KR20190071677A - Haart 안정화된 환자에서 cd4에 대한 항체에 의한 hiv 감염의 치료 및 지속적 바이러스 완화 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 HIV 감염의 예방, 치료, 및/또는 기능적 치유를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 한 측면은 HIV 감염의 예방, 치료, 및 기능적 치유를 위한 CD4에 대해 지시된 모노클로날 항체, 그의 조성물, 및 이러한 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

HAART 안정화된 환자에서 CD4에 대한 항체에 의한 HIV 감염의 치료 및 지속적 바이러스 완화
본 출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 2016년 8월 13일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/374,752의 이익을 주장하는 PCT 국제 출원이다.
발명의 분야
본 발명은 고도 활성 항레트로바이러스 요법 (HAART)에 대한 대체로서, HAART 안정화된 환자에서 HIV 감염의 치료 및 지속적 바이러스 완화를 위한 CD4에 대해 지시된 항체에 관한 것이다.
HIV/AIDS 범유행성은 근대사에서 가장 중요한 세계적 건강 도전과제를 대표한다. 조합 항레트로바이러스 요법 (cART)은, 최적으로 사용될 경우, HIV 복제를 효과적으로 제어하고, AIDS의 발생을 방지하고, 삶을 연장하고, 전파 위험을 감소시킬 수 있다. 이러한 놀라운 성공에도 불구하고, 현행 항레트로바이러스 요법은 그것이 치유적이지 않고, 감염된 환자는 기약없이 계속해서 치료받아야 하기 때문에 제한을 갖는다. HIV에 걸린 채로 살고 있는 35백만명 초과의 세계 인구에게 평생 요법을 제공하는데 있어서의 도전과제를 고려하면, HIV 감염 치유법을 개발하는데 있어서 관심이 집중된다. 최근 종설 논문 "Global Scientific Strategy: Towards an HIV Cure 2016"은 그러한 분야에서의 중대한 지식 격차 및 연구 과제를 기재하였고, 이는 이러한 분야의 최신 기술에 대한 배경으로서 언급된다 (Deeks, S.G., et al., 2016). 이러한 종설 논문에 개시된 정보는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
임의의 바이러스 감염을 치료하는데 있어서 이상적 결과는 치료된 환자 내의 모든 복제-적격 비리온의 완전한 근절, 즉 치유이다. 이러한 멸균 치유는 달성하기 위해 도전 중일 수 있고/거나 특정 바이러스 감염, 예컨대 HIV에 대해서는 입증이 곤란할 수 있다. 복합 바이러스 감염에 대한 보다 실용적인, 아직 임상적으로는 성공적인, 치료 결과는 지속적 장기간 바이러스 완화의 달성일 것이다. 완화는 진정한 HIV 치유법의 개발을 위해 필요한 전조일 수 있고, ART의 부재 하에 아직 규정되지 않은 기간 (아마도 수년) 동안 장기적으로 검출불가능한 바이러스혈증의 목표를 나타내기 위해 기술분야에서 점점 사용되고 있다.
현행 최신 기술을 고려하면, HAART에 대한 대체로서 HIV의 지속적 장기간 바이러스 완화를 달성할 수 있는 제품 및 치료 방법에 대한 필요가 존재한다.
참고문헌
Figure pct00001
Figure pct00002
본 개시내용은 HAART에 대한 대체로서 HAART 안정화된 환자에서 HIV 감염의 치료 및 지속적 바이러스 완화를 위한 항체, 조성물, 및 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 한 측면은 후속하는 cART를 포함한 다른 치료의 부재 하에, HAART 안정화된 환자에서 HIV 감염의 치료 및 지속적 바이러스 완화를 위한 CD4에 대해 지시된 항체, 그의 조성물, 및 이러한 조성물을 제조 및 사용하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 항체는 CD4의 세포외 부위에 특이적으로 결합한다. 구체적 실시양태에서, 항체는 CD4에 도메인 1의 CDR2 영역 또는 그 근처의 부위에서 특이적으로 결합한다. 개시된 항체는 무세포 및 세포-대-세포 시스템 둘 다에서 CD4에의 그의 결합을 통해 경쟁적 HIV 진입 억제를 발휘한다. 개시된 항체는 또한 가교의 존재 또는 부재 하에 휴지기 CD4 양성 T 세포를 재활성화하는 능력을 갖고, 이는 TNF-α 생산의 증가로 이어질 수 있다. 이러한 항체는 B4, M2 및 dB4C7을 포함한 모노클로날 항체 (mAb) (예를 들어, Wang, C.Y. 1999; Lynn. S. and Wang, C.Y. 2009); Leu3a (Than, S. et al., 1997), ST4 (Briant, L,1999); 및 항-HIV RC, CD4의 도메인 1의 CDR2 영역을 포함하는 폴리클로날 항체 (Wang, C.Y., WO2016/043788)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 항체는 CD4에 대해 지시되고, 그에 특이적으로 결합하고, 기능상 (1) 무세포 및 세포-대-세포 전파 모드 둘 다에서 HIV 진입을 차단하고 (2) HIV 감염된 휴지기 CD4 T-세포를 재활성화하는 능력을 갖는다. 구체적 실시양태에서, 항체는, TNF 생산, HIV p24 방출, 또는 Lck 키나제 인산화를 통한 T-세포 활성화의 증가로 나타내어지는 바와 같이, 가교의 존재 또는 부재 하에 시험관내에서 HIV 감염된 휴지기 CD4 T-세포를 재활성화한다. 특정 실시양태에서, 개시된 항체를 사용하여 HIV 환자를 치료하는 것은 (1) 조절 T 세포 (Treg)의 감소; (2) 혈액 CD8+ 세포 카운트의 증가; (3) HIV 특이적 항원(들)에 의한 시험관내 자극 시 HIV 특이적 CD8+ 세포의 확장; 및/또는 (4) 혈액 세포에서의 HIV DNA 수준의 감소를 발생시킨다.
본 개시내용은 또한 상기 기재된 기능적 특성을 갖는 항-CD4 항체 (예를 들어, 모노클로날 인간, 인간화, 키메라 등)를 포함하는 제약 조성물, 뿐만 아니라 HIV 감염의 치료 및 지속적 바이러스 완화를 위해 이러한 제약 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 구체적 실시양태는 후속하는 cART의 부재 하에 HAART 안정화된 환자에서 HIV 감염의 치료 및 지속적 바이러스 완화를 위해 제약 조성물을 제조 및/또는 사용하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 개시된 항체를 포함하는 개시된 제약 조성물이 제조되고 환자에게 투여되어, 바이러스 로드 반동 없이 바이러스 로드를 비-검출가능한 수준으로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물이 제조되어 환자에게 매주, 격주, 또는 심지어 더 긴 일정으로 약 10 mg/kg 이상의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 단독요법으로서 또는 또 다른 요법, 예컨대 HAART와 조합되어 투여된다. 일부 실시양태에서, 바이러스 로드는, 치료된 환자에서의 혈청 항체 수준이 약 10 μg/mL 이상인 경우 바이러스 로드 반동 없이, 비-검출가능한 수준으로 감소된다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 단독요법으로서, 매주 또는 격주 또는 심지어 더 긴 일정으로 약 10 mg/kg 이상의 용량으로 주어지며, 이는 혈청 항체 수준이 10 μg/mL 초과인 한 바이러스 로드 반동 없이 치료된 대상체에서 바이러스 로드의 비-검출가능한 수준으로의 감소로 이어진다.
CD4에 대해 지시된 항체를 포함하는 개시된 제약 조성물은 HIV 치료에 (1) 단독으로 투여되는 경우 단독요법으로서; (2) 다른 치료 방법 (예를 들어, cART)에 대한 보조로서 투여되는 경우 조합 요법으로서; 또는 (3) 간헐적으로 주어지는 다른 치료 방법 (예를 들어, cART)에 의한 약물 치환 치료 주기에서 단독요법으로서 사용될 수 있다.
개시된 항체 및 치료 방법에 의해 달성되는 세포적 및 면역학적 특징은 우수 제어자 또는 장기간 비진행자 (LTNP)의 특징과 유사하다. 즉, 개시된 항체 및 치료 방법은 후속하는 cART의 부재 하에 HIV 감염의 지속적 바이러스 완화를 달성할 수 있으며, 이는 HIV 감염의 치료에서 혁신적인 것이다.
도 1a. 경쟁적 HIV 진입 억제 메카니즘을 예시하는 그래프. 그래프는 경쟁적 HIV 진입 억제 모델에서 수득된 이론적 결과를 보여주며, 여기서 HIV 외피 단백질 gp120 및 억제제 (예를 들어, 항체 약물)는 공통 표적 표면 분자 (즉, CD4 도메인 1의 CDR2)의 동일한 부분 상에서 결합에 대해 경쟁한다. 이 모델에서, HIV 결합/진입의 100% 억제는 억제제의 농도가 특정 역치에 도달할 경우 달성될 수 있다.
도 1b. mAb B4를 사용하여 10년 기간에 걸쳐 수집된 850종 초과의 Env 유사형 HIV 바이러스 패널로부터의 HIV-1 진입 억제. mAb B4는 모든 850종의 Env 유사형 바이러스에서 거의 100% 최대 퍼센트 억제 (MPI)를 갖는 HIV 진입 억제의 폭 및 효력 둘 다를 제공하며, IC50은 약 2종의 농도, 하나는 0.01 내지 1 μg/mL 및 제2의 것은 약 10 μg/mL로 클러스터링된다.
도 2a. 비-경쟁적 HIV 진입 억제 메카니즘을 예시하는 그래프. 그래프는 비-경쟁적 HIV 진입 억제 모델에서 수득된 이론적 결과를 보여주며, 여기서, HIV 및 억제제는 동일한 표적 분자 (예를 들어 TMB-355의 경우 CD4의 도메인 2) 상의 상이한 부위에 결합한다. 이 비-경쟁적 억제 모델에서, HIV 결합/진입은 억제제에 의해 감소될 수 있지만, 억제제의 농도와 무관하게 완전한 억제는 달성되지 않는다. 항체 약물에 대한 HIV의 내성은 약물 농도와 무관하게 % 억제에서 "플래토"로서 반영된다.
도 2b. TMB-355를 사용한 11개의 계통군을 커버하는 118종의 다양한 HIV-1 Env 슈도바이러스 균주의 패널로부터의 HIV-1 진입 억제 결과 (Pace, G., et al., 2011). 각각의 바이러스에 대해, 흑색 선은 10 μg/mL 이하의 TMB-355 농도에서 처리된 경우 최대 퍼센트 억제 (MPI)를 지시하고 (좌측 Y 축); 회색 선은 상응하는 IC50을 지시한다 (우측 Y 축). TMB-355는 바이러스 균주의 92%를 ≥ 50% 억제로 중화시키고, 단지 바이러스 균주의 31%를 ≥ 95% 억제로 중화시킨다.
도 3. 하기 자극에 의해 유도된 휴지기 PBMC에서의 바이러스 재활성화 (HIV-1 p24 gag 생성에 의해 측정된 바와 같음)를 보여주는 막대 그래프: 비자극됨 (레인 1), PHA (레인 2), 불활성화된 HIV (iHIV) 용해물 (레인 3), CD4 도메인 1의 CDR2 영역에 지시된 모노클로날 항체 (레인 4), CD4 도메인의 CDR3 영역에 지시된 모노클로날 항체 (레인 5), CD4 도메인 1/2에 지시된 모노클로날 항체 (레인 6), 가용성 CD4의 존재 하에서의 iHIV (레인 7), 가용성 CD4의 존재 하에서의 CD4 도메인 1의 CDR2 영역에 지시된 모노클로날 항체 (레인 8), 가용성 CD4의 존재 하에서의 CD4 도메인 1의 CDR3 영역에 지시된 모노클로날 항체 (레인 9), 및 가용성 CD4의 존재 하에서의 CD4 도메인 1/2에 지시된 모노클로날 항체 (레인 10), 도면 설명에 나타낸 바와 같음 (문헌 [Briant L., et al., 1999]으로부터 조정됨).
도 4. 항체 B4는 항체 Leu3a에 의해 결합된 CD4 도메인 1의 CDR2 영역을 커버하는 입체형태적 에피토프를 인식한다. CD4 양성 세포에 대한 경쟁적 결합 억제는 모노클로날 항체 B4 및 Leu3a (CD4 도메인 1의 CDR2 영역에 대해 지시됨)에 의해 확인되었다. 2종의 대상체 (X282 및 X301)로부터의 침팬지 PBMC 세포를 연구에 사용하였다. 모노클로날 항체 B4를 FITC에 의해 표지하였다. 항체 Leu3a는 PE에 의해 표지하였다. PBMC 세포의 세포형광촬영 분석은 좌측에서 두번째 패널에 제시된 바와 같은 Leu3a-PE에 의한 양성 결합 (패널 2), 좌측에서 세번째 패널에 제시된 바와 같은 항체 B4-FITC에 의한 양성 결합 (패널 3), 및 PBMC를 먼저 Leu3a-PE에 의해 염색한 다음 항체 B4-FITC에 의해 염색했을 때 좌측에서 네번째 패널에 제시된 바와 같은 이중 염색된 집단 (패널 4)을 나타낸 반면에; 항체 B4-FITC에 의한 선행 결합은, 좌측에서 다섯번째 패널에 제시된 바와 같이, Leu3a-PE에 의한 순차적 결합을 차단하여 오직 B4-FITC 결합만을 남길 것이다 (패널 5). 이러한 순차적 결합 억제 연구는 Leu3a-PE에 대한 항체 B4-FITC에 의한 한 방향 억제를 나타내었고, 이는 항체 B4가 도메인 1 내의 AA47-64로부터 펩티드의 보다 짧은 스트레치에서 Leu3에 의해 인식되는 CD4 도메인 1 내의 CDR2 영역 주위의 CD4 양성 세포와의 보다 큰 표면 접촉 구역을 인식한다는 것을 나타낸다.
도 5. ELISA에 의해 측정된 바와 같은 항-HIV RC 폴리클로날 항체에 의한 rsCD4에의 비오티닐화된-B4 결합의 경쟁적 억제를 보여주는 그래프.
도 6. PBMC 상의 표면 CD4에 대한 mAb dB4 및 항-HIV RC 폴리클로날 항체의 항체 역가측정을 보여주는 그래프. 항체 역가측정은 % CD4 결합 대 항체 농도 (μg/mL)로서 측정하였다.
도 7a 내지 7g. 치료 나이브 HIV 양성 및 HIV 음성 대상체에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 증식시킴으로써 시토카인 IL2 및 IFN-γ의 초항원 SEB 유도된 생성의 mAb dB4 및 항-HIV RC 폴리클로날 항체 억제의 분석. HIV 음성 (도 7a) 및 HIV 양성 (도 7b) 대상체에 대한 초항원 유도된 증식성 CD4+ T 세포에 의한 IL2 생성의 mAb dB4 및 항-HIV RC 폴리클로날 항체 억제가 제시된다. HIV 음성 대상체 및 동일-연령 HIV 양성 대상체 (도 7c)에 대한 초항원 유도된 증식성 CD8+ T 세포에 의한 IL2 생성의 mAb dB4 및 항-HIV RC 폴리클로날 항체 억제가 또한 제시된다. HIV 음성 (도 7d) 및 HIV 양성 (도 7e) 대상체에 대한 초항원 유도된 증식성 CD4+ T 세포에 의한 IFN-γ 생산의 mAb dB4 및 항-HIV RC 폴리클로날 항체 억제가 제시된다. HIV 음성 (도 7f) 및 HIV 양성 (도 7g) 대상체에 대한 초항원 유도된 증식성 CD8+ T 세포에 의한 IFN-γ 생산의 mAb dB4 및 항-HIV RC 폴리클로날 항체 억제가 또한 제시된다.
도 8a 내지 8d. IIa상 임상 시험의 과정에 걸친, 바이러스 로드 감소에 의해 측정된 바와 같은 UB-421 치료의 임상 효능 (상부 패널), 및 μg/mL 혈청 농도에 의해 측정된 바와 같은 UB-421의 약동학 (하부 패널)을 보여주는 그래프. 하기 대표적 환자에 대한 관련 데이터가 제공된다: UB-421의 10 mg/kg 매주 투여를 받는 환자 1-1-01 (도 8a); UB-421의 10 mg/kg 매주 투여를 받는 환자 1-1-02 (도 8b); UB-421의 25 mg/kg 격주 투여를 받는 환자 1-2-03 (도 8c); 및 UB-421의 25 mg/kg 격주 투여를 받는 환자 1-2-06 (도 8d). 세포의 완전한 코팅을 지시하는 PBMC CD4+ 세포 상의 UB-421 결합의 지속기간은 회색으로 음영표시된다.
도 9a 및 9b. 도 9a는 유효 기준선을 갖는, 연구 약물 UB-421 10 mg/kg (상부) 또는 연구 약물 UB-421 25 mg/kg (하부)을 모두 투여받은 프로토콜-기반 (PP) 집단에서의 상대적으로 안정한 CD4 T 세포 카운트 (평균 및 STD)를 보여주는 그래프이다. 도 9b는 UB421를 제공받은 환자로부터 PBMC를 수득하고 초항원 SEB (상부 패널) 또는 CMV pp65 (하부 패널)를 포함한 항원에 의해 자극한 경우 치료 전 (W1), 종료시 (W8), 및 모니터링 기간 후 (W16) 환자로부터의 CD3+, CD3+/CD4+ 세포의 증식 백분율을 보여준다.
도 10a 및 10b. 다른 이들 (Jacobson, J.L., et al., 2009; Toma, J., et al., 2011; 및 Pace, C.S., et al., 2013)에 의해 수행된 TMB-355 (이발리주맙, 이전 TNX-355)에 대한 유사한 연구에서 관찰된 바이러스 로드 감소에 대한, UB-421을 사용한 IIa상 임상 시험에서 관찰된 바이러스 로드 감소의 이론적 비교를 나타내는 그래프. 도 10a는 10 mg/kg 및 25 mg/kg의 UB-421로 치료된 대상체에서 관찰된 바이러스 로드 변화를 요약한 반면, 도 10b는 TMB-355의 동일한 투여량 수준으로 치료된 대상체에서 관찰된 바이러스 로드 변화를 요약한다.
도 11. UB421를 제공받은 환자로부터 PBMC를 수득하고 컨센서스 B 서열을 갖는 HIV Gag 모티프 펩티드에 의해 자극한 경우 UB421 치료 전 (W1), 종료시 (W8), 및 후 (W16) 환자로부터의 CD3+, CD3+/CD4+ 및 CD3+CD8+ 세포의 증식 백분율. CD3+/CD8+ (p<0.01) T 세포 집단에 주로 기인하는 CD3+ (p<0.01) T 세포의 증식 백분율에서 통계적으로 유의한 증가가 존재한다.
도 12. HIV-1 감염된 성인에서 항레트로바이러스 요법에 대한 대안으로서 UB-421 단독요법을 사용한 치료 양식을 위한 코호트 1 및 코호트 2 둘 다로부터의 프로토콜 설계를 보여주는 개략도.
도 13. 치료 개시시 (V1) 또는 종료시 (V12)의, 연구 약물 UB-421 10 mg/kg (코호트 1) 또는 연구 약물 UB-421 25 mg/kg (코호트 2)을 모두 투여받은 환자에서의 상대적으로 안정한 CD4 T 세포 카운트 (평균 및 STD)를 보여주는 그래프. 코호트 1 (P=0.331) 및 코호트 2 (P=0.905) 둘 다의 경우 치료 전 및 후에 어떠한 통계적으로 유의한 차이도 존재하지 않는다.
도 14. 치료 개시시 (V1) 또는 종료시 (V12)의, 연구 약물 UB-421 10 mg/kg (코호트 1) 또는 연구 약물 UB-421 25 mg/kg (코호트 2)을 모두 투여받은 환자에서의 CD8 T 세포 카운트 (평균 및 STD)를 보여주는 그래프. 코호트 1 (P<0.001) 및 코호트 2 (P=0.004) 둘 다의 경우 치료 전 및 후에 통계적으로 유의한 차이가 존재한다.
도 15a 및 15b. 평균 바이러스 로드 감소 (HIV RNA 카피/mL)에 의해 측정된 바와 같은 UB-421 치료의 임상 효능, 및 HIV-1 감염된 성인에서 항레트로바이러스 요법에 대한 대안으로서 UB-421 단독요법을 사용한 IIa상 임상 시험의 과정에 걸친 UB-421-알렉사488 결합된 세포의 평균 백분율에 의해 측정된 바와 같은 UB-421의 약동학을 보여주는 그래프. 도 15a는 코호트 1에 대한 것이고, 15b는 코호트 2에 대한 것이다.
도 16a 및 16b. HIV-1 감염된 성인에서 항레트로바이러스 요법에 대한 대안으로서 UB-421 단독요법을 사용한 II상 임상 시험의 과정에 걸친, 개별 환자 바이러스 로드 감소 (HIV RNA 카피/mL)에 의해 측정된 바와 같은 UB-421 치료의 임상 효능을 보여주는 그래프. 도 16a는 코호트 1에 대한 것이고, 16b는 코호트 2에 대한 것이다. 바이러스 반동은 2회의 연속 방문에서 400 RNA 카피/mL 초과의 바이러스 로드에 의해 정의된다 (파선).
도 17a 및 17b. 시험에 걸쳐 연구 약물 UB-421 10 mg/kg (코호트 1, 도 17a) 또는 연구 약물 UB-421 25 mg/kg (코호트 2, 도 17b)을 모두 투여받은 환자에서의 각각의 시점 (방문일)에 대한 % Treg 세포 (평균 및 STD)를 나타내는 총 CD4+ 세포 중 CD4+CD25+FoxP3+ T 세포 %를 보여주는 그래프.
도 18. 치료 기간의 개시시 (V1) 또는 종료시 (V8), 또는 V8에서 V12까지의 환자를 원래의 HAART 치료로 다시 되돌린 경우의 모니터링 기간의 종료시에 측정된, 연구 약물 UB-421 10 mg/kg 또는 25mg/kg을 모두 투여받은 개별 환자에 대한 PBMC HIV 프로바이러스 DNA 함량. 각각의 선은 개별 환자로부터 수득한 결과를 나타낸다.
도 19. 9명의 환자에 대한 그래프는 항레트로바이러스 요법에 대한 대안으로서 항 HIV gp120 광범위 중화 항체 VRC01 단독요법을 사용한 HAART 안정화된 환자에서의 혈장 바이러스혈증 (채워진 삼각형, HIV RNA 카피/mL) 및 VRC01 항체 혈장 농도 (채워진 원형, ug/ml)의 수준을 보여준다. 높은 VRC01 항체 혈장 농도 혈청의 존재에도 불구하고 HIV 억제가 달성되지 않았기 때문에 이러한 NIH 시험은 일정에 앞서 종료되었다. x-축 상의 역삼각형은 UB-421 주입 시점을 나타낸다.
도 20. 4 내지 16주의 기간 동안 (1) 시판 중인 HIV 약물 (HAART) 또는 모노클로날 항체 (2) VRC01, (3) HIV 보조-수용체 CCR5를 표적화하는 Pro140 또는 (4) UB421을 사용한 단독요법의 경우의 HIV 바이러스 억제의 유지에서의 효능의 비교.
도 21. 치료 시 UB421-유사 항체에 의해 매개되는 세포 메카니즘은 (1) % Treg 세포의 감소에 의한 HIV 항원 특이적 T 세포 활성의 회복, (2) 항체 결합 시 감염된 세포에서 HIV 잠복상태의 활성화, 및 (3) 세포-대-세포 및 무세포 감염의 방지에 의한 새로운 HIV 감염의 중단을 포함하며; 이는 모두 (4) HIV-1 감염의 지속적 바이러스 완화로 이어지는 바이러스 저장소의 감소 또는 제거를 발생시킨다.
도 22a 내지 22d. Jurkat T 세포에서 티로신 394 (Y394) 및 티로신 505 (Y505)에 대한 Lck 인산화의 웨스턴 블롯 분석. 도 22a는 양성 대조군으로서 항-CD3 (OKT3) 항체에 의한 자극 후 Lck Y394 인산화 (상부) 및 Y505 인산화 (중간), 및 총 Lck 단백질 수준 (하부)의 웨스턴 블롯 영상이다. 도 22b는 도 22a에 제시된 각각의 시점의 총 Lck에 의해 정규화된 Lck Y394 및 Y505 인산화 수준을 보여주는 그래프이다. 도 22c는 가교의 존재 또는 부재 하의 UB-421 자극에 의한 Lck Y394 인산화 (상부), Y505 인산화 (중간), 및 총 Lck 단백질 수준 (하부)의 웨스턴 블롯 영상이다. 도 22d는 도 22c에 제시된 각각의 시점의 총 Lck에 의해 정규화된 Lck Y394 및 Y505 인산화 수준을 보여주는 그래프이며, 여기서 파선은 가교 조건 하에 수득된 데이터를 나타내고, 실선은 가교 부재의 조건 하에 수득된 데이터를 나타낸다.
도 23a 내지 23b. 정상 혈액 공여자 3으로부터의 1차 CD4+ T 세포에서 항-CD3 (OKT-3) 자극에 의한 Lck 인산화의 웨스턴 블롯 분석. 도 23a는 항-CD3 (OKT3) 항체 자극에 의한 Lck Y394 인산화 (상부), Y505 인산화 (중간), 및 총 Lck 단백질 수준 (하부)의 웨스턴 블롯 영상이다. 도 23b는 도 23a의 각각의 시점의 총 Lck에 의해 정규화된 Lck Y394 및 Y505 인산화 수준을 보여주는 그래프이다.
도 24a 내지 24d. 정상 혈액 공여자 1, 2, 4, 5, 6, 및 7로부터의 1차 CD4+ T 세포에서 UB-421 자극에 의한 Lck 인산화의 웨스턴 블롯 분석. 도 24a는 건강한 공여자 1 및 2에서 가교의 존재 또는 부재 하의 UB-421 자극에 의한 Lck Y394 인산화 (상부), Y505 인산화 (중간), 및 총 Lck 단백질 수준 (하부)의 웨스턴 블롯 영상이다. 도 24b는 건강한 공여자 4, 5, 6, 및 7에서 가교의 부재 하의 UB-421 자극에 의한 Lck Y394 인산화 (상부), Y505 인산화 (중간), 및 총 Lck 단백질 수준 (하부)의 웨스턴 블롯 영상이다. 도 24c 및 도 24d는 도 24a 및 24b의 각각의 시점의 총 Lck에 의해 정규화된 Lck Y394 및 Y505 인산화 수준을 보여주는 그래프이며, 여기서 파선은 가교 조건 하에 수득된 데이터를 나타내고, 실선은 가교 부재의 조건 하에 수득된 데이터를 나타낸다.
