KR20240021289A - Bcma 및 cd3에 결합하는 이중특이성 항체 및 그 제조 방법과 응용 - Google Patents

Bcma 및 cd3에 결합하는 이중특이성 항체 및 그 제조 방법과 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 BCMA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체 및 그 제조 방법과 응용을 제공한다. 본 발명은 BCMA 및 CD3에 동시에 결합할 수 있고, 특이적인 표적 작용을 가지며, 지향성 면역 반응을 효율적으로 자극할 수 있는 이중특이성 항체를 제공한다. 상기 이중특이성 항체는 항-CD3 항체 및 항-BCMA 항체의 생물학적 기능을 잘 유지하여, 하나의 이중특이성 항체 분자가 동시에 BCMA 및 CD3에 표적화된 방식으로 결합하는 우수한 생물학적 기능을 실현하였으며, 종양 세포와 면역 효과기세포 사이에 브릿지(bridge)를 형성할 수 있으며, 면역 효과기세포 및 지향성 면역 반응을 효과적으로 활성화하여, 종양 세포를 사멸하는 면역 세포의 효능을 현저히 향상시켰으며, 높은 표적세포 사멸 효율을 가지며, 이와 동시에 ADCC 효과를 최소화하며, 높은 안전성을 가지며, 종양의 면역 요법에서 우수한 응용 전망이 있다.

Description

BCMA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체 및 그 제조 방법과 응용
본 출원은 2021년 6월 24일자로 제출한 특허 명칭이 "BCMA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체 및 그 제조 방법과 응용"인 제202110704255.6호 중국 특허출원의 우선권을 주장하며, 그 모든 개시 내용은 참고문헌으로 본 특허출원에 병합된다.
본 발명은 유전공학 항체의 기술분야에 관한 것으로, 구체적으로 BCMA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체 및 그 제조 방법과 응용에 관한 것이다.
단일클론 항체는 임상에서 종양 치료, 면역질환 치료 및 항감염 치료에 사용될 수 있다. 그중, 종양 치료는 현재 단일클론 항체가 가장 널리 응용되고 있는 분야이며, 단일클론 항체의 종양 치료는 병변 세포의 특이적 표적에 대해 면역 시스템을 자극하여 표적세포를 사멸하는 면역 요법이다. 단일클론 항체를 기반으로, 약효를 더 향상시키고 독성 부작용을 감소시키기 위하여, 항체 약물 접합체(Antibody drug conjugate, ADC), 이중특이성 항체(bispecific antibody, bsAb) 및 CAR-T(chimeric antigen receptor T cells) 등과 같은 신규 단백질 및 세포 약물을 포함하는 단일클론 항체를 기반으로 하는 신규 항체 약물이 매우 신속하게 발전하고 있다. 여기서, 이중특이성을 기반으로 구축한 cell-bridging 이중항체는 면역 T 세포 및 암 표적세포를 연결하는 능력으로 인해, 사멸 활성 및 특이성을 현저히 향상시켰으며, 획기적인 임상적 가치를 갖고 있어, 특별한 주목을 받고 있다. 다발성골수종에 있어서, BCMA를 표적으로 하는 상기 특성을 갖는 cell-bridging 이중항체는 항체 치료 효과를 개선하는 발전 방향 중 하나로서, 현재 항체 공학 연구 분야에서 주목받고 있다.
T 세포 표면의 CD3 분자는 δ, ε, γ, ζ의 4개의 서브유닛으로 구성되었고, 분자 질량은 각각 18.9kDa, 23.1kDa, 20.5kDa 및 18.7kDa이고, 길이는 각각 171개, 207개, 182개, 164개의 아미노산 잔기이다. 이들은 함께 6개의 펩타이드 사슬을 형성하며, 종종 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR)에 밀접히 결합되여 8개의 펩타이드 사슬을 함유하는 TCR-CD3 복합체를 형성하며, 그 구조의 모식도는 도 1의 A에 나타낸 바와 같다. 상기 복합체는 T 세포 활성화, 신호 전달 및 TCR 구조 안정화 기능을 가지고 있다. CD3 세포질 부분에는 ITAM(immunoreceptor tyrosine-based activation motif)이 함유되어 있으며, TCR은 MHC(major histo-compatibility complex) 분자가 제시하는 항원 펩타이드를 식별 및 결합하여, CD3의 ITAM의 보존 서열의 티로신 잔기가 T 세포 내 티로신 단백질 키나제 p56lck에 의해 인산화되며, 그 다음 SH2(Scr homology 2) 도메인을 함유하는 기타 티로신 단백질 키나제(예를 들어, ZAP-70)를 모집한다. ITAM의 인산화 및 ZAP-70에 대한 결합은 T 세포 활성화 신호 전달 과정의 초기 단계의 중요한 생화학 반응 중 하나이다. 따라서, CD3 분자의 기능은 TCR에 의한 항원 식별에 의해 생성되는 활성화 신호를 전달하는 것이다.
BCMA(즉, B 세포 성숙 항원, TNFRSF17, CD269)는 분화된 형질 세포에서 우선적으로 발현되는 종양 괴사(TNF) 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 비글리코실화 I형 막횡단 단백질로서, B 세포의 성숙, 성장 및 생존에 관여한다. 최초 보도된 바에 따르면, BCMA는 인간 성숙 B 림프구의 골지체 내 통합 막 단백질, 즉, 세포 내 단백질이며, 이는 BCMA가 B 세포 배양 및 항상성에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다는 것을 나타낸다.
BCMA의 발현은 B세포 계보로 제한되고, 주로 형질세포 및 형질모세포(plasma blasts)에 존재하고(도 1의 B), 일정 정도 기억 B세포에 존재하지만, 실제로 말초 B세포에는 존재하지 않는다. BCMA는 다발성골수종(MM) 세포에서도 발현된다. BCMA는 그 패밀리 구성원인 막횡단 활성화제 및 시클로필린 리간드 상호작용 인자(TACI) 및 TNF 패밀리 수용체(BAFF-R)의 B세포 활성화 인자와 함께 체액성 면역, B세포 발육 및 항상성의 다양한 방면을 조절한다. BCMA는 TNF 슈퍼패밀리의 두 가지 리간드의 수용체이다(도 1의 C): APRIL(증식 유도 리간드, CD256, TNFSF13), BCMA의 고친화력 리간드, 및 B 세포 활성화 인자 BAFF(THANK, BlyS, B 림프구 자극 인자, TALL-1 및 zTNF4), BCMA의 저친화력 리간드. APRIL 및 BAFF는 구조적 유사성, 및 중첩되지만 상이한 수용체 결합 특이성을 나타낸다. 음성 조절인자 TACI는 BAFF 및 APRIL 양자에도 결합한다. APRIL 및 BAFF와 BCMA 및/또는 TACI의 배위 결합은 전사 인자 NF-κB를 활성화시키고, 생존 촉진 Bcl-2 패밀리 구성원(예를 들어, Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, A1)의 발현을 증가시키고, 세포사멸 촉진 인자(예를 들어, Bid, Bad, Bik, Bim 등)의 발현을 하향 조절하여, 세포 사멸을 억제하고 생존을 촉진한다. 이 조합의 작용은 B 세포 분화, 증식, 생존 및 항체 생성을 촉진하는 것이다. BCMA의 발현은 B 세포 분화 작용의 후기 단계에서 발생하며 골수 내 형질모세포와 형질세포의 장기 생존에 유리하다.
BCMA는 매우 중요한 B 세포 바이오마커로서, MM 세포의 표면에 광범위하게 존재하며, MM 및 기타 혈액학적 악성 종양의 유력한 면역 요법 표적이다. BCMA는 3회 연속 ASCO 연차총회에서 업계의 주목을 받았다. 미국 암 연구소(CRI)의 최신 분석에 따르면, BCMA는 CD19에 이어 두 번째로 주목받는 항암 세포 요법의 표적이 되었다. MM은 이질적인 질환이며, 주로 t(11;14), t(4;14), t(8;14), del(13), del(17)(기타 제외)의 염색체 전좌에 의해 발생된다. MM 환자는 골수 침윤, 뼈 파괴, 신부전, 면역 결핍 및 암 진단에 따른 심리적 부담으로 인해 다양한 질환 관련 증상을 경험할 수 있다.
MM의 경우, 화학요법 및 줄기세포 이식의 치료 방법은 생존율을 향상시킬 수 있지만, 종종 유해한 부작용이 동반되기 때문에, MM은 여전히 치료하기 어렵다. 화학요법, 프로테아좀 억제제, 면역조절제인 탈리도마이드 유도체 및 CD38 표적 항체의 방면에서 큰 진전이 있음에도 불구하고, 거의 모든 환자는 결국 재발한다. 따라서, 해당 분야에서 신규 약물에 대한 수요는 여전히 시급한 상황이다. 현재까지, 다발성골수종 환자에게 가장 흔히 사용되는 두 가지 치료 선택 사항은 스테로이드, 탈리도마이드, 레날리도마이드, 보르테조밉 또는 다양한 세포독성제의 조합, 및 젊은 환자의 경우 고용량 화학요법 이념과 자가 줄기세포 이식을 배합하는 것이다. 대부분의 이식은 자가 이식이며, 즉 환자 자신의 세포를 사용한다. 이러한 이식은 완치적이지는 않지만, 선택된 환자의 수명을 연장시키는 것으로 나타났다. 이는 새로 진단된 환자에 대해 초기 요법으로 사용되거나 재발 시 사용될 수 있다. 때로는 적절한 질환 통제를 위해, 선택된 환자에게 1종 이상의 이식이 제안될 수도 있다. 이 질환의 치료에 사용되는 화학요법제는 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 멜팔란을 포함하고, 이들 화학요법제와 탈리도마이드, 레날리도마이드, 보르테조밉, 및 코르티코스테로이드(예를 들어, 덱사메타손)와 같은 면역조절제의 조합 요법은 새로 진단된 환자 및 화학요법이나 이식에 모두 실패한 말기 환자의 골수종을 치료하기 위한 중요한 선택이 되었다.
현재 MM에 대한 치료법은 통상적으로 비완치적이다. 줄기세포 이식은 고령, 기타 심각한 질환의 존재 또는 기타 신체적 제한으로 인해 대부분의 환자에게 적합한 선택 사항이 아닐 수 있다. 화학요법은 다발성골수종을 부분적으로만 제어할 수 있으며, 완전한 완화를 실현하는 경우는 거의 없다. 따라서, 새로운 혁신적인 치료법이 시급히 필요하다.
길항형 BCMA-특이성 항체는 정상 및 악성 B 세포에서 강력한 생존 촉진 신호 전달 경로와 관련된 NF-κB 활성화를 차단할 수 있다.
혈행성 종양 또는 자가면역 질환 방면에 대한 기타 방법은 BAFF 및 APRIL(즉, TNF 리간드 슈퍼패밀리의 리간드)과 BAFF 및/또는 APRIL에 의해 활성화되는 수용체 TACI, BAFF-R 및 BCMA 사이의 상호 작용에 중점을 두었다. 예를 들어, 인간 면역글로불린의 Fc-도메인을 Zymogenetics사의 TACI에 융합시켜 atacicept(TACI-Ig)을 생성하고, 이로써 두 리간드를 중화시키고 수용체 활성화를 방지한다. atacicept는 현재 전신홍반루푸스(SLE, 3상), 다발성경화증(MS, 2상) 및 류마티스관절염(RA, 2상) 치료를 위한 임상시험을 진행 중이며, B 세포 악성 종양 만성 림프구성 백혈병(CLL), 비호지킨 림프종(NHL) 및 MM 치료를 위한 1상 임상시험을 진행 중이다. 전임상 연구에서, atacicept는 in vitro 및 in vivo에서 초기 MM 세포 및 MM 세포주의 성장과 생존을 감소시켰으며, 이는 MM 세포에 대한 TACI 리간드의 관련성을 나타낸다. 대부분의 MM 세포와 그 파생 세포주는 모두 BCMA 및 TACI를 발현하며, 양자의 수용체는 리간드 매개 성장 및 생존에 유리할 수 있다. 이러한 데이터는 BCMA 및 TACI에 대한 길항 작용이 형질세포 질환의 치료에 유익할 수 있음을 나타낸다. 또한, 이미 TACI와 교차반응하는 BCMA-특이성 항체를 기술하였다(WO02/066516).
