CN1471406A - 含有il-6拮抗剂作为有效成分的牛皮癣的预防或治疗剂 - Google Patents

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Abstract

一种牛皮癣的预防或治疗剂，含有白细胞介素－6(IL－6)拮抗剂、例如对IL－6受体的抗体。

Description

含有IL-6拮抗剂作为有效成分的牛皮癣的预防或治疗剂
技术领域
本发明涉及含有白细胞介素-6(IL-6)拮抗剂作为有效成分的牛皮癣的预防或治疗剂。
背景技术
IL-6是B细胞刺激因子2(BSF2)或也被称为干扰素β2的细胞因子。IL-6作为与B淋巴细胞系细胞的活化相关的分化因子被表达(Hirano，T.etal.，Nature(1986)324，73～76)，之后，已明确IL-6为对各种细胞的功能有影响的多功能细胞因子(Akira，S.et al.，Adv.in Immunology(1993)54，1～78)。有报告指出，IL-6是诱导T淋巴细胞系细胞的成熟化的因子(Lotz，M.et al.，J.Exp.Med.(1988)167，1253～1258)。
IL-6在细胞上通过两种蛋白质传递其生物学活性。其一是，IL-6结合的分子量约80kD的配体结合性蛋白质的IL-6受体(Taga，T.et al.，J.Exp.Med.(1987)166，967～981，Yamasaki，K.et al.，Science(1987)241，825～828)。IL-6受体除了跨细胞膜在细胞膜上表达的膜结合型外，主要也作为从其细胞外区域形成的可溶性IL-6受体存在。
另一个是与非配体结合性的信号传递有关的分子量约130kD的膜蛋白质gp130。IL-6和IL-6受体通过形成IL-6/IL-6受体复合体、然后和gp130结合，使IL-6的生物学活性被传递入细胞内(Taga，T.et al.，Cell(1989)58，573～581)。
IL-6拮抗剂为阻碍IL-6的生物学活性传递的物质。到目前为止，已知对于IL-6的抗体(抗IL-6抗体)、对于IL-6受体的抗体(抗IL-6受体抗体)、对于gp130的抗体(抗gp130抗体)、IL-6变异体、IL-6或IL-6受体部分肽等。
关于抗IL-6受体抗体，有很多报告(Novick，D.et al.，Hybridoma(1991)10，137～146、Huang，Y.W.et al.，Hybridoma(1993)12，621～630、国际专利申请公开号WO 95-09873、法国专利申请公开号FR2694767、美国专利号US 521628)。已知其中之一是通过将小鼠抗体PM-1(Hirata，Y.et al.，J.Immunol.(1989)143，2900～2906)的互补决定区(CDR)向人抗体移植得到的人源化PM-1抗体(国际专利申请公开号WO 92-19759)。
牛皮癣一般为慢性·难治性的皮肤病，具有在圆形或椭圆形的红色隆起部分(红斑)上形成白色或银白色的角质的外观。牛皮癣为炎症性角化症的代表性皮肤病，该炎症性角化症为同时发生通过淋巴细胞等的白血球侵入皮肤产生的“炎症”、和皮肤的表皮变厚且角质层也变厚的“角化症”的皮肤症状。
牛皮癣按照症状可分为寻常性牛皮癣、关节症性牛皮癣、脓疱性牛皮癣、掌跖脓疱症、及滴状牛皮癣，但其发病原因或发病机制不明确。但是，由于具有淋巴细胞抑制活性的环胞菌素A具有牛皮癣的治疗效果等，存在淋巴细胞参与的学说。
作为牛皮癣的治疗剂，已知有为抑制皮肤炎症的甾类外用药、环胞菌素A内服药、氨甲喋呤内服药、紫外线疗法等；为抑制表皮增殖(角化症)的维生素D外用药、维生素A类(体卡松)内服药、紫外线疗法等；以及为治疗其它个别关联症状的非甾体类消炎镇痛药(对关节症牛皮癣的关节炎)、抗生素(对关联的感染症)等。
但是，到目前为止，在牛皮癣中没有进行使用抗IL-6受体抗体等的IL-6拮抗剂特异地抑制IL-6生物学活性的试验，还不知道抗IL-6受体抗体等的IL-6拮抗剂对牛皮癣会显示治疗效果。
发明的公开
本发明提供一种新型的牛皮癣的预防或治疗剂。
即，(1)本发明提供一种牛皮癣的预防或治疗剂，其含有IL-6拮抗剂作为有效成分。
(2)本发明还提供一种牛皮癣的预防或治疗剂，其含有对IL-6受体的抗体作为有效成分。
(3)本发明还提供一种牛皮癣的预防或治疗剂，其含有对IL-6受体的单克隆抗体作为有效成分。
(4)本发明还提供一种牛皮癣的预防或治疗剂，其含有对人IL-6受体的单克隆抗体作为有效成分。对人IL-6受体的单克隆抗体，优选为PM-1抗体。
(5)本发明还提供一种牛皮癣的预防或治疗剂，其含有对小鼠IL-6受体的单克隆抗体作为有效成分。对小鼠IL-6受体的单克隆抗体，优选为MR16-1抗体。
(6)本发明还提供一种牛皮癣的预防或治疗剂，其含有对IL-6受体的重组型抗体作为有效成分。对IL-6受体的重组型抗体，优选为具有人抗体恒定区域(C区域)。
(7)本发明还提供一种牛皮癣的预防或治疗剂，其含有对IL-6受体的嵌合抗体或人源化抗体作为有效成分。
(8)本发明还提供一种牛皮癣的预防或治疗剂，其含有人源化PM-1抗体作为有效成分。
发明的实施方案
本发明中使用的IL-6拮抗剂，若为显示牛皮癣的预防或治疗效果的物质，则不管其来源、种类及形状。
IL-6拮抗剂为隔断IL-6产生的信号传递、阻碍IL-6的生物学活性的物质。IL-6拮抗剂优选为对IL-6、IL-6受体及gp130的任一个的结合具有阻碍作用的物质。作为IL-6拮抗剂，可以列举例如抗IL-6抗体、抗IL-6受体抗体、抗gp130抗体、IL-6变异体、可溶性IL-6受体变异体或者IL-6或IL-6受体的部分肽、以及和它们显示相同活性的低分子物质。
本发明中使用的抗IL-6抗体，可以使用公知的手段作为多克隆或单克隆抗体得到。作为本发明中使用的抗IL-6抗体，特别优选来自哺乳动物的单克隆抗体。作为来自哺乳动物的单克隆抗体，有产生于杂交瘤中的抗体、以及通过基因工程的手段产生于用含有抗体基因的表达型载体转化的宿主中的抗体。该抗体通过与IL-6结合，阻碍IL-6与IL-6受体结合、阻断IL-6的生物学活性向细胞内传递。
作为这种抗体，可以列举MH166(Matsuda，T.et al.，Eur.J.Immunol.(1988)18，951～956)或SK2抗体(Sato，K.et al.，第21次日本免疫学会总会、学术纪录(1991)21，166)等。
产生抗IL-6抗体的杂交瘤，基本可以使用公知技术、如下所述进行制备。即，使用IL-6作为致敏抗原、将其按照通常的免疫方法进行免疫，得到的免疫细胞按照通常的细胞融合法和已知的亲代细胞融合，通过通常的筛选法，可以通过筛选单克隆的抗体产生细胞来制备。
具体地，制备抗IL-6抗体可按下面的方法进行。例如，作为取得抗体的致敏抗原被使用的人IL-6可以通过使用Eur.J.Biochem(1987)168，543～550、J.Immunol.(1988)140，1534～1541、或Agr.Biol.Chem.(1990)54，2685～2688中公开的IL-6基因/氨基酸序列得到。
