JPH0429997A - ヒトｇｐ１３０蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、Ｉ　Ｌ−６のシグナル伝達に関与する蛋白質
であるヒトｇｌ）１３０蛋白質、該蛋白質をコードする
ＤＮＡ、さらには該蛋白質を遺伝子工学的に生産するた
めの手段および方法に関するものである。

〔従来の技術〕

ＩＬ−６は、免疫、造血、炎症という生体防御系におい
て重要な役割を果たしていることをコードする、生体の
増殖分化に広く関与する蛋白質である（岸本、Ｂｌｏｏ
ｄ、　７４．　ｐ　ｌ　、　１９８９年参照）。さらに
ＩＬ−６の異常産生が種々の自己免疫疾患の病因因子で
ある可能性が報告されている（岸本、平野、Ａｎｎ、Ｒ
ｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　　６．　ｐ４８５＋　１９
８８年参照）。

本発明者はヒトＩＬ−６と特異的に結合する細胞膜上の
ヒト　Ｉ　Ｌ−６レセプタ−の遺伝子を単離し、−次構
造を決定した（特願昭６３−１９４８８５号明細書参照
）。次にマウスＩ　Ｌ−６と特異的に結合する細胞膜上
のマウスＩ　Ｌ−６レセプタ−の遺伝子を単離し、−次
構造を決定した（特願平１２９２２３０明細書参照）。

またヒトＩＬ−６レセプタ−遺伝子を出発材料として、
治療薬、診断薬として期待される、可溶性Ｉ　Ｌ−６レ
セプタ−（ＩＬ６レセプタ−の細胞外部分）を作製した
（特願平１−９７７４号明細書参照）。

〔発明が解決しようとする課題〕

生体内で生理活性を強く発揮するＩＬ−６の作用を人為
的に調節することは、各種疾患の新しい治療のメカニズ
ムとして期待されている。ＩＬ６の作用を増強あるいは
阻害する治療薬を開発するためには、Ｉ　Ｌ−６のシグ
ナル伝達の経路に関する知見が重要である。

本発明者は、Ｉ　Ｌ−６のシグナル伝達の機作を種々研
究した結果、ＩＩ、−６及びＩ　１．、−６レセプタ−
のほかに、第三の因子としてＩＬ−６のシグナル伝達に
関与する蛋白質が存在することを見出し、これがおよそ
１３０ｋｂの見かけ分子量を有することからヒトｇｐ１
３０と命名した。ＩＩ、−６のシグナル伝達をさらに解
析するためには、あるいは可溶性ｇｐ１３０　（ｇｐ１
３０蛋白質の細胞外部分）をＩＬ６の阻害剤として開発
するためには、大量の可溶性ｇｐ１３ｏ精製品を得る必
要があるが、ｇｐ１３０の生体内での生産量は極めて微
量である。ｇｐ１３０を遺伝子工学を用いて大量に生産
するにはｇｐ１３０をコードするＤＮＡ配列が必須であ
る。

従って、本発明はヒトｇｐ１３０　、及びそれをコード
するＤＮＡ、並びに該ＤＮＡを用いるｇｐ１３０の製造
方法を提供しようとするものである。

［課題を解決するための手段］ 本発明者は、ＩＬ−６のシグナル伝達について鋭意研究
を行った結果、ＩＬ−６のシグナル伝達に関与する細胞
膜上の蛋白質を発見した。さらに、細胞膜上のＩ　Ｌ−
６レセプタ−が、ＩＬ−６と結合することによりこの膜
蛋白質と結合すること、および、この膜蛋白質がＩＬ−
６のシグナル伝達を担っており、ＩＬ−６レセプタ−の
細胞内領域はＩＬ−６のシグナル伝達には関与しないこ
とを証明した。

本発明者はさらに、ヒトｇｐ１３０をコードするＤＮＡ
をクローニングすることに成功し、そしてその塩基配列
を決定した。

本発明は上記の成果を基礎とするものであって、ＩＬ−
６のシグナル伝達に関与するｇｐ１３０　　；ヒトｇｐ
１３０をコードするＤＮＡ配列；組換微生物または培養
細胞中で前記ＤＮＡ配列を発現し得る複製可能な発現ベ
クター；前記発現ベクターにより形質転換された微生物
または培養細胞；及び前記微生物または培養細胞におい
てｇｐ１３０をコードするＤＮＡ配列を発現させること
をコードするヒトｇｐ１３０の生産方法、を提供するも
のであり、以下詳細に説明する。

