマトグラフィー」 （笠井献一ら、 東京化学同人出版、 1991年、 105〜108 頁） を参照することができる。 スぺ一サ —の例として、 ポリメチレン鎖及びポリエチレングリコール鎖等が挙げられる。 スぺーサ一の長さは 500 A以下であることが好ましく、 200人以下であることが 更に好ましい。 スぺ一サ一を介して水不溶性担体に化合物を結合させる方法とし ては、 例えば、 水不溶性担体としてァガロースを用いる場合、 ァガロースの水酸 基とスぺーサ一として用いるへキサメチレンジィソシアナ一トの片側のィソシァ ナ一ト基を反応、 結合させ、 残ったイソシアナ一ト基と抗体のアミノ基、 水酸基 又はカルボキシル基等を反応、 結合させる方法等が挙げられる。
本発明でいう水不溶性担体とは、 常温の水溶液中で固形状態にあるものをいい、 いずれの形状であってもよい。 形状を例示すると球状、 立方状、 平面状、 チップ 状、 繊維状、 平膜状、 スポンジ状、 中空糸状のものなどが挙げられる。 これらの 内、 細密充填のしゃすさ、 抗体を比較的均質に表面に保持しやすい点、 実有効面 積を比較的多く確保できる点、 及び細胞懸濁液の流通面から、 球状、 粒状及び繊 維状のものが望ましい。
水不溶担体の材質は、 表面に抗体を保持できるものであれば、 無機化合物、 有 機化合物を問わないが、 細胞懸濁液との接触時に溶出物が少ないこと、 形状の制 御がより容易なことから有機高分子化合物が望ましい。 このような例として、 ポ リプロピレン、 ポリスチレン、 ポリメタクリレートエステル、 ポリアクリレート エステル、 ポリアクリル酸、 ポリビニルアルコール等のビニル系化合物あるいは その誘導体の重合体及び共重合体、 ナイロン 6あるいは 66等のポリアミ ド系化合 物、 ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル系化合物、 セルロース等の植 物由来の多糖類系化合物等が挙げられる。 また、 これらと磁石を組み合わせて、 これらの水不溶性担体の回収を容易にすることもできる。
水不溶性担体を修飾し、 表面に親水性を付与することも本発明に好適に用いら れる。 アルブミ ン、 グロブリン等の生体由来タンパク質を固定化することや、 合 成官能基を導入することによって、 水不溶性担体表面に親水性を付与しうる。 親 水性を付与する合成官能基の例を示すと、 繰り返し単位が 2から 1500のポリェチ レングリコール鎖、 水酸基、 アミ ド基、 エーテル基、 エステル基がそれに該当す る。 但し、 ポリエチレングリコール鎖と水酸基は結合していても、 別に存在して も良い。 親水性を付与するポリエチレングリコ一ル鎖を有するモノマーの例を挙 げると、 メ トキシジエチレングリコールメタクリレート、 メ トキシトリエチレン グリコールメタクリ レート等の末端メ トキシメタクリレート、 メ トキシジェチレ ングリコールァクリ レート、 メ トキシトリエチレングリコールァクリレート等の 末端メ トキシァクリレート、 及びメチル基の代わりに水素が結合した末端水酸基 を有するメタクリレ一ト及びァクリレ一ト、 また末端に 1つ以上の重合性の官能 基を有する繰り返し単位が 2〜1500のポリェチレングリコール鎖を有するモノマ 一全般をさす。 更に、 担体に直接結合させる場合、 繰り返し単位 2〜1500のポリ エチレングリコール誘導体も含まれる。 親水性を与えるその他の置換基を有する モノマーの例を示すと、 ビニルピロリ ドン等が挙げられるがこれに限定されるも のではない。 更に重合性官能基は 1つ以上幾つ存在しても良い。 重合性の官能基 とは、 単独または 2つ以上の官能基によって重合できる官能基を指し、 例を挙げ るとビニル基、 アセチレン基、 ジェン基等の炭素多重結合、 エポキシ基、 ォキセ 夕ン基等の環構造、 等が挙げられるがこれに限定されるものではない。
更に、 上記官能基と共に非イオン性官能基が存在しても良くその例を挙げると、 非イオン性官能基で特に親水性の向上を目的にしたジメチルアミ ド基、 ジェチル アミ ド基、 ジイソプロピルアミ ド基等のアミ ド基、 ポリエチレンテレフタレート 鎖、 ポリブチレンテレフタレート鎖等の芳香族ポリエステル鎖及び脂肪族ポリェ ステル鎖等のポリエステル鎖、 メチレングリコール鎖、 プロピレングリコール等 のポリエーテル鎖、 ポリカーボネート鎖、 等の非ィォン性親水性官能基、 または 、 疎水性付与を目的としたアルキル鎖、 弗化アルキル鎖、 ァリル鎖等の非イオン 性官能基全般を含む。 以上の何れの官能基が共存しても良いが、 好ましくは、 非 イオン性親水性官能基を有する場合が良好である。 水不溶性担体を修飾し、 表面に親水性を付与する方法として、 共有結合、 ィォ ン結合、 放射線やプラズマによるグラフ ト法、 物理吸着、 包埋あるいは基材表面 への沈澱不溶化等あらゆる公知の方法を用いることもできる。 従って、 高分子化 合物やその単量体を放射線或いはプラズマ等を用いてグラフ ト重合したり、 共有 結合するなどの公知の方法により表面改質 （特開平 1-249063号公報、 特開平 3-50 2094号公報） を施す方法は本発明に好適に用いられる。
水不溶性担体表面に抗体を固定化する方法には、 化学的あるいは放射線や電子 線を用いてのグラフ ト法によって水不溶性担体表面に抗体を共有結合する方法、 あるいは、 化学的方法により水不溶性担体表面の官能基を介して共有結合する方 法などがある。 この中で官能基を介しての共有結合方法が使用時の抗体の溶出の 危険性が無く好ましい。 水不溶性担体が被覆層を有する場合は、 その被覆層表面 に不溶化することもできる。
水不溶性担体、 あるいはその被覆層表面に抗体固定化のための活性基を得る方 法の一例としてハロゲン化シアン法、 ェピクロロヒ ドリン法、 ビスエポキシド法、 プロモアセチルブロミ ド法、 ハロゲン化ァセトアミ ド法等がある。 具体的には、 アミノ基、 カルボキシル基、 ヒ ドロキシル基、 チオール基、 酸無水化物、 サクシ ニルイミ ド基、 置換性ハロゲン基、 アルデヒ ド基、 エポキシ基、 トレシル基など が挙げられる。 抗体固定化のしゃすさとして、 ブロムシアン法、 N-ヒ ドロサクシ ンイミ ド基法、 ハロゲン化ァセトアミ ド法が特に望ましい。
活性基に用いるハロアセトアミノメチル化剤としては、 N-ヒ ドロキシメチルク ロロァセトアミ ド、 N-ヒ ドロキシメチルフルォロアセトアミ ド、 N-ヒ ドロキシメ チルブ口モアセトアミ ド、 N-ヒ ドロキシメチルョ一ドアセトアミ ド等が良好に用 いられる。 中でも、 経済性及び安定性の面から好ましくは、 N-ヒ ドロキシメチル ブロモアセトアミ ド、 N-ヒ ドロキシメチルョ一ドアセトアミ ド、 等が良好に用い られる。 水不溶性担体に導人されたフルォロ基、 クロ口基は活性基導入後に、 ョ ゥ化カリゥム或いは臭化力リゥムの溶液で処理することで容易にヨウ素基或いは 臭素基に変換できる。 これらの活性基を導入した水不溶性担体の製造に用いられ る酸触媒としては、 強酸特にプロ トン酸であれば何れのものでもよいが、 敢えて 例を挙げると トリフルォロメタン、 メタン、 ベンゼン、 トルエン等のスルホン酸 誘導体及び硫酸、 塩化亜鉛、 塩化アルミニウム、 四塩化スズ等のフリーデル · ク ラフッ触媒等が良好に用いられる。
本発明の遺伝子によって生産させた抗体に毒素を結合させ、 慢性関節リゥマチ、 多発性硬化症、 全身性エリテマトーデスなどの患者に投与し、 自己反応性抗原受 容体を持った C D 4陽性リンパ球クロ一ンを低減させ得る。 また、 こうした修飾 抗体は、 ァフュレ一シスにより回収した患者の末梢血、 および末梢血白血球懸濁 液にも利用し得る。 また、 他の抗体由来の可変領域の遺伝子を組み合わせること により、 バイスぺシフィ ック抗体、 マルチスぺシフィ ック抗体の生産も可能とな る。
さらに本発明は、 上記記載の本発明のモノクロ一ナル抗体と医薬的に許容しう る担体とからなる医薬組成物を提供する。
こうして得られた本発明の抗 C D 4抗体遺伝子は、 効率的に抗 C D 4抗体を生 産することを可能とし、 種々の形態の治療用製剤を提供する。 こうして生産され た組換え抗体は、 例えば医薬的に許容しうる成分組成の担体や安定化剤など人体 への投与に際し、 該抗体の活性を保持させるために使用される物質とともに医薬 用組成物中に含まれていてもよい。 このような担体や安定剤としては、 ヒ ト血清 アルブミン、 ゼラチン等を例示することができる。 医薬的に許容しうるとは、 悪 心、 目眩、 吐き気等投与に伴う望ましくない副作用、 頻回投与時の製剤に対する 免疫応答などが起きないことを意味する。 また、 医薬的に許容しうる適当な溶剤 や希釈剤、 安定化剤とともに溶解された液状の医薬用組成物でもよい。 さらに上 記の医薬組成物に加えて生体内における濃度調節を目的とするミクロスフィァー、 リポゾーム等の徐放移植体を含む医薬用組成物であつてもよい。
本発明において非経口 （注射） する場合は、 キメラ抗体及び 1本鎖抗体で 10 ^ g〜lmg/体重 kg程度が適当である。 また、 体外で細胞を処理する場合は、 0. 1 〜lmg/ml程度が適当である。
他の抗体由来の可変領域の遺伝子を組み合わせることにより、 バイスぺシフィ ック抗体、 マルチスぺシフィ ック抗体の生産も可能となる。 マルチスぺシフイ ツ クとは、 異なる抗原もしくはェピトープを認識する抗原結合部位を少なくとも 2 種類以上有する抗体を示す。 中でもバイスぺシフィ ックとは、 異なる抗原もしく はェピ卜一プを認識する抗原結合部位を 2種類以上有する抗体を示す。 例えば、 通常の抗体の一方の抗原結合部位が C D 4抗原もしくは C D 34抗原を認識し、 も う一方の抗原結合部位を Tリンパ球抗原 C D 3等に対するバイスべシフィ ック化 したものは、 C D 4陽性 Tリンパ球もしくは C D 34陽性白血病細胞にリンパ球を より強く認識することが可能であり白血病細胞などの除去効果を誘導し得る。 CD 3以外にも、 汎リンパ球マ一力一例えば CD2， CD5, CD6, CD7などが利用し得る。 これらを組み合わせて IgM として発現させれば、 バイスぺシフィック、 マルチス ぺシフィ ックの抗体を作成し得る。 こうした生産時にバイスべシフィ ック化する 以外に、 モノクローナル抗体を生産、 精製し、 その後に抗体同士を結合させ、 バ イスぺシフィ ック化、 マルチスぺシフィ ック化することができる。
1本鎖抗体の場合において、 生産時でのバイスぺシフィ ック化、 マルチスぺシ フィ ック化が可能であり、 1ペプチド内に複数の抗原認識部位の組み合わせの H 鎖 L鎖を繰り返して並べることにより生産させることができる。 生産、 精製後に 結合させることもできる。
これらは、 異なる抗原に対してのみならず、 同一分子内の異なるェピト一プ、 例えば異なる抗 C D 4抗体を組み合わせることも可能である。 抗 C D 4抗体は、 いくつか報告されている。 例えば Leu_3a抗体、 Leu- 3b抗体 （べク トンデッキンソ ン社） 、 0KT4抗体、 0KT4A 抗体 （ォーソ社） 、 T4抗体 （コールター社） 、 MT310 抗体 （ダコ社） 、 F101- 69 抗体、 16P25 抗体 （バイオシス社） 、 Edu- 2 抗体、 廳 M-115 抗体 （シンバスバイオテクノロジ一社） 、 7E14抗体 （ェクサルフィアコ一 ポレーシヨン社） 、 BL4 抗体、 13B8.2抗体 （ィムノテック社） 、 KT69- 7抗体 （ラ ブビジョ ンコーポレーショ ン社） 、 B- F51 抗体 （プロゲンバイオテクニック社） 、 Bい TH4抗体 （サンバイオ BV社） 、 94B1抗体、 L197抗体、 L80 抗体、 L93 抗体、 L201抗体、 L34 抗体、 L202抗体、 L200抗体、 L252抗体、 73F11 抗体、 72G4抗体、 NUTH1 抗体、 L71 抗体、 RFT4抗体、 MT151 抗体、 MT321 抗体 （D. G. Healey ら、 Eur. J. Immunol.誌、 21巻、 1491頁、 1991年） 、 0KT4B 抗体、 0KT4C 抗体、 0KT4 D 抗体、 0KT4E 抗体、 0KT4F 抗体、 Q6D3抗体、 L77 抗体、 L104抗体、 L83 抗体、 L190抗体、 L122抗体、 L120抗体 (Matthias Merkenschlager ら、 The J. Immunol. 誌、 145巻、 2839頁、 1990年） などが知られ、 これらの抗体遺伝子を単離し、 生 産に用いることができる。
同様にこれらは、 異なる抗原に対してのみならず、 同一分子内の異なるェピト —プ、 例えば異なる抗 CD34抗体を組み合わせることも可能である。 抗 CD34抗 体は、 いくつか報告されている。 例えば抗 HPCA- 2抗体 （べク トンデッキンソン社 ) 、 抗 HPCA- 1抗体 （べク トンデッキンソン社） 、 4A1 (ニチレイ社） 、 B1.3C5 (Ka tzら， Leuk. Res. 誌、 9巻、 191 頁、 1985年） 、 12.8、 115.2(Andrews ら、 Bloo d 誌、 67巻、 842 頁、 1986年） 、 ICH3(Watt ら、 Leukaemia 誌、 1巻、 417 頁、 1987年） 、 Tuk3 (Unchanska-Ziegler ら、 Tissue Antigens 、 33巻、 230 頁、 19 89年) 、 QBEND10(Finaら、 Blood 、 75巻、 2417頁、 1990年) 、 CD34(Ab-l) (Oncog ene Sciences社） 、 Immu-133(Barrande ら、 Hybridoma 誌、 12巻、 203 頁、 1993 年） などが知られ、 これらの抗体遺伝子を単離し、 生産に用いることができる。
H鎖及び L鎖の組み合わせによらず、 H鎖のみもしくは L鎖のみのべプチドを 利用することもできる。 こうした抗体種の選択は、 利用する用途により行うこと ができ、 結合強度、 抗原性等で選択し得る。
1本鎖抗体のァミノ酸配列は、 配列表配列番号 9および配列表配列番号 10に示 した。 また、 それをコードする核酸配列の例をアミノ酸配列と共に示した。 配列 表配列番号 9のァミノ酸配列 1位から 22位は大腸菌から分泌用シグナルを含む配 列、 23位から 133位は L鎖の可変領域、 134位から 148位はリンカ一、 149位か ら 266位は H鎖の可変領域、 267位から 305位までは FLAG- tag(270位から 277位 ) 、 c-myc- tag (281位から 290位） 、 Hi s X 6- tag (296位から 301位） を含む配 列を示す。 配列表配列番号 10のァミノ酸配列 1位から 22位は大腸菌から分泌用シ グナルを含む配列、 23位から 140位は H鎖の可変領域、 141位から 155位はリン カー、 156位から 266位は L鎖の可変領域、 267位から 305位までは FLAG- tag(2 70位から 277位） 、 c-myc-tag (281位から 290位） 、 Hi s x 6- tag (296位から 3 01位） を含む配列を示す。