在已知的表达型载体系中插入IL-6的基因序列、使适当的宿主细胞转化后，用公知的方法纯化来自该宿主细胞中或培养上清液中的目的IL-6蛋白质，可将该纯化IL-6蛋白质作为致敏抗原使用。另外，也可以将IL-6蛋白质与其它蛋白质的融合蛋白质作为致敏抗原使用。
本发明中使用的抗IL-6受体抗体，可以使用公知的手段作为多克隆抗体或单克隆抗体得到。作为本发明中使用的抗IL-6受体抗体，特别优选来自哺乳动物的单克隆抗体。作为来自哺乳动物的单克隆抗体，有产生于杂交瘤中的物质、和通过基因工程的手段，产生于用含有抗体基因的表达型载体转化的宿主中的物质。该抗体通过与IL-6受体结合，阻碍IL-6与IL-6受体结合、阻断IL-6的生物学活性向细胞内传递。
作为这种抗体，可以列举MR16-1抗体(Tamura，T.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90，11924～11 928)、PM-1抗体(Hirata，Y.et al.，J.Immunol.(1989)143，2900～2906)、AUK12-20抗体、AUK64-7抗体或AUK146-15抗体(国际专利申请公开号WO 92-19759)等。其中，作为特别优选的抗体可以列举PM-1抗体。
另外，产生PM-1抗体的杂交瘤细胞株作为PM-1，基于布达佩斯条约，在1988年7月12日、作为FERM BP-2998被国际保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(
Figure A0181784800091
305-5466日本茨城县つくば市东1段1号1中央第6)。另外，产生MR16-1抗体的杂交瘤细胞株作为大鼠-小鼠杂交瘤MR16-1，基于布达佩斯条约，在1997年3月13日、作为FERM BP-5875被国际保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心( 305-5466日本茨城县つくば市东1段1号1中央第6)。
产生抗IL-6受体单克隆抗体的杂交瘤，基本可以使用已知技术、如下进行制备。即，使用IL-6受体作为致敏抗原、将其按照通常的免疫方法进行免疫，得到的免疫细胞按照通常的细胞融合法和已知的亲代细胞融合，通过通常的筛选法，可以通过筛选单克隆抗体的产生细胞来制备。
具体地说，制备抗IL-6受体抗体可按下面的方法进行。例如，作为引起抗体的致敏抗原被使用的人IL-6受体可以通过使用在欧洲专利申请公开号EP 325474中公开的、小鼠IL-6受体可以通过使用在日本专利申请公开号特开平3-155795中公开的IL-6受体基因/氨基酸序列来得到。
IL-6受体蛋白质，有在细胞膜上表达的蛋白质和从细胞膜脱离的蛋白质(可溶性IL-6受体)(Yasukawa，K.et al.，J.Biochem.(1990)108，673～676)两种。可溶性IL-6受体抗体是由与细胞膜结合的IL-6受体的实质性细胞外区域构成的，在缺损跨细胞膜区域或跨细胞膜区域和细胞内区域方面与膜结合型IL-6受体不同。IL-6受体蛋白质只要是在本发明中使用的抗IL-6受体抗体的制备中作为致敏抗原使用，就可以使用任一种IL-6受体。
在已知的表达型载体系中插入IL-6受体的基因序列、使适当的宿主细胞转化后，用已知的方法纯化来自该宿主细胞中或培养上清液中的目的IL-6受体蛋白质，可将该纯化IL-6受体蛋白质作为致敏抗原使用。另外，也可以将表达IL-6受体的细胞或IL-6受体蛋白质和其它蛋白质的融合蛋白质作为致敏抗原使用。
含有含编码人IL-6受体的cDNA的质粒pIBIBSF2R的大肠杆菌(E.coli)，基于布达佩斯条约，在1989年1月9日、作为HB101-pIBIBSF2R，保藏号FERM BP-2232被国际保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心( 305-5466日本茨城县つくば市东1段1号1中央第6)。
本发明中使用的抗gp130抗体，可以使用公知的手段作为多克隆或单克隆抗体得到。作为本发明中使用的抗gp130抗体，特别优选来自哺乳动物的单克隆抗体。作为来自哺乳动物的单克隆抗体，有产生于杂交瘤中的抗体、和通过基因工程的手段产生于用含有抗体基因的表达型载体转化的宿主中的抗体。该抗体通过和gp130结合，阻碍IL-6/IL-6受体复合体与gp130结合、阻断IL-6的生物学活性向细胞内传递。
作为这种抗体，可以列举AM64抗体(特开平3-219894)、4B11抗体和2H4抗体(US 5571513)B-S12抗体以及B-P8抗体(特开平8-291199)等。
产生抗gp130单克隆抗体的杂交瘤，基本可以使用公知技术、如下所述进行制备。即，使用gp130作为致敏抗原、将其按照通常的免疫方法进行免疫，得到的免疫细胞通过通常的细胞融合法和公知的亲代细胞融合，通过通常的筛选法，可以通过筛选单克隆抗体的产生细胞来制备。
具体地，制备单克隆抗体可按下面的方法进行。例如，作为引起抗体的致敏抗原被使用的gp130可以使用在欧洲专利申请公开号EP 411946中公开的gp130基因/氨基酸序列来得到。
在已知的表达型载体系中插入gp130的基因序列、使适当的宿主细胞转化后，用已知的方法纯化来自该宿主细胞中或培养上清液中的目的gp130蛋白质，可将该纯化gp130受体蛋白质作为致敏抗原使用。另外，也可以将表达gp130的细胞或gp130蛋白质和其它蛋白质的融合蛋白质作为致敏抗原使用。
作为用致敏抗原免疫的哺乳动物，虽没有特别的限制，但是优选考虑与在细胞融合中使用的亲代细胞的相容性来进行选择，一般地可以使用啮齿类动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠等。
用致敏抗原免疫动物时可以按已知的方法进行。例如，作为一般的方法，通过在哺乳动物的腹腔内或皮下注射致敏抗原进行。具体地说，用适量的PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)或生理盐水等稀释致敏抗原、悬浊液根据需要混合通常的佐剂，例如弗氏完全佐剂，乳化后，优选每4～21日向哺乳动物给药数次。另外，致敏抗原免疫时也可以使用适当的载体。
这样进行免疫、确认血清中所期望的抗体水平上升后，从哺乳动物中取出免疫细胞、进行细胞融合。作为进行细胞融合的优选的免疫细胞，特别可以列举脾细胞。