Human Genome Sciences사 및 GlaxoSmithKline은 벨리무맙(belimumab)이라 불리우는 BAFF를 표적으로 하는 항체를 개발하였다. 벨리무맙은 가용성 BAFF와 이의 수용체인 BAFF-R, BCMA 및 TACI가 B세포에서 결합하는 것을 차단한다. 벨리무맙은 B세포와 직접 결합하지는 않지만, BAFF와의 결합을 통해 자가반응성 B세포를 포함한 B세포의 생존을 억제하고, B세포가 면역글로불린을 생산하는 형질세포로 분화하는 것을 감소시킨다.
그러나, BCMA, BAFF-R 및 TACI(즉, TNF 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 B 세포 수용체)와 이들의 리간드 BAFF 및 APRIL이 암 및/또는 자가면역 질환에 대한 치료 방안에 순응한다는 사실에도 불구하고, 여전히 이러한 의학적 질환을 치료하기 위한 기타 이용 가능한 선택 사항이 필요하다.
본 발명의 제1 목적은 BCMA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체 및 그 활성 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 제2 목적은 상기 항체 또는 그 활성 단편을 코딩하는 핵산을 제공하는 것이다.
본 발명의 제3 목적은 상기 항체 또는 그 활성 단편의 용도를 제공하는 것이다.
구체적으로, 본 발명은 다음과 같은 기술방안을 제공한다:
우선, 본 발명은 BCMA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체를 제공하며, 상기 이중특이성 항체는,
B 세포 성숙 항원 BCMA에 결합하는 제1 도메인, 및
T 세포 표면 항원 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하며,
제1 도메인 및 제2 도메인은 링커 펩타이드를 통해 연결되며,
제1 도메인은 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하며, 중쇄 가변영역의 CDR1, CDR2, CDR3은 각각 서열번호 4 내지 6으로 표시되는 아미노산 서열을 가지거나, 또는, 각각 서열번호 4 내지 6으로 표시되는 아미노산 서열을 참조 서열로 하고, 다음과 같은 돌연변이 중 하나 이상의 돌연변이의 조합을 함유하는 아미노산 서열을 가지며:
(1) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 S가 P 또는 K로 돌연변이;
(2) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 2번 위치의 Y가 H, D, G, M 또는 S로 돌연변이;
(3) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 3번 위치의 A가 N으로 돌연변이;
(4) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 5번 위치의 S가 H, N, A 또는 M으로 돌연변이;
(5) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치 G가 V 또는 T로 돌연변이;
(6) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 3번 위치의 I가 H로 돌연변이;
(7) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 4번 위치의 I가 D 또는 A로 돌연변이;
(8) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 5번 위치의F가 H로 돌연변이;
(9) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 7번 위치의 T가 K로 돌연변이;
(10) 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열의 4번 위치의 F가 L로 돌연변이.
제1 도메인의 경쇄 가변영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지거나, 또는, 각각 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 아미노산 서열을 참조 서열로 하고, 다음과 같은 돌연변이 중 하나 이상의 돌연변이의 조합을 함유하는 아미노산 서열을 갖는다:
(1) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 5번 위치의 S가 N, R 또는 T로 돌연변이;
(2) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 7번 위치의 L가 Q, V 또는 A로 돌연변이;
(3) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 8번 위치의 I가 S, A, R 또는 P로 돌연변이;
(4) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 10번 위치의 Y가 M, L, W 또는 T로 돌연변이;
(5) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 11번 위치의 V가 L 또는 Q로 돌연변이.
본 발명은 완전 합성 단일 사슬 인간 항체 라이브러리로부터 항-BCMA의 유전공학 단일 사슬 항체를 선별하고, 그 항체의 가변영역 유전자 서열을 얻고, 점 돌연변이 키트를 이용하여 돌연변이 라이브러리를 구축하여, 친화력이 높은 클론을 얻었으며, 이들 클론의 DNA를 혼합하고, 재조합 방식으로 단일 사슬 항체 조합 라이브러리를 조립하고, 선별 후, 인간 BCMA와 결합한 친화력이 높은 BCMA 항체를 얻었다.
본 발명에서 제공하는 항체 가변영역의 아미노산 서열 패턴은 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 이다. 본 출원에서 FR 및 CDR의 영역 구분은 Kabat 넘버링 시스템을 기반으로 한다. 여기서, FR1 내지 FR4는 4개의 프레임워크 영역을 나타내고, CDR1 내지 CDR3은 3개의 초가변 영역을 나타낸다. FR1 내지 FR4는 불변 영역 서열로부터 분리될 수 있거나(예를 들어, 인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 클래스, 서브클래스 또는 서브패밀리의 가장 많이 사용되는 아미노산), 별도의 인간 항체 프레임워크 영역으로부터 분리되거나 상이한 프레임워크 영역 유전자의 조합으로부터 얻을 수 있다.
추가적인 선별을 통해, 본 발명은 다음과 같은 BCMA에 대해 더 높은 친화력을 나타내는 제1 도메인을 갖는 이중특이성 항체를 제공한다:
BCMA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체는,
B 세포 성숙 항원 BCMA에 결합하는 제1 도메인, 및
T 세포 표면 항원 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하고,
제1 도메인 및 제2 도메인은 링커 펩타이드를 통해 연결되며,
제1 도메인은 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하며, 중쇄 가변영역의 CDR1은 서열번호 4, 7, 8 및 9 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 5 및 10 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 6 및 11 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
경쇄 가변영역의 CDR1은 서열번호 1 및 12중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 3, 13, 14, 15 및 16중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
추가적으로, 상기 BCMA에 결합하는 항체 중에서, 하기 항체는 BCMA에 대해 더 높은 친화력을 나타낸다:
중쇄 가변영역의 CDR 영역 서열은 다음 중 어느 하나이며:
(1) CDR1은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
(2) CDR1은 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
(3) CDR1은 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
(4) CDR1은 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
경쇄 가변영역의 CDR 영역 서열은 다음 중 어느 하나이다:
(1) CDR1은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
(2) CDR1은 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
(3) CDR1은 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
(4) CDR1은 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
(5) CDR1은 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
더 추가적으로, 상기 BCMA에 결합하는 항체 중에서, 하기 항체는 BCMA에 대해 더 높은 친화력을 나타낸다:
중쇄 가변영역의 CDR 및 경쇄 가변영역의 CDR은 다음 중 어느 하나이다:
(1) 중쇄 가변영역의 CDR1은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며; 경쇄 가변영역의 CDR1은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
(2) 중쇄 가변영역의 CDR1은 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 가지며; 경쇄 가변영역의 CDR1은 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
(3) 중쇄 가변영역의 CDR1은 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 가지며; 경쇄 가변영역의 CDR1은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
(4) 중쇄 가변영역의 CDR1은 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 가지며; 경쇄 가변영역의 CDR1은 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
상기 CDR의 서열을 기반으로, 다음과 같은 가변영역 서열을 갖는 항체(제1 도메인)는 BCMA에 대해 높은 친화력을 나타낸다:
중쇄 가변영역은 서열번호 17, 19 내지 21 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 가변영역은 서열번호 18, 22 내지 27 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역에 기초하여, 그 서열과 비교하여 다음 두 가지 중 적어도 하나를 만족하는 아미노산 서열도 본 발명의 보호범위에 속한다: a) 동일한 항원결정기에 결합; b) 70％, 80％, 85％, 90％, 97％, 98％ 또는 99％를 초과하는 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
추가적으로, 다음과 같은 가변영역 서열을 갖는 항체(제1 도메인)는 BCMA에 대해 더 우수한 친화력을 나타낸다:
중쇄 가변영역은 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 가변영역은 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
또는, 중쇄 가변영역은 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 가변영역은 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
또는, 중쇄 가변영역은 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 가변영역은 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
또는, 중쇄 가변영역은 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 가변영역은 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
또는, 중쇄 가변영역은 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 가변영역은 서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 이중특이성 항체에서, 제1 도메인은 2개의 완전한 중쇄-경쇄 쌍을 포함하는 BCMA에 결합할 수 있는 항체이며, 여기서, 각 경쇄와 중쇄의 쌍은 이황화 결합을 통해 연결된다.
제1 도메인의 중쇄의 Fc 단편은 인간 또는 인간화 항체(IgG1, IgG2, IgA, IgE, IgM, IgG4 또는 IgD)의 Fc 단편일 수 있다.
본 발명의 하나의 실시예로서, 제1 도메인의 중쇄의 Fc 단편은 인간 또는 인간화 IgG4 항체의 Fc 단편이다.
본 발명의 바람직한 실시예로서, 제1 도메인의 중쇄는 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄는 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며,
또는, 중쇄는 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄는 서열번호 42로 표시되는 아미노산 서열을 가지며,
또는, 중쇄는 서열번호 50으로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄는 서열번호 44로 표시되는 아미노산 서열을 가지며,
또는, 중쇄는 서열번호 51로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄는 서열번호 46으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며,
또는, 중쇄는 서열번호 52로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄는 서열번호 48로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
BCMA에 결합하는 이들 항체는 BCMA에 대해 높은 친화력을 가지며, CD3에 결합하는 항체와 이중특이성 항체를 형성할 때 두 항체의 기능이 모두 충분히 발휘되도록 확보할 수 있다.
상기 중쇄 및 경쇄 서열에 기초하여, 상기 서열과 비교하여 다음 두 가지 중 적어도 하나를 만족하는 아미노산 서열도 본 발명의 보호범위에 속한다: a) 동일한 항원결정기에 결합; b) 70％, 80％, 85％, 90％, 97％, 98％ 또는 99％를 초과하는 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
본 발명에서 제공하는 상기 인간 항-인간 BCMA 항체는 0.2 nM 내지 10 nM의 친화력으로 인간 BCMA에 결합한다. 상기 항체는 BCMA 리간드가 인간 BCMA에 결합하는 것을 억제한다. 상기 항체는 BCMA를 발현하는 세포에 결합하며, 상기 세포는 인간 다발성골수종 세포 또는 림프종 세포일 수 있다.
CD3 항원에 결합하는 제2 도메인에 있어서, 그 중쇄 가변영역은 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 가변영역은 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
바람직하게는, 제2 도메인의 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역은 링커 펩타이드를 통해 연결되어 단일 사슬 항체를 형성하고, 상기 단일 사슬 항체는 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 이중특이성 항체는 바람직하게는 다음과 같은 구조로 설계된다: 제1 도메인은 2개의 완전한 경쇄-중쇄 쌍을 포함하고, 제2 도메인은 2개의 단일 사슬 항체를 포함하고, 다음 중 어느 하나의 방식으로 연결된 대칭 구조이다:
(1) 제2 도메인의 2개의 단일 사슬 항체의 C말단은 각각 링커 펩타이드를 통해 제1 도메인의 2개의 중쇄의 N말단에 연결되며;
(2) 제2 도메인의 2개의 단일 사슬 항체의 N말단은 각각 링커 펩타이드를 통해 제1 도메인의 2개의 중쇄의 C말단에 연결된다.
본 발명은 상기 제1 도메인 및 제2 도메인의 서열에 대하여, 상기 대칭 구조를 갖는 이중특이성 항체가 기타 구조의 이중특이성 항체와 비교하여 제1 도메인 및 제2 도메인의 원래 항체의 특이적 항원 결합 능력을 더 잘 유지할 수 있으면서 BCMA 및 CD3에 결합하는 우수한 생물학적 기능을 가지며, 생산 공정 및 약용 성능 등의 방면에서 현저한 우세를 가지고 있음을 발견하였다. 본 발명은 상기 항체 분자 구조를 갖는 BCMA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체를 개발하였으며, 상기 이중특이성 항체는 특이적 표적 작용을 가지고, 지향성 면역 반응을 효율적으로 자극할 수 있으며, 종양 세포를 사멸할 수 있다.
제1 도메인과 제2 도메인을 연결하기 위한 링커 펩타이드의 아미노산 서열은 바람직하게는 (GGGGX)n이고, 여기서, X는 Gly 또는 Ser이며, n은 1 내지 4의 자연수이다.
본 발명의 바람직한 실시예로서, 링커 펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 30으로 표시된다.
