DE69319662T2 - Monoklonale Antikörper gegen GP130-Protein - Google Patents
Monoklonale Antikörper gegen GP130-ProteinInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft monoclonale Antikörper gegen das gp130-Protein, das für die übertragung von Interleukin-6 (IL-6) verantwortlich ist.
- IL-6 bindet an den Interleukin-6-Rezeptor (IL-6R) (Japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 2- 288898), wodurch ein Komplex erzeugt wird. Der Komplex aus IL-6 und IL-6R bindet an das gp130-Protein, ein Mernbranprotein auf einer Zielzelle (Japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 4-29997), wodurch verschiedene physiologische wirkungen von IL-6 auf eine Zielzelle übertragen werden (Taga et al. , Cell 58 (1989) , 573).
- Eine physiologische Wirkung von IL-6 besteht darin, daß die Blutplättchen vermehrt werden (Ishibashi et al., Blood 74 (1989), 1241), weshalb man davon ausgehen kann, daß IL-6 als neues Medikament eingesetzt werden kann. Andererseits wurde berichtet, daß eine abnorme Produktion von IL-6 verschiedene Autoimmunkrankheiten bewirkt, deshalb standen Inhibitoren dieser physiologischen Wirkung bereits im Mittelpunkt des Interesses (Hirano et al., Immunology Today 11 (1990), 443). Solche IL-6-Inhibitoren, Antikörper gegen IL-6, zeigten eine therapeutische Wirkung bei terminalen Myelompatienten (B. Klein et al., Eur. cytokine Net. 1 (1990), 193).
- Antikörper gegen IL-6 und Antikörper gegen gp130, das ein Protein ist, welches ein IL-6-Signal, d.h. eine physiologische Wirkung von IL-6, überträgt, wirken voraussichtlich als Inhibitoren von IL-6. Außerdem wird berichtet, daß das gp130-Protein ein Signal-übertragendes Protein für Onkostatin M, einen Wachstumsfaktor für Krebszellen, ist, und daß es ein Signalübertragendes Protein für einen Leukämie-Hemmfaktor ("leukemia inhibitory factor", LIF) ist, der ursprünglich als Leukämiewachstums-Inhibitor identifiziert wurde (Gearing et al., Science 255 (1992), 1434), deshalb kann man erwarten, daß die Antikörper gegen das gp130-Protein diese physiologisch aktiven Substanzen hemmen.
- Die Japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 3-219894 beschreibt Antikörper gegen das gp130-Protein, die Antikörper AM64 und AM277, die aus Mäusen hergestellt wurden, die mit dem gp130-Protein immunisiert worden waren. Jedoch sind die inhibitorischen Effekte der bekannten Antikörper, wie z.B. AM64 und AM277, auf die IL-6-Funktionen nur unvollständig, folglich kann keiner der bekannten Antikörper als Inhibitor von IL-6 eingesetzt werden. Das Anlegen von Hybridomen, die Anti-gp130-Antikörper produzieren, die die IL-6-Funktionen so stark hemmen können wie der bekannte Antikörper gegen IL-6 (MH166, vgl. Matsuda et al., Eur. Immunol. 18 (1988), 951) oder der gegen IL-6R (PM1, vgl. Hirata et al., 143 (1989) , 2900) scheint schwierig zu sein, da (1) nicht unbedingt gegen gp130 gerichtete Monoclonale Antikörper hergestellt werden können, die die IL-6-Funktionen stark hemmen, und (2) kein wirksames Verfahren bekannt ist, mit dem aus einer großen Zahl von angelegten donen die Hybridome selektiert werden können, die den gewünschten Antikörper erzeugen. (Es ist nicht möglich, unter Verwendung des Antikörper-enthaltenden Überstandes exakt die inhibitorischen Effekte auf die IL- 6-Funktionen zu testen.) Obwohl (3) ein gentechnisch hergestelltes lösliches gp130, dem Transmembran- und Cytoplasma-Regionen fehlen, anstelle von Membran-gereinigtem gp130 verwendet werden kann, wurde bisher nicht berichtet, daß ein solches lösliches gp130 als Immunogen zur Herstellung des vorstehenden Antikörpers geeignet ist.
- Demgemäß immunisierten die Erfinder Mäuse mit einem rekombinanten gp130-Protein, legten eine große Zahl von Hybridomen an, die Antikörper produzieren, die das gp130-Protein erkennen, und suchten die Hybridome ab, um Hybridome zu erhalten, die Antikörper produzieren, die die physiologischen Wirkungen von IL-6 vollständig hemmen.
- Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung Monoclonale Antikörper bereit, die spezifisch das gp130-Protein erkennen und die IL-6-Funktionen vollständig hemmen (d.h., bis zum gleichen Niveau wie in Abwesenheit von IL-6), wenn sie in einer ausreichenden Menge vorliegen, nämlich wenn der Monoclonale Antikörper in einem Überschuß, bezogen auf das gp130-Protein, vorliegt, und die insbesondere die Signalübertragung zwischen IL-6 und gp130 hemmen.
- Die vorliegende Erfindung stellt auch Hybridome bereit, die die vorstehend erwähnten Monoclonalen Antikörper produzieren.
- Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung der vorstehend erwähnten Monoclonalen Antikörper bereit, das die Züchtung der vorstehend erwähnten Hybridome umfaßt.
- Die vorliegende Erfindung stellt ferner einen Inhibitor der physiologischen Wirkung von IL-6 bereit, der den vorstehend erwähnten Monoclonalen Antikörper umfaßt.
- Figur 1 zeigt die Wirkung der vorliegenden Monoclonalen Antikörper, die induzierende Aktivität auf die Antikörperproduktion der menschlichen B-Zellinie CL4 zu hemmen, wie in Beispiel 2 beschrieben, wobei auf der Abszisse die zugegebene Antikörpermenge in ug/ml aufgetragen ist und auf der Ordinate die Antikörper-Produktivität als Absorption bei 405 nm dargestellt ist. In dieser Abbildung geben die obere und die untere gestrichelte Linie die Ergebnisse wieder, die bei Zugabe von IL-6 in einer Menge von 10 U/ml bzw. 0 U/ml ohne Zusatz eines Antikörpers erhalten wurden. Die Symbole - -, - -, - - und - - zeigen die Ergebnisse des Antikörpers GPX 22, des Antikörpers GPZ 35, des Antikörpers PM1 bzw. des Maus-Immunglobulins.
- Fig. 2 zeigt die Wirkung der vorliegenden Antikörper, die induzierende Wirkung auf das Wachstum der menschlichen T-Zellen KT3 zu hemmen, wie in Beispiel 3 beschrieben, wobei auf der Abszisse die zugegebene Antikörpermenge in ug/ml aufgetragen ist und auf der Ordinate die Zahl der Zellen dargestellt ist, die durch die Absorption bei 570 bis 630 nm wiedergegeben wird. In dieser Figur zeigen die obere und die untere gestrichelte Linie die Ergebnisse, die bei Zugabe von IL-6 in einer Menge von 0,25 U/ml bzw. 0 U/ml ohne Zusatz eines Antikörpers erhalten wurden. Die Symbole - -, - -, - -, - - und - -stellen die Ergebnisse des Antikörpers GPX 22, des Antikörpers GPX 7, des Antikörpers GPZ 35, des Antikörpers PMI bzw. des Maus-Immunglobulins dar.
- Fig. 3 zeigt die Wirkung der vorliegenden Antikörper, die Bindung eines Komplexes aus IL-6 und IL-6R an das gp130-Protein zu hemmen, wie in Beispiel 4 beschrieben, wobei auf der Abszisse die zugegebene Antikörpermenge in ug/ml aufgetragen ist und auf der Ordinate die Menge von IL-6R, das an das gp130-Protein gebunden ist, als Absorption bei 405 nm dargestellt ist. In dieser Figur zeigen die obere und die untere gestrichelte Linie das Ergebnis, das ohne Zugabe eines Antikörpers erhalten wurde, bzw. den Basiswert. Die Symbole - -, - -, - - und - - stellen die Ergebnisse des Antikörpers GPX 22, des Antikörpers GPX 7, des Antikörpers GPZ 35 bzw. des Maus-Immunglobulins dar.
- Fig. 4 zeigt die Wirkung des vorliegenden Antikörpers, die Wirkung von IL-6 zur Beschleunigung des Wachstums des menschlichen Myeloms zu hemmen, wie in Beispiel 5 beschrieben, wobei auf der Abszisse die zugegebene Antikörpermenge in ug/ml aufgetragen ist und auf der Ordinate die Zahl der Zellen dargestellt ist, die durch die Absorption bei 570 bis 630 nm erhalten wird. In dieser Figur zeigt die gestrichelte Linie das Ergebnis, das ohne Zugabe eines Antikörpers erhalten wurde. Die Symbole - -, - -, - -, - - und - - stellen die Ergebnisse des Antikörpers GPX 22, des Antikörpers GPX 7, des Antikörpers GPZ 35, des Antikörpers PM1 bzw. des Maus-Immunglobulins dar.
