JP7206772B2 - ヒトｇｐ１３０受容体に対するヒト化抗体 - Google Patents
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Description
本発明は、ヒトｇｐ１３０受容体に結合することでヒトｇｐ１３０受容体を介したシグナル伝達を抑制可能な抗体に関する。特に本発明は、抗ヒトｇｐ１３０受容体マウス抗体のアミノ酸配列のうち、相補性決定領域以外のアミノ酸配列をヒト抗体由来のアミノ酸配列に置換し（ヒト化し）、かつヒトｇｐ１３０受容体に対する親和性が前記マウス抗体と同等以上である抗体に関する。
インターロイキン－６（ＩＬ－６）は、関節リウマチやキャッスルマン病のような自己免疫疾患、骨格系の疾病、癌、心臓病、肥満、糖尿病、喘息、アルツハイマー病、多発性硬化症等、多数の疾病に関与していると考えられている。これらは、ＩＬ－６シグナルの抑制がこれら疾病の治療に有益になり得る可能性を示唆している。
ＩＬ－６は、ＩＬ－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）に結合し、その複合体がｇｐ１３０受容体に結合してできる三量体がさらに二量体化することで伝達される（非特許文献１）。また、ＩＬ－６Ｒおよびｇｐ１３０受容体は細胞膜上だけではなく可溶形態でも存在しており生体内でＩＬ－６のシグナルを伝達、抑制していると考えられている（非特許文献２）。さらにｇｐ１３０受容体は、ＩＬ－６の他にＩＬ－６ファミリーに属するインターロイキン１１（ＩＬ－１１）、インターロイキン２７（ＩＬ－２７）、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルジオトロフィン－１（ＣＴ－１）等のシグナル伝達にも関与している（非特許文献３）。
近年、モノクローナル抗体を利用した医薬品（抗体医薬品）の開発が進められている。例えば、リウマチによる炎症に対する抗体医薬品として腫瘍壊死因子（ＴＮＦ－α）やＩＬ－６Ｒに対する抗体医薬品が販売され高い治療効果を上げている。
通常モノクローナル抗体はマウス、ラット、ウサギ等由来の動物細胞を用いて作製される。そのため、それらモノクローナル抗体をそのままヒトに投与するとヒトの免疫系によって異物として認識される。特に一般的なマウスモノクローナル抗体をヒトに投与すると、ヒト抗マウス抗体（Ｈｕｍａｎ ＡｎｔｉＭｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ：「ＨＡＭＡ」）が産生され免疫応答が起こり異物として排除される。従って、マウス抗体をヒトに繰返し投与することはできない。このような抗体をヒトに投与するためには、抗体の特異性を保持したままＨＡＭＡ応答を起こさないように抗体分子を改良する必要がある。
一般に、抗体（免疫グロブリン）は、分子量の大きな重鎖（Ｈ鎖）および分子量の小さな軽鎖（Ｌ鎖）から構成されている。重鎖と軽鎖は、ともにＮ末端から約１１０残基において可変領域と称されるアミノ酸配列の異なる領域を有しており、重鎖の可変領域はＶＨ、軽鎖の可変領域はＶＬと表される。このＶＨとＶＬは３つのＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：相補性決定領域）と立体構造の維持に働いている４つのＦＲ（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ：フレームワーク領域）から構成されており、ＶＨとＶＬが相対して静電的な結合を形成することにより、抗原結合部位が形成される。ＣＤＲの中でも特にアミノ酸配列の変異の頻度が高い領域を超可変領域といい、この重鎖の超可変領域と軽鎖の超可変領域が、抗体固有の抗原結合部位構造をつくりだし、抗原への親和性・特異性を決定する。
ＨＡＭＡ応答を避けるためにはヒトの抗体に構造が類似し、異物として認識されない抗体が必要である。これまでに、抗体の可変領域以外の領域である定常領域のみをヒト抗体の構造としたキメラ抗体、定常領域および可変領域中のＣＤＲ以外の部位をヒト抗体の構造としたヒト化抗体（図１）およびヒト抗体がある。ヒト抗体はヒトＢ細胞の不死化、ヒトＢ細胞から得た抗体遺伝子や人工的に作製したヒト抗体可変領域遺伝子を遺伝子組換えで発現させスクリーニングする方法、またはヒト抗体を作製可能なマウスを用いることにより作製される。ヒト化抗体はキメラ抗体に比べるとヒト抗体の構造により類似しているため、キメラ抗体に比べ免疫原性は低いと考えられている。
一般に抗体をヒト化する場合、ヒト化前の抗体のＦＲとアミノ酸配列が近いヒト抗体のＦＲを選択したり、計算化学を用いたシミュレーションでＣＤＲの構造が崩れないようなヒト抗体のＦＲを選択したりすることで分子設計し作製する。しかしながら多くの場合、設計したヒト化抗体の親和性はヒト化前の抗体と比較して低下するため、親和性を維持したヒト化抗体を得るには多くの労力が必要である。
Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３００、２１０１－２１０４（２００３）
Ｎａｒａｚａｋｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，８２，１１２０－１１２６（１９９３）
Ｈｅｉｎｒｉｃｈ Ｐ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３３４，２９７－３１４（１９９８）
本発明の課題は、ヒトｇｐ１３０受容体に結合することでヒトインターロイキン－６およびそのファミリーサイトカインのシグナル伝達を阻害するマウス抗体が有するヒトｇｐ１３０受容体に対する親和性を低下させることなく、相補性決定領域以外のアミノ酸配列をヒト抗体由来のアミノ酸配列に置換した（ヒト化した）抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体を提供することにある。
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、ヒトｇｐ１３０受容体に結合することでヒトインターロイキン－６およびそのファミリーサイトカインのシグナル伝達を阻害するマウス抗体が有するヒトｇｐ１３０受容体に対する親和性を低下させないヒト抗体由来のフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明の第一の態様は、重鎖可変（ＶＨ）領域が配列番号２５に記載のアミノ酸配列、または配列番号２５に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、を含むポリペプチドであり、軽鎖可変（ＶＬ）領域が配列番号７６、７７もしくは８０に記載のアミノ酸配列、または配列番号７６、７７もしくは８０に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、を含むポリペプチドであり、かつヒトｇｐ１３０受容体に対するＫＤ値が０．６ｎＭ以下である、抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体である。
また本発明の第二の態様は、ＶＬ領域が配列番号７６に記載のアミノ酸配列または配列番号７６に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ヒトｇｐ１３０受容体に対するＫＤ値が０．３ｎＭ以下である、第一の態様に記載の抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体である。