상기 구조를 갖는 이중특이성 항체의 예로서, 본 발명은 인간 CD3 및 BCMA에 대한 이중특이성 항체를 제공하며, 상기 단일 사슬 항체의 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역, 및 단일클론 항체의 중쇄 및 경쇄를 갖는 구조 및 서열에 있어서, 본 발명은 CD3 및 BMCA에 동시에 결합할 수 있는 2개의 이중특이성 항체를 구축하였고, 그 구조 및 서열은 다음과 같다:
(1) 제1 도메인의 중쇄는 제2 도메인과 연결되어 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 형성하고, 제1 도메인의 경쇄는 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
(2) 제1 도메인의 중쇄는 제2 도메인과 연결되어 서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 형성하고, 제1 도메인의 경쇄는 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
(3) 제1 도메인의 중쇄는 제2 도메인과 링커 펩타이드를 통해 연결된 후 서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄는 서열번호 42로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
(4) 제1 도메인의 중쇄는 제2 도메인과 링커 펩타이드를 통해 연결된 후 서열번호 43으로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄는 서열번호 44로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
(5) 제1 도메인의 중쇄는 제2 도메인과 링커 펩타이드를 통해 연결된 후 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄는 서열번호 46으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
(6) 제1 도메인의 중쇄는 제2 도메인과 링커 펩타이드를 통해 연결된 후 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄는 서열번호 48로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
상기에서 개시 및 청구한 서열번호 1 내지 52로 표시되는 서열은 "보존적 서열 변형", 즉, 상기 항체 또는 상기 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특징에 뚜렷한 영향을 미치거나 변화시키지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 변형을 포함한다. 상기 보존적 서열 변형은 뉴클레오티드 또는 아미노산의 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다. 부위 지정 돌연변이 유발 및 PCR 매개 돌연변이 유발 등과 같은 당업계의 표준 기술에 의해 변형을 서열번호 1 내지 52에 도입할 수 있으며, 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 또는 기타 아미노산 잔기로 치환되는 것을 포함한다. 당업계에 있어서, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않는 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), β-분지 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신), 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 동일한 측쇄 패밀리로부터 유래된 기타 아미노산 잔기로 인간 항-BCMA 항체의 비필수 아미노산 잔기를 대체하는 것이 바람직하다.
따라서, 상기에서 개시된 상기 아미노산 서열을 갖는 항체 및/또는 상기에서 개시된 아미노산 서열을 함유하는 항체는 기본적으로 보존적 서열 변형의 유사한 서열에 의해 코딩되는 항체, 또는 보존적 서열 변형의 유사한 서열을 함유하는 항체를 포함하며, 이들 항체는 모두 본 발명의 범주로 간주되어야 한다.
또한, 본 발명은 상기 BCMA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체를 코딩하는 핵산을 제공한다.
코돈의 축퇴성을 고려하여, 본 발명에 따른 항체를 코딩하는 유전자는 아미노산 서열을 변경하지 않고 그 코딩 영역에서 상기 항체를 코딩하는 유전자 서열을 변형하여, 동일한 항체를 코딩하는 유전자를 얻을 수 있다. 당업자는 항체의 발현 효율을 향상시키기 위해 항체를 발현하는 숙주의 코돈 선호도에 따라 유전자를 인공적으로 합성하고 변형할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 BCMA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체를 코딩하는 핵산을 함유하는 생물학적 재료를 제공하며, 상기 생물학적 재료는 재조합 DNA, 발현 카세트, 벡터, 숙주세포, 엔지니어링 박테리아 또는 세포주를 포함한다.
상기 벡터는 클로닝 벡터 및 발현 벡터를 포함하나 이에 제한되지 않으며, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 트랜스포존과 같은 벡터일 수 있다.
상기 숙주세포 또는 세포주는 미생물 또는 동물로부터 유래된 세포 또는 세포주일 수 있다.
또한, 본 발명은 BCMA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 제1 도메인 및 상기 제2 도메인의 코딩 유전자를 함유하는 발현 벡터를 구축하며; 상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여, 상기 이중특이성 항체를 발현하는 숙주세포를 얻으며; 숙주세포를 배양하고, 분리 및 정제를 통해 상기 이중특이성 항체를 얻는 것을 포함한다.
상기 이중특이성 항체를 제조할 때, 당업자는 필요에 따라 당업계의 통상적인 숙주세포, 발현 벡터, 발현 벡터를 숙주세포에 도입하는 방법 및 항체의 분리 및 정제 방법을 선택할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 BCMA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체의 기능에 기초하여, 본 발명은 BCMA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 또는 상기 핵산을 함유하는 생물학적 재료의 다음 중 어느 하나의 응용을 제공한다:
(1) BCMA 발현 B 세포 관련 질환의 진단, 예방 또는 치료용 약물의 제조에서의 응용; 바람직하게는, 상기 BCMA 발현 B 세포 관련 질환은 B 세포 관련 종양(다발성골수종 또는 림프종을 포함하되, 이에 제한되지 않음) 및 B 세포에 의한 자가면역 질환을 포함하며;
(2) BCMA를 표적으로 하는 질환의 진단, 예방 또는 치료용 약물의 제조에서의 응용, 바람직하게는, 상기 약물은 항종양 약물 또는 자가면역 질환 치료용 약물이며;
(3) BCMA 발현 세포 사멸용 약물의 제조에서의 응용;
(4) BCMA 및/또는 CD3의 검출 시약의 제조에서의 응용;
(5) CAR-T 치료에 적합한 관련 시약의 제조에서의 응용.
상술한 BCMA 발현 B 세포 관련 질환은 바람직하게는 BCMA가 고도로 발현/과발현되는 악성 종양 및 자가면역 질환이다.
본 발명에서 제공하는 이중특이성 항체 자체는 치료 및 진단에 사용될 수 있다. 항체는 진단 및 치료를 위해 표지화, 교차결합 또는 접합 및 기타 단백질 또는 폴리펩타이드 분자와 융합 및 발현하여 복합체(예를 들어, 세포 독성 물질, 방사성 독소 및/또는 화학 분자 등)를 형성할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 BCMA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체를 포함하는 다중특이성 항체, 융합 단백질, 면역독소, 약물 또는 검출 시약을 제공한다.
상술한 면역독소는 다양한 형태로 세포독성제에 연결된 상기 이중특이성 항체를 포함한다.
상기 다양한 연결 형태는 항체의 표지화, in vitro 교차결합 또는 분자 접합을 포함한다. 상기 세포독성제에는 화학 분자, 방사성 동위원소, 폴리펩타이드, 독소 및 세포를 사멸 또는 세포 사멸을 유도하는 특성을 갖는 기타 물질이 포함된다.
상술한 융합 단백질은 본 발명에서 제공하는 상기 이중특이성 항체 및 특정 기능을 갖는 기타 단백질 또는 폴리펩타이드 분자의 복합체를 포함한다.
구체적으로, 상기 융합 단백질은 항체 유전자를 면역독소 또는 사이토카인 유전자와 연결하여 재조합 발현 벡터를 구축하고, 포유동물 세포 또는 기타 발현 시스템을 통해 얻은 재조합 융합 단백질 분자일 수 있다.
상술한 약물 및 검출 시약에는 약학 분야 및 검출 시약 분야에서 허용되는 기타 유효성분 또는 보조물질(예를 들어: 항체의 성분 및 약리학적으로 허용되는 전달 분자 또는 용액. 여기서, 치료용 성분은 멸균된 것이고, 저온에서 동결건조될 수 있음)이 포함될 수도 있다.
본 발명의 이중특이성 항체는 BCMA에 의해 유도되는 하나 이상의 생물학적 활성을 억제할 수 있다. BCMA가 그 리간드에 결합하는 것을 방지함으로써 작용할 수 있으며, BCMA가 고도로 발현된 세포를 사멸함으로써 작용할 수도 있으며, 또는 BCMA에 결합한 후 복합체가 내재화되어 세포 표면의 BCMA를 소모함으로써 작용할 수 있다. BCMA 길항제가 갖는 모든 간섭 기능은 모두 본 발명의 목적으로 동일하게 간주되어야 한다.
본 발명의 유익한 효과는 다음과 같다:
본 발명은 유전공학 및 파지 표면 디스플레이 라이브러리 기술을 통해, 천연 완전 인간 서열의 단일 사슬 항체 라이브러리로부터 항-인간 B 세포 표면 항원 BCMA의 특이성 항체를 선별한다. 친화력 성숙 엔지니어링을 통해 결합 능력이 현저히 향상된 여러 클론을 얻었고, 이들의 인간 BCMA에 대한 친화력은 0.26nM 내지 0.31nM이다. 유세포분석기로 측정한 겉보기 친화력은 parental 항체에 비해 61 내지 97배 향상되어, 본 발명의 항-인간 BCMA 항체 및 최적화된 돌연변이체는 모두 우수한 BCMA 결합 능력을 갖고 있음을 입증하였다.
이를 바탕으로, 본 발명은 BCMA 및 CD3에 동시에 결합할 수 있고, 특이적인 표적 작용을 가지며, 지향성 면역 반응을 효율적으로 자극할 수 있는 이중특이성 항체를 제공한다. 상기 이중특이성 항체는 항-CD3 항체 및 항-BCMA 항체의 생물학적 기능을 잘 유지하여, 하나의 이중특이성 항체 분자가 동시에 BCMA 및 CD3에 결합하는 우수한 생물학적 기능을 실현하였으며, 종양 세포와 면역 효과기세포 사이에 브릿지를 형성할 수 있으며, 면역 효과기세포 및 지향성 면역 반응을 효과적으로 활성화하여, 종양 세포를 사멸하는 면역 세포의 효능을 현저히 향상시켰으며, 이와 동시에 ADCC 효과를 최소화하며, 높은 안전성을 갖는다.
본 발명에서 제공하는 이중특이성 항체는 우수한 치료 응용 전망을 갖고 있으며, 주로 인간 BCMA 및 CD3에 대한 특이적 결합 활성을 나타낸다. 상기 항체는 ELISA 및 유세포분석기의 검측 결과, H929 및 RPMI8226 세포 표면의 BCMA 및 T 세포에 모두 특이적으로 결합할 수 있으며, 이는 표적 특이성이 우수함을 나타낸다. in vitro 세포 사멸 효율 검측 결과, 상기 이중특이성 항체는 높은 표적세포 사멸 효율을 갖고 있다.
또한, 본 발명에서 제공하는 이중특이성 항체는 구조가 완전히 대칭되는 특징을 갖고 있으며, 숙주에서 발현 시, 기타 구조의 단백질 이성질체를 생성하지 않기 때문에, 추출 및 정제 공정의 어려움을 크게 줄이고, 제조가 간단하고, 수율이 높은 장점이 있으며, 종양의 면역 요법에서 광범위한 응용 전망을 갖고 있다.
본 발명은 BCMA를 표적으로 하는 항종양 항체 약물의 연구 개발, CAR-T 시약의 개발, B 세포 관련 염증 및 자가면역 질환과 같은 기타 질환의 예방 및 치료를 위하여 이중특이성 항체 후보 분자를 제공한다. 본 발명의 이중특이성 항체는 면역세포 및 종양세포에 동시에 결합하여, T 면역반응을 유도할 수 있고, 종양세포를 특이적이고 효과적으로 사멸시킬 수 있어, 다발성골수종의 항체 약물로 개발될 수 있다.
도 1은 본 발명의 배경기술의 BCMA 발현 및 TCR 구조의 모식도이며, 여기서, A는 B 세포의 발달 단계에서 BCMA 항원의 발현이며; B는 BCMA 항원의 리간드 작용 신호 경로이고, 출처는 fimmu-09-01821-g001.jpg(1050Х762)(frontiersin.org)이며; C는 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 구조와 그중의 CD3의 조성이고, 출처는 https://www.researchgate.net/publication/299549376이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에서 유세포분석기(FACS)로 클론 B10에 대한 BCMA의 결합을 분석한 것이며, 여기서, 상단의 두 도면은 음성 대조군(NC)이며; 중간의 두 도면은 양성 대조군(PC)이며; 하단의 두 도면은 후보 클론 B10(B10)이다.
도 3은 본 발명의 실시예 3에서 유세포분석기로 B10 및 그 친화력 성숙 돌연변이체의 결합을 분석한 것이며, 여기서, A, B, C, D, E는 순차적으로 B10, B10.3, B10.4, B10.5, B10.9의 H929 세포에 대한 결합이고, F, G, H, I, J는 순차적으로 B10, B10.3, B10.4, B10.5, B10.9의 RPMI8226 세포에 대한 결합이다.