- Fig. 5 zeigt die Wirkung des vorliegenden Monoclonalen Antikörpers, die Wachstum-induzierenden Wirkung auf Maus-BAF- 130-Zellen in Gegenwart von IL-6 und IL-6R zu hemmen, wie in Beispiel 6 beschrieben, wobei auf der Abszisse die zugegebene Antikörpermenge aufgetragen ist und auf der Ordinate das Zellwachstum dargestellt ist, das durch die Aufnahme von H-Thymidin (cpm) wiedergegeben wird. In dieser Figur zeigen die obere und die untere gestrichelte Linie das Ergebnis, das bei Zugabe von IL-6 und IL-6R ohne Zusatz des Antikörpers erhalten wurde, bzw. das Ergebnis, das ohne Zugabe von IL-6, IL-6R und des Antikörpers erhalten wurde. Die Symbole - -, - -, - -, - -und - - stellen die Ergebnisse des Antikörpers GPX 22, des Antikörpers GPX 7, des Antikörpers GPZ 35, des Antikörpers PM1 bzw. des Maus-Immunglobulins dar.
- Die vorliegenden Monoclonalen Antikörper werden unter Verwendung eines Antigens, des gp130-Proteins, hergestellt, das ein Glykoprotein ist, das in Gegenwart von IL-6 an IL-6R bindet, das jedoch in Abwesenheit von IL-6 nicht an IL-6R bindet und das ein offensichtliches Molekulargewicht von 130 kDa zeigt, das durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese bestimmt wurde.
- Die vorliegenden Monoclonalen Antikörper werden durch Hybridomzellinien hergestellt, die konstruiert werden, indem ein Tier, z.B. eine Maus, mit einem Antigen immunisiert wird, Milzzellen aus dem immunisierten Tier entnommen werden, die Milzzellen mit etablierten Myelomzellen, wie z.B. der Zellinie SP2/0, hybridisiert werden und die Zellinien, die einen gewünschten Monoclonalen Antikörper produzieren, doniert werden. Das Antigen ist z.B. ein rekombinantes gp130-Protein (löslicher Typ), das z.B. gemäß einem in Yasukawa et al., Immunol. Lett. 31 (1992) , 123, beschriebenen Verfahren hergestellt wird.
- Bevorzugte Hybridome der vorliegenden Erfindung sind Hybridom GPZ 35, hinterlegt beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FRL), 1-3 Higashi 1-chome, Tuskuba-shi, Ibaraki, 305 Japan, als FERM P- 12940, am 27. April 1992, und umgewandelt in eine internationale Hinterlegung unter dem Budapester Vertrag als FERM BP-4263, am 15. April 1993; GPX 7, hinterlegt beim FRI als FERM P-12938 am 27. April 1992 und umgewandelt in eine internationale Hinterlegung unter dem Budapester Vertrag als FERM BP-4261 am 15. April 1993; und GPX 22, hinterlegt beim FRI als FERM P-12939 am 27. April 1992 und umgewandelt in eine internationale Hinterlegung unter dem Budapester Vertrag als FERM BP-4262 am 15. April 1993.
- Die durch die vorstehend erwähnten Hybridome hergestellten Monoclonalen Antikörper binden an das gp130-Protein, so daß die physiologische Wirkung von IL-6 vollständiger gehemmt wird, als das bei den bekannten Monoclonalen Antikörpern AM64 und AM277 der Fall ist. Darüberhinaus reagieren diese monoclonalen Antikörper mit dem nativen gpl3o-Protein, das aus Zellmembran, Serum oder Urin isoliert wurde, und außerdem mit einem rekombinanten gp130-Protein, das als Antigen zur Immunisierung von Mäusen eingesetzt wurde.
- Der vorliegende Monoclonale Antikörper wird hergestellt, indem das vorstehend erwähnte Hybridom in einem herkömmlichen Medium unter herkömmlichen Bedingungen in vitro gezüchtet wird. Alternativ kann der vorliegende Monoclonale Antikörper in vivo hergestellt werden, indem das vorstehend erwähnte Hybridom in ein Tier, z.B. eine Maus, eingeimpft wird und die Ascitesflüssigkeit aus dem Tier gewonnen wird. Wenn mehr als ein Hybridom gezüchtet wird, kann ein Gemisch aus mehr als einem Monoclonalen Antikörper erhalten werden.
