CN109996815A - 以cd4抗体于稳定接受haart治疗的患者进行hiv感染的治疗和持续性的病毒缓解 - Google Patents
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Abstract
本发明是关于用以预防、治疗及/或功能性治愈HIV感染的组合物和方法。本发明一方面是关于针对CD4的单克隆抗体、其组合物,以及使用此组合物以预防、治疗及功能性治愈HIV感染的方法。
Description
技术领域
本发明是关于针对CD4的抗体,此抗体可替代HAART,用以于稳定接受HAART治疗的患者进行HIV感染的治疗和持续性的病毒缓解。
背景技术
HIV/AIDS大流行为现代历史中最重要的全球健康挑战。在选择性地使用联合抗反转录病毒治疗(cART)时,可有效控制HIV复制,阻止AIDS发展,延长寿命并降低传播风险。尽管获取显著的成功,但目前的抗反转录病毒疗法有其限制,原因在于其非治愈性且感染的患者必须无限期地持续治疗。由于带来要对全球超过3500万HIV感染者提供终身治疗的挑战,因此对发展HIV感染的疗法具有强烈兴趣。最近的一篇文献回顾“Global ScientificStrategy:Towards an HIV Cure 2016”描述此领域关键的知识鸿沟和研究问题,并被作为本领域先前技术的参考文献(Deeks,S.G.,et al.,2016)。此文献回顾的内容透过引用并入本文整体。
治疗任何病毒感染的理想结果就是将接受治疗的患者体内所有具有复制能力的病毒颗粒完全根除,即所谓的治愈。消除性治愈对于某些病毒感染(例如HIV)来说,是个挑战及/或难以证明。对于复杂的病毒感染而言,较为务实却可于临床上成功的治疗结果将是达成持续性地长期病毒缓解。缓解似乎是发展真正HIV治愈的必要前提,且此领域越来越多地利用这观点指明,在无ART治疗下于一段尚未定义的期间(可能数年)以长期病毒血症低于检测极限为目标。
鉴于当前状况,亟需可作为HAART替代药物,达成持续性长期HIV病毒缓解的产品与治疗方法。
参考文献
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发明简述
在本发明一方面中,本发明是关于用以于稳定接受HAART治疗的患者作为HAART替代药物进行HIV感染的治疗和持续性的病毒缓解的抗体、组合物及方法。在本发明一方面中,本发明使关于针对CD4的抗体、其组合物,以及制造与使用此组合物于稳定接受HAART治疗的患者在后续缺乏其他治疗(包括cART)的状况下进行HIV感染的治疗和持续性的病毒缓解的方法。
在某些实施例中,抗体特异性地结合至CD4的细胞外位置。在特定实施例中,抗体特异性地结合至CD4,结合位置位于结构域1中的CDR2区域或其附近。所揭示的抗体在无细胞(cell-free)和细胞间(cell-to-cell)系统中,通过与CD4结合展现竞争型HIV进入抑制。所揭示抗体以有或无交联的方式同样具有能力再活化静默CD4阳性T细胞,其可增加TNF-α的生成。此抗体,包括,但不限于单克隆抗体(Mabs),其包括B4、M2及dB4C7(例如Wang,C.Y.1999;Lynn.S.and Wang,C.Y.2009);Leu3a(Than,S.et al.,1997)、ST4(Briant,L,1999);及多克隆抗体,其包括抗-HIV RC、CD4结构域1的CDR2区域(Wang,C.Y.,WO2016/043788)。
在某些实施例中,此抗体为针对并特异性地结合至CD4且功能性地具有下述能力:(1)在无细胞和细胞间传播模型中阻断HIV进入,以及(2)再活化HIV感染的静默CD4T细胞。在特定实施例中,抗体于体外以交联或无交联方式再活化HIV感染的静默CD4T细胞,显现在TNF生成、HIV p24释放、或透过Lck激酶磷酸化的T细胞活化的增加。在某些实施例中,以本发明抗体治疗HIV患者,可导致(1)调节性T细胞(Tregs)的减少;(2)血液中CD8+细胞数的增加;(3)藉由HIV特异性抗原体外刺激时HIV特异性CD8+细胞的增加;及/或(4)血细胞中HIVDNA水平的减少。
本发明也关于医药组合物,其包含具有上述功能特性的抗-CD4抗体(例如单克隆人类、人源化、嵌合等),以及使用此医药组合物进行HIV感染的治疗和持续性的病毒缓解的方法。本发明特定实施例关于制备及/或使用此医药组合物于稳定接受HAART治疗的患者在后续缺乏cART治疗的状况下进行HIV感染的治疗和持续性的病毒缓解的方法。
在某些实施例中,制备包含本发明抗体的医药组合物,并投予患者,以降低病毒量至低于检测极限,且无病毒反弹。在某些实施例中,制备医药组合物并以每周、每二周或甚至更长的时程表以约10mg/kg或更高的剂量投予患者。在某些实施例中,医药组合物是以单一药物治疗或结合其它治疗(例如HAART)的方式投予。在某些实施例中,当接受治疗的患者中的血清抗体水平为约10μg/mL或更高时,病毒量减少至低于检测极限,且无病毒反弹。在某些实施例中,此医药组合物是以单一药物治疗方式,以每周、每二周或甚至更长的时程表,投予约10mg/kg或更高的剂量,其造成只要接受治疗的受试者中的血清抗体水平高于10μg/mL,可降低病毒量至低于检测极限,且无病毒反弹。
本发明包含针对CD4抗体的医药组合物,其可使用于HIV治疗:(1)当单独投予时,作为单一药物治疗;(2)当作为其它疗法(例如,cART)的佐药投予时,作为组合治疗;或(3)在利用其他疗法(例如,cART)进行替代治疗循环时作为间歇性地投予的单一药物治疗。
本发明抗体与治疗方法可达成与精英的控制者或长期无进展者(LTNP)类似的细胞和免疫学的特征。本发明抗体及治疗方法在后续缺乏cART的状况下可达到HIV感染的持续性病毒缓解,为HIV感染治疗的变革。
附图说明
图1A是竞争型HIV进入抑制机制。此曲线图显示于竞争型HIV进入抑制模型中所提供理论结果,在此,HIV包膜蛋白gp120和抑制剂(例如抗体药物)竞争结合位于一个共同目标表面分子上的相同位置(即CD4结构域1的CDR2)。在此模型中,当此抑制剂浓度达到某个阀值时可达成HIV结合/进入的100%抑制。
图1B是来自利用mAb B4对在10年间所收集的一组超过850种Env假型HIV病毒株的HIV进入抑制的结果。MAb B4于HIV进入抑制提供了广泛性与效力,其于所有850种Env假型病毒株具有接近100%最大抑制百分比(MPI),且具有两个IC50浓度(一个是介于0.01至1μg/mL,且第二个是约10μg/mL)。
图2A是非竞争型HIV进入抑制机制。此曲线图显示于非竞争型HIV进入抑制模型中所提供理论结果,在此,HIV和抑制剂结合至位于相同目标分子上的不同位置(例如CD4的结构域2对于TMB-355)。在此非竞争型抑制模型中,抑制剂可减少HIV结合/进入,但不论抑制剂的浓度为何都无法达成完全抑制。不论药物浓度为何,作为于%抑制的“高原”反映了HIV对抗体药物的抗药性。
图2B是来自利用TMB-355对一组涵盖11个进化支的118种不同HIV-1Env假型病毒株的HIV-1进入抑制的结果(Pace,G.,et al.,2011)。对每一种病毒而言,黑线是指当以浓度达到10μg/mL的TMB-355处理时的最大抑制百分比(MPI)(请参见左边的Y轴);而灰线是指相对应的IC50(请参见右边的Y轴)。TMB-355以≥50%抑制中和了92%的病毒株,且以≥95%抑制只中和了31%的病毒株。
图3是显示藉由以下刺激所引发于静默PBMCs的病毒再活化的直方图(其乃利用HIV-1 p24 gag制造加以测量),刺激种类包含未受刺激(第1道)、植物凝集素(PHA)(第2道)、不活化的HIV(iHIV)溶胞产物(第3道)、针对CD4结构域1的CDR2区域的单克隆抗体(第4道)、针对CD4结构域1的CDR3区域的单克隆抗体(第5道)、针对CD4结构域1/2的单克隆抗体(第6道)、可溶性CD4存在下的iHIV(第7道)、可溶性CD4存在下针对CD4结构域1的CDR2区域的单克隆抗体(第8道)、可溶性CD4存在下针对CD4结构域1的CDR3区域的单克隆抗体(第9道),以及可溶性CD4存在下针对CD4结构域1/2的单克隆抗体(第10道),如附图说明所示(改编自Briant L.,et al.,1999)。
图4是显示抗体B4辨识与抗体Leu3a结合的涵盖CD4结构域1的CDR2区域的构象抗原表位。发现利用单克隆抗体B4和Leu3a(针对CD4结构域1的CDR2区域)可对CD4阳性细胞竞争型结合抑制。此试验利用来自两位受试者(X282和X301)的黑猩猩PBMC细胞。利用FITC标志单克隆抗体B4。利用PE标志抗体Leu3a。PBMC细胞的细胞荧光图分析指出利用Leu3a-PE(如由左边算起第二小图(第2组图)所示),利用抗体B4-FITC(如由左边算起第三小图(第3组图)所示)的阳性结合,而当PBMCs利用Leu3a-PE进行第一染色之后以抗体B4-FITC染色显现双重染色的细胞群体(如由左边算起第四小图(第4组图)所示);然而利用抗体B4-FITC在先结合可阻断后续Leu3a-PE的结合(如由左边算起第五小图(第5组图)所示),而仅有B4-FITC的结合。此顺序性结合抑制试验指出针对Leu3a-PE的利用抗体B4-FITC的单向抑制,指明抗体B4辨识位于CD4结构域1的CDR2区域附近的与CD4阳性细胞相接触的较大表面面积(利用结构域1内从第47-64个氨基酸的肽的较短延伸,Leu3a可辨识CD4结构域1的CDR2区域)。
图5是显示利用抗-HIV RC多克隆抗体对生物素化-B4结合至rsCD4的竞争型抑制的图式,其藉由ELISA加以测量。
图6是显示mAb dB4和抗-HIV RC多克隆抗体对位在PBMCs上的表面CD4的抗体效价测定图式。抗体效价测定为%CD4结合对抗体浓度(μg/mL)。
图7A至图7G是显示于未使用治疗药物的HIV阳性和HIV阴性受试者以mAb dB4和抗-HIV RC多克隆抗体对由超抗原SEB所引起增殖CD4+和CD8+T细胞的细胞因子IL2和IFN-γ制造抑制的分析。对HIV阴性(图7A)和HIV阳性(图7B)受试者,mAb dB4和抗-HIV RC多克隆抗体对由超抗原所引起增殖CD4+ T细胞的IL2制造的抑制如图所示。对HIV阴性受试者和年龄一致的HIV阳性受试者(图7C),mAb dB4和抗-HIV RC多克隆抗体对由超抗原所引起增殖CD8+ T细胞的IL2制造的抑制也如图所示。对HIV阴性(图7D)和HIV阳性(图7E)受试者,mAb dB4和抗-HIV RC多克隆抗体对由超抗原所引起增殖CD4+ T细胞的IFN-γ制造的抑制如图所示。对HIV阴性(图7F)和HIV阳性(图7G)受试者,mAb dB4和抗-HIV RC多克隆抗体对由超抗原所引起增殖CD8+T细胞的IFN-γ制造的抑制如图所示。
图8A至图8D是显示在第IIa期临床试验期间UB-421治疗的临床疗效的图式,如利用病毒量下降(上图)和UB-421的药物动力学(如以μg/mL血清浓度加以测定(下图))所测定。提供了以下代表性患者的相关数据:接受每周10mg/kg UB-421投予的患者1-1-01(图8A);接受每周10mg/kg UB-421投予的患者1-1-02(图8B);接受每两周25mg/kg UB-421投予的患者1-2-03(图8C);以及接受每两周25mg/kg UB-421投予的患者1-2-06(图8D)。以整个涂满灰色阴影的区间代表UB-421结合于PBMC CD4+细胞上的持续期间。
图9A和9B。图9A是显示在依计划书执行临床试验的群体(Per-protocol(PP)population)(其接受10mg/kg试验药物UB-421(左图)或25mg/kg试验药物UB-421(右图)的所有投予且具有有效基线)具有相对稳定的CD4 T细胞数量(平均值和标准偏差)的图式。图9B显示来自在治疗期之前(W1)、在治疗结束时(W8)或在治疗的监控期之后(W16)的患者的CD3+、CD3+/CD4+细胞的增殖百分比,PBMC由接受UB-421的患者所提供,并以抗原(包括超抗原SEB(左图)或CMV pp65(右图))刺激。
图10A和图10B是显示于使用UB-421的第IIa期临床试验所观察到的病毒量减少对照于由他人所作的TMB-355(ibalizumab,先前称为TNX-355)类似试验(Jacobson,J.L.,etal.,2009;Toma,J.,et al.,2011;和Pace,C.S.,et al.,2013)所观察到的病毒量减少的理论比较图式。图10A概述于以10mg/kg和25mg/kg UB-421治疗的受试者所观察到的病毒量变化,而图10B概述于以相同剂量水平TMB-355治疗的受试者所观察到的病毒量变化。
图11是显示来自在以UB-421治疗之前(W1)、治疗结束时(W8)或治疗之后(W16)的患者的CD3+、CD3+/CD4+和CD3+CD8+细胞的增殖百分比,PBMC由接受UB-421的患者所提供,并以具有一致性B序列的HIV Gag基序(motif)肽刺激。CD3+ T细胞的增殖百分比具有统计学上显著增加(p<0.01),其主要归因于CD3+/CD8+ T细胞群体(p<0.01)。
图12是显示利用UB-421单一药物治疗作为于HIV-1感染成年人的抗反转录病毒疗法的替代药物治疗形式的来自第1剂量组与第2剂量组临床试验计划书设计的示意图。
图13是显示在接受10mg/kg试验药物UB-421(第1剂量组)或25mg/kg试验药物UB-421(第2剂量组)的所有投予的患者中于治疗开始(V1)或结束(V12)时具有相对稳定的CD4T细胞数量(平均值和标准偏差)的图式。对第1剂量组(P=0.331)和第2剂量组(P=0.905)二者而言在治疗前和后并无统计学上显著差异。
图14是显示在接受10mg/kg试验药物UB-421(第1剂量组)或25mg/kg试验药物UB-421(第2剂量组)的所有投予的患者中于治疗开始(V1)或结束(V12)时CD8 T细胞数量(平均值和标准偏差)的图式。对第1剂量组(P<0.001)和第2剂量组(P=0.004)二者而言在治疗前和后具有统计学上显著差异。
图15A和图15B是显示在利用UB-421单一药物治疗作为于HIV-1感染成年人的抗反转录病毒疗法的替代药物的第IIa期临床试验期间UB-421治疗的临床疗效的图式,如利用平均病毒量下降(HIV RNA拷贝/mL)和UB-421的药物动力学(如利用UB-421-alexa488结合细胞的平均百分比测定)所测定。图15A为第1剂量组,而图15B为第2剂量组。
图16A和图16B是显示在利用UB-421单一药物治疗作为于HIV-1感染成年人的抗反转录病毒疗法的替代药物的第II期临床试验期间UB-421治疗的临床疗效的图式,如利用个别患者病毒量下降(HIV RNA拷贝/mL)所测定。图16A为第1剂量组,而图16B为第2剂量组。将病毒反弹定义为病毒量于两次连续访视超过400RNA拷贝/mL(虚线)。
图17A和图17B是显示在整个试验中在接受10mg/kg试验药物UB-421(第1剂量组,图17A)或25mg/kg试验药物UB-421(第2剂量组,图17B)的所有投予的患者中于每个时间点(随访天数)的%Treg细胞(平均值和标准偏差)图式(以总CD4+细胞中CD4+CD25+FoxP3+ T细胞%代表%Treg细胞)。
图18是显示于治疗期开始(V1)或结束(V8)时,或当来自V8至V12患者回复至原先HAART治疗于监控期结束时,在接受10mg/kg或25mg/kg试验药物UB-421的所有投予的个别患者中PBMC HIV原病毒DNA含量。每一条线代表来自一个个别患者所提供结果。
图19是显示利用抗HIV gp120广泛中和抗体VRC01单一药物治疗作为抗反转录病毒疗法的替代药物于稳定接受HAART治疗的患者中9位患者所显现病毒血症水平(实心三角形,HIV RNA拷贝/mL)和VRC01抗体血浆浓度(实心圆,μg/mL)的图式。尽管呈现高VRC01抗体血浆浓度血清,因为未达到HIV抑制而提前终止此NIH试验。x轴上方的倒三角形表示VRC01输注时间点。
图20是显示作为单一药物治疗于HIV病毒抑制维持的疗效的比较,单一药物治疗是利用(1)市场上HIV药物(HAART)或单克隆抗体、(2)VRC01、(3)针对HIV共同受体CCR5的Pro140或(4)UB-421,使用4至16周期间。
图21是显示治疗时利用UB-421类似抗体介导的细胞机制。细胞机制包括:(1)藉由%Treg细胞减少恢复HIV抗原特异性T细胞活性;(2)在抗体结合后在受感染的细胞中活化潜伏HIV;以及(3)阻断细胞间和无细胞感染以中止新的HIV感染;所有这些机制都会导致(4)病毒库的减少或消除,以导致HIV-1感染的持续性病毒缓解。
图22A至图22D是显示于Jurkat T细胞中位在酪氨酸394(Y394)和酪氨酸505(Y505)的Lck磷酸化的蛋白质印迹分析。图22A是以作为阳性对照组的抗-CD3(OKT3)抗体刺激后的Lck Y394磷酸化(上方)和Y505磷酸化(中间)以及总Lck(下方)蛋白质水平的蛋白质印迹图。图22B为显示以图22A所示每个时间点的总Lck标准化的Lck Y394和Y505磷酸化程度的图式。图22C为于有或无交联的状况下利用UB-421刺激的Lck Y394磷酸化(上方)、Y505磷酸化(中间)以及总Lck(下方)蛋白质水平的蛋白质印迹图。图22D为显示以图22C所示每个时间点的总Lck标准化的Lck Y394和Y505磷酸化程度的图式,在此虚线表示于交联状况下所提供的数据,而实线表示于无交联状况下所提供的数据。
图23A至图23B是显示于来自正常血液捐赠者3的原代CD4+T细胞利用抗-CD3(OKT-3)刺激的Lck磷酸化的蛋白质印迹分析。图23A为利用抗-CD3(OKT3)抗体刺激的Lck Y394磷酸化(上方)、Y505磷酸化(中间)以及总Lck(下方)蛋白质水平的蛋白质印迹图。图23B为显示以图23A所示每个时间点的总Lck标准化的Lck Y394和Y505磷酸化程度的图式。
图24A至24D是显示于来自正常血液捐赠者1、2、4、5、6和7的原代CD4+T细胞利用UB-421刺激的Lck磷酸化的蛋白质印迹分析。图24A为于健康捐赠者1和2于有或无交联的状况下利用UB-421刺激的Lck Y394磷酸化(上方)、Y505磷酸化(中间)以及总Lck(下方)蛋白质水平的蛋白质印迹图。图24B为于健康捐赠者4、5、6和7于无交联的状况下利用UB-421刺激的Lck Y394磷酸化(上方)、Y505磷酸化(中间)以及总Lck(下方)蛋白质水平的蛋白质印迹图。图24C和图24D为显示以图24A和图24B所示每个时间点的总Lck标准化的Lck Y394和Y505磷酸化程度的图式,在此虚线表示于交联状况下所提供的数据,而实线表示于无交联状况下所提供的数据。
图25A至图25B是显示在来自健康血液捐赠者8和9的原代CD4+T细胞的Lck磷酸化的流式细胞仪分析。图25A显示在具有作为阳性对照组的抗-CD3刺激(虚线)或作为阴性对照组无任何处理(实线)的状况下PE-抗-Lck pY394(左图)和Alexa647-抗-LckpY505(右图)的MFI。图25B显示在交联状况下(虚线)或无交联状况下(实线)以UB-421刺激在来自健康血液捐赠者8和9的原代CD4+T细胞的PE-抗-Lck pY394(左图)和Alexa647-抗-LckpY505(右图)的MFI。
具体实施方式
本发明是关于用以于稳定接受HAART治疗的患者进行HIV感染的治疗和持续性的病毒缓解的抗体、组合物及方法。在本发明一方面中,本发明是关于针对CD4的抗体、其组合物,以及制造与使用此组合物于稳定接受HAART治疗的患者在后续缺乏其他治疗(包括cART)的状况下进行HIV感染的治疗和持续性的病毒缓解的方法。