도 25a 내지 25b. 정상 혈액 공여자 8 및 9로부터의 1차 CD4+ T 세포에서의 Lck 인산화의 유동 세포측정 분석. 도 25a는 양성 대조군으로서 항-CD3 자극이 존재하는 (파선) 또는 음성 대조군으로서 어떠한 치료도 부재하는 (실선) PE-항-Lck pY394 (좌측) 및 알렉사647-항-LckpY505 (우측)의 MFI를 보여준다. 도 25b는 가교 조건 하 (파선) 또는 가교 부재 조건 하 (실선)에 UB-421에 의해 자극된 정상 혈액 공여자 8 및 9로부터의 1차 CD4+ T 세포의 PE-항-Lck pY394 (좌측) 및 알렉사647-항-LckpY505 (우측)의 MFI를 보여준다.
본 개시내용은 HAART 안정화된 환자에서 HIV 감염의 치료 및 지속적 바이러스 완화를 위한 항체, 조성물, 및 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 한 측면은 후속하는 cART를 포함한 다른 치료의 부재 하에, HAART 안정화된 환자에서 HIV 감염의 치료 및 지속적 바이러스 완화를 위한 CD4에 대해 지시된 항체, 그의 조성물, 및 이러한 조성물을 제조 및 사용하는 방법에 관한 것이다.
본원에 사용된 섹션 제목은 단지 조직적 목적을 위한 것이며, 기재된 대상을 제한하는 것으로 간주되지 않는다. 이 출원에 인용된 모든 참고문헌 또는 참고문헌의 부분은 임의의 목적으로 그 전문이 본원에 참조로 명확히 포함된다.
CD4
인간 CD4 (분화 클러스터 4)는 면역 세포, 예컨대 T 헬퍼 세포, 단핵구, 대식세포, 및 수지상 세포의 표면 상에서 발견되는 458개 아미노산의 당단백질 (유니프롯KB/스위스-프롯: P01730.1)이다 (웹사이트: en.wikipedia.org/wiki/CD4). CD4의 아미노산 서열은 서열 목록에서 서열식별번호(SEQ ID NO): 22로 제시된다. CD4+ T 헬퍼 세포는 인간 면역계의 필수적 부분인 백혈구이다. 이는 종종 CD4 세포, T-헬퍼 세포 또는 T4 세포로 지칭된다. 이들은 감염성 입자를 파괴하는 CD8 킬러 세포를 포함한 다른 유형의 면역 세포에게 신호를 전송하기 때문에, 헬퍼 세포이다. CD4 세포가 예를 들어 비치료된 HIV 감염에서 또는 이식 전 면역 억제에 따라 고갈되면, 신체는 광범위한 감염에 취약해지게 되고, 이는 다른 방법으로 싸울 수 있을 것이다.
CD4는 항원-제시 세포와의 소통에서 T 세포 수용체 (TCR)를 보조하는 보조-수용체이다. CD4는 그의 세포외 도메인을 사용하여 항원-제시 세포의 표면 상의 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 부류 II 분자와 직접 상호작용한다. 세포외 도메인은 2개의 베타 시트에서 7개의 가닥을 갖는 이뮤노글로불린-유사 베타-샌드위치를 채택한다. 그의 세포내 도메인을 사용하여, CD4는 활성화된 T 세포의 신호전달 캐스케이드의 많은 분자 성분을 활성화하는데 필수적인 티로신 키나제 Lck를 동원함으로써 TCR에 의해 생성되는 신호를 증폭시킨다. 그에 의해 다양한 유형의 T 헬퍼 세포가 생산된다.
CD4의 주요 구조적 특색이 서열 목록에 제시되어 있고, 하기 추가의 세부사항에서 논의된다.
CD4는 이뮤노글로불린 슈퍼패밀리의 구성원이며, 세포의 세포외 표면 상에 노출된 4개의 이뮤노글로불린 도메인 (D1 내지 D4)을 갖는다. CD4 도메인 D1 및 D3은 이뮤노글로불린 가변 (IgV) 도메인과 유사한 반면에; D2 및 D4는 이뮤노글로불린 불변 (IgC) 도메인과 유사하다.
CD4 도메인 1 (D1)
D1 코어 도메인 (대략 aa 26-125)은 디술피드 결합 가교에 의해 연결된 β-가닥에 의해 형성된 2개의 β-시트로 이루어진다. D1의 아미노산 서열은 이뮤노글로불린 쇄의 그것과 유사한 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에서 이뮤노글로불린과 상동성을 공유한다. CDR1-, CDR2-, 및 CDR3-유사 영역은 CD4의 D1 도메인 내에 위치한다.
CD4의 D1 도메인은 항원 제시 세포의 표면 상의 MHC 부류 II 분자와 직접 상호작용하고, lck을 동원하여 헬퍼 T 세포의 활성화를 용이하게 함으로써, 적응 면역 반응을 조정한다. CD4 분자의 세포외 영역의 도메인 1 및 도메인 2 둘 다는 부류 II MHC 분자에 대한 결합 부위에 기여하는 것으로 밝혀졌지만; 그러나, 도메인 1 단독은 HIV 결합 및 합포체 형성에 수반되는 것으로 밝혀졌다. 특히, HIV 외피 당단백질 gp120에 대한 결합 부위는 D1의 CDR2-유사 루프에 국재화되는 것으로 밝혀졌다.
CD4의 D1 도메인을 인식하는 여러 항-CD4 항체가 생산되었다. 예를 들어, HIV RC, B4, M2, 및 dB4C7 (예를 들어, Wang, C.Y. 1999; Lynn. S. and Wang, C.Y. 2009; 및 Wang, C.Y., WO2016/043788); Leu3a (Chiba, Y. 1992); OKT4A (Jameson, B.D., et al., 1988); ST4 및 13B8.2 (Briant, L,1999); 6H10 (예를 들어, Moore, et al., 1992); 15A7, 2D5, 및 2F2 (예를 들어, Yuan R, et al., 2016); 및 D1 및 D2 사이의 영역을 인식하는 F91-55 및 BL4 (Briant, L, et al., 1999; Celada F, et al., 1990; 및 Moore, et al., 1992).
CD4 도메인 2 (D2)
CD4의 D2 도메인 (대략 aa 126-203)은 그의 소수성 계면을 통해 D1과 연결된다. D2는 부류 II MHC 분자를 위한 결합 부위에 기여한다. CD4의 D2 도메인을 인식하는 여러 항-CD4 항체가 생산되었다. 예를 들어, 이발리주맙 (TMB-355; 이전에 TNX-355 또는 Hu5A8로 공지됨; 예를 들어, Kuritzkes, D.R., et al., 2004); M-T441 (Koenig R, et al., 1995).
CD4 도메인 3 (D3)
CD4의 D3 도메인은 대략 aa 204-317에 위치한다. D3은 D2가 D1과 상호작용하는 방식과 유사하게, 그의 소수성 계면을 통해 D4에 연결된다. 항체 OKT4는 D3을 인식한다 (예를 들어, Yuan R, et al., 2016; Moore, et al., 1992).
CD4 도메인 4 (D4)
D4 도메인 (대략 aa 318-374)은 막횡단 도메인 앞의 CD4 분자 상의 마지막 세포외 도메인이다. D4는 D2와 구조적으로 유사하고, CD4 분자의 이량체화를 통해 T 세포 및 CD4 기능을 활성화하는 것으로 널리 여겨진다. 항체 OKT4 및 L120은 D4를 인식한다 (예를 들어, Yuan R, et al., 2016; Moore, et al., 1992).
CD4 - 막횡단 영역 및 세포질 영역
막횡단 영역 (대략 aa 397-418)은 소수성인 반면에 세포내/세포질 영역 (대략 419-458)은 3개의 세린 잔기 (S433, S440 및 S456)를 포함하고, 이는 인산화되어 신호 전달을 매개한다. 이들 세린 잔기는 P56lck 티로신 인산화의 수준을 증가시키고 신호 전달을 조절할 수 있는 Src 티로신 키나제 (TK) 패밀리 구성원 P56lck과 직접 연결된다.
CD4 - HIV 감염에서의 역할
HIV-1은 CD4를 사용하여 숙주 T-세포 내로의 진입을 획득하며, gp120으로 공지된 그의 바이러스 외피 단백질을 통해 이를 달성한다. Gp120은 성숙 HIV-1 막 외피 당단백질 전구체 gp160의 2개의 도메인 중 1개이며; 다른 것은 gp41이다. gp120의 CD4에 대한 결합은 HIV-1 부착에서 제1 단계를 구성하고, CD4-gp120 상호작용은 gp120의 입체형태에서의 변화를 생성하여 그것이 숙주 세포 상에 발현된 케모카인 수용체 CCR5 또는 CXCR4에 결합하게 한다. 이러한 2차 결합은 HIV-1의 gp41 (융합 펩티드) 분자가 숙주 세포 막 내로 삽입되게 하여, 궁극적으로 바이러스와 숙주의 막 융합을 매개한다. HIV 감염은 CD4를 발현하는 T 세포의 수에서의 점진적 감소로 이어진다.
CD4는 따라서 HIV-1 감염의 개시에 있어서 주요 역할을 한다. gp120의 CD4와의 결합 및 미결합 결정 구조를 비교한 것은 "가교 시트" - 2개의 β-헤어핀에 의해 형성된 4-가닥 β-시트 -가 CD4 결합 동안 gp120 코어의 2종의 밀접하게 회합된 "내부" 및 "외부" 도메인의 상대적인 배향을 고정시킨다는 것을 보여준다. CD4 D1 도메인은 이들 내부 및 외부 도메인 뿐만 아니라 가교 시트와 상호작용하고, 이는 gp120 내부 도메인의 재배열로 이어진다. 또한, gp120 V3 가변 루프와의 추가의 상호작용에 의해, 가교 시트는 보조-수용체 결합 부위를 노출한다 (예를 들어, Yuan R, et al., 2016).
항체
본 개시내용의 한 측면은 HIV 감염의 치료 및 지속적 바이러스 완화를 위한 CD4에 대해 지시된 항체, 그의 조성물, 및 이러한 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 항체는 무손상 항체 분자를 폭넓게 포괄하며, 이는 무손상 폴리클로날, 모노클로날, 단일특이적, 다중특이적, 키메라, 탈면역화, 인간화, 인간, 영장류화, 단일-쇄, 단일-도메인, 합성 및 재조합 항체를 포함한다. 본 개시내용은 또한 목적하는 활성 또는 기능을 갖는 무손상 항체의 부분 (예를 들어, 항체의 면역학적 단편)을 포함한다.
본 개시내용의 항체는 CD4에 대해 지시된다. 일부 실시양태에서, 항체는 CD4의 세포외 영역에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체는 CD4의 이뮤노글로불린 도메인 (D1 내지 D4) 중 적어도 하나를 특이적으로 인식하고 그에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체는 CD4의 이뮤노글로불린 도메인 중 오직 하나 (즉 D1, D2, D3 또는 D4)에 결합한다. 구체적 실시양태에서, 항체는 CD4의 D1 도메인에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 D1 도메인 내의 상보성 결정 영역 (CDR1, 2 또는 3)의 또는 그 근처의 CD4에 결합한다. 구체적 실시양태에서, 항체는 D1 도메인의 CDR2 영역의 또는 그 근처의 CD4에 결합한다.
본 개시내용의 항체는 임의의 표준 방법에 의해 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 개시된 항체는 동물 (예를 들어, 마우스, 개, 기니아 피그, 돼지, 염소, 말 등)을 재조합 CD4 단백질, CD4 단백질의 단편, CD4의 면역학적 부분을 함유하는 융합 단백질, 및/또는 CD4의 유사체 또는 상동체로 면역화함으로써 생산된다. 다른 실시양태에서, 항체는 동물을 표면 상에 CD4를 발현하는 세포로 면역화함으로써 생산될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 화학적으로 합성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 항체는 동물을 CD4 단백질, CD4 단백질의 단편, CD4의 면역학적 부분을 함유하는 융합 단백질, 및/또는 CD4의 유사체 또는 상동체로 면역화함으로써 생산된다. 일부 실시양태에서, 항체는 동물을 전장 CD4 단백질을 함유하는 펩티드로 면역화함으로써 생산된다. 다른 실시양태에서, 항체는 동물을 CD4 단백질의 부분을 함유하는 펩티드로 면역화함으로써 생산된다. 예를 들어, 펩티드는 세포외 영역 (예를 들어, D1 내지 D4), 이뮤노글로불린 도메인 (D1, D2, D3 및/또는 D4), D1 도메인 내의 상보성 결정 영역 (CDR1, 2 또는 3) 등을 나타내는 CD4 단백질의 부분을 함유할 수 있다. 항체는 동물을 CD4의 적어도 일부를 포함하는 단일 펩티드 또는 CD4의 아미노산 서열을 함유하는 펩티드의 조합으로 면역화함으로써 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 면역원은 CD4의 aa39-66을 함유하며, 이는 HIV가 CD4의 이러한 부분에 결합하기 때문에 HIV 수용체 복합체 ("HIV RC")로도 공지되어 있다. 구체적 실시양태에서, HIV RC 펩티드는 디술피드 결합을 통해 시클릭으로 만들어진다. 일부 실시양태에서, 폴리클로날 항체는 동물을 시클릭 HIV RC 펩티드로 면역화함으로써 생산된다. 본원에 사용된 용어 "항-HIV RC 폴리클로날 항체"는 CD4 도메인 1의 CDR2 영역의 aa39-66을 함유하는 시클릭 펩티드에 대해 지시된 면역 혈청을 지칭한다.
다른 실시양태에서, 항체는 동물을 CD4 양성 세포로 면역화함으로써 생산된다. 세포주는 CD4를 발현하는 임의의 세포주, 예컨대 Jurkat 세포, HPB-ALL 세포, U87MG 세포, NIH-3T3 세포, HOS 세포, CCRF-CEM 세포 (ATCC® CCL-119™), HuT 78 (ATCC® TIB-161™), MJ (G11) (ATCC® CRL-8294™) 등일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 BALB/c 마우스를 T-급성 림프모구성 백혈병 세포주인 무손상, 비감염된 CD4+ 인간 HPB-ALL 세포 또는 정제된 말초 혈액 일핵 T 세포 (PBL T 세포)로 면역화함으로써 생산될 수 있다. 이러한 항체는 미국 특허 번호 5,912,176, 6,090,388 및 WO/2016/043788 (Wang) 및 학술지 논문 [Wang et al., 1999]에서 추가로 상세하게 논의되어 있고, 이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 화학물질로 태깅되거나 표지된다. 예를 들어, 항체는 비오틴, 스페이서 아암, 프로브 (예를 들어, FITC, PE, TRITC, 딜라이트 플루오르, 알렉사, GFP, R-피코에리트린, 양자점 등), 효소 접합체, 및 이들의 조합으로 표지될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 항체는 비오틴 또는 형광 프로브로 표지된다.
구체적 실시양태에서, 항체는 탈면역화로 공지된 과정을 통해 변형될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "탈면역화"는 일반적으로 항체의 부분을 변형하여, 그것이 동물 내에서 면역 반응을 촉발시키지 않고 동물에게 투여될 수 있도록 하는 과정을 지칭한다. 구체적으로, 탈면역화는 항체가 투여되고 있는 특정 동물에서 면역원성일 것인 항체의 아미노산 서열의 부분 (예를 들어, T-세포 에피토프)을 위치화하고 제거하는 과정을 포함한다. 이 과정은 면역학 및 분자 생물학 기술의 조합 사용을 통해 달성될 수 있다. 이 과정은 이전에 기재되었다 (예를 들어, 문헌 [Jones, T.D., et al. 2009]). 항체의 탈면역화의 경우, T-세포 에피토프를 제거하는 돌연변이는 일반적으로 항체의 결합 친화도를 유의하게 감소시키지 않고 도입될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "인간화"는 그것이 인간에게 투여되는 경우 항체의 면역원성을 제거하는 방식으로, 그의 단백질 서열이 변형된 (탈면역화된) 비-인간 종에 의해 원래 생산된 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 개시된 항체는 불변 영역을 인간 불변 영역으로 대체함으로써 및/또는 포유동물 세포에서 이들 항체를 코딩하는 유전자의 발현에 의해 인간 용도를 위해 탈면역화된다.
본원에 사용된 용어 "mAb B4" 또는 "B4" 또는 "뮤린 B4"는 뮤린 모노클로날 항체를 지칭하며, 이는 CD4를 인식하는 것으로 제시된 바 있고 HIV 진입을 억제할 수 있다. 이 항체의 구조적 및 기능적 특징은 이어지는 실시예에서 더 상세하게 논의된다.
본원에 사용된 용어 "mAb dB4" 또는 "dB4"는 mAb B4로부터 유래된 인간 탈면역화 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, mAb B4는 그 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 번호 7,501,494 및 7,872,110에 기재된 방법에 따라 인간 용도를 위해 탈면역화된다. 특정 실시양태에서, 인간 탈면역화 mAb dB4는 mAb B4의 뮤린 항체의 불변 영역 (CH 및 Cκ)을 제거하고, 인간 IgG1의 불변 영역으로 대체함으로써 생산된다. mAb dB4는 임의의 적합한 세포 클론에 의해 생산된 dB4를 포괄한다. 구체적 실시양태에서, mAb dB4는 클론 7에 의해 생산된다.
본원에 사용된 용어 "mAb dB4C7" 또는 "dB4C7"은 그 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 번호 7,501,494 및 7,872,110, 및 WO/2016/043788 (Wang)에 이전에 기재된 재조합 유전자 B4DIVHv1/VK1CHO#7을 함유하는 클론 7에 의해 발현된 mAb dB4를 지칭한다. C7 클론은 고품질의 mAb dB4 항체를 생산하는 것으로 나타났다. 추가적으로, mAb dB4C7에서 위치 298에서의 Asn (N) 잔기는 N-글리코실화 부위를 제거하기 위해 His (H)로 치환되었으며, 따라서 IgG 매개된 보체 의존성 세포독성 (CdC)을 제거하여 항체 B4의 존재 하에서의 CD4 양성 T 세포의 고갈을 방지한다.
본원에 사용된 용어 "UB-421"은 인간 대상체에게 투여되는 데 적합한 형태로 사용되는 mAb dB4C7을 지칭한다.
항체는 글리코실화, 메틸화 및/또는 인산화를 위한 부위를 포함한, 번역-후 변형을 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 당 결합 잔기를 갖는다. 구체적 실시양태에서, 항체는 글리코실화 부위로서의 역할을 하는 아스파라긴 (Asn) 잔기를 함유한다. 특정한 실시양태에서, Asn 잔기는 중쇄 상에 존재하고, 구체적 실시양태에서, Asn은 Fv 영역 및/또는 CDR 내에 존재한다.
본 개시내용의 항체는 또한 그의 흥미롭고 독특한 기능적 특징에 의해 기재될 수 있다.
예를 들어, 개시된 항체는 CD4의 도메인 1에의 그의 결합을 통해 강력한 경쟁적 HIV 진입 억제를 발휘한다. 특히, 개시된 항체는 시험된 모든 Env 유사형 바이러스에서 거의 100% 최대 퍼센트 억제 (MPI)를 갖고, IC50은 약 2종의 농도; 하나는 0.01 내지 1 μg/mL 및 제2의 것은 약 10 μg/mL로 클러스터링된다. 개시된 항체의 결합 활성은 HIV gp120 외피 단백질에 의해 나타난 CD4 결합 친화도보다 약 2 log 더 높다 (즉 100X 더 긴밀한 결합). 또한, 개시된 항체의 평균 Kd는 5.6 x 10-11 M (범위: 3.1 내지 8.1 x 10-11 M)인 것으로 추정되었으며, Bmax는 세포 당 1.2 x 106 Ab (범위: 0.93 내지 1.4 x 106)인 것으로 추정되었다.
개시된 항체의 경쟁적 억제 특성은 무세포 및 세포-대-세포 시스템 둘 다에서 나타났다. 개시된 항체는 HIV-1 외피 단백질 gp120 MN에 대한 것보다 적어도 50배 더 높은 친화도로 CD4 수용체에 결합한다. 또한, 개시된 항체는 다른 시판되는 항체, 예컨대 Leu3a에 비해 더 큰 친화도 및 특이성으로 CD4에 결합한다.
개시된 항체는 또한 피롭토시스의 병원성 주기에 연루되는 CD4 양성 T 세포의 항원 유도된 T 세포 증식 및 시토카인 생산 (IL2 및 IFN-감마)을 억제할 수 있다. CD4에 대한 이러한 고친화도 모노클로날 항체는 항원, 예컨대 초항원 SEB (스타필로코쿠스 내독소 B, SEB) 유도된 CD4 양성 T 세포 활성화 및 시토카인 (예를 들어 IL2 및 IFN-γ) 생산을 억제한다. 불발성 HIV 감염을 갖는 정지 CD4+ T 세포에서 시토카인 생산을 발생시키는 이러한 항원 유도된 활성화는 이들 정지 CD4+ T 세포 및 인근의 정상 휴지기 CD4 양성 세포의 피롭토시스를 초래하여, CD4 + T 세포의 뒤이은 대량 고갈, 따라서 AIDS를 초래할 것이다.
개시된 항체는 또한 휴지기 CD4 양성 T 세포를 재활성화시키는 능력을 갖는다. 이 특성은 휴지기 T 세포에서 HIV의 잠복 저장소를 재활성화시켜 이들 세포를 항레트로바이러스제로의 치료에 감수성이도록 만드는 데 특히 유용하다. CD4에 대한 이러한 고친화도 항체는 HIV의 방출을 위해 휴지기 HIV 감염된 세포를 활성화시킬 수 있다. HIV 감염된 휴지기 CD4+ T 세포의 재활성화는 본 발명의 항체를 HIV 감염된 환자에서의 HAART와 함께 혼입시켜 기능적 치유를 발생시키는 조합적 치료를 허용한다.
개시된 항체의 추가적인 구조적 및 기능적 특징은 하기 실시예에서 제공된다.
제제
본 개시내용은 또한 HIV 감염의 예방, 치료, 및/또는 기능적 치유에 사용될 수 있는 제약 제제에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 제제는 CD4에 대해 지시된 항체를 함유한다. 구체적 실시양태에서, 본 개시내용은 CD4 도메인 1의 CDR2 영역 내의 또는 인근의 부위로 지시된 CD4에 대한 고친화도 모노클로날 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 이러한 항체의 결합 활성 (EC50)은 HIV gp120 외피 단백질에 의해 나타난 CD4 결합 친화도 (gp120에 대한 EC50=97 nM)보다 약 2 log 더 높다 (즉 100X 더 긴밀한 결합).
개시된 항체 단백질의 제약 제제는 항체 단백질을 임의적 제약학적으로 허용되는 담체와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 제약학적으로 허용되는 담체는 용매, 분산 매질, 등장화제 등을 포함한다. 담체는 액체, 반-고체, 예를 들어 페이스트, 또는 고체 담체일 수 있다. 담체의 예로는 물, 염수 용액 또는 다른 완충제 (예컨대 포스페이트, 시트레이트 완충제), 오일, 알콜, 단백질 (예컨대 혈청 알부민, 젤라틴), 탄수화물 (예컨대 글루코스, 수크로스, 트레할로스, 만노스, 만니톨, 소르비톨 또는 덱스트린을 포함한 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물), 겔, 지질, 리포좀, 수지, 다공성 매트릭스, 결합제, 충전제, 코팅, 안정화제, 보존제, 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제, 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 염 형성 반대-이온, 예컨대 소듐; 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 또는 이들의 조합을 들 수 있다.
제제는 1종 초과의 활성 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 제제는 1종 이상의 항체 및/또는 HIV 감염의 예방 및 치료를 위한 1종 이상의 추가의 유익한 화합물을 함유할 수 있다. 활성 성분은 임의의 편리하고 실용적인 방식으로, 예를 들어, 혼합, 용액화, 현탁, 유화, 캡슐화, 흡수 등에 의해 담체와 배합될 수 있으며, 정제, 캡슐, 분말 (동결건조된 분말 포함), 시럽, 주사, 섭취, 주입에 적합한 현탁액 등으로 제제화될 수 있다. 서방형 제제는 또한 제조될 수 있다.
특정 실시양태에서, 제약 제제는 인간 용도를 위한 mAb dB4C7을 함유한다. mAb dB4C7을 함유하는 제약 제제는 pH 6.0 내지 7.0의 시트레이트, 포스페이트, 트리스(Tris), BIS-트리스 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 적절한 완충제에서 제조될 수 있으며, 또한 부형제, 예컨대 당 (50 mM 내지 500 mM의 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 또는 이들의 혼합물), 계면활성제 (예를 들어, 0.025% 내지 0.5%의 트윈 20 또는 트윈 80), 및/또는 다른 시약을 함유할 수 있다. 구체적 실시양태에서, 제제는 20 mM 글리신 중 mAb dB4C7, 및 pH 6.5의 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중 0.05% (v/v) 트윈 (폴리소르베이트 20)을 함유한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 10 mM 히스티딘을 포함한 피하 주사제를 포함한 mAb dB4의 고농도 제제가 또한 특정 적용에 사용하기 위해 제조되었다.
제제는 다양한 양의 항체를 함유하도록 제조될 수 있다. 일반적으로, 대상체에게 투여하기 위한 제제는 약 0.1 mg/mL 내지 약 200 mg/mL를 함유한다. 특정 실시양태에서, 제제는 약 0.5 mg/mL 내지 약 50 mg/mL; 약 1.0 mg/mL 내지 약 50 mg/mL; 약 1 mg/mL 내지 약 25 mg/mL; 또는 약 10 mg/mL 내지 약 25 mg/mL의 항체를 함유할 수 있다. 구체적 실시양태에서, 제제는 약 1.0 mg/mL, 약 5.0 mg/mL, 약 10.0 mg/mL, 또는 약 25.0 mg/mL의 항체를 함유한다.
구체적 실시양태에서, 본 발명은 HIV 감염을 갖는 환자에서의 면역요법으로서, 경쟁적 HIV 진입 억제 뿐만 아니라 CD4+ T 세포의 활성화를 나타내는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 인간, 인간화 또는 키메라 모노클로날 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 10 μg/mL 초과의 혈청 항체 수준에서 치료되는 대상체에서 바이러스 로드를 비-검출가능한 수준으로 저하시킬 수 있는 단독요법으로서 기능하는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 10 μg/mL 초과의 혈청 항체 수준에서 치료되는 대상체에서 바이러스 로드를 비-검출가능한 수준으로 저하시킬 수 있고, 12-주 치료 기간 동안 안정한 CD4 T 세포 카운트를 유지한 단독요법으로서 기능하는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 단독요법으로서 매주 또는 격주 일정으로 약 10 mg/kg 이상의 용량으로 주어질 경우, 이러한 치료가 12-주 치료 기간 동안 치료되는 대상체에서 바이러스 로드를 비-검출가능한 수준으로 저하시킬 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 매주 또는 격주 일정으로 약 10 mg/kg 이상으로 치료 나이브 HIV 환자에게 주어질 경우 환자의 기능적 치유를 발생시킬, HAART와의 보조 요법에서의 핵심 성분으로서 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 매주 또는 격주 일정으로 약 10 mg/kg 이상으로 HAART 하의 안정화된 바이러스 로드를 갖는 환자에게 주어질 경우 환자의 기능적 치유를 발생시킬, HAART와의 보조 요법에서의 핵심 성분으로서 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
항바이러스제
본 개시내용은 또한 HIV 감염의 치료, 예방, 및 기능적 치유를 위한 방법에 사용될 수 있는 항바이러스제를 포함한다.