- Der Monoclonale Antikörper der vorliegenden Erfindung in einem Kulturmedium oder in Ascitesflüssigkeit kann gereinigt werden, z.B. durch Ammoniumsulfatfällung, Affinitätschromatographie unter Verwendung eines Gels, an welches das gp130-Protein immobilisiert wurde, und dergleichen, alleine oder in Kombination.
- Wie vorstehend beschrieben, binden die vorliegenden Antikörper an das gp130-Protein, dies führt zur Hemmung der physiologischen Wirkung von IL-6. Demgemäß können die vorliegenden Monoclonalen Antikörper zur Herstellung eines Mittels zur Hemmung der physiologischen Wirkung von IL-6 verwendet werden. Außerdem kann man erwarten, daß die vorliegenden Monoclonalen Antikörper als Inhibitoren gegen physiologisch aktive Substanzen, an deren Signalübertragung das gp130-Protein beteiligt ist, eingesetzt werden können.
- Im folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand von Beispielen ausführlich beschrieben, die lediglich der Erläuterung dienen und in keiner Weise den Umfang der Patentansprüche einschränken sollen.
- Eine BALB/c-Maus wurde intraperitoneal mit einem rekombinanten gpl3o-Protein immunisiert, das aus CHO-Zellen gemäß Yasukawa et al., Immunol. Lett. 31 (1992), 21, hergestellt wurde, indem jeweils 50 ug des rekombinanten gpl3o-Proteins viermal alle zehn Tage verabreicht wurden. Die Milzzellen wurden aus der Maus gewonnen und mit Myelomzellen (Linie SP2/0) unter Verwendung von Polyethylenglykol hybridisiert.
- Die der Zellfusion unterworfenen Zellen wurden in DMEM- HAT-Medium gezüchtet und zur Produktion eines Monoclonalen Antikörpers im Medium belassen, so daß die Zellen auf die Produktion des Monoclonalen Antikörpers abgesucht werden konnten. Hierzu wurde das als Immunogen verwendete rekombinante gp130- Protein (löslicher Typ) in jeder Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen immobilisiert und ein Kulturüberstand und ein mit alkalischer Phosphatase konjugierter Anti-Maus-Immunglobuim-Antikörper zugefügt, wodurch das Vorliegen des das gpl3o- Protein erkennenden Monoclonalen Antikörpers bestimmt werden konnte. Anschließend wurden die Zellen der Kulturen, bei denen das Vorliegen des das gp130-Protein erkennenden Monoclonalen Antikörpers bestatigt wurde, durch die Grenzverdünnungsmethode doniert. Auf diese Weise wurden schließlich 66 Clone etabliert, die einen Monoclonalen Antikörper produzieren, der das gp130-Protein erkennt.
- Die 66 auf diese Weise erhaltenen Clone wurden folgendermaßen getestet. Zuerst wurde der gegen das menschliche 9p130- Protein gerichtete Monoclonale Antikörper AM64, der aus Mäusen stammte (Japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 3-219894), in jeder Vertiefung einer Platte rnit 96 Vertiefungen immobilisiert. Anschließend wurde das aus CHO-Zellen stammende gp130-Protein (löslicher Typ, vgl. vorstehend) zugegeben, so daß das gp130-Protein über den immobilisierten monoclonalen Antikörper immobilisiert wurde. Zu jeder Vertiefung wurden gleichzeitig ein Gemisch aus rekombinantem IL-6, hergestellt aus E. coli (Yasukawa et al., Biotech. Lett. 12 (1990), 419), und rekombinantem IL-6R (Yasukawa et al., J. Biochem. 108 (1990), 673) und ein Kulturüberstand von jedem Hybridom zugefügt. Um die Fähigkeit des zugegebenen Monoclonalen Antikörpers zu bestimmen, die Bildung eines aus drei Stoffen bestehenden Komplexes aus IL-6, IL-6R und gp130 von IL-6 zu hemmen, wurden sodann zu jeder Vertiefung ein Anti-IL-6R-polyclonaler Antikörper, hergestellt durch Immunisierung eines Meerschweinchens mit IL-6R, und ein mit alkalischer Phosphatase markierter Anti-Meerschweinchen-Immunglobulin-Antikörper zugegeben, so daß die Reaktion des zugefügten Anti-IL-6R-polyclonalen Antikörpers mit dem über den Monoclonalen Antikörper AM64 und das gp130-Protein immobilisierten IL-6R erfolgen konnte. Danach wurde jede Vertiefung gewaschen und ein Substrat für die alkalische Phosphatase zugegeben.