また本発明の第三の態様は、重鎖可変（ＶＨ）領域が配列番号２５に記載のアミノ酸配列、または配列番号２５に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、を含むポリペプチドであり、軽鎖可変（ＶＬ）領域が配列番号７６、７７もしくは８０に記載のアミノ酸配列、または配列番号７６、７７もしくは８０に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、を含むポリペプチドであり、かつヒトＩＬ－６シグナルおよびその他ＩＬ－６ファミリーに属するサイトカインのシグナルを抑制することができる、抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体である。
また本発明の第四の態様は、ＶＨ領域が配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＶＬ領域が配列番号７６、７７または８０に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、第一または第三の態様に記載の抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体である。
さらに本発明の第五の態様は、配列番号２５に記載のアミノ酸配列、または配列番号２５に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、を含む抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体重鎖可変（ＶＨ）領域をコードするポリヌクレオチドである。
さらに本発明の第六の態様は、配列番号７６、７７もしくは８０に記載のアミノ酸配列、または配列番号７６、７７もしくは８０に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、を含む抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体軽鎖可変（ＶＬ）領域をコードするポリヌクレオチドである。
また本発明の第七の態様は、前記第五および／または第六の態様に記載のポリヌクレオチドを少なくとも含む、ベクターである。
また本発明の第八の態様は、前記第五の態様に記載のポリヌクレオチドを少なくとも含むベクター、および前記第六の態様に記載のポリヌクレオチドを少なくとも含むベクターで共形質転換し得られた、形質転換体である。
また本発明の第九の態様は、前記第五および第六の態様に記載のポリヌクレオチドを少なくとも含むベクターで形質転換し得られた、形質転換体である。
また本発明の第十の態様は、前記第八または第九の態様に記載の形質転換体を培養して抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体を発現させる工程と、前記形質転換体の培養物から発現した抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体を回収する工程とを含む、抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体の製造方法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において抗体とは、４つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合で相互に連結された２本の重鎖（Ｈ鎖）、および２本の軽鎖（Ｌ鎖）を含む免疫グロブリン分子を意味する。重鎖はそれぞれ、重鎖可変（ＶＨ）領域および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を含む。軽鎖はそれぞれ、軽鎖可変（ＶＬ）領域および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）で構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）領域と、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる高度に保存された領域とに分類される。ＣＤＲの定義は、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ 第５版（１９９１））、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、ｃｏｎｔａｃｔの定義が一般的に使用されており、本明細書中のＣＤＲはＫａｂａｔの定義に基づいている。ＶＨ領域およびＶＬ領域はそれぞれ、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成されており、これらはアミノ末端からカルボキシ末端への方向でＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番で配置されている。
本発明の抗体は、ヒトｇｐ１３０受容体に特異的に結合しヒトＩＬ－６およびその他ＩＬ－６ファミリーに属するサイトカインのシグナル伝達を阻害する、配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなる重鎖（Ｈ鎖）と配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖（Ｌ鎖）とを有した抗ヒトｇｐ１３０受容体マウスモノクローナル抗体のうち、ＣＤＲ以外のアミノ酸配列をヒト抗体由来のアミノ酸配列に変換し（ヒト化し）、かつ前記マウスモノクローナル抗体が有するヒトｇｐ１３０受容体に対する親和性（具体的には、ＫＤ値＝０．６ｎＭ）と同等以上の抗体である。本発明の抗体の一例として、ＶＨ領域が配列番
号２５に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＶＬ領域が配列番号７６または７７に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドである抗体があげられる。
号２５に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＶＬ領域が配列番号７６または７７に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドである抗体があげられる。
また前記可変領域（ＶＨ領域およびＶＬ領域）のうちＦＲ領域については、ヒトｇｐ１３０受容体への結合能（具体的にはＫＤ値が０．６ｎＭ以下）またはヒトＩＬ－６およびその他ＩＬ－６ファミリーに属するサイトカインのシグナルを抑制する活性が保持される限り、１または数残基のアミノ酸置換、欠失、挿入または付加（以下、まとめて「改変」という）が生じてもよい。当該改変の割合は可変領域全体に対し１０％以下（すなわち、ＶＨ領域では配列番号２５に記載のアミノ酸配列に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性、ＶＬ領域では配列番号７６、７７または８０に記載のアミノ酸配列に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性）であればよく、５％以下であれば好ましく、２％以下であればより好ましい。