〔具体的な説明］ １、　　ｇｐ１３０蛋白質 本発明のＩＬ−６のシグナル伝達に関与する細胞膜由来
の蛋白質、すなわちヒト　ｇｐ１３０は、ＩＬ６がＩＬ
−６レセプタ−と結合して最終的に種々の細胞に増殖分
化等の生物活性を発揮させる際に重要な働きを担ってお
り、天然状態においては細胞膜に局在している蛋白質で
ある。ここで、Ｉ　Ｌ−６とは生体内で作られたＩ　Ｌ
−６、遺伝子工学的に作られたＩ　Ｌ−６、およびその
誘導体等を例示することができる。またＩ　Ｌ−６レセ
プタ−とは、生体内で、あるいは遺伝子工学的に作られ
た細胞膜上に存在、あるいは細胞膜から離脱した可溶性
のＩ　Ｉ、−６レセプタ−、およびその誘導体等を例示
することができる。

上記蛋白質は次の性質： （１）ＩＬ−６（インタ−ロイキン−６）とＩ　Ｌ−６
レセプタ−（インタ−ロイキン−６レセプタ−）との複
合体と結合し； （２）ＩＬ−６単独又はＩＬ−６レセプタ−単独とは結
合せず；そして （３）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動におい
て１３０ｋＤａの見かけの分子量を示す；を有する、Ｉ
Ｌ−６のシグナル伝達に関与する蛋白質であって、その
天然の形態においては第５図中１位のＭｅｔから９１８
位のＧｉｎまでのアミノ酸配列を有する。本発明では前
記アミノ酸配列を有する蛋白質の他、前記アミノ酸配列
中の、ＩＬ−６とＩ　Ｌ−６レセプタ−の複合体への特
異的な結合に寄与する部分を含有する蛋白質またはポリ
ペプチドであれば良い。すなわち前記アミノ酸配列中の
１個または複数個のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に
より置換されているかまたは欠失もしくは付加されてい
るアミノ酸配列を有し、がっＩＬ６とＩ　Ｌ−６レセプ
タ−の複合体と特異的に結合する能力を保持している蛋
白質またはポリペプチドはすべて本発明のｇｐ１３０の
範囲に含まれる。

例えば、このような蛋白質として、前記アミノ酸配列中
のＩ　Ｌ−６とＩ　Ｌ−６レセプタ−の複合体との結合
に寄与するアミノ酸配列および／またはアミノ酸残基部
分以外のアミノ酸配列および／またはアミノ酸残基が置
換、欠損、挿入等により変化したもの、さらには前記ア
ミノ酸配列のＮ末端側および／またはＣ末端側にアミノ
酸配列および／またはアミノ酸残基が追加された蛋白質
、あるいは例えばヒト成長ホルモン等の他の蛋白質等が
融合したものであっても良い。

式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列は９１８アミノ酸残基
からなり、Ｎ末端側から第２番目に位置すルロイシンか
ら第２２番目に位置するグリシンにかけてと、第６２０
番目に位置するアラニンがら第６４１番目に位置するフ
ェニルアラニンにかけての部分に疎水性アミノ酸残基が
位置している。この２つの疎水性領域は、前者がシグナ
ルペプチド領域、後者が膜貫通領域であると考えられる
。

２、ＤＮＡ配列 本発明のヒトｇｐ１３０蛋白質をコードするＤＮＡは、
例えば第５図中、１位のＭｅｔから９１８位のＧｌｎま
でのアミノ酸配列をコードするものであり、これを代表
するｃＤＮＡの場合、第５図中の２７３位のＡから３０
２６位のＧまでの塩基配列を有する。本発明のＤＮＡ配
列は、上記のＤＮＡ配列の他、このＤＮＡ配列中の１個
または複数個のヌクレオシドが他のヌクレオシドにより
置換されているかまたは欠失もしくは付加されているＤ
ＮＡ配列を有し、かつＩ　Ｌ−６とＩＬ−６レセプタ−
の複合体と特異的に結合する能力を有する蛋白質をコー
ドしているＤＮＡ配列をも含有する。例えば、前記１に
おいて記載した種々のアミノ酸配列を有する蛋白質をコ
ードするＤＮＡ配列があげられる。

３、　　ｇｐ１３ｏ蛋白質の製造方法 本発明のＩＬ−６のシグナル伝達に関与する細胞膜由来
の蛋白質は、第一の方法として、この蛋白質を産生ずる
動物細胞から製造することができる。この様な細胞とし
ては、Ｉ　Ｌ−６レセプタ−を産生ずる細胞、例えばヒ
トミエローマ細胞Ｕ２６６、マウス白血病細胞株Ｍ１、
ヒｌ−Ｂ細胞株Ｃ１４等が挙げられる。さらに、本発明
のＩ　Ｌ−６のシグナル伝達に関与する蛋白質は、Ｉ　
Ｌ−６レセプタ−を産生しない細胞によっても生産され
ており、このような細胞としてマウスＢ細胞株Ｍ１２、
ヒトＴ細胞株Ｊｕｒｋａｔ、マウスＴ細胞株ＣＴＬＬ　
２等を挙げることができる。従って本発明のＩ　Ｌ−６
のシグナル伝達に関与する蛋白質は、これら種々の細胞
から得ることができる。