配列表配列番号 9および配列表配列番号 10に記載のァミノ酸配列 1位から 20位 を欠失させ、 大腸菌菌体内に 1本鎖抗体を発現することも可能である。 また、 配 列表配列番号 9および配列番号 10に記載のアミノ酸配列 267位から 305位までは、 1本鎖抗体の検出および精製のための配列であり、 欠失あるいは如何なる配列に も置換し得る。 大腸菌からの分泌シグナル及び検出、 精製のための配列を含むベ クタ一の作製は参考例 2として示した。 配列表配列番号 9のアミノ酸配列 134位 から 148位および配列表配列番号 10のアミノ酸配列 141位から 155位のリンカ一 は、 L鎖および H鎖の可変領域の立体構造を実質的に 4H5 抗体と同等に保持でき るものであれば、 如何なる配列にも置換し得る。 配列表配列番号 9および配列表 配列番号 10に記載のアミノ酸配列 305位の Lys残基は水不溶性の担体に固定化す る場合に 1本鎖抗体分子の方向性を揃えるなど、 有効に働く力 より固定化効率 を上げるために Lys残基を複数導入することもできる。 また、 Cys残基を導入す ることも有効である。 上述のような改変は遺伝子工学的手法により容易に実施し うる。
本発明の実施によれば、 発現プラスミ ド pGl に組み込まれた定常領域遺伝子が c r 1であるため、 各クローンは i gGiとして発現する。 抗体の生産時には、 血清 由来のゥシ抗体の混入を避けるために、 無血清の D M E M培地によって培養する ことが望ましい。 こうして培養上清中に分泌された抗 C D 3 4抗体は、 例えばプ 口ティン Aやプロティン Gを用いる一般的な I gG抗,本の精製法によって容易に 精製することができる。 工業生産の場合の宿主としては CH0細胞、 ミエ口一マ Sp 2/0 細胞がよく知られている（Xiang, J. et al. (1990) Mol. Immun. , 27, 809; Beb bington, C. R. et al. (1992) Bio/technology, 10, 169;Larrick, J. W. and Wallace, E. F. et al. (1992) Imunol. Rev.130, 69-85.； Deyev, S. M. andLieber, A. et al. (1 994) Appl. Biochem. Biotechnol.47(2-3), 143-54. ) 。
例えば CH0 細胞では、 MTX等の薬剤により生産性の高いクローンを選択する 方法も報告されており （Bebbington, C. R. (1991) METHODS： A Companion to Meth ods in Enzymology, 2(2), 136- 45. )、 安定な高生産株が取得できれば、 その株を 組換え抗ヒ ト CD34抗体の工業的生産に利用できる。
抗体の形状として、 生産抗体分子をそのまま利用することも可能であるが、 各 種プロテア一ゼ処理により得られる抗原結合部位を含む断片である Fab、 F(ab')2 、 Fvあるいは F dなども適用することができる。 これらの断片については、 「抗 体工学入門」 （金光著、 p20- 22、 地人書館） などに説明がされている。 その他に も本発明をヒ ト体内の血液を体外循環に応用する場合には抗体が血液中に遊離し た際の副作用， 抗原性などを考慮して可変領域以外の部分をヒ ト型抗体にするよ うなキメラ抗体を用いることも有用である。 これら抗体の作製方法は特に限定さ れるものではないが、 高純度に精製されたものを用いなければならない。 モノク 口一ナル抗体の生産方法は、 通常行なわれているハイプリ ドーマをマウスの腹腔 で増殖させ腹水から生産された抗体を回収する方法、 もしくは、 無血清培地で培 養した培養上清から得る方法でよい。 断片べプチドの場合には抗体分子の酵素処 理により得ることができる力く、 遺伝子工学的な手法により細菌， 酵母などに産生 させることも可能である。 これらの方法により得たモノクローナル抗体、 モノク ローナル抗体由来抗体断片、 ペプチド等を組み合わせることにより、 より強固な 結合性を生じる。
CD34分子は、 Civin らによりに報告（USP-4965204、 及び J. I讓 unology 誌、 133 巻、 157 頁、 1984年） され、 血液の未分化細胞上に特異的に発現する未分化 細胞の抗原マーカーとして知られている。 この抗原マーカ一を利用し、 未分化細 胞を分離する試みが報告されてきている（S. Sae landら、 B l ood 誌、 72巻、 1580頁、 1988年など） 。 さらに、 抗 C D 34抗体と、 ピオチンやアビジン、 または磁気ビー ズとを組み合わせ、 未分化細胞を分化した細胞群および癌細胞から分離する医療 機器の開発が行われつつある （Dregerら、 ExpHematol. 誌、 23巻、 147頁、 1995 年） 。
本発明で分離される造血未分化細胞 （C D 34陽性細胞） とは、 特定の刺激によ り増殖可能な細胞であり、 赤血球、 単球、 顆粒球、 リンパ球、 マクロファージな どの成熟した細胞群を 1種類以上に分化しうる細胞を示している。 特に、 半固形 培地にて適当な増殖因子存在下で培養した場合、 コロニ一を形成する未分化な血 液細胞及び、 全ての系列への分化能と自己増殖能を有する造血幹細胞を含む。 そ の細胞は、 骨髄や臍帯血に豊富に含まれている。 また、 その細胞は、 末梢血中に も含まれるが、 顆粒球コロニー形成因子（G-CSF) などのサイ 卜力インを投与する ことで、 末梢血中に誘導することもできる。 また、 これらの細胞を培養すること により、 造血未分化細胞を体外で増殖させる技術も報告されつつある。 これらの 造血未分化細胞を含む、 細胞懸濁液は、 本発明により造血未分化細胞を分離する 材料となりうる。
本発明の細胞分離装置を医療機器として利用し、 造血未分化細胞の分離を行う ことができる。 体外において血液細胞懸濁液から、 もしくは体外循環により血液 から効率よく造血未分化細胞を分離でき、 分離した細胞は種々の疾患の治療に用 いることが可能となる。
血液のようにさまざまな細胞種を含む溶液から、 必要とする造血未分化細胞を 単離または濃縮し、 もしくは必要としない細胞を除去することは、 医療効果を高 める上で有効な手段である。 骨髄移植とは、 骨髄破壊した白血病患者などの癌患 者、 再生不良性貧血など先天性免疫疾患の患者に対し、 正常な造血未分化細胞を 移植する方法であり、 これらの患者に対する有効な治療法の一つとして定着しつ つある。 最近では、 造血未分化細胞は骨髄からだけでなく、 末梢血や臍帯血から 得る方法が用いられる。 同種骨髄移植は、 白血球型である HLA型がほぼ一致した 健常人から回収した骨髄液を、 抗癌剤または、 放射線で骨髄破壊した患者へ輸注 する方法であるが、 その問題点として、 拒絶反応である GVHD (移植片体宿主病） を引き起こすことである。 そのため、 近年造血系の悪性腫瘍， 癌の治療において 行なわれる自家骨髄移植療法、 または、 同種骨髄移植法の結果引き起こされる移 植片対宿主病（GVHD)予防のために、 造血未分化細胞の分離の需要が高まってきて いる。
本発明の一つの特徴は、 組み換え抗体を利用していることであるが、 組み換え 抗体を利用することで、 不溶性担体へ固定化しゃすい抗体に改変することができ る。 抗体を構成しているペプチドの C末端、 もしくは N末端にアミノ酸配列を付 加することで、 不溶性担体等の基材に効率よく固定しうる。
ヒ トマウスキメラ抗体の場合、 H鎖、 L鎖の C末端、 N末端、 またはその組み 合わせで本来の抗体の有していなかった配列として、 塩基性または酸性のァミノ 酸を含む配列を付加することである。 F c部分の途中で配列を、 遺伝子的に改変 し、 塩基性または酸性アミノ酸にする場合も、 改変した部分を含めた C末端側は、 付加したァミノ酸配列と見なすことができる。 ヒ トマウスキメラ抗体に限らず、 F c部分を不溶性担体に結合しゃすくすることは、 分離器等を作成するに適して いる。
1本鎖抗体において、 ぺプチドの C末端または N末端に基材への固定用配列を 付加することは望ましい。
付加する配列に含まれるアミノ酸として、 塩基性ァミノ酸、 酸性ァミノ酸を含 む配列が望ましいが、 基材への固定化を目的とするものであれば本発明に含まれ 塩基性アミノ酸として、 リシン、 ヒ ドロキシリシン、 アルギニン、 ヒスチジン 等が挙げられる。 酸性アミノ酸として、 ァスパラギン酸、 グルタミン酸等が挙げ られる。 特に、 リシン、 グルタミン酸、 ァスパラギン酸を利用することは、 より 効率的である。
配列の長さは、 特に限定されるものでないが、 リシン、 ァスパラギン酸、 グル 夕ミン酸などの 1アミノ酸を付加することであっても有効である。 しかし、 これ らのアミノ酸を複数個含めた配列を付加することは、 より効果的である。 1本鎖 抗体の様に、 分子量の小さな抗体に付加した場合、 ある程度長い配列を付加する ことで、 基材との固定後に抗体が抗原と結合する際の立体障害が少なくなり、 分 離器としての効果がより期待される。
本配列に付加した抗体は、 検出するための色素等を結合しやすくするため、 抗 原と結合した抗体を検出することで、 抗原を検出測定することが可能となる。 図面の簡単な説明
第 1図は、 I gG の構造を模式的に示す。
第 2図は、 プラスミ ド pGl の概略図である。
第 3図は、 プラスミ ド pSE380ScFv の概略図である。
第 4図は、 プラスミ ド pET24ScFvの概略図である。
第 5図は、 4H5 抗体と MT310 抗体の抗原結合親和性を示した図であり、 使用し た抗体濃度と ELI SA での定量値 (ABS) との相関で表した。
第 6図は、 キメラ抗体の KG la 細胞への結合性を示す。
(1)は、 マウス C D 34抗体を反応させたポジティブコントロール。
(2)は組換え抗体が C D 34陽性細胞である KG la 細胞を染色しうることを示して いる。 黒ピークは、 ネガティブコントロールである白ピークに対し染色されたこ とを示している。
発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施例を説明するが、 これら実施例は具体例により本発明を更 に説明するものであって、 本発明を限定するものではない。 〔参考例 1〕
PGI プラスミ ドの調製を行った。 膜結合型ヒ 卜抗体の発現ベクター pSE (国際公 開公報 W095/15393) の膜貫通領域 （TM) を除去し、 ヒ ト抗体を分泌発現可能なベ クタ一を作製した。 まず発現べクタ一 pSE を制限酵素 Sai lで消化後、 切断末端を 平滑化した。 この反応は、 DNA Bl unt i ng Ki t (宝酒造社） を用い、 添付のプロ 卜 コールに従って操作した。 以上の処理を行った発現べクタ一 pSE を制限酵素 Apal で消化後、 0. 7%ァガロースゲルにて電気泳動し、 Cァ 1 遺伝子及び膜貫通領域
(TM) を含む遺伝子領域が欠失した pSEベクター DNAを抽出精製した。 この反応 は GeneCl ean I I Ki t (B i o 101 社） を用い、 添付のプロ トコールに従って操作し た。 抽出した pSEベクターの制限酵素切断末端は、 ゥシアルカリフォスファタ一 ゼ （宝酒造社） により、 自己環化が起きないよう処理した。 次に、 ヒ ト Cァ 1 遺 伝子の全長が組み込まれたプラスミ ド DNA pUCCGlを制限酵素 Kpnl (宝酒造社） で 消化し、 切断末端を平滑末端化した後、 制限酵素 Apalで消化した。 この反応物を
0. 7%ァガロースゲルにて電気泳動し、 Cァ 1 遺伝子の全長を含む DNA断片を抽 出精製した。 この DNA断片と、 先の処理を行った pSEベクターをライゲーシヨン キッ ト Ver. 2(宝酒造社） を用いて連結し、 連結反応産物を大腸菌 DH5株へ導入し た。 出現したコロニーから数個を選んで培養し、 常法に従ってプラスミ ド DNA を 抽出精製した。 pSE ベクターに存在する適当な制限酵素を用いてこれらプラスミ ドの切断パターンを調べ、 予想されたパターンに一致したものを選び出した。 以 上の操作によって得られたプラスミ ドを pGlとした。 第 2図に pGlプラスミ ドの 図を示した。
〔参考例 2〕
1本鎖抗体 （ScFv抗体） を産生するベクターは、 抗 C D 4抗体遺伝子を導入す る前にあらかじめ大腸菌からの分泌シグナル、 及び精製、 検出用の tag をコード する配列を含むプラスミ ドの作成を行った。 大腸菌からの分泌シグナル （Pel Bタ ンパク質のシグナル配列） の取得は、 配列表配列番号 21 (5' TCATGAAATACCTGCTGC CGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCGGCCCAG 3' )及び配列番号 22 (5' TGCGGCCGCAGC CATGGTGTTTGCGGCCATCGCCGGCTGGGCCGCGAGGAGCAGCA 3' )の 2種を等量混合し、 94°C 5分、 熱変性後 65°Cにて 5分ァニールさせ、 72°C 10分、 GeneAmp PCR Reagent Ki t wi th Ampl iTaq DNA Polymerase (宝酒造社） を用い、 ポリメラーゼにより伸長 反応を行った。 この断片を TA cl oning ki t (インビ卜ロジヱン社） を使用し、 ク ローニングした。 これにより大腸菌からの分泌シグナルをコ一ドする cDNAを取得 し 7 o