作为和上述免疫细胞融合的另一亲代细胞的哺乳动物骨髓瘤细胞，适宜使用以前、已知的各种细胞株，例如P3X63Ag8.653(Kearney，J.F.et al.J.Immnol.(1979)123，1548～1550)、P3X63Ag8U.1(Current Topics inMicrobiology and Immunology(1978)81，1～7)、NS-1(Kohler.G.andMilstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511～519)、MPC-11(Margulies.D.H.et al.，Cell(1976)8，405～415)、SP2/0(Shulman，M.et al.，Nature(1978)276，269～270)、F0(de St.Groth，S.F.et al.，J.Immunol.Methods(1980)35，1～21)、S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313～323)、R210(Galfre，G.et al.，Nature(1979)277，131～133)等。
上述免疫细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合基本可以按照已知的方法、例如Milstein等的方法(Kohler.G.and Milstein，C.、Methods Enzymol.(1981)73，3～46)等进行。
更具体地说，上述细胞融合例如可在细胞融合促进剂存在下，在通常的营养培养液中进行。作为融合促进剂，可使用例如聚乙二醇(PEG)、日本血细胞凝集病毒(HVJ)等，进一步，根据需要，为了提高融合效率、也可以添加二甲基亚砜等的辅助溶剂来使用。
免疫细胞和骨髓瘤细胞的使用比例，例如，相对于骨髓瘤细胞、免疫细胞优选为1～10倍。作为上述细胞融合中使用的培养液，例如，可以使用在上述骨髓瘤细胞株的增殖中适合的RPMI1640培养液、MEM培养液，除此之外，还可使用在该种细胞培养中可使用的通常的培养液，进一步，也可能并用胎牛血清(FCS)等的血清补液。
细胞融合是将上述免疫细胞和骨髓瘤细胞的规定量在上述培养液中充分混合，通常在30～60％(w/v)的浓度下添加预先加热至37℃左右的PEG溶液、例如平均分子量为1000～6000左右的PEG溶液，通过混合形成目的融合细胞(杂交瘤)。然后，通过反复进行依次添加适当的培养液，离心除去上清液的操作、可以除去杂交瘤的繁殖中不优选的细胞融合剂等。
该杂交瘤通过在通常的选择培养液、例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养液)中培养来进行选择。在该HAT培养液中的培养，持续使目的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)灭绝所需的充分的时间、通常要持续数日～数周。然后，实施通常的极限稀释法、进行产生目的抗体的杂交瘤的筛选和纯株培养。
另外，除了在人以外的动物中免疫抗原得到上述杂交瘤以外、将人淋巴细胞在体外被所期望的抗原蛋白质或抗原表达细胞致敏、使致敏B淋巴细胞和人骨髓瘤细胞、例如U266融合，也可以得到对期望的抗原或抗原表达细胞具有结合活性的所期望的人抗体(参照特公平1-59878)。进一步，也可以对具有人抗体基因储藏库的转基因动物给与抗原或抗原表达细胞，按上述方法得到所期望的人抗体(参照国际专利申请公开号WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO 96/33735)。
产生这样制备的单克隆抗体的杂交瘤，在通常的培养液中传代培养，另外，也可在液氮中长期保存。
从该杂交瘤取得单克隆抗体时，可以采用将该杂交瘤用通常的方法培养、得到其培养上清液的方法，或将杂交瘤投入与其有相容性的哺乳动物中使其增殖、得到其腹水的方法等。前者的方法适于得到高纯度的抗体，另一方面，后者的方法适于抗体的大量生产。
例如，产生抗IL-6受体抗体的杂交瘤的制备，可以按照特开平3-139293中公开的方法进行。可以进行将基于布达佩斯条约，在1988年7月12日、作为FERM BP-2998被国际保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(
Figure A0181784800121
305-5466日本茨城县つくば市东1段1号1中央第6)的产生PM-1抗体的杂交瘤注入BALB/c小鼠的腹腔内、得到腹水，从该腹水纯化PM-1抗体的方法，或将该杂交瘤在适当的培养基中、例如10％胎牛血清、含有5％BM-Condimed H1(Boehringer Mannheim制)RPMI1640培养基、杂交瘤SFM培养基(GIBCO-BRL制)、PFHM-II培养基(GIBCO-BRL制)等中培养，由该培养上清液纯化PM-1抗体的方法。
本发明中，作为单克隆抗体，可以使用基因重组技术，由杂交瘤克隆抗体基因，将其整合入适当的载体，然后将载体导入宿主中而产生的重组型抗体(例如，参照Borrebaeck C.A.K.and Larrick J.W.THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES，Published in theUnited Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD，1990)。
具体地，产生目的抗体的细胞，例如由杂交瘤分离编码抗体的可变(V)区域的mRNA。mRNA的分离可以按照公知的方法，例如胍超离心法(Chirgwin，J.M.et al.，Biochemistry(1979)18，5294～5299)、AGPC法(Chomczynski，P.et al.，Anal.Biochem.(1987)162，156～159)等制备总RNA，使用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制)等制备mRNA。另外，通过使用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制)直接制备mRNA。
由得到的mRNA使用逆转录酶合成抗体V区域的cDNA。cDNA的合成可以使用AMV逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒等进行。另外，进行cDNA的合成及扩增中也可以使用5′-Ampli FINDER RACE试剂盒(Clontech制)及PCR的5′-RACE法(Frohman，M.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998～9002；Belyavsky，A.et al.，Nucleic AcidsRes.(1989)17，2919～2932)。由得到的PCR产物纯化目的DNA片断，与载体DNA连结。进一步，由此制备重组载体、导入大肠杆菌等中、选择集落制备所期望的重组载体。目的DNA的碱基序列可通过已知的方法、例如脱氧法确认。
若得到编码目的抗体的V区域的DNA、将其和编码期望的抗体恒定区域(C区域)的DNA连结，插入表达型载体中。另外，也可以将含有编码抗体的V区域的DNA整合入含有抗体C区域的DNA的表达型载体中。
制备本发明中使用的抗体，是将下述的抗体基因整合入表达型载体，以使其在表达控制区域、例如在增强子、启动子的控制下表达。然后，通过该表达型载体转化宿主细胞、可以使抗体表达。