本発明の蛋白質は、前記のごとく、■Ｌ−６の存在下で
Ｉ　Ｌ−６レセプタ−と結合し、Ｉ　Ｌ−６の非存在下
ではＩ　Ｌ−６レセプタ−と結合しないから、この性質
を利用して単離することができる。

例えば、ＩＩ、−６レセプタ−及び本発明の蛋白質の両
者を産生ずる細胞から本発明の蛋白質を単離するには、
まず該生産細胞を培養し、この細胞を、人為的に加えた
ＩＬ−６と、生理的条件下で両者間の反応のために十分
な時間、例えばＲＰＭ１１６４０のごとき常用の培地中
で約３７°Ｃにて約３０分間インキュベートする。次に
細胞を常法に従って、例えば１％ジギトニンを含有する
トリエタノールアミン緩衝液で処理することにより溶解
し、Ｉ　Ｌ−６とＩ　Ｌ−６レセプタ−と本発明の蛋白
質とが結合した複合体を含有する細胞溶解物を得る。あ
るいは、細胞を常法に従って溶解した後にＩＬ〜６を添
加し、前記のごとくインキュベートして、前記の複合体
を含有する細胞溶解物を得る。他方、抗Ｉ　Ｌ−６レセ
ブタ一抗体、例えばＭＴ１８抗体（本明細書の参考例１
に従って製造される１なお、特願昭１９４８８５号明細
書を参照のこと）を固体キャリア、例えばセファロース
４Ｂと、ブロムシアン活性化法により固定化する。次に
、この固定化抗Ｉ　Ｌ−６レセプタ一抗体と前記の細胞
溶解物とを接触せしめることにより、Ｉ　Ｌ−６レセプ
タ−と抗−ＩＬ−６レセプタ一抗体との特異的反応を介
して、本発明の蛋白質を含有する複合体を前記面体キャ
リアーに固定する。次に、この固体キャリアーを洗浄し
て非特異的に結合又は付着している夾雑物を除去した後
、常用の手段、例えば尿素、グアニジン等により複合体
を固体キャリアーから溶出し、本発明の目的蛋白質をＩ
Ｌ−６レセプタ一含有蛋白質複合体から遊離せしめる。

こうして得られた溶液から本発明の目的蛋白質を単離・
精製するには、蛋白質の単離・精製されている常法、例
えば硫酸アンモニウムによる沈澱、カラムクロマトグラ
フィー、例えば逆相クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、電気泳動等を用いればよい。これら
の単離・精製過程における活性画分の選択は、Ｉ　Ｌ−
６の存在下でのＩＬ−６レセプタ−への結合、Ｉ　Ｌ−
６非存在下でのＩ　Ｌ−６レセプタ−への非結合性、分
子量が１３０ｋＤａであること等を指標として行うこと
ができる。

出発材料として、本発明の蛋白質を産生ずるがＩ　Ｌ−
６レセプタ−を産生じない細胞を使用する場合には、可
溶性ＩＬ−６レセプタ−及びＩＬ６の存在下でインキュ
ベートした後細胞を溶解して、ＩＬ−６／ＩＬ−６レセ
プタ−／目的蛋白質から成る複合体を含有する細胞溶解
物を調製する。

あるいは前記の本発明の蛋白質を産生ずる細胞を溶解し
た後にＩ　Ｌ−６及びＩ　Ｌ−６レセプタ−とのインキ
ュベーションを行い、最終的にＩ　Ｌ−６／ＩＩ、−６
レセプタ−／目的蛋白質から成る複合体を含有する細胞
溶解物を得ることができる。この細胞溶解物からの目的
蛋白質の単離・精製は前記のようにして行うことができ
る。

本発明のＩ　Ｌ−６のシグナル伝達に関与する蛋白質の
製造のための第二の方法は遺伝子組換による方法である
。この方法において、ＩＬ−６のシグナル伝達に関与す
る細胞膜上の蛍白質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
は種々の方法で得ることができる。例えば、該蛋白質を
発現している細胞、例えば、ヒトミエローマ細胞から常
法に従ってｃＤＮＡライブラリーを作成し、これを種々
の方法、例えば、該蛋白質を精製して決定した部分アミ
ノ酸配列に基づく方法や、ｃＤＮＡを発現させ該蛋白質
の性質、例えば、ＩＬ−６の結合したＩＬ−６レセプタ
−との特異的結合等により検出する方法等により選択す
ることができる。こうしてクローン化されたＤＮＡを常
法に従って発現せしめることにより、本発明の蛋白質を
製造することができる。