精製、 検出用の tag をコードする配列の取得は、 配列表配列番号 23 (5' TGCGGC CGCAGACTACAAGGATGACGATGACAAAGGCTCGAGCGAGCAGAAGCTGA 3' )及び配列番号 24 (5 GGTGGGTCGACCTCGAGCCCAGATCCTCTTCGCTGATCAGCTTCTGCTCGCTCGAGC 3，） の 2種を等 量混合し、 94°C 5分、 熱変性後 60°Cにて 5分ァニールさせ、 72°C 10分、 GeneAmp PCR Reagent Ki t wi th Ampl i Taq DNA Polymerase (宝酒造社） を用い、 ポリメラ —ゼにより伸長反応を行った。 この反応後のサンプルをテンプレートとして、 さ らに以下に示すプライマ一を用いて PCR 反応を行い、 増幅された断片を TA cloni ng ki t (インビトロジヱン社） を使用し、 クローニングした。 これにより精製、 検出用の tag をコードする cDNAを取得した。 使用したプライマーは配列表配列番 号 25 (5 TGCGGCCGCAGACTACAAGGATG 3， ) 及び配列番号 26 (5 TAAGCTTATCATTTGGTC GA CCCGTGGTGATGATGATGGTGGGTCGACCTCGAGCC 3' ) を使用した。 PCR 条件は GeneAm P PCR Reag ent Ki t wi th Ampl iTaq DNA Polymerase (宝酒造社） を用い、 94°C 1 分、 62°C 1分、 72°C 1分を 1サイクルとして、 18サイクル行った。 PCR装置は、 型名 DNA Thermal Cycl er 480 (パーキンエルマ一社） を使用した。 クローニング した遺伝子を、 大腸菌からの分泌シグナルをコードする cDNAは、 制限酵素 BspHI (New England B i olabs社） 及び No t I (宝酒造社） で消化し、 精製、 検出用の tag をコードする cDNAは、 制限酵素 Hindl l l (宝酒造社） 及び Not l (宝酒造社） で消化 した後、 3. 5%ァガロースゲルにて電気泳動し各々の DNA 断片を切り出し抽出し た。 ァガロースゲルからの DNA断片の抽出には、 PCRprep (プロメガ社） を用いて 行った。
pET24d(+) プラスミ ド （ノバジェン社） は予め、 マルチクローニングサイ ト中 の制限酵素 Not!サイ 卜から制限酵素 Bpull02iサイ ト間の除去を行った。 制限酵素 Notl (宝酒造社） 及び制限酵素 Bpull02I (宝酒造社） を用いて pET24d(+) プラス ミ ドを消ィ匕し、 lenow fragment (New England Biolabs社) と dNTP mixture (宝 酒造社） を用いて添付のプロ トコ一ルに従い平滑末端化した。 このプラスミ ド D NA断片を 1 %ァガロースゲルにて電気泳動し、 切り出し抽出した。 これを自己環 化させることによって、 制限酵素サイ トの除去を行った pET24d(+) プラスミ ドを 取得した。 自己環化は、 ライゲ一シヨ ン Ver. 2キッ ト （宝酒造社） を使用した。 またァガロースゲルからの A断片の抽出には、 GeneCleanll Kit (Bio 101社） を用い行った。
PSE380プラスミ ド （インビトロジェン社） または上記の制限酵素サイ 卜の除去 を行った pET24d(+) プラスミ ドを制限酵素 Ncol (宝酒造社） 及び Hindi 11 (宝酒造 社） で消化し、 0.8%ァガロースゲルにて電気泳動し、 ベクタ一 DNA断片を抽出 精製した。 前述の制限酵素消化した大腸菌からの分泌シグナルをコードする cMA 及び、 精製、 検出用の tag をコードする cDNAをこのべクタ一断片と連結した。 各 々のライゲ一シヨンは、 ライゲ一シヨン Ver. 2キッ ト （宝酒造社） を使用した。 またァガロースゲルからの DNA断片の抽出には、 GeneCleanll Kit (Bio 101社） を用い行った。
以上の操作により作製した ScFv抗体産生用プラスミ ドベクタ一を pSE380ScFv及 び pET24ScFv とした。 第 3図、 第 4図にそれぞれの概略図を示した。
〔実施例 1〕
種々の抗体とヒ ト CD 4との結合親和性を評価するため、 ヒ ト可溶性 CD 4の 生産と精製を行った。 健常人より末梢血 15mlを採取し、 ハンクスバランスド生理 食塩水 （ギブコ社） で 30mlとし、 フイコールパック （フアルマシア社） を 10mlず つ分注した遠沈管 2本に静かに 13mlずつ重層し、 800回転/分、 20分の条件にて 分離し、 単核細胞層の細胞を回収した。 回収した細胞をハンクス液で洗浄した。 この細胞 1 X107 個から mRNAを QuickPrep mRNA Purification Kit (フアルマシア 社） を使用し、 添付の説明書に従って単離した。 得られた mRNAを铸型として、 Is t strand cDNA を合成した。 これは、 cDNA Synthesis Kit (フアルマシア社） を 使用し、 添付の説明書に従い行った。 その後、 PCR法により、 目的の遺伝子の開 始コ ドンから膜貫通領域 （TM) の前まで増幅および 5'末端側に Hindi II サイ トの 付加、 3'末端側に FLAG- tag配列、 ストップコ ドン、 Notlサイ 卜の付加を行った。 使用したプライマ一は配列表配列番号 11 (5' AAGCTTATGAACCGGGGAGTCCCTTTTA 3' ) および配列番号 12 (5' GCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCTGGCTGCACCGGGGTGG ACCA 3' )である。
PCR 条件は GeneAmp PCR Reagent Kit with Am liTaq DNA Polymerase (宝酒造 社） を用い、 94°C 1分、 57°C 1分、 72°C 2分を 1サイクルとして、 30サイクル行 つた。 PCR装置は、 型名 DNA Thermal Cycler 480 (パーキンエルマ一社） を使用 した。 増幅された遺伝子断片は、 TA cloning kit (インビトロジヱン社） を使用 し、 クローニングした。 塩基配列の決定は DNA シークェンサ一 Ver.1, 2. 0，
Model373A (Applied Biosystems社） を用い、 メーカ一のプロ トコールに従って 行った。 標識反応は、 Universal M13 Reverse primer (インビトロジヱン社） ま たは Universal M13 Forward primer (インビトロジヱン社） をプライマ一として、 PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied
Biosystems 社） を用い、 方法は添付のプロトコールに従った。 染色は、 ABI社 のラベリングキッ トを利用した。 得られた遺伝子配列の確認後、 真核細胞発現べ クタ一である PCDNA3プラスミ ド （インビトロジェン社） およびクロ一ニングした ヒ ト可溶性 CD4CDNA を有するプラスミ ドを制限酵素 Hindlll (宝酒造社） と制限酵 素 Notl (宝酒造社） を用いて消化し、 常法によるァガロースゲル電気泳動後、 ベ クタ一およびヒ ト可溶性 CD4CDNA を抽出精製した。 この反応は GeneCleanll Kit (Bio 101社） を用い、 添付のプロ トコ一ルに従って操作した。 これら 2つの DNA をライゲ一シヨンキッ ト Ver. 2 (宝酒造社） を用いて連結し、 連結反応産物を大 腸菌 DH5株へ導入した。 出現したコロニーから数個を選んで培養し、 常法に従つ てプラスミ ド DNAを抽出精製した。 pcDNA3に存在する適当な制限酵素を用いてこ れらプラスミ ドの切断パターンを調べ、 予想されたパターンに一致したものを選 び出した。
次に得られたヒ ト可溶性 C D 4発現プラスミ ドを、 DEAEデキストラン法 （Beb_ bington, C. R. (1991) ； METHODS ： A Compa-nion to Methods in Enzymology, 2 (2), 136-45. ) にてそれぞれ C0S7細胞へ導入した。 C0S7細胞を 10%ゥシ胎児血 清 (FBS)加 Dulbecco' s Modi f i ed Eagle' s Medi um (DMEM) にて、 遺伝子組み込み の 4日前に直径 100mmのディ ッシュあたり約 6. 1 x 105Cel l s/10ml となるよう蒔 き直し、 培養した。 4日後、 まず上清を除き、 PBS (—） にて細胞を静かに洗浄し て、 4mlの 10% FBS加 DMEMを加え、 次いで DEAEデキストラン Zヒ ト可溶性 C D 4 発現プラスミ ド混合液を細胞へ均一にふりかけて、 37°Cで 4時間インキュベート した。 この混合液は 20mg/mlの DEAEデキストラン （フアルマシア社） 水溶液と、 ヒ ト可溶性 C D 4発現プラスミ ドを TBS (—）（20mM Tri s · HC1 (ρΗ7· 4), 0. 15M NaCl)により 0. 17〃g/ l とした溶液を 2 : 1 (v/v) で混合したものであり、 ディ ッシュあたり 180 / 1 を添加する。 インキュベーション後、 上清を捨て、 10%ジ メチルスルフォキシド （DMS0) 添加 PBS (—） 5mlを加えて 1分静置した。 次いで上 清を捨て、 PBS (-）で洗浄後、 100 / M クロ口キン（Sigma社） 入りの 2 % FBS添加 DMEM 7mlを加え、 37°Cで 3時間インキュベートした。 その後、 上清を捨て、 PBS( 一） で洗浄して、 10% FBS加 DMEM 10ml を加え、 培養した。 翌日、 PBS (—） 及び DMEMにて、 FBS加 DMEMをよく除去した後、 無血清の DMEM 10mlを加え、 生産を開 始した。
生産開始から 3日後培養上清を回収し、 以後約 2週間生産を続けた。 得られた 培養上清を集め、 抗 FLAG- M2 ゲル （イーストマンケミカル社） カラムクロマトグ ラフィ一により精製し、 これをヒ ト可溶性 C D 4の精製標品とした。 〔実施例 2〕
抗ヒ ト CD 4抗体産生ハイプリ ドーマ 4H5(受託番号 FERM BP-6729) は、 10%FB S (ICN社） を添加した DMEM培地（GIBC0社） で培養した。 あらかじめハイプリ ドー マは、 限界希釈法で、 クローンを分離したのち、 培養上清をヒ ト可溶性 CD 4 ( リプリジェン社） を固相化した ELISA法にてヒ 卜可溶性 CD 4への結合性の高い クロ一ンを選択した。 この細胞 1 X107 個から mRNAを QuickPrep mRNA Purificat ion Kit (フアルマシア社） を使用し、 添付の説明書に従って単離した。 得られた mRNAを铸型として、 1st strand cDNA を合成した。 これは、 cDNA Synthesis Kit (フアルマシア社） を使用し、 添付の説明書に従い行った。 その後、 PCR法によ り、 上記で取得した cDNAをテンプレートとして、 目的の遺伝子の増幅を行った。
H鎖の取得に関しプライマ一は、 Mouse Ig-Prime Kit (ノバジヱン社） を使用 し、 配列表配列番号 13 (5' GGGAATTCATGRAATGSASCTGGGTYWTYCTCTT 3' )及び配列番 号 14 (5' CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACNGRTGG 3，） の配列を持つプライマーか ら遺伝子が増幅された。 PCR条件は、 GeneAmp PCR Reagent Kit with AmpliTaq DNA Polymerase (宝酒造社） を用い、 94°C 1分、 50°C 1分、 72°C 2分を 1サイク ルとして、 30サイクル行った。 PCR装置は、 型名 DNA Thermal Cycler 480 (パ一 キンエルマ一社） を使用した。 増幅された遺伝子断片は、 TA cloning kit (イン ビトロジェン社） を使用し、 クロ一ニングした。
L鎖の取得に関し、 予め L鎖べプチドの N末端ァミノ酸配列をプロテインシ一 ケンサ一 （Applied Biosystems社 492 Protein Sequencer) により、 N末端から 15残基を添付のプロ トコールに従って決定した。 センスプライマーは、 この N末 端ァミノ酸配列を基にコードしうる塩基配列を複数合成した。 アンチセンスブラ イマ一は、 マウス抗体遺伝子 cDNAが合成しうる配列候補を Sequences of Protein s of Immunological Interest, 5th edition, 1991 (USA NIH 発行） に掲載され たマウス抗体可変領域の遺伝子配列を参考にして複数合成した。 それらセンスプ ライマ一とアンチセンスプライマ一を組み合わせた PCR法を行った。 配列表配列 番号 15 (5'TGTGCCCTCGAGCTNACNCARAGYCCNGC 3，） 及び配列番号 16 (5' ATGGATACTA GTGGTGCAGCATCAGCCC 3' )の配列を持つプライマ—から L鎖可変領域遺伝子 （部分 長） が増幅された。 PCR条件は GeneAmp PCR Reagent Kit with Am liTaq DNA Po lymerase (宝酒造社） を用い、 94°C 1分、 55°C 1分、 72°C 2分を 1サイクルとし て、 30サイクル行った。 PCR装置は、 型名 DNA Thermal Cycler 480 (パーキンェ ルマ一社） を使用した。 増幅された遺伝子断片は、 TA cloning kit (インビトロ ジェン社） を使用し、 クロ一ニングした。
これら得られた遺伝子の H鎖及び L鎖の可変領域 （部分長） 塩基配列を決定し た。 塩基配列の決定は DNA シークェンサ一 Ver.1. 2. 0， Model373A (Applied Biosystems社） を用い、 メーカ一のプロ トコールに従って行った。 標識反応は、 Universal M13 Reverse primer (インビトロジヱン社） または Universal M13 Fo rward primer (インビトロジェン社） をプライマ一として、 PRISM Ready Reacti on DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Ki t(Appl ied Biosystemssc) ¾r用い 、 方法は添付のプロ トコールに従った。 染色は、 ABI社のラベリングキッ トを利 用した。