- Als Ergebnis wurden von den vorstehend erwähnten 66 Clonen drei Clone erhalten, d.h. GPZ 35, GPX 7 und GPX 22, die einen Monoclonalen Antikörper produzierten, der eine Hemmwirkung auf die physiologische Wirkung von IL-6 zeigte.
- Die in Beispiel 1 hergestellten Hybridome GPZ 35 und GPX 22 wurden getrennt in BALB/c-Mäuse intraperitoneal eingeimpft, so daß Ascitesflüssigkeit erzeugt wurde, die die monoclonalen Antikörper GPZ 35 bzw. GPX 22 enthielt, sodann wurden die monodonalen Antikörper gereinigt. Der Anti-IL-6R-Antikörper PMI, der die IL-6-Funktionen hemmt (Hirano et al., J. Immunol. 143 (1989), 2900), wurde als positive Kontrolle eingesetzt.
- CL4-Zellen (T. Hirano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 5490) reagieren auf IL-6, indem die Produktion von Immunglobulin in Gang gesetzt wird. Eine Suspension von CL4- Zellen wurde in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen verteilt, so daß jede Vertiefung 1 × 10&sup4; Zellen in 0,2 ml enthielt, und zu jeder Vertiefung wurden verschiedene Verdünnungen der Monoclonalen Antikörper und des Maus-Immunglobulins als Kontrolle und außerdem 10 U/ml IL-6 zugegeben und die Zellen drei Tage in RPMI 1640-Medium gezüchtet. Nach der Züchtung wurde die erzeugte Immunglobulinmenge durch Enzym-Immunassay (ELISA) gemessen.
- Als Ergebnis wurde erhalten, daß bei Zugabe des monoclonalen Antikörpers GPZ 35, GPX 22 oder PM1 die Antikörperproduktion durch die CL4-Zellen dosisabhängig gehemmt wurde, während bei Zugabe des Maus-Immunglobulins als Kontrolle die Antikörperproduktion durch die CL4-Zellen nicht gehemmt wurde. Dieses Ergebnis zeigt, daß die vorliegenden Monoclonalen Antikörper das gp130-Protein erkennen und die physiologische Wirkung von IL-6 (Wirkung zur Induktion der Antikörperproduktion von CL4-Zellen) so stark hemmen wie PM1. Das Ergebnis ist in Figur 1 dargestellt.
- Die Hybridome GPZ 35, GPX 7 und GPX 22 wurden getrennt in BALB/c-Mäuse intraperitoneal eingeimpft, die den Monoclonalen Antikörper enthaltende Ascitesflüssigkeit wurde jeweils gewonnen und die Monoclonalen Antikörper GPZ 35, GPX 7 und GPX 22 gereinigt.
- Die T-Zellinie KT3 (Y. Hirata et al., J. Immunol. 143 (1989), 2900) wächst durch die physiologische Wirkung von IL 6. Eine Suspension der T-Zellinie KT3 wurde in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen verteilt, so daß jede Vertiefung 2 × 10&sup4; Zellen in 0,2 ml enthielt, und verschiedene Verdünnungen der Monoclonalen Antikörper oder des Maus-Immunglobulins als Kontrolle und außerdem 0,25 U/ml IL-6 wurden zugegeben und die Zellen in einem RPMI 1640-Medium drei Tage gezüchtet. Nach der Züchtung wurde die Zellzahl durch das MTT- Verfahren unter Verwendung eines handelsüblichen Kits (Chemicon) gemessen.
- Als Ergebnis wurde erhalten, daß bei Zugabe des monoclonalen Antikörpers GPZ 35, GPX 7 oder GPX 22 die Zahl der differenzierten Zellen vermindert war, abhängig von der Konzentration des zugegeben Monoclonalen Antikörpers, während bei Zugabe des Maus-Immunglobulins als Kontrolle die Zahl der Zellen nicht vermindert war. Dieses Ergebnis zeigt, daß die vorliegenden Monoclonalen Antikörper das gp130-Protein erkennen und die physiologische Wirkung von IL-6 (Wirkung zur Induktion des Wachstums der T-Zellinie KT3) hemmen. Das Ergebnis ist in Figur 2 dargestellt.