４、　　ｇｐ１３０蛋白質をコードするＤＮＡ上記の方
法に使用するＤＮＡは、例えば、ヒト胎盤から、公知な
方法で抽出した種々のメツセンジャーＲＮＡより、本発
明により提供される式（ＩＩ）ＤＮＡ配列をもとに作製
したプローブ等を用いて目的とするメツセンジャーＲＮ
Ａを抽出し、これをもとに作製しても良いし、また例え
ば一部あるいは全部を本発明をもとに化学的に合成して
も良い。

５、　発現ベクター 本発明で提供されるヒトｇｐ１３０をコードするＤＮＡ
配列を発現、すなわち生産し得る複製可能な発現ベクタ
ーは、前記２で説明されたようなりＮＡ配列を発現させ
得るＤＮＡ配列と読取り可能に結合しているｇｐ１３０
をコードするＤＮＡ配列および宿主中でベクターＤＮＡ
を複製するだめの複製オリジン等を有し、選定した宿主
を形質転換できるものであれば制限なく適宜選定して使
用できる。例えば宿主として大腸菌等の細胞株を用いる
場合は、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２７等のプラスミドが
例示できる。また例えば、宿主として哺乳動物等の培養
細胞を用いる場合には、ＳＶ４０ウィルス由来のＤＮＡ
複製オリジンを有するベクターが例示できる。

ＤＮＡ配列を発現させるためのＤＮＡ配列の中でも、プ
ロモーター系は重要であり、しかも選定した宿主との関
係において適宜選定する必要がある。宿主として大腸菌
を使用する場合のプロモーター系としては、乳糖プロモ
ーター系、トリプトファンプロモーター系、さらにはこ
れらのハイブリッドプロモーター系が例示できる。宿主
として哺乳動物由来の培養細胞を使用する場合のプロモ
ーター系としては、ＳＶ４０プロモーター系、アデノウ
ィルスプロモーター系、サイトメガロウィルス系が例示
できる。

６、　宿主 本発明では、特別の制限なしに通常の遺伝子工学的に蛋
白質を生産するために用いられる微生物または培養細胞
が使用できる。微生物としては、Ｋ−１２，Ｗ−３１１
０等の大腸菌類、枯草菌類、酵母等を例示できる。培養
細胞としては、ＣＯ８細胞（猿の腎臓繊維芽細胞）１．
ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスターの卵母細胞）、ミ
エローマ細胞等が例示できる。

前記５で説明したベクターにより形質転換された前記４
で説明された様な宿主を培養し、ベクターＤＮＡ中のヒ
トｇｐ１３０をコードするＤＮＡ配列を発現させること
でヒトｇｐ１３０を生産することができる。これはヒト
ｇｐ１３０をコードするＤＮＡ配列と結合した該ＤＮＡ
配列を発現させ得るＤＮＡ配列中のプロモーター系の活
性化により実現される。

上記の種々の方法により製造される本発明の蛋白質又は
該蛋白質を産生ずる細胞を免疫原として用いて、該蛋白
質に対するポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗
体を常法に従って調製することができる。これらの調製
法に用いる細胞源又は動物としてヒト、マウス、ウサギ
、ヒツジ、ヤギなど種々の生物種を例示することができ
る。

〔発明の効果〕

本発明により提供されるＩＬ−６のシグナル伝達に関与
する細胞膜由来の蛋白質は、ＩＬ−６のシグナル伝達機
作を解明するため、及びＩ　Ｌ−６作用を調節する治療
薬等の有用物質を開発するのに有用な試薬として使用す
ることができる。例えばＩ　Ｌ−６と結合したＩ　Ｌ−
６レセプタ−と特異的に結合してシグナルを伝達する性
質等を検出の指標として用いることにより、Ｉ　Ｌ−６
の作用を調節する物質をスクリーニングすることができ
る。

スクリーニングの対象となる物質としては、天然物質、
合成化合物、遺伝子工学的に生産されたＩ　Ｌ、−６あ
るいはＩ　Ｌ−６レセプタ−、及びその誘導体、さらに
はＩ　Ｌ−６、Ｉ　Ｌ−６レセプタ−該蛋白質の抗体等
を例示することができる。