更に L鎖の取得に関し、 N末端部の未取得領域を取得するために再度 PCR法に より、 目的の遺伝子の増幅を行った。 プライマ一は、 Mouse Ig-Prime Kit (ノバ ジェン社） と取得した L鎖 「CDR-3」 cDNAに相補的な塩基配列を使用し、 配列表 配列番号 17 ( 5' GGGAATTCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT 3') および配列番号 18 (5' CGTCGGAGGATCCTCACTACT 3') の配列を持つプライマ一から遺伝子が増幅された。 PCR条件は GeneAmp PCR Reagent Kit with AmpliTaq DNA Polymerase (宝酒造社 ) を用い、 94°C 1分、 50°C 1分、 72°C 2分を 1サイクルとして、 30サイクル行つ た。 PCR装置は、 型名 DNA Thermal Cycler 480 (パーキンエルマ一社） を使用し た。 増幅された遺伝子断片は、 TA cloning kitを使用し、 クローニングし、 同様 に L鎖の可変領域 （N末端部） 塩基配列を、 決定した。 先に pCR2.1プラスミ ド （ TA cloning kitに添付） 上にクローニングされた L鎖の可変領域 （部分長） 中の 制限酵素 ΡΠΜΙサイ 卜と Hindlllサイ トを利用し、 L鎖の可変領域 （N末端部） と L鎖の可変領域 （部分長） の遺伝子を組換え、 L鎖可変領域 （完全長） の遺伝 子断片を構築した。 制限酵素 ΡΠΜΙは New England Biolabs社、 制限酵素 Hindi 11は宝酒造社のものを使用した。 ァガロースゲル電気泳動後の抽出精製には Gene Cleanll Kit (Bio 101社） を用い、 添付のプロ トコールに従って操作した。 これ ら 2つの DNAの連結には、 ライゲ一シヨンキッ ト Ver. 2 (宝酒造社） を用いた。 以上の操作により決定した 4H5抗体 H鎖可変領域 （完全長） の遺伝子配列をァ ミノ酸配列とともに配列表配列番号 37、 L鎖可変領域 （完全長） の遺伝子配列を ァミノ酸配列とともに配列表配列番号 38に示した。
〔実施例 3〕
実施例 2で得られた抗ヒ ト CD 4抗体（4H5抗体） の H鎖 （アミノ酸 4位から 1 18位） 、 L鎖 （アミノ酸 4位から 111位） 可変領域塩基配列を含む遺伝子断片を pGlプラスミ ドへ組み込み、 抗 CD 4ヒ トマウスキメラ抗体を発現可能なプラス ミ ドを作製した。 H鎖可変領域の遺伝子断片を含むクローンのプラスミ ド DNAを テンプレートとして配列表配列番号 19 (5， CAGGATCCGCTGCAGCAGTCTGGACCT 3' ) お よび配列番号 20 (5' TGGGCCCGTCGTTTTGGCTGCAGAGAC 3，） の配列を持つプライマー を用いて、 Apal及び BamHI制限酵素サイ トを新たに導入した H鎖可変領域断片を
PCR法により作製した。 PCR条件は、 GeneAmp PCR Reagent Kit with AmpliTaq DNA Polymerase (宝酒造社） を用い、 94°C 1分、 55°C 1分、 72°C 2分を 1サイク ルとして、 30サイクル行った。 PCR装置は、 型名 DNA Thermal Cycler 480 (パー キンエルマ一社） を使用した。 増幅された断片を TA cloning kit (インビトロジ ヱン社） を使用し、 クローニングした。 この H鎖 （アミノ酸 4位から 118位） 可 変領域塩基配列を含む DNA断片を制限酵素 Apal (宝酒造社） 及び BamHI (宝酒造社） で消化後、 2 %ァガロース電気泳動ゲルにて展開し、 切り出し抽出した。 ァガロ ース電気泳動ゲルからの DNA断片の抽出には、 GeneCleanll Kit (Bio 101社） を 用い、 添付のプロ トコールに従って操作を行った。 次に、 ベクタ一 pGlを制限酵素 Apal及び BamHIで消化後、 0. 7%ァガ口一ス電 気泳動ゲルから同様に切り出し抽出したものと連結した。 連結反応物を大腸菌 JM
109株へ導入した。 この連結反応には、 ライゲーシヨンキッ ト ver. 2 (宝酒造社） を用いた。 形質転換した大腸菌をアンピシリン含有 LBプレー卜に蒔いて一晩培養 し、 出現したコロニーの中から数個を選び、 常法に従ってプラスミ ド DNAを抽出 精製した。 これらを組み込みに用いた制限酵素 Apal及び BamHUこて消化し、 H鎖 可変領域塩基配列を含む断片が挿入されたものを選び出した。 次に L鎖に関し、 実施例 2にて取得した配列表配列番号 13 (5' TGTGCCCTCGAGCTNACNCARAGYCCNGC 3，） 及び配列番号 14 (5' ATGGATACTAGTGGTGCAGCATCAGCCC 3' )の配列を持つプライマ— から遺伝子が増幅されたクローンのプラスミ ド DNAC L鎖 （アミノ酸 4位から 111 位） 可変領域塩基配列を含む遺伝子断片） を制限酵素 Xhol (宝酒造社） 及び Spe l
(宝酒造社） で消化後、 1 %ァガロース電気泳動ゲルにて展開し、 L鎖可変領域 塩基配列を含む DNA断片を切り出し抽出した。 ァガロースゲルからの DNA断片の 抽出には、 GeneCleanl l Ki t (Bi o 101社） を用い、 添付のプロ トコールに従って 操作を行った。 次に、 H鎖可変領域塩基配列を含む DNA断片が挿入されたべクタ -pGl を制限酵素 Xho l及び Spe lで消化後、 0. 7%ァガロースゲルにて同様に切り 出し抽出したものと連結し、 連結反応物を大腸菌 JM 109株へ導入した。 この連結 反応には、 ライゲーシヨンキッ ト ver. 2 (宝酒造社） を用いた。 形質転換した大 腸菌をアンピシリン含有 LBプレー卜に蒔いて一晩培養し、 出現したコロニーの中 から数個を選び、 常法に従ってプラスミ ド DNAを抽出精製した。 これらを組み込 みに用いた制限酵素 Xho l及び Apalにて消化し、 H鎖及び L鎖可変領域塩基配列を 含む断片が挿入されたものを選び出した。 以上の方法にて得られた分泌型抗体発 現プラスミ ドを pG14H5とした。
〔実施例 4〕
実施例 3にて得られた分泌型抗体発現ブラスミ ド PG14H5を、 DEAEデキストラン 法 （Beb- bington, C. R. (1991) ； ETHODS ： A Compa-ni on to Methods in Enzy mology, 2 (2), 136- 45. )にてそれぞれ C0S7細胞へ導入した。 C0S7細胞を 10%ゥシ 胎児血清 (FBS)加 Dulbecco' s Modified Eagle's Medium (DMEM) にて、 遺伝子組 み込みの 4日前に直径 100麵のディ ッシュあたり約 6.1X105 Cells/lOmlとなる よう蒔き直し、 培養した。 4日後、 まず上清を除き、 PBS (—） にて細胞を静かに 洗浄して、 4mlの 10% FBS加 DMEMを加え、 次いで DEAEデキストラン Z分泌型抗体 発現プラスミ ド混合液を細胞へ均一にふりかけて、 37。Cで 4時間インキュベー ト した。 この混合液は 20mg/nilの DEAEデキストラン （フアルマシア社） 水溶液と、 分泌型抗体プラスミ ドを、 TBS (—）（20mM Tris · HC1 (pH7.4), 0.15M NaCl)に より 0.17 g / 1 とした溶液を 2:1 (v/v) で混合したものであり、 ディ ッシュあ たり 180 zl を添加する。 インキュベーション後、 上清を捨て、 10%ジメチルス ルフォキシド （DMS0) 添加 PBS (—） 5ml を加えて 1分静置した。
次いで上清を捨て、 PBS (—） で洗浄後、 100 zM クロ口キン（Sigma社） 入りの 2 % FBS添加 DMEM 7mlを加え、 37°Cで 3時間ィンキュベ一トした。 その後、 上清 を捨て、 PBS (―) で洗浄して、 10% FBS加 DMEM 10mlを加え、 培養した。 翌日、 PBS (-) 及び DMEMにて FBS加 DMEMをよく除去した後、 無血清の DMEM 10ml を加え、 生産を開始した。
生産開始から 3日後培養上清を回収し、 以後約 2週間生産を続けた。 得られた 培養上清を集め、 プロテイン Gセファロースカラムクロマトグラフィーにより精 製し、 これをヒ トマウスキメラ抗 CD 4抗体の精製標品とした （以下キメラ 4H5 抗体とする） 。
〔実施例 5〕
実施例 1において調製したヒ ト可溶性 CD 4を Superdex 200ゲル濾過カラム （ フアルマシア社） と SMARTsystem (フアルマシア社） を用いて、 10mM酢酸緩衝液 pH = 5.0 に buffer置換した。 このヒ 卜可溶性 CD 4液（250//g/ml、 20〃1)をセンサ —チップ CM5 (ファルマンァ社） のそれぞれ異なるレーンに 5〃l/niin で送液す ることによりアミンカツプリング法にて固定化し、 ヒ ト可溶性 CD 4固定化セン サ一チップを得た。
4H5 抗体またはキメラ 4H5抗体 （実施例 4で調製） を Superdex 200ゲル濾過力 ラム （フアルマシア社） と SMARTsystem (フアルマシア社） を用いて、 HBSbuffeK フアルマシア社） に buffer置換した。 BIA- core2000 (フアルマシア社） を用いて 、 先に作製したヒ ト可溶性 CD 4固定化センサ一チップ上に、 この 4H5抗体液ま たはキメラ 4H5抗体液 （50 zg/nd、 20 1)をアナライ トとして、 5 zl/min で各 レーンに送液し結合時のセンサグラムを得た。 その後 HBSbuffer のみを 5 / l/mi η でセンサーチップの各レーンに送液し解離時のセンサグラムを得た。 このセン サグラムの解析によりヒ ト可溶性 CD 4と抗ヒ 卜 CD 4抗体との解離定数 （KD： この値が低いほど結合親和性は高い） を得た。 その結果、 4H5抗体は KD==8.08X
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5.33xl0"6 S—リ であり、 キメラ 4H5抗 体では KD=1.24X10— 9M (Kon = 2.36xl04M— 一1、 Kof f = 2.92 x 10— 5 S つ であ り、 ヒ ト CD 4抗原に強く結合しうることが明らかとなった。
〔実施例 6〕
キメラ 4H5抗体の工業生産利用しうる、 安定な高生産株を取得した。 工業生産 の場合の宿主としては CH0細胞、 ミエローマ Sp 2/0細胞がよく知られている （Xi ang, J. et al. (1990) Mol. I讓 un. , 27， 809; Bebbington, C. R. et al. (199 2) Bio/technology, 10, 169 ； Larrick, J.W. and Wallace, E. F. et al. (199 2) imunol. Rev. 130， 69-85.； Deyev, S. M. and Lieber, A. etal. (1994) App 1. Biochem. Biotec nol. 47 (2-3)， 143-54. )0 例えば CHO細胞では、 MTX等の 薬剤により生産性の高いクローンを選択する方法も報告されており （Bebb i ngton, C.R. (1991) METHODS ： A Companion to Methods in Enzymology, 2 (2), 136-4 5)この方法を参考にし、 安定なキメラ 4H5抗体の高生産株を取得した。
すなわち、 CHOdhfr -株 (ATCC CRL- 9096)を電気穿孔法用緩衝液（272mM sucrose, 7mM リン酸緩衝液、 lmM MgCl2、 pH=7.4)に 1.0X107 eel ls/mlの濃度に調製し、 電気穿孔法用キュべッ ト（bio- rad社） に 500 1 を分注し、 氷冷した。 ここに実 施例 3において作製した pG14H5プラスミ ド 10〃g と pSV2dhf rプラスミ ド （ATCC N 0. 37146) 1 / を混合し、 5分間氷冷した。 3 F 、 0. 55kVの電気パルスを与え、
1分間氷冷した。 もう一度 3 F 、 0. 55kVの電気パルスを与え、 5分間氷冷した 。 この電気パルスの負荷は bio- rad社のジーンパルサ一を用いて行った。 細胞を
F12培地（GIBC0社） に 10% FBSを添加した培地 10mlに移し、 100mm組織培養用 di sh (FALCON社） において 37°C、 5 %C02 下で一晩培養した。 この細胞をトリプシ ン -EDTA 液（GIBC0社） を用いて di shから剥離し、 DMEM培地（GIBC0社） に 10%透析 FBS (GIBC0社） を添加した培地 120nilに移し、 150mm組織培養用 di sh 4枚に播種 した。 2から 3日毎に同培地で培地交換を行った。 約 2週間程度で肉眼で観察で きる程度に細胞のコロニーが形成される。
コロニーを数十個単離し、 それぞれ MTX (Ame thopterin ; SIGMA 社） 20nMを添加 した DMEM培地 + 10%透析 FBS (GIBC0社） で培養した。 2から 3日毎に同培地で培 地交換を行い一ヶ月培養した。 MTX薬剤耐性を獲得したクローン （同培地中で増 殖し得るクローン） をそれぞれ MTXIOOnMを添加した DMEM培地 + 10%透析 FBS培地 で培養した。 2から 3日毎に同培地で培地交換を行い一ヶ月培養した。 最終的に ΙΟΟηΜ MTX薬剤耐性を獲得したクローン （同培地中で増殖し得るクローン） の培 養上清中のキメラ 4H5抗体濃度を human immunogl obul in G (IgG) subclass E IA ki t (The Binding s i te社） の IgGl用を用いて測定し、 安定なキメラ 4H5抗体の 高生産株を選択した。 これらの手法により、 キメラ 4H5抗体を S ^ g/lO^ cel l s/d ayの割合で生産する安定発現株を作製した。
〔実施例 7〕
抗体遺伝子を ScFv抗体産生用べクタ一に組み込むため、 実施例 2で得た配列表 配列番号 37及び配列番号 38に記載の遺伝子を、 制限酵素配列及びリ ンカー配列を 含むプライマーを使用し、 PCR法で増幅させた。 L鎖用プライマ一は、 配列表配 列番号 27 (5' AGCCGGCCATGGCCGACATTGTGCTGACCCAATCTCCA 3' )及び配列番号 28 (5' CTCCGGAGC CCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTCC 3' )、 H鎖用プ ライマ—は、 配列表配列番号 29 (5' CTCCGGAGGTGGCGGATCGCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCT 3，）、 及び配列番号 30 (5'TGCGGCCGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTC 3，） を使用した。 PCR条件は GeneAmp PCR Reagent Kit with Am liTaq DNA Polymerase (宝酒造社 ) を用い、 94°C 45秒、 58°C 45秒、 72°C 1分を 1サイクルとして、 18サイクル 行った。 PCR装置は、 型名 DNA Thermal Cycler 480 (パーキンエルマ一社） を使 用した。 増幅された断片をそれぞれ TA cloning kit (インビトロジヱン社） を使 用し、 クローニングした。 この遺伝子を L鎖は制限酵素 Nael (宝酒造社） 及び Mr ol (東洋紡社） で消化し、 H鎖は制限酵素 Mrol (東洋紡社） 及び Notl (宝酒造社 ) で消化した後、 2 %ァガロースゲルにて電気泳動し各々の DNA断片を切り出し 抽出した。 ァガロースゲルからの DNA断片の抽出には、 Gene Cleanll Kit (Bio 101 社） を用いて行った。