- Die Hybridome GPZ 35, GPX 7 und GPX 22 wurden getrennt in BALB/c-Mäuse intraperitoneal eingeimpft, die den Monoclonalen Antikörper enthaltende Ascitesflüssigkeit wurde jeweils gewonnen und die Monoclonalen Antikörper GPZ 35, GPX 7 und GPX 22 gereinigt.
- Der gegen das menschliche gp130-Protein gerichtete monodonale Antikörper AM64, der aus Mäusen stammte, wurde in jeder Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen immobilisiert und das unter Verwendung von CHO-Zellen hergestellte rekombinante gp130-Protein zugegeben, so daß es an den immobilisierten Monoclonalen Antikörper AM64 binden konnte. Danach wurden zu einem Gemisch aus dem unter Verwendung von CHO-Zellen hergestellten rekombinanten gp130-Protein und dem unter Verwendung von OHO-Zellen hergestellten rekombinanten IL-6R (löslicher Typ) verschiedene Verdünnungen des Monoclonalen Antikörpers oder des Maus-Immunglobulins gleichzeitig zugegeben. Zu beachten ist, daß die Mengen von IL-6 und IL-6R 5 ug/ml betrugen.
- Um die Wirkung des zugegebenen, gegen das gp130-Protein gerichteten Monoclonalen Antikörpers zu bestimmen, wurde anschließend Anti-IL-6R-polyclonaler Antikörper, der durch Immunisierung eines Meerschweinchens mit IL-6R hergestellt wurde, und mit alkalischer Phosphatase markierter Anti-Meerschweinchen-Immunglobulin-Antikörper zu jeder Vertiefung zugegeben, so daß die Reaktion des zugegebenen Anti-IL-6R-polyclonalen Antikörpers mit dem über den Monoclonalen Antikörper AM64 und das gp130-Protein immobilisierten IL-6R erfolgen konnte. Danach wurde jede Vertiefung gewaschen und ein Substrat für alkalische Phosphatase zugegeben.
- Als Ergebnis wurde erhalten, daß bei Zugabe des monoclonalen Antikörpers GPZ 35, GPX 7 oder GPX 22 das Signal, d.h. das an das gp130-Protein bindende IL-6R, abhängig von der Menge des zugegebenen Monoclonalen Antikörpers vermindert war, während bei Zugabe des Maus-Immunglobulins das Signal nicht vermindert war. Dieses Ergebnis zeigt, daß die vorliegenden Monoclonalen Antikörper das gp130-Protein erkennen und die Bindung von IL-6 und IL-6R an das gp130-Protein hemmen.
- Die in Beispiel 1 erhaltenen Hybridome GPZ 35, GPX 7 und GPX 22 wurden getrennt in BALB/c-Mäuse intraperitoneal eingeimpft, die den Monoclonalen Antikörper enthaltende Ascitesflüssigkeit wurde jeweils gewonnen und die Monoclonalen Antikörper GPZ 35, GPX 7 und GPX 22 gereinigt.
- Eine Suspension menschlicher Myelom-56845-Zellen (Okuno et al., Exp. Hematol. 20 (1992), 395), bei denen IL-6 als autokriner Wachstumsfaktor wirkte, wurde in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen verteilt, so daß jede Vertiefung 5 × 10&sup4; Zellen in 0,5 ml enthielt, und verschiedene Verdünnungen des Monoclonalen Antikörpers oder des Maus-Immunglobulins als Kontrolle zugefügt. Die Zellen wurden in einem RPMI-1640-Medium gezüchtet und am dritten Tag die Zahl der Myelomzellen durch das MTT-Verfahren unter Verwendung eines handelsüblichen Kits (Chemicon) gemessen.
- Als Ergebnis wurde erhalten, daß bei Zugabe des monoclonalen Antikörpers GPZ 35, GPX 7, GPX 22 oder PMI das Wachstum der Myelomzellen, abhängig von der Konzentration des zugegebenen Monoclonalen Antikörpers, autokrin gehemmt wurde, während bei Zugabe des Maus-Immunglobulins das Wachstum der Myelomzellen nicht gehemmt wurde. Dieses Ergebnis zeigt, daß die vorliegenden Monoclonalen Antikörper das gp130-Protein erkennen und die physiologische Wirkung von IL-6 (autokrines Wachstum von Myelomzellen) hemmen. Das Ergebnis ist in Fig. 4 dargestellt.