また本発明により提供される蛋白質に、ＩＬ６に結合し
た細胞表層から離脱した可溶性ＩＬ６レセプタ−を結合
させることにより、ＩＬ−６作用を増強させるだけでな
く、ＩＬ−６レセプタ−を細胞表層に有しない細胞にも
Ｉ　Ｌ−６を作用させることができよう。一方、該蛋白
質と、ＩＬ６と結合したＩ　Ｌ−６レセプタ−との結合
を、ＩＬ−６、ＩＬ−６レセプタ−あるいは該蛋白質に
対する抗体等で阻害すれば、Ｉ　Ｌ−６の生物活性を阻
害することができよう。従って本発明の蛋白質は、医薬
の活性成分としても期待される。

本発明で提供されるヒトｇｐｔ３ｏをコードするＤＮＡ
配列、さらには該蛋白質を遺伝子工学的に生産するため
の手段および方法により、自然状態では極めて微量にし
か生産されない該蛋白質を大量に生産することが可能で
ある。

以下本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示す
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

なお、実施例においては本発明の蛋白質を便宜上ｒ　ｇ
ｐ１３０．と称する場合がある。

ヒトミエローマ細胞Ｕ２６６（Ｉ　Ｌ　−６レセプタ−
及びｇ＋）１３０蛋白質の両者を産生ずる細胞）（２ｘ
ｌｏ７個）を１　ｍＣｉの３５３−メチオニンで内部標
識した後、２等分し、一方をＩ　Ｌ−６存在下（ｌｌｒ
ｇ／ｍｌ）、そして他方をｒＬ−６非存在下で０．５　
ｄのＲＰＭ１１６４０中で３７°Ｃで３０分間インキュ
ベートした。その後Ｕ２６６細胞をｌ　ｍｌｌの１％ジ
ギトニン（和光純薬）含有１０ｍＭ　）リエタノールア
ミン緩衝液（ｐＨ７，４）、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ２　
、１ｍＭ　ｐＡＰＭＳＦ（和光純薬）で可溶化した。一
方、ブロムシアンで活性化したセファロース４Ｂに、抗
Ｉ　Ｌ−６レセプタ一抗体ＭＴ１８抗体（参考例１）を
常法どおり結合させた。これと前述の可溶化した細胞の
上清を混合し、樹脂上のＭＴ１８抗体に可溶化したＩＬ
−６レセプタ−を結合させた。

非特異的結合物を前述の１％ジギトニン溶液で洗い流し
た。その後、還元条件又は非還元条件にて、ドデシル硫
酸ナトリウム中ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ／ＰＡＧＥ）　、及びオートラジオグラフィーを行っ
た。結果を第１図に示す。第１図中、８０ｋＤａのバン
ドはＵ２６６細胞由来ノ３ＳＳメチオニン標識されたＩ
Ｌ−６レセプタ−を示し、そして１３０ｋＤａのバンド
は本発明のｇｐ１３０蛋白質を示す。この結果は、ＩＬ
−６と結合したＩＩ、−６レセプタ−が３７°Ｃでは３
０分以内に単量体の分子量１３０ｋＤａのヒト蛋白質軸
ｐ１３０）と結合することを示している。

Ｉ　Ｌ−６レセプタ−を細胞表面に発現しないマウスＢ
細胞株Ｍ１２に、プラスミドｐＺｉｐＮｅｏｓＶ（Ｘ）
　Ｉ（Ｃｅｐｋｏら、Ｃｅ１１．３７．　ｐ１０５３．
１９８４年参照）のＢ　ａ　ｍ　１１部位にヒトＩ　Ｌ
−６レセプタ−ｃＤＮＡを挿入して作製したプラスミド
をエレクトロポレーション法にて導入し、抗生物質Ｇ　
４１Ｂ　（シグマ社）に対する耐性により形質転換細胞
をスクリーニングした。この様にして確立されたヒトＩ
Ｌ＝６レセプタ−を細胞表面上に発現するマウスＢ細胞
Ｍ１２由来クロ■ 一ンをＭ１２１Ｌ６Ｒと名づけた。