参考例 2において調製した pSE380ScFvまたは pET24ScFv ベクターを制限酵素 Na el (宝酒造社） 及び Notl (宝酒造社） で消化した後、 1 %ァガロースゲルにて電 気泳動し各々の DNA断片を切り出し抽出した。 これを上記で制限酵素消化した L 鎖及び H鎖 DNA断片と連結した。 ライゲーシヨンは、 ライゲーシヨン Ver. 2キッ ト （宝酒造社） を使用した。 またァガロースゲルからの DNA断片の抽出には、 Ge neCleanll Kit (Bio 101社） を用い行った。 以上の操作によって得られたプラス ミ ドをそれぞれ大腸菌 DH 5株へ導入した。 形質転換した大腸菌を pSE380ScFvべク タ一由来のものはアンピシリン含有 LBプレート、 または pET24ScFv ベクタ一由来 のものはカナマイシン含有 LBプレー卜に蒔いてー晚培養し、 出現したコロニーの 中から数個を選び、 常法に従ってプラスミ ド DNAを抽出精製した。 適当な制限酵 素を用いてこれらプラスミ ドの切断パターンを調べ、 予想されたパターンに一致 したものを選び出した。 以上の操作によって得られた、 抗 CD 4抗体の配列を有 する 4H5ScFv(N 末 VL- linker- VH C末型：以下 LH型） 抗体を発現するプラスミ ド をそれぞれ pSE380ScFv4H5LH または pET24ScFv4H5LHとした。 また配列表配列番号 9に、 1本鎖抗体 （ScFv4H5LH)のァミノ酸配列をそれをコ—ドする核酸塩基配列 の 1例とともに示した。
〔実施例 8〕
抗体遺伝子を ScFv抗体産生用べクタ一に組み込むため、 実施例 2で得た配列表 配列番号 37及び配列番号 38に記載の遺伝子を、 制限酵素配列及びリンカ一配列を 含むプライマ一を使用し、 PCR法で増幅させた。 H鎖用プライマーは、 配列表配 列番号 31 (5' AGCCGGCCATGGCCCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCT 3' ) 及び配列番号 32 (5， CT CCGGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTC 3，）、 L鎖用プライ マ一は、 配列表配列番号 33 (5' CTCCGGAGGTGGCGGATCGGACATTGTGCTGACCCAATCTCCA 3，） 、 及び配列番号 34 (5' TGCGGCCGCTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTCC 3，） を使用した 。 PCR条件は GeneAmp PCR Reagent Ki t wi th Am l iTaq DNA Polymerase (宝酒造 社） を用い、 94°C 45秒、 58°C 45秒、 72°C 1分を 1サイクルとして、 18サイク ル行った。 PCR装置は、 型名 DNA Thermal Cycler 480 (パーキンエルマ一社） を 使用した。 増幅された断片をそれぞれ TA cloning ki t (インビトロジヱン社） を 使用し、 クローニングした。 この遺伝子を H鎖は制限酵素 Nae l (宝酒造社） 及び ro l (東洋紡社） で消化し、 L鎖は制限酵素 Mro l (東洋紡社） 及び Not l (宝酒造 社） で消化した後、 2 %ァガロースゲルにて電気泳動し各々の DNA断片を切り出 し抽出した。 ァガロースゲルからの DNA断片の抽出には、 GeneCleanl l Ki t (Bi o 101社） を用いて行った。
参考例 2において調製した pSE380ScFvまたは pET24ScFv ベクターを制限酵素 Na e l (宝酒造社） 及び Not l (宝酒造社） で消化した後、 1 %ァガロースゲルにて電 気泳動し各々の DNA断片を切り出し抽出した。 これを上記で制限酵素消化した H 鎖及び L鎖 DNA断片と連結した。 ライゲ一シヨンは、 ライゲーシヨン Ver. 2キッ ト （宝酒造社） を使用した。 またァガロースゲルからの DNA断片の抽出には、 Ge neCl eanl l Ki t (Bi o 101社） を用い行った。 以上の操作によって得られたプラス ミ ドをそれぞれ大腸菌 DH 5株へ導入した。 形質転換した大腸菌を pSE380ScFvべク タ一由来のものはアンピシリン含有 LBプレート、 または pET24ScFv ベクタ一由来 のものはカナマイシン含有 LBプレートに蒔いてー晚培養し、 出現したコロニーの 中から数個を選び、 常法に従ってプラスミ ド DNAを抽出精製した。 適当な制限酵 素を用いてこれらプラスミ ドの切断パターンを調べ、 予想されたパターンに一致 したものを選び出した。 以上の操作によって得られた、 抗 C D 4抗体の配列を有 する 4H5ScFv (N末 VH-1 inker- VL C末型：以下 HL型） 抗体を発現するプラスミ ド をそれぞれ pSE380ScFv4H5HL または pET24ScFv4H5HLとした。 また配列表配列番号 10に、 1本鎖抗体 （ScFv4H5HL)のァミノ酸配列をそれをコ—ドする核酸塩基配列 の 1例とともに示した。
〔実施例 9〕
実施例 7の pSE380ScFv4H5LH プラスミ ドでトランスフォームした大腸菌 DH 5株 を lOO ^ g/mlアンピシリンおよび 1 %グリセロール添加 2 X YT培地（1. 6%バク ト トリプトン、 1 %バク トイ一ストエキストラク ト、 0. 5%NaCl) にて培養した。 翌日この一部を 10倍量の上記培地に加え、 1時間培養した後上清を除き、 ImMの IPTG、 100 g/mlアンピシリンおよび 1 %グリセロール添加 2 X YT培地の等量に 換えて、 さらに 3時間培養した後、 培養上清を除去した菌体を培養容積の 1/10量 の氷冷した TES液 （200mM Tr i s-HCl (pH= 8. 0)、 0. 5mM EDTA、 0. 5Mスクロース） に懸濁した。 10分氷温で放置した後、 14000回転/分、 4。C、 20分遠心分離した。 上清を除き、 培養容積の 1/10量の氷冷した TE液（10mM Tr i s- HC1 (pH = 8. 0)、 0. 5 mM EDTA)に懸濁した。 30分氷温で放置した後、 14000回転/分、 4 °C、 20分遠心 分離することにより、 ペリブラズム中の抗体を回収した。 得られた抗体粗画分を 抗 FLAG-M2ゲル （ィーストマンケミカル社） カラムクロマトグラフィ一により精 製し、 さらに TALON metal af f ini tyゲル （クロンテック社） により精製した。 力 ラムクロマトグラフィ一はそれぞれゲルに添付のプロ トコールに従って行った。 これを抗ヒ ト C D 4 1本鎖抗体 （ScFv4H5LH)の精製標品とした。
実施例 1において調製したヒ ト可溶性 C D 4の PBS (—） 溶液（5. 2 z g/ml) をポ リスチレン 96穴プレートに 50 1 ずつ分注し、 4 °Cー晚静置することによって抗 原を固定化した。 上清を除去したのち 0. 05%Tween20加 PBS (—） （以下 PBS- T) 250 II I で洗浄した。 ブロックエース （大日本製薬） 100 l を個々のゥヱルに分注し、 室温で 1時間静置することによってブロッキングを行つた。 個々のゥヱルの上清 を除去したのち、 PBS-T 250 ^ 1 で 2回洗浄した。 上清を除去後、 上記で調製し た抗ヒ ト C D 4 1本鎖抗体 （ScFv4H5LH)の PBS (—） 溶液、 10 g/ml、 50 l を分 注し、 室温で 2時間静置反応した。 上清を除去したのち PBS-T 250 /i l で 3回洗 浄した。 上清を除去した後、 1000倍に PBS-Tで希釈した西洋ヮサビペルォキシダ —ゼ標識抗 myc抗体 （インビトロジヱン社） 50〃1 を個々のゥヱルに分注し、 室 温で 2時間静置した。 上清を除去したのち PBS- T 250 ^ 1 で 3回洗浄した。 上清 を除去後、 オルトフヱ二レンジァミ ン（S IGMA社） の PBS (—） 溶液に 0. 01 %H202を 添加した発色液 50 ^ 1 を加え、 室温で 7分間反応後、 2N硫酸液 50 1 を加え酵素 反応を停止した。 このプレートの 490nmにおける吸光度を測定した。 その際の吸 光度は 0. 574であった。 また、 ヒ ト可溶性 C D 4の固定化操作のみをせずに同様 の実験を行ったところ、 吸光度は 0. 109であった。 これらの結果より抗ヒ ト C D 4 1本鎖抗体 （ScFv4H5LH)はヒ ト C D 4を認識し、 親和性を持つことが示された。 〔実施例 1 0〕
2-ョードアセトアミ ド （東京化成社） 50gを蒸留水 100mlに懸濁し、 37%ホルム アルデヒ ド （和光純薬工業社） 20mlを加え 50°C攪拌下で溶解した。 炭酸カリウム 25. 2gを徐々に加え、 スターラーで 10分間攪拌後、 室温にて 2時間放置した。 さ らに 4 °Cでー晚静置したのち、 上清をデカンテーシヨンにより捨て、 蒸留水を 40 ml加えたのち 50°Cで沈殿を溶解し、 室温にて 2時間放置し、 さらに 4 °Cで一晩再 び静置した。 この操作をもう一度繰り返してから、 生じた沈殿を G- 3のガラスフ ィルター （フィルタ一径 30隨： 日本理化学器械 （株） 社） を通過させることによ り回収し、 1時間ァスピレーターにて吸引乾燥してから、 24時間凍結乾燥し、 水 不溶性担体に導入可能な抗体固定化用活性基である N -ヒ ドロキシメチルョ一ドア セトアミ ドを調製した。 ガラス製のフラスコに硫酸 5.7ml、 ニトロベンゼン 7.2ml及びパラホルムアル デヒ ド 0.0363gを加え、 攪拌下溶解後、 N-ヒ ドロキシメチルョ一ドアセトアミ ド 0.58gを加え攪拌した。 これにポリプロピレンからなる不織布 （平均繊維直径 3 .3 zm) 0.3g を入れ室温にて一晩反応した。 反応後不織布を取り出し、 純水にて 洗浄し、 これを真空乾燥して、 抗体固定化用活性基を導入した不織布を得た。 こ の不織布を直径 0.7cmの円に切断し、 それぞれ 4枚ずつを PBS (—） に溶解した抗 ヒ ト CD 4抗体（4H5抗体） 液 （17.7 g/ 400 zl)または実施例 9にて調製した抗 ヒ ト CD4 1本鎖抗体 （ScFv4H5LH)液 （17.7 z g/ 400 1)に室温にて 2.5時間浸 し、 抗体を固定した。 2.5時間後、 PBS (—） で洗浄した。 入口と出口を有する容 量 lmlの容器に 4枚充塡しカラムを作成した。 また比較対照として牛血清アルブ ミン（BSA; ピアス社アルブミ ンスタンダード） を抗体の代わりに同様に固定化し たカラムも作成した。
ヒ ト健常人血液より実施例 1 と同様に、 フイコールパック （フアルマシア社） を使った密度勾配遠心法により単核細胞層の細胞を回収した。 回収した細胞を PB S (―) で洗浄し、 1.2X106 個/ ml に調整した。 この単核球浮遊液 4 mlをシリ ン ジポンプを用いて流速 lm 1 /分で送液し、 上記で作製したカラムの入口より流した。 カラム出口より処理後の液を回収した。 この時の CD 4陽性細胞の比率を、 公知 のフローサイ トメ トリー法 （FACS) で測定した。 FACS解析の際の細胞の染色は FI TC標識抗 CD 4抗体 （ファーミンジヱン社） を用い、 FACSCalibur (べック トン ' ディ ッキンソン社） を用いて測定した。
第 1表にカラム通過前後での CD 4陽性細胞と他の細胞 （CD 4陰性細胞） の 比率を示した。 また、 この実施例の際の 4H5抗体固定化カラム通過後の CD 4陽 性細胞の除去率は 100%、 ScFv4H5LH 固定化カラム通過後の C D 4陽性細胞の除 去率は 99.9%であった。 これらの結果より抗ヒ ト CD4 1本鎖抗体 （ScFv4H5LH) は 4H5抗体に比べ、 CD 4陽性細胞に対しての結合親和性および特異性が 4H5抗 体と実質的に同じ機能であることが明らかとなつた。 第 1 表
Figure imgf000049_0001
〔実施例 1 1〕
4H5 ハイプリ ドーマの取得は、 以下のようにして行った。
血液をフイコールハイパックに重層し、 遠心後、 単核白血球層を回収し、 さら に抗 CD 8抗体で CD 8陽性細胞を免疫沈降除去することで C D 4 リンパ球を濃縮し た画分を得た。 さらにこの細胞画分を PHAレクチン （ィーワイラボラ トリ一社） で刺激することで、 免疫用細胞を調製した。 その細胞を DMEM培地 （ギブコ社） で 洗浄後、 その細胞をアジュバントであるタイタ一マックス （CytRx 社） と混合し、 マウス当たり約 2 X 107 細胞を Balb/cマウス （日本チャールズリバ一社） 腹腔内 に投与し免疫した。 初回免疫から 2週間おきに追加免疫を行った。 その後初回免 疫から、 3 ヶ月後に、 同様に調製した細胞を静注にて追加免疫した。
BALB/cマウス由来の骨髄腫細胞株である NS1 細胞株 （ATCC TIB-18)は、 20% F CS添加 DMEM培地 （ギブコ社） で継代を行った。
上記の免疫動物のマウスから取得した脾臓をほぐし、 DMEM培地で洗浄しながら メッシュで濾過後、 遠心分離を行い、 脾臓細胞を分離した。 この脾臓細胞と上記 の増殖させた NS 1細胞株を混合した後、 遠心分離を行った。 混合した細胞に対し、 ポリエチレングリコール （ベ—リンガーマンハイム社） の最終濃度が 30%となる ように懸濁した。
細胞を遠心分離で分離し、 マウス脾臓細胞をフィーダ一として、 20%牛胎児血 清を含む DMEM組織培養培地 （ギブコ社） で徐々に分散させた。 そして、 平底の 96 穴マイクロタイタ一プレート （ヌンク社製） のゥエルに、 1 ゥエル当たり 106個 /100 1の細胞数の細胞を植え、 5 %の二酸化炭素中 37°Cで培養した。