항바이러스제는 포유동물에서 HIV의 형성 및/또는 복제를 억제하는 데 유효한 임의의 제제 (화합물 또는 생물제제)를 포함한다. 항바이러스제의 예로는 진입/융합 억제제 (예를 들어, 마라비록, 엔푸비르티드); 뉴클레오시드 역전사효소 억제제 (NRTI) 및 뉴클레오티드 역전사효소 억제제 (NtRTI) (예를 들어, 지도부딘, 아바카비르, 디다노신, 라미부딘, 엠트리시타빈, 스타부딘, 및 테노포비르); 비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제 (NNRTI) (예를 들어, 네비라핀, 에파비렌즈, 에트라비린, 및 릴피비린); 인테그라제 핵 가닥 전달 억제제 또는 INSTI로도 공지된 인테그라제 억제제 (예를 들어, 랄테그라비르, 돌루테그라비르, 엘비테그라비르); 프로테아제 억제제 (예를 들어, 사퀴나비르, 사퀴나비르 메실레이트, 포삼프레나비르, 티프라나비르, 로피나비르, 인디나비르, 넬피나비르, 암프레나비르, 리토나비르, 다루나비르, 아타자나비르, 베비리마트, 비베콘); 바이러스 성숙 억제제; HIV 유전자의 발현을 표적화하는 제제; 핵심 숙주 세포 유전자 및 HIV 복제에 관여하는 유전자 생성물을 표적화하는 제제; 및 다른 항-HIV 제제; iRNA 제제; 안티센스 RNA; iRNA 제제 또는 안티센스 RNA를 발현하는 벡터; PNA 및 항바이러스 항체; 및 이들의 조합을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
항바이러스제는 개별적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 조합으로의 항바이러스제의 사용은 항-레트로바이러스 요법 (ART), 조합 항-레트로바이러스 요법 (cART) 또는 고도 활성 항-레트로바이러스 요법 (HAART)으로 공지되어 있다. 항-레트로바이러스 (ARV) 약물은 약물이 억제하는 레트로바이러스 생활-주기의 단계에 의해 폭넓게 분류된다. 전형적인 조합은 "기본"으로서 1 NNRTI, PI 또는 INSTI와 함께 "골격"으로서 2 NRTI를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항바이러스제의 조합, 예컨대 콤비비르(Combivir), 트리지비르(Trizivir), 칼레트라(Kaletra), 엡지콤(Epzicom), 트루바다(Truvada), 아트리플라(Atripla), 콤플레라(Complera), 스트리빌드(Stribild), 트리우메크(Triumeq)가 사용된다.
HIV 감염의 치료 및 지속적 바이러스 완화 방법
본 개시내용은 또한 HIV 감염의 치료, 예방, 및 기능적 치유를 위한 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 제제는 CD4에 대해 지시된 항체를 함유한다.
추가의 측면에서, 임의로 제약학적으로 허용되는 담체 중에 제공되는 본원에 개시된 항체는 대상체에서 HIV 감염의 치료, 예방, 및/또는 기능적 치유, 뿐만 아니라 HIV 전파의 예방을 위해 사용될 수 있다.
용어 HIV 감염의 "치료"는 HIV 감염에 의해 유발된 개시를 지연시키고/거나, 진행을 감속시키고/거나, 바이러스 로드를 감소시키고/거나, 증상을 개선시키도록 HIV 감염의 유효한 억제를 제공한다. 치료는 HIV에의 노출 전 및 후 둘 다를 포함한다.
용어 HIV 감염의 "예방"은 HIV 감염의 개시가 지연되는 것, 및/또는 HIV 감염의 발생 또는 가능성이 감소되거나 제거되는 것을 의미한다. 용어 HIV 전파의 "예방"은 한 개체로부터 또 다른 개체로 (예를 들어, 임신, 출산 또는 분만, 또는 모유수유 동안 HIV-양성 여성으로부터 어린이에게로) HIV가 전달되는 것의 발생 또는 가능성이 감소되거나 제거되는 것을 의미한다.
용어 "대상체"는 인간, 리저스원숭이, 개코원숭이, 및 침팬지 대상체를 포함한 임의의 영장류 대상체를 지칭한다.
HIV 감염을 치료하고/거나 예방하기 위해, 본원에 개시된 항체의 치료량이 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
용어 "치료학적 유효량"은 HIV 감염을 치료하고/거나 예방하도록 HIV 감염의 억제를 수행하는 데 요구되는 투여량을 의미한다. 항체의 투여량은 질환 상태 및 다른 임상적 인자, 예컨대 대상체의 체중 및 상태, 요법에 대한 대상체의 반응, 제제의 유형 및 투여 경로에 의존한다. 치료학적으로 유효하고 비-유해한 정확한 투여량은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다.
일반적으로, 성인 인간에의 투여를 위한 항체의 적합한 용량은 약 3 내지 50 mg/kg의 대상체의 체중의 범위이며, 사용되는 전형적인 초기 범위는 약 5 내지 25 mg/kg의 대상체의 체중의 범위이다. 적합한 투여량은 또한 약 5.0 mg/kg, 약 10.0 mg/kg, 또는 약 25.0 mg/kg의 환자의 체중을 포함한다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체를 함유하는 치료 조성물은 통상적으로 정맥내로, 예를 들어 단위 용량의 주사에 의해 투여된다. 단위 용량은 일반적으로 본 발명의 치료 조성물을 지칭하며, 이는 추가로 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하고, 각각의 단위는 요구되는 희석제; 즉, 담체, 또는 비히클과 함께 바람직한 치료 효과를 생성하도록 계산된 활성 물질의 미리 결정된 양을 함유한다.
조성물은 투여량 제제와 혼화성인 방식으로, 및 치료학적 유효량으로 투여된다. 투여되는 양은 치료되는 대상체, 활성 성분을 이용하는 대상체의 계의 능력, 요망되는 치료 효과의 정도에 의존한다. 투여되도록 요구되는 활성 성분의 정확한 양은 의사의 판단에 의존하며, 각각의 개체에 고유하다. 그러나, 전신적 적용을 위한 적합한 투여량 범위는 본원에 개시되며, 투여 경로에 의존한다. 투여를 위한 적합한 처방은 또한 가변적이지만, 초기 투여 후 1시간 이상의 간격으로 후속 주사 또는 다른 투여에 의한 반복된 용량이 전형적이다. 대안적으로, 생체내 요법에 대해 특정된 범위로 혈액 중 농도를 유지하는 데 충분한 연속적 정맥내 주입이 고려된다.
대상체에서 HIV 감염의 치료, 예방, 및/또는 기능적 치유를 위한 방법은 항체를 함유하는 제제의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제제는 단일 투여로 대상체에게 제공된다. 다른 실시양태에서, 제제는 다중 투여로 대상체에게 제공된다. 제제가 다중 투여로 제공되는 경우, 제제는 1일에 1회, 1주 1회, 격주 (2주마다), 또는 1개월 1회 투여될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 치료 일정이 1주 1회인 경우, 제제는 약 5.0 mg/kg의 대상체의 체중의 투여량으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 치료 일정이 격주인 경우, 제제는 약 25.0 mg/kg의 대상체의 체중의 투여량으로 대상체에게 투여된다.
특정 실시양태에서, 모노클로날 항체를 함유하는 제제는 높은 안전성 인자를 나타내며, 대상체에게 매주 기초로 총 8주 동안 5 mg/kg 또는 25 mg/kg으로 반복적으로 주어질 경우 내약성이 양호하였다. 구체적 실시양태에서, 모노클로날 항체는 HIV 감염의 멸균 치유를 제공하기 위해 HIV 감염의 수 시간 내에 5 mg/kg으로 대상체에게 주어질 수 있다. 다른 실시양태에서, 모노클로날 항체는 HIV 감염의 기능적 치유를 제공하기 위해 HIV 감염의 수 일 내에 5 mg/kg으로 대상체에게 주어질 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 바이러스 로드의 감소를 위한 면역요법으로서 정맥내 (IV), 근육내 (IM) 또는 피하 (SC) 경로를 통해 HIV 환자에게 투여될 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 구체적 실시양태에서, 본 발명은 HIV 감염을 갖는 환자에서의 면역요법으로서, 경쟁적 HIV 진입 억제 뿐만 아니라 CD4+ T 세포의 활성화를 나타내는 상기 기재된 결합 특징을 갖는, 인간, 인간화 또는 키메라 모노클로날 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
다른 특정 실시양태에서, 본 발명은 매주 또는 격주 일정으로 약 10 mg/kg 이상의 용량으로 바이러스 로드의 감소를 위한 면역요법으로서 IV, IM 또는 SC 경로를 통해 HIV 환자에게 투여될 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 10 μg/mL 초과의 혈청 항체 수준에서 치료되는 대상체에서 바이러스 로드를 비-검출가능한 수준으로 저하시킬 수 있는 단독요법으로서 기능하는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 10 μg/mL 초과의 혈청 항체 수준에서 치료되는 대상체에서 바이러스 로드를 비-검출가능한 수준으로 저하시킬 수 있고, 12-주 치료 기간 동안 안정한 CD4 T 세포 카운트를 유지한 단독요법으로서 기능하는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 단독요법으로서 매주 또는 격주 일정으로 약 10 mg/kg 이상의 용량으로 주어질 경우, 이러한 치료가 12-주 치료 기간 동안 치료되는 대상체에서 바이러스 로드를 비-검출가능한 수준으로 저하시킬 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 단독요법으로서 매주 또는 격주 일정으로 약 10 mg/kg 이상의 용량으로 주어질 경우, 이러한 치료가 혈청 항체 수준이 10 μg/mL 초과인 한 바이러스 로드 반동 없이 치료되는 대상체에서 바이러스 로드를 비-검출가능한 수준으로 저하시킬 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 매주 또는 격주 일정으로 약 10 mg/kg 이상으로 치료 나이브 HIV 환자에게 주어질 경우 환자의 기능적 치유를 발생시킬, HAART와의 보조 요법에서 핵심 성분으로서 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 매주 또는 격주 일정으로 약 10 mg/kg 이상으로 HAART 하의 안정화된 바이러스 로드를 갖는 환자에게 주어질 경우 환자의 기능적 치유를 발생시킬, HAART와의 보조 요법에서 핵심 성분으로서 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 IV, IM 또는 SC 경로 중 어느 하나로, HAART 대체 요법에서 핵심 성분으로서 투여됨으로써, 각각의 치료 주기가 HAART 하의 안정화된 비검출가능한 바이러스 로드를 경험하는 환자에 대해 치료 휴지기로서 2 내지 4개월 동안 항-CD4 항체 치료로 시작한 후, 1 내지 4 또는 그 초과의 주기에 걸쳐 HAART 치료가 이어져, 기능적 치유를 발생시킬 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 IV, IM 또는 SC 경로 중 어느 하나로, HAART 대체 요법에서 핵심 성분으로서 투여됨으로써, 각각의 치료 주기가 치료 나이브 HIV 환자에 대해 2 내지 4개월 동안 항-CD4 항체 치료로 시작한 후, 1 내지 4 또는 그 초과의 주기에 걸친 2 내지 4개월의 HAART 치료가 이어져, 기능적 치유를 발생시킬 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 IV, IM 또는 SC 경로 중 어느 하나로, HAART 대체 요법에서 핵심 성분으로서 투여됨으로써, 각각의 치료 주기가 HAART 하의 안정화된 비검출가능한 바이러스 로드를 경험하는 환자에 대해 치료 휴지기로서 2 내지 4개월 동안 항-CD4 항체 치료로 시작한 후, 매주 또는 격주 일정으로 약 5 mg/kg 이상의 용량으로 1 내지 4 또는 그 초과의 주기에 걸쳐 HAART 치료가 이어져, 기능적 치유를 발생시킬 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 IV, IM 또는 SC 경로 중 어느 하나로, HAART 대체 요법에서 핵심 성분으로서 투여됨으로써, 각각의 치료 주기가 치료 나이브 HIV 환자에 대해 2 내지 4개월 동안 항-CD4 항체 치료로 시작한 후, 매주 또는 격주 일정으로 약 5 mg/kg 이상의 용량으로 1 내지 4 또는 그 초과의 주기에 걸쳐 2 내지 4개월의 HAART 치료가 이어져, 기능적 치유를 발생시킬 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 매주 또는 격주 일정으로 약 10 mg/kg 이상으로 치료 나이브 HIV 환자에게 주어질 경우 환자의 기능적 치유를 발생시킬, HAART와의 보조 요법에서 핵심 성분으로서 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 매주 또는 격주 일정으로 약 10 mg/kg 이상으로 HAART 하의 안정화된 바이러스 로드를 갖는 환자에게 주어질 경우 환자의 기능적 치유를 발생시킬, HAART와의 보조 요법에서 핵심 성분으로서 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 IV, IM 또는 SC 경로 중 어느 하나로, 매주 또는 격주 일정으로 약 10 mg/kg 이상의 용량으로 HAART에 대한 보조 요법에서 HAART 치료에 실패한 환자에게 투여되어, 추가의 바이러스 감소를 발생시킬 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 IV, IM 또는 SC 경로 중 어느 하나로, HAART와의 보조 요법에서 핵심 성분으로서, 1 내지 4 또는 그 초과의 주기에 걸쳐 주기 당 2 내지 4개월 동안의 치료 기간 및 1 내지 2개월 동안의 치료 휴지기로 시작하는 간헐적 방식으로, 치료 나이브 HIV 환자에게 집중 HAART 치료 방식에서 보조 요법으로서 투여되어, 환자의 기능적 치유를 발생시킬 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 IV, IM 또는 SC 경로 중 어느 하나로, HAART와의 보조 요법에서 핵심 성분으로서, 1 내지 4 또는 그 초과의 주기에 걸쳐 주기 당 2 내지 4개월 동안의 치료 기간 및 1 내지 2개월 동안의 치료 휴지기로 시작하는 간헐적 방식으로, 매주 또는 격주 일정으로 약 5 mg/kg 이상의 용량으로, 치료 나이브 HIV 환자에게 집중 HAART 치료 방식에서 보조 요법으로서 투여되어, 환자의 기능적 치유를 발생시킬 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 IV, IM 또는 SC 경로 중 어느 하나로, HAART와의 보조 요법에서 핵심 성분으로서, 1 내지 4 또는 그 초과의 주기에 걸쳐 주기 당 2 내지 4개월 동안의 치료 기간 및 1 내지 2개월 동안의 치료 휴지기로 시작하는 간헐적 방식으로, 매주 또는 격주 일정으로 약 5 mg/kg 이상의 용량으로, HAART 하의 안정화된 비검출가능한 바이러스 로드를 경험하는 환자에게 집중 HAART 치료 방식에서 보조 요법으로서 투여되어, 환자의 기능적 치유를 발생시킬 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간화 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 바이러스 로드의 감소를 위한 면역요법으로서 IV, IM 또는 SC 경로를 통해 HIV 환자에게 투여될 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 매주 또는 격주 일정으로 약 5 mg/kg 이상의 용량으로 바이러스 로드의 감소를 위한 면역요법으로서 IV, IM 또는 SC 경로를 통해 HIV 환자에게 투여될 수 있는 상기 기재된 결합 특징을 갖는 모노클로날 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD4 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
구체적 실시양태
(1) CD4 분자의 세포외 영역에 특이적으로 결합하는, CD4 분자에 대해 지시된 항체이며, 여기서
항체가 CD4+ 세포의 표면 상의 CD4 분자에 결합한 경우에,
a) CD4+ 세포 내로의 HIV 진입을 경쟁적으로 억제하고;
b) HIV에 감염된 휴지기 CD4+ 세포에서 잠복 HIV 저장소를 활성화하고;
d) 세포 HIV DNA의 수준을 감소시키고;
e) 바이러스 로드 반동 없이 HIV 감염의 지속적 바이러스 완화를 제공하는
항체.
(2) (1)에 있어서, HIV의 무세포 및 세포-대-세포 전파를 경쟁적으로 억제하는 항체.
(3) (1)에 있어서, 대상체에게 투여될 경우 조절 T 세포의 백분율을 감소시키는 항체.
(4) (1)에 있어서, 대상체에게 투여될 경우 CD8+ 세포의 양을 증가시키는 항체.
(5) (1)에 있어서, 대상체에게 투여될 경우 HIV gag 모티프 펩티드 자극에 반응하여 CD8+ 증식성 세포를 증가시키는 항체.
(6) (1)에 있어서, 대상체에게 투여될 경우 HIV 감염된 CD4+ 세포를 표적화하는 기능적 HIV 특이적 CD8+ CTL 세포를 증진시키는 항체.
(7) (1)에 있어서, CD4+ 세포에서 TNF-알파 생산을 증진시키는 항체.
(8) (1)에 있어서, 가교의 존재 또는 부재 하에 휴지기 CD4+ 세포를 활성화하는 항체.
(9) (1)에 있어서, 바이러스 로드 반동 없이 HIV 양성 환자에서 HIV 바이러스 로드를 혈액 밀리리터당 50 카피 미만으로 감소시키는 항체.
(10) (1)에 있어서, CD4 분자의 도메인 1 주위의 영역에 결합하는 항체.
(11) (1)에 있어서, CD4의 도메인 1 내의 CDR2 영역 주위의 영역에 결합하는 항체.
(12) (1)에 있어서,
서열식별번호: 1의 CDR1,
서열식별번호: 2의 CDR2 및
서열식별번호: 3의 CDR3
을 포함하는 중쇄 가변 영역 아미노산 서열; 및
서열식별번호: 4의 CDR1,
서열식별번호: 5의 CDR2 및
서열식별번호: 6의 CDR3
을 포함하는 경쇄 가변 영역 아미노산 서열
을 포함하는 항체.
(13) (1)에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
(14) (1)에 있어서, 인간화 모노클로날 항체인 항체.
(15) (1)에 있어서,
서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 인간화 모노클로날 항체인 항체.
(16) (1)에 있어서,
서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하는 인간화 모노클로날 항체인 항체.
(17) (1)에 있어서,
서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하는 인간화 모노클로날 항체인 항체.
(18) (1)에 있어서,
서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하는 인간화 모노클로날 항체인 항체.
(19) (1)에 있어서, HPB-ALL 세포 상의 막-결합된 CD4에 대해 약 3.1 x 10-11 M 내지 약 8.1 x 10-11 M의 절대 결합 친화도 (Kd)를 갖는 항체.
(20) (1)에 있어서, CD4 분자에 결합된 항체.
(21) (1)의 항체를 포함하는 조성물.
(22) (1)의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
(23) 포스페이트 완충 염수 (PBS), 20 mM 글리신, 및 0.05% (v/v) 폴리소르베이트 20 중에 (1)의 항체를 포함하는 제약 조성물.
(24) 포스페이트 완충 염수 (PBS), 20 mM 글리신, 0.05% (v/v) 폴리소르베이트 20, 및 10 mM 히스티딘 중에 (1)의 항체를 포함하는 제약 조성물.
(25) 포스페이트 완충 염수 (PBS), 20 mM 글리신, 및 0.05% (v/v) 폴리소르베이트 20 중에 약 1.0 mg/mL 내지 약 200.0 mg/mL의 (1)의 항체를 포함하는 제약 조성물.
(26) 포스페이트 완충 염수 (PBS), 20 mM 글리신, 0.05% (v/v) 폴리소르베이트 20, 및 10 mM 히스티딘 중에 약 1.0 mg/mL 내지 약 200.0 mg/mL의 (1)의 항체를 포함하는 제약 조성물.
(27) 포스페이트 완충 염수 (PBS), 20 mM 글리신, 및 0.05% (v/v) 폴리소르베이트 20 중에 약 10.0 mg/mL의 (1)의 항체를 포함하는 제약 조성물.
(28) 포스페이트 완충 염수 (PBS), 20 mM 글리신, 0.05% (v/v) 폴리소르베이트 20, 및 10 mM 히스티딘 중에 약 10.0 mg/mL의 (1)의 항체를 포함하는 제약 조성물.
(29) (12)의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
(30) (16)의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
(31) HIV에 노출된 대상체를 치료하는 방법이며,
약리학상 유효량의 (1)의 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
(32) (31)에 있어서, 항체를 대상체에게 HIV에의 노출 전에 투여하는 것인 방법.
(33) (31)에 있어서, 항체를 대상체에게 HIV에의 노출 후에 투여하는 것인 방법.
(34) (31)에 있어서, 항체를 HIV에의 노출 후 48시간 내에 투여하는 것인 방법.
(35) (31)에 있어서, 항체를 대상체에게 적어도 약 5 mg/kg 체중의 투여량으로 투여하는 것인 방법.
(36) (35)에 있어서, 항체를 대상체에게 다수회 투여하는 것인 방법.
(37) (36)에 있어서, 항체를 대상체에게 매주, 격주, 또는 매월 간격으로 투여하는 것인 방법.
(38) (36)에 있어서, 항바이러스제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
(39) (38)에 있어서, 항바이러스제가 고도 활성 항레트로바이러스 요법 (HAART)인 방법.
(40) (39)에 있어서, HAART가 프로테아제 억제제 또는 비-뉴클레오시드 리버스 트랜스크립타제 억제제와 조합된 뉴클레오시드 유사체 리버스 트랜스크립타제 억제제를 포함하는 것인 방법.
(41) (39)에 있어서, 항체를 HAART와 공동으로 투여하는 것인 방법.
(42) (39)에 있어서, 항체 및 HAART를 대상체에게 주기의 과정에 걸쳐 투여하며, 여기서 주기는
i) 항체를 대상체에게 제1 시간 동안 투여한 다음 제2 시간 동안 치료 휴지기를 갖는 것; 및
ii) HAART를 대상체에게 (i)의 제1 시간 및 제2 시간 동안 연속적으로 투여하는 것
을 포함하는 것인 방법.
(43) (39)에 있어서, 항체 및 HAART를 대상체에게 주기의 과정에 걸쳐 투여하며, 여기서 주기는
i) 항체를 대상체에게 4개월의 기간 동안 매주, 격주, 또는 매월 간격으로 투여한 다음 2개월 치료 휴지기를 갖는 것; 및
ii) HAART를 대상체에게 (i)의 6-개월 기간 동안 연속적으로 투여하는 것
을 포함하는 것인 방법.
(44) (42)에 있어서, 대상체가 2 주기의 과정에 걸쳐 치료되는 것인 방법.
(45) (43)에 있어서, 대상체가 2 주기의 과정에 걸쳐 치료되는 것인 방법.
(46) (39)에 있어서, 항체를 HAART와 공동이 아닌 시간에 투여하는 것인 방법.
(47) (39)에 있어서, 항체 및 HAART를 대상체에게 주기의 과정에 걸쳐 투여하며, 여기서 주기는
i) 항체를 대상체에게 제1 시간 동안 투여한 다음 제2 시간 동안 치료 휴지기를 갖는 것; 및
ii) HAART를 대상체에게 제2 시간 동안 투여하고 제1 시간 동안은 투여하지 않는 것
을 포함하는 것인 방법.
(48) (47)에 있어서, 항체를 제1 시간 동안 규칙적 간격으로 투여하는 것인 방법.
(49) (47)에 있어서, 항체를 제1 시간 동안 매주, 격주, 또는 매월 간격으로 투여하는 것인 방법.
(50) HIV 감염에 걸린 대상체를 치료하는 방법이며,
a) 약리학상 유효량의 (1)의 항체; 및
b) 고도 활성 항레트로바이러스 요법 (HAART)
을 포함하는 치료 요법을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
(51) (50)에 있어서, 항체를 대상체에게 적어도 약 5 mg/kg 체중의 투여량으로 투여하는 것인 방법.
(52) (50)에 있어서, 항체 및 HAART를 대상체에게 주기의 과정에 걸쳐 투여하며, 여기서 주기는
i) 항체를 대상체에게 제1 시간 동안 투여한 다음 제2 시간 동안 치료 휴지기를 갖는 것; 및
ii) HAART를 대상체에게 (i)의 제1 시간 및 제2 시간 동안 연속적으로 투여하는 것
을 포함하는 것인 방법.
(53) (50)에 있어서, 항체 및 HAART를 대상체에게 주기의 과정에 걸쳐 투여하며, 여기서 주기는
i) 항체를 대상체에게 4개월의 기간 동안 매주, 격주, 또는 매월 간격으로 투여한 다음 2-개월 치료 휴지기를 갖는 것; 및
ii) HAART를 대상체에게 (i)의 6-개월 기간 동안 연속적으로 투여하는 것
을 포함하는 것인 방법.
(54) (52)에 있어서, 대상체가 2 주기 이상의 과정에 걸쳐 치료되는 것인 방법.
(55) (53)에 있어서, 대상체가 2 주기 이상의 과정에 걸쳐 치료되는 것인 방법.
(56) (53)에 있어서, 항체 및 HAART를 대상체에게 주기의 과정에 걸쳐 투여하며, 여기서 주기는
i) 항체를 대상체에게 4개월의 기간 동안 매주, 격주, 또는 매월 간격으로 투여한 다음 2-개월 치료 휴지기를 갖는 것; 및
ii) HAART를 대상체에게 (i)의 6-개월 기간 동안 연속적으로 투여하는 것
을 포함하는 것인 방법.
(57) (50)에 있어서, (a)의 항체를 (b)의 HAART와 공동이 아닌 시간에 투여하는 것인 방법.
(58) (50)에 있어서, (a)의 항체 및 (b)의 HAART를 대상체에게 주기의 과정에 걸쳐 투여하며, 여기서 주기는
i) 항체를 대상체에게 제1 시간 동안 투여한 다음 제2 시간 동안 치료 휴지기를 갖는 것; 및
ii) HAART를 대상체에게 제2 시간 동안 투여하고 제1 시간 동안은 투여하지 않는 것
을 포함하는 것인 방법.
(59) (58)에 있어서, 항체를 제1 시간 동안 규칙적 간격으로 투여하는 것인 방법.
(60) (58)에 있어서, 항체를 제1 시간 동안 매주, 격주, 또는 매월 간격으로 투여하는 것인 방법.
(61) CD4+ 세포 내로의 HIV 진입을 억제하는 방법이며,
(1)의 항체를 세포에 노출시키는 것을 포함하는 방법.
(62) CD4+ 세포에 대한 gp120 결합을 억제하는 방법이며,
(1)의 항체를 세포에 노출시키는 것을 포함하는 방법.
(63) 휴지기 CD4+ T 세포를 활성화하는 방법이며,
(1)의 항체를 세포에 노출시키는 것을 포함하는 방법.
(64) 휴지기 T 세포에서 HIV의 잠복 저장소를 활성화하는 방법이며,
(1)의 항체를 세포에 노출시키는 것을 포함하는 방법.
(65) HIV에 감염된 세포의 샘플에서 잠복 HIV 저장소를 감소시키는 방법이며,
a) (1)의 항체를 세포의 샘플에 노출시키는 것; 및
b) HAART를 세포의 샘플에 노출시키는 것
을 포함하는 방법.