また前記可変領域（ＶＨ領域およびＶＬ領域）のうち、ＣＤＲ（具体的には、Ｈ鎖ＣＤＲ１：配列番号１７［配列番号１５では５０番目から５４番目、配列番号２５では３１番目から３５番目までのアミノ酸残基］、Ｈ鎖ＣＤＲ２：配列番号１８［配列番号１５では６９番目から８５番目、配列番号２５では５０番目から６６番目までのアミノ酸残基］、Ｈ鎖ＣＤＲ３：配列番号１９［配列番号１５では１１８番目から１２８番目、配列番号２５では９９番目から１０９番目までのアミノ酸残基］、Ｌ鎖ＣＤＲ１：配列番号２２［配列番号２０では４６番目から５５番目、配列番号７６、７７および８０では２４番目から３３番目までのアミノ酸残基］、Ｌ鎖ＣＤＲ２：配列番号２３［配列番号２０では７１番目から７７番目、配列番号７６、７７および８０では４９番目から５５番目までのアミノ酸残基］、Ｌ鎖ＣＤＲ３：配列番号２４［配列番号２０では１１０番目から１１８番目、配列番号７６、７７および８０では８８番目から９６番目までのアミノ酸残基］）については原則改変しないが、ヒトｇｐ１３０受容体への結合能（具体的にはＫＤ値が０．６ｎＭ以下）またはヒトＩＬ－６およびその他ＩＬ－６ファミリーに属するサイトカインのシグナル伝達を阻害する活性が保持される限り、１または数残基の改変が生じてもよい。当該改変の割合は、好ましくは各ＣＤＲに対し３０％以下（ただし、前記ＦＲ領域における改変と併せ、可変領域全体に対する改変の割合が１０％以下、以下同じ）であり、より好ましくは２０％以下であり、更により好ましくは１０％以下である。
なお前述したアミノ酸置換には、機能特性が実質的に変化していない置換（保守的アミノ酸置換）も含まれる。保守的アミノ酸置換の一例として、バリン－ロイシン－イソロイシン間の置換、フェニルアラニン－チロシン間の置換、リジン－アルギニン間の置換、アラニン－バリン間の置換、グルタミン酸－アスパラギン酸間の置換、アスパラギン－グルタミン間の置換があげられる。
本発明の抗体のうち、ＶＬ領域を配列番号７６に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドとすると、マウス抗体よりもヒトｇｐ１３０受容体に対する親和性が向上（ＫＤ値０．３ｎＭ以下）するため、本発明の抗体の好ましい態様といえる。なおＶＬ領域が配列番号７６に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有した（ＶＬ領域全体に対して１０％以内のアミノ酸置換が生じた）ポリペプチドであっても、前記親和性（ヒトｇｐ１３０受容体に対するＫＤ値が０．３ｎＭ以下）を有している限り、本発明の抗体の好ましい態様に含まれる。
抗ヒトｇｐ１３０受容体マウス抗体をヒト化して本発明の抗体を取得する際、最も重要な点は、ヒト抗体由来のＦＲ領域アミノ酸配列の選択である。ヒト化抗体の作製法は、今までにいくつかの報告がなされているが、おおよそ３つの方法に分けることができる。１つ目の方法は、既に三次元構造の明らかとなったヒト抗体フレームを用いる方法である（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２，３２３－３２７（１９８８）；Ｔｅｍｐｓｔ，ＰＲ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，１５０１－１５０７（１９９４））。２つ目の方法は、データベースにより、目的のマウス抗体可変領域と最も高いホモロジーを持つヒト抗体可変領域を選択し、そのフレームを用いる方法である（Ｑｕｅｅｎ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８６，１００２９－１００３３（１９８９））。３つ目の方法は、ヒト抗体のフレームで最も共通に用いられるアミノ酸を選択する方法である（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ＣＡ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４，７７３－７８３（１９９１））。なお、本明細書実施例においては前記２つ目の方法を選択しているが、本発明の抗体は他の方法を用いても取得可能である。
本発明の抗体のうち、ＶＨ領域およびＶＬ領域以外の定常領域には特に限定はない。例えばヒトであればＨ鎖の定常領域には４種類：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４が存在し、Ｌ鎖の定常領域には２種類：κ鎖、λ鎖ありこれらから選択すればよい。Ｈ鎖の定常領域は生体内で抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）や補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）の強さに影響を与えることが知られており、その必要性に応じ、適宜選択すればよい。ＡＤＣＣやＣＤＣで目的細胞を死滅させることを目的とした抗体を作製する場合はＡＤＣＣやＣＤＣが高くなるサブクラスを選択すればよく、またＡＤＣＣやＣＤＣが不要な抗体を作製する場合はＡＤＣＣやＣＤＣが低くなるサブクラスを選択すればよい。なお抗体におけるＡＤＣＣやＣＤＣの増強または減少は、抗体の定常領域のアミノ酸残基を置換および／または抗体に付加する糖鎖を変更することで行なってもよい。
また、本発明の抗体は小型化してもよい。小型化抗体とは、抗原（例えば、ヒトｇｐ１３０受容体）に特異的に結合する能力を保持する、抗体のフラグメントを意味する。例としては、
（ｉ）Ｆａｂフラグメント：ＶＬ領域、ＶＨ領域、ＣＬ１ドメインおよびＣＨ１ドメインからなるフラグメント
（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント：ヒンジ領域においてジスルフィド架橋で連結された２つのＦａｂフラグメントを含むフラグメント
（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント：ＶＨ領域およびＣＨ１ドメインからなるフラグメント
（ｉｖ）Ｆｖフラグメント：抗体の単一のアームのＶＬ領域およびＶＨ領域からなるフラグメント
が挙げられる。このうち（ｉｖ）Ｆｖフラグメントの２つの領域であるＶＬ領域およびＶＨ領域は通常別々の遺伝子によってコードされているが、ＶＬ領域とＶＨ領域とが対をなし、かつ合成リンカーを介して両領域が結合した態様（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ））を遺伝子組換え技術を用いて作製してもよい。
（ｉ）Ｆａｂフラグメント：ＶＬ領域、ＶＨ領域、ＣＬ１ドメインおよびＣＨ１ドメインからなるフラグメント
（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント：ヒンジ領域においてジスルフィド架橋で連結された２つのＦａｂフラグメントを含むフラグメント
（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント：ＶＨ領域およびＣＨ１ドメインからなるフラグメント
（ｉｖ）Ｆｖフラグメント：抗体の単一のアームのＶＬ領域およびＶＨ領域からなるフラグメント
が挙げられる。このうち（ｉｖ）Ｆｖフラグメントの２つの領域であるＶＬ領域およびＶＨ領域は通常別々の遺伝子によってコードされているが、ＶＬ領域とＶＨ領域とが対をなし、かつ合成リンカーを介して両領域が結合した態様（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ））を遺伝子組換え技術を用いて作製してもよい。