도 4는 본 발명의 실시예 3에서 J6, B10 및 그 돌연변이체의 결합을 각각 ELISA 및 유세포분석기로 분석 및 비교한 것이며, 여기서, A는 ELISA이고, B는 FACS이다.
도 5는 본 발명의 실시예 4에서 FIST 플랫폼을 기반으로 구축한 항-BCMAХCD3 이중특이성 항체의 구조 모식도이며, 여기서, A는 N말단 융합(nFIST)으로 구축된 이중항체: 항-CD3 단일 사슬 항체가 항-BCMA 항체 VH의 N말단에 융합된 것이며, B는 C말단 융합(cFIST)으로 구축된 이중항체: 항-CD3 단일 사슬 항체가 항-BCMA 항체 Fc의 C-말단에 융합된 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예 5의 이중특이성 항체 K3B10.3 및 B10.3K3의 SDS-PAGE 전기영동 도면이며, 여기서, A 및 C는 환원 SDS-PAGE 전기영동이며; B 및 D는 비환원 SDS-PAGE 전기영동이며; A 및 B는 K3B10.3 이중특이성 항체의 SDS-PAGE 전기영동 결과이며; C 및 D는 B10.3K3 이중특이성 항체의 SDS-PAGE 전기영동 결과이며; 레인 M은 단백질 분자량 표준을 나타내고, 레인 1은 표적 단백질이다.
도 7은 본 발명의 실시예 5에서 정제된 이중특이성 항체 K3B10.3 및 B10.3K3의 HPLC-SEC 순도 분석 피크 프로파일이며, 여기서, A는 이중특이성 항체 K3B10.3이고; B는 이중특이성 항체 B10.3K3이다.
도 8은 본 발명의 실시예 6에서 유세포분석기로 인간 Jurkat T 세포 및 RPMI 세포에 대한 K3B10.3 및 B10.3K3의 결합을 분석한 것이며, 여기서, A는 2차 항체 대조군이며; B는 K3B10.3이며; C는 B10.3K3의 CD3에 대한 결합이며; D는 2차 항체 대조군이며; E는 K3B10.3이며; F는 B10.3K3의 BCMA에 대한 결합이다.
도 9는 본 발명의 실시예 7에서 BCMA 항원에 대한 cFIST 이중항체의 결합을 통해 매개되는 T 세포의 BCMA 발현 세포 RPMI8226에 대한 사멸이며, 여기서, A는 친화력이 향상된 돌연변이체 이중항체 B10의 BCMA 항원에 대한 ELISA 결합이며, 여기서, 항체는 200ng/well로 코팅되고, biotin-BCMA는 250ng/ml의 초기 농도로부터 serial half 희석되며, B는 친화력이 향상된 돌연변이체 이중항체 B10의 BCMA 발현 세포에 대한 매개 사멸이며, 여기서, B10K3는 각각 고농도 및 저농도 실험을 수행하였으며, 저농도(B10K3)에서 표준 S 곡선을 얻을 수 없으며, 고농도(B10(high)K3)에서 표준 S 곡선을 얻을 수 있으며, 이 곡선에 따라 EC50 값을 계산한다.
도 10은 본 발명의 실시예 7에서 BCMA 이중항체에 의해 매개되는 T 세포의 발현 수준이 상이한 BCMA 세포에 대한 사멸의 도면이며, 여기서, A는 H929 세포이고, B는 RPMI8226 세포이다.
이하 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.
실시예 1: 천연 인간 항체 파지 표면 디스플레이 라이브러리로부터 항-인간 BCMA 항체 선별
항체 라이브러리 기술은 특정 동물(인간 포함)의 모든 항체 가변영역 유전자를 플라스미드 또는 파지에 클로닝한 다음 대장균에 감염시킨 후, 항체 단편이 파지 입자 표면, 또는 대장균의 주변세포질 및 세포질에서 발현되도록 하며, 그다음 표적 항원으로 항체 라이브러리에서 특이적 항체 유전자를 운반하는 클론을 선별하여, 상응하는 특이성 항체를 얻는 기술이다. 항체 라이브러리에서 이미 종양 관련 막 단백질 항원, 자가면역질환 관련 자가항원, 항바이러스성 질환의 바이러스 항원의 항체 등과 같이 기초연구 및 임상 연구 개발에 필요한 여러가지 항체를 선별하였다. 이는 기초연구 및 항체 약물 연구 개발에 있어서의 항체 라이브러리 기술의 거대한 응용 잠재력을 나타낸다. 특히, 인간 항체 라이브러리에서 완전 인간 단일클론 항체를 얻어, 마우스 하이브리도마 기술을 사용하여 인간 단일클론 항체를 얻음에 있어서의 어려움을 극복하였으며; 인간 항체 서열의 보존성이 높기 때문에, 이들 항체는 동물 유래 항체보다 인체 자체의 면역 체계에 대한 면역원성이 훨씬 낮으므로, 더 안전하다.
비면역 인간 천연 항체 라이브러리는 건강한 인간을 항체 유전자 소스로 하며, 이러한 인간을 공여체라고 한다. 천연 인간 항체 서열을 사용하기 때문에, 얻어진 항체는 인간 면역 체계에 대한 면역원성이 매우 낮다. 분자 생물학 및 DNA 작업 기술을 사용하여, RNA 추출 키트(예를 들어, QIAGEN의 RNeasy Mini Kit, 카탈로그 번호 74104)로 공여체의 말초혈액 단핵 세포(PBMC)에서 전부의 RNA를 추출한 후, 각 RNA 샘플에서 동일한 양을 취하여 결합한 후, 역전사 키트(예를 들어, ThermoFisher Scientific의 cDNA 합성 키트(SuperScriptTM IV Reverse Transcriptase)로 경쇄 및 중쇄 유전자 cDNA의 합성을 진행하였다. 이들 항체 cDNA를 주형으로 하여, 1차 증폭에서, 각 서브 그룹 특이적 업스트림 프라이머 및 불변 영역 프라이머의 배합하에 PCR 증폭을 수행하여, 각 서브 그룹의 모든 구성원 유전자를 얻었다. 2차 PCR에서, 브리징을 갖는 중쇄 가변영역(VH) 3'-말단 프라이머 세트 및 브리징을 갖는 경쇄 가변영역(VL) 5'-말단 프라이머 세트는 획득된 VH와 VL가 함께 연결되어 단일 사슬 항체(scFv) 유전자를 형성할 수 있도록, 각각의 다른쪽 말단 프라이머(특이적 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함)와 각각 배합되었다. 이들 단일 사슬 항체의 유전자의 5'-말단 및 3'-말단의 특이적 효소 절단 부위를 이용하여, 이들 scFv 유전자를 용원성 파지미드(phagemid, 예를 들어 M13 phagemid) 벡터에 클로닝하여, 항체 라이브러리를 구축하였다. 이 라이브러리의 크기는 50억개의 집락 형성 단위(cfu)에 도달하였다.
바이오패닝은 특이적 표적을 사용하여 항체에서 특이성 클론을 선별하여 얻는 과정을 지칭한다. 인간 BCMA 항원 특이성 인간 항체를 얻기 위하여, 액상 선별 방법을 이용하여 패닝을 수행하였다. 액상 패닝 방법의 일반적인 단계는 다음과 같다: 먼저 상품화된 BCMA 항원(BCMA-Fc 융합 단백질, Acrobiosystems, 카탈로그 번호 BC7-H5254)을 비오틴으로 변형하여, 각 분자가 3 내지 5개의 비오틴 분자와 교차결합되도록 하고, 유리 비오틴을 제거하였다. 적절한 양의 비오틴으로 표지된 BCMA 항원을 스트렙트아비딘 결합 자성 비드(예를 들어, DynabeadsTM M-280 Streptavidin, ThermoFisher Scientific, 카탈로그 번호 11205D)에 결합시켰다. 다양한 항체를 발현하는 100억 개의 파지 입자가 포함된 인간 항체 라이브러리를 해동하였다. 비특이성 작용 부위를 제거하기 위해, 자성 비드 및 항체 라이브러리는 모두 4％ 탈지분유 용액(4％ MPBS)으로 차단하였다. 자성 비드에 아비딘과 결합하지 않은 스트렙트아비딘이 있을 수 있고, 동시에 BCMA 항원 분자는 인간 Fc로 구성된 융합 단백질이기 때문에, 충분한 양(사용된 표적 단백질의 양의 50~100배 초과)의 스트렙트아비딘과 인간 항체 Fc를 해동된 항체 라이브러리에 동시에 첨가하여, 이들을 결합하는 항체 클론을 제거하여야 한다. 차단된 항체 라이브러리 용액과 자성 비드(총 부피 <1ml)를 1.5ml Eppendorf 튜브에 첨가하고, BCMA 특이성 파지 항체가 결합하도록, 실온에서 2시간 동안 회전 혼합하여 배양하였다. 배양 완료 후 Eppendorf 튜브를 자성 랙에 1분 동안 정치하여, 자성 비드와 용액을 분리하였다. 피펫을 사용하여 용액 부분을 최대한 완전히 제거하고, 새로운 팁(tip)으로 교체하여, Eppendorf 튜브에 세척 용액 PBST(인산 완충액(PBS) 용액에 Tween 20을 최종 농도가 0.05%가 되도록 첨가) 1ml를 첨가하고, 자성 랙에서 멀리하여 피펫으로 자성 비드를 부드럽게 현탁시키고, 다시 자성 랙에 놓아 자성 비드와 용액을 분리하였다. 용액을 제거하고, 이를 3회 반복하였다. 그다음, 세척 용액을 PBS로 변경하고, 자성 비드를 3회 세척하였다. 세척 후, 비특이성 및 친화력이 낮은 파지 항체는 대부분 제거되고, 특이성 파지 항체는 자성 비드에 남아있다. 자성 비드에 용출액(10 mM Glycine, pH 2.0)을 첨가하고, 자성 비드를 재현탁시키고, 실온에서 10분 동안 정치하여, 자성 랙으로 자성 비드와 용액을 분리하고, 용액을 깨끗한 Eppendorf 튜브에 넣고, 1/10 1M Tris 용액(pH 8.0)을 첨가하여 용액을 중화시켜, BCMA 항원에 결합하는 수천 개의 다양한 파지 항체가 포함되는 용출액을 얻었으며, 이로써 1차 패닝이 완료되었다.
친화력이 높은 특이적 항체 클론을 추가로 얻기 위하여, 더 많은 라운드의 패닝이 필요하다. 이를 위해, 1차 패닝에서 용출된 파지 항체 용액을 사용하여 M13 파지에 의해 감염될 수 있는 대수기의 대장균(TG1 균주 등)을 감염시켜, 감염액을 얻었으며, 소량을 취해 일련의 10배 구배 희석(통상적으로 원액의 100만분의 1로 희석하고, 마지막 3개의 구배를 취하여 코팅함)을 수행하여 첫 번째 라운드에서 생성된 용출액(output)의 역가(titer)를 측정하며, 이 titer은 첫 번째 라운드의 최대 다양성이라고도 하며, 통상적으로 1차 패닝 후 생성된 역가는 10E6개 cfu 이하이다. 나머지 감염액을 모두 상응하는 항생제가 함유된 세균 배양 플레이트에 코팅하고 밤새 배양하여 콜로니를 얻었으며; 콜로니층을 긁어내고 배지로 재현탁시키고, 첫 번째 라운드의 output 다양성이 포함된 충분한 양의 재현탁액을 취하여 충분한 양의 액체 배지(2YT-CG, 2YT 배지에 Carbenicillin 및 글루코스를 첨가하고, 최종 농도는 각각 100 μg/ml 및 2％임)를 함유하는 진탕 플라스크에 첨가하고, 재현탁액을 0.1 OD600 이하로 희석하고, 배양을 시작하여 대수기, 즉 OD600이 약 0.5에 도달할 때까지 배양하였다. 1차 패닝에서 얻은 이들 항체가 다시 파지 입자의 표면에 나타나도록 하기 위해, 세균 용액 10ml를 취하고, 헬퍼 파지 M13K07를 첨가하여, 감염 다중도가 20:1이 되도록 하고, 37℃에서 정치하여 30분 동안 유지하였다(이 단계를 파지 구출(rescue)이라고 함). 원심분리하고, 발현 배지 50ml(2YT-AK, 2YT 배지에 Carbenicillin 및 Kanamycin를 첨가하고, 최종 농도는 각각 100 μg/ml 및 30 μg/ml임)를 사용하여 균체를 재현탁시키고, 30℃ 및 200 rpm에서 밤새 배양하였다. 그 다음날 원심분리하여 배양 상등액을 얻고, 1/5 부피의 PEG8000/NaCl(PEG-8000 20％, NaCl 2.5M)을 첨가하고, 충분히 혼합한 후, 얼음 위에서 1시간 동안 배양하였다. 고속 원심분리(11500Хg)를 30분 동안 수행하여 파지 항체 입자를 얻었다. PBS 용액 1ml로 재현탁 및 침전시키고, 다시 고속 원심분리로 세균 잔해를 제거하였다. 상등액은 1차 패닝 후의 증폭액이며, 그중에 포함된 각 항체 클론은 모두 1만 배 이상 증폭되었다. 이 증폭액은 2차 패닝 실험에 사용될 수 있다. 2차 패닝 작업은 PBST/PBS를 사용할 때 각각 6회(6/6)로 증가한 것을 제외하고는 첫 번째 라운드의 작업 방법과 완전히 동일하였다. 세 번째 라운드에서는 세척 회수를 10/10으로 더 증가할 수 있다. 여러 라운드의 패닝은 통상적으로 특이성 클론을 농화시킴에 있어 효과적이고, 다양성은 명확하게 감소되지만 친화력은 비교적 높아, 후속 단일클론 선별에 용이하다.