달리 설명되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 나타내지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 유사하게, 단어 "또는"은 문맥이 달리 명백하게 나타내지 않는 한 "및"을 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, "A 또는 B를 포함하는"은 A, 또는 B, 또는 A 및 B를 포함하는 것을 의미한다. 또한, 폴리펩티드에 대해 주어진 모든 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자 질량 값은 대략적이며, 설명을 위해 제공되는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가의 방법 및 물질이 개시된 방법의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 하기에 설명된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 상충되는 경우, 용어의 설명을 포함한 본 명세서가 지배할 것이다. 또한, 물질, 방법, 및 실시예는 단지 예시적이며, 제한인 것으로 의도되지 않는다.
도면 및 관련된 실시예의 하기 예시적 설명은 본원에, 특히 실시예에서 빈번하게 사용된 특정 용어의 이해를 용이하게 하기 위해 제공된다. 설명은 편의상 주어지며, 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1
MAB B4의 면역학적 및 기능적 특성
모노클로날 항체 B4 (mAb B4) 또는 M2 (mAb M2)는 T 세포 표면 상의 복합체 HIV 수용체 부위 (CD4)를 인식하는 모노클로날 항체이다. mAb B4 또는 M2는 HIV 보조-수용체와의 CD4의 상호작용에 영향을 미치고, 이를 방해할 수 있다. mAb B4 또는 M2는 1차 HIV-1 분리주를 우선적으로 중화시킨다 (둘 다의 항체는 미국 특허 번호 5,912,176, 6,090,388에서 추가로 상세하게 논의됨).
하기 정보는 모두 그 전문이 참조로 포함되는 2건의 미국 특허 (미국 특허 번호 5,912,176 및 6,090,388 (Wang)) 및 학술지 논문 [Wang et al., 1999]으로부터 발췌된 데이터를 포함한 뮤린 mAb B4의 발견 및 예비적 특징화 연구를 요약한다.
1. HPB ALL 세포 또는 정제된 PBL T 세포에 의한 면역화로부터 유래된 뮤린 모노클로날 항체
mAb B4는 BALB/c 마우스를 T-급성 림프모구성 백혈병 세포주인 무손상, 비감염된 CD4+ 인간 HPB-ALL 세포로 면역화함으로써 수득하였다.
mAb M2는 BALB/c 마우스를 PBL로부터 단리된 무손상, 비감염된 CD4+ 세포로 면역화함으로써 수득하였다.
세포 표면 상의 CD4에 대한 특이성을 가지며, HIV-1의 1차 분리주에 대해 폭넓은 중화 활성을 갖는, mAb B4 또는 M2로 나타내어지는 신규 부류의 항-CD4 항체를 수득하였다. 후속 논의 및 예에서는, 중요한 특성 개시내용에 초점을 맞추기 위한 목적으로, 오직 mAb B4만이 추가로 예시되고 논의될 것이다.
2. mAb B4 인식 부위의 특징화
mAb B4는 재조합 가용성 CD4 (rsCD4)에 비해 세포의 표면 상의 막-결합된 CD4를 우선적으로 인식하는 것으로 밝혀졌다.
HIV의 노출 전에 막-결합된 CD4에 결합하는 mAb B4는 CD4에의 gp120 및 전체 바이러스의 후속 부착을 차단하는 것으로 나타났다. 그러나, 항체에의 노출 전에 gp120에 결합된 막-결합된 CD4는 여전히 mAb B4에 결합할 수 있다. 따라서, mAb B4는 막-결합된 CD4에의 gp120의 결합에 영향을 미칠 수 있지만, gp120은 CD4에의 mAb B4의 결합에 영향을 미치지 않는다.
3. mAb B4의 시험관내 중화 활성
뮤린 mAb B4는 통상적인 정의에 의하면 중화 항체가 아니다. 대신, mAb B4는 바이러스에 부착하기보다는 숙주 세포 수용체를 코팅함으로써 바이러스 진입을 억제한다. HIV 감염에 대한 mAb B4의 효과는 관련 기술분야에서 사용되는 바이러스 중화 검정 (예를 들어, MT-2 마이크로플라크 중화 검정 (Sawyer et al., 1994))에 의해 용이하게 관찰될 수 있다. 뮤린 mAb B4의 중화 활성은 본 발명자들의 공동연구자인 칼 한슨(Carl Hanson) 박사 (캘리포니아 보건당국)에 의해 평가되었으며, 또한 존 마스콜라(John Mascola) 박사 (헨리 잭슨 파운데이션(Henry Jackson Foundation), WRAIR), 데이비드 몬테피오리(David Montefiori) (듀크 유니버시티(Duke University)) 및 말콤 마틴(Malcolm Martin) 박사 (NIAID)의 실험실에서 독립적으로 평가되었다. 1995년에서 2010까지 광범위하게 특징화된 하기 HIV 중화 특색은 mAb B4와 연관된다:
1. PBMC-성장된 1차 분리주는 T 세포주-적합화된 분리주 HIV-1IIIB 및 HIV-1MN보다 mAb B4에 의한 중화에 더 감수성이다.
2. mAb B4는 보조-수용체 사용 CCR5/CXCR4 (이중) 및 CCR5의 1차 분리주에 의한 감염을 중화시킨다.
3. mAb B4는 CXCR4 보조-수용체 사용의 T 세포주-적합화된 HIV-1 분리주에 대해 낮은 활성을 갖는다.
4. mAb B4는 HIV-1 하위유형 A 내지 G를 나타내는 다양한 범위의 합포체 유도 (SI) 및 비-합포체 유도 (NSI) 1차 분리주를 90% 종점 및 3 log 이하의 감염력으로 중화시킨다.
5. mAb B4는 이중 보조-수용체 HIV-1 외피를 갖는 HIV-2, SIV, 및 SHIV를 중화시킨다.
6. 편도 조직배양 시스템에서, mAb B4는 HIV-1 1차 분리주 VL135 (HIV-1VL135)의 감염력을 2 log 감소시킨다. 12.5 μg/mL만큼 작은 mAb B4는 많은 항-바이러스 항체가 항체-의존성 증진을 나타내는 상태인 활성 인간 보체의 존재 하에서 >100 TID50 (50% 편도 감염 용량)의 단일세포친화성 분리주 JR-CSF를 중화시킨다.
7. mAb B4는 감염후 48시간 이하에 첨가될 경우 HIV-1VL135에 대한 중화 활성을 발휘하며, 72시간 이하 후에 첨가될 경우 유의한 항-바이러스 효과를 갖는다.
a. 이는 세포로든 바이러스로든 예비-인큐베이션되면 동등하게 유효하다.
b. 이는 진입후 메커니즘에 의해서라기 보다는 감염의 초점이 새로운 세포로 확산되는 것을 차단함으로써 작용한다.
c. 이들 검정에서, mAb B4는 세포독성에 기여하지 않았다.
실시예 2
HIV-1 중화 및 내성 검정
하기 바이러스 중화 및 내성 검정은 1998년 내지 2011년의 기간 동안 칼 한슨 박사의 실험실 및 모노그램 바이오사이언시스, 인크.(Monogram Biosciences, Inc.)에서 다양한 계통군의 다중 HIV 분리주에 대해 수행되었다. 검정의 상세한 설명을 하기에 기재한다.
1. HIV-1 중화 검정.
혈액 또는 항체 샘플을 각각의 연구에 지시된 바와 같이 수집하였다. 혈청 또는 항체 샘플을 HIV-1 분리주의 다중-계통군 패널에 대해 MT-2 마이크로플라크 검정 또는 미토겐 (PHA)-자극된 PBMC 검정 중 어느 하나를 사용하여 평가하였다.
1.1. MT-2 마이크로플라크 검정
MT-2 마이크로플라크 검정은 HIV의 합포체-유도 분리주에 제한되었다. 검정을 96-웰 플레이트에서 수행하였으며, 여기서, 웰 당 25개 이하의 작은 플라크는 마이크로플라크 상의 합포체의 형광 형광 염색에 의해 나열될 수 있었다. 이 검정에서, 감염된 MT-2 세포는 원심분리 동안 겔화되는 용융된 아가로스를 통한 원심분리에 의해 단층으로 형성되었다. 검정은 감수성인 것으로 밝혀졌으며, 많은 차수 규모에 걸쳐 확대되는 동적 범위를 갖는다. 검정은 또한 다수의 시료를 프로세싱하는 데 특별하게 유효한 것으로 밝혀졌다. 다수의 복제물 웰에 의해 가능하게 된 컴퓨터화된 통계적 분석의 사용은 다른 형식을 사용하여 달성되기 곤란하였던 품질 제어 및 표준화의 정도를 제공하는 것으로 밝혀졌다.
1.2 PBMC 검정
PBMC 검정은 PBMC에서의 p24 항원의 발현을 96-웰 미세역가 플레이트에서의 감염된 세포의 성장 후 항원-포획 ELISA에 의해 정량화하는 표준 항원-감소 검정이다. 이 검정의 이점은 모든 HIV 균주 및 분리주에의 그의 적용가능성이다.
1.3 바이러스 스톡.
생체외 및 생체내 연구에서 중화를 위한 HIV-1 스톡은 표 3, 5, 및 6 뿐만 아니라 도 1a, 1b, 3, 22 및 23에 열거되어 있다. 하위유형 A 내지 G 및 H로부터의 1차 HIV-1 바이러스는 (a) 캘리포니아 보건당국, 바이러스 및 리케차 질환 실험실, VRDL의 샌 프란시스코 남성의 보건 연구에 참여한 동성애자 남성으로부터 단리되고; (b) HIV 단리 및 특징화를 위한 세계 보건 기구 네트워크로부터 수득되고, (c) 미국 국방부 HIV 연구 프로그램에 의해 공급되고, (d) 국립 알레르기 및 감염성 질환 연구소 AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램으로부터 기증품으로서였다. 침팬지 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 계대된 환자 분리주인 DH-12는 또한 국립 알레르기 및 감염성 질환 연구소 AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램에 의해 공급되었다.
1.4. B4 또는 dB4 중화 활성
B4 또는 dB4 중화 활성은 항체를 함유하지 않는 대조군과 비교할 경우 지시된 백분율의 바이러스의 감소 (50 내지 95%)를 제공한 항체 농도로서 정의되었다. 50% 및 90% 종점에 대한 항체 농도는 항체 희석액 사이의 내삽에 의해 유도되었다.
2. 페노센스(PhenoSense) HIV 진입 검정
약물 내성의 측정을 위한 페노센스 HIV 진입 검정을 모노그램 바이오사이언시스, 인크. (미국 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코)에서 수행하였다.
벡터 풀로부터 생성된 재조합 바이러스를 사용하여 세포를 다양한 농도의 약물 또는 항체 (예를 들어 B4 또는 dB4)의 존재 하에서 감염시켰다. 시험 벡터의 바이러스 복제를 50% (IC50) 또는 90% (IC90) 억제하는 데 필요한 약물의 양을 측정하였다.
2.1 페노센스 HIV 검정에 사용된 재조합 바이러스의 생성
페노센스 HIV 검정에 사용된 재조합 바이러스를 HIV 감염의 종적 연구에서 스크리닝되고 HIV 혈청양성으로 확인된 환자로부터 수집된 샘플로부터 생성하였다. 우연한 HIV 감염을 갖는 개체에 대해, 임상 및 혈장 샘플을 HIV 바이러스 로드 및 CD4 세포 카운트를 포함한 실험실 평가를 위해 수집하였다. 초기에 혈청음성이었지만, 대략 1년의 추적 후에 혈청양성이 된 개체에 대해, HIV 감염을 웨스턴 블롯 확인으로 2가지 효소 면역검정에 의해 확인하였다.
혈청전환 시에 하위유형 A, BF, C, D, E, EA, F, G, 또는 J를 가졌던 (다중 혼성화 검정을 사용한 이전의 HIV 하위유형화에 기초하여) 참가자로부터의 샘플을 표 3에 나타낸 바와 같이 재조합 바이러스의 구축을 위해 수집하였다. HIV env, pol 영역을 시험 샘플로부터 증폭시키고, 증폭된 DNA를 시험 벡터 내로 클로닝하였다. 진세크(GeneSeq) HIV에서, 벡터 풀을 시퀀싱하여 HIV 유전자형을 결정하였다. 페노센스 HIV 검정에서, 벡터 풀로부터 생성된 재조합 바이러스를 사용하여 세포를 다양한 농도의 약물의 존재 하에서 감염시켰다.
실시예 3
모든 계통군의 HIV 분리주에 대한 모노그램 바이오사이언스 페노센스 검정에 의한 MAB B4의 중화 활성
mAb B4는 B 계통군의 모든 HIV 바이러스를 중화시키는 것으로 널리 문서화되었다. 한 연구에서, 계통군 A (n=8), BF (n=1), C (n=18), D (n=18), E (n=4), EA (n=10), F (n=8), G (n=4), J (N=2)로부터의 총 73개의 대표적 비-B 계통군 HIV 분리주, 플러스 3개의 대조군 바이러스 92HT594, JRCSF, JRFL을 재조합 바이러스 내로 제조하고, 페노센스 HIV 검정에서 mAb B4에 대한 그의 감수성에 대해 시험하였다 (표 3). 모든 재조합 바이러스는 평균 IC50=0.018 μg/mL 및 IC90=0.062 μg/mL를 갖는 전례없는 낮은 IC50 및 IC90 농도로 mAb B4에 대해 매우 감수성인 것으로 밝혀졌다. 많은 이들 HIV 분리주는 다중-약물 내성 환자로부터 유래되었음을 밝혀낸 것은 주목할 가치가 있었으며, 이는 mAb B4 또는 그의 인간 대응물은 이미 HIV 약물 내성인 환자를 치료하는 데 매우 유효할 것임을 명백하게 지시한다.
실시예 4
모노클로날 항체 B4는 경쟁적 HIV 진입 억제를 매개한다: 치료 시 HIV 내성 돌연변이체의 예방을 예측하는 예상외의 특색
경쟁적 억제 연구는 CD4 상의 동일한 수용체 결합 부위에 대해 HIV 외피 단백질과 경쟁함으로써, 세포 내로의 HIV의 진입을 억제하는 억제제 (예를 들어, 진입 억제제 항체)의 능력 및 효능을 평가할 수 있다. 이론적 연구에서, mAb B4는 CD4의 결합에 대해 HIV 외피 단백질 (gp120)과 경쟁한다. 도 1a는 이 연구의 예측된 결과를 나타내며, 여기서, 각각의 선은 상이한 바이러스 분리주를 나타낸다. 구체적으로, 이 이론적 연구로부터 예상된 결과는, 상이한 바이러스 분리주는 mAb B4에 대해 상이한 감수성 (IC50)을 가질 것이지만, 모든 바이러스 분리주의 진입은 mAb B4가 충분한 농도로 존재하는 한 100% 억제될 것임을 입증한다.
그에 비해, 비경쟁적 억제 연구는 CD4에 결합하는 HIV 외피 단백질의 능력을 억제하거나 감소시킴으로써, 세포 내로의 HIV의 진입을 억제하는 억제제 (예를 들어, CD4의 상이한 부분에 결합하는 보조-수용체 길항제 또는 항체)의 능력 및 효능을 평가할 수 있다. 이론적 연구에서, HIV 외피 단백질 (gp120)이 CD4에 결합하는 것을 억제하는 비경쟁적 억제제 (예를 들어, TMB-355)의 능력이 분석된다. 도 2a는 이 연구의 예측된 결과를 나타내며, 여기서, 각각의 선은 상이한 바이러스 분리주를 나타낸다. 구체적으로, 이 이론적 연구로부터 예상된 결과는 상이한 바이러스 분리주는 TMB-355에 대해 상이한 감수성 (IC50)을 가질 것이며, 바이러스 분리주의 적어도 일부 부분은 존재하는 TMB-355의 양과 무관하게 세포로 진입할 것임을 입증한다. 이 이론적 연구에 기초하여, HIV 내성은 IC50과 무관하게 최대 퍼센트 억제에서 "플래토"로서 관찰될 것임이 예상될 것이다.
TMB-355 (이전 TNX-355, 이발리주맙으로도 지칭됨)는 리저스원숭이 및 인간 CD4의 세포외 도메인 2에 결합하여 CD4+ 세포 내로의 HIV의 결합후 진입을 방지하도록 설계된 인간화 IgG4 모노클로날 항체이다 (예를 들어, 문헌 [Burkly, LC, et al., 1992]; 및 [Kurizkes, DR, et al., 2004]). CD4 상의 TMB-355 항체 결합 부위는 HIV-1 외피 gp120의 결합에 요구되는 부위와는 별개이며, 주조직적합성 복합체 단백질과의 상호작용에 필요한 부위와 별개이다. 따라서, TMB-355는 비-경쟁적 HIV 진입 억제를 매개한다.
TMB-355는 일부 HIV-1 바이러스에 대해 강한 중화 활성을 갖는 것으로 나타났지만, 그의 억제 활성은 HIV 균주의 폭넓은 패널을 평가하는 경우 불일치한다. 도 2b는 TMB-355의 MPI가 118개의 Env 유사형 HIV 바이러스의 패널에 대해 (각각의 막대는 1개의 바이러스 분리주를 나타냄), 0.01 μg/mL 내지 10 μg/mL의 증가하는 IC50과 커플링하여 (우측 Y 축), 100% 내지 15% (좌측 Y 축)의 범위임을 나타낸다 (Song, R., et al., 2013). 분석된 모든 계통군 중에서, 계통군 A 및 E 바이러스는 비-계통군 A 및 E 바이러스보다 TMB-355에 대해 유의하게 더 감수성이었다. 또한, 바이러스 내성 돌연변이체는 바이러스 로드 감소를 위한 TMB-355 치료를 받는 환자로부터의 gp120의 V5 영역에서 확인된 돌연변이와 함께 발견되었다 (Toma, J., et al., 2011; Pace, C.S., et al., 2013). TMB-355 (이발리주맙)에 의해 입증된 비-경쟁적 억제 효과는, 바이러스 복제가 100% 억제 미만을 갖는 분리주에 대해 일어날 것이기 때문에, 항체 치료 기간 동안 내성 HIV 돌연변이체의 발생에 대한 높은 가능성이 있을 것임을 시사한다.
대조적으로, 850개 초과의 Env 유사형 HIV 바이러스의 패널로부터 10년 기간에 걸쳐 수집된 데이터는 mAb B4가 HIV 진입 억제에서 예상외의 폭 및 효력을 제공함을 나타낸다 (도 1b). 이 데이터의 수집으로부터, mAb B4는 거의 100% MPI를 가지며, IC50은 약 2종의 농도, 하나는 0.01 내지 1 μg/mL 및 다른 것은 약 10 μg/mL로 클러스터링된다는 것을 확인할 수 있다. mAb B4에 대한 HIV 진입 억제 프로파일은 IC50과 무관하게 약 100%에서 각각의 HIV 바이러스에 대한 MPI를 갖는 경쟁적 억제 메커니즘의 전형적인 특징을 갖는다. mAb B4의 현저하게 강한 경쟁적 HIV 진입 억제 특징의 관점에서, 바이러스 내성 돌연변이체는 mAb B4 치료 기간 동안 발생할 가능성이 적다. mAb B4에 의해 발휘되는 바와 같은 이러한 긴밀한 경쟁적 억제는 지금까지 시험된 임의의 다른 HIV 억제제로는 결코 관찰되지 않았다.
이 실시예로부터의 MPI 및 IC50 데이터는 다중-약물 내성 환자로부터 유래된 많은 HIV 분리주가 실시예 3에서 논의된 mAb B4에 대해 매우 감수성이었음을 나타내는 데이터와 조합되어, mAb B4 또는 그의 인간 대응물이 HAART 치료에 실패하고 있는 약물 내성 HIV 환자의 치료에 매우 유효할 것임을 시사하였다. mAb B4에 의해 매개되는 중화의 방식은 유사한 Fv 영역을 운반하는 mAb B4 또는 그의 인간 대응물 유사체로의 치료를 받는 HIV 환자에서 약물 내성 바이러스 돌연변이체의 생성을 방지할 독특한 HIV 약물을 제공한다. 경쟁적 HIV 결합 억제는 본 발명에 기재된 바와 같은 HIV 환자의 치료에서 항 CD4 항체가 임상 효능을 발휘하게 할 고유 특성이다.
실시예 5
항체 B4는 HIV의 무세포 및 세포-대-세포 전파 둘 다를 유효하게 억제한다
HIV 입자는 고전적으로 무세포 전파에 의해 신체 전반에 확산되며, 여기서, 바이러스는 혈류 및 국소 환경에서 확산되어 세포를 감염시킨다. 바이러스는 또한 친밀한 세포-대-세포 접촉을 요구하는 메커니즘에 의해 감염된 세포로부터 비감염된 세포로 직접적으로 전달되는 능력을 갖는다. 이러한 확산은 감염된 세포가 비감염된 세포와의 안정한 접촉점을 형성하고, HIV 입자를 비감염된 세포로 직접적으로 전파할 경우 일어난다. 세포-대-세포 확산은 무세포 확산에 비해 더 유효하고, 더 빠르며, 혈류에서의 확산을 요구하지 않는다.
문헌 [Sigal, A., et al., 2011]은 무세포 바이러스로부터 기원한 감염이 항레트로바이러스 약물 테노포비르의 존재 하에서 강하게 감소하는 반면, 세포-대-세포 확산에 관여하는 감염은 공동-배양 검정에서 약물에 대해 현저하게 덜 감수성임을 보고하였다. 감수성의 감소는 감염의 다중 라운드가 약물의 존재 하에서 종결되지 못하게 하는 데 충분하였다. 저자들은 추계적 감염 모델을 사용하여 임상적 약물 농도의 존재 하에서 세포-대-세포 확산으로부터의 복제를 조사하였으며, 복제가 돌연변이의 실질적 축적 없이 간헐적이었음을 밝혀내었다. 세포-대-세포 확산이 생체내에서 동일한 특성을 갖는 경우, 이는 면역계에 대해 유해 결과를 가져, 위험 인자를 갖는 개체에서 요법 실패를 초래하며, 잠재적으로 바이러스 내성에 기여하고, 따라서, HIV 감염의 치유에 대한 장벽이 될 수 있다.
따라서, 치료에 있어서 그의 잠재적 효과의 평가를 위해 HIV의 세포-대-세포 전파를 억제하는 mAb B4 및 mAb dB4 관련된 항체의 능력 및 효능을 평가하는 것은 중요하다.
1. HIV의 세포-대-세포 전파의 항체 매개된 억제를 측정하기 위한 검정
1.1 물질 및 방법
1.1.1 세포 및 바이러스. HIV-1 게놈 내로 조작된 리포터 유전자 루시페라제를 갖는 Jurkat-inGLuc 클론 (NIH AIDS 연구 및 시약 프로그램)을, 표면 CD4의 낮은 발현으로 인해, 표적 1차 CD4+ T 세포를 사용한 공동-배양 실험에서 공여자-대-공여자 감염을 최소화하기 위한 공여자 세포로서 선택하였다. 리포터 유전자 루시페라제는 감염된 세포에서 발현되며, 바이러스 감염에 대한 마커로서 사용될 수 있다. 감염된 세포에서의 이들 바이러스적으로 발현된 리포터를 측정하여 HIV-1 감염을 정량화할 수 있다. 1차 CD4+ T 세포를 표적 세포로서 사용하였다. 계통군 D의 바이러스 UG266 및 UG046을 연구에 사용하였다.
1.1.2 바이러스 세포-대-세포 전파 검정. 이 검정에서, 공여자를 계열 희석액 중에서 항체 B4와 함께 예비인큐베이션한 후, 지시된 HIV-1 균주와 혼합하고, 수 일 후에 사용하였으며, 이 때 세포의 약 10 내지 75%가 Gag+였다. 그 후, 공여자 및 CD4 양성 PBMC 표적 세포를 1:2 비율로 96-웰 플레이트에서 200 μl 중 1.5 × 106개 세포/ml의 최종 농도에서 혼합하였다. 48시간 후, 세포를 세포내 Gag에 대해 염색하고, 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 배양물 상청액에 축적된 GLuc를 바이오룩스 가우시아(BioLux Gaussia) 루시페라제 검정 키트 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)) 및 버톨드 테크놀로지스(Berthold Technologies) 광도계를 사용하여 검출하였다.
1.1.3 IC50 및 IC90의 계산. 데이터를 S자형 용량-반응 곡선 (가변 기울기)으로 피팅함으로써 용량-반응 억제 곡선을 도출하였다. 억제의 백분율은 (비처리된 표적 세포에서의 퍼센트 신호 ― 항체-처리된 세포에서의 퍼센트 신호)/(비처리된 표적 세포에서의 퍼센트 신호 ) × 100으로서 정의되었다. IC50 및 IC90을 그에 따라 계산하였다.
2. 결과 및 논의
표 4는 항체 B4가 엄격한 90% 진입 억제 기준에 의해 측정한 경우 HIV (계통군 C의 바이러스 균주 UG266 및 UG046)의 세포-대-세포 및 무세포 전파를 등가적으로 억제할 수 있었음을 나타낸다. 구체적으로, 융합 억제 역가는 세포-대-세포 전파 검정에서 UG266 및 UG046 바이러스 균주에 대해 1:140 및 1:245인 것으로 밝혀졌으며, 이는 각각 무세포 전파 중화 검정에서 1:136 및 1:234의 중화 역가에 필적하였다. 50% 진입 억제 기준에 의해 측정한 경우 상응하는 무세포 전파에 비해 세포-대-세포 전파에 대해 2가지 균주에 대한 보다 높은 융합 억제 역가가 관찰되었다.
이들 결과는 항체 B4가 HIV Env 단백질을 표적화하는 모든 다른 중화 모노클로날 항체 및 지금까지 측정된 다른 ART-약물과 비교할 경우 HIV의 세포-대-세포 및 무세포 전파 둘 다를 억제하는 그의 능력에 있어서 비범한 특성을 가짐을 입증한다. 이들 결과는 mAb B4 및 mAb dB4 관련된 항체가 개체에서 HIV 바이러스의 무세포 및 세포-대-세포 확산을 방지하는 데 특출하게 적격임을 시사한다.
실시예 6
항체 UB-421 (DB4C7 또는 DB4)은 HIV 감염된 개체에서 증진된 바이러스 복제를 위한 휴지기 PBMC의 재활성화를 매개한다
1. 배경
HIV-1은 휴지기 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 감염시키지만, 후속 세포 활성화까지 불활성으로 남아 있다. 정지 PBMC에 잠복한 잠복 HIV-1을 모방하는 휴지기 T 세포의 비증식적 감염을 허용하는 세포 배양 조건 및 프로토콜을 사용한 시험관내 모델을 사용하여 이들 휴지기 PBMC에 대한 열-불활성화된 HIV-1 (iHIV-1) 또는 gp120-항-gp120 면역 복합체의 자극 효과를 조사하였다 (Briant, L., et al., 1996).
열-불활성화된 HIV-1 (iHIV-1) 또는 gp120-항-gp120 면역 복합체의 외피 당단백질과의 CD4 맞물림은 가교를 통해, NF-kB (즉, 핵 전위) 및 AP-1의 활성화를 제어하는 신호 전달 경로를 자극하고, 결국 CD4 및 몇몇 키나제 (Lck, Raf-1, MEK 및 ERK)의 세포외 도메인 1 (D1) 및 세포질내 도메인이 세포 주기 진행을 유도하고, 활성화 마커 CD25의 세포-표면 발현을 촉진시키며, 프로바이러스 통합을 자극하고 세포가 바이러스를 생산하게 하는 것에 관여하는 데 충분한 것으로 입증되었다.