前述した抗体や小型化抗体はタンパク質であることから、これらタンパク質をコードするポリヌクレオチドをそのまま宿主細胞に導入しても構わないが、プロモーターやシグナルぺプチドを含む発現ベクターにクローニングし、当該ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体を培養することで製造すると好ましい。抗体や小型化抗体をコードするポリヌクレオチドを設計する際は、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換すればよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。前記宿主細胞には特に限定はなく、一例として、哺乳動物細胞（ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞、ＨＥＫ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞等）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ等）、昆虫細胞（Ｓｆ９、Ｓｆ２１等）、大腸菌（ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、Ｗ３１１０株等）や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）が挙げられる。中でも、抗体分子を発現させる場合は哺乳動物細胞が好ましく、ＣＨＯ細胞が特に好ましい。
前記発現ベクターは、宿主に応じたプロモーターやシグナルペプチドを含んでいればよい。一例をあげると、哺乳動物を宿主として用いた場合、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＥＦ１αプロモーターが例示でき、さらに各種分泌タンパク質に付加されているシグナルペプチドを組合せればよい。また宿主細胞に大腸菌を用いる場合にはＴ７プロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーターなどが例示でき、シグナルペプチドはＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥおよびＴｏｒＴが例示できる。また発現タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された宿主細胞を選択するために、必要であれば抗生物質のような薬剤マーカーを前記発現ベクターに導入してもよい。さらにＣＨＯ細胞で高発現細胞株を作製するときに行なわれる遺伝子増幅のためのマーカー（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子）を前記発現ベクターに含んでいてもよい。
本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクターにクローニングし、当該
ベクターで宿主を形質転換して、本発明の抗体を発現可能な形質転換体を作製する際、
本発明の抗体のＶＨ領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および本発明の抗体のＶＬ領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、それぞれ異なる発現ベクターにクローニング後、当該二つのベクターで宿主を形質転換して作製してもよく、
本発明の抗体のＶＨ領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび本発明の抗体のＶＬ領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、一つの発現ベクターにクローニング後、当該一つのベクターで宿主を共形質転換して作製してもよい。
ベクターで宿主を形質転換して、本発明の抗体を発現可能な形質転換体を作製する際、
本発明の抗体のＶＨ領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および本発明の抗体のＶＬ領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、それぞれ異なる発現ベクターにクローニング後、当該二つのベクターで宿主を形質転換して作製してもよく、
本発明の抗体のＶＨ領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび本発明の抗体のＶＬ領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、一つの発現ベクターにクローニング後、当該一つのベクターで宿主を共形質転換して作製してもよい。
形質転換体を培養することで発現した抗体は、前記形質転換体の培養物から、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどを組み合わせて精製・回収することで製造できる。
本発明の抗体は、抗ヒトｇｐ１３０受容体マウス抗体のアミノ酸配列のうち、相補性決定領域以外のアミノ酸配列をヒト抗体由来のアミノ酸配列に置換した抗体であり、前記マウス抗体と比較し、免疫原性が大幅に低下している。一方、本発明の抗体が有するヒトｇｐ１３０受容体に対する親和性は、前記マウス抗体と同等以上である。したがって本発明の抗体は、ＩＬ－６ファミリーサイトカインの異常によって引き起こされる疾病（例えば関節リウマチ等の自己免疫疾患）の治療に有用であることが期待される。
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は当該実施例に限定されるものではない。
実施例１ 可溶性ヒトｇｐ１３０受容体の調製
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトｇｐ１３０受容体のうち細胞外領域（配列番号１の１番目のメチオニンから６１９番目のグルタミン酸までの領域）を発現させるためのベクターを以下の方法で構築した。
（１－１）配列番号２に記載のヌクレオチド配列からなるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ｄｈｆｒ）およびＳＶ４０のＰｏｌｙＡをコードする遺伝子の５’末端側および３’末端側に制限酵素ＳａｃＩＩ認識配列（ＣＣＧＣＧＧ）を付加した遺伝子を全合成し（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社に委託）、プラスミドにクローニングした。
（１－２）（１－１）で作製したプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体を培養し、プラスミドを抽出したのち、制限酵素ＳａｃＩＩで消化することで、ｄｈｆｒ－ＳＶ４０ＰｏｌｙＡをコードする遺伝子を調製しｄｈｆｒ－ＳＶ４０ＰｏｌｙＡ－Ｐ１と命名した。
（１－３）ｐＩＲＥＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型として、配列番号３（５’－ＴＣＣ［ＣＣＧＣＧＧ］ＧＣＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＧＧＴＴＣＧＡＡＡＴＧＡＣＣＧ－３’）および配列番号４（５’－ＴＣＣ［ＣＣＧＣＧＧ］ＧＧＴＧＧＣＴＣＴＡＧＣＣＴＴＡＡＧＴＴＣＧＡＧＡＣＴＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号３および配列番号４中の角かっこは制限酵素ＳａｃＩＩ認識配列を示している）を用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表１に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で３０秒間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で５分間の第３ステップを１サイクルとする反応を２５サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより、ｐＩＲＥＳベクターのうちネオマイシン耐性遺伝子を除いた領域を増幅した。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトｇｐ１３０受容体のうち細胞外領域（配列番号１の１番目のメチオニンから６１９番目のグルタミン酸までの領域）を発現させるためのベクターを以下の方法で構築した。