在此使用的章节标题仅作为组织的目的,且并非被解释作为限制所述的专利标的。为了任何目的,此申请案引用的所有参考文献或参考文献的部分透过引用在此明确地被并入本文整体。
CD4
人类CD4(分化群4)为具有458个氨基酸的糖蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot:P01730.1),其位于免疫细胞(例如T辅助细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞)的表面(en.wikipedia.org/wiki/CD4)。CD4的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:22所示。CD4+T辅助细胞为白血球,其为人体免疫系统的重要组成。它们通常被称为CD4细胞、T辅助细胞或T4细胞。它们为辅助细胞,原因在于它们向其他类型的免疫细胞(包括瓦解感染颗粒的CD8杀手细胞)传送信号。若CD4细胞耗竭,例如于未接受治疗的HIV感染或在移植前的允疫抑制之后,原本可抵御广泛的感染的身体变得容易受到攻击。
CD4为共同受体,其可协助T细胞受体(TCR)与抗原呈现细胞之间的联系。CD4使用其细胞外结构域与抗原呈现细胞表面的第二型主要组织相容性复合体(MHC)分子直接相互作用。细胞外结构域使用类免疫球蛋白的β-三明治结构,其在2个β片层中具有7股。使用其细胞内结构域,CD4可藉由吸引酪氨酸激酶Lck放大TCR所产生的信号,其对于激活活化的T细胞的信号级联的许多分子组分是必需的。因此,产生各种的T辅助细胞。
CD4的主要结构特征如序列表所示,并详述于下。
CD4为免疫球蛋白超家族的成员,并具有四个免疫球蛋白结构域(D1至D4),其暴露于细胞的细胞外表面。CD4结构域D1和D3类似免疫球蛋白变异(IgV)区;而D2和D4类似免疫球蛋白恒定(IgC)区。
CD4结构域1(D1)
D1核心区域(约第26-125个氨基酸)由2个由β-股所形成的β-片层所组成,其以二硫键桥加以连结。D1的氨基酸序列与免疫球蛋白共有同源性,于其三个互补决定区(CDRs)与免疫球蛋白链相似。类CDR1、CDR2及CDR3区域位于CD4的D1结构域。
CD4的D1结构域直接与抗原呈递细胞表面上的第II型MHC分子相互作用,并吸引lck以促进T辅助细胞的活化,以调控特异性免疫反应。发现CD4分子细胞外区域的结构域1和结构域2均对第二型MHC分子的结合位具有贡献;然而,发现仅结构域1涉及HIV结合与合胞形成(syncytia formation)。特别地,发现HIV包膜糖蛋白gp120的结合位位于结构域1的类CDR-2环(CDR2-like loop)。
已开发出许多辨识CD4的D1结构域的抗-CD4抗体。例如,HIV RC、B4、M2及dB4C7(例如Wang,C.Y.1999;Lynn.S.and Wang,C.Y.2009;和Wang,C.Y.,WO2016/043788);Leu3a(Chiba,Y.1992);OKT4A(Jameson,B.D.,et al.,1988);ST4及13B8.2(Briant,L,1999);6H10(例如Moore,et al.,1992);15A7、2D5及2F2(例如Yuan R,et al.,2016);及F91-55及BL4,其辨识位于D1及D2之间的区域(Briant,L,et al.,1999;Celada F,et al.,1990;和Moore,et al.,1992)。
CD4结构域2(D2)
CD4的D2结构域(约第126-203个氨基酸)通过其疏水性界面与D1连接。D2对第二型MHC分子的结合位具有贡献。已开发出许多辨识CD4的D2结构域的抗-CD4抗体。例如ibalizumab(TMB-355;原先名称为TNX-355或Hu5A8;例如Kuritzkes,D.R.,et al.,2004);M-T441(R,et al.,1995)。
CD4结构域3(D3)
CD4的D3结构域位于约第204-317个氨基酸。D3藉由其疏水性界面连接D4,其类似于D2与D1相互作用的方式。抗体OKT4可辨识D3(例如Yuan R,et al.,2016;Moore,et al.,1992)。
CD4结构域4(D4)
D4结构域(约第318-374个氨基酸)是CD4分子上在跨膜区域前最后的细胞外区域。D4结构上类似D2,被广泛认为可透过CD4分子形成二聚体以激活T细胞和CD4功能。抗体OKT4及L120可辨识D4(例如Yuan R,et al.,2016;Moore,et al.,1992)。
CD4-跨膜区域和细胞质区域
跨膜区域(约第397-418个氨基酸)为疏水性,而细胞内/细胞质区域(约419-458个氨基酸)包括3个丝氨酸残基(S433、S440及S456),其被磷酸化以介导信号传递。这些丝氨酸残基直接与Src酪氨酸激酶(TK)家族成员P56lck连结,其可增加P56lck酪氨酸磷酸化程度并调控信号传递。
CD4-于HIV感染的角色
HIV-1藉由CD4进入宿主T细胞,此乃透过其病毒包膜蛋白(称为gp120)达成。Gp120是成熟HIV-1细胞膜包膜糖蛋白前体gp160的两个结构域之一,另一个为gp41。结合gp120至CD4构成HIV-1附着中的第一步,且CD4-gp120相互作用引起gp120构象变化,以允许其结合至表达于宿主细胞上的趋化因子受体CCR5或CXCR4。此第二步骤的结合允许HIV的gp41(融合肽)分子插入宿主细胞膜,以介导病毒和宿主的细胞膜融合。HIV感染造成表达CD4的T细胞数量逐渐减少。
因此,CD4在HIV-1感染的初期扮演重要的角色。比较gp120与CD4结合及未结合的晶体结构,显示“链接区(bridging sheet)”-由2个β-发夹所形成的4股β-片层-在CD4结合期间,可固定gp120核心的两个密切相关的“内”及“外”结构域的相对位向。CD4 D1结构域与这些内和外结构域以及链接区相互作用,导致gp120内结构域的重组。此外,利用与gp120V3可变环的额外相互作用,链接区暴露出共同受体结合位(例如Yuan R,et al.,2016)。
抗体
在本发明的一方面中,本发明是关于针对CD4的抗体、其组合物,以及使用此组合物进行HIV感染的治疗和持续性的病毒缓解的方法。
本发明抗体广泛地涵盖完整的抗体分子,其包括完整的多克隆、单克隆、单特异性、多特异性、嵌合、去免疫化、人源化、人类、灵长类化、单链、单结构域、合成及重组抗体。本发明还包括具有所欲活性或功能的完整抗体的部分(例如抗体的免疫片段)。
本发明抗体是针对CD4。在一些实施例中,抗体特异性地结合CD4的细胞外区域。在某些实施例中,抗体特异性地辨识并结合至CD4免疫球蛋白结构域(D1至D4)中的至少一个。在某些实施例中,抗体仅结合至CD4免疫球蛋白结构域的其中之一(即D1、D2、D3或D4)。在特定实施例中,抗体结合至CD4的D1结构域。在某些实施例中,抗体结合至位于CD4结构域1中的互补决定区(CDR1、2或3)或其附近。在特定实施例中,抗体结合至CD4D1结构域的CDR2区域或其附近。
本发明的抗体可以任何标准方法制备。在一些实施例中,本发明抗体可以重组CD4蛋白、CD4蛋白的片段、含有CD4免疫部分的融合蛋白及/或CD4类似物或同源物免疫动物(例如,小鼠、狗、天竺鼠、猪、山羊、马等)加以制造。在其它实施例中,可利用表面表达CD4的细胞免疫动物以产生此抗体。在其它实施例中,可利用化学合成制备此抗体。
在某些实施例中,抗体可以CD4蛋白、CD4蛋白的片段、含有CD4免疫部分的融合蛋白及/或CD4类似物或同源物免疫动物加以制造。在一些实施例中,使用含有全长CD4蛋白的肽免疫动物以产生抗体。在其它实施例中,使用含有一部分CD4蛋白的肽免疫动物以产生抗体。例如,肽可含有CD4蛋白的一部分,以细胞外区域(例如D1至D4)、免疫球蛋白结构域(D1、D2、D3及/或D4)、D1结构域内的互补决定区(CDR1、2或3)等作为代表。此抗体可利用包含至少一部分CD4蛋白的单一肽或含有CD4氨基酸序列的肽组合免疫动物加以制造。在一些实施例中,肽免疫原含有CD4的第39-66个氨基酸(也称为HIV受体复合体(“HIV RC”)),如同HIV结合至CD4的此部分。在特定实施例中,HIV RC肽可藉由二硫键以制造环状结构。在一些实施例中,可利用环状HIV RC肽免疫动物以制造多克隆抗体。本发明所述“抗-HIV RC多克隆抗体”是指针对含有CD4结构域1的CDR2区域第39-66个氨基酸的环状肽的免疫血清。
在其它实施例中,以CD4阳性细胞免疫动物可产生抗体。细胞系可为任何表达CD4的细胞系,例如,Jurkat细胞、HPB-ALL细胞、U87MG细胞、NIH-3T3细胞、HOS细胞、CCRF-CEM细胞(CCL-119TM)、HuT 78(TIB-161TM)、MJ(G11)(CRL-8294TM)及其类似物。在某些实施例中,可以完整、未受感染的CD4+人类HPB-ALL细胞(一种T细胞急性淋巴细胞性白血病细胞系(T-acute lymphoblastic leukemia cell line))或纯化的外周血单个核T细胞(PBL T细胞)免疫BALB/c小鼠制造抗体。于Wang发明的美国专利第5,912,176和6,090,388号以及WO/2016/043788,以及Wang等人于1999年发表的期刊论文,对此抗体有更详细的讨论,其均透过引用以并入本文整体。
在某些实施例中,以化学物质标记或标志本发明抗体。例如,抗体可以生物素、延伸臂、探针(例如:荧光异硫氰酸盐(FITC)、藻红蛋白(PE)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)、DyLight Fluors、Alexa、绿色荧光蛋白(GFP)、R-藻红蛋白(R-Phycoerythrin)、量子点等)、酶结合物,及其结合加以标志。在具体实施例中,抗体是以生物素或荧光探针标志。
在具体实施例中,抗体可透过已知的去免疫化过程加以修饰。本发明所述“去免疫化”一般是指用以修饰抗体的部分的过程,藉此使其投予动物时不引起动物体内的免疫反应。具体来说,当此抗体于投予至特定动物时具有免疫原性,去免疫化涉及定位与移除抗体部分氨基酸序列(例如,T细胞抗原表位)的过程。此过程可藉由结合使用免疫学与分子生物学技术达成。此过程先前已揭露(例如Jones,T.D.,et al.2009)。在抗体去免疫化的状况下,可普遍地引入突变以移除T细胞抗原表位,而未显著地减少抗体的结合亲和力。
本发明所述“人源化”是指修饰(去免疫化)非人类物种抗体的蛋白质序列,藉此移除当此抗体投予人类时的免疫原性。在某些实施例中,本发明抗体是利用以人类恒定区取代其恒定区及/或利用表达于哺乳类细胞编码此些抗体的基因以去免疫化供人类使用。
本发明所述“mAb B4”或“B4”或“鼠源B4”是指鼠源单克隆抗体,其可辨识CD4及抑制HIV进入。此抗体的结构及功能特征详述于以下实施例中。
本发明所述“mAb dB4”或“dB4”是指衍生自mAb B4的人类去免疫化抗体。在一个实施例中,mAb B4是利用依据美国7,501,494号和7,872,110号专利所述的方法去免疫化以供人类使用,其透过引用在此并入本文整体。在特殊实施例中,人类去免疫化mAb dB4是藉由移除mAb B4的鼠源抗体恒定区(C H和CK),并以人类IgG1的恒定区取代,而制造。MAb dB4包含以任何适当的细胞克隆制造的dB4。在具体实施例中,mAb dB4是由7号克隆所制造。
本发明所述“mAb dB4C7”或“dB4C7”,是指由包含重组基因B4DIVHv1/VK1CHO#7的7号克隆所表达的mAb dB4,其先前于Wang发明的美国专利第7,501,494、7,872,110号及WO/2016/043788揭露,这些专利透过引用在此并入本文整体。显示C7克隆可制造高产量的mAbdB4抗体。此外,将位于mAb dB4C7位置298的Asn(N)残基以His(H)取代,以移除N-糖化点,因此消除IgG介导的补体依赖型细胞毒性作用(CdC),以防止于抗体B4存在下CD4阳性T细胞的耗竭。
本发明所述“UB-421”是指使用于投予人类受试者的合适形式的mAb dB4C7。
此抗体可含有翻译后修饰,包括糖基化、甲基化及/或磷酸化的位置。在某些实施例中,此抗体具有糖类结合残基。在特定实施例中,此抗体含有作为糖基化点的天冬酰胺(Asn)残基。在特定实施例中,Asn残基位于重链,且在特定实施例中,Asn位于Fv区域及/或CDR。
本发明抗体也可藉由其有趣且独特的功能特征而加以描述。
例如,本发明的抗体可透过其结合至CD4的结构域1而发挥有效的竞争型HIV进入抑制。特别是,本发明的抗体于测试的所有Env假型病毒具有接近100%的最大抑制百分比(MPI),具有两个IC50浓度;一个是介于0.01至1μg/mL,且第二个是约10μg/mL。本发明抗体的结合活性较HIV gp120包膜蛋白所展现的CD4结合亲和力高了约两个对数(即100倍更紧密的结合)。此外,本发明抗体的平均解离常数(Kd)测得为5.6x10-11M(范围:3.1至8.1x10- 11M),且最大结合容量(Bmax)测得为1.2x106Ab/细胞(范围:0.93-1.4x106)。
于无细胞和细胞间的系统中均显示本发明抗体的竞争型抑制特性。本发明抗体以较HIV包膜蛋白gp120 MN高至少50倍的亲和力结合至CD4受体。并且,本发明抗体以相较于其他市售抗体(例如Leu3a)更高的亲和力与特异性结合至CD4。
本发明抗体也可抑制由抗原引起的T细胞增殖和CD4阳性T细胞的细胞因子制造(IL2和IFN-gamma),其涉及细胞焦亡的致病循环。此种对CD4具高亲和力的单克隆抗体可抑制抗原(例如超抗原SEB(金黄色葡萄球菌B型肠毒素(staphylococcal enterotoxin B,SEB))引起的CD4阳性T细胞活化和细胞因子(例如IL2和IFN-γ)制造。此种抗原引起的活化导致HIV感染失败的静默CD4+ T细胞产生细胞因子,造成这些静默CD4+ T细胞和附近正常静默CD4阳性细胞的细胞焦亡,其导致之后CD4+ T细胞的大量耗竭,因而导致AIDS。
本发明抗体也具有再活化静默CD4阳性T细胞的能力。此特性对再活化静默T细胞中的潜伏HIV病毒库特别有用,可使这些细胞对抗反转录病毒药物治疗敏感。此种对CD4高亲和力的抗体可活化静默的HIV感染细胞以释放HIV。HIV感染的静默CD4+ T细胞再活化允许在HIV感染患者使用合并本发明抗体与HAART的合并治疗,以达成功能性治愈。
于以下实施例提供本发明抗体额外的结构与功能特征。
剂型
本发明也针对用以预防、治疗,及/或功能性治愈HIV感染的药剂剂型。在某些实施例中,剂型包含针对CD4的抗体。在特定实施例中,本发明关于包含对CD4高亲和力的单克隆抗体的医药组合物(此抗体可针对位于CD4结构域1的CDR2区域内或附近的位置)。此种抗体的结合活性(EC50)较HIV gp120包膜蛋白所展现的CD4结合亲和力(对gp120的EC50=97nM)高了约两个对数(即100倍更紧密的结合)。
抗体蛋白质的药剂剂型可藉由混合抗体蛋白质与任选的药物学上可接受的载体而加以制备。药物学上可接受的载体包含溶剂、分散介质、等渗剂等。载体可为液体、半固体(例如膏状物)或固体载体。载体的例子包含水、盐溶液或其他缓冲液(例如磷酸盐、柠檬酸盐缓冲液)、油类、醇类、蛋白质(例如血清白蛋白、明胶)、碳水化合物(例如单糖、双糖,以及其他碳水化合物(包含葡萄糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇、山梨糖醇或糊精)、凝胶、脂质、脂质体、树脂、多孔基体、黏合剂、充填剂、涂层、安定剂、防腐剂、抗氧化剂(包含抗坏血酸以及甲硫氨酸)、螯合剂(例如EDTA);成盐的抗衡离子(salt forming counter-ions)(例如钠);非离子表面活性剂(例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG),或其结合)。
此剂型可包含不止一种的活性物质。例如,剂型可含有用于预防和治疗HIV感染的一或多个抗体及/或一或多个具有额外优点的化合物。活性物质可以任何方便使用的方式(例如:混合、溶液、悬浮液、乳化作用、胶囊化、吸附等)与载体结合,且可制成适用于注射、摄取、输注等的剂型(例如:锭剂、胶囊、粉末(包含冷冻干燥粉末)、糖浆剂、悬浮液)。亦可制备成缓释制剂。
在某些实施例中,药剂剂型包含供人类使用的mAb dB4C7。包含mAb dB4C7的药剂剂型可配制于适当缓冲液中,包含,但不限于,柠檬酸盐、磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1,3-二[三(羟甲基)甲基氨基]丙烷(BIS-Tris)等,于介于6.0至7.0的pH值,且可包含赋形剂(例如糖类(50mM至500mM的蔗糖、海藻糖、甘露醇,或其混合))、表面活性剂(例如:0.025%-0.5%的Tween 20或Tween 80),及/或其他试剂。在具体实施例中,剂型包含mAbdB4C7于含有20mM甘氨酸,以及0.05%(v/v)Tween(聚山梨酯20(polysorbate 20))的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH 6.5)中。在其他具体实施例中,也可制备mAb dB4的高浓度剂型以供特定应用(包含皮下注射),其包含10mM组氨酸。
可制备含有不同量抗体的剂型。一般来说,用于投予受试者的剂型包含介于约0.1mg/mL至约200mg/mL。在某些实施例中,剂型可包含介于约0.5mg/mL至约50mg/mL;介于约1.0mg/mL至约50mg/mL;介于约1mg/mL至约25mg/mL;或介于约10mg/mL至约25mg/mL的抗体。在具体实施例中,剂型包含约1.0mg/mL,约5.0mg/mL,约10.0mg/mL,或约25.0mg/mL的抗体。
在具体实施例中,本发明关于包含具有上述结合特征的人类、人源化或嵌合、单克隆抗-CD4抗体的医药组合物,其展现竞争型HIV进入抑制与CD4+ T细胞活化,作为HIV患者的免疫疗法。
在其他实施例中,本发明关于包含具有上述结合特征的单克隆人类、人源化或嵌合,抗-CD4抗体的医药组合物,其作为单一药物治疗使接受治疗的受试者血清抗体水平高于10μg/mL,可将病毒量降低至低于检测极限。
在其他实施例中,本发明关于包含具有上述结合特征的单克隆人类、人源化或嵌合,抗-CD4抗体的医药组合物,其作为单一药物治疗可于为期12周治疗期间使接受治疗的受试者血清抗体水平高于10μg/mL,将病毒量降低至低于检测极限,且维持稳定的CD4T细胞数量。
在某些实施例中,本发明关于包含具有上述结合特征的单克隆人类、人源化或嵌合,抗-CD4抗体的医药组合物,当以每周或每两周的时程表以约10mg/kg或更高的剂量投予作为单一药物治疗时,此种治疗可于为期12周治疗期间使接受治疗的受试者的病毒量降低至低于检测极限。
在另一较佳实施例中,本发明关于包含具有上述结合特征的单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物,其可作为偕同HAART的辅助治疗的关键成份,当以每周或每两周的时程表以约10mg/kg或更高的剂量投予未使用治疗药物的HIV患者,将达成患者的功能性治愈。
在另一较佳实施例中,本发明关于包含具有上述结合特征的单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物,其可作为偕同HAART的辅助治疗的关键成份,当以每周或每两周的时程表以约10mg/kg或更高的剂量投予于HAART下具有稳定病毒量的患者,将达成患者的功能性治愈。
抗病毒药物
本发明内容更包括可用以治疗、预防和功能性治愈HIV感染方法中所使用的抗病毒药物。