특이성 단일클론 항체를 얻기 위하여, Monophage ELISA을 수행하여야 한다. 이를 위해, 2차 및/또는 3차 구배 희석에서 잘 분리된 단일 콜로니를 2YT-AG를 함유하는 96웰 배양 플레이트에 별도로 접종하고(플레이트당 93개의 콜로니를 접종하고, 3개의 웰을 음성 대조군으로 남겨둠), 밤새 배양하여 마스터 플레이트(master plate)로 사용하였다. 마스터 플레이트의 각 웰의 균액을 새로운 배양 플레이트에 접종하고 대수기까지 성장시켜 상기 파지 구출을 수행하여 각 클론 항체가 파지 표면에 발현되도록 하였다. BCMA 항원(1μg/ml)을 일반 96-웰 enzyme-linked 플레이트에 코팅하고, 동일한 농도의 인간 Fc를 다른 enzyme-linked 플레이트에 코팅하였다. 각각의 별도로 발현된 단일클론 파지 항체 균액을 각각 BCMA 플레이트 및 Fc 플레이트의 상응하는 웰에 첨가한 후, 적합한 2차 항체와 겨자무과산화효소(HRP)가 결합된 3차 항체를 접종하여, 기질을 발색시켜, 흡광도 값(450nM)을 읽었다. BCMA 양성 클론의 판단 방법은 다음과 같다: Fc 플레이트에서는 음성이고(위치한 플레이트의 음성 웰 흡수값의 1.5배를 초과하지 않음), BCMA 플레이트에서는 양성이고(위치한 플레이트의 음성 웰 흡수값의 3배를 초과), 웰 흡수값이 Fc 플레이트의 대응되는 웰의 흡수값보다 높은 클론. 분석 결과, 10개의 웰에 해당하는 클론은 BCMA 항원에 대해서만 양성이고, Fc에 대해서는 음성이며, 이들 클론을 총칭하여 hit라고 한다.
마스터 플레이트의 대응되는 웰로부터 이들 hit 균액을 각각 3ml 2YT-CG에 접종하고, 37℃ 및 200 rpm에서 밤새 배양하였다. 그 다음날 파지미드 DNA를 추출하고, 특이성 프라이머를 사용하여 각 hit를 포함하는 단일 사슬 항체 영역의 서열을 측정하였다. 코딩 영역의 DNA 서열을 아미노산 서열로 번역하여, 다중 서열 정렬(CLUSTALW, 웹사이트 링크 https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)을 수행하여 클론 특이성을 판단하였다. 분석 결과, 이들 10개의 hit는 서열 방면에서 2개의 서로 다른 클론에 속하고, 그 중 하나는 B10으로 명명하여, 항-인간 BCMA 항원의 완전 인간 항체의 가변영역 서열을 얻었다. B10의 중쇄 가변영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 4 내지 6으로 표시되고, 경쇄 가변영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 1 내지 3으로 표시되고, 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 17로 표시되고, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 18로 표시된다. B10의 경쇄 및 중쇄 가변영역으로 구성된 단일 사슬 항체 아미노산 서열은 서열번호 36으로 표시된다.
실시예 2: 항체 기능 검증
얻어진 BCMA 항체 클론이 정제된 BCMA 항원과 세포막 표면에 발현된 BCMA와 결합하는지를 확인하기 위해, B10 단일 사슬 항체의 유전자를 진핵 발현 벡터 pFH(EXCYTE사 제조)에 클로닝하여, 플라스미드 pFH-B10을 얻었다. 이 벡터에서, scFv 유전자는 인간 IgG4의 Fc 유전자와 융합되어, scFv-Fc 형태의 단백질을 발현하며, 이는 Potein-A로 친화 및 정제되거나, (HRP 또는 플루오레세인)으로 표지된 항-인간 Fc 항체에 의해 검측될 수 있다.
B10의 scFv-Fc 단백질을 얻은 후, BCMA에 대한 이 항체의 결합 정황은 Octet RED를 사용하여 검측하였으며, BCMA에 대한 B10의 특이성 결합을 확인하였다.
유세포분석기를 사용하여 BCMA를 발현하는 세포주 H929(NCI-H929, ATCC® CRL-9068TM)에 대한 B10을 검측하였고, B10은 세포막 표면의 BCMA 항원에 특이적으로 결합함을 나타낸다(도 2를 참조). 이 FACS 분석에서, 사분면의 왼쪽 상단에 있는 백분율(양성 백분율)은 각 단일 사슬 항체의 세포 표면 항원에 대한 결합 강도를 나타낸다. 클론 B10의 양성 백분율은 48.96％이고, 이로부터 상기 항-인간 BCMA 항원에 대한 항체의 결합 능력을 검증하였다.
실시예 3: 항체 친화력 성숙
in vitro 친화력 성숙은 DNA 수준에서 돌연변이를 도입하고 단백질 결합 수준에서 선별하는 신속한 방향성 분자 진화 작업이다. B10 항체에 있어서, 면역원성을 강화시킬 수 있는 돌연변이 또는 항체를 확연하게 변화시킬 수 있는 구조의 도입을 피면하기 위해, 돌연변이 부위는 CDR 영역의 서열로 제한되며, 각 위치는 모두 각각 포화 돌연변이를 수행하여, 각 돌연변이는 별도로 발현되고, 별도로 검출하였다.
친화력 성숙의 작업 과정은 다음과 같다: 먼저, B10의 경쇄 및 중쇄 가변영역 유전자를 각각 pUFL 벡터(pUFL은 대장균에서 항체 Fab를 발현할 수 있는 플라스미드이며, EXCYTE사에서 제조)에 클로닝하여 B10의 Fab 형태를 얻었다. 풀 세트의 CDR 영역 single-site 무작위 돌연변이 프라이머를 설계하고, 점 돌연변이 키트(QuikChange Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis Kit, Agilent 카탈로그 번호 210515)를 사용하여 각 CDR 위치에 대해 각각 PCR 돌연변이를 수행하고, BL21(DE3) 컴피턴트 세균을 각각 형질전환하여 단일클론 콜로니 플레이트를 각각 제작하였으며, 이들 돌연변이체를 총칭하여 single-site 돌연변이 라이브러리라고 한다. 이와 동시에, B10 parental 항체의 Fab 벡터도 형질전환하였다. >30개의 콜로니를 선택하여 DNA를 준비하여 돌연변이 영역에 대하여 서열 분석을 수행하여 돌연변이 효율을 평가하였다. 돌연변이 효율이 적합할 경우(80% 초과), 각 CDR 위치의 돌연변이에 따라 92개의 콜로니를 선택하여 상응하는 배지(100μg/ml Carbenicillin + 0.1% 글루코스를 포함하는 2YT)를 포함하는 96웰 배양 플레이트에 넣고, 추가로 3개의 parental 콜로니를 선택하고, 3개의 웰을 blank 대조군으로 남겨 두었다. 플레이트를 37℃ 및 300 rpm에서 6시간 동안 배양하고, 최종 농도가 1mM이 되도록 IPTG를 첨가하고, 30℃로 옮겨 300 rpm에서 밤새 배양하여, Fab 단편이 발현되어 배지로 분비되도록 하였다.
예비 실험을 통해 enzyme-linked 반응 조건을 최적화하여 항원 BCMA-Fc에 대한 B10 parental 항체 Fab의 결합의 A450 흡수값이 백그라운드 신호보다 약 3배 높도록 하였다. 하루 전에 enzyme-linked 플레이트에 BCMA-Fc 항원을 0.25 μg/ml로 코팅하고, 그 다음날 분비 및 발현된 돌연변이 Fab를 웰에 첨가하고, HRP가 결합된 항-인간 Fab를 2차 항체로 사용하여, 기질을 발색시켜, A450을 읽어, 신호가 parental 웰의 최대값보다 1.5배 높은 웰에 대응되는 클론을 얻었으며, 이들 클론을 hit라고 한다. 경쇄 및 중쇄 가변영역의 모든 hit를 수집하고, 발현 유도 및 ELISA를 다시 수행하여 이들이 확실히 parental 항체보다 더 높은 친화력을 가지고 있음을 검증하였다. re-positive 클론의 플라스미드에 대한 돌연변이 영역 서열 분석을 수행하여 CDR 아미노산의 돌연변이 정보를 얻었으며, 이 과정을 1차 선별(primary screening)이라고 한다. 이에 따라, 친화력 향상에 유익한 CDR 영역의 모든 돌연변이 정보를 얻었다: 친화력을 제공하는 중쇄 가변영역 CDR의 돌연변이 부위를 표 1에 나타내었고, 친화력을 제공하는 경쇄 가변영역 CDR의 돌연변이 부위를 표 2에 나타내었다.
B10 중쇄 가변영역 CDR의 친화력 향상에 유익한 돌연변이
CDR 영역 위치 parental 아미노산 유익한 돌연변이 아미노산
H31 S P, K
H32 Y H, D, G, M, S
H33 A N
H35 S H, N, A, M
H50 G V, T
H52 I H
H53 I D, A
H54 F H
H56 T K
H98 F L
B10 경쇄 가변영역 CDR의 친화력 향상에 유익한 돌연변이
CDR 영역 위치 parental 아미노산 유익한 돌연변이 아미노산
L28 S N, R, T
L97 L Q, V, A
L98 I S, A, R, P
L100 Y M, L, W, T
L101 V L, Q
ELISA를 통해 1차 라이브러리로부터 전체 CDR 영역의 친화력 향상에 유익한 모든 단일 돌연변이 정보를 선별하여 얻은 후, 새로운 multi-site 돌연변이 프라이머를 주요 유익한 돌연변이를 포함하도록 재설계하고, 다시 점 돌연변이 키트로 돌연변이 라이브러리를 구축하며, 이 라이브러리를 조합 라이브러리라고 한다. 경쇄 및 중쇄 가변영역의 모든 돌연변이 조합을 최대한 선별하기 위해, 각각의 다수 돌연변이가 포함된 경쇄 및 중쇄 가변영역의 조합 라이브러리를 각각 구축하여 선별하였다. 경쇄 가변영역 조합 라이브러리에서 친화력이 가장 높은 상위 5개의 클론을 얻었으며, 이들의 경쇄 가변영역 아미노산 서열은 서열번호 22 내지 26으로 표시되는 5개의 돌연변이 서열을 포함하고, 그 경쇄 가변영역의 CDR1은 서열번호 1, 12 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 3, 13, 14, 15, 16 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.중쇄 가변영역 조합 라이브러리에서 ELISA 선별을 수행하여, 중쇄 가변영역 조합 라이브러리에서 친화력이 가장 높은 상위 3개 클론의 아미노산 서열을 얻었으며, 이들의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 각각 서열번호 19 내지 21로 표시되는 3개의 돌연변이 서열을 포함하고, 그 중쇄 가변영역의 CDR1은 서열번호 7, 8, 9 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
상기 경쇄 및 중쇄 가변영역의 친화력이 가장 높은 상위 5개 클론의 DNA를 각각 혼합하고, 효소 소화, 연결의 재조합 방식을 통해 최종 단일 사슬 항체 조합 라이브러리로 조립하였다. 이 라이브러리에 대해 선별을 수행하여 신호가 가장 높은 상위 10개를 선택하고, DNA 서열을 분석하여, 4개의 서로 다른 단일 사슬 항체 클론을 얻었으며, 대응되는 아미노산 서열은 서열번호 37 내지 40으로 표시된다.