本发明中，以降低对人的异种抗原性等作为目的、可以使用人为地改变了的基因重组型抗体，例如嵌合抗体、人源化抗体。这些修饰抗体可以用已知的方法制备。
嵌合抗体可通过将编码上述得到的抗体V区域的DNA与编码人抗体C区域的DNA连结，通过将其整合入表达型载体中、导入宿主产生得到(参照欧洲专利申请公开号EP 125023、国际专利申请公开号WO92-19759)。使用该已知方法，可以得到本发明中有用的嵌合抗体。
例如，含有编码嵌合PM-1抗体的L链及H链的V区域的DNA的质粒，分别被命名为pPM-k3和pPM-h1，具有该质粒的大肠杆菌基于布达佩斯条约，在1991年2月11日分别作为NCIMB 40366和NCIMB 40362被国际保藏在国立工业和海洋微生物保藏有限公司。
人源化抗体也被称为重构人抗体，是将人以外的哺乳动物、例如小鼠抗体的互补决定区(CDR)移植入人抗体的互补决定区得到的抗体，也知道其一般的基因重组方法(参照欧洲专利申请公开号EP 125023、国际专利申请公开号WO 92-19759)。
具体地说，设计为连结小鼠抗体的CDR和人抗体的构架区域(FR)的DNA序列，通过PCR法由在制造成末端部分具有重叠部分的多个寡核苷酸合成。将得到的DNA与编码人抗体C区域的DNA连结，然后通过整合入表达型载体中，将其导入宿主产生可得到(参照欧洲专利申请公开号EP 239400、国际专利申请公开号WO 92-19759)。
通过CDR连结的人抗体的FR，可选择互补决定区域形成良好的抗原结合部位的物质。根据需要，也可以置换抗体可变区域的构架区域的氨基酸以使重构人抗体的互补决定区形成适当的抗原结合部位(Sato，K.et al.，Cancer Res.(1993)53，851～856)。
在嵌合抗体、人源化抗体中也可以使用人抗体C区域。作为人抗体C区域，可以列举Cγ，例如，可以使用Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4。另外，为了改善抗体及其产生的稳定性，也可以修饰人抗体C区域。
嵌合抗体由来自人以外的哺乳动物的抗体的可变区域和来自人的抗体C区域构成，人源化抗体由来自人以外的哺乳动物的抗体的互补决定区域和来自人抗体的构架区域和C区域构成，为了降低人体内的抗原性，它们作为本发明中使用的抗体是有用的。
作为本发明中使用的人源化抗体的优选具体实例，可以列举人源化PM-1抗体(参照国际专利申请公开号WO 92-19759)。
如上所述构建的抗体基因，可以通过公知的方法使之表达、取得。在哺乳类细胞的情况下，可通过功能性结合了经常使用的有用的启动子、被表达的抗体基因、在其3′侧下游的poly A信号的DNA或含有该DNA的载体使之表达。例如作为启动子/增强子，可以列举人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子。
另外，作为其它在本发明中使用的可用于抗体表达时的启动子/增强子，也可以使用逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿病毒40(SV40)等的病毒启动子/增强子或人促进因子-1α(HEF1α)等来自哺乳类细胞的启动子/增强子。
例如，使用SV 40启动子/增强子时，按照Mulligan等的方法(Mulligan，R.C.et al.，Nature(1979)277，108～114)，或者，在使用HEF1α启动子/增强子时，按照Mizushima等的方法(Mizushima，S.and Nagata，S.Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)可以容易地实施。
在大肠杆菌的情况下，可以功能性结合被经常使用的有用的启动子、为了抗体分泌的信号序列、被表达的抗体基因并使之表达。例如作为启动子，可以列举1acZ启动子、araB启动子。在使用1acZ启动子时，可以按照Ward等的方法(Ward，E.S.et al.，Nature(1989)341，544～546；Ward，E.S.et al.FASEB J.(1992)6，2422～2427)，使用araB启动子时，可以按照Better等的方法(Better，M.et al.Science(1988)240，1041～1043)。
作为为了抗体分泌的信号序列，在产生于大肠杆菌的周质间隙时，可以使用pelB信号序列(Lei，S.P.et al J.Bacteriol.(1987)169，4379～4383)。分离产生于周质间隙的抗体后，将抗体的结构适当地再折叠使用(例如，参照WO 96/30394)。
作为复制起点，可以使用来自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头状瘤病毒(BPV)等的物质，进一步，为了增加宿主细胞系中的基因复制数量，表达型载体，可以含有氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等作为选择标记。
为了制备本发明中使用的抗体，可以使用任意的生产系。对于另制造抗体的生产系，有体外和体内的生产系。作为体外的生产系，可以列举使用真核细胞的生产系或使用原核细胞的生产系。
使用真核细胞时，有使用动物细胞、植物细胞、或真菌细胞的生产系。作为动物细胞，已知(1)哺乳类细胞，例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾)、Hela、Vero等，(2)两栖类细胞，例如爪蟾卵细胞，或(3)昆虫细胞，例如sf9、sf21、Tn5等。作为植物细胞，已知来自烟草(Nicotiana tabacum)的细胞，可以将其进行愈伤组织培养。作为真菌细胞，已知酵母、例如酵母(Saccharomyces)属、例如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，丝状真菌、例如曲霉(Aspergillus)属、例如黑曲霉(Aspergillus niger)等。
使用原核细胞时，有使用细菌细胞的生产系。作为细菌细胞，已知大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌。
通过转化将目的抗体基因导入这些细胞中，通过在体外培养被转化的细胞可得到抗体。培养按公知的方法进行。例如，作为培养液，可以使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM，也可以并用胎牛血清(FCS)等的血清补液。另外，通过将导入了抗体基因的细胞移入动物的腹腔等，也可以在体内产生抗体。
另一方面，作为体内的生产系，可以列举使用动物的生产系或使用植物的生产系。使用动物时，有使用哺乳类动物、昆虫的生产系等。
作为哺乳动物，可以使用山羊、猪、绵羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser，SPECTRUM Biotechnology Applications，1993)。另外，作为昆虫，可以使用蚕。使用植物时，例如可以使用烟草。