（１－１）配列番号２に記載のヌクレオチド配列からなるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ｄｈｆｒ）およびＳＶ４０のＰｏｌｙＡをコードする遺伝子の５’末端側および３’末端側に制限酵素ＳａｃＩＩ認識配列（ＣＣＧＣＧＧ）を付加した遺伝子を全合成し（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社に委託）、プラスミドにクローニングした。
（１－２）（１－１）で作製したプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体を培養し、プラスミドを抽出したのち、制限酵素ＳａｃＩＩで消化することで、ｄｈｆｒ－ＳＶ４０ＰｏｌｙＡをコードする遺伝子を調製しｄｈｆｒ－ＳＶ４０ＰｏｌｙＡ－Ｐ１と命名した。
（１－３）ｐＩＲＥＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型として、配列番号３（５’－ＴＣＣ［ＣＣＧＣＧＧ］ＧＣＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＧＧＴＴＣＧＡＡＡＴＧＡＣＣＧ－３’）および配列番号４（５’－ＴＣＣ［ＣＣＧＣＧＧ］ＧＧＴＧＧＣＴＣＴＡＧＣＣＴＴＡＡＧＴＴＣＧＡＧＡＣＴＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号３および配列番号４中の角かっこは制限酵素ＳａｃＩＩ認識配列を示している）を用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表１に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で３０秒間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で５分間の第３ステップを１サイクルとする反応を２５サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより、ｐＩＲＥＳベクターのうちネオマイシン耐性遺伝子を除いた領域を増幅した。
（１－４）（１－３）で作製したＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＳａｃＩＩで消化し、（１－２）で調製したｄｈｆｒ－ＳＶ４０ＰｏｌｙＡ－Ｐ１とライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することでｄｈｆｒ遺伝子を含んだ発現ベクターｐＩＲＥＳ－ｄｈｆｒを得た。
（２）（１）で作製したｐＩＲＥＳ－ｄｈｆｒを鋳型として配列番号５（５’－ＡＣＧＣ［ＧＴＣＧＡＣ］ＡＣＴＡＧＡＡＧＣＴＴＴＡＴＴＧＣＧＧＴＡＧＴＴＴＡＴＣＡＣ－３’）および配列番号６（５’－ＡＣＧＣ［ＧＴＣＧＡＣ］ＡＧＡＴＣＴＧＴＣＧＡＧＣＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号５および配列番号６中の角かっこは制限酵素ＳａｌＩ認識配列を示している）を用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表１に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で７分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより、ｐＩＲＥＳ－ｄｈｆｒベクターのＣＭＶプロモーター遺伝子を除いた領域を増幅し、ｐＩＲＥＳ－ｄｈｆｒ－Ｐ１と命名した。
（３）ｐＥＢＭｕｌｔｉ－Ｎｅｏ（富士フイルム和光純薬社製）を鋳型として、配列番号７（５’－ＡＣＧＣ［ＧＴＣＧＡＣ］ＧＧＡＴＣＴＣＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧ－３’）および配列番号８（５’－ＡＣＧＣ［ＧＴＣＧＡＣ］ＣＡＡＡＡＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＣＡＣＡＡＴＡＡＣＣ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号７および配列番号８中の角かっこは制限酵素ＳａｌＩ認識配列を示している）を用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表１に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で２分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより、ｐＥＢＭｕｌｔｉ－Ｎｅｏに含まれるＣＡＧプロモーター（特許第２８２４４３３号公報）をコードする遺伝子を増幅し、ＣＡＧ－Ｐ１と命名した。
（４）（２）で作製したｐＩＲＥＳ－ｄｈｆｒ－Ｐ１および（３）で作製したＣＡＧ－Ｐ１をそれぞれ制限酵素ＳａｌＩで消化し、精製後ライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することでＣＡＧプロモーター遺伝子を含んだ発現ベクターｐＣＡＧ－ｄｈｆｒを得た。
（５）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトｇｐ１３０受容体のうち細胞外領域（配列番号１の１番目のメチオニンから６１９番目のグルタミン酸までの領域）をコードするポリヌクレオチドに、６個のヒスチジンをコードするオリゴヌクレオチドならびに制限酵素ＮｈｅＩ認識配列（ＧＣＴＡＧＣ）およびＮｏｔＩ認識配列（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）を付加したポリヌクレオチド（配列番号９）を全合成し（ＦＡＳＭＡＣ社に委託）、プラスミドにクローニング後、当該プラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体を培養し、プラスミドを抽出後、制限酵素ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで消化し精製することでヒトｇｐ１３０受容体の細胞外領域をコードする遺伝子を得た。
（６）（４）で作製したｐＣＡＧ－ｄｈｆｒを制限酵素ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、（５）で作製したヒトｇｐ１３０受容体の細胞外領域をコードする遺伝子をライゲーション後、当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。前記形質転換体の培養物からプラスミドを抽出することで、ヒトｇｐ１３０受容体の細胞外領域を発現するための発現ベクターｐＣＡＧ－ｈｇｐ１３０を得た。