탄(Than) 등에 의한 별개의 과학적 발견 (Than, et al., 1997)은 항-CD4 모노클로날 항체에 의한 gp120 결합 부위에서의 CD4 분자의 가교가 HIV 감염된 환자로부터 잠복 감염된 PBMC를 유도하여 바이러스 복제를 촉진시킴을 추가로 확인하였다. 이 연구에 사용된 항-CD4 mAb는 CD4의 D1의 CDR2-루프에 결합하는 Leu3a였다. 구체적으로, Leu3a는 CD4의 도메인 1 내에 aa47-64를 갖는 펩티드로 나타내어진 선형 에피토프로 지시된다 (Chiba, Y. 1992).
또한, 휴지기 PBMC에서의 바이러스 재활성화는 CD4의 도메인 1 (D1) 중의 CDR2-루프에 대해 지시된 모노클로날 항체에 의해 특이적으로 유도되며, 다른 에피토프, 예컨대 D1 중의 CDR3 또는 인근의 D1/D2 연접 영역에 대해 지시된 항체에 의해서는 그렇지 않은 것으로 밝혀졌다 (Briant, L., et al., 1999) (도 3, 레인 4를 레인 5 및 6와 비교). 이러한 바이러스 재활성화는 가용성 CD4 (sCD4)로의 CDR2-루프 리간드의 사전 흡수에 의해 방지될 수 있다 (도 3, 레인 4 및 레인 8을 비교).
따라서, 도메인 1 영역 주위의 CD4와의 높은 결합 친화도를 갖는 항체 dB4C7 (UB-421)이 HIV 감염된 개체에서 향상된 바이러스 복제를 위한 휴지기 PBMC의 재활성화를 매개할 수 있는지 여부를 평가하는 것이 중요하였다.
2. CD4의 D1 주위의 B4/dB4 입체형태적 결합 부위의 정밀화
2.1 mAb B4에 의한 침팬지 CD4 양성 PBMC에의 Leu3a 결합의 경쟁적 순차적 결합 억제 (그러나 역순은 아님)
2종의 대상체 (X282 및 X301)로부터 단리된 침팬지 PBMC 세포 뿐만 아니라 mAb B4 (FITC에 의해 표지됨) 및 Leu3a (PE에 의해 표지됨)를 이 연구에 사용하였다. PBMC를 각각의 항체로 순차적으로 염색하고, 세포형광촬영법에 의해 분석하였다. 이 실험으로부터 수득된 데이터를 표 5 및 도 4에 보고하며, 하기에서 논의한다.
단일 표지 대조군 샘플에서, Leu3a만으로 염색된 세포는 Leu3a-PE 결합에 대해 양성으로 판정되었고 (도 4, 패널 2); mAb B4만으로 염색된 세포는 B4-FITC 결합에 대해 양성으로 판정되었다 (도 4, 패널 3). 구체적으로, 비-감염된 침팬지 샘플 (X282 및 X301)에서 CD4+ 세포 (Leu3a에 의해 검출된 바와 같음)는 각각 25.5% 및 44.0%였으며, 이는 mAb B4에 의해 검출된 것들 (26.1% 및 45.5%)과 유사하였다 (표 5).
Leu3a의 사전 결합 후 이어진 mAb B4에의 노출은 Leu3a 또는 B4 단독으로 염색된 단일 표지 대조군 세포와 유사한 이중 염색된 (Leu3a+/B4+) PBMC 세포 카운트를 발생시켰다 (도 4, 패널 4) (즉, X282 및 X301에 대해 각각 24.5% 및 46.7%) (표 5).
대조적으로, mAb B4의 사전 결합, 그 후 이어진 Leu3a에의 노출은 단일 또는 이중 염색 절차 중 어느 하나에서 Leu3a 양성 염색 없이 단지 mAb B4 염색된 PBMC를 발생시켰다 (도 4, 패널 5, 표 5).
집합적으로, 이들 결과는 Leu3a-PE에 대한 항체 B4-FITC에 의한 한 방향 억제를 입증한다. 즉, B4 결합은 사전 Leu3a 결합에 의해 차단되지 않지만; 그러나, Leu3a 결합은 사전 B4 결합에 의해 차단된다. 이들 데이터는 mAb B4가 항체 Leu3a에 의해 인식되는 CD4 도메인 1의 CDR2 영역을 커버하는 입체형태적 에피토프를 인식하며, mAb B4가 항체 Leu3a에 비해 더 높은 친화도로 CD4의 이 영역에 결합한다는 결론을 뒷받침한다.
2.2 ELISA에 의한 HIV RC 펩티드 (aa39-66)에 대해 지시된 면역 혈청에 의한 rsCD4에의 B4 결합의 경쟁적 억제
전장 재조합 가용성 CD4 (rsCD4)에 대한 mAb B4의 결합 친화도를 CD4 도메인 1의 CDR2 영역에 대해 지시된 면역 혈청을 사용한 경쟁적 억제 연구를 통해 평가하였다.
2.2.1 항-HIV RC 폴리클로날 항체. CD4 도메인 1의 CDR2 영역에 대한 폴리클로날 항체를, 기니아 피그를 CD4의 aa39-66을 포함하는 시클릭 펩티드로 면역화함으로써 제조하였다. 이 시클릭 펩티드는 이 연구에서 HIV 수용체 복합체 펩티드 (HIV RC 펩티드)로 지칭되며, 이전에 문헌 [Wang, et al., 2002]에서 펩티드 p2240c로서 기재되었다.
구체적으로, HIV RC 펩티드에 대해 지시된 기니아 피그 혈청을, 4 내지 6주령 던컨 하틀리(Duncan Hartley) 기니아 피그를 제0주에서 완전 프로인트 아주반트 및 3 및 6주에서 불완전 프로인트 중에서 용량당 0.5 ml 중 100 μg으로 근육내 면역화하고, 그 후 불완전 프로인트 중에서 매월 부스팅한 후에, 특정된 시점에서 수득하였다.
수득된 폴리클로날 항체는 "항-HIV RC 폴리클로날 항체"로 지칭된다.
2.2.2 항-HIV RC 폴리클로날 항체에 의한 rsCD4에의 B4 결합의 경쟁적 억제. 전장 rsCD4로 웰 당 0.1 mL 중 0.08 μg/mL로 코팅된 96 웰 미세역가 플레이트를 사용하여 경쟁적 억제 실험을 수행하였다. 웰을 1:30 희석액에서의 HIV RC 펩티드 (CD4의 aa39-66)에 대해 지시된 면역원으로 면역화 후, 비오티닐화된 B4-항체에 의한 결합, 그 후 이어진 트레이서로서의 접합된 아비딘-HRP과의 결합 후 0, 3, 6, 9, 12, 14, 16, 및 19주로부터 수집된 기니아 피그 혈청과 함께 인큐베이션하였다. 동일한 기간 전반에 걸쳐 수집된 비면역화된 기니아 피그로부터의 음성 대조군 혈청 (RC 이소형)을 또한 시험하였다.
도 5는 rsCD4에의 비오티닐화된-B4 결합이 초기 면역화 후 6주에서 수득된 항-HIV RC 폴리클로날 항체에 의해 유의하게 억제되어, 초기 면역화 후 9주까지 거의 완전한 억제에 도달하였음을 나타낸다.
이 경쟁적 결합 억제 연구는 mAb B4의 결합 부위가 CD4의 도메인 1의 CDR2 루프 주위에 있지만, mAb B4에 의한 이 펩티드에의 직접 결합은 막-결합된 CD4의 입체형태적 윤곽에의 mAb B4의 우선적 결합으로 인해 유의하지 않았음을 추가로 입증하였다.
2.3 mAb dB4의 가교 시 HIV 감염된 개체에서의 향상된 바이러스 생산을 위한 휴지기 CD4 양성 T 세포의 재활성화
휴지기 CD4+ 세포를 활성화시키는 mAb dB4의 능력을, 세포를 mAb dB4로 처리하고, TNF-α 생산, 바이러스 로드, 및 세포 증식을 모니터링함으로써 평가하였다.
이 연구에서, 8-웰 배양 플레이트를, 플레이트를 200 μL의 염소 항-인간 IgG (잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch))와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 인간 IgG로 코팅하였다. 코팅된 플레이트를 4℃ 냉장고에서 이 연구에 추가로 사용할 때까지 유지하였다.
HIV 환자로부터의 PBMC를 1.5시간 동안 표준 관행에 따라 해동하였다. 휴지기 CD4+ 세포의 활성화를, 하기 설명된 바와 같이 PBMC를 mAb dB4 (실험적), PMA+PHA (양성 대조군), 또는 배지 단독 (음성 대조군) 중 어느 하나로 처리함으로써 평가하였다.
2.3.1 MAb dB4 처리. 세포를 3 μg/106개 세포/mL의 농도의 mAb dB4로 4℃에서 1시간 동안 처리하여 세포 상의 CD4의 가교를 개시하였다. 그 후, mAb dB4로 처리된 세포를 세척하고, 코팅된 48-웰 배양 플레이트 상에서 7일 동안 RPMI 배지 및 10% FBS와 함께 배양하였다. 비코팅된 웰을 또한 음성 대조군으로서 사용하였다. 배양물 상청액의 분취물을 차후 평가를 위해 제0일, 제2일 및 제7일에 동결시켰다. mAb dB4 샘플에 대한 제0일 시점을, 4℃에서 30분의 처리 후에 세포로부터 상청액을 제거함으로써 수득하였다.
2.3.2 PMA+PHA 처리. 휴지기 CD4+ 세포를 재활성화시키기 위한 양성 대조군으로서, 세포를 0.1 μM 피토헤마글루티닌 (PHA) 플러스 15 μg/mL 포르볼 미리스테이트 아세테이트 (PMA) (시그마) (PMA+PHA)로, 코팅된 48-웰 배양 플레이트 상에서 7일 동안 RPMI 배지 및 10% FBS와 함께 처리하였다. 비코팅된 웰을 또한 음성 대조군으로서 사용하였다. 배양물 상청액의 분취물을 차후 평가를 위해 제0일, 제2일 및 제7일에 동결시켰다. PMA+PHA 샘플에 대한 제0일 시점을, 4℃에서 30분의 처리 후에 세포로부터 상청액을 제거함으로써 수득하였다.
2.3.3 배지 단독. 음성 대조군으로서, 세포를 코팅된 48-웰 배양 플레이트 상에서 7일 동안 RPMI 배지 및 10% FBS (배지 단독)와 함께 인큐베이션하였다. 비코팅된 웰을 또한 음성 대조군으로서 사용하였다. 배양물 상청액의 분취물을 차후 평가를 위해 제0일, 제2일 및 제7일에 동결시켰다. 배지 단독 샘플에 대한 제0일 시점을, 4℃에서 배지 중에서 30분의 인큐베이션 후에 세포로부터 상청액을 제거함으로써 수득하였다.
2.3.4 CD4+ 재활성화의 분석. CD4+ 세포의 재활성화를, TNF-α 생산, 바이러스 로드, 및 세포 증식을 평가함으로써 측정하였다. 이 연구로부터의 결과를 표 6에 요약한다.
모든 샘플로부터의 분취물을 표준 방법을 사용하여 (1) 정량적 ELISA에 의해 TNF-α의 농도; (2) RT PCR에 의해 HIV 바이러스 로드; (3) 세포 카운트; 및 (4) 트리판 블루에 의해 생존율에 대해 검정하였다.
구체적으로, 데이터는 HIV 환자로부터의 mAb dB4 코팅된 PBMC 세포의 가교가 배지 단독 음성 대조군 (비-검출가능함) 및 PMA+PHA로 자극된 세포 (mAb dB4 코팅된 세포보다 약 3 내지 5배 더 높음)와 비교할 경우, TNF-α의 중등도 생산을 촉발시켰음을 나타낸다.
또한, mAb dB4 샘플은 배지 단독 음성 대조군과 유사한 속도로 증식한 반면; PMA+PHA 자극된 세포는 mAb dB4와 가교된 세포에 비해 훨씬 더 큰 정도로 증식하였다 (세포 카운트는 제7일에 mAb dB4 배양물보다 PMA+PHA 배양물에서 5배 더 높았음).
그러나, HIV 바이러스 로드는 배지 대조군 및 PMA+PHA 자극된 세포에 비해 mAb dB4와 가교된 세포에서 유의하게 향상되었다. 구체적으로, mAb dB4와 가교된 세포는 제2일 및 제7일에서의 배지 단독 음성 대조군과 비교할 경우 각각 바이러스 로드의 151% 및 220% 증가를 나타낸 반면; PMA+PHA 배양물은 세포 증식의 5배 증가에도 불구하고, 차선의 바이러스 로드 생산 (제2일 및 제7일에서 각각 55% 및 78%)을 나타내었다.
3. 결론
1. 뮤린 mAb B4는 항체 Leu3a에 의해 인식되는 부위 (CDR2 영역 중의 aa47-64)에 가까운 CD4 상의 입체형태적 부위를 인식하는 것으로 밝혀졌다. mAb dB4는 실시예 7에서 보고된 비교 연구에 기초하여 mAb B4에 대해 본원에 기재된 것과 동일한 인식 특성을 갖는다.
2. 전장 rsCD4에의 뮤린 mAb B4 결합은 CD4 도메인 1의 CDR2 영역의 aa39-66을 함유하는 시클릭 펩티드 (HIV RC 펩티드)에 대해 지시된 폴리클로날 항체에 의해 억제되었다. 이들 결과는 mAb B4가 CD4의 D1의 CDR2 루프에 상응하는 CD4의 aa39-66을 인식함을 시사한다. mAb dB4는 실시예 7에서 보고된 비교 연구에 기초하여 mAb B4에 대해 본원에 기재된 것과 동일한 인식 특성을 가질 것으로 예상된다.
3. mAb dB4와 가교되는 CD4는 HIV 감염된 PBMC CD4+ T 세포에서 바이러스 생산을 활성화시키는 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, mAb dB4는 표 6에 나타낸 바와 같이, 세포 증식의 유도 없이 TNF-α 생산 및 향상된 HIV 생산의 유도를 초래한다.
4. 이 실시예에서 수득된 결과에 기초하면, mAb dB4 (UB-421 포함)는 HIV 감염된 개체에서 향상된 바이러스 생산을 위한 휴지기 PBMC의 재활성화를 매개할 수 있다.
실시예 7
MAB DB4C7 및 항-HIV RC 폴리클로날 항체는 CD4 양성 T 세포에 의한 항원 유도된 T 세포 증식 및 시토카인 (IL2 및 IFN-γ) 생산을 억제하며, 따라서 피롭토시스의 HIV 병원성 주기를 파괴한다
1. 배경
최근의 보고는 HIV가 허용적, 활성화된 CD4+ T 세포를 감염시키는 경우, 세포 사멸이 카스파제-3-의존성 아폽토시스를 통해 침묵적으로 일어남을 보여주었다 (Doitsh, G., et al., 2014). 반대로, R5 또는 X4-트로픽 HIV 중 어느 하나가 림프성 조직으로부터의 비-허용적, 정지 CD4+ T 세포를 불발적으로 감염시키는 경우, 이들 세포는 프로그래밍된 세포 사멸의 극심하게 염증성 형태인 카스파제-1-의존성 피롭토시스에 의해 사멸한다. 인터페론 유도 인자 16 (IFI16)은 불완전 HIV 역전사체를 인식하고, 결국 카스파제-1의 활성화를 개시하는 숙주 DNA 센서로서 확인되었다 (Monroe, K.M., et al., 2013). 편도, 림프절 및 비장을 포함한 대부분의 인간 림프성 조직에서, 세포의 활성화된 허용적 하위집합은 총 CD4 T-세포의 5% 이하를 나타내는 반면, 비-허용적 정지 세포는 HIV에 의해 마주친 표적의 95% 이상을 나타낸다. 따라서, 카스파제-3-매개된 아폽토시스가 아니라 카스파제-1-매개된 피롭토시스는 이들 림프성 조직의 HIV 감염 후 CD4 T-세포 사멸의 유도를 우세하게 담당하는 것으로 보인다. 이들 발견은 R5-트로픽 HIV로 감염된 대상체로부터의 신선한 림프절의 분석에 의해 추가로 뒷받침되며, 여기서, 카스파제-1 및 IL-1β는 휴지기 CD4 T 세포에 풍부한 부피질 구역에서 검출된 반면, 카스파제-3 활성은 증식적으로 감염된 세포가 발견되는 해부학적으로 별개의 배중심에서 검출된다.
피롭토시스는 가장 가능성있게는, 세포내 복제 니치를 제거하고, 염증유발 시토카인의 방출 및 내인성 위험 신호를 통해 숙주의 방어 반응을 향상시킴으로써 다양한 박테리아 감염의 급속한 클리어런스를 촉진시킨다. 그러나, 병원성 만성 염증에서, 예컨대 HIV 감염에서, 피롭토시스는 보호적 반응이며, 1차 감염의 클리어런스를 초래하지 않는다. 사실, 피롭토시스는 악성 병원성 주기를 생성하는 것으로 보이며, 여기서, 사멸하는 CD4 T 세포는 보다 많은 세포를 감염된 림프성 조직 내로 유인하여 사멸시키고 보다 많은 염증을 생성하는 염증 신호를 방출한다. 이들 사건은 질환 진행 및 조직 손상을 부추기는 염증의 만성 상태를 확립한다. 만성 염증은 또한 기억 CD4 T 세포의 항상성 증식을 자극하는 잠복 HIV 저장소의 유지를 촉진시킬 수 있다.
CD4 T 세포의 고갈 및 만성 염증의 발생은 질환 진행을 추진시키는 HIV 발병기전에서 특징적인 과정이며, 피롭토시스는 이들 2가지 질환-촉진 과정 사이의 예상외의 관련을 제공한다.
상기 정보는 HIV 감염 동안 림프성 조직에서 일어나는 피롭토시스가 CD4+ 세포의 항원 자극에 의해 촉발되는 CD4+ 세포 증식 및/또는 염증성 시토카인 생산을 억제하는 메커니즘에 의해 경감되거나 감소될 수 있음을 시사한다.
2. 실험
mAb dB4가 HIV 감염된 개체에서 만성 염증의 발생을 억제함으로써 피롭토시스에 의해 유발된 병원성 주기를 파괴할 수 있는 지를 측정하기 위한 연구를 수행하였다. 항원 자극에 의해 촉발된 시토카인 생산의 억제는 이미 불발성 HIV 감염을 갖는 많은 휴지기 T 세포에 의한 피롭토시스의 부하를 완화하며, 따라서 시토카인 생산으로 인한 CD4 양성 T 세포 고갈에서 HIV 병리학을 파괴하는 데 조력할 것이다.
스타필로코쿠스 내독소 B (SEB)를 사용한 시험관내 모델을 사용하여 정상 및 HIV 감염된 개체 둘 다에서 PBMC T 세포 증식을 억제하는 mAb dB4C7 (UB-421)의 능력을 평가하였다. SEB는 특정 T 세포 항원 수용체 (TCR)를 보유하는 모든 T 세포를 자극하는 능력을 가지며, 대량 시토카인 생산을 유도하는 초항원이다.
후옌 카오(Huyen Cao) 및 모하메드 엘레패리(Mohamed Elrefaei) 박사와의 공동연구를 통해, 정상 인간 공여자 (n=3) 및 HIV-감염된 공여자 (n=6, ART 나이브, CD4+ 카운트 > 200, 바이러스 로드 > 10,000)의 기능적 분석을 수행하여, mAb dB4C7 (UB-421) 또는 CD4의 D1의 CDR2 영역에 대해 지시된 항-HIV RC 폴리클로날 항체 (실시예 9에 기재됨)가 세포 증식 및 시토카인 (IL2 및 IFN-γ) 생산을 억제할 수 있는 지를 평가하였다.
2.1 연구 대상 및 샘플.
HIV-양성 ART 치료 나이브 자원자 (n=6)를 REACH 코호트 (샌 프란시스코)로부터 모집하였다. 3명의 동일-연령, HIV-혈청음성 대조군 자원자가 또한 연구에 포함되었다. PBMC를 분리하고, 검정 시간까지 액체 질소에서 저온보존하였다.
2.2 포화 농도의 mAb dB4C7 또는 정제된 항-HIV RC 폴리클로날 항체를 사용하였다.
CD4+ T 림프구를 먼저 간접 면역형광 연구에서 각각 mAb dB4C7 IgG 또는 항-HIV RC 폴리클로날 항체 IgG, 그 후 알렉사-염소 항-HuIgG 또는 알렉사-염소 항-기니아 피그 IgG로 염색하였다. 생성된 염색된 세포를 유동 세포측정법에 의해 검출된 양성 세포 퍼센트에 대해 분석하였다. mAb dB4C7 및 항-HIV RC 폴리클로날 항체 둘 다는 2배 희석에서 50 μg/mL 내지 0.0025 μg/mL에서 역가측정되었다. mAb dB4 및 항-HIV RC 항체에 대한 항체 역가측정은 % CD4 결합 대 항체 농도 (μg/mL)로서 측정되었다. 이들 역가측정은 HIV 감염된 개체 및 정상 개체에 대해 수행된 T 세포 기능적 검정에 사용하기 전에 평가되었다.
도 6은 기능적 연구에 사용된 각각의 시약에 대한 포화 농도가 mAb dB4 (dB4C7)에 대해서는 1 μg/mL이고, 항-HIV RC 폴리클로날 항체에 대해서는 25 μg/mL인 것으로 밝혀졌음을 나타낸다.
2.3 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 증식.
세포 증식을 CFSE (카르복시-플루오레세인 숙신이미딜 에스테르) 형광 검정에 의해 분석하였으며, 이는 세포 분열 시 CFDA-SE (카르복시-플루오레세인 디아세테이트, 숙신이미딜 에스테르) 염색의 소실을 따른다. CFSE는 3H-티미딘 (증식) 검정을 위한 대용물로서 사용되었다.
PBMC를 포화 농도의 mAb dB4C7 또는 정제된 항-HIV RC 폴리클로날 항체와 함께 인큐베이션하여 세포의 표면 상의 CD4 수용체를 코팅하였다. 세포를 또한 각각 음성 및 양성 대조군으로서 25 μg/mL의 항-HIV RC 이소형 및 PHA (10 μg/ml; 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))와 함께 인큐베이션하였다.
PBMC를 PBS 중 CFDA-SE (몰리큘라 프로브, 미국 오레곤주 유진)로 표지한 후, 100% FCS (시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스)로 켄칭하였다. 그 후, 세포를 PBS로 세척한 후 10% FCS를 갖는 RPMI 1640 (시그마-알드리치)에 재현탁시켰다.
그 후, 세포를 SEB Ag (1 μg/mL)의 존재 하에서 37℃에서 5% CO2 중에서 5일 동안 배양하고, 표면 마커의 발현에 대해 분석하였다.
CD3+ (암시안(Amcyan)) 게이팅된 CD4+ (PE, D2), CD8+ (PercpCY5.5) 세포 집단의 분석을 위해 유동 세포측정법을 수행하고, 이들을 각각 증식하는 세포의 %로서 % CFSE 양성 세포에 대해 추가로 측정하였다. LSR II (비디 바이오사이언시스, 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)를 사용하여 샘플 당 4만 (40,000)개의 림프구를 획득하고, 플로우조 소프트웨어 (트리스타(TreeStar), 미국 캘리포니아주 샌 칼로스)에 의해 분석을 수행하였다. 결과를 분열하는 CD4 (또는 CD8) T 세포의 %로서 측정하였다. 모든 연구 참가자는 PHA 자극 후 유의한 증식이 입증되었다. SEB Ag 자극이 없는 CD4 T 세포 (음성대조군)의 증식은 <0.5%였다.
2.4 시토카인 (IL2 및 IFN-γ) 생산의 측정을 위한 세포내 염색 검정.
PBMC (0.5 x 106개 세포)를 37℃에서 5% CO2 중에서 SEB Ag (1 μg/mL)와 함께 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 0.1% FCS를 함유하는 PBS (세척 완충제)로 세척하고, 세포를 실온에서 10분 동안 용해 용액 (비디 바이오사이언시스)에 재현탁시킴으로써 고정하였다. 세포를 세척 완충제로 1회 세척한 후, 0.5 mL의 투과화 용액 2 (비디 바이오사이언시스)에 재현탁시킴으로써 투과화하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 세척 완충제로 세척하고, 항-IL-2 APC, 항-IFN-γ (PE CY7), 및 항-CD3 (암시안), 항-CD4 (PE, D2) 또는 항-CD8 (Percp CY5.5) (비디 파밍겐(BD Pharmingen))로 염색하였다. LSR II (비디 바이오사이언시스)를 사용하여 샘플 당 4만 (40,000)개의 림프구를 획득하고, 플로우조 소프트웨어 (트리스타)에 의해 분석을 수행하였다. Ag 자극 없는 시토카인-생산 CD4 또는 CD8 T 세포의 백분율은 <0.05%였다 (음성 대조군). 결과를 IFN-γ 또는 IL2를 발현하는 CD4+ (또는 CD8+) T 세포의 %로서 표현하였다.
2.5 통계적 분석.
통계적 분석 및 비교를 대응표본 t 검정으로 수행하였다.
3. 결과
이 SEB Ag 유도된 T 세포 증식 연구로부터 수득된 결과는 mAb dB4C7 (1 μg/mL) 및 항-HIV RC 폴리클로날 항체 (25 μg/mL) 둘 다가, 포화 상태 하에서, CD4+ T 세포 증식을 감소시켰지만, 둘 다의 HIV ART 치료 나이브 환자에서 및 동일-연령 정상 개체에서 CD8+ T 세포 증식은 그렇지 않았음을 밝혀내었다 (데이터는 나타내지 않음).
mAb dB4 (1 μg/mL) 및 정제된 항-HIV RC 폴리클로날 항체 (25 μg/mL) 둘 다는, 그들의 각각의 포화 PBMC 표면 CD4 결합 농도에서, HIV 음성 (도 7a) 및 HIV 양성 (도 7b) 개체에서 초항원 SEB 유도된 증식성 CD4+ T 세포에 의한 IL2 생산을 억제하였다. 이러한 억제는 동일한 HIV 양성 및 음성 개체로부터의 CD8+ T 세포에서는 발견되지 않았다 (도 7c).
mAb dB4 (1 μg/mL) 및 정제된 항-HIV RC 항체 (25 μg/mL) 둘 다는, 그들의 각각의 포화 농도에서, 또한 HIV 음성 (도 7d) 및 HIV 양성 (도 7e) 개체에서 초항원 SEB 유도된 증식성 CD4+ T 세포에 의한 IFN-감마 생성을 억제하였다. 이러한 억제는 동일한 HIV 음성 (도 7f) 및 양성 (도 7g) 개체로부터의 CD8+ T 세포에서는 발견되지 않았다.