抗病毒药物包含可于哺乳类动物有效抑制HIV的形成及/或复制的任何药物(化合物或生物的)。抗病毒药物的例子包含,但不限于,进入/融合抑制剂(例如:maraviroc、enfuvirtide);核苷类反转录酶抑制剂(NRTI)和核苷酸类反转录酶抑制剂(NtRTI)(例如:zidovudine、abacavir、didanosine、lamivudine、emtricitabine、stavudine及tenofovir);非核苷类反转录酶抑制剂(NNRTI)(例如:nevirapine、efavirenz、etravirine和rilpivirine);整合酶抑制剂(也称为整合酶链转移抑制剂或INSTIs(例如:raltegravir、dolutegravir、elvitegravir);蛋白酶抑制剂(例如:saquinavir、saquinavir mesylate、fosamprenavir、tipranavir、lopinavir、indinavir、nelfinavir、amprenavir、ritonavir、darunavir、atazanavir、bevirimat、vivecon);病毒成熟抑制剂;针对HIV基因表达的药物;针对涉及HIV复制的重要宿主细胞基因和基因产物的药物;以及其他抗-HIV药物;iRNA药物;反义RNA(antisense RNA);表达iRNA药物或反义RNA的载体;肽核酸(PNA)以及抗病毒抗体;及其结合。
抗病毒药物可以单独或合并方式使用。以合并方式使用抗病毒药物称为抗反转录病毒治疗(ART),联合抗反转录病毒治疗(cART)或高效抗反转录病毒疗法(HAART)。抗反转录病毒(ARV)药物藉由药物抑制反转录病毒生命周期的阶段而广泛地被分类。典型的合并使用包含以两种NRTIs作为“骨架”,以及以一种NNRTI、PI或INSTI作为“基底”。在某些实施例中,以合并方式使用抗病毒药物,例如:Combivir、Trizivir、Kaletra、Epzicom、Truvada、Atripla、Complera、Stribild、Triumeq。
HIV感染的治疗和持续性的病毒缓解的方法
本发明也针对用以治疗、预防,和功能性治愈HIV感染的方法。在某些实施例中,剂型包含针对CD4的抗体。
另一方面,本发明的抗体、任选的药物学上可接受的载体可于受试者用以治疗、预防,及/或功能性治愈HIV感染,以及预防HIV传播。
本发明所述HIV感染的“治疗”是指对HIV感染的有效抑制,藉此延迟发生、延缓病程、减少病毒量,及/或改善由HIV感染所引起的症状。治疗包含对HIV暴露前和暴露后。
本发明所述HIV感染的“预防”是指延迟HIV感染的发生,及/或减少或消除HIV感染的发生率或可能性。本发明所述HIV传播的“预防”是指减少或消除HIV由一个体传染至另一个体(例如于怀孕、分娩或生产,或母乳喂养期间由HIV阳性的女性传至小孩)的发生率或可能性。
本发明所述“受试者”是指任何灵长类受试者,包含人类、恒河猴、狒狒和黑猩猩受试者。
为治疗及/或预防HIV感染,对有需求的受试者投予本发明抗体的治疗剂量。
本发明所述“治疗上有效剂量”是指抑制HIV感染效果所需剂量,藉此治疗及/或预防HIV感染。抗体的剂量取决于疾病状态和其他临床因素,例如受试者重量和状况、受试者对此疗法的反应、剂型的种类和给药途径。作为治疗上有效而非有害的精确剂量可由本领域技术人员所决定。
一般来说,投予成年人类的抗体的适当剂量范围介于约3至50mg/kg受试者体重,具有范围介于约5至25mg/kg受试者体重的典型初步范围可供使用。适当剂量也包含约5.0mg/kg、约10.0mg/kg、或约25.0mg/kg受试者体重。
包含本发明人类单克隆抗体的治疗性组合物可便于静脉投予(例如藉由单位剂量注射)。单位剂量一般是指本发明的治疗性组合物,其进一步是指对受试者适合作为单位剂量的物理上分开的单位,每一单位包含计算用以产生所欲治疗效果的活性物质的预定量和所需稀释剂(即载体或赋形剂)。
以适当剂型的方式与治疗上有效剂量投予组合物。给药量取决于所欲治疗的受试者、受试者身体利用活性物质的能力,以及所欲治疗效果的程度。需要投予的活性成分的精确剂量取决于医生的判断且具有个体的差异性。然而,所揭露供系统性应用的适当剂量范围取决于给药途径。用于投予的适当治疗方案也不尽相同,而是以于初次投予后投予重复剂量作为代表(于一或多个小时的间隔藉由之后的注射或其他投予方式)。另外,考虑在生物治疗中持续静脉输注以维持血液中的浓度于指定范围。
于受试者用以治疗、预防,及/或功能性治愈HIV感染的方法包含投予受试者有效剂量的含有抗体的剂型。在某些实施例中,以单次投予的方式提供剂型给受试者。在其他实施例中,以多次投予的方式提供剂型给受试者。当以多次投予的方式提供剂型时,剂型可以每天一次、每周一次、每两周一次(每隔一周),或每月一次投予。在具体实施例中,当治疗时程表是以每周一次时,剂型是以约5.0mg/kg受试者体重的剂量投予受试者。在另一实施例中,当治疗时程表是以每两周一次时,剂型是以约25.0mg/kg受试者体重的剂量投予受试者。
在某些实施例中,当以总共8周,以5mg/kg或25mg/kg剂量以每周为基础重复投予受试者时,含有单克隆抗体的剂型显现高安全系数且耐受性良好。在特定实施例中,单克隆抗体可以5mg/kg剂量在HIV感染数小时内投予受试者,以提供HIV感染的消除性治愈。在其他实施例中,单克隆抗体可以5mg/kg剂量于HIV感染后在数天内投予受试者,以提供HIV感染的功能性治愈。
在某些实施例中,本发明关于包含具有上述结合特征的单克隆人类、人源化或嵌合,抗-CD4抗体的医药组合物,可将其透过静脉注射(IV)、肌肉注射(IM)或皮下注射(SC)给药途径投予HIV患者作为免疫疗法以减少病毒量。在特定实施例中,本发明关于包含具有上述结合特征的人类、人源化或嵌合单克隆抗-CD4抗体的医药组合物,其展现竞争型HIV进入抑制与CD4+ T细胞活化,以作为HIV感染的患者的免疫疗法。
在其他某些实施例中,本发明关于包含具有上述结合特征的单克隆人类、人源化或嵌合抗-CD4抗体的医药组合物,可将其以每周或每两周的时程表以约10mg/kg或更高的剂量透过IV、IM或SC给药途径投予HIV患者作为免疫疗法以减少病毒量。
在其他实施例中,本发明关于包含具有上述结合特征的单克隆人类、人源化或嵌合抗-CD4抗体的医药组合物,其作为单一药物治疗可使接受治疗的受试者血清抗体水平高于10μg/mL,将病毒量降低至低于检测极限。
在其他实施例中,本发明关于包含具有上述结合特征的单克隆人类、人源化或嵌合抗-CD4抗体的医药组合物,其作为单一药物治疗可于为期12周治疗期间使接受治疗的受试者血清抗体水平高于10μg/mL,将病毒量降低至低于检测极限,且维持稳定的CD4T细胞数量。
在其他实施例中,本发明关于包含具有上述结合特征的单克隆人类、人源化或嵌合抗-CD4抗体的医药组合物,当以每周或每两周的时程表以约10mg/kg或更高的剂量投予作为单一药物治疗时,此种治疗可于为期12周治疗期间使接受治疗的受试者的病毒量降低至低于检测极限。
在其他实施例中,本发明关于包含具有上述结合特征的单克隆人类、人源化或嵌合抗-CD4抗体的医药组合物,当以每周或每两周的时程表以约10mg/kg或更高的剂量投予作为单一药物治疗时,此种治疗可使接受治疗的受试者的病毒量降低至低于检测极限,且只要血清抗体水平高于10μg/mL即无病毒量反弹。
在其他实施例中,本发明关于包含具有上述结合特征的单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物,其可作为偕同HAART的辅助治疗的关键成份,当以每周或每两周的时程表以约10mg/kg或更高的剂量投予未使用治疗药物的HIV患者,可达成患者的功能性治愈。
在其他实施例中,本发明关于包含具有上述结合特征的单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物,其可作为偕同HAART的辅助治疗的关键成份,当以每周或每两周的时程表以约10mg/kg或更高的剂量投予于HAART下具有稳定病毒量的患者,可达成患者的功能性治愈。
在其他实施例中,本发明关于包含具有上述结合特征的单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物,可将其以IV、IM或SC给药途径投予作为于HAART替代疗法的关键成份,藉此每治疗循环以抗-CD4抗体治疗2至4个月作为开始,其如同对于HARRT之下经历稳定低于检测极限病毒量的患者的治疗假日(treatment holiday),之后接续HAART治疗,进行1至4个或更多循环的期间,可达成功能性治愈。
在其他实施例中,本发明关于包含具有上述结合特征的单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物,可将其以IV、IM或SC给药途径投予作为于HAART替代疗法的关键成份,藉此对于未使用治疗药物的HIV患者每治疗循环以抗-CD4抗体治疗2至4个月作为开始,之后接续2至4个月的HAART治疗,进行1至4个或更多循环的期间,可达成功能性治愈。
在其他实施例中,本发明关于包含具有上述结合特征的单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物,可将其以IV、IM或SC给药途径投予作为于HAART替代疗法的关键成份,藉此每治疗循环以抗-CD4抗体治疗2至4个月作为开始,其如同对于HARRT之下经历稳定低于检测极限病毒量的患者的治疗假日,之后接续HAART治疗,进行1至4个或更多循环的期间,以每周或每两周的时程表以约5mg/kg或更高的剂量,可达成功能性治愈。
在其他实施例中,本发明关于包含具有上述结合特征的单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物,可将其以IV、IM或SC给药途径投予作为于HAART替代疗法的关键成份,藉此对于未使用治疗药物的HIV患者每治疗循环以抗-CD4抗体治疗2至4个月作为开始,之后接续2至4个月的HAART治疗,进行1至4个或更多循环的期间,以每周或每两周的时程表以约5mg/kg或更高的剂量,可达成功能性治愈。
在其他实施例中,本发明关于包含具有上述结合特征的单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物,其可作为偕同HAART的辅助治疗的关键成份,当以每周或每两周的时程表以约10mg/kg或更高的剂量投予未使用治疗药物的HIV患者,将达成患者的功能性治愈。
在其他实施例中,本发明关于包含具有上述结合特征的单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物,其可作为偕同HAART的辅助治疗的关键成份,当以每周或每两周的时程表以约10mg/kg或更高的剂量投予于HAART下具有稳定病毒量的患者,将达成患者的功能性治愈。
在其他实施例中,本发明关于包含具有上述结合特征的单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物,可将其以每周或每两周的时程表以约10mg/kg或更高的剂量透过IV、IM或SC给药途径投予对HAART的辅助治疗中HAART治疗失败的患者,使病毒进一步减少。
在其他实施例中,本发明关于包含具有上述结合特征的单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物,可将其以IV、IM或SC给药途径投予作为偕同HAART的辅助治疗的关键成份,于间歇模式中,每循环以2至4个月的治疗期作为开始,以及1至2个月的治疗假日,进行1至4个或更多循环的期间,对于未使用治疗药物的HIV患者如同于密集HAART治疗模式的辅助治疗,可达成患者的功能性治愈。
在其他实施例中,本发明关于包含具有上述结合特征的单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物,可将其以IV、IM或SC给药途径投予作为偕同HAART的辅助治疗的关键成份,于间歇模式中,每循环以2至4个月的治疗期作为开始,以及1至2个月的治疗假日,进行1至4个或更多循环的期间,以每周或每两周的时程表以约5mg/kg或更高的剂量,对于未使用治疗药物的HIV患者如同于密集HAART治疗模式的辅助治疗,可达成患者的功能性治愈。
在其他实施例中,本发明关于包含具有上述结合特征的单克隆人源化抗-CD4抗体的医药组合物,可将其以IV、IM或SC给药途径投予作为偕同HAART的辅助治疗的关键成份,于间歇模式中,每循环以2至4个月的治疗期作为开始,以及1至2个月的治疗假日,进行1至4个或更多循环的期间,以每周或每两周的时程表以约5mg/kg或更高的剂量,对HARRT之下经历稳定低于检测极限病毒量的患者如同于密集HAART治疗模式的辅助治疗,可达成患者的功能性治愈。
在其他实施例中,本发明关于包含具有上述结合特征的单克隆人类、人源化或嵌合抗-CD4抗体的医药组合物,可将其以IV、IM或SC给药途径投予HIV患者作为免疫疗法以减少病毒量。
在其他实施例中,本发明关于包含具有上述结合特征的单克隆人类、人源化或嵌合抗-CD4抗体的医药组合物,可将其以每周或每两周的时程表以约5mg/kg或更高的剂量透过IV、IM或SC给药途径投予HIV患者作为免疫疗法以减少病毒量。
具体实施例
本发明包含以下具体实施例:
(1)一种针对CD4分子的抗体,其中
抗体特异性地结合CD4分子的细胞外区域,且其中
当抗体结合位于CD4+细胞表面上的CD4分子时,抗体:
a)竞争型抑制HIV进入CD4+细胞;
b)活化位于HIV感染的静默CD4+细胞的潜伏HIV病毒库;
d)减少细胞HIV DNA的水平;以及
e)提供HIV感染的持续性病毒缓解且无病毒量反弹。
(2)依据(1)的抗体,其中抗体竞争型抑制HIV的无细胞和细胞间传播。
(3)依据(1)的抗体,其中抗体在投予受试者时可减少调节性T细胞的百分比。
(4)依据(1)的抗体,其中抗体在投予受试者时可增加CD8+细胞的数量。
(5)依据(1)的抗体,其中抗体在投予受试者时可增加对HIV gag基序肽刺激反应的CD8+增殖细胞。
(6)依据(1)的抗体,其中抗体在投予受试者时可增强靶向HIV感染CD4+细胞的功能性HIV特异性CD8+CTL细胞。
(7)依据(1)的抗体,其中抗体可增强于CD4+细胞的TNF-alpha的生成。
(8)依据(1)的抗体,其中抗体以有或无交联的方式活化静默CD4+细胞。
(9)依据(1)的抗体,其中抗体于HIV阳性患者中可减少HIV病毒量至每毫升血液低于50拷贝且无病毒量反弹。
(10)(1)的抗体,其中抗体结合至位于CD4分子的结构域1附近的区域。
(11)(1)的抗体,其中抗体结合至位于CD4的结构域1的CDR2区域附近的区域。
(12)(1)的抗体,其中抗体包含:
重链可变区氨基酸序列,该重链可变区氨基酸序列包含:
SEQ ID NO:1的CDR1、
SEQ ID NO:2的CDR2,以及
SEQ ID NO:3的CDR3;以及
轻链可变区氨基酸序列,该轻链可变区氨基酸序列包含:
SEQ ID NO:4的CDR1、
SEQ ID NO:5的CDR2,以及
SEQ ID NO:6的CDR3。
(13)(1)的抗体,其中抗体为单克隆抗体。
(14)(1)的抗体,其中抗体为人源化单克隆抗体。
(15)(1)的抗体,其中抗体为人源化单克隆抗体,该人源化单克隆抗体包含:
包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链可变区;以及
包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链可变区。
(16)(1)的抗体,其中抗体为人源化单克隆抗体,该人源化单克隆抗体包含:
包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链;以及
包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链。
(17)(1)的抗体,其中抗体为人源化单克隆抗体,该人源化单克隆抗体包含:
包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链;以及
包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链。
(18)(1)的抗体,其中抗体为人源化单克隆抗体,该人源化单克隆抗体包含:
包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链;以及
包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链。
(19)(1)的抗体对位于HPB-ALL细胞上与膜结合的CD4具有介于约3.1x10-11M至约8.1x10-11M的绝对结合亲和力(Kd)。
(20)(1)的抗体可结合CD4分子。
(21)一种包含(1)的抗体的组合物。
(22)一种医药组合物,包含(1)的抗体以及药学上可接受的载体。
(23)一种医药组合物,包含溶于磷酸盐缓冲液(PBS)、20mM甘氨酸以及0.05%(v/v)聚山梨酯20中的(1)的抗体。
(24)一种医药组合物,包含溶于磷酸盐缓冲液(PBS)、20mM甘氨酸、0.05%(v/v)聚山梨酯20以及10mM组氨酸中的(1)的抗体。
(25)一种医药组合物,包含溶于磷酸盐缓冲液(PBS)、20mM甘氨酸以及0.05%(v/v)聚山梨酯20中约1.0mg/mL至约200.0mg/mL的(1)的抗体。
(26)一种医药组合物,包含溶于磷酸盐缓冲液(PBS)、20mM甘氨酸、0.05%(v/v)聚山梨酯20以及10mM组氨酸中约1.0mg/mL至约200.0mg/mL的(1)的抗体。
(27)一种医药组合物,包含溶于磷酸盐缓冲液(PBS)、20mM甘氨酸以及0.05%(v/v)聚山梨酯20中约10.0mg/mL的(1)的抗体。
(28)一种医药组合物,包含溶于磷酸盐缓冲液(PBS)、20mM甘氨酸、0.05%(v/v)聚山梨酯20以及10mM组氨酸中约10.0mg/mL的(1)的抗体。
(29)一种医药组合物,包含(12)的抗体以及药学上可接受的载体。
(30)一种医药组合物,包含(16)的抗体以及药学上可接受的载体。
(31)一种用以治疗暴露于HIV的受试者的方法包含:
投予受试者(1)的抗体的药理学上有效剂量。
(32)依据(31)的方法,其中抗体是于暴露于HIV前投予受试者。
(33)依据(31)的方法,其中抗体是于暴露于HIV后投予该受试者。
(34)依据(31)的方法,其中抗体是于暴露于HIV后48小时内投予。
(35)依据(31)的方法,其中抗体是以至少约5mg/kg体重的剂量投予受试者。
(36)依据(35)的方法,其中抗体是以多次投予受试者。
(37)依据(36)的方法,其中抗体是以每周、每两周或每月的间隔投予受试者。
(38)依据(36)的方法,更包含投予受试者抗病毒药物的步骤。
(39)依据(38)的方法,其中抗病毒药物为高效抗反转录病毒疗法(HAART)。
(40)依据(39)的方法,其中HAART包含核苷类似物反转录酶抑制剂合并使用蛋白酶抑制剂或非核苷类反转录酶抑制剂。
(41)依据(39)的方法,其中抗体是与HAART同时投予。
(42)依据(39)的方法,其中在循环的期间内投予受试者抗体和HAART,其中此循环包含:
i)在第一段期间对受试者投予抗体,之后为第二段期间的治疗假日;以及
ii)持续地于(i)内的第一段期间和第二段期间对受试者投予HAART。
(43)依据(39)的方法,其中在循环的期间内投予受试者抗体和HAART,其中此循环包含:
i)以每周、每两周或每月的间隔于4个月的期间对受试者投予抗体,之后为两个月的治疗假日;以及
ii)于(i)内的六个月期间持续地对受试者投予HAART。
(44)依据(42)的方法,其中受试者是于两个循环的期间治疗。
(45)依据(43)的方法,其中受试者是于两个循环的期间治疗。
(46)依据(39)的方法,其中抗体是于不同于HAART的时间投予。
(47)依据(39)的方法,其中在循环的期间内投予受试者抗体和HAART,其中此循环包含:
i)在第一段期间对受试者投予抗体,之后为第二段期间的治疗假日;以及
ii)在第二段期间而非第一段期间对受试者投予HAART。
(48)依据(47)的方法,其中抗体于第一段期间是以定期间隔投予。
(49)依据(47)的方法,其中抗体于第一段期间是以每周、每两周或每月的间隔投予。
(50)一种用以治疗HIV感染的受试者的方法,包含给予受试者治疗方案,包含:
a)(1)的抗体的药理学上有效剂量;以及
b)高效抗反转录病毒疗法(HAART)。
(51)(50)的方法,其中抗体是以至少约5mg/kg体重的剂量投予受试者。
(52)依据(50)的方法,其中在循环的期间内投予受试者抗体和HAART,其中此循环包含:
i)在第一段期间对受试者投予抗体,之后为第二段期间的治疗假日;以及
ii)持续地于(i)内的第一段期间和第二段期间对受试者投予HAART。
(53)依据(50)的方法,其中在一循环的期间内投予受试者抗体和HAART,其中此循环包含:
i)以每周、每两周或每月的间隔于4个月的期间对受试者投予抗体,之后为两个月的治疗假日;以及
ii)于(i)内的六个月期间持续地对受试者投予HAART。
(54)依据(52)的方法,其中受试者是在两个循环或多个循环的期间治疗。
(55)依据(53)的方法,其中受试者是在两个循环或多个循环的期间治疗。
(56)依据(53)的方法,其中在循环的期间内投予受试者抗体和HAART,其中此循环包含:
i)以每周、每两周或每月的间隔于4个月的期间对受试者投予抗体,之后为两个月的治疗假日;以及
ii)于(i)内的六个月期间持续地对受试者投予HAART。
(57)依据(50)的方法,其中(a)内的抗体是于不同于(b)内的HAART的时间投予。
(58)依据(50)的方法,其中在循环的期间内投予受试者(a)内的抗体和(b)内的HAART,其中此循环包含:
i)在第一段期间对受试者投予抗体,之后为第二段期间的治疗假日;以及
ii)在第二段期间而非第一段期间对受试者投予HAART。
(59)依据(58)的方法,其中抗体于第一段期间是以定期间隔投予。
(60)依据(58)的方法,其中抗体于第一段期间是以每周、每两周或每月的间隔投予。
(61)一种用以抑制HIV进入CD4+细胞的方法,包含:
将(1)的抗体暴露于该细胞。
(62)一种用以抑制gp120结合CD4+细胞的方法,包含:
将(1)的抗体暴露于该细胞。
(63)一种用以活化静默CD4+ T细胞的方法,包含:
将(1)的抗体暴露于该细胞。
(64)一种用以活化位于静默T细胞的HIV的潜伏病毒库的方法,包含:
将(1)的抗体暴露于该细胞。
(65)一种用以减少位于HIV感染的细胞样品的潜伏HIV病毒库的方法,包含:
a)将(1)的抗体暴露于此细胞样品;以及
b)将HAART暴露于此细胞样品。
除非特别说明,在此使用的所有技术和科学用语如本发明所属技术领域中具有通常知识者的通常理解具有相同意义。除非上下文清楚地指出,否则单词“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包含复数形式。类似地,单词“或(or)”是意指包括“和(and)”,除非上下文另有明确说明。因此,“包含A或B”是指包括A,或B,或A和B。更应被理解的是,用于给定多肽的所有的氨基酸大小和所有分子量或分子质量值是近似的,并且被提供作为描述之用。然而类似或等同于在此描述者的方法和材料可被用于以下所述的揭露的方法、合适的方法和材料的实践或测试中。所有出版物、专利申请、专利和在此提及的其它参考文献透过引用在此并入本文整体。在冲突的情况下,以本说明书(包括术语的解释)为准。此外,材料、方法和实施例仅是说明性的而非意指加以限制。
所提供图式和相关实施例的以下说明性解释是用以便于理解在此频繁使用的某些术语,特别是在实施例中。解释是为便利性而被提供而非用以限制本发明。
实施例1.MAb B4的免疫和功能特性
单克隆抗体B4(mAb B4)或M2(mAb M2)为可辨识位于T细胞表面的复合HIV受体位点(CD4)的单克隆抗体。MAb B4或M2可影响和妨碍CD4和HIV共同受体的相互作用。MAb B4或M2优先地中和原代HIV-1分离株(此两种抗体于美国专利第5,912,176和6,090,388号有更详尽的讨论)。
以下信息总结了鼠源mAb B4的发现与初步的特性研究,其包含引用自两篇美国专利(由Wang所发明的美国5,912,176号和6,090,388号专利)和Wang等人于1999年发表期刊论文的数据,其均透过引用以并入本文整体。
1.衍生自利用HPB-ALL细胞或纯化的PBL T细胞免疫接种的鼠源单克隆抗体
以完整、未受感染的CD4+人类HPB-ALL细胞(一种T细胞急性淋巴细胞性白血病细胞系)免疫BALB/c小鼠以提供mAb B4。
以由PBL分离出的完整、未受感染的CD4+细胞免疫BALB/c小鼠以提供mAb M2。
所提供的新种类的抗-CD4抗体(以mAb B4或M2表示)对位于细胞表面的CD4具有特异性,且对HIV-1的原代分离株具有广泛的中和活性。
2.MAb B4辨识位置的特征
相较于重组可溶性CD4(rsCD4),发现mAb B4优先地辨识位于细胞表面上与膜结合的CD4(membrane-bound CD4)。
于暴露于HIV前的mAb B4结合至与膜结合的CD4显示可阻断后续gp120和整个病毒附着至CD4。然而,于暴露于抗体前就已结合至gp120的与膜结合的CD4仍然可结合mAb B4。因此,mAb B4能影响gp120结合至与膜结合的CD4,但是gp120并不影响mAb B4结合至CD4。
3.MAb B4的体外中和活性
透过一般的定义,鼠源mAb B4并非中和性抗体。反而,mAb B4是藉由覆盖宿主细胞受体,而非藉由附着至病毒,以抑制病毒进入。可藉由于此领域所使用的病毒中和试验而容易地观察到mAb B4对HIV感染的效果(例如MT-2微斑中和试验(MT-2 MicroplaqueNeutralization Assay)(Sawyer et al.,1994))。鼠源mAb B4的中和活性是由我们的合作者Carl Hanson博士(加州健康服务部)所评估,也于John Mascola博士(亨利杰克逊基金会,WRAIR)、David Montefiori博士(杜克大学)和Malcolm Martin博士(NIAID)的实验室中独立地评估。以下HIV中和特性,于1995年至2010年间被广泛地描绘,其与mAb B4相关:
(1)PBMC生长的原代分离株(PBMC-grown primary isolates)较T细胞系适应的分离株HIV-1IIIB和HIV-1MN对藉由mAb B4的中和作用更加敏感。
(2)MAb B4可中和透过使用CCR5/CXCR4(双性)和CCR5共同受体的原代分离株的感染。
(3)MAb B4对使用CXCR4共同受体的T细胞系适应的HIV-1分离株具有低活性。
(4)MAb B4可中和代表HIV-1亚型A-G的不同合胞诱导型(SyncVtial Inducing(SI))和非合胞诱导型(Non-SyncytialInducing(NSI))的原代分离株,达到90%终点指标(endpoints)与高达3个对数的感染性。
(5)MAb B4可中和具有双性共同受体HIV-1包膜的HIV-2、猿猴免疫不全病毒(SIV)和人猴嵌合免疫缺陷病毒(SHIV)。
(6)于扁桃体组织培养系统,mAb B4减少了两个对数的HIV-1原代分离株VL135(HIV-1VL135)的感染性。在活化的人类补体存在下,在此状况下许多抗-病毒抗体展现抗体依赖性增强作用,少至12.5μg/mL的mAb B4可完全地中和>100TID50(50%扁桃体感染剂量)的单亲细胞性(monocytotropic)分离株JR-CSF。
(7)当感染后48小时内加入mAb B4,mAb B4于HIV-1VL135展现中和活性;当72小时内加入,则具有显著的抗-病毒效果。
a.不论是否与细胞或病毒预培养,其均同样有效。
b.它的作用是藉由阻断感染的病灶传播至新的细胞,而非藉由进入后的机制。
c.在这些试验中,mAb B4并不有助于细胞毒性。
实施例2.HIV-1中和和抗药性试验
以下于1998年至2011年期间针对不同进化支的多个HIV分离株的病毒中和和抗药性试验是在Carl Hanson博士和Monogram生物科学公司的实验室中执行。此试验的详细说明如以下所述。
1.HIV-1中和试验
如每一试验所指明收集血液或抗体样品。使用MT-2微斑试验或有丝分裂促进剂(PHA)-刺激的PBMC试验,于一组含有多个进化支(multi-clade panel)的HIV-1分离株评估血清或抗体样品。
1.1.MT-2微斑试验
MT-2微斑试验限于HIV的合胞诱导型分离株。本试验于96孔盘上进行,于其藉由在微斑上合胞的荧光染色可计数到高达每孔洞25个微小空斑。在此试验中,受感染的MT-2细胞藉由透过熔化的琼脂糖离心形成单层,此熔化的琼脂糖于离心期间胶化。此试验被认为具有敏感性并具有遍布多个数量级数的动态范围。此试验也被视为是处理大量样品时唯一具有效率的方法。利用计算机化统计分析大量复制的孔洞,以提供使用其他方式所难以达成的质量控制与标准化的程度。
1.2.PBMC试验
PBMC试验是一种标准的抗原-减少试验,于此试验中,在受感染的细胞于96孔微量盘生长后,以抗原-捕获ELISA定量于PBMCs的p24抗原表达。此试验的优点在于其适用于所有的HIV病毒株与分离株。
1.3.病毒原液
用于离体与体内中和试验的HIV原液列于表3、表5和表6,以及图1A、1B、3、22和23。来自亚型A至G和H的原代HIV-1病毒为:(a)分离自参加病毒和立克次体疾病实验室(VRDL)加州健康服务部的旧金山男性健康研究的男性同性恋者;(b)由HIV分离和鉴定的世界卫生组织网络取得,(c)由美国军方HIV研究计划提供,以及(d)由国家过敏和传染病研究所AIDS研究和参考试剂计划所馈赠。DH-12(由患者分离,于黑猩猩外周血单个核细胞(PBMCs)继代,也是由国家过敏和传染病研究所AIDS研究和参考试剂计划所提供。
1.4.B4或dB4中和活性
B4或dB4中和活性定义为相对于不含抗体的对照组可提供指定百分比(50-95%)的病毒减少的抗体浓度。藉由于抗体稀释物之间的内插法推导出在50%和90%终点指标的抗体浓度。
2.PhenoSense HIV进入试验
用以测定抗药性的PhenoSense HIV进入试验是于Monogram生物科学公司执行(南旧金山,加州)。
利用从载体库产生的重组病毒于不同浓度的药物或抗体(例如B4或dB4)存在下感染细胞。测定用以抑制50%(IC50)或90%(IC90)试验载体的病毒复制所需的药物量。
2.1.使用于PhenoSense HIV试验的重组病毒的产生
PhenoSense HIV试验使用的重组病毒是由收集自患者的样本所产生,此些患者是于HIV感染的纵贯性研究所筛选出,并确定为HIV血清反应阳性者。对于发生HIV感染者,收集临床和血浆样品以供实验室评估(包括HIV病毒量和CD4细胞数量)。对于起初是血清反应阴性但于随访约一年后变成血清反应阳性的个体,利用两个酶免疫分析法和蛋白质印迹法的确证加以确认HIV感染。
收集来自于血清转化期间具有亚型A、BF、C、D、E、EA、F、G或J的受试者的样品(基于先前的HIV亚型分析,其乃利用多个杂交分析而达成),用以建构重组病毒(如表3所示)。由试验样品放大HIV env、pol区域,并克隆放大的DNAs进入试验载体。于GeneSeq HIV,测序载体库以确定HIV基因型。于PhenoSense HIV试验,于不同浓度药物存在下利用从载体库产生的重组病毒感染细胞。
实施例3.MAb B4对所有进化支的HIV分离株的中和活性(利用Monogram生物科学的PhenoSense试验)
已证实mAb B4可中和B进化支的所有HIV病毒。于本试验中共计73个具代表性的非B进化支HIV分离株,将来自进化支A(n=8)、BF(n=1)、C(n=18)、D(n=18)、E(n=4)、EA(n=10)、F(n=8)、G(n=4)、J(n=2),加上三个对照组病毒92HT594、JRCSF、JRFL,制成重组病毒,并于PhenoSense HIV试验中测试,以分析其对mAb B4的敏感性(请参见表1)。显示所有重组病毒对mAb B4具有高度敏感性,其具有无先例的低IC50和IC90浓度,具有平均IC50=0.018μg/mL和IC90=0.062μg/mL。值得注意的是,发现这些HIV病毒分离株中的多个衍生自具多重抗药性患者,此清楚地表明mAb B4或其人类对应物在已经对HIV药物产生抗药性的患者的治疗中具有高效率。
实施例4.单克隆抗体B4介导竞争型HIV进入抑制:可预测治疗后HIV抗药性突变体的预防的不可预期效果
竞争型抑制试验可评估抑制剂(例如,进入抑制剂抗体)与HIV包膜蛋白竞争位在CD4上相同受体结合位点从而抑制HIV进入细胞的能力和功效。理论试验中,mAb B4和HIV包膜蛋白(gp120)竞争结合CD4。图1A显示此试验的预测结果,在此每一条线代表不同的病毒分离株。具体地,从此理论试验的预期结果证明,虽然不同的病毒分离株对mAb B4具有不同敏感性(IC50),但只要mAb B4存在足够浓度下可抑制所有病毒分离株的进入,幅度达100%。
透过比较,非竞争型抑制试验可评估抑制剂(例如,共同受体拮抗剂或结合于CD4的不同部分的抗体)抑制或降低HIV包膜蛋白结合至CD4从而抑制HIV进入细胞的能力和功效。在理论试验中,分析非竞争型抑制剂(例如,TMB-355)抑制HIV包膜蛋白(gp120)结合CD4的能力。图2A显示此试验的预测结果,在此每一条线代表不同的病毒分离株。具体地,从此理论试验的预期结果证明,不同的病毒分离株对TMB-355具有不同敏感性(IC50),且不论TMB-355呈现量为何,至少一些部份的病毒分离株可进入细胞。基于此理论试验,如同于最大抑制百分比的“高原”,可预期不论IC50为何均可观察到HIV抗药性。
TMB-355(原TNX-355,也称为Ibalizumab)为人源化IgG4单克隆抗体,设计其结合恒河猴和人类CD4的细胞外结构域2以避免HIV结合后进入CD4+细胞(例如Burkly,LC,etal.,1992;和Kurizkes,DR,et al.,2004)。位于CD4的TMB-355抗体结合位点有别于HIV-1包膜蛋白gp120结合所需的位点,且有别于与主要组织相容性复合体蛋白质相互作用所需的位点。据此,TMB-355介导非竞争型HIV进入抑制。
已显示TMB-355对一些HIV-1病毒具有强烈的中和活性,但是当以一组广泛的HIV病毒株评估时,其抑制活性与中和活性并不一致。图2B显示TMB-355的MPI介于100%至15%(左边的Y轴),伴随由0.01μg/mL至10μg/mL的增加的IC50(右边的Y轴),对一组118种Env假型HIV病毒,以每一长条代表一种病毒分离株(Song,R.,et al.,2013)。于分析的所有进化支中,进化支A和E病毒较非进化支A和E病毒对TMB-355显著地具有敏感性。此外,发现来自接受TMB-355治疗以减少病毒量的患者的病毒抗药性突变体于gp120的V5区域具有突变(Toma,J.,et al.,2011;Pace,C.S.,et al.,2013)。以TMB-355(Ibalizumab)所证明的非竞争型抑制效应显示在抗体治疗期间有发展抗药性HIV突变体的高度可能性,因为具有低于100%抑制的分离株会发生病毒复制。
相反地,来自一组超过850种Env假型HIV病毒于10年期间收集的结果显示,mAb B4于HIV进入抑制提供了非预期的广泛性与效力(图1B)。从这些收集的数据可见mAb B4具有接近100%MPI,具有两个IC50浓度,一个是介于0.01至1μg/mL,且另一个是约10μg/mL。MAbB4的HIV进入抑制曲线具有竞争型抑制机制的典型特性,无论IC50为何,其对每一HIV病毒具有为~100%的MPI。鉴于mAb B4的显著强烈的竞争型HIV进入抑制特性,故在mAb B4治疗期间不大可能会发展出病毒抗药性突变体。这种严密的竞争型抑制,如透过mAb B4所展现者,迄今从未以任何其它测试的HIV抑制剂观察到。
来自此实施例的MPI和IC50的数据,与显示衍生自多重抗药性患者的多个HIV分离株对mAb B4具有高度敏感性的数据(实施例3)相结合,显示mAb B4或其人类对应物于HAART治疗失败的抗药性HIV患者治疗上具有高效率。由mAb B4所介导的中和模式提供独特HIV药物,其可于接受mAb B4或其人类对应相似物(具有相似Fv区域)治疗的HIV患者中预防抗药性病毒突变体的产生。如本发明所述,竞争型HIV结合抑制为一种独特的特性,可允许抗-CD4抗体于HIV患者治疗上展现临床功效。
实施例5.抗体B4有效地抑制HIV的无细胞和细胞间传播
HIV颗粒典型地藉由无细胞传播散布全身,在此病毒扩散于血流和局部环境中以感染细胞。病毒也藉由需要亲密细胞间接触的机制以具有直接地由受感染细胞转移至未受感染细胞的能力。此种传播发生于当受感染的细胞与未受感染的细胞形成稳定的接触点时,并直接地将HIV颗粒传播给未受感染的细胞。相较于无细胞传播,细胞间传播具有较高效率,速度较快,且不需要扩散至血流。
Sigal,A.等人于2011年报导,于抗反转录病毒药物tenofovir存在下,起源于无细胞病毒的感染激烈地下降,而于共培养试验中涉及细胞间传播的感染却显著地对药物较不具敏感性。敏感性的降低在药物的存在下足以阻止多轮感染的终止。作者使用随机感染模型在临床药物浓度的存在下研究来自细胞间传播的复制,并发现复制是间歇性的,无突变的实质积累。如果细胞间传播在体内具有相同的特性,它可能具有对免疫系统的不良后果,具有危险因子以导致个体的治疗失败,并可能有助于病毒的持久性,因此,其为治疗HIV感染的障碍。
因此,为了评估其于治疗上的潜在影响,重要的是评估用以抑制HIV细胞间传播的mAb B4和mAb dB4相关抗体的能力及效力。
1.用以测定HIV细胞间传播的抗体介导抑制的试验
1.1.材料和方法
1.1.1.细胞和病毒
选择Jurkat-inGLuc克隆(来自美国国立卫生研究所AIDS研究和参考试剂计划),其具有利用基因工程置入于HIV-1基因体中的报导基因萤光素酶(luciferase),选择其作为供体细胞(原因在于表面CD4的低度表达),以在与目标原代CD4+ T细胞的共培养试验中,可使供体间感染减到最少。报导基因萤光素酶可以在受感染的细胞中表达并作为病毒感染的标志。可测定于受感染细胞中的这些病毒表达的报导者,以定量HIV-1感染。以原代CD4+T细胞作为目标细胞。于此试验中使用进化支D的病毒UG266和UG046。
1.1.2.病毒细胞间传播试验
在本试验,在与指明的HIV-1病毒株混合之前,将供体与连续稀释的抗体B4预培养,并于几天后使用(当~10-75%的细胞为Gag+时)。之后以于200μl中为1.5×106细胞/ml的最终浓度在96孔盘上以1∶2比率混合供体和CD4阳性PBMC目标细胞。于48小时后,针对细胞内Gag进行细胞染色并以流式细胞仪分析。利用BioLux Gaussia Luciferase Assay试剂盒(New England Biolabs)和Berthold Technologies冷光测定仪侦测累积于培养上清液中的GLuc。