（７）（６）で作製したｐＣＡＧ－ｈｇｐ１３０をＣＨＯ細胞（ＤＧ４４株）にＮｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて遺伝子導入した。その後、ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で形質転換細胞を培養し、メトトレキサート（ＭＴＸ）を用いて遺伝子増幅を行なった後、限外希釈法により安定な可溶性ヒトｇｐ１３０受容体タンパク質の生産細胞株を得た。
（８）（７）で得られた細胞株をＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ Ｍｅｄｉｕｍおよび三角フラスコを用いてＣＯ２インキュベーター中（３７℃、８％のＣＯ２）で振盪培養し、可溶性ヒトｇｐ１３０受容体タンパク質を分泌発現させた。得られた培養上清を２０ｍＭのイミダゾールと１５０ｍＭの塩化ナトリウムとを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で透析した後、遠心分離によって細胞および不純物を除去し得られた上清を、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、あらかじめ２０ｍＭのイミダゾールと１５０ｍＭの塩化ナトリウムとを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した１ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社製）に流速１ｍＬ／分でアプライした。前記平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．５Ｍのイミダゾール、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出した。溶出液を限外ろ過膜で１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に緩衝液交換することで高純度な可溶性ヒトｇｐ１３０受容体タンパク質を得た。
実施例２ 抗ｇｐ１３０受容体抗体産生ハイブリドーマの作製
（１）実施例１で作製した可溶性ヒトｇｐ１３０受容体タンパク質を、１０日に１回５０μｇずつ、合計４回に渡りＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に注射することで免疫を行なった。
（１）実施例１で作製した可溶性ヒトｇｐ１３０受容体タンパク質を、１０日に１回５０μｇずつ、合計４回に渡りＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に注射することで免疫を行なった。
（２）マウスから脾臓細胞を摘出し、マウス由来のミエローマ細胞（ＳＰ２／０株）とポリエチレングリコールを用いて融合させた。細胞融合後、ＨＡＴ（Ｇｉｂｃｏ社製）および１０％（ｗ／ｖ）のウシ血清を含んだＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にて培養することでハイブリドーマを作製した。
（３）（２）で作製したハイブリドーマを９６穴プレートにて培養し、その培養上清を下記に示すＥｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）を用いることでヒトｇｐ１３０受容体タンパク質に結合する抗体を分泌しているハイブリドーマが存在するウェルを選択した。
（３－１）実施例１で調製した可溶性ヒトｇｐ１３０受容体を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌで固定化した（４℃で一晩）。固定化終了後、２％（ｗ／ｖ）のＳＫＩＭ ＭＩＬＫ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）および１５０ｍＭ
化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）によりブロッキングした。
（３－２）洗浄緩衝液（０．０５％［ｗ／ｖ］のＴｗｅｅｎ ２０と１５０ｍＭのＮａＣｌとを含む２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液緩衝液（ｐＨ７．４））で洗浄後、抗体を含んだハイブリドーマ上清を添加し、抗体と固定化組換えヒトｇｐ１３０受容体タンパク質とを反応させた（３０℃で１時間）。
（３－３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したペルオキシターゼで標識された抗マウス抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（３－４）３０℃で１時間反応し、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。その後、１Ｍのリン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー（テカン社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定し、測定値の高いハイブリドーマを選択した。
（３－１）実施例１で調製した可溶性ヒトｇｐ１３０受容体を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌで固定化した（４℃で一晩）。固定化終了後、２％（ｗ／ｖ）のＳＫＩＭ ＭＩＬＫ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）および１５０ｍＭ
化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）によりブロッキングした。
（３－２）洗浄緩衝液（０．０５％［ｗ／ｖ］のＴｗｅｅｎ ２０と１５０ｍＭのＮａＣｌとを含む２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液緩衝液（ｐＨ７．４））で洗浄後、抗体を含んだハイブリドーマ上清を添加し、抗体と固定化組換えヒトｇｐ１３０受容体タンパク質とを反応させた（３０℃で１時間）。
（３－３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したペルオキシターゼで標識された抗マウス抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（３－４）３０℃で１時間反応し、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。その後、１Ｍのリン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー（テカン社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定し、測定値の高いハイブリドーマを選択した。
（４）（３）で選択したハイブリド－マについて、以下の操作を行なった。
（４－１）９６穴プレートの各ウェルにマウス由来の抗ヒトｇｐ１３０受容体モノクローナルＡＭ６４抗体（特開平３－２１９８９４号公報）を固定化した。
（４－２）各ウェルに、実施例１で調製した可溶性ヒトｇｐ１３０受容体を加えて前記ヒトｇｐ１３０受容体抗体と結合させた。
（４－３）各ウェルに、組換えヒトインターロイキン－６（ＩＬ－６）（富士フイルム和光純薬社製）と組換えヒトＩＬ－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）との混合物、および各ハイブリド－マの培養液上清を同時に添加した。