4. 결론
둘 다 CD4 도메인 1의 CDR2 영역을 표적화하는 항체 mAb dB4C7 (UB-421) 및 항-HIV RC 폴리클로날 항체는 CD4 양성 T 세포에 의한 초항원 SEB 유도된 T 세포 증식 및 시토카인 (IL2 및 IFN-γ) 생산을 억제하지만, CD8 양성 T 세포에 의한 T 세포 증식 및 시토카인 (IL2 및 IFN-γ) 생산은 그렇지 않은 것으로 밝혀졌다. dB4C7 및 항-HIV RC 폴리클로날 항체가 CD4+ T 세포 증식 및 연관된 시토카인 (IL2 및 IFN-γ) 생산을 억제할 수 있다는 발견은 항체가 피롭토시스의 HIV 병원성 주기를 파괴할 잠재력을 갖는 다른 CD4 양성 세포 관련된 시토카인 생산에 대한 유사한 억제 효과를 발휘할 수 있음을 시사한다.
이 실시예 및 선행 실시예에서 관찰된 CD4 양성 T 세포 증식 및 연관된 시토카인 (IL2 및 IFN-γ) 생산에 대한 억제 효과는 본원에 기재된 CDR2 영역 표적화 항체가 (1) 그의 잠복성 상태로부터 HIV의 방출을 촉발시키는 휴지기 HIV 감염된 CD4 양성 T 세포의 재활성화 (실시예 9에서 논의된 바와 같음); (2) 휴지기 CD4+ T 세포의 재활성화에 의해 방출된 새로운 바이러스로부터의 비감염된 CD4 양성 T 세포 내로의 HIV 진입의 경쟁적 억제 및 방지 (실시예 4 및 6); 및 (3) (초)항원 자극 시 CD4 양성 T 세포에 의한 T 세포 증식 및 시토카인 생산의 억제 (이 실시예)를 포함한, CD4 세포에 대한 동시 대향 효과를 발휘할 수 있다는 점에서 매우 중요하다.
HIV 결합 및 면역 반응의 억제의 바로 그 부위 (즉, CD4 도메인 1의 CDR2 영역)를 표적화하는 mAb dB4 및 항-HIV RC 폴리클로날 항체의 독특한 생물학적 특색은 HIV 감염의 기능적 치유에 요구되는 특성, 즉, (1) 진입 억제를 통해 HIV 감염을 방지하고; (2) 휴지기 T 세포에서 바이러스 생산을 재활성화시키고, (3) 시토카인 생산을 직접적으로 변경시키는 능력을 제공한다.
실시예 8
무증상 HIV-1 감염된 성인에서의 UB-421의 안전성 및 효능을 조사하기 위한 IIa상, 개방-표지, 다중-투여, 용량-의존성 시험
1. 연구 목적:
1. 무증상 HIV-1 감염된 대상체에서의 UB-421의 2가지 용량 처방의 다중 투여의 안전성 및 내약성을 평가하기 위함.
2. 이들 대상체에서의 UB-421의 2가지 용량 처방의 다중 투여의 항바이러스 활성의 증거를 수득하기 위함.
3. 최적 UB-421 투여 및 용량 처방을 결정하기 위한 항바이러스 활성 및 안전성 프로파일을 평가하기 위함.
(임상 시험 식별자: NCT01668043).
2. 연구 설계
이는 UB-421의 반복된 정맥내 투여를 사용한 개방-표지 연구였다. HIV-1에 대해 혈청양성 및 무증상인 대상체를 적격성에 대해 스크리닝하였다. 스물 아홉 (29)명의 등록된 대상체는 8-주 치료 기간 동안 2가지 용량 수준, 즉, 10 mg/kg 매주 (코호트 1) 또는 25 mg/kg 격주 (코호트 2) 중 하나의 연구 약물 (UB-421)의 다중 정맥내 주입을 받았다. 대상체를 사이트에 의해 및 등록 순차에 기초한 차례에 의해 2개의 연구 코호트 중 하나로 할당하였다. 대상체를 8-주 치료 기간 후 추가의 8-주 기간 동안 지켜보았다. 연구는 제16주에 종료하였다.
3. 포함을 위한 기준
대상체는 IIa상 시험에 적격성이 되기 위해 하기 기준을 충족시킬 것이 요구되었다:
1. 무증상, 항레트로바이러스 요법 (ART)-나이브, HIV-1 혈청양성
2. CD4+ T 세포 카운트 > 350개 세포/mm3
3. HIV-1 바이러스 로드 > 5,000 카피/mL
4. 즉각 요법을 요구하는 활성 감염이 없음 (HIV-1 제외)
5. 면역조정 약물 또는 전신적 화학요법의 사용 없음
6. 고도 활성 항레트로바이러스 치료 (HAART)에 대한 필요 없음.
이 연구의 완결 후, 대상체는 외래환자 클리닉에서 통상적인 모니터링 일정 (항레트로바이러스제를 갖지 않음)을 따르거나, HIV/AIDS의 진단 및 치료를 위한 현재 지침에 따라 주요 조사자에 의해 필요한 것으로 간주되는 경우 치료 표준 항레트로바이러스 요법 (예를 들어 HAART)을 받았다. UB-421으로의 I상 시험에서 등록되고, IIa상 시험의 참가 기준을 충족시킨 환자는 이 연구에 합류하도록 허용되었다.
4. 조사 생성물(들)
UB-421 (dB4C7 mAb)을 10 mg/mL (10 mL 바이알 중 100 mg)의 농도에서 공급하였다.
각각의 등록된 대상체는 8주 동안 하기 투여량: 10 mg/kg 매주 (코호트 1) 또는 25 mg/kg 격주 (코호트 2) 중 하나의 UB-421의 다중 정맥내 주입을 받았다. UB-421의 적절한 부피는 특정된 용량 및 대상체의 체중에 기초하였다. 코호트 내의 각각의 개별 대상체가 약물의 등가의 주입 부피를 받도록 각각의 개별적 용량의 부피를 멸균 염수를 사용하여 조정하였다. 총 주입 부피는 대략, 10 mg/kg 용량 코호트에 대해 100 mL 및 25 mg/kg 용량 코호트에 대해 200 mL이었다. 각각의 투여에 대한 주입 시간은 대략 1 내지 2시간이었다.
5. 평가를 위한 기준:
5.1 1차 안전성 및 효능 종점:
UB-421의 하기 안전성 및 내약성 파라미터를 제16주 (연구의 종료)까지 평가하였다:
1. 신체 검사 (PE)
2. 활력 징후
3. 임상 화학 & 혈액학 시험
4. 유해 사례 (AE)/심각한 유해 사례 (SAE)의 발생
UB-421의 하기 효능 파라미터를 연구 기간 (V2 내지 V12) 동안 각각의 연구 코호트에 대해 평가하였다:
1. 개별적 최대 바이러스 로드 감소
2. 평균 최대 바이러스 로드 감소
5.2 2차 바이러스학적 종점
하기 바이러스학적 반응을 연구 기간 (V2 내지 V12) 동안 평가하였다:
1. 각각의 연구 코호트 내의 및 간의 하위군에 의한 개별적 최대 바이러스 로드 감소 및 평균 최대 바이러스 로드 감소.
2. 바이러스 로드 < 50 카피/mL를 갖는 대상체의 비율;
3. 바이러스 로드 < 200 카피/mL를 갖는 대상체의 비율;
4. 바이러스 로드 감소 > 0.5 log10 카피/mL를 갖는 대상체의 비율;
5. 바이러스 로드 감소 > 1 log10 카피/mL를 갖는 대상체의 비율;
6. 코호트 1에 대해 및 코호트 2에 대해 각각 최종 완결된 연구 약물 투여 후 7일 및 14일까지의 바이러스 반동 (최하점으로부터 바이러스 로드의 0.5 log10 초과 증가)을 갖는 대상체의 비율;
7. 항-UB-421 항체의 혈청 농도 (UB-421의 면역원성);
8. CD4+ 및 CD8+ T 세포 카운트의 변화;
9. UB-421의 약동학 파라미터 (Cmax, AUC(0→∞) 및 AUC(0→최종)).
6. 분석 집단:
치료 의도 (ITT) 집단: 연구 약물의 적어도 1회 투여를 받은 29명의 대상체. 코호트 1 및 코호트 2에 대한 ITT 집단은 각각 14명의 대상체 및 15명의 대상체였다.
프로토콜 기반 (PP) 집단: 유효한 기준선 및 적어도 1회의 유효한 치료후 효능 측정 (HIV-1 바이러스 로드 시험)을 갖고, 주요 프로토콜 위반이 없는 연구 약물의 모든 투여를 받은 18명의 대상체. 코호트 1 및 코호트 2에 대한 PP 집단은 각각 7명의 대상체 및 11명의 대상체였다.
안전성 및 면역원성 집단: 치료 의도 집단에 포함된 29명의 대상체.
약동학 집단: 안전성 및 면역원성 집단 내의 하위집합 집단에 기초하였음.
기준선 데이터 및 안전성 종점을 안전성 및 면역원성 집단에 대해 분석한 반면, 효능 분석은 ITT 및 PP 집단 둘 다에 대해 수행하였다. 약동학 분석은 약동학 집단에 대해 수행하였다.
7. 연구 기간의 지속기간
스크리닝 기간: < 4주
치료 기간: 8주
추적 기간: 치료 기간의 종료 후 8주
방문 0은 초기 스크리닝을 나타내었고, 연구 동안의 각각의 방문은 1주 기간을 나타낸다. 추적 기간은 일반적으로 매주 간격으로 수행되었다.
8. 결과의 요약:
8.1 연구 집단.
총 33명의 무증상 HIV 감염된 성인을 타이완에 있는 2개의 연구 사이트에서 스크리닝하였다. 그들 중에서, 29명의 대상체는 스크리닝 기준을 통과하였으며, 시험을 위해 선택되었다. 모든 29명의 적격성 대상체는 남성이었다.
8.2 안전성 및 내약성 결과:
모든 29명의 대상체는 연구 동안 적어도 1건의 AE, 합계 128건의 AE를 경험하였다. 이들 중에서, 114건 (모든 29명의 대상체에서 89.06%)은 치료-응급성 유해 사례 (TEAE)였으며, 14건 (5명의 대상체에서 10.94%)은 치료전 AE였다. 29명의 대상체에서는 심각한 유해 사례 (SAE)가 관찰되지 않았다. 모든 치료전 AE는 UB-421과 비관련되었으며, 이들 사례 중 어느 것도 SAE로 간주되지 않았다. 대부분 (78.95%)의 TEAE는 경도로 보고되었으며, 17.54%는 중등도이고, 3.51% (1명의 대상체에서)는 중증이었다.
가장 빈번히 관찰된 (>10%) TEAE는 피부 발진 및 두드러기였다. 기타 유해 사례인 혈액학의 이상 (22명의 대상체에서 154건의 사례) 및 생화학 (6명의 대상체에서 32건의 사례) 실험실 시험 결과가 22명의 대상체에서 관찰되었다. 그러나, 대부분의 변화는 사소하였으며, 임상적으로 유의하지 않았다. 신체 검사 결과 및 활력 징후는 연구 기간 동안 대부분 정상이거나 비-임상적으로 유의하였다.
UB-421은 연구 기간 동안 내약성이 양호하였고 임상 시험 프로토콜에 의해 특정된 바로 전체적 치료 내약성이 8-주 치료 기간 동안 73.84%이었다.
8.3 약역학
8.3.1 CD4+ T 및 CD8+ T 세포 카운트. 8-주 치료 기간 및 8-주 추적 기간 후에, 평균 CD4+ T 세포 카운트는 기준선으로부터 55.10 ± 117.97개 세포/mm3만큼 약간 감소한 반면, 평균 CD8+ T 세포 카운트는 기준선으로부터 193.31 ± 459.34개 세포/mm3만큼 증가하였다. 코호트 1에서의 대상체에 대한 대표적인 CD4+ T 세포 카운트 및 평균 CD4 T 세포 카운트를 도 9a 상부 패널에 나타낸다. 코호트 2에서의 대상체에 대한 대표적인 CD4+ T 세포 카운트 및 평균 CD4 T 세포 카운트를 도 9a 하부 패널에 나타낸다.
8.3.2 UB-421로의 CD4 수용체의 코팅. CD4 수용체 코팅의 정도를 유동 세포측정법에 의해 형광-접합된 UB-421로 검출하였다. 4명의 대표적인 대상체, 즉, 코호트 1로부터 2명의 환자 및 코호트 2로부터 2명의 환자로부터 수득된 결과를 각각 도 8a - 8b 및 도 8c - 8d에 나타낸다. 검정의 감수성은 0.15 μg/mL이다. 10 mg/kg 매주 또는 25 mg/kg 격주의 반복된 투약 시 UB-421의 임상 효능은 단독요법으로서 사용된 경우 >10 μg/mL의 UB-421 혈청 수준의 존재 하에서 비-검출가능한 수준으로 저하된 바이러스 감소를 밝혀내었다. PBMC CD4+ 세포가 완전히 코팅되는 (즉 % dB4C7-알렉사 결합이 0에 접근하는) 한, 바이러스 반동은 없다.
UB-421로의 PBMC 상의 CD4 수용체의 완전한 코팅은 둘 다의 투여량 수준의 UB-421의 2 내지 3회 투여 후에 달성되었다. 또한, UB-421로의 CD4+ T 세포의 완전한 코팅은 전체 치료 기간 전반에 걸쳐 유지되었다 (도 8a - 8d). 대부분의 대상체에서, 형광 dB4C7 mAb (dB4C7-알렉사)의 결합에 의해 결정된 바와 같이, CD4 수용체에의 UB-421 결합은 감소하였으며, 최종 UB-421 주입의 3주 내에 기준선 값으로 복귀하였다.
연구 동안 대상체의 혈청에 존재하는 UB-421의 농도를 평가하여 완전한 CD4 코팅 및 HIV-1 바이러스 억제를 달성하는 데 충분한 UB-421의 혈청 농도를 측정하였다. 수득된 데이터에 기초하면, UB-421의 혈청 농도가 10 μg/mL 초과로 유지된 한, UB-421에 의한 CD4+ T 세포의 일정한 완전한 코팅 및 HIV-1 바이러스 억제가 달성되었다 (도 8a - 8d).
8.4 약동학:
코호트 1에서 관찰된 평균 AUC는 17300 ± 10000 μg x hr/mL (방문 1 내지 2)로부터 23900 ± 10700 μg x hr/mL (방문 8 내지 9)로 증가한 후, 방문 11 내지 12에서 기준선으로 복귀하였다. 코호트 1에서 관찰된 평균 AUC(0→최종)는 171000 ± 70300 μg x hr/mL이었다.
코호트 2에서 관찰된 평균 AUC는 56500 ± 19500 μg x hr/mL (방문 1 내지 3)로부터 61100 ± 20700 μg x hr/mL (방문 7 내지 9)로 증가한 후, 방문 11 내지 12에서 기준선으로 복귀하였다. 코호트 2에서 관찰된 평균 AUC(0→최종)은 239000 ± 73900 μg x hr/mL이었다.
이들 데이터는 AUC(0→최종)에 의해 평가된 바로 평균 혈청 약물 농도가 10 mg/kg 매주 UB-421 주입을 받은 대상체 (코호트 1, 171000 ± 70300 μg x hr/mL)에 비해 25 mg/kg 격주 UB-421 주입이 투여된 대상체 (코호트 2, 239000 ± 73900 μg x hr/mL) 중에서 더 높았음을 입증한다.
8.5 효능 결과:
스물 아홉 (29)명의 HIV-1 감염된 대상체가 이 연구에서 모집되었으며, UB-421의 적어도 1회의 용량을 받았다 (ITT 집단). 모집된 스물 아홉 (29)명의 대상체 중, 총 열 여덟 (18)명의 대상체가 8-주 치료 기간을 완결하여 모두 연구 약물의 투여를 받았다 (PP 집단). UB-421의 다중-투여의 효능을, 연구 동안 등록된 무증상 HIV-1 감염된 대상체의 개별적 및 평균 최대 바이러스 로드 감소를 평가함으로써 평가하였으며, 코호트 1 및 2에 대한 ITT 및 PP 집단에 대한 결과를 표 7에 요약한다.
평균 최대 바이러스 로드 감소는 ITT에서도 PP 집단에서도 2가지 투여량 수준 사이에 유의하게 상이하지 않은 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, 바이러스 로드는 ITT 집단에서 코호트 1에서 2.27 ± 0.60 log10 카피/mL 및 코호트 2에서 2.45 ± 0.46 log10 카피/mL만큼 감소되었다. PP 집단에서, 바이러스 로드는 코호트 1에서 2.73 ± 0.34 log10 카피/mL 및 코호트 2에서 2.47 ± 0.45 log10 카피/mL만큼 감소되었다.
치료 기간 동안, ≥ 0.5 log10 카피/mL의 바이러스 로드 감소가 모든 (n=29, 100.00%) 연구 대상체에서 관찰되었으며; ≥ 1 log10 카피/mL의 바이러스 로드 감소가 또한 모든 (n=29, 100.00%) 연구 대상체에서 관찰되었다.
치료 기간 동안 수득된 데이터의 추가의 평가는 하기를 밝혀내었다:
코호트 1에서, ITT에서 대상체의 8/14 (57.14%) 및 PP에서 대상체의 5/7 (71.43%)은 바이러스 로드 ≤ 200 카피/mL를 가졌으며; 더욱이, ITT에서 대상체의 3/14 (21.43%) 및 PP에서 대상체의 3/7 (42.86%)은 바이러스 로드 < 50 카피/mL를 가졌다.
코호트 2에서, ITT에서 대상체의 10/15 (66.67%) 및 PP에서 대상체의 7/11 (63.64%)은 바이러스 로드 ≤ 200 카피/mL를 가졌으며; ITT에서 대상체의 3/15 (20.00%) 및 PP에서 대상체의 2/11 (18.18%)는 바이러스 로드 < 50 카피/mL를 가졌다.
코호트 1 및 2에서의 대상체로부터의 대표적인 바이러스 로드 감소 데이터를 표 7 및 도 9a에 나타낸다. 각각의 코호트 내, 코호트 간, 또는 각각의 코호트 내의 하위-집단 간에 바이러스 로드 감소를 갖는 대상체의 비율의 통계적으로 유의한 차이는 없었다. 게다가, 바이러스 로드는 8-주 치료 기간 동안 코호트 1 및 2에서 각각 대상체의 42.9% 및 18.2%에서 현재 검정 검출 한계 (20 카피/mL) 미만의 수준으로 감소되었다. 모든 대상체에서, 바이러스 로드 감소는 CD4+ T 세포가 UB-421에 의해 완전히 코팅되는 동안 지속되었다. 바이러스 로드는 추적 기간의 종료에 의해 둘 다의 코호트에서 기준선 수준으로 복귀하였다. 또한, 바이러스 반동은 치료 기간 동안 임의의 연구 대상체에서 관찰되지 않았다. 정량가능한 항-UB-421 항체는 치료 기간 전반에 걸쳐 둘 다의 코호트에서의 환자로부터 검출되지 않았다.
8.6 UB-421과 TMB-355의 비교:
UB-421에 대해 이 연구에서 수득된 결과를 다른 이들 (Jacobson, J.L., et al., 2009; Toma, J., et al., 2011; 및 Pace, C.S., et al., 2013)에 의해 수행된 TMB-355 (이발리주맙, 이전 TNX-355)에 대한 유사한 연구에서 수득된 결과에 대해 평가하였다. 도 10a는 CD4+ 세포의 완전한 코팅에 의한, UB-421의 존재 하에서 바이러스 로드 반동 없이 >3 Log10까지의 우월한 바이러스 로드 감소를 나타낸다. 대조적으로, TMB-355로 치료를 받는 환자는 심지어 CD4+ 세포의 완전한 코팅의 존재 하에서도 치료로부터 단지 1주 후에 바이러스 반동을 마주쳤으며, 이는 내성 바이러스 돌연변이체의 발생을 나타낸다 (도 10b).
이들 2가지 치료 처방의 비교는, 도면에 예시된 바와 같이, UB-421을 사용한 HIV 감염된 대상체의 치료가 TMB-355 치료에 비해 뚜렷한 이점을 가짐을 입증한다. 구체적으로, UB-421은 치료 기간 전반에 걸쳐 및 심지어 추적 기간 1 또는 2주에도 >3 log10의 최대 바이러스 로드 감소를 갖고 HIV 바이러스 로드의 계속적인 감소를 제공한다. 대조적으로, TMB-355는 제1 투여로 단지 일시적인 바이러스 로드 감소 및 대략 1 log10의 최대 바이러스 로드 감소를 제공하였다.
또한, TMB-355를 사용한 사전 연구는 혈청 TMB-355 및 CD4 양성 T 세포의 완전한 코팅의 존재에도 불구하고, 치료 1주 후에 HIV 바이러스 반동이 일어났음을 밝혀내었다 (Jacobson, J.L., et al., 2009). 이 결과는 TMB-355 (이발리주맙)에 의해 매개된 바와 같은 비-경쟁적 진입 억제 메커니즘이 항체 치료 기간 동안 내성 HIV 돌연변이체의 발생에 대한 높은 가능성을 제공할 것이라는 상기 실시예 4에서의 초기 예측과 일치한다. 사실, 바이러스 내성 돌연변이체는 바이러스 로드 감소를 위한 TMB-355 치료를 받는 환자로부터 gp120의 V5 영역에서 확인된 돌연변이 (Toma, J., et al., 2011; Pace, C.S., et al., 2013)와 함께 발견되었다.
CD3+, CD3+/CD4+, vs CD3+/CD8+ 세포를 초항원 SEB, CMV 펩티드 pp65, 또는 컨센서스 B 서열을 갖는 HIV gag 펩티드 (HIV Gag 모티프 펩티드)를 포함한 다양한 항원에 의해 자극한 경우, 이들 세포 집단의 증식 반응에 대해 몇몇 매우 흥미로운 관찰이 존재하였다.
도 9b에 제시된 바와 같이, 초항원 SEB (상부 패널) 또는 CMVpp65 펩티드 (하부 패널)의 경우 치료 과정 전 (W1), 종료시 (W8) 또는 2개월 후 (W16) 둘 다의 집단에 의한 자극 반응에 대해 CD3 또는 CD3/CD4+ 세포에 의한 어떠한 차이도 관찰되지 않았다.
UB421을 제공받은 환자로부터의 PBMC를 자극하기 위해 HIV Gag 모티프 펩티드를 사용한 경우 치료 과정 전 (W1), 종료시 (W8) 또는 2개월 후 (W16) 매우 흥미로운 점이 관찰되었다 (도 11). 추가 분석 시 W1 내지 W8에서 CD3/CD8+ 집단으로 인한 유의한 증식성 CD3+ 증식 반응이 발견되었다 (P<0.01). UB421을 제공받은 후 HIV Gag 모티프 펩티드에 의한 자극 시 HIV 환자에서 CD3/CD8+ 집단의 이러한 유의한 증가는, 이들 환자에서 HIV 감염된 T 세포를 더 잘 모니터링하게 할 수 있는 이들 환자에서의 개선된 HIV 특이적 CTL 반응을 나타내어, 비진행자인 환자를 보다 더 닮았다는 중요한 임상적 의미를 제공할 수 있다.
9. 결론
무증상 HIV-1 감염된 대상체에서의 UB-421로의 8-주 치료는 내약성이 양호하였다. 또한, 코호트 1 (상부 패널) 및 2 (하부 패널) 둘 다로부터의 평균 CD4 T 세포 카운트 (도 9a)는 각각 모니터링된 2-개월 기간 전반에 걸쳐 안정하게 남아 있었다.
보다 중요하게는, UB-421로의 치료는 모든 대상체에서 유의한 바이러스 로드 감소를 발생시켰다 (치료된 대상체의 100%가 ≥1 log10 카피/mL의 최대 감소를 갖고 반응하였다. 둘 다의 처방, 즉, 10 mg/kg 매주 (코호트 1) 및 25 mg/kg 격주 (코호트 2) 주입은 바이러스 로드 감소에서 유사한 효능을 나타내었다. ITT 집단에서의 평균 최대 바이러스 감소는 코호트 1에서 2.27 ± 0.60 log10 카피/mL 및 코호트 2에서 2.45 ± 0.46 log10 카피/mL에 도달하였다). UB-421로의 관찰된 바이러스 감소 효능은 지금까지 시험된 임의의 다른 소분자 항 HIV 약물보다 우월하다.
이 주의깊게 실시된 UB-421의 다중-용량 IIa상 시험으로부터의 임상 시험 결과는 치료 기간 동안 바이러스 반동 없이 단독요법으로서 높은 내약성, 안전성, 및 바이러스 로드 감소의 전례없는 효능을 입증하였다. 이 연구에서 수득된 결과는 예상외의 것이며, CD4의 도메인 1에 결합하는 항-CD4 모노클로날 항체가 주조직적합성 복합체 부류 II-매개된 면역 기능의 방해 때문에 면역억제성일 것이며, 이러한 요법은 HIV 질환의 치료에 부적합할 것 (Jacobson, J.L., et al., 2009)이라는 관련 기술분야에서 오랫동안 지속된 의심을 반박한다. 이들 결과는 직교의 HAART 및/또는 다른 HIV 저장소 활성화 제제, 예컨대 HDACi와 조합으로 UB-421을 사용한 HIV 요법의 추가의 양식이 HIV 감염에 대한 기능적 치유를 달성할 수 있었음을 추가로 시사한다.
실시예 9
HIV-1 감염된 성인에서 항레트로바이러스 요법에 대한 대안으로서 UB-421 단독요법을 사용한 치료 양식
도 12는 항레트로바이러스에 대한 대안으로서 UB-421 단독요법을 사용한 HAART 안정화된 환자에 대한 치료 양식을 예시한다. 상세한 목적 및 프로토콜을 하기 기재한다.
1. 적용된 환자 집단
안정한 고도 활성 항레트로바이러스 요법 (HAART)에 의해 바이러스 억제를 갖는 HIV-1에 대해 혈청양성인 대상체는 이러한 치료에 적격일 것이다.
적격성 환자는 IV, IM 또는 SC 경로 중 어느 하나를 통해 4개월의 초기 기간 동안 투여된 UB-421을 받고, 그 후 HAART 치료의 또 다른 주기가 이어질 것이다. "HAART-UB-421" 교대 치료 주기는 바이러스 반동이 UB-421 및 HAART 요법 둘 다의 철회 시 더 이상 관찰되지 않을 때까지 수 회 반복될 수 있으며, 그에 의해 HIV 감염에 대한 기능적 치유가 발생한다.
보다 구체적으로, 도 12에 제시된 바와 같이, 이들 대상체에게 2가지 용량 수준, 즉, 10 mg/kg 매주 또는 25 mg/kg 격주 중 하나의 연구 약물 (UB-421)의 다중 정맥내 주입을, 각각 8-주 및 16-주 치료 기간 동안 제공하였다. HAART 처방은 제1 UB-421 주입 전날에 철회하였다. UB-421 투여 전에, 대상체에게 주입 반응을 예방하기 위해, 주요 조사자에 의해 판단된 바와 같이 스테로이드 및 항-히스타민 약물을 포함한 예방 의약 (사전-의약)을 제공하였다. 최종 일정화된 UB-421 투여를 완결한 후, 모든 대상체에서 동일한 날에 그의 원래 또는 다른 적절한 바이러스-감수성 항레트로바이러스 요법을 재시작하였다. HAART 처방의 사용은 주요 조사자가 판단하였다. 모든 환자로부터의 바이러스 로드 및 CD4 및 CD8 세포 카운트는 치료 기간 및 치료 기간 종료 후 2개월 동안 모니터링하였다.