在这些动物或植物中导入抗体基因，在动物或植物的体内使抗体产生，然后回收。例如，在编码山羊β酪蛋白那样的在乳汁中固有产生的蛋白质的基因中插入抗体基因作为融合基因进行制备。将含有插入了抗体基因的融合基因的DNA片断注入山羊的胚胎中，将该胚胎导入母山羊体内。从容纳该胚胎的山羊生出的转基因山羊或其子孙产生的乳汁中可得到所期望的抗体。为了增加由转基因山羊产生的含有期望抗体的乳汁量，也可以对转基因山羊使用适宜的激素。(Ebert，K.M.et al.，Bio/Technology(1994)12，699～702)。
另外，使用蚕时，可使蚕感染插入了目的抗体基因的杆状病毒，通过该蚕的体液得到期望的抗体(Maeda，S.et al.，Nature(1985)315，592～594)。另外，使用烟草时，在植物表达用载体、例如pMON 530中插入目的抗体基因，在根癌病菌样的细菌中导入该载体。使烟、例如烟草感染该细菌，通过该烟叶可得到期望的抗体(Julian，K.-C.Ma et al.，Eur.J.Immunol.(1994)24，131～138)。
如上所述，在用体外或体内的生产系产生抗体时，可以将编码抗体重链(H链)或轻链(L链)的DNA分别整合入表达型载体中、同时转化宿主，或者也可以将编码H链和L链的DNA整合入单一的表达型载体中、使宿主转化(参照国际专利申请公开号WO 94-11523)。
本发明中使用的抗体，只要适于使用在本发明中，也可以是抗体的片断或其修饰物。例如，作为抗体的片断，可以列举Fab、F(ab′)2、Fv或H链和L链的Fv用适当的连接物连结而成的单链Fv(scFv)。
具体地说，抗体用酶、例如木瓜酶、胃蛋白酶处理生成抗体片断，或者，构建编码这些抗体片断的基因、将其导入表达型载体中后，在适当的宿主细胞中表达(例如，参照Co，M.S.et al.，J.Immunol.(1994)152，2968～2976、Better，M.& Horwitz，A.H.Methods in Enzymology(1989)178，476～496、Plueckthun，A.& Skerra，A.Methods in Enzymology(1989)178，476～496、Lamoyi，E.，Methods in Enzymology(1989)121，652～663、Rousseaux，J.et al.，Methods in Enzymology(1989)121，663～669、Bird，R.E.et al.，TIBTECH(1991)9，132～137)。
scFv可以通过连结抗体的H链V区域和L链V区域得到。该scFv中，H链V区域和L链V区域通过连接物、优选通过肽连接物连结(Huston，J.S.et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，5879～5883)。scFv中H链V区域和L链V区域可以是来自上述记载的抗体的任一种。作为连结V区域的肽连接物，可以使用例如由12～19个氨基酸残基组成的任意的单链肽。
编码scFv的DNA，可以通过将编码上述抗体的H链或H链V区域的DNA、以及编码L链或L链V区域的DNA作为模板，使用规定其两端的引物对，通过PCR法将这些序列中编码期望的氨基酸序列的DNA部分扩增，然后，进一步组合引物对并扩增得到，该引物规定编码肽连接物部分的DNA并使其两端分别连结H链、L链。另外，一旦制备编码scFv的DNA、则可以按照常规方法得到含有它们的表达型载体和该表达型载体转化的宿主，另外，使用该宿主按照常规方法，可以得到scFv。
这些抗体的片断，可以与上述相同，取得它的基因并使之表达、通过宿主产生。本申请权利要求范围内所说的“抗体”中也包含这些抗体的片断。
作为抗体的修饰物，可以使用和聚乙二醇(PEG)等各种分子结合的抗体。本申请权利要求范围内所说的“抗体”中也包含了这些抗体的片断。为了得到这种抗体修饰物，可通过对得到的抗体进行化学修饰得到。这些方法在该领域已经被确立。
如上所述生产、表达的抗体可以从细胞内外、宿主分离纯化至均一。本发明中使用的抗体的分离、纯化可以用亲和层析进行。作为亲和层析中使用的层析柱，可以列举例如蛋白质A柱、蛋白质G柱。作为蛋白质A柱中使用的载体，可以列举例如Hyper D、POROS、Sepharose F.F.等。此外，可以使用在通常的蛋白质中使用的分离、纯化方法，没有什么限制。
例如，若适当选择、组合除上述亲和层析以外的色谱法、过滤、超滤、盐析、透析等，可以分离、纯化本发明中使用的抗体。作为色谱法，可以列举例如离子交换色谱法、疏水色谱法、凝胶过滤等。这些色谱法适用于HPLC(高效液相色谱)。另外，也可以使用反相HPLC(反相HPLC)。
上述所得抗体的浓度测定可以通过吸光度的测定或ELISA等进行。即，用吸光度的测定时，用PBS(-)适当稀释后、测定280nm的吸光度、1mg/ml相当于1.35OD、算出浓度。另外，用ELISA时，可以如下进行测定。即，将用0.1M碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)稀释至1μg/ml的山羊抗人IgG(TAGO制)100μl加入96孔板(Nunc制)中，在4℃下温育1夜、固定化抗体。封闭后、添加适当稀释的本发明中使用的抗体或含有抗体的样品、或作为标准品的人IgG(CAPPEL制)100μl、室温下温育1小时。
洗涤后，加入稀释了5000倍的碱性磷酸酯酶标记的抗人IgG(BIOSOURCE制)100μl，在室温下温育1小时。洗涤后，加入底物溶液温育后、用MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad制)测定405nm的吸光度，算出目的抗体的浓度。
本发明中使用的IL-6变异体，具有和IL-6受体的结合活性、且为不传递IL-6的生物学活性的物质。即，虽然IL-6变异体相对于IL-6受体与IL-6竞争结合，但是由于不传递IL-6的生物学活性，故将阻断IL-6产生的信号传递。
IL-6变异体是通过置换IL-6的氨基酸序列的氨基酸残基、引入变异而制备的。虽然不管作为IL-6变异体原料的IL-6的由来，但是若考虑到抗原性等、优选人IL-6。
具体地说，IL-6的氨基酸序列可以使用已知的分子模型程序、例如WHATIF(Vriend et al.，J.Mol.Graphics(1990)8，52～56)来预测其二次结构，通过进一步评价被置换的氨基酸残基对总体的影响来进行。决定适当的置换氨基酸残基后、以含有编码人IL-6基因的碱基序列的载体作为模板，按照通常使用的PCR法引入变异使氨基酸被置换，可以得到编码IL-6变异体的基因。按照需要，将其整合入适当的表达型载体中、按照上述重组型抗体的表达、产生及纯化方法可以得到IL-6变异体。