（４－４）前記条件下でＡＭ６４抗体および可溶性ヒトｇｐ１３０受容体を介して固定化されたＩＬ－６Ｒに、モルモットにＩＬ－６Ｒを免疫して製造した抗ＩＬ－６Ｒポリクローナル抗体およびアルカリフォスファターゼで標識した抗モルモットイムノグロブリン抗体を添加し、洗浄後、アルカリフォスファターゼ基質を添加することにより、添加した可溶性ヒトｇｐ１３０受容体タンパク質に対する抗体のＩＬ－６の結合阻害効果を測定した。
（４－５）（４－４）でＩＬ－６の結合阻害効果を示した細胞を限外希釈法にてモノクローン化し、ハイブリドーマを得た。得られたハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体を、抗体Ａと命名した。
（４－１）９６穴プレートの各ウェルにマウス由来の抗ヒトｇｐ１３０受容体モノクローナルＡＭ６４抗体（特開平３－２１９８９４号公報）を固定化した。
（４－２）各ウェルに、実施例１で調製した可溶性ヒトｇｐ１３０受容体を加えて前記ヒトｇｐ１３０受容体抗体と結合させた。
（４－３）各ウェルに、組換えヒトインターロイキン－６（ＩＬ－６）（富士フイルム和光純薬社製）と組換えヒトＩＬ－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）との混合物、および各ハイブリド－マの培養液上清を同時に添加した。
（４－４）前記条件下でＡＭ６４抗体および可溶性ヒトｇｐ１３０受容体を介して固定化されたＩＬ－６Ｒに、モルモットにＩＬ－６Ｒを免疫して製造した抗ＩＬ－６Ｒポリクローナル抗体およびアルカリフォスファターゼで標識した抗モルモットイムノグロブリン抗体を添加し、洗浄後、アルカリフォスファターゼ基質を添加することにより、添加した可溶性ヒトｇｐ１３０受容体タンパク質に対する抗体のＩＬ－６の結合阻害効果を測定した。
（４－５）（４－４）でＩＬ－６の結合阻害効果を示した細胞を限外希釈法にてモノクローン化し、ハイブリドーマを得た。得られたハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体を、抗体Ａと命名した。
（５）下記に示す方法で抗体Ａを調製した。
（５－１）（４）で得られた、抗体Ａを産生するハイブリドーマを、３０ｍＬのＨｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）が入った５枚の１５０ｍｍφディッシュ（住友ベークライト社製）で、それぞれ培養した。培養後、遠心分離により培養上清を取得した。
（５－２）（５－１）で得られた上清を、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、あらかじめ１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した１ｍＬのＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥヘルスケア社製）に流速１ｍＬ／分でアプライした。
（５－３）前記平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．８）で溶出した。なお得られた溶出液は、溶出液量の１／４量の１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えることでｐＨを中性付近に戻した。当該精製により、高純度の抗体Ａを約５ｍｇ得た。
（５－１）（４）で得られた、抗体Ａを産生するハイブリドーマを、３０ｍＬのＨｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）が入った５枚の１５０ｍｍφディッシュ（住友ベークライト社製）で、それぞれ培養した。培養後、遠心分離により培養上清を取得した。
（５－２）（５－１）で得られた上清を、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、あらかじめ１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した１ｍＬのＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥヘルスケア社製）に流速１ｍＬ／分でアプライした。
（５－３）前記平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．８）で溶出した。なお得られた溶出液は、溶出液量の１／４量の１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えることでｐＨを中性付近に戻した。当該精製により、高純度の抗体Ａを約５ｍｇ得た。
実施例３ 抗体遺伝子の配列解析
（１）実施例２（４）で得られた、抗体Ａを産生するハイブリドーマを１００μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび１０％（ｗ／ｖ）のウシ血清を含んだＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）１０ｍＬを添加した、９０ｍｍφの培養ディッシュにて培養した。培養上清をＩｓｏＳｔｒｉｐ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ（ロッシュ社製）を用いて各抗体のサブクラスを確認したところ、抗体ＡはＨ鎖がＩｇＧ１でＬ鎖がκであることを確認した。
（１）実施例２（４）で得られた、抗体Ａを産生するハイブリドーマを１００μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび１０％（ｗ／ｖ）のウシ血清を含んだＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）１０ｍＬを添加した、９０ｍｍφの培養ディッシュにて培養した。培養上清をＩｓｏＳｔｒｉｐ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ（ロッシュ社製）を用いて各抗体のサブクラスを確認したところ、抗体ＡはＨ鎖がＩｇＧ１でＬ鎖がκであることを確認した。
（２）培養した細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出後、ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてｃＤＮＡライブラリーを作製した。
（３）（２）で作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲにより抗体遺伝子を増幅した。
具体的には、抗体Ａの重鎖（Ｈ鎖）遺伝子の増幅には、鋳型として抗体Ａを発現するハイブリドーマのｃＤＮＡライブラリーを用い、ＰＣＲプライマーとして配列番号１０（５’－ＧＣＡＴＡ［ＧＡＡＴＴＣ］ＣＣＣＧＧＧ－３’）および配列番号１１（５’－ＡＴＧＡＡＴ［ＧＣＧＧＣＣＧＣ］ＴＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＣ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（配列番号１０中の角かっこは制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列を示し、配列番号１１中の角かっこは制限酵素ＮｏｔＩ認識配列を示している）を用いた。
また抗体Ａの軽鎖（Ｌ鎖）の遺伝子の増幅には、鋳型として抗体Ａを発現するハイブリドーマのｃＤＮＡライブラリーを用い、ＰＣＲプライマーとして配列番号１０および配列番号１２（５’－ＡＴＧＡＡＴ［ＧＣＧＧＣＣＧＣ］ＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＡＣ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（配列番号１２中の角かっこは制限酵素ＮｏｔＩ認識配列を示している）を用いた。