2. 포함 기준
대상체는 하기 기준 모두를 충족시킬 경우 이 치료 양식에 포함시켰다:
1. HIV-1 혈청양성;
2. 20세 이상;
3. 적어도 2년 동안, 적어도 2종의 뉴클레오시드/뉴클레오티드 역전사효소 억제제 (NRTI) 플러스 비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제 (NNRTI), 인테그라제 억제제, 또는 프로테아제 억제제로서 정의된 HAART 치료를 받았음; 치료는 계속 진행중이며, 연구의 진입 전 1년 내에 약물의 변화가 없음;
4. 스크리닝 방문 전 1년 내에 CD4+ T 세포 카운트 ≥ 500개 세포/mm3 또는 CD4 백분율 ≥ 28%의 2가지 측정을 가짐;
5. 스크리닝 방문 전 4주 내 또는 스크리닝 방문에서 수득된 CD4+ T 세포 카운트 ≥ 500개 세포/mm3을 가짐;
6. HIV-1 혈장 RNA가 1년 당 적어도 2회의 바이러스 로드 측정치로, 스크리닝 방문 전 적어도 1년 동안 비검출가능하게 남아 있다. 바이러스 로드는 또한 스크리닝 방문 전 4주 내에 또는 스크리닝 방문에서 비검출가능하며; 스크리닝 방문 전 4주 전에 검출가능한 HIV 혈장 RNA의 단일 에피소드는 참가를 배제하지 않을 것이다.
3. 배제 기준
대상체는 하기 이유 중 임의의 것으로 인해 치료 양식으로부터 배제하였다:
1. 즉각 요법을 요구하는 임의의 활성 감염 (HIV 제외);
2. 미국 질환 통제 예방 센터 (CDC) HIV 감염에 대한 분류 체계에 따른 카테고리 B 및 카테고리 C 상태에 따른 임의의 이전에 진단된 또는 활성 AIDS-정의 질병;
3. 체중 > 80 kg;
4. 스크리닝 전 12주 내에 임의의 문서화된 CD4+ T 세포 카운트 < 250개 세포/mm3 또는 CD4+ T 세포 백분율 ≤ 14%;
5. UB-421의 I상 또는 IIa상 시험 중 어느 하나에서 이전에 등록되거나, 항-UB-421 항체의 존재의 임의의 내력;
6. 연구 약물 UB-421의 최초 용량 전 12주 내에 모노클로날 항체에의 임의의 이전 노출;
7. 임의의 유의한 질환 (HIV-1 감염 이외) 또는 조사자의 의견으로, 대상체가 이 연구에 참가하지 못하게 할, 스크리닝, 병력 및/또는 신체 검사로부터 측정된 정신적 및 행동적 문제를 포함한 임상적으로 유의한 발견;
8. 연구 약물의 최초 용량 전 8주 내에 임의의 백신화;
9. 연구 약물의 최초 용량 전 12주 내에 임의의 면역조정 요법 (인터페론 포함), 전신적 화학요법;
10. 12개월 미만의 기대 여명;
11. 연구 약물의 최초 용량 전 12주 내에 임의의 불법 정맥내 약물;
12. 바이러스학적 실패, 및 사전 비-호지킨 림프종 또는 카포시 육종으로 인한 1회 초과의 HAART 처방의 변화;
13. 조사자의 의견으로, 투약 및 방문 일정 및 프로토콜 평가에 순응하는 대상체의 능력을 방해할 임의의 현재 알콜 또는 불법 약물 사용.
4. 약물 생성물
약물 생성물 UB-421 (dB4C7 mAb)을 10 mg/mL (10 mL 바이알 중 100 mg)의 농도로 공급하였다. 대상체에게 10 mg/kg UB-421의 8회의 매주 용량 또는 25 mg/kg UB-421의 8회의 격주 용량을 정맥내 주입에 의해 제공하였다.
UB-421의 적절한 부피는 특정된 용량 및 대상체의 체중에 기초하였다. 코호트 내의 각각의 개별 대상체가 약물의 등가의 주입 부피로 주입되도록 각각의 개별적 용량의 부피는 멸균 염수를 사용하여 조정하였다. 총 주입 부피는 10 mg/kg 용량 코호트에 대해 대략 100 mL 및 25 mg/kg 용량 코호트에 대해 200 mL이었다. 각각의 투여에 대한 주입 시간은 대략 1 내지 2시간이었다.
5. 결과
5.1 연구 집단.
총 29명의 HAART 안정화된 HIV 환자를 타이완에 있는 2개의 연구 사이트에서 스크리닝하였다. 그들 중에서, 29명의 대상체는 스크리닝 기준을 통과하였으며, 시험을 위해 선택되었다. 모든 29명의 적격 대상체는 남성이었다.
5.2 안전성 및 내약성 결과:
모든 29명의 대상체는 연구 동안 적어도 1건의 AE를 경험하였다. 모든 치료전 AE는 UB-421과 비관련되었으며, 이들 사례 중 어느 것도 SAE로 간주되지 않았다. 보고된 대부분의 TEAE는 경도였다. 가장 빈번하게 관찰된 TEAE는 피부 발진 및 두드러기였다. 신체 검사 결과 및 활력 징후는 연구 기간 동안 대부분 정상이거나 비-임상적으로 유의하였다.
UB-421은, 임상 시험 프로토콜에 의해 명시된 바와 같이 8-주 또는 16-주 치료 기간 동안 전체 치료 내약성으로, 연구 기간 동안 내약성이 양호하였다.
5.3 약역학
5.3.1 CD4+ T 및 CD8+ T 세포 카운트. 8-주 (코호트 1) 및 16-주 (코호트 2) 치료 기간 및 8-주 추적 기간 (V12) 후에, 평균 CD4+ T 세포 카운트는 도 13에 제시된 바와 같이 어떠한 유의한 차이 없이 기준선 (V1)으로부터 치료 및 모니터링 기간 (V12) 후 거의 동일하게 유지된 반면에 (코호트 1의 경우 P=0.331 및 코호트 2의 경우 P=0.905), 평균 CD8+ T 세포 카운트는 도 14에 제시된 바와 같이 코호트1 (P<0.001) 및 코호트 2 (P<0.004) 둘 다의 경우 기준선 (V1)으로부터 치료 및 모니터링 기간 (V12) 후 유의하게 증가하였다. UB421 치료 후 HAART 안정화된 환자에서 관찰된 CD8+ 세포에서의 유의한 증가는 또한 실시예 7, 도 9a 하부 패널, UB421 치료를 받은 환자의 중요한 특징에 제시된 바와 같이, UB421을 제공받은 치료 나이브 환자에서도 또한 관찰되었다.
5.3.2 UB-421에 의한 CD4 수용체의 코팅. CD4 수용체 코팅의 정도를 유동 세포측정법에 의해 형광-접합된 UB-421로 검출하였다. 코호트 1 및 코호트 2로부터의 환자에 대해 수득한 결과를 각각 도 15a 및 15b에 제시한다. CD4 수용체의 완전한 코팅이 코호트 1 및 코호트 2에 대해 각각 63 및 112일 동안 관찰되었다. 10 mg/kg 매주 또는 25 mg/kg 격주로의 반복 투여 시 UB-421의 임상 효능은 치료 및 완전 CD4 수용체 코팅 기간 내내 및 또한 환자를 그의 원래의 HAART 치료 프로토콜로 되돌렸을 때 치료 후 기간 동안 (코호트 1의 경우 제63일에서 제112일까지 및 코호트 2의 경우 제112일에서 제168일까지) 모든 (100%) 환자에서 바이러스 로드의 비-검출가능한 수준으로의 완전한 억제를 밝혀내었다. 치료 기간 동안 PBMC CD4+ 세포가 완전히 코팅된 한 (즉 % dB4C7-알렉사 결합이 0에 접근) 어떠한 바이러스 반동도 없었다.
UB-421에 의한 PBMC 상의 CD4 수용체의 완전한 코팅은 UB-421의 둘 다의 투여량 수준으로의 오직 1회 투여 후에 달성되었다. 추가적으로, UB-421에 의한 CD4+ T 세포의 완전한 코팅은 전체 치료 기간 내내 유지되었다 (도 15). 대부분의 대상체에서, 형광 dB4C7 mAb (dB4C7-알렉사)의 결합에 의해 결정된 바와 같이, CD4 수용체에 대한 UB-421 결합은 감소하였으며, 최종 UB-421 주입의 3주 내에 기준선 값으로 복귀하였다.
연구 동안 대상체의 혈청에 존재하는 UB-421의 농도를 평가하여 완전한 CD4 코팅 및 HIV-1 바이러스 억제를 달성하는 데 충분한 UB-421의 혈청 농도를 결정하였다. 수득된 데이터에 기초하면, UB-421의 혈청 농도가 10 μg/mL 초과로 유지되는 한, UB-421에 의한 CD4+ T 세포의 일정한 완전한 코팅 및 HIV-1 바이러스 억제가 달성되었다.
5.3.3 조절 T 세포의 정량화. 이전에 억제자 T 세포로 공지된 조절 T 세포 (Treg)는 면역계를 조정하고, 자기-항원에 대한 내성을 유지하고, 자가면역 질환을 막는 T 세포의 하위집단이다. Treg는 면역억제성이고, 일반적으로 이펙터 T 세포의 유도 및 증식을 억제하거나 하향조절한다. Treg는 바이오마커 CD4, FOXP3, 및 CD25를 발현하고, 나이브 CD4 세포와 동일한 계통으로부터 유래되는 것으로 생각된다. (웹사이트: en.wikipedia.org/wiki/Regulatory_T_cell). 따라서 본 발명자들은 %Treg (CD3/CD4 양성 세포 중)를 UB421의 면역조정 능력을 평가하기 위한 바이오마커로서 포함시켰다. 조절 T 세포의 정량화에 대한 절차를 하기 기재한다.
EDTA 바큐테이너에 수집한 혈액을 실온에서 10분 동안 용해 완충제로 용혈시킨 다음, 스테인 완충제로 1회 세척하였다. 세포를 표면 마커 염색을 위해 항-CD4(D2)-FITC, 항-CD25-APC 및 항-CD45-PerCP를 포함한 다양한 항체로 빙상에서 30분 동안 염색하였다. 이어서 세포를 2회 세척하고, 항-FoxP3-PE (비디 바이오사이언시스)에 대해 제조업체의 지침에 따라 염색하였다. 이어서 세포를 2회 세척하고, 고정 완충제로 고정시켰다. 샘플을 FACS벌스 유동 세포측정기에 획득하였다. 데이터 분석은 플로우조 소프트웨어 V10.0.8. (6)을 사용하여 수행하였다.
도 17에 제시된 바와 같이, V1 후 치료 기간 동안 (V2 내지 V8) Treg 세포의 %에서의 감소 수준은 평균 V1의 대략 절반이었다 (코호트 1 및 코호트 2에서 각각 44.4-59.6% 및 52.4-65.3%). 치료 기간 후, Treg 세포%의 수준은 V11에서 기준선 초과로 반동하였고 (코호트 1에서 120.5%, 한편 코호트 2에서 120.1%), 평균 V12에서 기준선으로 복귀하였다 (코호트 1에서 110.5%, 한편 코호트 2에서 110.2%).
5.3.4 HIV-1 프로바이러스 DNA의 정량화. HIV-1 프로바이러스 DNA는 치료된 환자에서 HIV 감염된 바이러스 저장소 함량을 모니터링하기 위한 또 다른 바이오마커를 제공할 수 있다. 본 발명자들은 따라서 하기 기재된 바와 같이 HIV-1 프로바이러스 DNA의 정량화를 위한 검정을 확립하여 HAART 치료 후 안정화된 상태에 도달한 UB421을 제공받은 환자에 대한 이러한 모니터링을 수행하였다.
5.3.5 세포 단리 및 DNA 추출. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 환자의 혈액 샘플의 표준 피콜-하이팩 밀도 구배 원심분리에 의해 단리하였다. 세포 DNA를 정제된 PBMC로부터 ZR-듀엣(ZR-Duet) DNA/RNA 미니프렙 플러스 키트 (지모 리서치(Zymo Research))로 추출하고, 사용시까지 -80℃에서 저장하였다. 각각의 샘플의 PBMC의 수를 DNA 추출 전에 카운팅하였다.
5.3.6 HIV-1 프로바이러스 DNA의 정량화. 세미-네스티드 실시간 PCR의 프라이머 및 프로브 서열 및 PCR 절차를 하기 제시된 바와 같이 변형하였다. 간략하게, 정제된 DNA 및 표준 플라스미드를 HIV-1 gag 모티프를 갖는 보존된 영역을 증폭시키는 PCR의 2 라운드에 직접 적용하였다. 추출된 DNA를 먼저 각각의 프라이머, GAG1 및 SK431 0.2 μM을 사용하여 25 μl 반응물 중 앰플리택 골드(AmpliTaq Gold) (어플라이드 바이오시스템(Applied BioSystem))에 의해, 심플리앰프 써멀 사이클러(SimpliAmp Thermal Cycler) (어플라이드 바이오시스템즈) 상에서 10 주기 동안 증폭시켰다. 제1 PCR의 생성물을 후속적으로 택맨 검출 화학을 사용하는 실시간 PCR 기계 상에서 제2 정량화 PCR 증폭의 주형으로서 사용하였다. 제1 PCR의 생성물 2 μl를 제2 PCR에서 사용하여, 각각의 프라이머, GAG1 및 GAG2 0.2 μM을 사용하여 20 μl 반응물 중 택맨 패스트 어드밴스드 마스터 믹스(TaqMan Fast Advanced Master Mix) (어플라이드 바이오시스템)에 의해 증폭시키고, 제2 PCR의 생성물을 퀀트스튜디오 5(QuantStudio 5) 실시간 PCR 시스템 (어플라이드 바이오시스템) 상에서 이중-표지된 형광 프로브, GAG3 0.2 μM에 의해 검출하였다. HIV-1 gag 캡시드 영역을 함유하는 플라스미드에 의해 5 x 106개 내지 4 x 101개 카피의 표준 곡선이 생성되었다.
알부민 유전자의 정량화 PCR에 의해 세포 수를 결정하였다. 추출된 DNA를 각각의 프라이머, Alb-F 및 Alb-R 0.2 μM을 사용하여 20 μl 반응물 중 택맨 패스트 어드밴스드 마스터 믹스 (어플라이드 바이오시스템)에 의해 증폭시키고, 제2 PCR의 생성물을 퀀트스튜디오 5 실시간 PCR 시스템 (어플라이드 바이오시스템) 상에서 이중-표지된 형광 프로브, Alb-P 0.2 μM에 의해 검출하였다. 알부민을 함유하는 플라스미드에 의해 2.5 x 106개 내지 4 x 103개 카피의 표준 곡선이 생성되었다.
모든 샘플을 이중으로 실행하였다. 결과는 qPCR에 의해 정량화된 세포 수에 의해 정규화된, 백만개의 PBMC당 HIV 프로바이러스 DNA의 카피로서 표시되었다. 프라이머 및 프로브의 서열은 다음과 같다:
SK431 5'-TGCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTCT-3' (서열식별번호: 15),
GAG1 5'-TCAGCCCAGAAGTAATACCCATGT-3' (서열식별번호: 16),
GAG2 5'-CACTGTGTTTAGCATGGTGTTT-3' (서열식별번호: 17),
GAG3 5'-FAM-ATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGA-IBHQ-3' (서열식별번호: 18),
Alb-F 5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3' (서열식별번호: 19),
Alb-R 5'-ACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3' (서열식별번호: 20),
Alb-P 5'-FAM-GGAGAGATTTGTGTGGGCATG ACAGG-IBHQ-3' (서열식별번호: 21)
5.3.7 UB-421에 의한 세포 HIV DNA의 근절. UB-421 HAART 대체 요법 시험에서, DNA 추출 및 HIV 프로바이러스 DNA 정량화를 위해 PBMC를 수집하였다. 세포 HIV 프로바이러스 DNA 함량을 V1 (UB-421 치료 전), V8 (UB-421 치료의 종료) 및 V12 (추적의 종료)에서 측정하였다. HIV 프로바이러스 DNA 함량은 분석된 7명의 대상체에서 UB-421 치료 후 유의하게 감소되고, 이어서 환자를 그의 원래의 HAART 치료로 되돌린 후 최종 UB-421 투여 후 9주까지 (V12) 유사한 수준에서 유지되는 것으로 관찰되었다 (도 18). 이러한 결과는 UB-421 치료가 HAART 치료되고 안정화된 환자에서 통합된 세포 HIV 프로바이러스 DNA 및 비통합된 세포 HIV 프로바이러스 DNA 둘 다를 추가로 감소시킬 수 있다는 것을 나타내며, UB421 치료의 결과로서 HIV 바이러스 저장소 세포의 감소의 잠재력을 나타낸다. 이는 강력한 HIV 진입 억제제로서 그의 중요한 역할을 넘어, UB421과 연관된 또 다른 유의한 특색을 나타낸다.
5.4 효능 결과:
바이러스 반동은 mL 혈청 또는 혈장당 400개 HIV-1 RNA 카피 초과의 바이러스 로드의 2회 초과의 연속 검출로서 정의된다. 개별 환자에 대해 도 16에 제시된 바와 같이, HAART 치료 동안 때때로 HAART 안정화된 환자에 대해 거의 동일한 빈도로 검출된 소수의 일시적 현상을 제외하고, 400개 RNA 카피/mL (파선) 미만의 완전한 바이러스 억제가 치료 기간 내내 및 그를 넘어 유지되었다. 이는 HAART에 대한 대체로서 UB421 치료의 100% 효능을 나타낸다.
UB421에 의한 최대 16주 (코호트 2) 치료 동안 100% 바이러스 억제를 유지하는 능력은, 모든 (9명 중 9명) 환자 (100%)가 11일에서 86일까지의 치료 기간 동안 이러한 억제를 유지하는데 실패한 경우 광범위 중화 항-gp120 모노클로날 항체 VRC01 (NIH 백신 리서치 센터 VRC01)을 사용하여 NIH에 의해 수행된 유사한 HAART 대체 시험과 비교할 경우 유례없는 것이다 (도 19). 이는 심지어, 바이러스 억제 %를 종점 파라미터로 사용 시 도 20에 제시된 바와 같이 HIV-1 약물 중에서 지금까지 시험된 모든 단독요법 치료와 비교할 경우 더 인상적이다.
도 20에 제시된 바와 같이, 시판 중인 HIV 약물에 대한 과거 데이터는 환자의 오직 50%만이 바이러스 억제 상태를 최대 4주 유지하였음을 나타낸다. VRC 01-유사 항 gp120 광범위 중화 항체는 이러한 단독요법을 제공받은 환자의 70%가 치료에서 최대 4주까지 바이러스 억제를 유지하였고 여기서 환자의 약 10%는 치료 시 최대 8주까지 바이러스 억제를 유지하였다는 점에서 HIV-1 약물에 대한 유의한 개선을 나타낸다. CCR5 진입 억제제로서 Pro140은, 진입 수용체로서 CCR5를 사용하지 않는 환자의 HIV-1로 인해 시험 진입을 위해 약 30% 환자를 제외시키는 불편에도 불구하고, 환자가 4주에 98% 바이러스 억제, 8주에 82% 억제 및 12주에 75% 억제를 유지하였다는 점에서 상기 언급된 2종을 넘는 추가의 개선을 제공한다. 단독요법으로서 UB421은 이러한 치환 시험에서 시험된 프로토콜 기반 치료의 최대 16주까지 100% 억제를 유지하였음을 입증하여 가장 인상적이다. 이러한 전례없는 임상 결과는 CD4 세포가 완전히 코팅되는 한 바이러스 진입 억제 (100%)의 최신 기술의 효능; 치료 동안 % T reg 세포의 감소 및 치료 동안 CD4 및 CD8 세포 둘 다의 환자에서의 회복 (예컨대 HIV gag 반응성 CD8 T 세포 증식의 증가)에 의해 예시되는 바와 같은 인상적인 면역조정 효과; - 및 UB421 치료 시 바이러스 저장소 세포의 감소를 나타내는 HIV DNA 함량의 감소를 나타내었다.
도 21은 UB421-유사 항-CD4 치료를 제공받을 때 HIV-1 환자에게 긍정적인 영향을 미치는 인자를 요약한 것이다. 예를 들어, 도 21은 UB-421-유사 항체에 의한 치료가: (1) 실시예 8 및 9에 입증된 바와 같이, 치료 시 및 치료 동안 T reg 세포의 %를 감소시키고, 치료 후 CD8+ 세포 카운트를 증가시키고, 치료 후 HIV gag 모티프 펩티드 자극에 반응하여 CD8+ 증식 세포를 증가시킴으로써 (이는 모두 그러한 HIV 감염된 CD4 세포에서 CTL 표적화를 매개하는 증진된 기능성 HIV 특이적 T 세포를 나타냄) HIV-항원 특이적 T 세포 활성을 회복시키고; (2) 특히 HIV 저장소 T 세포가 풍부화되고 이러한 세포가 빽빽하게 패킹된 조직 여포성 CD4 세포에서의 증진된 TNF-알파 생산에 의해 제시되는 바와 같이, T 세포 활성화를 증진시키고; (3) 강력한 진입 억제를 제공하여 CD4 양성 세포의 새로운 감염을 방지함으로써 세포-대-세포 및 무세포 감염을 방지한다는 것을 보여준다. 이들 3가지 메카니즘의 지지 하에, UB-421-유사 항체에 의한 치료는: (4) 측정된 혈액 세포에서의 HIV DNA 함량의 감소에 의해 입증되는 바와 같은 HIV T 세포 저장소의 감소를 발생시킨다. 도 21에 예시된 바와 같은 이들 4가지 메카니즘은 HIV 감염의 궁극적인 지속적 바이러스 완화, 또는 기능적 치유로 이어질 것이다.
실시예 10
TCR 신호전달 키나제, LCK의 인산화 및 활성화에 의해 검출되는 바와 같은, UB421에 의한 CD4+ 세포의 직접 활성화
TCR 근위 신호전달 분자이며 CD4 세포내 도메인에 직접 결합하는 것으로 공지되어 있는 Lck 키나제 인산화를 통한 CD4+ T 세포의 활성화에 대한 UB-421의 효과를 검사하였다. UB-421 및 양성 대조군으로서 다른 공지된 T 세포 자극자 (예를 들어 OKT3, 항-CD3)에 의한 자극 시 Lck 인산화의 정도를 웨스턴 블롯 및 유동 세포측정 분석에 의해 평가하였다.
T 세포의 신호 전달은 적절한 T 세포 활성화 및 억제를 보장하기 위해 엄격하게 조절된다. 단백질 인산화는 항원 인식 시 T 세포 수용체 신호전달 (TCR 신호전달)을 변환하고 증진시키기 위한 주요 방식이다. T 세포에서 특이적으로 발현되는 1종의 키나제, 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제 (Lck)는 초기 TCR 신호 전달 및 조정에서 중요하다. Lck는 보조-수용체 CD4 또는 CD8과의 회합을 통해 TCR 신호전달 복합체로 동원되고, CD3-제타(ζ) 쇄 및 제타-쇄-회합 단백질 키나제 70 (Zap70)의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 인산화하고, 이는 차례로 TCR 신호전달 캐스케이드의 다른 단백질을 인산화하여 T 세포 활성화를 초래한다.
Lck은 Src 티로신 키나제 패밀리에 속하고, 림프성 세포, 주로 NK 및 T 세포에서 독점적으로 발현된다. Src 키나제 패밀리의 활성은 2개의 티로신 인산화 부위에 의해 제어되는 것으로 공지되어 있고, 1개는 그의 키나제 활성을 증진시키고 (Lck의 경우 Y394) 1개는 억제한다 (Lck의 경우 Y505). Lck의 촉매 활성은 Y505 및 Y394의 인산화 상태를 제어하는 키나제 및 포스파타제에 의해 조절된다. CD4+ T 세포에서, Lck는 4가지 상이한 활성 상태, (1) 비인산화, (3) Y394 인산화, (3) Y505 인산화, 및 (4) 자극의 부재 하의 이중-인산화 상태로 존재한다. Y394는 자가인산화 부위이고, 단백질의 활성화와 연관된다. 카르복실 말단에 인접하여 위치하는 Y505는 Csk에 의해 인산화되고 CD45에 의해 탈인산화된다. Lck의 3차 구조는 Y505 인산화 동안 폴딩되며, 이는 부위 Y394의 인산화를 막는다. CD45가 Y505를 탈인산화할 경우, 티로신 Y394는 키나제 활성을 위해 Lck 상에서 자가-인산화된다.
T 세포 활성화 시, 활성 Lck는 즉시 면역학적 시냅스로 동원되고, 하류 분자를 인산화한다. TCR가 항원에 결합하고, 활성화되고, CD3 ζ 쇄 및 ZAP-70을 포함한 하류 분자를 인산화한 후, Lck는 (a) 포스파타제 PTPN22를 통한 Y394의 탈인산화 및 (b) 키나제, Csk를 통한 Y505의 재-인산화에 의해 신속하게 탈활성화된다. 자극 후 상이한 시점에서의 Y394의 탈인산화는 TCR 신호전달 캐스케이드를 통한 T 세포의 활성화를 나타낸다.
UB-421은 CD4 도메인 1 상의 CDR2 영역 근처의 입체형태적 에피토프에 결합하여 HIV-1 결합 및 세포 내로의 진입을 차단한다. CD4에의 결합 후 TCR 신호 전달 캐스케이드 및 면역 조절에 대한 UB-421의 효과를 웨스턴 블롯 및 유동 세포측정 분석에 의한 Lck의 Y394 및 Y505의 인산화의 정량화를 통해 연구하였다.
1 물질 및 방법
1.1 1차 CD4+ T 세포 제조
정상인 건강한 공여자로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 먼저 피콜-하이팩 (지이 헬스케어) 밀도 구배 원심분리에 의해 단리하였다. 이어서 정제된 PBMC로부터 CD4 T 세포 단리 키트 (밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec))에 의해 CD4+ T 세포를 음성 선택하였다.
1.2 포스포-Lck의 이뮤노블롯팅 분석
2백만 (2 x 106)개의 Jurkat T 세포 또는 1차 인간 T 세포를 RPMI로 2회 세척하였다. 모든 세포를 사전 가온된 RPMI 1 ml 중에서 mAb UB-421 또는 항-CD3 (OKT-3, 바이오레전드(BioLegend)) 5 μg/ml로 자극한 다음, "가교" 샘플을 위해 10 μg/ml 스트렙타비딘 (잭슨 이뮤노리서치)과 가교시키고, 37℃에서 표시된 시간 간격 동안 인큐베이션하였다. 차가운 PBS 1 ml를 첨가하여 자극을 정지시키고, 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 세포 펠릿을 즉시 동결시켜 용해시까지 -80℃에서 저장하였다.