作为IL-6变异体的具体实例，在Brakenhoff et al.，J.Biol.Chem.(1994)269，86～93、及Savino et al.，EMBO J.(1994)13，1357～1367、WO 96-18648、WO 96-17869中有公开。
本发明中使用的IL-6部分肽或IL-6受体部分肽，具有和各自IL-6受体或IL-6的结合活性，且为不传递IL-6生物学活性的物质。即，IL-6部分肽或IL-6受体部分肽与IL-6受体或IL-6结合，通过捕捉它们可特异地阻碍IL-6与IL-6受体的结合。其结果表明，由于不传递IL-6的生物学活性，因此将阻断IL-6产生的信号传递。
IL-6部分肽或IL-6受体部分肽是由在IL-6或IL-6受体的氨基酸序列中与IL-6和IL-6受体的结合相关区域的一部分或全部的氨基酸序列组成的肽。这种肽通常由10～80、优选为20～50、更优选为20～40个氨基酸残基组成。
IL-6部分肽或IL-6受体部分肽，可通过在IL-6或IL-6受体的氨基酸序列中特定与IL-6和IL-6受体的结合相关的区域，将其一部分或全部的氨基酸序列用通常已知的方法、例如基因工程方法或肽合成法来制备。
通过基因工程方法制备IL-6部分肽或IL-6受体部分肽时，可将编码期望的肽的DNA序列整合入表达型载体中，按照上述重组型抗体的表达、产生及纯化方法可以得到。
通过肽合成法制备IL-6部分肽或IL-6受体部分肽时，可以使用在肽合成中通常用的方法、例如固相合成法或液相合成法。
具体地说，也可以按照续药品的开发第14卷肽合成监修矢岛治明广川书店1991年中记载的方法进行。作为固相合成法，可以使用使与要合成的肽的C末端对应的氨基酸与例如在有机溶剂中不溶性的支撑体结合，通过交互重复进行将用适当的保护基团保护了α-氨基及侧链官能团的氨基酸按从C末端到N末端方向的顺序逐一缩合氨基酸的反应、和使树脂上结合的氨基酸或肽的α-氨基的保护基团脱离的反应，使肽链延长的方法。固相肽合成法根据使用的保护基团种类，可大致分为Boc法和Fmoc法。
这样合成目的肽后，进行脱保护反应以及将肽链从支撑体切断的反应。与肽链的切断反应中，在Boc法中可以通常使用氟化氢或三氟甲磺酸、而Fmoc法中可以使用TFA。在Boc法中，例如在氟化氢中，在苯甲醚存在的情况下处理上述保护肽树脂。然后，进行保护基团的脱离和支撑体的切断、回收肽。通过将其冻结干燥、可以得到粗肽。另一方面，在Fmoc法中，例如在TFA中可以进行与上述相同的操作，进行脱保护反应以及从肽链切断支撑体的反应。
得到的粗肽，由于适用于HPLC，可以进行分离、纯化。洗脱时，可以使用在蛋白质的纯化中通常使用的水-乙腈系溶剂在最适条件下进行。分别取得相当于所得色谱法的曲线峰的馏分、将其冷冻干燥。对于这样纯化的肽馏分、通过根据质谱分析的分子量解析、氨基酸组成分析、或氨基酸序列解析等来鉴定。
IL-6部分肽及IL-6受体部分肽的具体实例，在特开平2-188600、特开平7-324097、特开平8-311098及美国专利公报US 5210075中公开。
本发明中使用的IL-6拮抗剂的IL-6信号传递阻碍活性，可以用通常使用的方法评价。具体地说，培养IL-6依赖性细胞MH60.BSF2，向其中加入IL-6、同时使IL-6拮抗剂共存，由此可以测定IL-6依赖性细胞的3H-胸苷的摄取。另外，培养IL-6受体表达细胞U266、加入125I标记的IL-6，同时加入IL-6拮抗剂，由此测定与IL-6受体表达细胞结合的125I标记的IL-6。在上述分析体系中，如果除了使IL-6拮抗剂存在的组以外、还准备不含IL-6拮抗剂的阴性对照组，比较两者得到的结果可以评价IL-6拮抗剂的IL-6抑制活性。
确认本发明的效果时，可以通过例如在移植CD4+CD45RBhigh T细胞、产生类似牛皮癣病变的动物中给与本发明中使用的IL-6拮抗剂，观察皮肤组织，评价牛皮癣类似病变的改善来进行。
为诱导牛皮癣类似病变的CD4+CD45RBhigh T细胞例如可以通过F2(BALB/c×129/SvJ)小鼠脾脏来制备，可以按照下述实施例中记载的方法进行。另外，作为诱导牛皮癣类似病变的动物，可以使用例如小鼠等、优选SCID小鼠等。
如下述实施例所示，通过给与抗IL-6受体抗体，在产生牛皮癣症状的实验动物中，可以确认牛皮癣类似病变的改善、显示出抗IL-6受体抗体等的IL-6拮抗剂具有牛皮癣治疗效果。
本发明中治疗对象为哺乳动物。治疗对象的哺乳动物优选为人。
本发明的预防或治疗剂，可以口服或非口服地在全身或局部给药。例如，可以选择点滴等静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、栓剂、灌肠、口服性肠溶剂等，根据患者的年龄、症状来选择适当的给药方法。有效给药量，每次在1kg体重0.01mg～100mg的范围内选择。或者，也可以选择给每个患者1～1000mg、优选5～50mg的给药量。
本发明的预防或治疗剂，也可以同时含有在给药路径下药物所容许的载体或添加物。作为这种载体及添加物的例子，可以列举水、药物中容许的有机溶剂、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、明胶、琼脂、一缩二丙二醇、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂酰醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、作为药品添加物容许的表面活性剂等。使用的添加物，按照剂型可以从上述中适宜选择或组合使用，但不限于这些。
实施例
以下，通过实施例、参考例及实验例对本发明进行具体地说明，但本发明并不仅限于这些例子。
实施例
方法
按照Schon MP等(Nature Medicine(1997)3，183～188)的方法，将BALB/c小鼠脾脏细胞溶血后、用MACS柱及FACS Vantage，制备CD4+CD45RBhigh T细胞，按4.0×105细胞/只i.p.移植入C.B-17 scid小鼠中。
细胞移植15分钟后按2mg/只i.p.给药抗IL-6受体抗体(MR16-1)。在阴性和阳性对照组(非细胞移植组和细胞移植组)中给与PBS。然后，在1mg/只/周下进行MR16-1给药、从细胞移植后经过约8周后对小鼠施行安乐死、取其耳朵用福尔马林固定。按照规定方法，制备病理组织，HE染色后，观察耳的皮肤组织，按照下述标准进行牛皮癣类似病变的等级判定。
-：正常、
±：稍微看出表皮肥厚、
+：看出表皮肥厚、
++：显著看出表皮肥厚。
统计分析是通过SAS、进行Wilcoxson的定序和检测、统计学显著水平为5％。
结果
如表1所示，通过移植细胞可以看到有意地牛皮癣类似病变等级上升、表示实验系统确立。通过向细胞移植组中给与抗IL-6受体抗体MR16-1，可以确认能有意地改善牛皮癣类似病变等级。由此显示，抗IL-6受体抗体成为新型牛皮癣治疗药的可能性。
                                            表1
                                      病理组织评价