細胞融合後 1 日目に、 各ゥエルに 100 / 1 の HAT培地 （上記の増殖培地に 13. 6 1 〃g/mlヒポキサンチン、 3. 88 /z g/mlチミジン及び 0. 18〃M アミノプテリンとな るようにそれぞれを補充した） を添加した。 その後 3日間は、 毎日、 約半分の H AT培地を新しい HAT培地と交換し、 更にその後は、 2〜3日ごとに同様の交換を 行った。 ハイブリ ドーマ （融合細胞） のクローンは HT培地 （アミノプテリ ンを含 まない HAT培地） で培養、 保持した。
上記のハイプリ ドーマ複数個を、 限界希釈法にてサブクロ一ニングした。 これ らのハイプリ ドーマの細胞数を、 トリパン青染料排除法及び血球計により計数を 行った。 そして、 これらのハイプリ ドーマを、 100 l の HT培地当たり、 0. 5 個 の生育細胞数の割合で懸濁し、 96穴の平底マイクロプレートの 1ゥエル当たり 100 \ ずつ分注した。 これを 2〜3日ごとに培地を交換して、 ハイプリ ドーマを増 殖させた。
得られたハイプリ ドーマの培養上清を、 ヒ ト白血球と反応させ、 ヒ ト白血球の C D 4陽性細胞を認識する抗体を検出した検出は、 FACScan (べク トンディ ッキン ソン社） で行った。 本操作により、 得られた抗体群より、 特異性、 結合性の優れ た 4H5 細胞を取得することに成功した。
〔実施例 1 2〕
4H5 抗体の生産と精製を行った。 抗ヒ ト C D 4抗体産生ハイプリ ドーマ 4H5(受 託番号 FERM BP- 6729)は、 10%ゥシ胎児血清 (FBSXICN社) を添加した DMEM培地 (GIBC0社） で培養した。 あらかじめハイプリ ドーマは、 限界希釈法で、 クローン を分離したのち、 この培養上清をヒ ト可溶性 C D 4 (リプリジ ン社） を固相化 した ELISA法にてヒ ト可溶性 C D 4への結合性の高いクローンを選択した。 この 4H5ハイプリ ドーマクローンを Balb/cマウスの腹腔内に移植後、 増殖させ、 得ら れた腹水を ProteinAセファロ一ス （ファルマンァ社） を用いたァフィ二ティ一ク 口マトグラフィ一により精製し、 4H5 抗体精製標品を得た。 〔実施例 1 3〕
実施例 1において調製したヒ ト可溶性 CD 4の PBS (—） 溶液（5.2 2/1111) を ポリスチレン 96穴プレート （NUNC社） に 50 /1 ずつ分注し、 4 °Cー晚静置するこ とによって抗原を固定化した。 上清を除去したのち 0.05% Tween20加 PBS (—）（以 下 PBS- T) 250 l で洗浄した。 ブロックエース （大日本製薬） 100 1を個々のゥ ヱルに分注し、 室温で 1時間静置することによってブロッキングを行った。 個々 のゥエルの上清を除去したのち PBS- T 250 //1 で 2回洗浄した。 上清を除去後、 様々な濃度に調整した 4H5抗体 （実施例 1 2で調製、 アイソタイプは IgGl- /c) または MT310抗体 （ダコ社、 アイソタイプは IgGl- c) の PBS (-)溶液、 50 1 ず つを分注し、 室温で 2時間静置反応した。 上清を除去したのち PBS- T 250 zl で 3回洗浄した。 上清を除去した後、 200倍に PBS- Tで希釈した biotin標識抗マウ ス IgG (H + L)抗体 （VECTOR社） 50 /1 を個々のゥエルに分注し、 室温で 1時間静 置した。 上清を除去したのち PBS-T 250 1 で 3回洗浄した。 上清を除去後、 1 00倍に PBS-Tで希釈した vectastain Elite standard kit (VECTOR 社） の A液と B液の等量混合液 50 1 を個々のゥエルに分注し、 室温で 1時間静置した。 上清 を除去したのち PBS-T 250 1 で 6回洗浄した。 上清を除去後、 オルトフヱニレ ンジァミン（SIGMA社） の PBS (—） 水溶液に 0.01%H202を添加した発色液 50 1 を 加え、 室温で 3分間反応後、 2N硫酸液 50 /1 を加え酵素反応を停止した。 このプ レートの 490nmにおける吸光度を測定した。
図 5に用いた抗体濃度（4H5抗体または MT310抗体） と吸光度の関係を示した。 4H5抗体の方が MT310抗体より低い濃度で CD 4分子を検出可能であり、 ヒ ト C D 4分子に対してより親和性の高い抗体であることが明らかとなつた。
〔実施例 1 4〕
4Ηδ 抗体 （実施例 1 2で調製、 アイソタイプは IgGl- / ) および 13B8.2抗体 （ ィムノテック社、 アイソタイプは IgGl- c) を Superdex200ゲル濾過カラム （フ アルマシア社） と SMARTsystem (フアルマシア社） を用いて、 10mM酢酸緩衝液 pH = 5.0 に buffer置換した。 この抗体液（100〃 g/ml、 70〃 1)をセンサ一チップ CM5(フ アルマシア社） のそれぞれ異なるレーンに 5 zl/min で送液することによりアミ ンカップリング法にて固定化し、 抗ヒ ト CD 4抗体固定化センサ一チップを得た ( 次に実施例 1において調製したヒ ト可溶性 CD 4を Superdex200ゲル濾過カラム
(フアルマシア社） と SMARTsystem (フアルマシア社） を用いて、 HBSbuffer (ファ ルマシア社） に buffer置換した。 BIA- core2000 (フアルマシア社） を用いて、 先 に作製した抗体固定化センサーチップ上にこのヒ ト可溶性 CD 4液 （15.2〃g/nil、 20〃 1)をアナライ 卜として、 5 zl/min でセンサーチップの各レーンに送液し結 合時のセンサグラムを得た。 その後 HBSbufferのみを 5 χ ΐ/min でセンサ一チッ プの各レーンに送液し解離時のセンサグラムを得た。 このセンサグラムの解析に よりヒ ト可溶性 CD 4と抗ヒ ト CD 4抗体との解離定数 （KD： この値が低いほど 結合親和性は高い） を得た。
その結果、 4H5 抗体は KD=1.71X10— 9M (Kon= 1.35 x 105M— 1 · S— '、 Koff = 2. 31X10- 4 S—1) であり、 13B8.2抗体では KD=7.58X10一9 M (Kon= 1.82 x 104M" 1 · S一1、 Koff=1.38xi0— 4S— であった。 しかるに解離定数の比較より、 4H5 抗体 は 13B8.2抗体より、 ヒ ト可溶性 CD 4に対しての結合親和性が約 4.4倍高いこと が判った。
〔実施例 1 5〕
安定な抗 CD 4抗体含有製剤を製造した。 実施例 1 2で得た 4H5抗体をゲルろ 過により lOOmM塩化ナトリゥムを含む 20mMリン酸緩衝液、 pH = 7.4(PBS)に無菌的 に置換し、 その 4H5抗体 1 mgとヒ ト血清アルブミン 200mgを PBS に混合し 2 mlと し、 ガラスバイアル瓶に無菌的に注入し密栓した。
〔実施例 1 6〕
安定なヒ トマウスキメラ抗 CD 4抗体含有製剤を製造した。 実施例 4で得たキ メラ 4H5抗体をゲルろ過により lOOmM塩化ナトリゥムを含む 20mMリン酸緩衝液、 pH = 7.4(PBS)に無菌的に置換し、 そのキメラ 4H5抗体 1 mgとヒ ト血清アルブミン 200mgを PBS に混合し 2 mlとし、 ガラスバイアル瓶に無菌的に注入し密栓した。 〔実施例 1 7〕
安定な 1本鎖抗 C D 4抗体含有製剤を製造した。 実施例 9で得た抗ヒ ト C D 4 1本鎖抗体 （ScFv4H5LH)をゲルろ過により lOOmM塩化ナ卜リゥムを含む 20mMリン 酸緩衝液、 PH = 7.4 (PBS) に無菌的に置換し、 その 1本鎖抗体 500マイクログラ ムとヒ ト血清アルブミン 200mgを PBS に混合し 2 mlとし、 ガラスバイアル瓶に無 菌的に注入し密栓した。
〔実施例 1 8〕
抗体遺伝子を単離するためハイプリ ドーマ Anti-My- 10(ATCC HB- 8483)は、 10% 牛胎児血清 （Flow社） を添加した、 RPMI-1640 培地（Gibco社） で培養した。 あら かじめハイプリ ドーマは、 限外希釈法で、 クローンを分離し、 培養上清を測定し ヒ ト急性骨髄性白血病細胞 KG- la への結合性の高いクローンを選択した。 この細 胞 6X107 から Total RNA を AG P C法 (Chomczynski, P. and Sacchi,N. (1987)S ingle-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-PhOH- chloroform extraction. Anal. Biochem.162， 156-159. )にて分離した。 さらに、 分 離した RNA から mRNAを QuickPrep mRNA Purification Kit (フアルマシア社) を使用 し単離した。 得られた mRNAを鋅型として、 1st strand cDNA を合成した。 これは、 cDNA Synthesis Kit (フアルマシア社） を使用し、 添付の説明書に従い行った。 その後、 P CR法により、 目的の遺伝子の増幅を行った。 プライマ一は、 マウ ス抗体遺伝子 c DN Aが合成しうる配列候捕を Sequences of Proteins of Immu nological Interest, 5th edition, 1991(USA NIH 発行） に掲載されたマウス抗 体可変領域の遺伝子配列を参考にして複数合成し、 それらプライマ一を組み合わ せた PCR 法を行った。 H鎖の取得に関し核酸配列 (5' GTCCCAGGATCCTCTGAAGCAGTC AGGCCC3' ) 及び（5' 0八0 060((^01^0171700(^½00 0 3')を、 L鎖の取得に関し ( 5' TGTGCCCTCGAGGTGACTCAAACTCCACTCTC3' ) 及び （5' ATGGATACTAGTGGTGCAGCATCAGC CC3') の配列を持つプライマーから遺伝子が増幅された。 増幅された遺伝子断片 は、 TAdoning kit (インビトロジェン社） を使用し、 クロ一ニングした。 これら 得られた遺伝子の H鎖及び L鎖の可変領域塩基配列を決定した。 塩基配列の決定 は DN Aシークェンサ一 Ver.1.2.0， Model373A (Applied Biosystems 社） を用 い、 メーカ一のプロ トコールに従って行った。 標識反応は、 H鎖は核酸配列 （5' CTCTTGGAGGAGGGTGCCAG3' ) を、 鎖は核酸配列（5， CCAGATTTCAACTGCTCATCAGA3' ) プライマーとして、 PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Terminator Cycle Seque ncing KitCApplied Biosystems社） を用い、 方法は添付のプロ トコ一ルに従った c 染色は、 AB I社のラベリングキッ トを利用した。 その結果、 H鎖のプライマ一 から得られた遺伝子断片を配列表配列番号 39、 L鎖のプライマーから得られた遺 伝子断片を配列表配列番号 40に示した。
〔実施例 1 9〕
実施例 1 8で得られた抗 CD 3 4抗体の H鎖 L鎖可変領域塩基配列を含む遺伝 子断片を pGl プラスミ ドへ組み込み、 抗 CD34抗体を発現可能なプラスミ ドを作 製した。 クローンのプラスミ ド DN Aの L鎖を制限酵素 Xhol (宝酒造社） 及び S peK宝酒造社） で消化後、 0.7 %ァガロース電気泳動ゲルにて展開し、 L鎖可変 領域塩基配列を含む D N A断片を切り出し抽出した。 ァガロースゲルからの D N A断片の抽出には、 GeneCleanll Kit (フナコシ社） を用い、 添付のプロ トコール に従って操作を行った。 次に、 ベクタ一 pGl を制限酵素 Xhol及び Spelで消化後、 0.7 %ァガロースゲルにて同様に切り出し抽出したものと連結した。 次にクロ一 ンのプラスミ ド DNAの H鎖可変領域塩基配列を含む DNA断片を制限酵素 Apa K宝酒造社） 及び BamHI (宝酒造社） で切り出し抽出した。 ァガロース電気泳動ゲ ルからの DNA断片の抽出には、 GeneCleanll K （フナコシ社） を用い、 添付の プロ トコールに従って操作を行った。 次に、 上記で H鎖可変領域塩基配列を含む DNA断片が挿入されたベクター p G 1を制限酵素 Apal及び BamHI で消化後、 0. 7 %ァガロース電気泳動ゲルから同様に切り出し抽出したものと連結し、 連結反 応物を大腸菌 JM109 株へ導入した。 この連結反応には、 ライゲ一シヨンキッ ト ver.2(宝酒造社） を用いた。 形質転換した大腸菌をアンピシリン含有 L Bプレー 卜に蒔いて一晩培養し、 出現したコロニーの中から数個を選び、 常法に従ってプ ラスミ ド DNAを抽出精製した。 これらを組み込みに用いた制限酵素 Xhol 及び Apal にて消化し、 H鎖及び L鎖可変領域塩基配列を含む断片が挿入されたもの を選び出した。 以上の方法にて得られた分泌型抗体発現プラスミ ドを pGlMylO と し
〔実施例 2 0〕
実施例 1 9にて得られた分泌型抗体発現プラスミ ド pGlMylO を、 DEAEデキスト ラン法（Beb- bington， R. (1991); METHODS： ACompa-nion to Methods in Enzymo logy ,2(2), 136-45.) にてそれぞれ C0S7細胞へ導入した。 C0S7細胞を 10%ゥシ胎 児血清（FCS) 加 Dulbecco's Modified Eagle's MediumCDMEM) にて、 遺伝子組み 込みの 4日前に直径 100腿 のディ ッシュあたり約 6. lxlO5 細胞/ 10ml となるよう 蒔き直し、 培養した。 4日後、 まず上清を除き、 リン酸緩衝生理食塩水 （カルシ ゥム、 マグネシウム不含）（PBS (—））にて細胞を静かに洗浄して、 4ml の 10%F C S加 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)を加え、 次いで DEAEデキスト ラン Z分泌型抗体発現プラスミ ド混合液を細胞へ均一にふりかけて、 37°Cで 4時 間インキュベートした。 この混合液は 20mg/ml の DEAEデキストラン （フアルマシ ァ社 Code No.1703 50 - 01， Lot. PF97323)水溶液と、 分泌型抗体プラスミ ドを TB S(-)(20mM Tris · HCl(pH7.4), 0.15M NaCl)により 0.17〃 g/〃 1 とした溶液を 2 ： 1 (v/v) で混合したものであり、 ディ ッシュあたり 180 1 を添加する。 ィ ンキュベーシヨン後、 上清を捨て、 10%ジメチルスルフォキシド（DMS0)添加 PBS( 一） 5mlを加えて 1分静置した。 次いで上清を捨て、 PBS (—） で洗浄後、 100 /M クロ口キン（Sigma社 No. C6628)入りの 2 % FCS添加 DMEM7mlを加え、 37°Cで 3時 間インキュベートした。 その後、 上清を捨て、 PBS (—） で洗浄して、 10% FCS添 加 DMEM 10mlを加え、 培養した。 翌日、 PBS (—） 及び DMEMにて FCS添加 DMEM を よく除去した後、 無血清の DMEMlOmlを加え、 生産を開始した。 生産開始から 3日後培養上清を回収し、 以後約 2週間生産を続けた。 得られた 培養上清を集め、 プロテイン Gセファロースカラムクロマトグラフィーにより精 製し、 これをヒ ト、 マウスキメラ抗 C D 34抗体の精製標品とした。