얻어진 돌연변이체의 친화력이 향상되었는지를 검증하기 위해, B10 parental 항체 및 최종적으로 얻은 4개의 돌연변이체 B10.3, B10.4, B10.5, B10.9(아미노산 서열은 각각 서열번호 37 내지 40으로 표시됨)와 Fc의 융합 단백질(즉 scFv-Fc)을 각각 발현 및 정제하였다. 정제 생성물은 서로 다른 발현 수준의 2개의 BCMA 양성 세포주 H929 및 RPMI8226에서 유세포분석기로 검측을 수행하였다. 이들의 H929 세포에 대한 결합 백분율은 각각 다음과 같다: B10 parental 항체는 75.31％이고, 돌연변이체 B10.3은 97.96％로 향상되고, 돌연변이체 B10.4는 97.89％로 향상되고, 돌연변이체 B10.5는 97.17％로 향상되고, 돌연변이체 B10.9는 91.61％로 향상되었다. RPMI8226 세포에 대한 결합 백분율은 각각 다음과 같다: B10 parental 항체는 5.54％이고, 돌연변이체 B10.3은 54.89％로 향상되고, 돌연변이체 B10.4는 57.51％로 향상되고, 돌연변이체 B10.5는 58.18％로 향상되고, 돌연변이체 B10.9는 42.89％로 향상되었다. 이러한 결과는 4개의 돌연변이체가 모두 B10에 비해 BCMA에 대한 결합이 현저히 향상되었음을 보여준다(도 3을 참조).
B10 및 이로부터 유래된 항체의 친화력을 확인하기 위해, B10 parental 항체 및 최종적으로 얻은 4개의 돌연변이체 및 친화력이 알려진 BCMA 항체 J6(즉, 클론 J6M0, 특허 [WO2012163805A1]의 기록에 따르면, 친화력이 약 0.2nM임)을 각각 ELISA를 통해 비교 실험을 수행하였다. 서로 다른 농도의 항체를 enzyme-linked 플레이트에 코팅한 후, 비오티닐화 BCMA 항원, 스트렙트아비딘 결합 겨자무과산화효소(HRP) 및 발색 기질을 단계에 따라 첨가하였다. 얻어진 신호-항체 구배 곡선은 도 4의 A에 나타낸 바와 같으며, 상대적 친화력 변화 배수는 표 3에 나타낸 바와 같다.
ELISA로 검측한 B10 및 그 친화력 성숙 돌연변이체의 BCMA에 대한 결합
Ab J6 B10 B10.3 B10.4 B10.5 B10.9
EC50 26.54 n/a 34.3 41.12 35.78 37.94
Fold of J6 1.00 n/a 1.29 1.55 1.35 1.43
nM 0.20 n/a 0.26 0.31 0.27 0.29
상기 결과는 내재적 친화력에 있어서, 인간 BCMA에 대한 B10 parental 항체의 결합은 J6보다 현저히 약하여, S-곡선을 얻지 못하였기 때문에, 친화력 값이 생성될 수 없음을 보여준다. 또한, B10.3 친화력은 약 0.26nM이고, B10.4 친화력은 약 0.31nM이고, B10.5 친화력은 약 0.27nM이고, B10.9 친화력은 약 0.29nM이다.세포 표면의 BCMA에 대한 이들 항체의 겉보기 친화력을 확인하기 위해, B10 parental 항체 및 최종적으로 얻은 4개의 돌연변이체의 BCMA 발현 세포주 RPMI8226에 대한 결합을 유세포 분석법으로 J6과 각각 비교 실험을 수행하였다(도 4의 B, 표 4를 참조). 그 결과, 세포 수준에서 B10 parental 항체의 EC50은 1.575μg/ml로, J6(EC50은 2.741μg/ml)보다 약 1.5배 향상되었음을 보여준다. B10.3, B10.4, B10.5및 B10.9의 EC50은 각각 0.02822μg/ml, 0.03429μg/ml, 0.04063μg/ml 및 0.04514μg/ml이다. J6 대비, 친화력이 향상된 이들 돌연변이체의 EC50 향상 배수는 각각 97.13, 79.94, 67.46 및 60.72이다.
FACS로 검측한 B10 및 그 친화력 성숙 돌연변이체의 RPMI8226 세포주에 대한 결합
항체 B10.3 B10.4 B10.5 B10.9 J6 B10
EC50 (μg/ml) 0.02822 0.03429 0.04063 0.04514 2.741 1.575
J6 대비 향상된 배수 97.13 79.94 67.46 60.72 1 0.57
실시예 4: BCMAХCD3 이중특이성 항체 설계본 실시예에서는 종양 세포 표면 항원 BCMA 및 면역 세포 표면 항원 CD3을 표적으로 하여, 이중특이성 항체를 설계하였다.
단백질 구조 설계 소프트웨어 및 대량의 인공 실험 선별을 결합하여, 본 발명은 BCMA 및 CD3에 결합하는 다양한 이중특이성 항체 구조에서 단일 사슬 항체 단위 및 단일클론 항체 단위를 포함하는 대칭 구조를 갖는 이중특이성 항체 구조를 선별하여 확정하였다. 본 발명은 이러한 기술 플랫폼을 FIST(fusion of IgG and scFv technology)라고 한다. 예를 들어, 항-BCMA 단일클론 항체 단위는 2개의 완전한 경쇄-중쇄 쌍(즉, 완전한 Fab 및 Fc 도메인을 함유하고, 중쇄와 경쇄는 이황화 결합을 통해 연결됨)을 포함하는 IgG 항체로 사용될 수 있고, 항-CD3은 2개의 단일 사슬 항체(ScFv)를 포함하는 단일 사슬 항체 단위로 사용될 수 있다. 단일 사슬 항체와 단일클론 항체는 링커 펩타이드(서열번호 30)를 통해 연결되고, 단일 사슬 항체와 단일클론 항체의 연결 방식에 대하여, 하기 연결 방식을 설계하고, 이에 따라 대칭 구조의 이중특이성 항체를 얻었다(도 5):
단일 사슬 항체의 C말단을 단일클론 항체의 중쇄 가변영역(VH)의 N말단에 연결하여, nFIST를 얻었다(도 5 의 A). 단일 사슬 항체는 링커 펩타이드를 통해 IgG-Fc의 C말단에 융합되어, cFIST를 얻을 수도 있다(도 5 의 B).
본 실시예에서, 항-CD3 단일 사슬 항체 UCHT1의 가변영역 서열은 문헌(Beverley, P. C. & Callard, R. E. Distinctive functional characteristics of human "T" lymphocytes defined by E rosetting or a monoclonal anti-T cell antibody (1981) Eur. J. Immunol. 11, 329-334)에서 유래되었으며, 인간화되었다(Shalaby et.al., Development of humanized bispecific antibodies reactive with cytotoxic lymphocytes and tumor cells overexpressing the HER2 protooncogene. (1992) J Exp Med. Jan 1;175(1):217-25). 이로부터 구축된 단일 사슬 항체는 K3(서열번호 31)로 명명되었으며, 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역 내에 각각 삽입된 2개의 시스테인(Cys)을 포함하고, 폴딩 후 한 쌍의 사슬 간 이황화 결합이 형성되고, 그 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 28로 표시되고, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 29로 표시된다.
실시예 5: BCMAХCD3 이중특이성 항체의 제조
실시예 4에 따라 nFIST 및 cFIST 형태의 이중특이성 항체 코딩 유전자를 설계하고 발현 벡터 pG4HK에 클로닝하여, 2개의 이중특이성 항체 K3B10.3 및 B10.3K3을 얻었다. 이들의 중쇄 아미노산 서열은 각각 서열번호 34 및 35로 표시되며(단일클론 항체의 중쇄와 단일 사슬 항체가 링커 펩타이드를 통해 연결되어 형성된 융합 펩타이드); 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 33으로 표시된다. K3B10.3 및 B10.3K3에 대응되는 발현 플라스미드를 각각 CHO-K1에 안정적으로 형질감염시켜, 이중항체 단백질을 발현 및 제조하였다.
cFIST 형식을 사용하여 더 많은 항-BCMAХCD3 이중특이성 항체를 구축하였다. 여기서, BCMA-결합 IgG 단위의 중쇄 가변영역은 서열번호 17 내지 21에서 유래되었으며; BCMA-결합 IgG 단위의 경쇄 가변영역은 서열번호 18, 22, 25 내지 27에서 유래되었다. 이들 항체의 플라스미드를 293F 세포에 형질감염시키고, 일과성 발현 및 protein-A one-step 정제를 통해 제조하여, B10K3(중쇄 아미노산 서열은 서열번호 41로 표시되고; 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 42로 표시됨), B10.3K3, B10.4K3(중쇄 아미노산 서열은 서열번호 43으로 표시되고; 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 44로 표시됨), B10.5K3(중쇄 아미노산 서열은 서열번호 45로 표시되고; 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 46으로 표시됨), B10.9K3(중쇄 아미노산 서열은 서열번호 47로 표시되고; 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 48로 표시됨) 이중항체를 얻었다. SDS-PAGE 순도 분석 결과, 단량체가 90% 이상인 것으로 나타났다. 이들의 BCMA 항원에 대한 결합 검측은 도 9의 A에 나타낸 바와 같다.
상기 이중특이성 항체에 대하여, 고순도의 이중특이성 항체를 얻기 위하여, 다음 단계에 따라 수행하였다. (1) 원료액 전처리: 발효 및 배양한 상등액을 2,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 0.22μM 필터막으로 여과하였다. (2) 친화성 크로마토그래피: Mabselect SuRe 친화성 크로마토그래피 컬럼(GE Company에서 구입, Cat. No. 18-5438-02)을 사용하여 전처리된 발효액의 항체를 포획하고, 평형 완충액(10mM PB, 0.1M NaCl, pH 7.0)으로 크로마토그래피 컬럼을 충분히 평형시킨 후, 친화성 크로마토그래피 컬럼을 통과시키고, 용출 완충액(0.1M 구연산, pH 3.0)으로 용출하였다. (3) 양이온 교환 크로마토그래피: 친화성 크로마토그래피로 제조된 샘플에 대해 완충액(50mM PBS, 0.2Man Na2SO4, pH 6.7)을 사용하여 분자체 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다.
K3B10.3 및 B10.3K3에 대해 SDS-PAGE 및 HPLC-SEC 검측을 수행하였고, SDS-PAGE의 결과는 도 6에 나타낸 바와 같다. 여기서, K3B10.3의 환원성 SDS-PAGE 전기영동 검측 결과는 도 6의 A에 나타낸 바와 같고, 비환원성 SDS-PAGE 전기영동 검측 결과는 도 6의 B에 나타낸 바와 같으며; B10.3K3의 환원성 SDS-PAGE 전기영동 검측 결과는 도 6의 C에 나타낸 바와 같고, 비환원성 SDS-PAGE 전기영동 검측 결과는 도 6의 D에 나타낸 바와 같다. HPLC-SEC 검측 결과는 도 7에 나타낸 바과 같다. 여기서, K3B10.3의 SEC 검측 결과는 도 7의 A에 나타낸 바와 같고, B10.3K3의 SEC 검측 결과는 도 7의 B에 나타낸 바와 같다. 검측 결과, 발현 및 정제를 통해 이중특이성 항체 K3B10.3 및 B10.3K3을 성공적으로 제조하였으며, 정제된 이중특이성 항체의 단량체 순도는 95% 이상임을 보여준다.