- Die in Beispiel 1 erhaltenen Hybridome GPZ 35, GPX 7 und GPX 22 wurden getrennt in BALB/c-Mäuse intraperitoneal eingeimpft, die den Monoclonalen Antikörper enthaltende Ascitesflüssigkeit wurde jeweils gewonnen und die Monoclonalen Antikörper GPZ 35, GPX 7 und GPX 22 gereinigt.
- Die Maus-BAF-130-Zellen wurden von Maus-BAF-Zellen (Hatakeyama et al., Cell 63 (1989), 154), die von sich aus das menschliche gp130-Protein nicht exprimieren, hergeleitet, indem die Maus-BAF-Zellen mit einem das menschliche 9p130-Protein codierenden Gen transformiert wurden. Eine Suspension der Zellen wurde in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen verteilt, so daß jede Vertiefung 8 × 10&sup4; Zellen in 0,2 ml enthielt, und jeweils 250 ng/ml von IL-6 und IL-6R zugegeben. In diesem Zustand wurden verschiedene Konzentrationen des monodonalen Antikörpers oder des Maus-Immunglobulins als Kontrolle zugefügt und die Zellen zwei Tage in RPMI 1640-Medium gezüchtet.
- Nach der Züchtung wurden in jede Vertiefung 750 nci ³H- Thymidin zugegeben und nach sechs Stunden die Menge des aufgenommenen ³H-Thymidins in einem Szinillationszähler gemessen.
- Als Ergebnis wurde erhalten, daß bei Zugabe des monoclonalen Antikörpers GPZ 35, GPX 7, GPX 22 oder PMI ein Rückgang der ³H-Thymidin-Aufnahme beobachtet wurde, d.h. eine Hemmung des Wachstums der Maus-BAF-130-Zellen, abhängig von der Konzentration des zugegebenen Monoclonalen Antikörpers, während bei Zugabe des Maus-Immunglobulins keine Hemmung des Wachstums beobachtet wurde. Dieses Ergebnis zeigt, daß die vorliegenden Monoclonalen Antikörper das gp130-Protein erkennen und die physiologische Wirkung von IL-6 (Wirkung zur Stimulation des Wachstums von Maus-BAF-130-Zellen) hemmen. Das Ergebnis ist in Fig. 5 dargestellt.
- Die vorliegenden Monoclonalen Antikörper, wie z.B. GPZ 35, GPX 7 und GPX 22, erkennen das menschliche gpl3o-Protein und binden an dieses Protein, dies führt zu einer starken Hemmung der physiologischen Wirkung von IL-6, und deshalb kann man erwarten, daß sie als ein Mittel zur Hemmung von IL-6 eingesetzt werden können, das die physiologische Wirkung von IL-6 hemmt. Dies ist mit den bekannten Monoclonalen Antikörpern AM64 und AM266, die beide das gpl3o-Protein erkennen, nicht möglich. Aus diesem Grund stellt die vorliegende Erfindung zuerst Monoclonale Antikörper bereit, die als Arzneimittel bei verschiedenen Erkrankungen eingesetzt werden können, wie z.B. Autoimmunerkrankungen, Myelom und dergleichen, die durch IL-6 verursacht werden oder an denen IL-6 beteiligt ist. Darüberhinaus kann man erwarten, daß die vorliegenden monoclonalen Antikörper z.B. als Inhibitor von physiologisch aktiven Substanzen eingesetzt werden können, wie z.B. Onkostatin M, einem Krebs-Wachstumsfaktor, und LIF, einem Leukämiewachstums- Hemmf aktor, die vermutlich an der Signalübertragung von IL-6 beteiligt sind.
- Die vorliegenden Monoclonalen Antikörper hemmen die physiologische Wirkung von IL-6 durch Bindung an das gp130-Protein. Aus diesem Grund kann der vorliegende Monoclonale Antikörper lokal an den Stellen verabreicht werden, an denen die Zielzellen vorliegen, so daß die physiologischen Effekte von IL-6 gehemmt werden, während Antikörper, die die physiologischen Wirkungen von IL-6 durch eine Bindung von IL-6 hemmen, an den Stellen verabreicht werden müssen, an denen IL-6 vorliegt, oder sie müssen auf die Stellen abgezielt werden, an denen IL-6 vorliegt.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung können die vorliegenden Monoclonalen Antikörper, wie z.B. GPZ 35, GPX 7 und GPX 22, einfach hergestellt werden, indem ein Hybridom, wie z.B. GPZ 35, GPX 7 und GPX 22, in vitro in einem Medium gezüchtet wird oder indem das Hybridom in ein Tier, z.B. eine Maus, intraperitoneal eingeimpft und gegebenenfalls der erzeugte monodonale Antikörper gewonnen wird.