次に１０″個のＭ１２ＩＬ６Ｒ細胞をＰＢＳで洗浄し、
０、１　ｒｒｄｌの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，４）
、　０．１５Ｍ　ＮａＣ１に懸濁した。次に、０．１　
ｍｆｌの上記緩衝液中で１　ｍＣｉのＮａ１２５Ｉと２
個のＩｏｄｏｂｅａｄｓ　（Ｐｉｅｒｃｅ社）とを室温
で５分反応させ、これを前記細胞懸濁液と混合し、３０
分間室温でインキュベートした。この様にして標識され
た細胞にＩＬ−６を１μｇ／ｍ１加え又は加えることな
く３７°Ｃで３０分間反応させた後に実施例１に示す方
法で可溶化し、ＭＴ１８による免疫沈降を行い、その後
、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ、オートラジオグラフィーを行った
。この結果を第２図に示す。この図中、８０ｋＤａのバ
ンドはＭ１２細胞に導入されたＩＬ−６レセプタ−ｃＤ
ＮＡに基＜ＩＬ−６レセプタ−を示し、１３０ｋＤａの
バンドはＭ１２細胞により本来的に産生されるｇｐ１３
０蛋白質を示す。この結果、ヒト■Ｌ−６と結合したＭ
１２ＩＬ６Ｒ上のヒトＩ’　Ｌ　−６レセプタ−が、３
７°Ｃで３０分以内にＭ１２１Ｌ６Ｒ由来のマウス蛋白
質（ｇｐ１３０）に結合することを示している。

２Ｘ１０７個のＭ１２細胞（ＩＬ−６レセプタ−非産生
細胞）を実施例２に示す方法で標識した。この様に標識
された５Ｘ１０６の細胞を、ＩＩ、−６存在下（１μｇ
　／　ｒｒｄｌ　）又は非存在下で、可溶性ＩＬ６レセ
プタ−を含有するか又は含有しないＣＯ３７細胞の培養
上清１　ｍｌに添加し、３７°Ｃで３０分間反応させた
。その後、実施例１に示す方法で細胞をジギトニンで可
溶化し、ＭＴ１８抗体により免疫沈降し、ＳＤＳ／ＰＡ
ＧＥ及びオートラジオグラフィーを行った。

この結果を第３図に示す。図中、１３０ｋＤａのバンド
はＭ１２細胞により産生されたｇｐ１３０蛋白質を示す
。

なお、この例においては可溶性ＩＬ−，６シー。ターは
標識されていないためオートラジオグラフィーに表われ
ていない。この結果は、Ｉ　Ｌ−６と可溶性ＩＬ−６レ
セプタ−の結合物が細胞膜上の蛋白質軸ｐ１３０）と結
合し、可溶性Ｉ　Ｌ−６レセプタ−単独ではｇｐ１３０
に結合しないことを示している。

実１副１エ　ＩＬ−６での口　　ＩＬ−６しＭ１細胞を
１×１０５個／　ｍｌ、　０．２　ｒｒｄｌ／ウェルで
、種々の濃度のＩＬ−６、および可溶性Ｉ　Ｌ−６レセ
プタ−を含むＣＯ３７細胞の培養上清あるいは対照とし
てのＣＯ３７細胞の培養上清を２５％加えた条件で培養
した。培養開始後６０時間〜７０時間の間に３Ｈ標識チ
ミジンを加え、細胞内に取り込まれた放射能活性を測定
することによりＭｌ細胞の増殖を調べた。第４図は、Ｉ
Ｌ−６のもつＭ１細胞に対する増殖阻害効果を、可溶性
ＩＬ−６レセプタ−が増強させることを示す。すなわち
Ｉ＞６と結合した可溶性Ｉ　Ｌ−６レセプタ−がＭ１細
胞のｇｐ１３０と結合することにより、Ｉ　Ｌ−６作用
を増強させる。

実ＩＬＬ　　ヒト　１３０　ｃＤＮＡの　−一連の遺伝
子組み換え操作方法（ｍ−ＲＮＡの抽出、ＤＮＡの制限
酵素による切断等）は、マニアナイスらの方法（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９８２年
参照）、バーウィンらの方法（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ
、　ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈｖｏｌ
、１＋　ｐ４９．　ＩＲＬ、　０ｘｆｏｒｄ、　１９８
５年参照）を参照に行った。また、ラムダｇｔｌｌ　ｃ
ＤＮＡ　ライブラリーの抗体によるスクリーニングも定
法に従った。

まず、ヒトミｘローマ細胞Ｕ２６６　（Ｃｅｌｌ、　５
８巻ｐ５７３．１９８９年参照）からメツセンジャー（
ｍ）ＲＮＡを抽出し、ラムダｇｔｌｌ　（クローンチッ
ク社）を用いてｃＤＮＡライブラリーを作製した。次に
、ｇｐ１３０に対するマウス由来モノクローナル抗体Ａ
ｌ’１６４とＡＭ２７７（特願平２−１５０９０号明細
書参照）を用いて約５０万個のクローンをスクリーニン
グした結果、最終的に２個のクローン（λＡ、λＢ）を
得た。λＡとλＢのインサートｃＤＮＡを解析した結果
、第５図に示すようにいずれのインサートｃＤＮΔも、
ヒトｇｐ１３０コード領域を完全に含まないことが判明
した。