실시예 6: 유세포 분석법으로 이중특이성 항체의 T 세포에 대한 결합 활성을 검측
건강한 인간 공여자의 PBMC 세포를 수집하고 T 세포를 정제하고, 1Х106 세포/반응 튜브로 PBS에 재현탁하여, 결합 완충액(0.5% w/v BSA + 2mM EDTA를 함유한 PBS) 1ml로 세포를 한 번 헹구고, 원심분리(350Хg, 4°C, 5분) 후, 결합 완충액 200μl으로 세포를 재현탁시켰다. 이중특이성 항체 K3B10.3 및 B10.3K3을 각각 5μg/ml로 첨가하고, 얼음 위에서 45분 동안 배양하였다. 위와 같이 세포를 한 번 헹군 후, 결합 완충액 100 μl으로 세포를 재현탁시켰다. 형광 표지된 2차 항체(PE anti-human IgG Fc Antibody, Biolegend, 409304) 5 μl를 샘플 튜브에 첨가하고, isotype control(PE Mouse IgG2a, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody, Biolegend, 400213)을 isotype control 튜브에 첨가하고, 빛을 차단한 상태에서 얼음 위에서 15분 동안 배양하였다. 위와 같이 세포를 한 번 헹구었다. PBS 200μl으로 세포를 재현탁시킨 후, 분석기(Beckman)에서 검측하였다.
유세포 분석법으로 K3B10.3 및 B10.3K3의 인간 T 세포에 대한 결합을 검측한 결과는 도 8에 나타낸 바와 같으며, 여기서, 대조군의 검측 결과는 도 8의 A에 나타낸 바와 같고, K3B10.3의 T 세포에 대한 결합의 검측 결과는 도 8의 B에 나타낸 바와 같고, B10.3K3의 T 세포에 대한 결합의 검측 결과는 도 8의 C에 나타낸 바와 같다. 그 결과, 이중특이성 항체 K3B10.3 및 B10.3K3이 모두 T 세포에 특이적으로 결합할 수 있으며, 즉, 이중특이성 항체 융합 단백질은 단일 사슬 항체 Anti-CD3의 결합 기능을 유지함을 보여준다.
항-BCMA 단위의 BCMA에 대한 결합을 검측하기 위하여, 이 실험의 T 세포를 RPMI8226(ATCC® CCL-155)으로 교체하여 유사한 FACS 실험을 수행하였으며, 대조군의 검측 결과는 도 8의 D에 나타낸 바와 같고, K3B10.3 및 B10.3K3의 검측 결과는 도 8의 E, F에 나타낸 바와 같다.
실시예 7: 이중특이성 항체에 의해 매개되는 in vitro 세포 사멸 효율의 검측
본 실시예에서는 H929-luc 및 RPMI8226-Luc를 각각 표적세포로 사용하고, PBMC를 면역 효과기세포로 사용하여, 이중특이성 항체 B10K3, B10.3K3, B10.4K3, B10.5K3, B10.9K3 및 K3B10.3에 의해 매개되는 표적세포의 사멸 작용을 검측하였다. 구체적인 실험 단계는 다음과 같다:
1) 표적세포 준비: H929-luc 및 RPMI8226-Luc(루시퍼라제에 의해 표지된 H929 및 RPMI8226 세포, 본 실험실에서 제조) 세포를 배양하고, 표적세포를 피펫팅하여 균일하게 혼합한 후 계수하고, 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, PBS로 1회 세척하였다. 표적세포를 원심분리 및 세척한 후 GT-T551 배지를 사용하여 밀도를 0.2Х106/ml로 조절하고, 각 웰에 50 μl씩 첨가하여, 각 웰에 10,000개의 세포가 존재하도록 하였다.
2) PBMC 준비: PBMC를 효과기세포로 사용하였다. 액체질소탱크에 동결 보존된 PBMC를 취하여(세포 동결 보존 및 소생을 참조) 해동하고, PBS 또는 GT-T551 배지를 함유하는 15ml 원심분리 튜브에 첨가하여, 1,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, PBS 또는 GT-T551 배지로 2회 세척하고, 세포 수, 활성 및 밀도를 기록하고, 생존 세포 밀도를 2Х106/ml로 조절하고, 각 웰에 50 μl씩 첨가하여, 각 웰에 100,000개의 세포가 존재하도록 하였다.
3) 항체 희석: GT-T551 배지를 사용하여 이중특이성 항체 B10K3, B10.3K3, B10.4K3, B10.5K3, B10.9K3, K3B10.3 및 B10.3K3을 각각 희석하고, 항체의 초기 농도를 10nM로 조절하였다. 순차적으로 1:5 비율로 희석하였다. 상기에서 준비한 세포에 희석된 항체 100 μl를 취하여 첨가하고, 균일하게 혼합하고, 96웰 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣어, 18시간 후에 사멸 효과를 검측하였다.
4) 검측: H929 또는 RPMI8226 표적세포는 Luciferase 유전자를 운반하기 때문에, LUMINEX 방법을 사용하여 표적세포 사멸 효율을 검측하였다.
Steady-GLO(Promega사)를 기질로 사용하여, 키트 내 완충액을 해동한 후 기질 분말에 첨가하여 균일하게 혼합하고, 각각 5ml 또는 10ml씩 분배하여, Steady-GLO 기질 재구성을 완료하였다. 공배양된 세포를 피펫팅하여 균일하게 혼합한 후 100 μl를 취하여 불투명한 백색 플레이트에 옮기고, 재구성된 Steady-GLO 기질 100μl를 추가로 첨가하고, 가볍게 두드려 균일하게 혼합하고, 5분 동안 방치한 후 플레이트를 읽었으며, 검측 기기는 Synergy HT이다.
5) 데이터 처리: 표적세포 사멸 비율의 계산식은 다음과 같다:
표적세포 사멸 비율(백분율)＝100Х(표적세포만 존재하는 웰 수 - 검측한 웰 수)/ 표적세포만 존재하는 웰 수
검측한 모든 웰의 표적세포 사멸 비율에 대응되는 항체 농도를 log10으로 전환하여, 이를 가로 좌표로 사용하고, 사멸 비율을 세로 좌표로 사용하여 곡선을 그렸다. 민감성 세포주 RPMI8226에 대한 cFIST 형태의 이중특이성 항체 B10K3, B10.3K3, B10.4K3, B10.5K3 및 B10.9K3의 사멸 농도-구배 곡선은 도 9의 B에 나타낸 바와 같으며; 각 구배의 사멸 백분율은 표 5에 나타낸 바와 같다.
K3B10.3 및 B10.3K3의 결과는 도 10에 나타낸 바와 같으며; 이들의 RPMI8226에 대한 사멸 백분율은 표 6에 나타낸 바와 같다. 이들의 H929에 대한 사멸 백분율은 표 7에 나타낸 바와 같다. 그 결과, 이중특이성 항체 B10.3K3은 모두 PBMC에 의한 종양 세포주 H929 또는 RPMI8226의 사멸을 효과적으로 매개할 수 있고, B10.3K3의 단일 분자는 모두 항-BCMA 및 항-CD3 단일클론 항체의 생물학적 기능을 동시에 가지고 있음을 보여준다. K3B10.3의 표적세포 RPMI8226의 사멸을 매개하는 효능은 B10.3K3보다 현저히 약하며, 특히 H929 세포에 대해서는 사멸 효과를 거의 나타내지 않았다. B10.9K3, B10.5K3, B10.4K3, B10.3K3, B10K3에 의해 매개되는 표적세포 사멸의 EC50은 각각 8.759pM, 12.87pM, 7.839pM, 5.833pM 및 281.7pM 이다.
상이한 용량의 이중특이성 항체에 의해 매개되는 표적세포 RPMI8226 사멸의 표적세포 사멸 비율
nM B10.9K3
 B10.5K3
 B10.4K3 B10.3K3 B10K3
0.1 60.77 77.35 58.20 67.98 69.81 67.41 81.10 86.51 31.27 42.02
0.025 66.27 64.55 51.07 49.06 64.78 49.36 78.84 76.85 25.86 22.70
6.3E-03 29.95 34.52 19.11 14.87 38.00 27.48 49.61 44.83 17.23 16.54
1.6E-03 8.96 27.99 6.96 0.38 5.35 9.98 7.65 32.26 11.37 30.92
3.9E-04 9.02 4.55 -3.91 -21.11 -34.55 7.37 -7.61 13.98 -2.14 19.17
9.8E-05 16.80 17.22 2.67 4.17 -1.28 24.16 12.50 12.63 9.71 21.37
2.4E-05 17.22 24.38 8.43 8.44 -13.27 -7.27 11.57 -0.91 11.12 9.26
상이한 용량의 이중특이성 항체 K3B10.3 및 B10.3K3에 의해 매개되는 표적세포 RPMI8226 사멸의 표적세포 사멸 비율
nM B10.3K3 K3B10.3
0.25 94.65 92.04 45.57 56.19
6.25E-2 92.31 89.86 32.15 24.14
1.6E-2 85.84 82.86 5.09 9.70
3.9E-3 68.89 64.42 -4.47 8.82
9.8E-4 21.16 32.04 2.84 8.87
2.4E-4 -7.47 0.18 -3.36 8.32
6.1E-0.5 7.71 3.14 -7.30 0.84
상이한 용량의 이중특이성 항체 K3B10.3 및 B10.3K3에 의해 매개되는 표적세포 H929 사멸의 표적세포 사멸 비율
nM B10.3K3 K3B10.3
0.25 94.84 95.57 95.57 -4.98 2.87 -4.89
6.25E-2 91.26 93.06 93.06 -15.44 4.71 -4.70
1.6E-2 80.60 79.11 79.11 -11.72 1.69 -2.78
3.9E-3 36.72 42.99 42.99 -0.38 3.37 -15.90
9.8E-4 7.81 13.06 13.06 -3.36 7.51 -20.43
2.4E-4 13.01 24.53 24.53 -3.62 7.39 2.87
6.1E-05 4.25 9.32 9.32 2.85 13.07 -1.53
상기 표 5, 표 6 및 표 7에서, 각 이중특이성 항체의 두 컬럼 값은 2회 반복 실험(duplicate)의 결과이다.
본 발명은 BCMA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체 및 그 제조 방법과 응용에 관한 것이다. 본 발명은 BCMA 및 CD3에 동시에 결합할 수 있고, 특이적인 표적 작용을 가지며, 지향성 면역 반응을 효율적으로 자극할 수 있는 이중특이성 항체를 제공한다. 상기 이중특이성 항체는 항-CD3 항체 및 항-BCMA 항체의 생물학적 기능을 잘 유지하여, 하나의 이중특이성 항체 분자가 동시에 BCMA 및 CD3에 표적화된 방식으로 결합하는 우수한 생물학적 기능을 실현하였으며, 종양 세포와 면역 효과기세포 사이에 브릿지를 형성할 수 있으며, 면역 효과기세포 및 지향성 면역 반응을 효과적으로 활성화하여, 종양 세포를 사멸하는 면역 세포의 효능을 현저히 향상시켰으며, 높은 표적세포 사멸 효율을 가지며, 이와 동시에 ADCC 효과를 최소화하며, 높은 안전성을 가지며, 종양의 면역 요법에서 우수한 응용 전망이 있다.
상기에서 본 발명을 일반적인 설명 및 구체적인 실시예를 통해 상세히 설명하였지만, 본 발명에 기초하여 일부 수정 또는 개선이 이루어질 수 있음은 당업자에게 있어서 자명한 것이다. 따라서, 본 발명의 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 수행한 이러한 수정 또는 개선은 모두 본 발명의 청구범위에 속한다.