1.1.3.IC50和IC90的校正
透过拟合数据至S形的剂量-反应曲线(多变的斜率)绘制剂量-反应抑制曲线。抑制的百分比定义为(未处理的目标细胞的信号百分比-抗体处理的细胞的信号百分比)/(未处理的目标细胞的信号百分比)×100。依此计算IC50和IC90。
2.结果和讨论
表4显示,当透过严格的90%进入抑制标准测定时,抗体B4可等效地抑制HIV(进化支C的病毒株UG266和UG046)的细胞间和无细胞传播。具体来说,发现于细胞间传播试验中对UG266和UG046病毒株的融合抑制效价分别为1:140和1:245,其相当于在无细胞传播中和试验中为1∶136和1∶234的中和效价。当以50%进入抑制标准测定时,相较于相对应的无细胞传播,在对细胞间传播观察到对此两种病毒株较高的融合抑制效价。
这些结果证明,当与迄今所测定的所有其他针对HIV Env蛋白质的中和单克隆抗体或其他ART-药物相比较时,抗体B4于其在抑制HIV的细胞间和无细胞传播的能力方面均具有独特的特性。这些结果显示,只有mAb B4和mAb dB4相关抗体具有资格可在个体中预防HIV病毒的无细胞和细胞间传播。
实施例6.抗体UB-421(dB4C7或dB4)介导在HIV感染个体中用于增强病毒复制的静默PBMCs的再活化
1.背景
HIV-1感染静默的外周血单个核细胞(PBMCs)却保持不活化直到后续的细胞活化。利用体外模型(此体外模型是利用细胞培养条件和允许静默T细胞非增殖性感染的方法,模拟藏匿于静默PBMCs中的静默HIV-1),以研究热灭活的HIV-1(iHIV-1)或gpl20-抗-gpl20免疫复合物对这些静默PBMCs的刺激效应(Briant,L.,et al.,1996)。
此证明偕同热灭活HIV-1(iHIV-1)或gp120-抗-gpl20免疫复合物的包膜糖蛋白的CD4接合(CD4engagement)足以透过交联以刺激控制NF-κB(即核转位)和AP-1活化的信号传递路径,其依次涉及CD4的细胞外结构域1(D1)和细胞质内结构域与几种激酶(Lck、Raf-1、MEK和ERK),以诱导细胞周期进程、促进活化标志CD25的细胞表面表达,以及刺激原病毒整合和使细胞产生病毒。
由Than等人(Than,et al.,1997)的独立的科学发现进一步证实,利用抗-CD4单克隆抗体于gp120结合位的CD4分子的交联可诱导来自HIV感染患者的潜伏受感染的PBMCs以促进病毒复制。此试验中使用的抗-CD4 mAb为Leu3a,其可结合CD4的D1的CDR2-环。具体来说,Leu3是针对线性抗原表位,而此线性抗原表位代表具有CD4结构域1内的第47-64个氨基酸的肽(Chiba,Y.1992)。
此外,发现藉由针对CD4结构域1(D1)的CDR2-环的单克隆抗体可特异性地诱导于静默PBMCs的病毒的再活化,且此并非藉由针对其他抗原表位(例如位于D1的CDR3或接近D1/D2接合点区域(Briant,L.,et al.,1999))的抗体(参见图3,比较第4长条与第5和6长条)。可利用可溶性CD4(sCD4)事先吸附CDR2-环配体以预防此种病毒再活化(参见图3,比较第4长条和第8长条)。
因此,重要的是要评估抗体dB4C7(UB-421)(其对CD4结构域1附近区域具有高结合亲合力)是否可介导在HIV感染个体中用于增强病毒复制的静默PBMCs的再活化。
2.位于CD4的D1附近的B4/dB4构象结合位的结构精算
2.1.藉由mAb B4对Leu3a结合至黑猩猩CD4阳性PBMCs的竞争型顺序结合抑制(而非反向顺序)
于此试验中使用分离自两个受试者(X282和X301)的黑猩猩PBMC细胞、mAb B4(利用FITC标志)和Leu3a(以PE标志)。以个别的抗体顺序地染色PBMCs并进行细胞荧光显影(cytofluorography)的分析。由此实验所提供的数据如表5和图4所描述,并于下文中讨论。
于单一标志的对照组样品,只利用Leu3a染色的细胞测试呈现Leu3a-PE结合阳性(参见图4第2组图);且只利用mAb B4染色的细胞测试呈现B4-FITC结合阳性(参见图4第3组图)。具体来说,于未受感染的黑猩猩样品(X282和X301)的CD4+细胞(如利用Leu3a所侦测)分别为25.5%和44.0%,其与那些以mAb B4所侦测者(26.1%和45.5%)相似(表5)。
事先结合Leu3a之后暴露于mAb B4导致双重染色的(Leu3a+/B4+)PBMC细胞数量(参见图4第4组图)与单独只利用Leu3a或B4染色的单一标志的对照组细胞相似(即对X282和X301分别为24.5%和46.7%)(表5)。
相反地,事先结合mAb B4之后暴露于Leu3a导致在单一或双重染色过程中只有无Leu3a阳性染色的mAb B4染色的PBMCs(参见图4第5组图;表5)。
整体来说,这些结果证明针对Leu3a-PE的藉由抗体B4-FITC的单向抑制。也就是说,藉由事先Leu3a结合未能阻断B4结合;然而,藉由事先B4结合可阻断Leu3a结合。结论为mAb B4辨识涵盖CD4结构域1的CDR2区域的构象抗原表位(抗体Leu3a可辨识此区域),且mAbB4以相较于抗体Leu3a的较高的亲和力结合CD4的此区域。而这些数据支持此结论。
2.2.利用针对HIV RC肽(第39-66个氨基酸)的免疫血清对B4结合至rsCD4进行竞争型抑制(ELISA方法)
透过利用针对CD4结构域1CDR2区域的免疫血清的竞争型抑制试验,评估mAb B4对完整重组可溶性CD4(rsCD4)的结合亲合力。
2.2.1.抗-HIV RC多克隆抗体
利用包含CD4第39-66个氨基酸的环状肽免疫天竺鼠以制备针对CD4结构域1的CDR2区域的多克隆抗体。此环状肽于本试验中称为HIV受体复合体肽(HIV RC肽),且如同先前于Wang等人在2002年所描述的肽p2240c。
具体来说,第0周是配制于完全弗氏佐剂者,且第3和6周是配制于不完全弗氏佐剂者,接着在此之后以配制于不完全弗氏佐剂者每月加强,以每剂量0.5ml中内含100μg者肌肉注射免疫接种4-6周龄的Duncan Hartley天竺鼠后,于特定时间点收集针对HIV RC肽的天竺鼠血清。
提供的多克隆抗体称为“抗-HIV RC多克隆抗体”。
2.2.2.藉由抗-HIV RC多克隆抗体对B4结合rsCD4进行竞争型抑制
利用每孔洞以体积0.1mL浓度0.08μg/mL的完整rsCD4涂覆的96孔微量盘进行竞争型抑制实验。在利用生物素化B4-抗体结合前,将天竺鼠血清(在利用针对HIV RC肽(CD4的第39-66个氨基酸)的免疫原免疫接种后第0、3、6、9、12、14、16和19周收集天竺鼠血清)以1∶30的比例稀释与孔洞培养,之后利用与接合的抗生物素蛋白(avidin)-HR的结合作为示迹剂。也对从整个试验同期所收集来自未免疫接种的天竺鼠的阴性对照血清(RC同种型)进行测试。
图5显示藉由于初次免疫后第6周所提供的抗-HIV RC多克隆抗体可显著地抑制生物素化-B4结合至rsCD4,藉由于初次免疫后第9周所提供的抗-HIV RC多克隆抗体可达到近乎完全的抑制。
此竞争型结合抑制试验进一步证明mAb B4的结合位是位于CD4结构域1的CDR2环附近,虽然藉由mAb B4直接结合至此肽并非显著地是因为mAb B4对与膜结合的CD4的构象结构的偏好性结合。
2.3.于mAb dB4交联后在HIV感染个体中用于增强病毒制造的静默CD4阳性T细胞的再活化
藉由利用mAb dB4处理细胞并观测TNF-α产量、病毒量和细胞增殖,以评估mAb dB4活化静默CD4+细胞的能力。
在此试验中,藉由将培养盘与200μL山羊抗-人IgG(Jackson ImmunoResearch)在37℃下培养1小时,以将人类IgG涂覆于8孔培养盘。将涂覆的培养盘保存于4℃冰箱中直到本试验进一步使用。
依照标准作法将来自HIV患者的PBMC解冻1.5小时。如下所述,利用mAb dB4(实验组)、PMA+PHA(阳性对照组)或只有培养液(阴性对照组)处理PBMC,以评估静默CD4+细胞的活化。
2.3.1.MAb dB4处理
以mAb dB4(浓度为3μg/106细胞/mL)于4℃下处理细胞1小时以引发细胞上CD4的交联。细胞以mAb dB4处理,之后洗涤,并以RPMI培养液和10%胎牛血清于涂覆的48孔培养盘上培养7天。以未涂覆的孔洞作为阴性对照组。于第0天、第2天和第7天冷冻培养上清液供之后的评估。于4℃处理30分钟后由细胞移除上清液,以提供作为mAb dB4样品的时间点第0天。
2.3.2.PMA+PHA处理
以0.1μM植物凝集素(phytohaemagglutinin,PHA)加上15μg/mL豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯(phorbol myristate acetate,PMA)(Sigma)(PMA+PHA)于涂覆的48孔培养盘上和RPMI培养液与10%胎牛血清处理细胞7天,作为再活化的静默CD4+细胞的阳性对照组。利用未涂覆的孔洞作为阴性对照组。于第0天、第2天和第7天冷冻培养上清液供之后的评估。于4℃处理30分钟后由细胞移除上清液,以提供作为PMA+PHA样品的时间点第0天。
2.3.3.只有培养液
如同阴性对照组,于涂覆的48孔培养盘上以RPMI培养液和10%胎牛血清培养细胞7天(只有培养液)。利用未涂覆的孔洞作为额外的阴性对照组。于第0天、第2天和第7天冷冻培养上清液供之后的评估。于4℃下在培养液中培养30分钟后由细胞移除上清液,以提供作为只有培养液样品的时间点第0天。
2.3.4.CD4+再活化的分析
藉由评估TNF-α产量、病毒量和细胞增殖以测定CD4+细胞的再活化。于表6概述来自本试验的结果。
使用标准方法分析来自所有样品的溶液,项目包含:(1)利用定量的ELISA分析TNF-α浓度;(2)利用RT PCR分析HIV病毒量;(3)细胞数量;以及(4)利用锥虫蓝(trypanblue)分析存活率。
具体来说,数据显示,相较于只有培养液的阴性对照组(低于检测极限)和以PMA+PHA刺激的细胞(较mAb dB4覆盖的细胞高约3至5倍),mAb dB4交联所覆盖的来自HIV患者的PBMC细胞可引起TNF-α的中度生成。
同样地,mAb dB4样品以与只有培养液的阴性对照组相似的速率增殖;然而,PMA+PHA刺激的细胞具有相较于以mAb dB4交联的细胞更大程度的增殖(在第7天时,于PMA+PHA培养组别的细胞数量为mAb dB4培养组的5倍高)。
然而,相较于培养液对照组和PMA+PHA刺激的细胞,于以mAb dB4交联的细胞的HIV病毒量显著地增加。具体来说,当于第2和7天与只有培养液的阴性对照组相比较时,以mAbdB4交联的细胞于病毒量分别地具有151%和220%的增加;然而,PMA+PHA培养具有次佳的病毒量产生(于第2和7天分别为55%和78%),尽管其细胞增殖有5倍量的增加。
3.结论
(1)发现鼠源mAb B4可辨识位于CD4上的构象位置,且此构象位置接近抗体Leu3a所辨识的位置(位于CDR2区域第47-64个氨基酸)。基于在实施例7所描述的比较性试验,mAbdB4具有如同在此所述的对于mAb B4而言相同的辨识特性。
(2)利用多克隆抗体(此多克隆抗体是针对含有CD4结构域1的CDR2区域第39-66个氨基酸的环状肽(HIV RC肽))可抑制鼠源mAb B4对完整rsCD4的结合。这些结果显示mAb B4辨识CD4第39-66个氨基酸,其对应至CD4的D1的CDR2环。基于在实施例7所描述的比较性试验,预期mAb dB4具有如同在此所述的对于mAb B4而言相同的辨识特性。
(3)发现CD4与mAb dB4交联于HIV感染的PBMC CD4+ T细胞可活化病毒制造。具体来说,mAb dB4诱导TNF-α产生,并增强HIV制造,而未诱导细胞增殖(如表6所示)。
(4)基于此实施例所提供的结果,mAb dB4(包含UB-421)能介导在HIV感染个体中用于增强病毒制造的静默PBMCs的再活化。
实施例7.MAb dB4C7和抗-HIV RC多克隆抗体抑制抗原所引发的T细胞增殖和CD4阳性T细胞的细胞因子(IL2和IFN-γ)制造,因此破坏细胞焦亡的HIV致病循环
1.背景
最近的报告显示,当HIV感染允许(permissive)、活化的CD4+ T细胞时,细胞死亡透过caspase-3依赖性的细胞凋亡默默地发生(Doitsh,G.,et al.,2014)。相反地,当R5或X4-向性HIV失败地感染来自淋巴组织的非允许(non-permissive)、静默的CD4+ T细胞时,这些细胞透过caspase-1依赖性的细胞焦亡而死亡,其为程序性细胞死亡的强烈的炎症形式。被视为宿主DNA传感器的干扰素诱导因子16(IFI16)可识别不完整的HIV反转录产物,进而引发caspase-1的活化(Monroe,K.M.,et al.,2013)。在大多数的人类淋巴组织(包含扁桃体、淋巴结和脾脏)中,活化和允许的细胞次群体代表了CD4T细胞总数中的5%或更少数量,而非允许静默细胞则代表了遭遇HIV的目标中的95%或更多数量。因此,Caspase-1介导的细胞焦亡似乎主要地负责在这些淋巴组织感染HIV后驱使CD4T细胞死亡,而非caspase-3介导的细胞凋亡。分析来自以R5-向性HIV感染的受试者的新鲜淋巴结进一步支持这些发现,其中在富含静默CD4T细胞的副皮质区可侦测到caspase-1和IL-1β,而发现在解剖学上不同的生发中心(在此发现生产性感染细胞)可侦测到caspase-3活性。
细胞焦亡极可能透过促炎性细胞因子的释放和内源危险信号,藉由移除细胞内复制的小生境(niches)和增强宿主的防御反应,促进各种细菌性感染的快速清除。然而,在致病的慢性炎症,例如HIV感染,细胞焦亡不是保护性反应且并不会导致原发性感染的清除。事实上,细胞焦亡似乎制造了恶性的致病循环,在此濒死CD4 T细胞释放炎症信号以吸引更多细胞进入受感染的淋巴组织,进而死亡并产生更多的炎症。这些事件建立了炎症的慢性状态,其刺激病程和组织损伤。慢性炎症也可能促进潜伏HIV病毒库的维持,而潜伏HIV病毒库可刺激记忆CD4 T细胞的稳态增殖。
CD4 T细胞的耗竭和慢性炎症的发展是推动疾病进展的HIV致病机制中的特征过程,且细胞焦亡提供了这两种疾病-促进过程之间意外的连结。
以上数据显示,透过抑制由CD4+细胞的抗原刺激所引发的CD4+细胞增殖及/或炎性细胞因子制造的机制可能可以减轻或减少发生于HIV感染期间在淋巴组织的细胞焦亡。
2.实验
进行研究以确定是否mAb dB4可藉由于HIV感染个体抑制慢性炎症发展以破坏由细胞焦亡所引起的致病循环。抑制由抗原刺激所引发的细胞因子制造有助于缓解许多静默T细胞(静默T细胞已经有失败的HIV感染)的细胞焦亡的负担,从而破坏起因于细胞因子制造所造成于CD4阳性T细胞耗竭的HIV病理。
利用金黄色葡萄球菌B型肠毒素(SEB)的体外模型评估mAb dB4C7(UB-421)在正常和HIV感染个体中抑制PBMC T细胞增殖的能力。SEB是一种超抗原,其具有刺激带有特定T细胞抗原受体(TCR)的所有T细胞的能力,并可诱导大量的细胞因子制造。
透过与Huyen Cao和Mohamed Elrefaei博士的合作,进行了正常人类供体(n=3)和HIV感染供体(n=6,未使用ART治疗的患者,CD4+数量>200,病毒量>10,000)的功能分析,以评估mAb dB4C7(UB-421)或针对CD4的D1的CDR2区域的抗-HIV RC多克隆抗体(实施例9)是否可以抑制细胞增殖和细胞因子(IL2和IFN-γ)的产生。
2.1.研究对象和样品
从REACH cohort(旧金山)招募HIV-阳性未使用ART治疗的志愿者(n=6)。也将三个年龄一致的HIV-血清反应阴性对照组的志愿者纳入此试验中。将PBMC分离并冷冻保存在液氮中直到试验的时间。
2.2.使用mAb dB4C7或纯化的抗-HIV RC多克隆抗体的饱和浓度
首先在间接免疫荧光试验中分别以mAb dB4C7 IgG或抗-HIV RC多克隆抗体IgG染色CD4+ T淋巴细胞,之后再用Alexa-山羊抗-HuIgG或Alexa-山羊抗-天竺鼠IgG进行染色。为了侦测阳性细胞百分比,透过流式细胞仪分析所得的染色的细胞。MAb dB4C7和抗-HIVRC多克隆抗体于2倍稀释所测得的效价介于50μg/mL和0.0025μg/mL。MAb dB4和抗-HIV RC抗体的抗体效价测定为%CD4结合对抗体浓度(μg/mL)。在于HIV感染和正常个体进行T细胞功能测试使用之前评估这些抗体效价。
图6显示于功能试验中所使用各试剂的饱和浓度,mAb dB4(dB4C7)为1μg/mL和抗-HIV RC多克隆抗体为25μg/mL。
2.3.CD4+或CD8+ T细胞的增殖
利用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(carboxy-fluorescein succinimidyl ester,CFSE)荧光试验分析细胞增殖,其在细胞分裂时产生羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(carboxy-fluorescein diacetate,succinimidyl ester,CFDA-SE)染色的减少。利用CFSE作为3H-胸腺嘧啶(增殖)测试的代用品。
以mAb dB4C7或纯化的抗-HIV RC多克隆抗体的饱和浓度与PBMCs培养,以覆盖位于细胞表面上的CD4受体。细胞也分别与抗-HIV RC同种型(浓度为25μg/mL)和PHA(10μg/ml;Sigma-Aldrich)培养作为阴性和阳性对照组。
于PBS中以CFDA-SE(Molecular Probes,Eugene,OR)标志PBMCs,之后以100%FCS(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)进行荧光淬熄。在以PBS洗涤后,将细胞再悬浮于具有10%FCS的RPMI 1640(Sigma-Aldrich)中。
之后在SEB抗原(1μg/mL)存在下,将细胞于37℃含5%CO2的条件下培养5天,并分析表面标志的表达。
利用流式细胞仪圈选CD3+(Amcyan)细胞群中CD4+(PE,D2)及CD8+(PercpCY5.5)细胞群进行分析,并针对%CFSE阳性细胞(作为%增殖细胞)进一步测定此细胞群。利用LSRII(BD Biosciences,Mountain View,CA)获得每个样品四万(40,000)个淋巴细胞,并利用FLOWJO软件(TreeStar,San Carlos,CA)分析。结果测定为分裂的CD4(或CD8)T细胞的百分比。所有试验参与者证明于PHA刺激后的显著的细胞增殖。CD4 T细胞在无SEB抗原刺激下的细胞增殖为<0.5%(阴性对照组)。
2.4.用以测定细胞因子(IL2和IFN-γ)制造的细胞内染色试验
PBMC(0.5x106个细胞)与SEB抗原(1μg/mL)于37℃含5%CO2的条件下培养2小时。以含有0.1%FCS的PBS(洗涤缓冲液)洗涤细胞,将细胞再悬浮于裂解缓冲液(BDBiosciences)中于室温下反应10分钟进行固定。细胞以洗涤缓冲液洗涤一次,之后将细胞再悬浮于0.5mL的膜通透剂2(BD Biosciences)中并于室温下培养10分钟进行通透化处理。接着以洗涤缓冲液洗涤细胞,并以抗-IL-2 APC、抗-IFN-γ(PE CY7)以及抗-CD3(Amcyan)、抗-CD4(PE,D2)或抗-CD8(Percp CY5.5)(BD Pharmingen)染色。利用LSR II(BDBiosciences)获得每个样品四万(40,000)个淋巴细胞,并利用FLOWJO软件(TreeStar)分析。在无抗原刺激下的细胞因子-制造CD4或CD8T细胞的百分比为<0.05%(阴性对照组)。结果表示为表达IFN-γ或IL2的CD4+(或CD8+)T细胞的百分比。