そこで、λＡのＢｃｏＲ１断片と、λＢのＥｃｏＲＩ断
片をｃＤＮＡ本来の方向に連結させた形でベクターｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社
）のＥｃｏＲ１部位に挿入し、ヒトｇｐ１３０コード領
域を完全に含むインサートＤＮＡを持つプラスミド、ｐ
ＧＰ１３０を作製しく２４） た。第２図にｐＧＰ１３０の構造を示す。第３図に、ｐ
ＧＰ１３０のインサートＤＮＡの配列１．すなわちλＡ
とλＢのインサートｃＤＮＡ配列から決定されたヒトｇ
ｐ１３０　ｃＤＮＡの配列、および推定されるアミノ酸
配列を示す。

なお、このプラスミドｐＧＰ１３０を含有する大腸菌旦
−並旦ＨＢＩＯＩ　／　ｐＧＰ１３０は工業技術院微生
物工業技術研究所に、微工研条寄第２９１２号（ＦＥＲ
Ｍ　ＢＰ−２９１２）としてブタベスト条約に基き国際
寄託されている。

実施拠炙　　ヒト　　１３０　ｍＲＮＡの各　細胞での
全各種細胞でのヒトｇｐ１３０の発現を調べるためにノ
ーザンプロット解析を行った。細胞の培養、細胞からの
ｍＲＮＡの抽出、電気泳動、プロッティング、プローブ
の標識、ハイブリダイゼーション、フィルターの洗浄、
オートラジオグラフィー等はすべて定法どおり行った。

ヒトミエローマ細胞株Ｕ２６６、ヒトＢ細胞株ＣＥＳＳ
、ヒトバーキットリンフオーマＪｉｊｏｙｅ、ヒトＴ細
胞株Ｊｕｒｋａｔ、　Ｎ　Ｋ細胞株ＹＴからｍＲＮＡを
抽出した。

次に各ｍＲＮΔ　１μｇをホルムアミド法で変性させ、
０．８％アガロースゲル電気泳動にかけ、ナイロンフィ
ルター膜にノーザンブロッティングした。続いて実施例
１に記載の方法で得られたλＡのインサートｃＤＮＡを
抽出し、これをプローブとして用い、４２°Ｃ１２４時
間のハイブリダイゼーションを行った。

洗浄後、オートラジオグラフィーを行った。

その結果、第４図に示すように、ｇｐ１３０　ｍＲＮＡ
の発現は、Ｕ２６６　、　ＹＴでは強く、ＣＥＳＳでは
中程度、Ｊｉｊｏｙｅ、　Ｊｕｒｋａｔでは弱いことが
わかった。これは、各種細胞のＩ　Ｌ−６の反応性と相
関する。

ヒトＩ　Ｌ、−６レセプタ−に対するマウスモノクロー
ナル抗体を作製する目的で、免疫原として、ヒトＩ　Ｌ
−６レセプタ−を膜面に発現しているマウスＴ細胞株を
以下の方法で作製した。すなわち、特願平１−９７７４
号明細書に記載されているｐＢｓＦ２Ｒ。

２３６及びｐｓＶ２ｎｅｏをマウスＴ細胞株ＣＴＬＬ−
２（ＡＴＣＣＴＩＢ２１４）に常法で導入し、Ｇ−４１
８を用いる通常の方法でスクリーニングをし、最終的に
Ｉ　Ｌ−６しセプターを細胞あたり約３０，０００個発
現している株を樹立し、これをＣＴＢＣ２と名づけだ。

免疫は以下の様に行った。ＲＰＭ１１６４０を用いる通
常の方法で培養後、ＰＢＳバッファーで４回洗浄したＣ
ＴＢＣ３を、Ｃ５７Ｂ　Ｌ　６マウス１匹あたり１×１
０７細胞個、１週間に１回で計６回、腹腔内に免疫した
。