精製標品の C D 34抗原への結合は次の方法により確認した。 1. 5ml チューブに 培養細胞 KGlaを lxlO6 個調製し、 細胞懸濁液 （2 % FCS添加 PBS (—））で 2回洗浄 した。 洗浄した細胞に細胞懸濁液を 50 1添加し懸濁した。 これに精製標品を 1 g加え、 氷中で 30分間静置した。 その後さらに細胞懸濁液で 3回洗浄を行った 後、 細胞懸濁液を 50 1添加し懸濁する。 これに FITC標識ャギ抗ヒ ト IgG(Fc) 抗 体（1/20 希釈 Immunotec社） を 1 g加え氷中で 30分間静置した。 その後さらに 細胞懸濁液で 3回洗浄を行った後、 細胞懸濁液を 300 1添加し懸濁する。 以上 の処理を行った細胞にフローサイ トメ一タ一 （べク トンディ ツキンソン社） でレ 一ザ一光を照射することにより細胞上に結合した抗体量を蛍光にて測定した。 対 照として、 精製標品の代わりにミエローマ由来ヒ ト IgG 抗体を 1 a g加え、 同様 の操作で細胞を処理した。 第 6図に、 精製標品の C D 34抗原への結合を示した。 抗 C D 34抗体 pGlMYlO 由来の精製標品は C D 34抗原への結合活性を保持している ことが確認され、 本ヒ ト、 マウスキメラ抗 C D 34抗体は、 C D 34抗原に対する結 合活性があることが実証された。 また、 本精製標品によって、 C D 34陽性細胞を 検出しうることを確認した。
〔実施例 2 1〕
抗体遺伝子を ScFv抗体産生用ベクターに組み込むため、 実施例 1 9で得た遺伝 子を制限酵素配列を含むプライマーを使用し、 PCR 法で増幅させた。 H鎖用ブラ イマ一の核酸配列は、 (5， GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGAAGCAGTCAG 3' )及 び (5' AGACGGTGACCGTGGTGCCTTGGCCCC3' ), L鎖用プライマーの核酸配列は、 (5' TCGAGCTCACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCT3' ) 、 及び (5' CACCTGCGGCCGCCCGTTTCAGCTC 3' ) を使用した。 P C R条件は GeneAmp PCR Reagent Ki t wi th Ampl iTaq DNA P olymerase (宝酒造社） を用い、 94°C 1分、 55°C 1分、 72°C 2分を 1サイクルとし て、 30サイクル行った。 P CR装置は、 型名 DNA Thermal Cycler 480 (パー キンエルマ一社） を使用した。 この増幅した遺伝子を H鎖は制限酵素 SfiK東洋 紡社） 及び BstP (宝酒造社） で消化し、 L鎖は制限酵素 SacK宝酒造社） 及び No tl (宝酒造社） で消化した後、 1.5 %ァガロースゲルにて電気泳動し各々の DN A断片を切り出し抽出した。 ァガロースゲルからの DN A断片の抽出には、 Gene Cleanll Kit (フナコシ社） を用いて行った。
ScFv抗体を産生するベクターは、 抗 CD 34抗体遺伝子を導入する前にあらかじ め任意の抗体遺伝子を産生するプラスミ ドの作成を行った。 Recombinant Phage Antibody System キッ ト （フアルマシア社） を用いて、 抗体を産生するハイブリ ドーマの任意の遺伝子を組み込んだ。 そのベクターの作成方法は、 このキッ トに 添付された説明書に従った。
この任意の抗体遺伝子を含むプラスミ ドを、 制限酵素 Sacl (宝酒造社） 及び N otl (宝酒造社） で消化後 0.8%ァガロースゲルにて電気泳動し、 L鎖領域が欠失 したベクター DNA断片を抽出精製した。 この DNA断片と、 先に調製した抗 C D34抗体の L鎖遺伝子を連結して L鎖遺伝子を組み入れた。 次に、 L鎖が入れ替 わったプラスミ ドを制限酵素 Sfil (東洋紡社） 及び、 BstPK宝酒造社） で消化後 0.8%ァガロースゲルにて電気泳動し、 H鎖領域が欠失したべクタ一 DNA断片 を抽出精製した。 この DNA断片と、 先に調製した抗 CD34抗体の H鎖遺伝子を 連結して H鎖遺伝子を組み入れた。 各々のライゲーシヨンは、 ライゲ一シヨン Ve r.2 キッ ト （宝酒造社） を使用した。 またァガロースゲルからの DNA断片の抽 出には、 GeneCleanll Kit (フナコシ社） を用い行った。 以上の操作によって得ら れたプラスミ ドを大腸菌 HB215 フアルマシア社） へ導入した。 形質転換した大 腸菌をアンピシリ ン含有 2 % Glucose加 2xYTプレートに蒔いて一晩培養し、 出現 したコロニーの中から数個を選び、 常法に従ってプラスミ ド DNAを抽出精製し た。 適当な制限酵素を用いてこれらプラスミ ドの切断パターンを調べ、 予想され たパターンに一致したものを選び出した。 以上の操作によって得られた、 抗 CD 34抗体の配列を有す ScFv抗体を発現するプラスミ ドを pCANMYlOとした。
上記プラスミ ドでトランスフォームした大腸菌を 2 %Glucose 添加 100 zg/ml アンピシリン添加 S B培地 （3.5 %パク ト トリプトン、 2 %バク トイース トヱキ ストラク ト、 0.5 % NaCl)にて培養した。 翌日この一部を 10倍量の上記培地に加 え、 1時間培養した後遠心し、 その上清を除き、 lmMの IPTG、 100 ig/mlアンピ シリ ン添加 S B培地の等量に換えて、 さらに 3時間培養した後、 菌体を RPAS Pur if ication Module (フアルマシア社） のプロ トコ一ルに従って処理することによ り、 ペリブラズム中の抗体を回収した。 得られた抗体粗画分を E t a g抗体カラ ム （フアルマシア社） で精製した。 このカラムによる精製は添付のプロ トコ一ル に従い、 付属の試薬を利用して行った。 以上の操作により S c Fv抗体精製標品 を得た。
〔実施例 2 2〕
実施例 2 1にて得た抗 CD34ScFv抗体精製標品を使用し、 ヒ ト CD34抗原の検 出を行った。 lxlO7 個の KG- la細胞を 0.05% Tri tonx 100 (ナカライテスク社） を含む lmlの PBS (—） で氷上 10分間処理して、 細胞膜からのタンパク質抽出を行 つた。 使用した KG- la細胞は、 10%牛胎児血清を含む RPMI- 1640培地で培養した 。 抽出液 10 1をメルカプトエタノール存在下で、 3分間沸騰処理した。 この液 を SDSポリアクリルアミ ド電気泳動ゲル （AC〖 社） を使用し展開した。 この電 気泳動は、 ゲルに添付の説明書に記載の条件で行った。 泳動後ゲル中のタンパク 質を PVDF膜（BioRad 社） にトランスファ一した。 トランスファ一は、 25mMトリス 192mM グリシン バッファ一及び Electrophoresis power Supply-EPS 600 装置 (フアルマシア社） を使用し、 100V、 1時間でトランスファ一した。 フィルター は室温で 10%スキムミルク入り PBS (—） にて 1時間ブロッキングした。 このフィ ルターは、 0.05%Tween- 20を含む PBS (—） で洗浄後、 15〃g /ml の 1本鎖抗体で 1時間反応させた。
次に、 このフィルターを洗浄後、 2次抗体として抗 E-tag 抗体 （フアルマシア 社） を 5 Ζ 3/πι1で 1時間反応させた。 さらに、 洗浄後、 3次抗体として、 バーオ キシダーゼ標識抗マウス F c抗体を 5〃g/mlで 1時間反応させた。 このフィルタ —を洗浄後、 1次抗体の結合した電気泳動のバンドは、 ECL 液 （アマシャム社） で発光させ、 高感度フィルム（Hyperf i lm_ECL : アマシャム社） で検出した。 その 結果、 ポジティブコントロールと同様約 120 Kダルトンの位置に C D 34分子のバ ンドが検出された。 ポジティブコン トロールは、 抗 HPCA- 1抗体 （べク トンディ ッ キンソン社） を 1次抗体、 パーォキシダーゼ標識抗マウス F c抗体を 2次抗体と したフィルターを同様に発色させた。 また、 ネガティブコン トロールとして 1次 抗体である 1本鎖抗体のみを除いて、 同様な処理を行った。 120Kダルトンのバン ドは、 検出できなかった。 従って、 抗 C D 34 1本鎖抗体は、 C D 34分子を検出し うることを確認した。
〔実施例 2 3〕
臍帯血 29mlをハンクスバランスド生理食塩水 （ギブコ社） で 48mlとし、 フィコ ールパック （フアルマシア社） を 3 mlずつ分注した円心管 4本に 12mlずつ分注し、 800 回転 分、 20分の条件にて分離し、 単核細胞層の細胞を回収した。 回収した 細胞をハンクス液で洗浄した。 その細胞 2. 0 X 107 個に対し、 実施例 2 0で生産 したヒ トマウスキメラ抗体 5〃g を添加し、 l l/mlで、 氷上にて 30分反応させ た。 それをハンクス液で洗浄後、 ダイナビーズ （ダイナル社） 抗ヒ ト I gビーズ 9 X 106 個を加え、 氷上で 1時間反応させた。 このダイナビーズの分離操作は、 付属のマニュアルに従った。 得られた細胞を、 14時間ダルベッコ MEM培地に 10% 牛胎児血清で 37度 5 %炭酸ガス雰囲気下で培養した。 培養後、 ピペッティ ングす ることで細胞とビーズを完全に分離させ、 ビーズは、 ダイナビーズ付属のマニュ アルに従い磁石により除去した。 回収した細胞は、 一部を使い細胞数を測定して 回収細胞数とした。 残りの細胞は、 抗 HPCA- 2抗体 （べク トン） で 30分氷上で反応 させ、 冷えた 2 %牛胎児血清を含む生理食塩水で洗浄し、 遠心機で回収した。 そ の細胞を、 コールタ一社のフローサイ トメ一ターで C D 34陽性率を測定した。 C D 34陽性率を C D 34細胞の純度とし、 C D 34陽性率と、 回収細胞数を掛けた細胞 数を回収 C D 34陽性細胞数とした。 C D 34陽性細胞の回収率は、 分離前の陽性細 胞数と回収した陽性細胞数から算出した。 その結果、 C D 34陽性細胞は、 純度 80 . 4%、 回収率 45. 3%であった。 このことから、 実施例 2 0で生産したヒ トマウス キメラ抗体は、 C D 34陽性細胞を分離することが示された。
〔実施例 2 4〕
実施例 2 0で生産したヒ トマウスキメラ抗体を結合させた抗体カラムを CNBr活 性化 Sepharose4B (フアルマシア社） を利用して作成した。 抗体の Sepharose4B ビ ーズへの結合方法は、 添付の取り扱い説明書に従った。 4. 0 mlのゲルにヒ トマゥ スキメラ抗体液を反応させ、 カツプリング効率 99. 5%の効率でァフィ二ティ一ゲ ルを作成した。 少量のガラスウールをカラム内下部に固定したガラスカラム（2cm2 X 3cm)をシリコナイズし、 このカラムに先に調製した 1 mlのゲルを詰めた細胞分 離用ゲルカラムを作成した。
臍帯血 32mlにシリカ液 （株式会社免疫生物研究所） を 3 ml加え、 37°Cで 1時間 インキュベートした。 この細胞懸濁液をハンクスバランスド生理食塩水 （ギブコ 社） で 48mlとし、 フイコールパック （フアルマシア社） を 3 mlずつ分注した円心 管 4本にこの懸濁液を 12mlずつ分注し、 800 回転 Z分、 20分の条件にて分離し、 単核細胞層の細胞を回収した。 回収した細胞をハンクス液で洗浄した。 その細胞 2. 1 X 107 個を含む l ml細胞懸濁液を上記抗体カラムに入れ、 4 °Cで弱い攪拌を しつつ 1時間反応させた。 カラムに、 10%牛胎児血清、 100 ュニッ ト /ml のべ二 シリン、 100 〃g/mlのストレプトマイシンを含むハンクスバランスド生理食塩水 を流し洗浄した。 このカラムを、 10%牛胎児血清、 100 ュニッ 卜/ mlのべニシリ ン、 100 〃g/inlのストレプトマイシンを含む M E M培地 （ギブコ社） を 2ml 加え 炭酸ガス培養器内で 37°Cで 13時間培養した。 このカラムを上下させることにより、 ゲルを多少強めに攪拌し、 カラムから培地を回収した。 さらに、 カラムに 5 mlの 10%牛胎児血清、 100 ュニッ ト /ml のペニシリン、 100 〃 g/mlのストレプトマイ シンを含むハンクスバランスド生理食塩水を流し、 その液も回収した。 これらの 回収した液中の細胞を遠心により回収した。 これらの細胞数を計測した。 残りの 細胞は、 抗 HPCA- 2抗体 （べク トン） で 30分氷上で反応させ、 冷えた 2 %牛胎児を 含む生理食塩水で洗浄し、 遠心機で回収した。 その細胞を、 コールター社のフロ —サイ トメ一ターで CD34陽性率を測定した。 CD34陽性率を CD34細胞の純度 とし、 CD34陽性率と、 回収細胞数をかけた細胞数を回収 CD34陽性細胞数とし た。 その結果、 純度 45.2%、 回収率 62.6%の結果を得た。 このことから、 ゲルを 詰めたカラム装置からなる造血未分化細胞の分離分離装置が有効であることを確
5¾、し 7こ。
〔実施例 2 5〕