2.5.统计分析
利用配对t检定进行统计分析和比较。
3.结果
此SEB抗原引发的T细胞增殖试验所提供的结果显示,在未使用HIV ART治疗的患者和年龄一致的正常个体中,mAb dB4C7(1μg/mL)和抗-HIV RC多克隆抗体(25μg/mL)在饱和状态下均可减少CD4+ T细胞增殖,而非CD8+ T细胞增殖(数据未示)。
MAb dB4(1μg/mL)和纯化的抗-HIV RC多克隆抗体(25μg/mL)于其个别的饱和PBMC表面CD4结合浓度下,于HIV阴性(图7A)和HIV阳性(图7B)个体均可抑制由超抗原SEB所引发增殖CD4+ T细胞的IL2生成。于来自相同HIV阳性和阴性个体的CD8+ T细胞中则未发现此种抑制(图7C)。
MAb dB4(1μg/mL)和纯化的抗-HIV RC抗体(25μg/mL)在其个别的饱和浓度下,于HIV阴性(图7D)和HIV阳性(图7E)个体也均可抑制由超抗原SEB所引发增殖CD4+ T细胞的IFN-gamma生成。于来自相同HIV阴性(图7F)和阳性(图7G)个体的CD8+ T细胞中则未发现此种抑制。
4.结论
抗体mAb dB4C7(UB-421)和抗-HIV RC多克隆抗体,二者针对CD4结构域1的CDR2区域,发现可抑制超抗原SEB所引发藉由CD4阳性T细胞的T细胞增殖和细胞因子(IL2和IFN-γ)生成,而非藉由CD8阳性T细胞的T细胞增殖和细胞因子(IL2和IFN-γ)生成。发现dB4C7和抗-HIV RC多克隆抗体可抑制CD4+ T细胞增殖和相关细胞因子(IL2和IFN-γ)生成,显示此抗体可能对其他CD4阳性细胞相关的细胞因子生成展现相似的抑制效果,具有破坏细胞焦亡的HIV致病循环的潜力。
在此与先前实施例所观察到,其对CD4阳性T细胞增殖和相关细胞因子(IL2和IFN-γ)生成的抑制效果为高度显著,其中在此所述的针对CDR2区域的抗体对CD4细胞可能展现同时发生的相反效果,包括:(1)静默HIV感染的CD4阳性T细胞的再活化,以引发由其潜伏状态释出HIV(实施例9);(2)藉由静默CD4+ T细胞的再活化,竞争型抑制和预防HIV从新释出的病毒进入未受感染的CD4阳性T细胞(实施例4和6);以及(3)当(超)抗原刺激时藉由CD4阳性T细胞抑制T细胞增殖和细胞因子生成(此实施例)。
针对HIV结合的特定位置(即CD4结构域1的CDR2区域)的mAb dB4和抗-HIV RC多克隆抗体的独特生物特征和免疫反应的引发可提供功能性治愈HIV感染所需的特性,即能够(1)透过进入抑制阻止HIV感染;(2)于静默T细胞再活化病毒制造;以及(3)直接地改变细胞因子生成。
实施例8.第IIa期,开放性,多次投予,剂量依赖性试验以研究UB-421于无症状HIV-1感染的成年人的安全性和疗效
1.试验目的
(1)评估于无症状HIV-1感染受试者的UB-421二剂量治疗方案的多次投予的安全性和耐受性。
(2)获得于这些受试者的UB-421二剂量治疗方案的多次投予的抗病毒活性证据。
(3)评估抗病毒活性和安全性概况以确定最佳UB-421给药和剂量治疗方案。
(临床试验标识符:NCT01668043)。
2.试验设计
这是利用UB-421的重复静脉内给药的开放性试验。为了可受试性(eligibility)而筛选对HIV-1血清反应阳性且无症状的受试者。二十九位纳入的受试者接受两个剂量水平(每周10mg/kg(第1剂量组)或每两周25mg/kg(第2剂量组))之一的试验药物(UB-421)的多次静脉输注,共为期8周的治疗期。基于收案顺序透过地点且轮流地将受试者分配到两个试验剂量组之一。在8周的治疗期之后随访受试者额外的八周。此试验在第16周结束。
3.纳入的标准
受试者必须满足以下标准才有资格参与第IIa期试验:
(1)无症状,未接受抗反转录病毒治疗(ART),HIV-1血清反应阳性
(2)CD4+ T细胞数量>350个细胞/mm3
(3)HIV-1病毒量>5,000拷贝/mL
(4)无需立即治疗的感染症(HIV-1除外)
(5)无使用免疫调节药物或全身化疗
(6)无需高效抗反转录病毒疗法(HAART)。
当依据对HIV/AIDS诊断与治疗的现行指导方针由试验总主持人视作必需时,在这项试验完成后,受试者于门诊遵循例行的监测时程表(无抗反转录病毒药物)或接受标准治疗的抗反转录病毒疗法(例如HAART)。允许于使用UB-421的第I期试验所纳入的个体和符合第IIa期试验的进入标准的个体参与此次试验。
4.试验用药品
以浓度为10mg/mL(100mg于10mL药瓶)提供UB-421(dB4C7 mAb)。
每个纳入的受试者接受利用以下剂量水平之一的UB-421的多次静脉输注:每周10mg/kg(第1剂量组)或每两周25mg/kg(第2剂量组),为期8周。UB-421的适当体积是基于特定剂量和受试者体重。使用无菌生理食盐水调整每个个别剂量的体积,藉此利用药物的等量输注体积输注一个剂量组内的每个个别受试者。对10mg/kg剂量组的输注总体积为约100mL,而对25mg/kg剂量组的输注总体积为约200mL。每次给药的输注时间为约一到两小时。
5.评估标准:
5.1.主要安全性和疗效终点:
直到第16周(试验结束)评估UB-421的以下安全性和耐受性参数:
(1)生理学检查(PE)
(2)生命征象
(3)临床化学和血液学试验
(4)不良事件(AE)/严重不良事件(SAE)的发生率
在试验期(从V2至V12)期间对每一个剂量组评估UB-421的以下疗效参数:
(1)个别最大病毒量下降
(2)平均最大病毒量下降
5.2.次要病毒学终点
在试验期(从V2至V12)期间评估以下病毒学反应:
(1)在每一试验剂量组内和之间根据次群组的个别最大病毒量下降和平均最大病毒量下降。
(2)具有病毒量<50拷贝/mL的受试者的比例;
(3)具有病毒量<200拷贝/mL的受试者的比例;
(4)具有病毒量下降>0.5log10拷贝/mL的受试者的比例;
(5)具有病毒量下降>1log10拷贝/mL的受试者的比例;
(6)分别地对第1剂量组和第2剂量组在最终完成试验药物投予后直到7天和14天具有病毒反弹(于病毒量从最低点有超过0.5log10的增加)的受试者的比例;
(7)抗-UB-421抗体的血清浓度(UB-421的免疫原性);
(8)CD4+和CD8+ T细胞数量的变化;
(9)UB-421的药物动力学参数(Cmax、AUC(0→∞)和AUC(0→last))。
6.分析群体
意图治疗(ITT)群体:29个受试者,其接受试验药物的至少一次给药。第1剂量组和第2剂量组的ITT群体分别为14个受试者和15个受试者。
依计划书执行临床试验的群体(Per-protocol(PP)population):18个受试者,其接受试验药物的所有给药,具有有效基准和至少一个有效的治疗后疗效测定(HIV-1病毒量试验),且无重大违反计划书规定。第1剂量组和第2剂量组的PP群体分别为7个受试者和11个受试者。
安全性和免疫原性群体:将29个受试者纳入意图治疗(ITT)群体。
药物动力学群体:是基于安全性和免疫原性群体中的次群体。
于安全性和免疫原性群体分析基线数据和安全性终点,然而疗效分析是在ITT和PP群体二者中进行。在药物动力学群体进行药物动力学分析。
7.试验期的持续时间
筛选期:<4周
治疗期:8周
随访期:治疗期结束后接着的8周
访视0代表初始筛选,而试验期间的每一次访视代表1周期间。随访期
通常以每周间隔执行。
8.结果的概述
8.1.试验群体
在台湾的两个试验地点筛选总共33个无症状的HIV感染的成年人。其中29个受试者通过了筛选标准并被选择进行试验。所有符合资格的29个受试者均为男性。
8.2.安全性和耐受性结果
所有29名受试者在试验期间经历至少1件不良事件,共计128件不良事件。其中,114例(在所有29个受试者中有89.06%)为治疗相关紧急不良事件(TEAEs)和14例(在5个受试者中有10.94%)为治疗前不良事件。于29个受试者中未观察到严重不良事件(SAEs)。所有治疗前不良事件均与UB-421无关,且这些事件中无事件被视为SAEs。报导TEAEs中的大多数(78.95%)为轻度,17.54%为中度,且3.51%(于一个受试者)是重度的。
最常见的(>10%)TEAE是皮疹和荨麻疹。除了不良事件,在22个受试者中观察到于血液学(于22个受试者中的154个事件)和生物化学(于6个受试者中的32个事件)的实验室异常检测结果。然而,大多数的变化是轻微且不具有临床意义的。生理学检查结果和生命征象在试验期期间大多为正常或无临床意义。
如临床试验计划书所说明,UB-421在试验期期间为耐受性良好的,其于8周治疗期的整体治疗耐受性为73.84%。
8.3.药效学
8.3.1 CD4+T和CD8+T细胞数量
在8周治疗期和8周随访期之后,平均CD4+T细胞数量从基线略微减少了55.10±117.97个细胞/mm3,而平均CD8+T细胞数量从基线增加了193.31±459.34个细胞/mm3。第1剂量组受试者的代表的CD4+T细胞数量和平均CD4T细胞数量如图9A左图所示。第2剂量组受试者的代表的CD4+T细胞数量和平均CD4T细胞数量如图9A右图所示。
8.3.2以UB-421覆盖CD4受体
利用荧光结合的UB-421透过流式细胞仪侦测CD4受体覆盖的程度。从四个代表受试者所提供的结果,来自第1剂量组的两个患者和来自第2剂量组的两个患者,分别如图8A至8B和图8C至8D所示。此试验的灵敏度为0.15μg/mL。以每周10mg/kg或每两周25mg/kg重复给药时,UB-421的临床疗效显示,当作为单一药物治疗时,于>10μg/mL的UB-421血清水平存在下可使病毒减少至低于检测极限。只要PBMC CD4+细胞被完全覆盖(即dB4C7-Alexa结合百分比接近0)就没有病毒反弹。
在以两个剂量水平投予UB-421二至三次后可达成以UB-421完全覆盖位于PBMC上的CD4受体。此外,于整个治疗期期间可保持以UB-421完全覆盖CD4+ T细胞(图8A-8D)。在大多数受试者中,如同利用荧光dB4C7mAb(dB4C7-Alexa)的结合所测定,在最终UB-421输注的三周内,结合至CD4受体的UB-421减少并回复至基线数值。
评估试验期间于受试者血清中所呈现的UB-421的浓度,以决定足以达成完全CD4覆盖和HIV-1病毒抑制的UB-421的血清浓度。基于所获得的数据,只要UB-421血清浓度维持在高于10μg/mL,则可利用UB-421达成持续的CD4+ T细胞的完全覆盖和HIV-1病毒抑制(图8A-8D)。
8.4.药物动力学
在第1剂量组中观察到平均AUC从17300±10000μg x小时/mL(访视1-2)增加至23900±10700μg x小时/mL(访视8-9),然后在访视11-12回复至基线。在第1剂量组中所观察到的平均AUC(0→last)是171000±70300μg x小时/mL。
在第2剂量组中观察到平均AUC从56500±19500μg x小时/mL(访视1-3)增加至61100±20700μg x小时/mL(访视7-9),然后在访视11-12回复至基线。在第2剂量组中所观察到的平均AUC(0→last)是239000±73900μg x小时/mL。
这些数据证明,如同利用AUC(0→last)所测定,相较于接受每周10mg/kg UB-421输注者(第1剂量组,171000±70300μg x小时/mL),平均血清药物浓度以在投予每两周25mg/kgUB-421输注的受试者中较高(第2剂量组,239000±73900μg x小时/mL)。
8.5.疗效结果
此试验招募29个HIV-1感染的受试者,其接受至少一剂的UB-421(ITT群体)。招募的29个受试者中,共计18个受试者完成了8周的治疗期,其接受试验药物的所有给药(PP群体)。于试验期间透过评定所纳入无症状HIV-1感染受试者的个别和平均最大病毒量下降,以评估UB-421多次投予的疗效,且将第1和2剂量组的ITT和PP群体的结果概述于表7。
发现平均最大病毒量下降在ITT或PP群体的两个剂量水平之间并无显著差异。具体来说,在第1剂量组于ITT群体的病毒量减少了2.27±0.60log10拷贝/mL,而在第2剂量组于ITT群体的病毒量减少了2.45±0.46log10拷贝/mL。于PP群体,在第1剂量组病毒量减少了2.73±0.34log10拷贝/mL,而在第2剂量组病毒量减少了2.47±0.45log10拷贝/mL。
在治疗期期间,于所有(n=29,100.00%)试验受试者观察到≥0.5log10拷贝/mL的病毒量下降;且于所有(n=29,100.00%)试验受试者观察到之1log10拷贝/mL的病毒量下降。
于以下内容揭露在治疗期期间所获得的数据的进一步评估:
在第1剂量组,于ITT的8/14(57.14%)的受试者和于PP的5/7(71.43%)的受试者具有≤200拷贝/mL的病毒量;此外,于ITT的3/14(21.43%)的受试者和于PP的3/7(42.86%)的受试者具有<50拷贝/mL的病毒量。
在第2剂量组,于ITT的10/15(66.67%)的受试者和于PP的7/11(63.64%)的受试者具有≤200拷贝/mL的病毒量;且于ITT的3/15(20.00%)的受试者和于PP的2/11(18.18%)的受试者具有<50拷贝/mL的病毒量。
来自第1和2剂量组受试者的代表的病毒量下降数据如表7及图9A所示。在每一剂量组之内、每一剂量组之间,或在每一剂量组内的次群体之间,于具有病毒量下降的受试者的比例并无统计上显著的差异。此外,在8周治疗期期间,在第1和2剂量组分别有42.9%和18.2%受试者的病毒量减少至低于目前实验检测极限(20拷贝/mL)的水平。在所有受试者中,当以UB-421完全覆盖CD4+ T细胞时可使病毒量下降持续。在随访期结束时,于两个剂量组的病毒量回复至基线水平。此外,在治疗期期间于任何的试验受试者中未观察到病毒反弹。来自两个剂量组的患者于整个治疗期中未侦测到可计量的抗-UB421抗体。
8.6.UB-421和TMB-355的比较
针对由他人(Jacobson,J.L.,et al.,2009;Toma,J.,et al.,2011;和Pace,C.S.,et al.,2013)所执行TMB-355(ibalizumab,先前称为TNX-355)的相似试验所提供的结果,以评估UB-421于此试验所提供的结果。图10A显示在具有CD4+细胞完全覆盖的UB-421存在下,有高达>3Log10的优异的病毒量下降而无病毒量反弹。相反地,甚至在CD4+细胞完全覆盖存在下,从治疗起只有一周之后,接受TMB-355治疗的患者便遭遇到病毒反弹,此为抗药性病毒突变体发展的象征(图10B)。
这两种治疗方案的比较,如图所示,证明了利用UB-421治疗HIV感染的受试者具有较TMB-355治疗明显的优势。具体来说,UB-421在整个治疗期中提供了于HIV病毒量的持续性下降,且甚至在进入到随访期的一或两周仍具有>3log10的最大病毒量下降。相反地,TMB-355藉由第一次投予只提供了暂时性的病毒量下降,以及接近1log10的最大病毒量下降。
此外,使用TMB-355的先前试验发现,尽管呈现血清TMB-355和CD4阳性T细胞的完全覆盖,HIV病毒反弹仍在进入治疗的一周后发生(Jacobson,J.L.,et al.,2009)。这结果与于上述实施例4的先前预测一致,非竞争型进入抑制机制,如TMB-355(ibalizumab)所介导者,在抗体治疗期期间可提供抗药性HIV突变体发展的高度可能性。实际上,发现来自接受TMB-355治疗以减少病毒量的患者的病毒抗药性突变体于gp120的V5区域上辨别出突变(Toma,J.,et al.,2011;Pace,C.S.,et al.,2013)。
当这些细胞被各种抗原,包括超抗原SEB、CMV肽pp65,或具有一致性B序列的HIVgag肽(HIV Gag基序肽)刺激时,对CD3+、CD3+/CD4+相对CD3+/CD8+细胞群体的增殖反应有一些非常有趣的观察。
如图9B所示,关于在治疗期之前(W1)、在结束时(W8)或两个月后(W16)的两群体以超抗原SEB(左图)或CMV pp65肽(右图)刺激的反应,在CD3或CD3/CD4+细胞都未见差异。
当以HIV Gag基序肽刺激来自接受UB-421的患者(在治疗期之前(W1)、在结束时(W8)或治疗期后两个月(W16))的PBMC产生非常有趣的观察(图11)。发现显著增殖的CD3+增殖反应,进一步分析是因为界于W1和W8的CD3/CD8+群体(P<0.01)。在接受UB-421后,当以HIV Gag基序肽刺激后,于HIV患者的CD3/CD8+群体显著增加,可提供在这些患者中经改进的HIV特异性CTL反应的重要具临床意义的指标,其可允许对这些患者中HIV感染T细胞较佳的监控,因此与那些无进展者的患者类似。
9.结论
发现于无症状HIV-1感染的受试者以UB-421进行8周治疗具有良好的耐受性。此外,分别来自第1(图9A左图)和2(图9A右图)剂量组的平均CD4T细胞数量在整个为期两个月的监测中保持稳定。
更重要的是,以UB-421治疗导致在所有受试者中显著的病毒量下降(100%接受治疗的受试者以≥1log10拷贝/mL的最大下降作出反应)。两种治疗方案,每周10mg/kg(第1剂量组)和每两周25mg/kg(第2剂量组)输注,显示于病毒量下降的类似疗效。在第1剂量组于ITT群体的平均最大病毒量下降达到2.27±0.60log10拷贝/mL,而在第2剂量组于ITT群体的平均最大病毒量下降达到2.45±0.46log10拷贝/mL。利用UB-421所观察到的病毒减少疗效比迄今所测试的任何其他的小分子抗HIV药物优越。
从此周密进行的UB-421的多剂量第IIa期试验所得到的临床试验结果证明在治疗期期间不具有病毒反弹的作为单一药物治疗的高耐受性、安全性,和于病毒量下降的空前的疗效。在这试验中所获得的结果是意想不到的,且与此领域中长期抱持的怀疑(结合CD4结构域1的抗-CD4单克隆抗体是免疫抑制的,因为其对于第二型主要组织相容性复合体所介导的免疫功能的干扰,且此种疗法对于HIV疾病的治疗并不合适(Jacobson,J.L.,etal.,2009))相矛盾。此结果进一步指出利用UB-421合并使用正交的(orthogonal)HAART及/或其他HIV病毒库激活剂(例如HDACi)的HIV疗法的额外形式可达到HIV感染的功能性治愈。
实施例9.利用UB-421单一药物治疗的治疗形式作为于HIV-1感染成年人的抗反转录病毒疗法的替代药物
图12说明利用UB-421单一药物治疗对稳定接受HAART治疗的患者的治疗形式,以作为抗反转录病毒疗法的替代药物。详细的目的和计划书于以下内容叙述。
1.适用的患者群体
藉由稳定的高效抗反转录病毒疗法(HAART)而具有病毒抑制的对HIV-1为血清反应阳性的受试者有资格进行此种治疗。
符合资格的患者在4个月的初期透过IV、IM或SC途径接受UB-421投予,之后是HAART治疗的另一个循环。“HAART-UB-421”交替治疗循环可重复多次,直到停用UB-421和HAART治疗时不再观察到病毒反弹为止,从而达成对HIV感染的功能性治愈。
更具体地,如图12所示,这些受试者分别地于为期8周和16周的治疗期,以两个剂量水平(每周10mg/kg或每两周25mg/kg)之一,接受试验药物(UB-421)的多次静脉输注。在第一次UB-421输注的前一天停用HAART治疗方案。在UB-421投予之前,依照试验总主持人所判断,给予受试者预防用药(治疗前给药),包含类固醇和抗组胺药物,以预防输注反应。在完成最后一次排程的UB-421给药后,所有受试者在同一天重启其原先或其他适当的病毒敏感的抗反转录病毒疗法。HAART治疗方案的使用是由试验总主持人所判断。在治疗期期间和在治疗期结束后的2个月监测来自所有患者的病毒量以及CD4和CD8细胞数量。