前記免疫されたマウスからの肺細胞を、親株としてのミ
エローマ細胞針Ｐ３Ｕ１と、ポリエチレングリコールを
用いる通常の方法に従って融合せしめた。

スクリーニングは以下の様に行った。Ｉ　Ｌ−６レセプ
タ−陰性のヒトＴ細胞株ＪＵＲＫＡＴ（ＡＴＣＣ，ＣＲ
Ｌ８１６３）に、ｐＢＲＦ２Ｒ，２３６とＰＳＶ２ｎｅ
ｏを常法で導入し、スクリーニングの結果、Ｉ　Ｌ−６
レセプタ−を細胞あたり約１００，０００個発現してい
る株を樹立し、これをＮＪＢＣ８と名づけだ。ＮＰ４０
で可溶化したＮＪＢＣ８を認識し、ＮＰ４０で可溶化し
たＪＵＲＫＡＴを認識しない抗体を産生しているハイブ
リドーマが１クローン単離され、これをＭＴ１８と名づ
けだ。また、このハイブリドーマによって生産されるモ
ノクローナル抗体をＭＴ１８抗体と称する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、３５３−メチオニンにより内部標識したＵ２
６６細胞をＩ　Ｌ−６により処理した後（レーン２及び
４）又はＩ　Ｌ−６により処理することなく　（レーン
１及び３）溶解し、セファロースＢ４に固定化された抗
Ｉ　Ｌ−６レセプタ一抗体ＭＴ１８により免疫沈降せし
め、そして非還元条件下（レーン１及び２）、又は還元
条件下（レーン３及び４）でＳＤＳ／ＰＡＧＥを行った
場合のオートラジオグラフィーのパターンを示す。 第２図は、　＋′■により表面標識したＭ１２ＩＬ６Ｒ
細胞をＩ　Ｌ−６により処理した後（レーン２）又はＩ
　Ｌ−６により処理することなく　（レーン１）溶解し
、第１図の場合と同様に処理して得られたオートラジオ
グラフィーのパターンを示す。 第３図は、ＩＬ−６の存在下（レーン２及び４）又はＩ
　Ｌ−６の非存在下（レーン１及び３）で、且つ可溶性
ＩＩ、−６レセプタ−を含有する（レーン３及び４）か
又は含有しない（レーン１及び２）ｃｏｓ　７　Ｍ！ｌ
胞培養上清の存在下で、Ｍ　１２１１１胞をインキュベ
ートした後溶解し、第１図の場合と同様に処理して得た
オートラジオグラフィーのパターンを示す。 第４図は、種々の濃度のＩ　Ｌ−６存在下、可溶性ＩＬ
−６レセプタ−存在下あるいは非存在下でのＭｌ細胞の
３Ｈ標識のチミジンの取り込みを示す。 第５図は、λＡとλＢの制限酵素地図および対応するヒ
トｇｐ１３０蛋白質の模式図を示す。ＥはＥｃｏＲＩサ
イトを示す。また、ＳＳはシグナル配列、ＥＣは細胞外
領域、ＴＭは膜貫通領域、Ｃは細胞内領域を示す。 ＤＮＡ、すなわちヒトｇｐ１３０をコードするＤＮＡ配
列について、その塩基配列を解析した結果、及びこのＤ
ＮＡ配列が発現された場合に生産される蛋白質、すなわ
ちヒトｇｐ１３０の推定されるアミノ酸配列を示す。下
線部分はＮ末端側の疎水性アミノ酸領域を示し、二重下
線部分はＣ末端側の疎水性アミノ酸領域を示す。 第８図は、ヒトｇｐ１３０　ｃＤＮＡをプローブとした
ときの各種細胞のノーザンプロットの結果を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、少なくとも次の性質を有する、ヒトｇｐ１３０蛋白
   質： （１）ＩＬ−６（インタ−ロイキン−６）とＩＬ−６レ
   セプタ−（インタ−ロイキン−６レセプタ−）との複合
   体に対して親和性を有する； （２）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動におい
   て１３０ｋＤａのみかけの分子量を示す；（３）ＩＬ−
   ６のシグナル伝達に関与する。 ２、第７図中、１位のＭｅｔから９１８位のＧｌｎまで
   のアミノ酸配列を有する請求項第１項に記載のヒトｇｐ
   １３０蛋白質。 ３、請求項第１項に記載のヒトｇｐ１３０蛋白質をコー
   ドするＤＮＡ。 ４、第７図中、１位のＭｅｔから９１８位のＧｌｎまで
   のアミノ酸配列を有するヒトｇｐ１３０蛋白質をコード
   する請求項第３項に記載のＤＮＡ。 ５、第７図中、２７３位のＡから３０２６位のＧまでの
   塩基配列を有する請求項第４項に記載のＤＮＡ。 ６、請求項第３項に記載のＤＮＡを含み、宿主細胞中で
   当該ＤＮＡを発現させることができる発現ベクター。 ７、請求項第６項に記載の発現ベクターにより形質転換
   された宿主細胞を培養する操作を含む、ヒトｇｐ１３０
   蛋白質の製造方法。 ８、請求項第３項記載のＤＮＡを用いて製造された、実
   質的にヒト由来の他の蛋白質を含まないヒトｇｐ１３０
   蛋白質。