    组        牛皮癣类似病变等级   Wilcoxson定序和检测
    -     ±     +    ++
非细胞移植组(n＝8)     7     1     0     0
细胞移植组(n＝7) 2 0 2 3  P＝0.0126、非VS细胞移植组
细胞移植+MR16-1给药组(n＝5) 5 0 0 0  P＝0.0221、VS细胞移植组
参考例1. 人可溶性IL-6受体的制备
使用含有编码按Yamasaki等的方法(Yamasaki，K.et al.，Science(1988)241，825～828)得到的IL-6受体的cDNA的质粒pBSF2R.236，通过PCR法制备可溶性IL-6受体。用限制酶Sph I消化质粒pBSF2R.236，得到IL-6受体cDNA、将其插入mp18(Amersham制)中。使用设计为以便在IL-6受体cDNA中导入终止密码子的合成寡引物，通过体外突变形成系统(Amersham制)、用PCR法在IL-6受体cDNA中导入变异。通过该操作终止密码子被导入氨基酸345的位置，可得到编码可溶性IL-6受体的cDNA。
为了在CHO细胞中表达可溶性IL-6受体，使其与质粒pSV(Pharmacia制)连结，得到质粒pSVL344。在含有dhfr的cDNA的质粒pECEdhfr中插入用Hind III-SalI切断的可溶性IL-6受体cDNA，得到CHO细胞表达质粒pECEdhfr344。
通过磷酸钙沉淀法(Chen，C.et al.，Mol.Cell.Biol.(1987)7，2745～2751)向dhfr-CHO细胞株DXB-11(Urlaub，G.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77，4216～4220)转染10μg的质粒pECEdhfr344。将转染的CHO细胞用含有1mM谷氨酰胺、10％透析FCS、100U/ml青霉素和100μ/ml链霉素的不含核苷的αMEM选择培养液培养3周。
被选择的CHO细胞用极限稀释法筛选，得到单一的CHO细胞克隆。用20nM～200nM浓度的氨基喋呤扩增该CHO细胞克隆，得到产生人可溶性IL-6受体的CHO细胞株5E27。用含有5％FBS的伊斯考夫改良的杜尔贝科培养基(IMDM、Gibco制)培养CHO细胞株5E27。回收培养上清液，用ELISA测定培养上清液中的可溶性IL-6受体的浓度。其结果表明，可以确认在培养上清液中存在可溶性IL-6受体。
参考例2. 抗人IL-6抗体的制备
用10μg的重组型IL-6(Hirano，T.et al.，Immunol.Lett.(1988)17，41)和弗氏完全佐剂一起免疫BALB/c小鼠，每周连续进行免疫至血清中能检出抗IL-6抗体为止。从局部淋巴节中取出免疫细胞，用聚乙二醇1500使其与骨髓瘤细胞株P3U1融合。按照使用HAT培养液的Oi等的方法(Selective Methods in Cellular Immunology，W.H.Freeman and Co.，SanFrancisco，351，1980)选择杂交瘤，建立产生抗人IL-6抗体的杂交瘤。
产生抗人IL-6抗体的杂交瘤如下所示进行IL-6结合分析。即，将柔软的聚乙烯制的96孔板(Dynatech Laboratories，Inc.制，Alexandria，VA)在0.1M的碳酸氢盐碳酸盐缓冲溶液(pH9.6)中用100μl的山羊抗小鼠Ig(10μg/ml，Cooper Biomedical，Inc制Malvern，PA)在4℃下包被一夜。然后，将板用含有100μl的1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS在室温下处理2小时。
将其用PBS洗涤后，在各孔中加入100μl的杂交瘤培养上清液、在4℃下温育一夜。洗涤该板后、在各孔中加入125I标记的重组型IL-6使其达到2000cpm/0.5ng/孔，洗涤后用γ计数器(Beckman Gamma 9000，Beckman Instruments，Fullerton，CA)测定各孔的放射活性。通过IL-6结合分析，216杂交瘤克隆中32个杂交瘤克隆为阳性。在这些克隆中可得到最终稳定的MH166.BSF2。该杂交瘤产生的抗IL-6抗体MH166具有IgG1κ型的亚型。
然后，使用IL-6依赖性小鼠杂交瘤克隆MH60.BSF2调查与MH166抗体导致的杂交瘤增殖相关的中和活性。将MH60.BSF2细胞分别注入小孔中达到1×104/200μl/孔，向其中加入含有MH166抗体的试样，培养48小时，加入0.5μCi/孔的3H胸苷(New England Nuclear，Boston，MA)后，进而连续培养6小时。将细胞放置在玻璃滤纸上，用自动采集机(LaboMash Science Co.，Tokyo，Japan)处理。作为对照使用兔抗IL-6抗体。
其结果，MH166抗体剂量依赖性地阻碍被IL-6诱导的MH60.BSF2细胞的3H胸苷的摄取。由此可知，MH166抗体中和IL-6的活性。
参考例3. 抗人IL-6受体抗体的制备
使按Hirata等的方法(Hirata，Y.et al.J.Immunol.(1989)143，2900～2906)制备的抗IL-6受体抗体MT18与通过CNBr活化的琼脂糖4B(Pharmacia Fine Chemicals制，Piscataway，NJ)按照附上的配方结合，纯化IL-6受体(Yamasaki，K.et al.，Science(1988)241，825～828)。将人骨髓瘤细胞株U266用含有1％毛地黄皂苷(Wako Chemicals制)、10mM三乙醇胺(pH7.8)及0.15M NaCl的1mM对氨基苯基甲磺酰氟盐酸盐(Wako Chemicals制)(毛地黄皂苷缓冲液)裂解，和与琼脂糖4B珠结合的MT18抗体混合。然后，将该珠用毛地黄皂苷缓冲液洗涤6次、作为用于免疫的部分纯化IL-6受体。
用由3×109个U266细胞得到的上述部分纯化IL-6受体每10天免疫BALB/c小鼠4次，然后用常规方法制备杂交瘤。用下述方法调查来自阳性孔的杂交瘤培养上清液对IL-6受体的结合活性。用35S-蛋氨酸(2.5mCi)标记的5×107个U266细胞，用上述毛地黄皂苷缓冲液使之溶化。将可裂解的U266细胞和0.04ml容量的与琼脂糖4B殊结合的MT18抗体混合，然后，用毛地黄皂苷缓冲液洗涤6次，使用0.25ml毛地黄皂苷缓冲液(pH3.4)使35S-蛋氨酸标记的的IL-6受体洗脱，用0.025ml的1M Tris(pH7.4)中和。
将0.05ml的杂交瘤培养上清液和0.01ml的蛋白G琼脂糖(Phramacia制)混合。洗涤后，将琼脂糖和上述制备的0.005ml35S标记的IL-6受体溶液一起温育。用SDS-PAGE分析免疫沉降物，研究与IL-6受体反应的杂交瘤培养上清液。其结果确立了反应阳性杂交瘤克隆PM-1。产生于杂交瘤PM-1的抗体具有IgG1κ型的亚型。