2.纳入标准
若受试者满足以下所有标准则可纳入此治疗形式:
(1)HIV-1血清反应阳性;
(2)年龄20岁(含)以上;
(3)已接受HAART治疗,定义为至少2个核苷类/核苷酸类反转录酶抑制剂(NRTIs)加上1个非核苷类反转录酶抑制剂(NNRTI)、整合酶抑制剂,或蛋白酶抑制剂,达至少2年;此治疗在进入本试验之前一年内是不间断的且无药物更换。
(4)在筛选访视前1年内具有CD4+ T细胞数量≥500个细胞/mm3或CD4百分比≥28%的两个测量值;
(5)在筛选访视前4周内或于筛选访视时所提供具有CD4+ T细胞数量≥500cells/mm3;
(6)筛选访视前至少1年的HIV-1血浆RNA保持在低于检测极限,每年具有至少2个病毒量测定。病毒量在筛选访视前4周内或于筛选访视时也是低于检测极限;在筛选访视前4周以前的可检测HIV血浆RNA的单次事件将不排除参与。
3.排除标准
为了以下任何的理由可将受试者排除在此治疗形式之外:
(1)需要立即治疗的任何感染症(HIV除外);
(2)根据美国疾病控制与预防中心(CDC)对HIV感染分类系统按照第B类和第C类条件的任何先前确诊或现行的AIDS-界定疾病;
(3)体重>80kg;
(4)在筛选前12周内任何纪录的CD4+ T细胞数量<250个细胞/mm3或CD4+ T细胞百分比≤14%;
(5)先前纳入于UB-421的第I期或第IIa期试验,或呈现抗-UB-421抗体的任何病史;
(6)在试验药物UB-421第一次给药前12周内对单克隆抗体的任何先前暴露;
(7)任何显著疾病(除了HIV-1感染)或临床上显著的发现,包括精神和行为问题,根据筛选、病史及/或生理学检查决定,由试验主持人判定,将受试者排除参加此项试验;
(8)在试验药物第一次给药前8周内的任何疫苗接种;
(9)在试验药物第一次给药前12周内的任何免疫调节治疗(包含干扰素)、全身化疗;
(10)少于12个月的预期余命;
(11)在试验药物第一次给药前12周内的任何非法静脉注射药物;
(12)由于病毒学失败和先前的非何杰金氏淋巴瘤或卡波西氏肉瘤的不只一次的HAART治疗方案改变;
(13)任何当前的酒精或非法毒品的使用,由试验主持人判定,会妨碍受试者去遵从投药和访视时程表以及计划书评估的能力。
4.药品成品
以浓度为10mg/mL(100mg于10mL药瓶)提供药品成品UB-421(dB4C7 mAb)。受试者利用静脉输注接受8次每周剂量为10mg/kg的UB-421,或8次每两周剂量为25mg/kg的UB-421。
UB-421的适当体积是基于特定剂量和受试者体重。使用无菌生理食盐水调整每个个别剂量的体积,藉此利用药物的等量输注体积输注一个剂量组内的每个个别受试者。对10mg/kg剂量组的输注总体积为约100mL,而对25mg/kg剂量组的输注总体积为约200mL。每次给药的输注时间为约一到两小时。
5.结果
5.1试验群体
在台湾的两个试验地点筛选总共29个稳定接受HAART治疗的HIV患者。其中29个受试者通过了筛选标准并被选择进行试验。所有符合资格的29个受试者均为男性。
5.2安全性和耐受性结果
所有29名受试者在试验期间经历至少1件不良事件。所有治疗前不良事件均与UB-421无关,且这些事件中无事件被视为SAEs。报导TEAEs中的大多数为轻度。最常见的TEAE是皮疹和荨麻疹。生理学检查结果和生命征象在试验期期间大多为正常或无临床意义。
如临床试验计划书所说明,UB-421在8周或16周的整体治疗耐受性治疗期间具良好耐受性。
5.3药效学
5.3.1 CD4+T和CD8+T细胞数量
在8周(第1剂量组)和16周(第2剂量组)治疗期和8周随访期(V12)之后,平均CD4+T细胞数量从基线(V1)在治疗和观察期后(V12)保持约略相同,没有显著差异(第1剂量组P=0.331,而第2剂量组P=0.905)(如图13所示);而对第1剂量组(P<0.001)与第2剂量组(P=0.004)而言,平均CD8+T细胞数量从基线(V1)在治疗和观察期后(V12)显著地增加(如图14所示)。于稳定接受HAART治疗的患者在UB-421治疗后观察到CD8+细胞的显著增加,此现象如实施例7图9A下图所示在接受UB-421的未接受治疗的患者中也可观察得到,此为接受UB-421治疗患者的重要特征。
5.3.2以UB-421覆盖CD4受体
利用荧光结合的UB-421透过流式细胞仪侦测CD4受体覆盖的程度。从来自第1剂量组和第2剂量组患者所提供的结果,分别如图15A和15B所示。对第1剂量组和第2剂量组而言发现,CD4受体的完全覆盖分别至第63天和112天。以每周10mg/kg或每两周25mg/kg重复给药后,UB-421的临床疗效显示,在整个治疗和完全CD4受体覆盖期间,以及在所有患者(100%)中当患者回复至其原先HAART治疗计划书在治疗后期间内(第1剂量组从第63至第112天,而第2剂量组从第112至168天),可使病毒量完全抑制至低于检测极限。只要在治疗期期间PBMC CD4+细胞被完全覆盖(即dB4C7-Alexa结合百分比接近0)就没有病毒反弹。
在两个剂量水平中只要投予UB-421一次后可达成以UB-421完全覆盖位于PBMC上的CD4受体。此外,于整个治疗期期间可保持以UB-421完全覆盖CD4+ T细胞(图15)。在大多数受试者中,如同利用荧光dB4C7 mAb(dB4C7-Alexa)的结合所测定,在最终UB-421输注的三周内,结合至CD4受体的UB-421减少并回复至基线数值。
评估试验期间于受试者血清中所呈现的UB-421的浓度,以决定足以达成完全CD4覆盖和HIV-1病毒抑制的UB-421的血清浓度。基于所获得的数据,只要UB-421血清浓度维持在高于10μg/mL,则可利用UB-421达成持续的CD4+ T细胞的完全覆盖和HIV-1病毒抑制。
5.3.3.调节性T细胞的定量
调节性T细胞(Tregs),以前称为抑制性T细胞,是调节免疫系统的T细胞的亚族群,可维持对自体抗原的耐受性,并避免自体免疫疾病。Tregs具有免疫抑制性,且通常可抑制或向下调节效应T细胞的诱导与增殖。Tregs表达生物标志CD4、FOXP3和CD25,且被视为衍生自与幼稚CD4细胞(CD4 cells)相同的系谱(en.wikipedia.org/wiki/Regulatory_T_cell)。因此,我们将%Tregs(出于CD3/CD4阳性细胞)纳入作为生物标志以评估UB421的免疫调节能力。下文描述了调节性T细胞的定量的方法。
将收集在EDTA真空采血管的血液于室温下以裂解缓冲液溶血10分钟,然后以染色缓冲液洗涤一次。在冰上利用用于表面标志染色的各种抗体(包括抗-CD4(D2)-FITC、抗-CD25-APC和抗-CD45-PerCP)进行细胞染色30分钟。然后将细胞洗涤两次并根据厂商说明书以抗-FoxP3-PE(BD Biosciences)进行细胞染色。然后将细胞洗涤两次并以固定缓冲液进行固定。于FACSVerse流式细胞仪上获得样品。利用FlowJo软件V10.0.8.(6)进行数据分析。
如图17所示,在V1之后于治疗期期间(V2至V8)的Treg细胞减少水平(%)平均约为V1的一半(于第1剂量组和第2剂量组分别为44.4-59.6%和52.4-65.3%)。在治疗期之后,于V11的Treg细胞%的水平反弹超过基线(于第1剂量组为120.5%,而第2剂量组为120.1%),且平均于V12回复至基线(于第1剂量组为110.5%,而第2剂量组为110.2%)。
5.3.4 HIV-1原病毒DNA的定量
HIV-1原病毒DNA可能可以提供于接受治疗的患者中用以监控HIV感染病毒库含量的另一生物标志。因此,如下所述,我们建立用以定量HIV-1原病毒DNA的试验,对已经在HAART治疗后达到稳定化状态的接受UB-421的患者进行监控。
5.3.5细胞分离和DNA萃取
将患者血液样品利用标准Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离出外周血单个核细胞(PBMCs)。利用ZR-Duet DNA/RNA Miniprep Plus Kit(Zymo Research)由纯化PBMCs萃取细胞DNA,并将其储存于-80℃直到使用时。在DNA萃取前计算每个样品的PBMCs数量。
5.3.6 HIV-1原病毒DNA的定量
经修饰的半巢式实时定量聚合酶连锁反应(semi-nested Real Time PCR)的引物和探针序列以及PCR程序如下所示。简言之,将纯化的DNA和标准质粒直接进行两轮PCR,其扩增具有HIV-1 gag基序的保留区域。首先在SimpliAmp Thermal Cycler(AppliedBiosystems)上进行10个循环反应,于25μl反应体积中,利用AmpliTaq Gold(AppliedBioSystem),以0.2μM的每一种引物、GAG1和SK431扩增萃取的DNA。随后利用第一次PCR产物作为第二次定量PCR扩增的模板,第二次定量PCR扩增是利用TaqMan侦测化学在实时定量聚合酶连锁反应机器上进行。在20μl反应体积中利用TaqMan Fast Advanced Master Mix(Applied BioSystem),以0.2μM的每一种引物、GAG1和GAG2对用于第二次PCR的2μl第一次PCR产物进行扩增,并在QuantStudio 5 RealTime PCR System(Applied BioSystem)上利用0.2μM的双重标记的荧光探针GAG3侦测第二次PCR的产物。利用含有HIV-1 gag衣壳区域的质体产生由5x106至4x101拷贝的标准曲线。
利用白蛋白基因的定量PCR测定细胞数量。于20μl反应体积中,利用TaqMan FastAdvanced Master Mix(Applied BioSystem),以0.2μM每一种引物、Alb-F和Alb-R扩增萃取的DNA,并在QuantStudio 5 RealTime PCR System(Applied BioSystem)上利用0.2μM双重标记的荧光探针Alb-P侦测第二次PCR的产物。利用含有白蛋白的质体产生由2.5x106至4x103个拷贝的标准曲线。
所有样品进行二重复试验。结果以每百万PBMCs的HIV原病毒DNA拷贝数加以表示,其利用由qPCR定量的细胞数进行标准化。引物和探针的序列如下所示:
SK431 5’-TGCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTCT-3’(SEQ ID NO:15),
GAG1 5’-TCAGCCCAGAAGTAATACCCATGT-3’(SEQ ID NO:16),
GAG2 5’-CACTGTGTTTAGCATGGTGTTT-3’(SEQ ID NO:17),
GAG35’-FAM-ATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGA-IBHQ-3’(SEQ ID NO:18),
Alb-F 5’-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3’(SEQ ID NO:19),
Alb-R 5’-ACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3’(SEQ ID NO:20),
Alb-P 5’-FAM-GGAGAGATTTGTGTGGGCATGACAGG-IBHQ-3’(SEQ ID NO:21)
5.3.7利用UB-421消除细胞HIV DNA
在UB-421 HAART取代治疗试验,收集PBMCs供DNA萃取和HIV原病毒DNA定量。在V1(UB-421治疗之前)、V8(UB-421治疗结束时)和V12(随访结束时)测定细胞HIV原病毒DNA含量。分析七个受试者发现,HIV原病毒DNA含量在UB-421治疗后显著地下降,且在患者回复至其原先HAART治疗后维持相似程度,直到最后UB-421投予后9周(V12)(图18)。此结果指出,UB-421治疗可于稳定接受HAART治疗的患者中进一步减少整合和未整合的细胞HIV原病毒DNA,此指明由于UB-421治疗而导致HIV病毒库细胞减少的潜力。这代表了与UB-421相关的另一项重要特征,超出其作为有效的HIV进入抑制剂的重要作用。
5.4疗效结果
将病毒反弹定义为病毒量于超过两次连续检测在每毫升血清或血浆中高于400HIV-1 RNA拷贝。如图16所示,对个别患者而言,除了在HAART治疗期间对稳定接受HAART治疗的患者以约略相同的频率偶而侦测到的少数忽上忽下的走势之外,在整个治疗期或是超出治疗期外可维持完全病毒抑制至低于400RNA拷贝/mL(虚线)。UB-421治疗作为HAART的替代药物达成100%疗效。
相较于NIH所实施相似的HAART替代试验(使用广泛中和抗-gp120单克隆抗体VRC01(NIH疫苗研究中心VRC01),当所有患者(9名之中的9名)于第11至86天治疗期间无法维持此种抑制(图19),利用UB-421治疗直到第16周维持100%病毒抑制(第2剂量组)的能力是空前的。当以病毒抑制百分比作为终点参数与迄今所测定的所有单一药物治疗(如在图20所示HIV-1药物)相比较时,这是更令人印象深刻的。
如图20所示,市场上HIV药物的历史性数据指出只有50%患者可维持病毒抑制状态直到第4周。VRC 01类似抗gp120广泛中和抗体显示对HIV-1药物的显著改进,其中70%接受此种单一药物治疗的患者可维持病毒抑制直到进入治疗的第4周,在此当治疗达第8周时约10%患者可维持病毒抑制。作为CCR5进入抑制剂的Pro140可提供超越上述二者的进一步改进,尽管不方便排除约30%进入试验的患者(因为患者的HIV-1并非使用CCR5作为进入受体),患者于第4周保持98%的病毒抑制,于第8周保持82%的抑制,并于第12周保持75%的抑制。最令人印象深刻的是,UB421作为单一药物治疗已经在此替代试验中证明,根据测试的临床试验计划书其可维持100%抑制直到治疗的第16周。此空前的临床试验结果指出只要CD4细胞被完全覆盖的病毒进入抑制(100%)的最先进疗效;如以在治疗期间的%Treg细胞减少,以及在治疗期间CD4和CD8细胞(例如于对HIV gag反应的CD8 T细胞增殖的增加)于患者中的恢复为例的令人印象深刻的免疫调节效果;以及UB-421治疗后HIV DNA含量的减少,表明病毒库细胞减少。
图21总结接受UB-421类似抗-CD4抗体治疗后会积极影响HIV-1患者的因素。例如,图21显示利用UB-421类似抗体治疗:(1)恢复HIV-抗原特异性T细胞活性,如于实施例8和9所证实,藉由在治疗后和治疗期间Treg细胞百分比减少、在治疗后增加CD8+细胞数量,以及在治疗后增加对HIV gag基序肽刺激反应的CD8+增殖细胞,所有这些都指明于那些HIV感染CD4细胞中介导靶向CTL的功能性HIV特异性T细胞的增强;(2)增强T细胞活化,如增加的TNF-α生成所示,特别是在组织滤泡CD4细胞,在此富含HIV病毒库T细胞,且此种细胞被紧包成团;(3)藉由提供有效的进入抑制阻断细胞间和无细胞感染,因此避免CD4阳性细胞新的感染。藉由这三个机制的支持,利用UB-421类似抗体治疗导致:(4)于HIV T细胞病毒库的减少,此可透过测定血液细胞中HIV DNA含量的减少加以证实。如图21所说明,这四个机制可导致最终HIV-1感染的持续性病毒缓解,或功能性治愈。
实施例10.利用UB-421直接活化CD4+细胞(利用TCR信号激酶LCK的磷酸化和活化加以测定)
调查经由Lck激酶磷酸化(其为TCR近端信号分子,且已知可直接结合至CD4细胞内结构域)的UB-421对CD4+ T细胞活化的影响。在利用UB-421和其他已知T细胞刺激剂(作为阳性对照组(例如OKT3,抗-CD3))刺激后利用蛋白质印迹法和流式细胞仪分析评估Lck磷酸化的程度。
T细胞的信号传递被严格调控以确保适当的T细胞活化和抑制。在抗原辨识后,蛋白质磷酸化是用以传递和增强T细胞受体信号(TCR信号)的主要途径。一种特异性地表达于T细胞中的激酶,淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(Lymphocyte-specific proteintyrosine kinase,Lck),在早期TCR信号传递和调节中具有重要性。Lck透过与共同受体CD4或CD8结合,而被吸引至TCR信号复合体,且其磷酸化CD3-zeta(ζ)链和zeta链相关蛋白激酶70(zeta-chain-associated protein kinase 70,Zap70)的免疫受体酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs,ITAMs),其依次磷酸化位于导致T细胞活化的TCR信号级联中的其他蛋白质。
Lck属于Src酪氨酸激酶家族,且仅在淋巴细胞中表达,主要是在NK和T细胞中。已知Src激酶家族的活性是由两个酪氨酸磷酸化位点控制,一个是增强(Lck的Y394),一个是抑制(Lck的Y505)其激酶活性。Lck的催化活性是由控制Y505和Y394磷酸化状态的激酶和磷酸酶所调控。于CD4+T细胞,Lck以四种不同活性状态存在:(1)未磷酸化,(2)Y394磷酸化,(3)Y505磷酸化,以及(4)无刺激的双重磷酸化状态。Y394是自磷酸化位点,且与蛋白质活化相关。Y505,其位置接近羧基端,可被Csk磷酸化,并可被CD45去磷酸化。在Y505磷酸化期间,Lck的三级结构被折叠,其阻断位点Y394的磷酸化。当CD45去磷酸化Y505时,位在Lck上的酪氨酸Y394被自磷酸化,以提供激酶活性。
在T细胞活化后,活化的Lck立刻被吸引至免疫突触并磷酸化下游分子。在TCR结合至抗原之后被活化,并磷酸化下游分子(包括CD3ζ链和ZAP-70),藉由(a)透过磷酸酶PTPN22的Y394的去磷酸化,以及(b)透过激酶Csk的Y505的再磷酸化,Lck被快速地去活化。在刺激后于不同时间点的Y394的去磷酸化指明透过TCR信号级联的T细胞活化。
UB-421结合至位于CD4结构域1上的CDR2区域附近的构象抗原表位,以阻断HIV-1结合和进入细胞。透过利用蛋白质印迹法和流式细胞仪分析定量Lck的Y394和Y505的磷酸化,已经研究了在结合至CD4之后UB-421对TCR信号传递级联和免疫调控的影响。
1材料与方法
1.1原代CD4+T细胞制备
首先利用Ficoll-Hypaque(GE Healthcare)密度梯度离心分离出来自正常健康捐赠者的外周血单个核细胞(PBMCs)。然后从纯化的PBMCs中利用CD4T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)阴性选择CD4+T细胞。
1.2 Phospho-Lck的免疫印迹分析
利用RPMI洗涤两百万(2x106)个Jurkat T细胞或原代人类T细胞两次。将所有细胞置于1ml预热的RPMI中以浓度为5μg/ml的单克隆抗体UB-421或抗-CD3(OKT-3,BioLegend)刺激,然后对“交联”样品利用10μg/ml链霉抗生物素蛋白(Jackson ImmunoResearch)进行交联,且在指定的时间间隔于37℃进行培养。藉由加入1ml冷的PBS以停止刺激,并离心以移除上清液。立刻将细胞沉淀物冷冻并储存于-80℃直到细胞裂解。