- Die Erfindung erstreckt sich auch auf die Verwendung eines Monoclonalen Antikörpers, der spezifisch das gp130-Protein, ein IL-6-Signal-übertragendes Protein, erkennt, bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Hemmung der physiologischen Wirkung von IL-6, wobei der Antikörper aus dem Hybridom GPZ 35 (FERM BP-4263), aus dem Hybridom GPX 7 (FERM BP- 4261) oder aus dem Hybridom GPX 22 (FERM BP-4262) erhalten werden kann.
Claims (19)
1. Monoclonaler Antikörper, der spezifisch das
gp130-Protein erkennt, welches ein Interleukin-6
(IL-6)-Signalübertragendes Protein ist, und der fähig ist,
IL-6-Funktionen im gleichen Ausmaß zu hemmen, wie es in der
Abwesenheit von IL-6 erreicht wird, wenn der Monoclonale
Antikörper in einem Überschuß bezogen auf das
gp130-Protein vorhanden ist.
2. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 1, wobei das
gp130-Protein vom Menschen stammt.
3. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, wobei
der monoclonale Antikörper Antikörper GPZ 35 ist,
erhältlich vom Hybridom GPZ 35 (FERM BP-4263).
4. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, wobei
der monoclonale Antikörper Antikörper GPX 7 ist,
erhältlich vom Hybridom GPX 7 (FERM BP-4261).
5. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, wobei
der monoclonale Antikörper Antikörper GPX 22 ist,
erhältlich vom Hybridom GPX 22 (FERM BP 4262).
6. Hybridom, das einen monoclonalen Antikörper produziert,
der spezifisch das gp130-Protein erkennt, welches ein
IL-6-Signal-übertragendes Protein ist, und der fähig
ist, IL-6-Funktionen im gleichen Ausmaß zu hemmen, wie
es in der Abwesenheit von IL-6 erreicht wird, wenn der
monoclonale Antikörper in einem Überschuß bezogen auf
das gp130-Protein vorhanden ist.
7. Hybridom nach Anspruch 6, wobei das gp130-Protein vom
Menschen stammt.
8. Hybridom nach Anspruch 6 oder 7, wobei das Hybridom GPZ
35 (FERM BP-4263) ist.
9. Hybridom nach Anspruch 6 oder 7, wobei das Hybridom GPX
7 (FERM BP 4261) ist.
10. Hybridom nach Anspruch 6 oder 7, wobei das Hybridom GPX
22 (FERM BP-4262) ist.
11. Verfahren zur Produktion eines monoclonalen Antikörpers,
der spezifisch das 9p130-Protein erkennt, welches ein
IL-6-Signal-übertragendes Protein ist, und der fähig
ist, IL-6-Funktionen im gleichen Ausmaß zu hemmen, wie
es in Abwesenheit von IL-6 erreicht wird, wenn der
monodonale Antikörper in einem Überschuß bezogen auf das
gp130-Protein vorhanden ist, umfassend die Züchtung
eines Hybridoms, das den Monoclonalen Antikörper
produziert, in vitro oder in vivo.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Hybridom GPZ 35
(FERM BP-4263) ist.
13. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Hybridom GPX 7
(FERM BP-4261) ist.
14. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Hybridom GPX 22
(FERM BP-4262) ist.
15. Zusammensetzung zur Hemmung einer physiologischen
Wirkung von IL-6, umfassend in Kombination mit einem Träger
einen monoclonalen Antikörper, der spezifisch das gp130-
Protein erkennt, welches ein IL-6-Signal-übertragendes
Protein ist, und der fähig ist, die IL-6-Funktionen im
gleichen Ausmaß zu hemmen, wie es in der Abwesenheit von
IL-6 erreicht wird, wenn der Monoclonale Antikörper in
einem Überschuß bezogen auf das gp130-Protein vorhanden
ist.
16. Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei das
gp130-Protein vom Menschen stammt.
17. Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder 16, wobei der
monodonale Antikörper der vom Hybridom GPZ 35 (FERM BP-
4263) erhältliche Antikörper ist.
18. Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder 16, wobei der
monodonale Antikörper der vom Hybridom GPX 7 (FERM
BP-4261) erhältliche Antikörper ist.
19. Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder 16, wobei der
monodonale Antikörper der vom Hybridom GPX 22 (FERM BP-
4262) erhältliche Antikörper ist.
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