<110> EXCYTE BIOPHARMA LTD <120> BISPECIFIC ANTIBODY BINDING TO BCMA AND CD3, AND PREPARATION METHOD THEREFOR AND USE THEREOF <130> KHP229810206.0 <150> CN 202110704255.6 <151> 2021-06-24 <160> 52 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laboratory synthesis <400> 1 Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ala 1 5 10 15 Ser Asn Ile Leu Glu Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Thr Tyr Arg Ser Glu 20 25 30 Arg Val Ala Leu Ala Ser Asn 35 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laboratory synthesis <400> 2 Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laboratory synthesis <400> 3 Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ile Gly Tyr Val 1 5 10 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laboratory synthesis <400> 4 Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laboratory synthesis <400> 5 Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly 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Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Trp Tyr Leu Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 340 345 350 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly 435 440 445 Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 450 455 460 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 465 470 475 480 Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 485 490 495 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 500 505 510 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser 515 520 525 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn 530 535 540 Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly 545 550 555 560 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val 565 570 575 Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu 580 585 590 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met 595 600 605 Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ala Leu 610 615 620 Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 625 630 635 640 Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 645 650 655 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 660 665 670 Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln 675 680 685 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 690 695 <210> 46 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laboratory synthesis <400> 46 Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Gly Tyr 20 25 30 Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ile Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 47 <211> 696 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laboratory synthesis <400> 47 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Lys Ser 20 25 30 Ala Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Val Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Trp Tyr Leu Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 340 345 350 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly 435 440 445 Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 450 455 460 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 465 470 475 480 Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 485 490 495 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 500 505 510 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser 515 520 525 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn 530 535 540 Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly 545 550 555 560 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val 565 570 575 Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu 580 585 590 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met 595 600 605 Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ala Leu 610 615 620 Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 625 630 635 640 Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 645 650 655 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 660 665 670 Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln 675 680 685 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 690 695 <210> 48 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laboratory synthesis <400> 48 Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Asn Asn Ile Gly Gly Tyr 20 25 30 Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Glu 85 90 95 Ile Gly Trp Leu Phe Gly Thr Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 49 <211> 442 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laboratory synthesis <400> 49 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 340 345 350 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 50 <211> 442 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laboratory synthesis <400> 50 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Lys Ser 20 25 30 Ala Ile Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Val Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Trp Tyr Leu Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 340 345 350 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 51 <211> 442 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laboratory synthesis <400> 51 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Lys Ser 20 25 30 Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Val Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Trp Tyr Leu Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 340 345 350 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 52 <211> 442 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Laboratory synthesis <400> 52 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Lys Ser 20 25 30 Ala Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Val Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Trp Tyr Leu Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 340 345 350 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440

Claims (13)

  1. B 세포 성숙 항원 BCMA에 결합하는 제1 도메인, 및
    T 세포 표면 항원 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 BCMA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체로서,
    상기 제1 도메인 및 상기 제2 도메인은 링커 펩타이드를 통해 연결되며,
    상기 제1 도메인은 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하며, 상기 중쇄 가변영역의 CDR1, CDR2, CDR3은 각각 서열번호 4 내지 6으로 표시되는 아미노산 서열을 가지거나, 또는, 각각 서열번호 4 내지 6으로 표시되는 아미노산 서열을 참조 서열로 하고, 다음과 같은 돌연변이 중 하나 이상의 돌연변이의 조합을 함유하는 아미노산 서열을 가지며:
    (1) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 S가 P 또는 K로 돌연변이;
    (2) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 2번 위치의 Y가 H, D, G, M 또는 S로 돌연변이;
    (3) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 3번 위치의 A가 N으로 돌연변이;
    (4) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 5번 위치의 S가 H, N, A 또는 M으로 돌연변이;
    (5) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 1번 위치의 G가 V 또는 T로 돌연변이;
    (6) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 3번 위치의 I가 H로 돌연변이;
    (7) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 4번 위치의 I가 D 또는 A로 돌연변이;
    (8) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 5번 위치의 F가 H로 돌연변이;
    (9) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 7번 위치의 T가 K로 돌연변이;
    (10) 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열의 4번 위치의 F가 L로 돌연변이;
    상기 경쇄 가변영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지거나, 또는, 각각 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 아미노산 서열을 참조 서열로 하고, 다음과 같은 돌연변이 중 하나 이상의 돌연변이의 조합을 함유하는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 BCMA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체:
    (1) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 5번 위치의 S가 N, R 또는 T로 돌연변이;
    (2) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 7번 위치의 L가 Q, V 또는 A로 돌연변이;
    (3) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 8번 위치의 I가 S, A, R 또는 P로 돌연변이;
    (4) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 10번 위치의 Y가 M, L, W 또는 T로 돌연변이;
    (5) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 11번 위치의 V가 L 또는 Q로 돌연변이.
  2. B 세포 성숙 항원 BCMA에 결합하는 제1 도메인, 및
    T 세포 표면 항원 CD3에 결합하는 제2 도메인을 포함하는 BCMA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체로서,
    상기 제1 도메인 및 상기 제2 도메인은 링커 펩타이드를 통해 연결되며,
    상기 제1 도메인은 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하며, 상기 제1 도메인의 중쇄 가변영역의 CDR1은 서열번호 4, 7, 8 및 9 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 5 및 10 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 6 및 11 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
    경쇄 가변영역의 CDR1은 서열번호 1 및 12 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 3, 13, 14, 15 및 16 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
    바람직하게는, 상기 제1 도메인의 중쇄 가변영역의 CDR은 다음 중 어느 하나이며:
    (1) CDR1은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
    (2) CDR1은 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
    (3) CDR1은 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
    (4) CDR1은 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
    경쇄 가변영역의 CDR은 다음 중 어느 하나이며:
    (1) CDR1은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
    (2) CDR1은 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
    (3) CDR1은 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
    (4) CDR1은 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
    (5) CDR1은 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
    더 바람직하게는, 상기 제1 도메인의 중쇄 가변영역의 CDR 및 경쇄 가변영역의 CDR은 다음 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 BCMA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체:
    (1) 중쇄 가변영역의 CDR1은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며; 경쇄 가변영역의 CDR1은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
    (2) 중쇄 가변영역의 CDR1은 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 가지며; 경쇄 가변영역의 CDR1은 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
    (3) 중쇄 가변영역의 CDR1은 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 가지며; 경쇄 가변영역의 CDR1은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
    (4) 중쇄 가변영역의 CDR1은 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 가지며; 경쇄 가변영역의 CDR1은 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, CDR3은 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제1 도메인의 중쇄 가변영역은 서열번호 17, 19 내지 21 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 가변영역은 서열번호 18, 22 내지 27 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
    또는, 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역은 전술한 서열과 비교하여 다음 두 가지 중 적어도 하나를 만족하며:
    a) 동일한 항원결정기에 결합; b) 70％, 80％, 85％, 90％, 97％, 98％ 또는 99％를 초과하는 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    바람직하게는, 상기 제1 도메인의 중쇄 가변영역은 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 가변영역은 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
    또는, 상기 제1 도메인의 중쇄 가변영역은 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 가변영역은 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
    또는, 상기 제1 도메인의 중쇄 가변영역은 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 가변영역은 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
    또는, 상기 제1 도메인의 중쇄 가변영역은 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 가변영역은 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
    또는, 상기 제1 도메인의 중쇄 가변영역은 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 가변영역은 서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 BCMA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 도메인은 이황화 결합을 통해 연결된 2개의 완전한 경쇄-중쇄 쌍이며;
    바람직하게는, 상기 중쇄의 Fc 단편은 인간 또는 인간화 항체의 Fc 단편이고, 상기 인간 또는 인간화 항체는 IgG1, IgG2, IgA, IgE, IgM, IgG4 또는 IgD인 것을 특징으로 하는 BCMA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 도메인의 중쇄는 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄는 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며,
    또는, 중쇄는 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄는 서열번호 42로 표시되는 아미노산 서열을 가지며,
    또는, 중쇄는 서열번호 50으로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄는 서열번호 44로 표시되는 아미노산 서열을 가지며,
    또는, 중쇄는 서열번호 51로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄는 서열번호 46으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며,
    또는, 중쇄는 서열번호 52로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄는 서열번호 48로 표시되는 아미노산 서열을 가지며,
    또는, 상기 중쇄 및 경쇄는 전술한 서열과 비교하여 다음 두 가지 중 적어도 하나를 만족하는 것을 특징으로 하는 BCMA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체:
    a) 동일한 항원결정기에 결합; b) 70％, 80％, 85％, 90％, 97％, 98％ 또는 99％를 초과하는 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 도메인의 중쇄 가변영역은 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 가변영역은 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
    바람직하게는, 상기 제2 도메인의 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역은 링커 펩타이드를 통해 연결되어 단일 사슬 항체를 형성하고, 상기 단일 사슬 항체는 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 BCMA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 도메인은 2개의 단일 사슬 항체를 포함하고, 상기 이중특이성 항체는 다음 중 어느 하나의 방식으로 연결된 대칭 구조인 것을 특징으로 하는 BCMA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체:
    (1) 상기 제2 도메인의 2개의 단일 사슬 항체의 C말단은 각각 링커 펩타이드를 통해 상기 제1 도메인의 2개의 중쇄의 N말단에 연결되며;
    (2) 상기 제2 도메인의 2개의 단일 사슬 항체의 N말단은 각각 링커 펩타이드를 통해 상기 제1 도메인의 2개의 중쇄의 C말단에 연결되며;
    바람직하게는, 상기 링커 펩타이드의 아미노산 서열은 (GGGGX)n이고, 여기서, X는 Gly 또는 Ser이며, n은 1 내지 4의 자연수이며;
    더 바람직하게는, 상기 링커 펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 30으로 표시된다.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 도메인의 중쇄는 상기 제2 도메인과 링커 펩타이드를 통해 연결된 후 서열번호 34 또는 35로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄는 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며,
    또는, 상기 제1 도메인의 중쇄는 상기 제2 도메인과 링커 펩타이드를 통해 연결된 후 서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄는 서열번호 42로 표시되는 아미노산 서열을 가지며,
    또는, 상기 제1 도메인의 중쇄는 상기 제2 도메인과 링커 펩타이드를 통해 연결된 후 서열번호 43으로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄는 서열번호 44로 표시되는 아미노산 서열을 가지며,
    또는, 상기 제1 도메인의 중쇄는 상기 제2 도메인과 링커 펩타이드를 통해 연결된 후 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄는 서열번호 46으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며,
    또는, 상기 제1 도메인의 중쇄는 상기 제2 도메인과 링커 펩타이드를 통해 연결된 후 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 경쇄는 서열번호 48로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 BCMA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 BCMA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체를 코딩하는 핵산.
  10. 재조합 DNA, 발현 카세트, 벡터, 숙주세포, 엔지니어링 박테리아 또는 세포주를 포함하는, 제9항에 따른 핵산을 함유하는 생물학적 재료.
  11. 상기 제1 도메인 및 상기 제2 도메인의 코딩 유전자를 함유하는 발현 벡터를 구축하며; 상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여, 상기 이중특이성 항체를 발현하는 숙주세포를 얻으며; 숙주세포를 배양하고, 분리 및 정제를 통해 상기 이중특이성 항체를 얻는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 BCMA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체의 제조 방법.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 BCMA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체 또는 제9항에 따른 핵산 또는 제10항에 따른 생물학적 재료의 다음 중 어느 하나의 응용:
    (1) BCMA 발현 B 세포 관련 질환의 진단, 예방 또는 치료용 약물의 제조에서의 응용; 바람직하게는, 상기 BCMA 발현 B 세포 관련 질환은 B 세포 관련 종양 및 B 세포에 의한 자가면역 질환을 포함하며;
    (2) BCMA를 표적으로 하는 질환의 진단, 예방 또는 치료용 약물의 제조에서의 응용;
    (3) BCMA 발현 세포 사멸용 약물의 제조에서의 응용;
    (4) BCMA 및/또는 CD3의 검출 시약의 제조에서의 응용;
    (5) CAR-T 치료에 적합한 관련 시약의 제조에서의 응용.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 BCMA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체를 포함하는 다중특이성 항체, 융합 단백질, 면역독소, 약물 또는 검출 시약.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP2982692A1 (en) * 2014-08-04 2016-02-10 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
EP3023437A1 (en) * 2014-11-20 2016-05-25 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
IL298041A (en) * 2015-08-17 2023-01-01 Janssen Pharmaceutica Nv Anti-bcma antibodies, bispecific antigen-binding molecules that bind bcma and cd3 and their uses
KR102505681B1 (ko) * 2016-09-14 2023-03-06 테네오바이오, 인코포레이티드 Cd3 결합 항체
IL267485B2 (en) * 2016-12-21 2024-01-01 Teneobio Inc Antibodies against BCMA containing only heavy chains and their uses
CN109776683B (zh) * 2019-03-19 2020-04-07 益科思特(北京)医药科技发展有限公司 一种双特异性抗体及其制备方法与应用
CN112574308A (zh) * 2019-09-30 2021-03-30 和铂医药(苏州)有限公司 靶向bcma的抗体、双特异性抗体及其用途
CN112979807B (zh) * 2019-12-17 2022-07-26 深圳市菲鹏生物治疗股份有限公司 Bcma结合抗体及其用途
CN113061185B (zh) * 2020-01-02 2023-08-08 益科思特(北京)医药科技发展有限公司 一种bcma抗体的制备方法与应用

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