将冷冻的细胞沉淀物置于40μL的Triton-X100裂解缓冲液(1%(v/v))(溶于20mMTris-HCl(pH 7.4)和150mM NaCl,内含10μg/ml抑肽酶(aprotinin)、10μg/ml亮肽素(leupeptin)、1mM PMSF、1mM[正]钒酸钠、1mM焦磷酸钠,以及10mM氟化钠)中进行裂解。将溶胞产物于4℃以14,000rpm离心7分钟以移除细胞碎片。于SDS-PAGE上将细胞萃取物分成多个部份并转渍至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad)上。利用抗-phosph-Lck(Y394)(R&DSystems)、抗-phosph-Lck(Y505)(R&D Systems)或抗-Lck(Abcam),之后透过添加适当辣根过氧化物酶结合的二级抗体(Jackson ImmunoResearch),探测转渍膜。利用ClarityTM化学发光试剂(Bio-Rad)和BioSpectrum 500成像系统(UVP)侦测信号。用于免疫印迹的所有一级抗体是以1∶1,000至1∶5,000稀释而加以使用。Lck Y394和Y505的磷酸化程度(条带的密度)是利用VisionWorkLS 8.2成像系统软件测定,并以于每个时间点的总Lck的密度加以标准化。
1.3 Phospho-Lck的流式细胞仪分析
在刺激前将分离的CD4+T细胞置于无血清的AIM-5培养液中隔夜培养。将CD4+T细胞置于冰上,并且在于冰上培养额外10分钟之前将5μg/mL生物素化抗-CD3抗体(OKT-3,BioLegend)或UB-421加入细胞中。然后细胞在37℃下于有或无交联状况下刺激指定的时间。藉由在37℃下刺激指定的时间前将纯化的链霉抗生物素蛋白加入生物素化的抗体以达成交联。然后利用Phosflow固定缓冲液(BD Biosciences)于37℃下作用10分钟立即地固定细胞,之后再以Phosflow Perm/Wash缓冲液(BD Biosciences)对细胞进行通透化。在冰上利用PE-抗-Src(pY418)和Alexa Fluor 647-抗-Lck(pY505)(BD Biosciences)对细胞进行染色。在BD FACSVerse流式细胞仪(BD Biosciences)上收集所有样品。在FloWJo软件V10.0.8(Tree Star Inc.,Ashland,OR)上进行数据分析。
2.结果
从约80mL正常健康捐赠者的血液获得CD4+T细胞。血液样品有限且各捐赠者的CD4+ T细胞数量不尽相同。因此,并非所有测试条件都可以用相同捐赠者的CD4+T细胞进行。在几个例子中,只在无交联状况下评估UB-421对Lck磷酸化的影响。在交联状况下测试的阳性对照组是抗-CD3(OKT3),而阴性对照组是未处理(只有培养基)的样品。
2.1由UB-421结合于Jurkat T细胞上所引起的Lck的酪氨酸磷酸化
利用UB-421刺激Jurkat T细胞,以评估其诱导Lck磷酸化和下游TCR信号传递事件的能力。使用抗-CD3抗体(已知的T细胞刺激剂)刺激作为阳性对照组。先前的实验利用流式细胞仪证明100%的Jurkat T细胞在细胞表面表达CD4受体。
如预期的,在交联状况下,于抗-CD3-刺激的Jurkat T细胞的phospho-Y394 Lck水平增加且于第一个时间点(5分钟)达到峰值(图22A和图22B)。
在利用UB-421刺激的细胞中,于Jurkat细胞中在交联或无交联的两种状况下Lck都会被磷酸化,且Lck酪氨酸Y394的磷酸化水平增加并于15分钟后达到峰值(图22C和图22D)。
2.2由UB-421结合于原代CD4+ T细胞上所引起的Lck的酪氨酸磷酸化
在原代CD4+T细胞中研究UB-421结合对CD4和TCR信号的影响。
利用阴性筛选分离CD4+T细胞并纯化至约90-95%的纯度。作为阳性对照组,利用抗-CD3抗体刺激细胞,且Lck Y394磷酸化水平如预期持续(图23A和图23B)。
出人意料地,在交联和无交联的两种状况下于利用UB-421刺激的细胞中,LckY394和Y505二者的酪氨酸磷酸化都被增强(图24A和图24B)。相较于来自相同捐赠者(捐赠者1和捐赠者2)在交联状况下以UB-421刺激的细胞中Lck Y394磷酸化程度,Lck Y394磷酸化程度在无交联状况下以UB-421刺激的细胞中略低(图24A)。在有或无UB-421交联的状况下,捐赠者1的磷酸化的Y394-Lck于5分钟达到峰值,而捐赠者2的磷酸化的Y394-Lck于30分钟达到峰值(图24A)。
为了进一步评估于无交联状况下UB-421的刺激能力,利用蛋白质印迹分析测试来自额外捐赠者(捐赠者4至7)的原代CD4+ T细胞。在测试的大多数捐赠者中观察到活化(Y394的磷酸化)和抑制(Y505的磷酸化)(图24A至24D)。磷酸化的程度、达到峰值和持续的时间似乎在个别捐赠者间存在显著差异(图24C和图24D)。对于无交联状况下利用UB-421处理的CD4+T细胞而言,在捐赠者之间Y394的峰值磷酸化水平范围介于1至4倍,在刺激后达到峰值的时间范围介于5至30分钟(图24C和图24D)。
透过流式细胞仪利用细胞内染色进一步评估UB-421所引起的Lck磷酸化,以在单个细胞基础上测量Lck Y394和Y505磷酸化。作为阳性对照组,于交联状况下利用抗-CD3抗体刺激细胞。在阳性对照组样品中,Lck磷酸化和去磷酸化迅速发生以控制TCR信号的强度(图25A,虚线)。在阴性对照组样品中(无任何处理),Y394和Y505磷酸化水平随时间保持不变(图25A,实线)。
利用UB-421处理来自两个不同捐赠者(捐赠者8和9)的原代CD4+T细胞。在交联状况下,发现UB-421可引起Y394和Y505磷酸化,其与利用抗-CD3刺激的阳性对照组细胞类似(图25B,虚线)。在无交联状况下,UB-421引起较低的Lck磷酸化(图25B,实线)。在某些例子中,只有观察到下降的趋势,原因在于活化发生得太快。此结果证明Y394的峰值磷酸化水平发生得比Y505早。图25B显示,相较于Y505的峰值磷酸化水平发生在第10分钟,Y394的峰值磷酸化水平发生在约第3分钟。结果也显示,由UB-421交联所引起的Lck磷酸化达到高原的时间较抗-CD3刺激晚,但相较于抗-CD3具有相似的磷酸化水平。
3.讨论
CD4+T细胞的TCR信号被严格调控以避免不必要和不受控制的免疫反应。作为TCR信号的关键激酶,Lck的活性在时间和空间上均受到调控。在此试验中,证明UB-421(UB-421为抗-CD4抗体)能够活化CD4+T细胞并引发位于Y394(活化形式)和Y505(抑制形式)的Lck磷酸化。透过分析Lck的Y394磷酸化,在UB-421无交联状况下在大多数捐赠者的CD4+T细胞中的Lck被活化;然而,相较于交联状况下利用UB-421处理,其磷酸化程度较低。透过流式细胞仪分析发现,在交联UB-421状况下,活化性酪氨酸首先被磷酸化,并在第3分钟达到高原,之后是抑制性酪氨酸Y505磷酸化,其于约第10分钟达到高原。此表明Lck活性首先被Y394的磷酸化所增强,然后很快地被Y505的抑制性磷酸化所控制。
已经在用以治疗慢性HIV感染的几项临床试验中对UB-421进行评估,且显示UB-421作为单一疗法在HIV病毒抑制上具有很大的疗效。藉由结合至CD4,UB-421也可以在交联或无交联状况下引发TCR信号级联激酶Lck的活化。UB-421治疗对Lck Y394和Y505磷酸化水平、达到峰值和持续的时间的影响因受试者不同而异。目前的研究结果表明,UB-421可能具有调控免疫反应的潜力。除了透过HIV进入的竞争型抑制之外,透过增强CD4+T细胞反应,UB-421还可以透过内在的免疫反应控制HIV感染。此对于UB-421所引发的CD4+T细胞TCR信号和免疫反应的调查与进一步研究可以更好地了解UB-421在控制HIV感染的额外机制。
4.结论
·目前研究的结果证明,UB-421与CD4的结合于来自正常健康捐赠者的原代CD4+T细胞中透过活化性酪氨酸Y394和抑制性酪氨酸Y505而引发或增强Lck的磷酸化。
·在交联或无交联状况下可利用UB-421活化Lck的磷酸化。
·利用UB-421治疗后,Lck磷酸化的程度、达到峰值和持续的时间因个别捐赠者不同而异。
·UB-421除了作为有效的HIV进入抑制剂以外还可以作为免疫调节剂。
所有说明书中所揭示的发明技术特点可以任意方式组合。说明书中揭示的每一技术特点可以提供相同、等同或相似目的的其他方式替换。因此,除非另有特别说明,文中所有揭示的特点均只是等同或相似特点的一般系列的实例。
由上述可知,熟习此技艺者能轻易地了解本发明的必要特征,在不脱离其精神与范围之下能就本发明做许多改变与调整以应用于不同用途与条件。
表1.单克隆抗体B4的HIV进入抑制活性(Monogram BioScience PhenoSenseTM试验)
表2.相较于亲本B4的去免疫化B4(dB4C7)的中和活性(MT-2微斑试验)
表3.相较于亲本B4的去免疫化B4(dB4C7)的中和活性(PBMC试验)
表4.单克隆抗体B4阻断HIV的无细胞和细胞间传播
表5.利用FACS分析的顺序性染色-阳性PBMC百分比
表6.于PBMC培养物的TNF-α水平和HIV-1病毒量
ND:低于检测极限
表7.在第IIa期试验于多次投予UB-421后的病毒量下降
ITT:意图治疗群体(Intent-to-Treat Population)
PP:依计划书执行临床试验的群体(Per-Protocol Population)
VL:病毒量(Viral Load)
表8.于功能性治愈的UB-421治疗的设计
Claims (65)
1.一种针对CD4分子的抗体,其中
该抗体特异性地结合该CD4分子的细胞外区域,且其中
当该抗体结合位于CD4+细胞表面上的该CD4分子时,该抗体:
a)竞争型抑制HIV进入该CD4+细胞;
b)活化位于HIV感染的静默CD4+细胞的潜伏HIV病毒库;
d)减少细胞HIV DNA的量;以及
e)提供HIV感染的持续性病毒缓解且无病毒量反弹。
2.如权利要求1所述的抗体,其中该抗体竞争型抑制HIV的无细胞和细胞间传播(transmission)。
3.如权利要求1所述的抗体,其中该抗体在投予受试者时可减少调节性T细胞的百分比。
4.如权利要求1所述的抗体,其中该抗体在投予受试者时可增加CD8+细胞的数量。
5.如权利要求1所述的抗体,其中该抗体在投予受试者时可增加对HIV gag基序肽刺激反应的CD8+增殖细胞。
6.如权利要求1所述的抗体,其中该抗体在投予受试者时可增强靶向HIV感染CD4+细胞的功能性HIV特异性CD8+CTL细胞。
7.如权利要求1所述的抗体,其中该抗体可增强CD4+细胞的TNF-alpha的生成。
8.如权利要求1所述的抗体,其中该抗体以有或无交联的方式活化静默CD4+细胞。
9.如权利要求1所述的抗体,其中该抗体于HIV阳性患者中可减少HIV病毒量至每毫升血液低于50个拷贝且无病毒量反弹。
10.如权利要求1所述的抗体,其中该抗体结合至位于该CD4分子的结构域1附近的区域。
11.如权利要求1所述的抗体,其中该抗体结合至位于CD4的结构域1的CDR2区域附近的区域。
12.如权利要求1所述的抗体,其中该抗体包含:
重链可变区氨基酸序列,该重链可变区氨基酸序列包含:
SEQ ID NO:1的CDR1、
SEQ ID NO:2的CDR2,以及
SEQ ID NO:3的CDR3;以及
轻链可变区氨基酸序列,该轻链可变区氨基酸序列包含:
SEQ ID NO:4的CDR1、
SEQ ID NO:5的CDR2,以及
SEQ ID NO:6的CDR3。
13.如权利要求1所述的抗体,其中该抗体为单克隆抗体。
14.如权利要求1所述的抗体,其中该抗体为人源化单克隆抗体。
15.如权利要求1所述的抗体,其中该抗体为人源化单克隆抗体,该人源化单克隆抗体包含:
包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链可变区;以及
包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链可变区。
16.如权利要求1所述的抗体,其中该抗体为人源化单克隆抗体,该人源化单克隆抗体包含:
包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链;以及
包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链。
17.如权利要求1所述的抗体,其中该抗体为人源化单克隆抗体,该人源化单克隆抗体包含:
包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链;以及
包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链。
18.如权利要求1所述的抗体,其中该抗体为人源化单克隆抗体,该人源化单克隆抗体包含:
包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链;以及
包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链。
19.如权利要求1所述的抗体,其对位于HPB-ALL细胞上与膜结合的CD4具有介于约3.1x10-11M至约8.1x 10-11M的绝对结合亲和力(Kd)。
20.如权利要求1所述的抗体,其结合至CD4分子。
21.一种包含如权利要求1所述的抗体的组合物。
22.一种医药组合物,包含如权利要求1所述的抗体以及药学上可接受的载体。
23.一种医药组合物,包含溶于磷酸盐缓冲液(PBS)、20mM甘氨酸以及0.05%(v/v)聚山梨酯20中的如权利要求1所述的抗体。
24.一种医药组合物,包含溶于磷酸盐缓冲液(PBS)、20mM甘氨酸、0.05%(V/v)聚山梨酯20以及10mM组氨酸中的如权利要求1所述的抗体。
25.一种医药组合物,包含溶于磷酸盐缓冲液(PBS)、20mM甘氨酸以及0.05%(v/v)聚山梨酯20中约1.0mg/mL至约200.0mg/mL的如权利要求1所述的抗体。
26.一种医药组合物,包含溶于磷酸盐缓冲液(PBS)、20mM甘氨酸、0.05%(v/v)聚山梨酯20以及10mM组氨酸中约1.0mg/mL至约200.0mg/mL的如权利要求1所述的抗体。
27.一种医药组合物,包含溶于磷酸盐缓冲液(PBS)、20mM甘氨酸以及0.05%(V/v)聚山梨酯20中约10.0mg/mL的如权利要求1所述的抗体。
28.一种医药组合物,包含溶于磷酸盐缓冲液(PBS)、20mM甘氨酸、0.05%(v/v)聚山梨酯20以及10mM组氨酸中约10.0mg/mL的如权利要求1所述的抗体。
29.一种医药组合物,包含如权利要求12所述的抗体以及药学上可接受的载体。
30.一种医药组合物,包含如权利要求16所述的抗体以及药学上可接受的载体。
31.一种用以治疗暴露于HIV的受试者的方法,包含:
投予该受试者如权利要求1所述的抗体的药理学上有效剂量。
32.如权利要求31所述的方法,其中该抗体在暴露于HIV前投予该受试者。
33.如权利要求31所述的方法,其中该抗体在暴露于HIV后投予该受试者。
34.如权利要求31所述的方法,其中该抗体在暴露于HIV后48小时内投予。
35.如权利要求31所述的方法,其中该抗体是以至少约5mg/kg体重的剂量投予该受试者。
36.如权利要求35所述的方法,其中该抗体多次投予该受试者。
37.如权利要求36所述的方法,其中该抗体是以每周、每两周或每月的间隔投予该受试者。
38.如权利要求36所述的方法,更包含投予该受试者抗病毒药物的步骤。
39.如权利要求38所述的方法,其中该抗病毒药物为高效抗反转录病毒疗法(HAART)。
40.如权利要求39所述的方法,其中该HAART包含核苷类似物反转录酶抑制剂合并使用蛋白酶抑制剂或非核苷类反转录酶抑制剂。
41.如权利要求39所述的方法,其中该抗体与HAART同时投予。
42.如权利要求39所述的方法,其中在循环的期间内投予该受试者该抗体和HAART,其中该循环包含:
i)在第一段期间对该受试者投予该抗体,之后为第二段期间的治疗假日;以及
ii)持续地于(i)内的该第一段期间和该第二段期间对该受试者投予HAART。
43.如权利要求39所述的方法,其中在循环的期间内投予该受试者该抗体和HAART,其中该循环包含:
i)以每周、每两周或每月的间隔于4个月的期间对该受试者投予该抗体,之后为两个月的治疗假日;以及
ii)于(i)内的该六个月期间持续地对该受试者投予HAART。
44.如权利要求42所述的方法,其中该受试者是于两个循环的期间治疗。
45.如权利要求43所述的方法,其中该受试者是于两个循环的期间治疗。
46.如权利要求39所述的方法,其中该抗体是不同于HAART的时间投予。
47.如权利要求39所述的方法,其中在循环期间内投予该受试者该抗体和HAART,其中该循环包含:
i)在第一段期间对该受试者投予该抗体,之后为第二段期间的治疗假日;以及
ii)在该第二段期间而非该第一段期间对该受试者投予HAART。
48.如权利要求47所述的方法,其中该抗体于该第一段期间是以定期间隔投予。
49.如权利要求47所述的方法,其中该抗体于该第一段期间是以每周、每两周或每月之间隔投予。
50.一种用以治疗HIV感染的受试者的方法,包含给予该受试者治疗方案,包含:
a)如权利要求1所述的抗体的药理学上有效剂量;以及
b)高效抗反转录病毒疗法(HAART)。
51.如权利要求50所述的方法,其中该抗体是以至少约5mg/kg体重的剂量投予该受试者。
52.如权利要求50所述的方法,其中在循环的期间内投予该受试者该抗体和HAART,其中该循环包含:
i)在第一段期间对该受试者投予该抗体,之后为第二段期间的治疗假日;以及
ii)持续地于(i)内的该第一段期间和该第二段期间对该受试者投予HAART。
53.如权利要求50所述的方法,其中在循环的期间内投予该受试者该抗体和HAART,其中该循环包含:
i)以每周、每两周或每月的间隔于4个月的期间对该受试者投予该抗体,之后为两个月的治疗假日;以及
ii)于(i)内的该六个月期间持续地对该受试者投予HAART。
54.如权利要求52所述的方法,其中该受试者是在两个循环或多个循环的期间治疗。
55.如权利要求53所述的方法,其中该受试者是在两个循环或多个循环的期间治疗。
56.如权利要求53所述的方法,其中在循环的期间内投予该受试者该抗体和HAART,其中该循环包含:
i)以每周、每两周或每月的间隔于4个月的期间对该受试者投予该抗体,之后为两个月的治疗假日;以及
ii)于(i)内的该六个月期间持续地对该受试者投予HAART。
57.如权利要求50所述的方法,其中(a)内的该抗体是于不同于(b)内的HAART的时间投予。
58.如权利要求50所述的方法,其中在循环的期间内投予该受试者(a)内的该抗体和(b)内的HAART,其中该循环包含:
i)在第一段期间对该受试者投予该抗体,之后为第二段期间的治疗假日;以及
ii)在该第二段期间而非该第一段期间对该受试者投予HAART。
59.如权利要求58所述的方法,其中该抗体于该第一段期间是以定期间隔投予。
60.如权利要求58所述的方法,其中该抗体于该第一段期间是以每周、每两周或每月的间隔投予。
61.一种抑制HIV进入CD4+细胞的方法,包含:
将如权利要求1所述的抗体暴露于该细胞。
62.一种抑制gp120结合CD4+细胞的方法,包含:
将如权利要求1所述的抗体暴露于该细胞。
63.一种活化静默CD4+T细胞的方法,包含:
将如权利要求1所述的抗体暴露于该细胞。
64.一种活化位于静默T细胞的HIV的潜伏病毒库的方法,包含:
将如权利要求1所述的抗体暴露于该细胞。
65.一种减少位于HIV感染的细胞样品的潜伏HIV病毒库的方法,包含:
a)将如权利要求1所述的抗体暴露于该细胞样品;以及
b)将HAART暴露于该细胞样品。
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Application publication date: 20190709 |