臍帯血 29mlをハンクスバランスド生理食塩水 （ギブコ社） で 48mlとし、 フィコ ールパック （フアルマシア社） を 3 mlずつ分注した円心管 4本に 12mlずつ分注し、 800 回転 Z分、 20分の条件にて分離し、 単核細胞層の細胞を回収した。 回収した 細胞をハンクス液で洗浄した。 その細胞 2.0X107 個に対し、 実施例 2 1で生産 した 1本鎖抗体 25 g を添加し、 5 zl/mlで、 氷上にて 1時間反応させた。 それ をハンクス液で洗浄後、 抗 Etag (フアルマシア社） 抗体で 30分反応させた。 洗浄 後、 ダイナビーズ （ダイナル社） 抗マウス IgG ビーズ 9X106 個を加え、 氷上で 1時間反応させた。 付属のダイナビーズのマニュアルに従い、 ビーズに吸着した 細胞と共に、 このビーズを分離した。 得られた細胞を、 10%牛胎児血清を加えた ダルベッコ MEM培地で 5 %炭酸ガス雰囲気下で 37°Cで 12時間培養した。 培養後、 ピペッティングする事で細胞とビーズを完全に分離させ、 ビーズは、 ダイナビー ズ付属のマニュアルに従い磁石により除去した。 回収した細胞は、 一部を使い細 胞数を測定して回収細胞数とした。 残りの細胞は、 抗 HPCA-2抗体 （べク トン） で 30分氷上で反応させ、 冷えた 2 %牛胎児血清を含む生理食塩水で洗浄し、 遠心機 で回収した。 その細胞を、 コールタ一社のフローサイ トメ一ターで CD34陽性率 を測定した。 CD 34陽性率を CD 34細胞の純度とし、 CD 34陽性率と、 回収細胞 数をかけた細胞数を回収 C D 34陽性細胞数とした。 その結果、 純度 36. 1%、 回収 率 35. 3%であった。 このことから、 実施例 2 1で生産で生産した 1本鎖抗体した 抗体は、 C D 34陽性細胞を分離することが示された。
〔実施例 2 6〕
実施例 2 1で生産した 1本鎖抗体を結合させた抗体カラムを CNBr活性化 Sepha rose4B (フアルマシア社） を利用して作製した。 抗体の Sepharose4B ビーズへの 結合方法は、 添付の取り扱い説明書に従った。 4. 0ml のゲルに 1本鎖抗体液を反 応させ、 カップリング効率 99. 0%の効率でァフィ二ティ一ゲルを作製した。 少量 のガラスウールをカラム内下部に固定したガラスカラム（2cm2 X 4 cm) をシリコ ナイズし、 このカラムに先に調製した 1 mlのゲルを詰めたゲルカラム細胞分離装 置を作製した。
臍帯血 28mlにシリカ液 （株式会社免疫生物研究所） を 3 ml加え、 37°Cで 1時間 インキュベートした。 この細胞懸濁液をハンクスバランスド生理食塩水 （ギブコ 社） で 48mlとし、 フイコールパック （フアルマシア社） を 3 mlずつ分注した円心 管 4本にこの懸濁液を 12mlずつ分注し、 800 回転/分、 20分の条件にて分離し、 単核細胞層の細胞を回収した。 回収した細胞をハンクス液で洗浄した。 その細胞 1. 8 X 107 個を含む 1 ml細胞懸濁液を上記抗体カラムに入れ、 1時間 4度で弱い 攪拌をしつつ反応させた。 カラムに、 10%牛胎児血清、 100 ュニッ 卜/ mlのべ二 シリ ン、 100 n gl ml のス トレプトマイシンを含むハンクスバランス ド生理食塩 水を流し洗浄した。 このカラムを、 10%牛胎児血清、 100 ュニッ ト /mlのぺニシ リ ン、 100 〃g/mlのス トレプトマイシンを含む MEM培地 （ギブコ社） を 2 ml加え 炭酸ガス培養器内で 37°Cで 13時間培養した。 このカラムを上下させることにより、 ゲルを多少強めに攪拌し、 カラムから培地を回収した。 さらに、 カラムに 5 mlの 10%牛胎児血清、 100 ユニッ ト/ mlのペニシリ ン、 100 z g/mlのストレプトマイ シンを含むハンクスバランスド生理食塩水を流し、 その液も回収した。 これらの 回収した液中の細胞を遠心により回収した。 これらの細胞数を計測した。 残りの 細胞は、 抗 HPCA- 2抗体 （べク トン） で 30分氷上で反応させ、 冷えた 2 %牛胎児を 含む生理食塩水で洗浄し、 遠心機で回収した。 その細胞を、 コールター社のフロ 一サイ トメ一ターで C D 34陽性率を測定した。 C D 34陽性率を C D 34細胞の純度 とし、 C D 34陽性率と、 回収細胞数を掛けた細胞数を回収 C D 34陽性細胞数とし た。 その結果、 純度 52. 8%、 回収率 41. 0%の結果を得た。 このことから、 ゲルを 詰めたカラム装置からなる造血未分化細胞の分離分離装置が有効であることを確 ΰίϋλし 7 ο
〔実施例 2 7〕
実施例 2 1で作成した pCANMYlOベクターを改良し、 水不溶性担体への結合性を 向上しうる抗体を作成した。 1本鎖抗体のカルボキシル末端にある E- tag 配列に 続いてァミノ酸リシン残基を 3個導入した。 pCANMYlOベクターの制限酵素部位を 利用し、 P C R法でリシン残基を含む配列を導入した。 その配列を配列表 4に示 した。
このべクタ一を大腸菌 H B 2151細胞に導入し、 実施例 2 1 と同様に 1本鎖抗体 を作成した。
得られた抗体を、 1本鎖抗体を結合させた抗体カラムを C N B r活性化 Sephar ose4B (フアルマシア社製） を利用して作製した。 抗体の Sepharose4B ビーズへの 結合方法は、 添付の取り扱い説明書に従った。 4. 0ml のゲルに 1本鎖抗体液を反 応させ、 ァフィ二ティーゲルを作製した。 少量のガラスウールをカラム内下部に 固定したガラスカラム （2cm2 x 3 cm) をシリコナイズし、 このカラムに先に調製 した 1 mlのゲルを詰めたゲルカラム細胞分離装置を作製した。
臍帯血 32mlにシリカ液 （株式会社免疫生物研究所） を 3 ml加え、 1 時間 37度で インキュベートした。 この細胞懸濁液をハンクスバランスド生理食塩水 （ギブコ 社製） で 48mlとし、 フイコールパック （フアルマシア社製） を 3 mlずつ分注した 円心管 4本にこの懸濁液を 12mlずつ分注し、 800 回転 Z分、 20分の条件にて分離 し、 単核細胞層の細胞を回収した。 回収した細胞をハンクス液で洗浄した。 その 細胞 2. 1 X 107 個を含む l ml細胞懸濁液を上記抗体カラムに入れ、 1時間 4度で 弱い攪拌をしつつ反応させた。 カラムに、 10%牛胎児血清、 100 ュニッ 卜/ mlLの ぺニシリン、 100 マイクログラム /ml のス卜レプトマイシンを含むハンクスバラ ンスド生理食塩水を流し洗浄した。 このカラムを、 10%牛胎児血清、 100 ュニッ 卜/ ml のぺニシリン、 100 マイクログラム/ ml のストレプトマイシンを含む MEM 培地 （ギブコ社製） を 2 ml加え 37度炭酸ガス培養器内で 14時間培養した。 この力 ラムを上下させることにより、 ゲルを多少強めに攪拌し、 カラムから培地を回収 した。 さらに、 カラムに 5 mlの 10%牛胎児血清、 100 ュニッ ト/ ml のペニシリン、 100 マイクログラム/ ml のストレプトマイシンを含むハンクスバランスド生理食 塩水を流し、 その液も回収した。 これらの回収した液中の細胞を遠心により回収 した。 これらの細胞数を計測した。 残りの細胞は、 抗 HPCA- 2抗体 （べク トン） で 30分氷上で反応させ、 冷えた 2 %牛胎児を含む生理食塩水で洗浄し、 遠心機で回 収した。 その細胞を、 コールター社のフローサイ トメータ一で C D 34陽性率を測 定した。 C D 34陽性率を C D 34細胞の純度とし、 C D 34陽性率と、 回収細胞数を 掛けた細胞数を回収 C D 34陽性細胞数とした。 その結果、 純度 71. 0%、 回収率 52 . 0%の結果を得た。 このことから、 ゲルを詰めたカラム装置からなる造血未分化 細胞の分離装置が有効であることを確認すると共に、 カルボキシル末端にリシン 残基を導入した組換え抗体がより効率よく、 細胞を分離しうることが示された。 産業上の利用の可能性
本発明により、 C D 4陽性細胞及び C D 34陽性細胞の分離を特異的かつ効率よ く行うことが可能となった。 本発明は、 自己免疫疾患などの治療を目的とした自 己反応性抗原受容体を持った Tリンパ球の捕集、 骨髄移植用細胞からのリンパ球 除去などの分野、 さらに本発明は、 白血病などの医療を目的とした造血未分化細 胞の捕集、 骨髄移植用細胞からのリンパ球除去などの分野において有効である。 寄託された微生物への言及
ィ. 当該微生物を寄託した寄託機関の名称及びあて名 寄託機関： 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名 ： 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1 一 3
口. 寄託機関に寄託した日付
平成 1 0年 （1998年） 5月 1 4日
ハ. 寄託機関に寄託について付した受託番号
FERM BP- 6729
なお、 本寄託は平成 1 0年 （1998年） 5月 1 4日に寄託された原寄託 （受託番 号：微ェ研菌寄第 P-16807 号） より、 平成 1 1年 5月 2 1日にブタぺスト条約に 基づく寄託に移管されたものである。

Claims

請 求 の 範 囲
1. キメラ抗体、 1本鎖抗体、 またはそれらを組合せた抗体を用いた細胞分離装
2. C D 4分子に結合するキメラ抗体、 1本鎖抗体、 またはそれらを組合せた抗 体を用いた C D 4陽性細胞分離装置。
3. H鎖可変領域の CDR-1が配列表配列番号 1、 CDR-2 が配列番号 2、 CDR-3 が 配列番号 3で表されるアミノ酸配列であり、 L鎖可変領域の CDR-1が配列番号 4、 CDR- 2が配列番号 5、 CDR-3 が配列番号 6で表されるァミノ酸配列であり、 Fc領域がヒト型であるキメラ抗体を用いた C D 4陽性細胞分離装置。
4. H鎖可変領域の CDR- 1が配列表配列番号 1、 CDR- 2 が配列番号 2、 CDR-3 が 配列番号 3で表されるアミノ酸配列であり、 L鎖可変領域の CDR-1が配列番号 4、 CDR-2 が配列番号 5、 CDR- 3が配列番号 6で表されるァミノ酸配列である 1本鎖抗体を用いた C D 4陽性細胞分離装置。
5. C D 34分子に結合するキメラ抗体、 1本鎖抗体、 またはそれらを組合せた抗 体を用いた C D 34陽性細胞分離装置。
6. H鎖可変領域の CDR- 1が配列表配列番号 43、 CDR-2 が配列番号 44、 CDR-3 が 配列番号 45で表されるアミノ酸配列であり、 L鎖可変領域の CDR-1 が配列番号 46、 CDR-2 が配列番号 47、 CDR-3 が配列番号 48で表されるアミノ酸配列であり、 F c領域がヒト型である抗体を用いたヒト C D 34陽性細胞分離装置。
7. H鎖可変領域の CDR - 1 が配列表配列番号 43、 CDR-2 が配列番号 44、 CDR-3 が 配列番号 45で表されるアミノ酸配列であり、 L鎖可変領域の CDR-1が配列番号 46、 CDR-2 が配列番号 47、 CDR - 3 が配列番号 48で表されるアミノ酸配列である 1本鎖抗体を用いたヒト C D 34陽性細胞分離装置。
8. 抗体のアミノ酸配列の C末端、 N末端、 またはそれらの両者に、 塩基性アミ ノ酸または酸性ァミノ酸を含むァミノ酸配列を付加して用いた請求項 1から 7 のいずれかに記載の細胞分離装置。
9. ポリプロピレン不織布にハロアセトアミノメチル化剤を反応させてなる活性 基にキヌラ抗体もしくは一本鎖抗体、 またはそれらを組み合わせた抗体を結合 させた請求項 1から 8の細胞分離装置。
10. キメラ抗体、 1本鎖抗体、 またはそれらを組合せた抗体を用いた細胞分離ま たは検出方法。
11. C D 4分子に結合するキメラ抗体、 1本鎖抗体、 またはそれらを組み合わせ た抗体を用いたヒ ト C D 4陽性細胞の分離または検出方法。
12. H鎖可変領域の CDR- 1が配列表配列番号 1、 CDR-2 が配列番号 2、 CDR-3が 配列番号 3で表されるアミノ酸配列であり、 L鎖可変領域の CDR-1が配列番号 4、 CDR-2 が配列番号 5、 CDR- 3が配列番号 6で表されるァミノ酸配列であり、 Fc領域がヒ ト型であるキメラ抗体を用いたヒ ト C D 4陽性細胞の分離または検 出方法。
13. H鎖可変領域の CDR-1が配列表配列番号 1、 CDR-2 が配列番号 2、 CDR- 3が 配列番号 3で表されるアミノ酸配列であり、 L鎖可変領域の CDR-1が配列番号
4、 CDR-2 が配列番号 5、 CDR- 3が配列番号 6で表されるァミノ酸配列を含有 する 1本鎖抗体を用いたヒ ト C D 4陽性細胞の分離または検出方法。
14. C D 34分子に結合するキメラ抗体、 1本鎖抗体、 またはそれらを組合せた抗 体を用いたヒ ト C D 34陽性細胞の分離または検出方法。
15. H鎖可変領域の CDR-1が配列表配列番号 43、 CDR-2 が配列番号 44、 CDR-3 が 配列番号 45で表されるアミノ酸配列であり、 L鎖可変領域の CDR- 1 が配列番号 46、 CDR-2 が配列番号 47、 CDR-3 が配列番号 48で表されるアミノ酸配列であり、 F c領域がヒ ト型である抗体を用いたヒ ト C D 34陽性細胞の分離または検出方 法。
16. H鎖可変領域の CDR- 1が配列表配列番号 43、 CDR-2 が配列番号 44、 CDR - 3 が 配列番号 45で表されるアミノ酸配列であり、 L鎖可変領域の CDR- 1が配列番号 46、 CDR-2 が配列番号、 47、 CDR-3 が配列番号 48で表されるアミノ酸配列を含 有する 1本鎖抗体を用いたヒト C D 34陽性細胞分離または検出方法。
17. 抗体のアミノ酸配列の C末端、 N末端またはそれらの両者に、 塩基性ァミノ 酸または酸性ァミノ酸を含むァミノ酸配列を付加して用いた請求項 1 0から 1 6のいずれかに記載の細胞分離または検出方法。
18. H鎖可変領域の CDR- 1、 CDR-2 および CDR- 3がそれぞれ配列表配列番号 1 、
2および 3に記載のァミノ酸配列であり、 CD4抗原に対して親和性を有する抗 体。
19. L鎖可変領域の CDR- 1、 CDR-2 および CDR-3がそれぞれ配列表配列番号 4 、
5および 6に記載のァミノ酸配列であり、 CD4抗原に対して親和性を有する抗 体。
20. 受託番号が FERM BP- 6729であるハイブリ ドーマ 4H5 により産生される、 C D 4抗原に対するモノクローナル抗体。
21. 請求項 1 8から 2 0のいずれかに記載の抗体をコードする核酸。
22. 配列表配列番号 7および配列番号 8に記載の塩基配列を含有する、 請求項 2 1に記載の核酸。
23. 請求項 2 1または 2 2に記載の核酸を用いた抗体の生産方法。
24. 請求項 2 3の方法によって得ることができ、 CD4抗原に対して親和性を有す る組換え抗体。
25. 抗体の Fc領域がヒト型である請求項 2 4に記載の組換え抗体。
26. 抗体が 1本鎖抗体である請求項 2 4に記載の組換え抗体。
27. 請求項 1 8から 2 0のいずれかに記載の抗体と、 医薬的に許容しうる担体と からなる医薬組成物。
28. 請求項 2 4から 2 6のいずれかに記載の組換え抗体と、 医薬的に許容しうる 担体とからなる医薬組成物。
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