用人骨髓瘤细胞株U266研究杂交瘤PM-1产生的抗体相对于人IL-6受体的IL-6的结合抑制活性。人重组型IL-6用大肠杆菌制备(Hirano，T.et al.，Immunol.Lett.(1988)17，41～45)、用Bolton-Hunter试剂(NewEngl and Nuclear，Boston，MA)进行125I标记的(Taga，T.et al.，J.Exp.Med.(1987)166，967～981)。
将4×105个U266细胞与70％(v/v)杂交瘤PM-1的培养上清液和14000cpm的125I标记的IL-6一起培养一小时。将70μl样品铺到400μl的微植菌聚乙烯管中的300μl的FCS上，离心后，测定细胞上的放射活性。
结果表明，杂交瘤PM-1产生的抗体抑制IL-6与IL-6受体的结合。
参考例4. 抗小鼠IL-6受体抗体的制备
通过Saito，T.et al.，J.Immunol.(1991)147，168～173记载的方法，制备对小鼠IL-6受体的单克隆抗体。
在含有10％FCS的IMDM培养液中培养产生小鼠可溶性IL-6受体的CHO细胞，从其培养上清液使用将抗小鼠IL-6受体抗体RS12(参照上述Saito，T.et al)固定于Affigel 10凝胶(Biorad制)的亲和性色谱柱纯化小鼠可溶性IL-6受体。
混合得到的小鼠可溶性IL-6受体50μg和弗氏完全佐剂，向ウイスタ一大鼠的腹部注射。2周后开始用弗氏不完全佐剂追加免疫。第45天采集大鼠脾脏细胞，使2×108个脾脏细胞按照常规方法与1×107个小鼠骨髓瘤细胞P3U1和50％的PEG1500(Boehringer Mannheim制)细胞融合后，在HAT培养基中筛选杂交瘤。
在包被了兔抗大鼠IgG抗体(Cappel制)的板上加入杂交瘤培养上清液后，使小鼠可溶性IL-6受体反应。然后，通过使用兔抗小鼠IL-6受体抗体和碱性磷酸酯酶标记的的绵羊抗兔IgG的ELISA法筛选对于小鼠可溶性IL-6受体产生抗体的杂交瘤。对已确认产生抗体的杂交瘤克隆进行2次亚筛选，得到单一的杂交瘤克隆。此克隆被命名为MR16-1。
用MH60.BSF2细胞(Matsuda，T.et al.，J.Immunol.(1988)18，951～956)用3H胸苷的摄取研究该杂交瘤产生的抗体在小鼠IL-6的信息传递中的中和活性。在96孔板上制备MH60.BSF2细胞至1×104个/200μl/孔。在该板上加入10pg/ml的小鼠IL-6和MR16-1抗体或RS12抗体12.3～1000ng/ml，在37℃、5％CO2下培养44小时后，加入1μCi/孔的3H胸苷。4小时后测定3H胸苷的摄取。结果表明，MR16-1抗体抑制MH60.BSF2细胞的3H胸苷摄取。
因此表明，杂交瘤MR16-1产生的抗体，能阻碍IL-6与IL-6抗体的结合。
工业上的可利用性
根据本发明，显示了抗IL-6受体抗体等的IL-6拮抗剂具有牛皮癣的治疗效果。因此，可以明确IL-6拮抗剂作为牛皮癣等的治疗剂是有用的。
对第13条规则的2中规定的被保藏微生物的说明国际保藏单位
名称：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心
地址：
Figure A0181784800271
305-5466日本茨城县つくば市东1段1号1中央第6保藏日及保藏号(1)保藏微生物的名称：HB101-pIBIBSF2R
保藏日：1989年1月9日
保藏号：FERM BP-2232(2)保藏微生物的名称：PM1
保藏日：1989年7月12日
保藏号：FERM BP-2998(3)保藏微生物的名称：大鼠-小鼠杂交馏MR16-1
保藏日：1997年3月13日
保藏号：FERM BP-5875

Claims (30)

1.一种牛皮癣的预防或治疗剂，其中含有白细胞介素-6(IL-6)拮抗剂作为有效成分。
2.如权利要求1记载的预防或治疗剂，其中IL-6拮抗剂是对于IL-6受体的抗体。
3.如权利要求2记载的预防或治疗剂，其中对IL-6受体的抗体为对IL-6受体的单克隆体抗体。
4.如权利要求3记载的预防或治疗剂，其中对IL-6受体的抗体为对人IL-6受体的单克隆抗体。
5.如权利要求3记载的预防或治疗剂，其中对IL-6受体的抗体为对小鼠IL-6受体的单克隆抗体。
6.如权利要求2～5的任一项记载的预防或治疗剂，其中对IL-6受体的抗体为重组型抗体。
7.如权利要求4记载的预防或治疗剂，其中对人IL-6受体的单克隆抗体为PM-1抗体。
8.如权利要求5记载的预防或治疗剂，其中对小鼠IL-6受体的单克隆抗体为MR16-1抗体。
9.如权利要求2～4的任一项记载的预防或治疗剂，其中对IL-6受体的抗体为对IL-6受体的嵌合抗体或人源化抗体。
10.如权利要求9记载的预防或治疗剂，其中对IL-6受体的人源化抗体为人源化PM-1抗体。
11.一种白细胞介素-6(IL-6)拮抗剂的用途，用于制备牛皮癣的预防或治疗剂。
12.如权利要求11记载的用途，其中IL-6拮抗剂为对IL-6受体的抗体。
13.如权利要求12记载的用途，其中对IL-6受体的抗体为对IL-6受体的单克隆体抗体。
14.如权利要求13记载的用途，其中对IL-6受体的抗体为对人IL-6受体的单克隆抗体。
15.如权利要求13记载的用途，其中对IL-6受体的抗体为对小鼠IL-6受体的单克隆抗体。
16.如权利要求12～15的任一项记载的用途，其中对IL-6受体的抗体为重组型抗体。
17.如权利要求14记载的用途，其中对人IL-6受体的单克隆抗体为PM-1抗体。
18.如权利要求15记载的用途，其中对小鼠IL-6受体的单克隆抗体为MR16-1抗体。
19.如权利要求12～14的任一项记载的用途，其中对IL-6受体的抗体为对IL-6受体的嵌合抗体或人源化抗体。
20.如权利要求19记载的用途，其中对IL-6受体的人源化抗体为人源化PM-1抗体。
21.一种牛皮癣的预防或治疗方法，包括向对象给与白细胞介素-6(IL-6)拮抗剂。
22.如权利要求21记载的方法，其中IL-6拮抗剂是对IL-6受体的抗体。
23.如权利要求22记载的方法，其中对IL-6受体的抗体为对IL-6受体的单克隆体抗体。
24.如权利要求23记载的方法，其中对IL-6受体的抗体为对人IL-6受体的单克隆抗体。
25.如权利要求23记载的方法，其中对IL-6受体的抗体为对小鼠IL-6受体的单克隆抗体。
26.如权利要求22～25的任一项记载的方法，其中对IL-6受体的抗体为重组型抗体。
27.如权利要求24记载的方法，其中对人IL-6受体的单克隆抗体为PM-1抗体。
28.如权利要求25记载的方法，其中对小鼠IL-6受体的单克隆抗体为MR16-1抗体。
29.如权利要求22～24的任一项记载的方法，其中对IL-6受体的抗体为对IL-6受体的嵌合抗体或人源化抗体。
30.如权利要求29记载的方法，其中对IL-6受体的人源化抗体为人源化PM-1抗体。
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