동결된 세포 펠릿을 10 μg/ml 아프로티닌, 10 μg/ml 류펩틴, 1 mM PMSF, 1 mM 오르토바나듐산나트륨, 1 mM 피로인산나트륨, 및 10 mM 플루오린화나트륨을 함유하는 20 mM 트리스-HCl (pH 7.4) 및 150 mM NaCl 중의 트리톤-X100 용해 완충제 40 μL (1% (v/v))에서 용해시켰다. 용해물을 4℃ 및 14,000 rpm에서 7분 동안 원심분리하여 파편을 제거하였다. 세포 추출물을 SDS-PAGE 상에서 분획화하고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF) 막 (바이오-라드(Bio-Rad))으로 옮겼다. 항-포스프-Lck (Y394) (알앤디 시스템즈(R&D Systems)), 항-포스프-Lck (Y505) (알앤디 시스템즈) 또는 항-Lck (압캠(Abcam))에 이어 적합한 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 2차 항체 (잭슨 이뮤노리서치)를 첨가하여 막을 프로빙하였다. 클라리티(Clarity)™ 화학발광 시약 (바이오-라드), 및 바이오스펙트럼 500(BioSpectrum 500) 영상화 시스템 (UVP)에 의해 신호를 검출하였다. 이뮤노블롯을 위한 모든 1차 항체는 1:1,000 내지 1:5,000 희석하여 사용하였다. 비전워크엘에스 8.2(VisionWorkLS 8.2) 영상화 시스템 소프트웨어를 사용하여 Lck Y394 및 Y505 인산화 수준 (밴드의 밀도)을 결정하고, 각각의 시점에서 총 Lck의 밀도로 정규화하였다.
1.3 포스포-Lck의 유동 세포측정법
단리된 CD4+ T 세포를 자극 전 무혈청 AIM-5 배지에서 밤새 인큐베이션하였다. CD4+ T 세포를 빙상에 두고, 비오티닐화된 항-CD3 항체 (OKT-3, 바이오레전드) 또는 UB-421 5μg/mL를 세포에 첨가한 후, 빙상에서 추가로 10분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 가교의 존재 또는 부재 하에 37℃에서 표시된 시간 동안 자극하였다. 가교는 정제된 스트렙타비딘 (바이오레전드)을 비오티닐화된 항체에 자극 전 37℃에서 표시된 시간 동안 첨가하는 것에 의해 달성되었다. 이어서 세포를 포스플로우 고정 완충제 (비디 바이오사이언시스)에 의해 37℃에서 10분 동안 즉시 고정시킨 다음, 포스플로우 투과/세척 완충제 (비디 바이오사이언시스)를 사용하여 투과화하였다. 세포를 빙상에서 PE-항-Src (pY418) 및 알렉사 플루오르 647-항-Lck (pY505) (비디 바이오사이언시스)로 염색하였다. 모든 샘플을 BD FACS벌스 유동 세포측정기 (비디 바이오사이언시스)에 수집하였다. 데이터 분석은 플로우조 소프트웨어 V10.0.8 (트리 스타 인크.(Tree Star Inc.), 오레곤주 앳슈랜드) 상에서 수행하였다.
2 결과
CD4+ T 세포를 대략 80 mL의 정상인 건강한 공여자의 혈액으로부터 수득하였다. 혈액 샘플은 제한되었고, CD4+ T 세포의 수는 공여자들 사이에 달랐다. 따라서, 모든 시험 조건을 동일한 공여자의 CD4+ T 세포를 사용하여 수행할 수 없었다. 여러 사례에서, Lck 인산화에 대한 UB-421의 효과는 오직 비-가교 조건 하에서만 평가할 수 있었다. 양성 대조군은 가교 조건 하에 시험된 항-CD3 (OKT3)이었고, 음성 대조군은 비치료 (배지 단독) 샘플이었다.
2.1 Lck의 티로신 인산화는 Jurkat T 세포에의 UB-421 결합에 의해 유도된다.
Jurkat T 세포를 UB-421로 자극하여 Lck 인산화 및 하류 TCR 신호 전달 사건을 유도하는 능력을 평가하였다. T 세포의 공지된 자극자인 항-CD3 항체에 의한 자극을 양성 대조군으로서 사용하였다. 유동 세포측정법을 사용한 이전의 실험은 Jurkat T 세포의 100%가 세포 표면 상에서 CD4 수용체를 발현하였음을 입증하였다.
예상된 바와 같이, 항-CD3-자극된 Jurkat T 세포에서 가교 조건 하에 포스포-Y394 Lck 수준은 증진되었고 제1 시점, 5분에 피크에 이르렀다 (도 22a 및 22b).
UB-421에 의해 자극된 세포에서, Lck는 Jurkat 세포에서 가교 및 비-가교 조건 둘 다 하에 인산화되었고, Lck 티로신 Y394의 인산화 수준은 증진되어 이후 15분에 피크에 이르렀다 (도 22c 및 22d).
2.2 Lck의 티로신 인산화는 1차 CD4+ T 세포에의 UB-421 결합에 의해 유도된다.
CD4에 대한 UB-421 결합 및 TCR 신호전달의 효과를 1차 CD4+ T 세포에서 연구하였다.
CD4+ T 세포를 단리하고 음성 선택에 의해 약 90-95% 순도로 정제하였다. 양성 대조군으로서 세포를 항-CD3 항체로 자극하였고, Lck Y394의 인산화 수준은 예상된 바와 같이 지속되었다 (도 23a 및 23b).
놀랍게도, Lck Y394 및 Y505 둘 다의 티로신 인산화가 UB-421로 자극된 세포에서 가교 조건 및 비-가교 조건 둘 다 하에 증진되었다 (도 24a 및 24b). 가교의 부재 하에 UB-421로 자극된 세포에서의 Lck Y394의 인산화의 정도는 동일한 공여자 (공여자 1 및 공여자 2)로부터의 가교 조건 하에 UB-421로 자극된 그러한 세포보다 약간 더 낮았다 (도 24a). 인산화된 Y394-Lck는, UB-421의 가교의 존재 또는 부재 하에, 공여자 1의 경우 5분 및 공여자 2의 경우 30분에 피크에 이르렀다 (도 24a).
가교의 부재 하의 UB-421의 자극 능력을 추가로 평가하기 위해, 추가의 공여자 (공여자 4 내지 7)로부터의 1차 CD4+ T 세포를 웨스턴 블롯 분석에 의해 시험하였다. 활성화 (Y394의 인산화) 및 억제 (Y505의 인산화)가 시험된 대부분의 공여자에서 관찰되었다 (도 24a 내지 24d). 인산화의 정도, 피크까지의 시간, 지속시간은 개별 공여자들 사이에 유의하게 다른 것으로 보인다 (도 24c 및 24d). 가교의 부재 하에 UB-421로 처리된 CD4+ T 세포의 경우, Y394의 피크 인산화 수준은 공여자들 사이에 1 내지 4배 범위였고, 피크까지의 시간은 자극 후 5 내지 30분 범위였다 (도 24c 및 24d).
UB-421에 의해 유도된 Lck 인산화를 세포내 염색에 의해 유동 세포측정법을 통해 추가로 평가하여 단일 세포 기반 Lck Y394 및 Y505 인산화를 측정하였다. 양성 대조군으로서, 세포를 가교 조건 하에 항-CD3 항체로 자극하였다. 양성 대조군 샘플에서, Lck 인산화 및 탈인산화가 신속하게 발생하여 TCR 신호전달의 강도를 제어하였다 (도 25a, 점선). 음성 대조군 샘플에서 (어떠한 처리도 없음), Y394 및 Y505 인산화 수준 둘 다는 시간의 경과에 따라 변화없이 유지되었다 (도 25a, 실선).
2명의 상이한 공여자 (공여자 8 및 9)로부터의 1차 CD4+ T 세포를 UB-421로 처리하였다. 가교 조건 하에, UB-421은 항-CD3으로 자극된 양성 대조군 세포와 유사하게 Y394 및 Y505 인산화 둘 다를 유도하는 것으로 발견되었다 (도 25b, 점선). 비-가교 조건 하에, UB-421은 보다 낮은 Lck 인산화를 유도하였다 (도 25b, 실선). 일부 경우에, 활성화가 너무 신속하게 발생하였기 때문에 단지 감소 추세만이 관찰되었다. 결과는 Y394의 피크 인산화 수준은 Y505보다 더 빨리 발생한다는 것을 입증하였다. 도 25b는 Y394의 피크 인산화 수준이 Y505 인산화에 의하면 10분인 것과 비교하여 약 3분에 발생하였음을 보여준다. 결과는 또한 UB-421의 가교에 의해 유도된 Lck의 인산화는 항-CD3 자극보다 늦게 플래토에 도달하지만 항-CD3과 비교하여 유사한 인산화 수준을 갖는다는 것을 보여준다.
3 논의
CD4+ T 세포의 TCR 신호전달은 불필요하고 비제어되는 면역 반응을 피하기 위해 엄격하게 조절된다. TCR 신호전달의 중요한 키나제로서, Lck 활성은 시간적 및 공간적 둘 다로 조절된다. 본 연구에서, UB-421, 항-CD4 항체는 CD4+ T 세포를 활성화할 수 있고, Y394 (활성화 형태) 및 Y505 (억제 형태)에서 Lck의 인산화를 유도할 수 있다는 것을 입증하였다. Lck는 Lck의 Y394 인산화의 분석에 의하면 UB-421의 가교의 부재 하에 대부분의 공여자의 CD4+ T 세포에서 활성화되지만; 그러나, 인산화의 정도는 가교의 존재 하의 UB-421 처리의 경우와 비교하여 더 낮다. 유동 세포측정 분석에 의해, 본 발명자들은 가교 UB-421에 의하면 활성화 티로신이 먼저 인산화되고 3분에 플래토에 도달하며, 이어서 억제 티로신 Y505가 인산화되고, 이는 약 10분에 플래토에 도달한다는 것을 발견하였다. 이는 Lck 활성이 먼저 Y394의 인산화에 의해 증진된 다음 곧 Y505의 억제 인산화에 의해 제어된다는 것을 나타낸다.
만성 HIV 감염을 치료하기 위해 UB-421을 여러 임상 시험에서 평가하였고, 이는 단독요법으로서 HIV 바이러스 억제에 대해 큰 효능을 나타내었다. CD4에 결합함으로써, UB-421은 또한 TCR 신호전달 캐스케이드 키나제, Lck의 활성화를 가교 하에 또는 가교 조건의 부재 하에 유도할 수 있었다. Lck Y394 및 Y505 인산화의 수준, 피크까지의 시간, 및 지속시간에 대한 UB-421 치료의 효과는 공여자들마다 상이하였다. 현재의 결과는 UB-421이 면역 반응을 조정하는 잠재력을 가질 수 있다는 것을 시사한다. CD4+ T 세포 반응을 증진시킴으로써, UB-421은 또한 HIV 진입의 경쟁적 억제에 더하여 고유의 면역 반응을 통해 HIV 감염을 제어할 수 있다. UB-421에 의해 유도되는 CD4+ T 세포 TCR 신호전달 및 면역 반응의 이러한 연구 및 추가의 연구는 HIV 감염을 제어하는데 있어서 UB-421의 추가의 메카니즘을 이해하는 것을 보다 명백하게 할 수 있다.
4 결론
Figure pct00003
현재의 연구로부터의 결과는 CD4에 대한 UB-421의 결합이 정상인 건강한 공여자로부터 단리된 1차 CD4+ T 세포에서 활성화 티로신 Y394 및 억제 티로신 Y505 둘 다에 대한 Lck의 인산화를 유도하거나 증진시킨다는 것을 입증한다.
Figure pct00004
Lck의 인산화는 UB-421에 의해 가교 또는 비 가교 조건 하에 활성화될 수 있다.
Figure pct00005
UB-421에 의한 처리 시 Lck 인산화의 정도, 피크까지의 시간, 및 지속시간은 개별 공여자들 사이에 다르다.
Figure pct00006
UB-421은 강력한 HIV 진입 억제제에 더하여 면역 조정제로서의 역할을 할 수 있다.
표 1.
모노클로날 항체 B4의 HIV 진입 억제 활성
(모노그램 바이오사이언스 페노센스™ 검정)
Figure pct00007
표 2.
모 B4와 비교하여 탈면역화된 B4 (dB4C7)의 중화 활성 (MT-2 마이크로플라크 검정)
Figure pct00008
표 3.
모 B4와 비교하여 탈면역화된 B4 (dB4C7)의 중화 활성 (PBMC 검정)
Figure pct00009
표 4.
모노클로날 항체 B4는 HIV의 무세포 및 세포-대-세포 전파 둘 다를 차단한다
Figure pct00010
표 5.
FACS 분석에 의한 순차적 염색 - 퍼센트 양성 PBMC
Figure pct00011
표 6.
PBMC 배양물 중의 TNF-α 수준 및 HIV-1 바이러스 로드
Figure pct00012
ND: 검출가능하지 않음
표 7.
IIa상 시험에서의 UB-421의 다중 투여 후의 바이러스 로드 감소
Figure pct00013
ITT: 치료 의도 집단
PP: 프로토콜 기반 집단
VL: 바이러스 로드
표 8.
기능적 치유에서의 UB-421 치료의 설계
Figure pct00014
SEQUENCE LISTING <110> UBI US HOLDINGS, LLC. UBI IP HOLDINGS Wang, Chang-Yi <120> TREATMENT AND SUSTAINED VIROLOGIC REMISSION OF HIV INFECTION BY ANTIBODIES TO CD4 IN HAART STABILIZED PATIENTS <130> 1004263.216WO (2035-WO) <140> TBD <141> 2017-08-13 <150> US 62/374,752 <151> 2016-08-13 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine Antibody <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(5) <223> CDR1 of heavy chain of murine antibody B4 <400> 1 Asp Tyr Val Ile His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine Antibody <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(17) <223> CDR2 of heavy chain of murine antibody B4 <400> 2 Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Ser Asn Ala Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine Antibody <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(9) <223> CDR3 of heavy chain of murie antibody B4 <400> 3 Arg Gly Asn Gly Thr Gly Phe Ala Tyr 1 5 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 13 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Antibody <400> 13 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 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(26)..(26) <223> Iowa Black Hole Quencher (IBHQ) <400> 21 ggagagattt gtgtgggcat gacagg 26 <210> 22 <211> 458 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(25) <223> Signal Peptide <220> <221> SITE <222> (1)..(396) <223> Extracellular <220> <221> SITE <222> (1)..(92) <223> gpl20 binding region <220> <221> SITE <222> (1)..(458) <223> UniProtKB/Swiss-Prot: P01730.1 <220> <221> SITE <222> (26)..(125) <223> Domain 1 (D1) <220> <221> SITE <222> (126)..(203) <223> Domain 2 (D2) <220> <221> SITE <222> (204)..(317) <223> Domain 3 (D3) <220> <221> SITE <222> (318)..(374) <223> Domain 4 (D4) <220> <221> SITE <222> (397)..(418) <223> Transmembrane Domain <220> <221> SITE <222> (419)..(458) <223> Cytoplasmic Domain <400> 22 Met Asn Arg Gly Val Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Val Leu Gln Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gln Gly Lys Lys Val Val Leu Gly Lys 20 25 30 Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser 35 40 45 Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gln Ile Lys 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Claims (65)

  1. CD4 분자의 세포외 영역에 특이적으로 결합하는, CD4 분자에 대해 지시된 항체이며, 여기서
    항체가 CD4+ 세포의 표면 상의 CD4 분자에 결합한 경우에,
    a) CD4+ 세포 내로의 HIV 진입을 경쟁적으로 억제하고;
    b) HIV에 감염된 휴지기 CD4+ 세포에서 잠복 HIV 저장소를 활성화하고;
    d) 세포 HIV DNA의 수준을 감소시키고;
    e) 바이러스 로드 반동 없이 HIV 감염의 지속적 바이러스 완화를 제공하는
    항체.
  2. 제1항에 있어서, HIV의 무세포 및 세포-대-세포 전파를 경쟁적으로 억제하는 항체.
  3. 제1항에 있어서, 대상체에게 투여될 경우 조절 T 세포의 백분율을 감소시키는 항체.
  4. 제1항에 있어서, 대상체에게 투여될 경우 CD8+ 세포의 양을 증가시키는 항체.
  5. 제1항에 있어서, 대상체에게 투여될 경우 HIV gag 모티프 펩티드 자극에 반응하여 CD8+ 증식성 세포를 증가시키는 항체.
  6. 제1항에 있어서, 대상체에게 투여될 경우 HIV 감염된 CD4+ 세포를 표적화하는 기능적 HIV 특이적 CD8+ CTL 세포를 증진시키는 항체.
  7. 제1항에 있어서, CD4+ 세포에서 TNF-알파 생산을 증진시키는 항체.
  8. 제1항에 있어서, 가교의 존재 또는 부재 하에 휴지기 CD4+ 세포를 활성화하는 항체.
  9. 제1항에 있어서, 바이러스 로드 반동 없이 HIV 양성 환자에서 HIV 바이러스 로드를 혈액 밀리리터당 50 카피 미만으로 감소시키는 항체.
  10. 제1항에 있어서, CD4 분자의 도메인 1 주위의 영역에 결합하는 항체.
  11. 제1항에 있어서, CD4의 도메인 1 내의 CDR2 영역 주위의 영역에 결합하는 항체.
  12. 제1항에 있어서,
    서열식별번호: 1의 CDR1,
    서열식별번호: 2의 CDR2 및
    서열식별번호: 3의 CDR3
    을 포함하는 중쇄 가변 영역 아미노산 서열; 및
    서열식별번호: 4의 CDR1,
    서열식별번호: 5의 CDR2 및
    서열식별번호: 6의 CDR3
    을 포함하는 경쇄 가변 영역 아미노산 서열
    을 포함하는 항체.
  13. 제1항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
  14. 제1항에 있어서, 인간화 모노클로날 항체인 항체.
  15. 제1항에 있어서,
    서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 인간화 모노클로날 항체인 항체.
  16. 제1항에 있어서,
    서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
    서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는 인간화 모노클로날 항체인 항체.
  17. 제1항에 있어서,
    서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
    서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는 인간화 모노클로날 항체인 항체.
  18. 제1항에 있어서,
    서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및
    서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는 인간화 모노클로날 항체인 항체.
  19. 제1항에 있어서, HPB-ALL 세포 상의 막-결합된 CD4에 대해 약 3.1 x 10-11 M 내지 약 8.1 x 10-11 M의 절대 결합 친화도 (Kd)를 갖는 항체.
  20. 제1항에 있어서, CD4 분자에 결합된 항체.
  21. 제1항의 항체를 포함하는 조성물.
  22. 제1항의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  23. 포스페이트 완충 염수 (PBS), 20 mM 글리신, 및 0.05% (v/v) 폴리소르베이트 20 중에 제1항의 항체를 포함하는 제약 조성물.
  24. 포스페이트 완충 염수 (PBS), 20 mM 글리신, 0.05% (v/v) 폴리소르베이트 20, 및 10 mM 히스티딘 중에 제1항의 항체를 포함하는 제약 조성물.
  25. 포스페이트 완충 염수 (PBS), 20 mM 글리신, 및 0.05% (v/v) 폴리소르베이트 20 중에 약 1.0 mg/mL 내지 약 200.0 mg/mL의 제1항의 항체를 포함하는 제약 조성물.
  26. 포스페이트 완충 염수 (PBS), 20 mM 글리신, 0.05% (v/v) 폴리소르베이트 20, 및 10 mM 히스티딘 중에 약 1.0 mg/mL 내지 약 200.0 mg/mL의 제1항의 항체를 포함하는 제약 조성물.
  27. 포스페이트 완충 염수 (PBS), 20 mM 글리신, 및 0.05% (v/v) 폴리소르베이트 20 중에 약 10.0 mg/mL의 제1항의 항체를 포함하는 제약 조성물.
  28. 포스페이트 완충 염수 (PBS), 20 mM 글리신, 0.05% (v/v) 폴리소르베이트 20, 및 10 mM 히스티딘 중에 약 10.0 mg/mL의 제1항의 항체를 포함하는 제약 조성물.
  29. 제12항의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  30. 제16항의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  31. HIV에 노출된 대상체를 치료하는 방법이며,
    약리학상 유효량의 제1항의 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 항체를 대상체에게 HIV에의 노출 전에 투여하는 것인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 항체를 대상체에게 HIV에의 노출 후에 투여하는 것인 방법.
  34. 제31항에 있어서, 항체를 HIV에의 노출 후 48시간 내에 투여하는 것인 방법.
  35. 제31항에 있어서, 항체를 대상체에게 적어도 약 5 mg/kg 체중의 투여량으로 투여하는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 항체를 대상체에게 다수회 투여하는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 항체를 대상체에게 매주, 격주, 또는 매월 간격으로 투여하는 것인 방법.
  38. 제36항에 있어서, 항바이러스제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 항바이러스제가 고도 활성 항레트로바이러스 요법 (HAART)인 방법.
  40. 제39항에 있어서, HAART가 프로테아제 억제제 또는 비-뉴클레오시드 리버스 트랜스크립타제 억제제와 조합된 뉴클레오시드 유사체 리버스 트랜스크립타제 억제제를 포함하는 것인 방법.
  41. 제39항에 있어서, 항체를 HAART와 공동으로 투여하는 것인 방법.
  42. 제39항에 있어서, 항체 및 HAART를 대상체에게 주기의 과정에 걸쳐 투여하며, 여기서 주기는
    i) 항체를 대상체에게 제1 시간 동안 투여한 다음 제2 시간 동안 치료 휴지기를 갖는 것; 및
    ii) HAART를 대상체에게 (i)의 제1 시간 및 제2 시간 동안 연속적으로 투여하는 것
    을 포함하는 것인 방법.
  43. 제39항에 있어서, 항체 및 HAART를 대상체에게 주기의 과정에 걸쳐 투여하며, 여기서 주기는
    i) 항체를 대상체에게 4개월의 기간 동안 매주, 격주, 또는 매월 간격으로 투여한 다음 2개월 치료 휴지기를 갖는 것; 및
    ii) HAART를 대상체에게 (i)의 6-개월 기간 동안 연속적으로 투여하는 것
    을 포함하는 것인 방법.
  44. 제42항에 있어서, 대상체가 2 주기의 과정에 걸쳐 치료되는 것인 방법.
  45. 제43항에 있어서, 대상체가 2 주기의 과정에 걸쳐 치료되는 것인 방법.
  46. 제39항에 있어서, 항체를 HAART와 공동이 아닌 시간에 투여하는 것인 방법.
  47. 제39항에 있어서, 항체 및 HAART를 대상체에게 주기의 과정에 걸쳐 투여하며, 여기서 주기는
    i) 항체를 대상체에게 제1 시간 동안 투여한 다음 제2 시간 동안 치료 휴지기를 갖는 것; 및
    ii) HAART를 대상체에게 제2 시간 동안 투여하고 제1 시간 동안은 투여하지 않는 것
    을 포함하는 것인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 항체를 제1 시간 동안 규칙적 간격으로 투여하는 것인 방법.
  49. 제47항에 있어서, 항체를 제1 시간 동안 매주, 격주, 또는 매월 간격으로 투여하는 것인 방법.
  50. HIV 감염에 걸린 대상체를 치료하는 방법이며,
    a) 약리학상 유효량의 제1항의 항체; 및
    b) 고도 활성 항레트로바이러스 요법 (HAART)
    을 포함하는 치료 요법을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 항체를 대상체에게 적어도 약 5 mg/kg 체중의 투여량으로 투여하는 것인 방법.
  52. 제50항에 있어서, 항체 및 HAART를 대상체에게 주기의 과정에 걸쳐 투여하며, 여기서 주기는
    i) 항체를 대상체에게 제1 시간 동안 투여한 다음 제2 시간 동안 치료 휴지기를 갖는 것; 및
    ii) HAART를 대상체에게 (i)의 제1 시간 및 제2 시간 동안 연속적으로 투여하는 것
    을 포함하는 것인 방법.
  53. 제50항에 있어서, 항체 및 HAART를 대상체에게 주기의 과정에 걸쳐 투여하며, 여기서 주기는
    i) 항체를 대상체에게 4개월의 기간 동안 매주, 격주, 또는 매월 간격으로 투여한 다음 2-개월 치료 휴지기를 갖는 것; 및
    ii) HAART를 대상체에게 (i)의 6-개월 기간 동안 연속적으로 투여하는 것
    을 포함하는 것인 방법.
  54. 제52항에 있어서, 대상체가 2 주기 이상의 과정에 걸쳐 치료되는 것인 방법.
  55. 제53항에 있어서, 대상체가 2 주기 이상의 과정에 걸쳐 치료되는 것인 방법.
  56. 제53항에 있어서, 항체 및 HAART를 대상체에게 주기의 과정에 걸쳐 투여하며, 여기서 주기는
    i) 항체를 대상체에게 4개월의 기간 동안 매주, 격주, 또는 매월 간격으로 투여한 다음 2-개월 치료 휴지기를 갖는 것; 및
    ii) HAART를 대상체에게 (i)의 6-개월 기간 동안 연속적으로 투여하는 것
    을 포함하는 것인 방법.
  57. 제50항에 있어서, (a)의 항체를 (b)의 HAART와 공동이 아닌 시간에 투여하는 것인 방법.
  58. 제50항에 있어서, (a)의 항체 및 (b)의 HAART를 대상체에게 주기의 과정에 걸쳐 투여하며, 여기서 주기는
    i) 항체를 대상체에게 제1 시간 동안 투여한 다음 제2 시간 동안 치료 휴지기를 갖는 것; 및
    ii) HAART를 대상체에게 제2 시간 동안 투여하고 제1 시간 동안은 투여하지 않는 것
    을 포함하는 것인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 항체를 제1 시간 동안 규칙적 간격으로 투여하는 것인 방법.
  60. 제58항에 있어서, 항체를 제1 시간 동안 매주, 격주, 또는 매월 간격으로 투여하는 것인 방법.
  61. CD4+ 세포 내로의 HIV 진입을 억제하는 방법이며,
    제1항의 항체를 세포에 노출시키는 것을 포함하는 방법.
  62. CD4+ 세포에 대한 gp120 결합을 억제하는 방법이며,
    제1항의 항체를 세포에 노출시키는 것을 포함하는 방법.
  63. 휴지기 CD4+ T 세포를 활성화하는 방법이며,
    제1항의 항체를 세포에 노출시키는 것을 포함하는 방법.
  64. 휴지기 T 세포에서 HIV의 잠복 저장소를 활성화하는 방법이며,
    제1항의 항체를 세포에 노출시키는 것을 포함하는 방법.
  65. HIV에 감염된 세포의 샘플에서 잠복 HIV 저장소를 감소시키는 방법이며,
    a) 제1항의 항체를 세포의 샘플에 노출시키는 것; 및
    b) HAART를 세포의 샘플에 노출시키는 것
    을 포함하는 방법.
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