ＰＣＲは、表２に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１．５分間の３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。
具体的には、抗体Ａの重鎖（Ｈ鎖）遺伝子の増幅には、鋳型として抗体Ａを発現するハイブリドーマのｃＤＮＡライブラリーを用い、ＰＣＲプライマーとして配列番号１０（５’－ＧＣＡＴＡ［ＧＡＡＴＴＣ］ＣＣＣＧＧＧ－３’）および配列番号１１（５’－ＡＴＧＡＡＴ［ＧＣＧＧＣＣＧＣ］ＴＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＣ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（配列番号１０中の角かっこは制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列を示し、配列番号１１中の角かっこは制限酵素ＮｏｔＩ認識配列を示している）を用いた。
また抗体Ａの軽鎖（Ｌ鎖）の遺伝子の増幅には、鋳型として抗体Ａを発現するハイブリドーマのｃＤＮＡライブラリーを用い、ＰＣＲプライマーとして配列番号１０および配列番号１２（５’－ＡＴＧＡＡＴ［ＧＣＧＧＣＣＧＣ］ＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＡＣ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（配列番号１２中の角かっこは制限酵素ＮｏｔＩ認識配列を示している）を用いた。
ＰＣＲは、表２に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１．５分間の３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。
（４）（３）で得られたＰＣＲ産物を精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化した発現ベクターｐＡＰ３ｎｅｏ（タカラバイオ社製）にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
（５）得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、抗体Ａの重鎖を発現可能なベクターｐＡＰ－ＡＨ、および軽鎖を発現可能なベクターｐＡＰ－ＡＬを抽出した。
（６）（５）で作製した発現ベクターのうち、抗体ＡのＨ鎖、Ｌ鎖をコードする遺伝子周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｖｅｒ．３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号１３（５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ－３’）または配列番号１４（５’－ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＣＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。
発現ベクターｐＡＰ－ＡＨで発現される抗体Ａ重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１５に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１６に、それぞれ示す。なおＫａｂａｔの定義によれば、配列番号１５に記載の配列からなる抗体Ａ重鎖ポリペプチドのうち相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）は、５０番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）から５４番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までの領域（配列番号１７、ＣＤＲ１）、６９番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）から８５番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までの領域（配列番号１８、ＣＤＲ２）および１１８番目のトレオニン（Ｔｈｒ）から１２８番目のチロシン（Ｔｙｒ）までの領域（配列番号１９、ＣＤＲ３）である。
発現ベクターｐＡＰ－ＡＬで発現される抗体Ａ軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２０に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２１に、それぞれ示す。なお配列番号２０に記載の配列からなる抗体Ａ軽鎖ポリペプチドのうちＣＤＲは、４６番目のアスパラギン（Ａｓｎ）から５５番目のチロシン（Ｔｙｒ）までの領域（配列番号２２、ＣＤＲ１）、７１番目のロイシン（Ｌｅｕ）から７７番目のセリン（Ｓｅｒ）までの領域（配列番号２３、ＣＤＲ２）および１１０番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から１１８番目のトレオニン（Ｔｈｒ）までの領域（配列番号２４、ＣＤＲ３）である。
実施例４ 抗体ＡのＶＨ領域のヒト化
配列番号１５に記載のアミノ酸配列のうち２０番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）から１３９番目のセリン（Ｓｅｒ）までのアミノ酸残基が、抗体Ａの重鎖可変（ＶＨ）領域である。また前述した通り、配列番号１５に記載のアミノ酸配列のうち５０番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）から５４番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）が抗体ＡのＨ鎖のＣＤＲ１、６９番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）から８５番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）が抗体ＡのＨ鎖のＣＤＲ２、１１８番目のトレオニン酸（Ｔｈｒ）から１２８番目のチロシン（Ｔｙｒ）が抗体ＡのＨ鎖のＣＤＲ３である。そこで、２０番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）から４９番目のトレオニン（Ｔｈｒ）までのフレームワーク領域（ＦＲ）１、５５番目のトリプトファン（Ｔｒｐ）から６８番目のグリシン（Ｇｌｙ）までのＦＲ２、８６番目のリジン（Ｌｙｓ）から１１７番目のアルギニン（Ａｒｇ）までのＦＲ３、および１２９番目のトリプトファン（Ｔｒｐ）から１３９番目のセリン（Ｓｅｒ）までのＦＲ４のアミノ酸配列について、ヒト抗体由来のアミノ酸配列を設計し、当該アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを作製した。
配列番号１５に記載のアミノ酸配列のうち２０番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）から１３９番目のセリン（Ｓｅｒ）までのアミノ酸残基が、抗体Ａの重鎖可変（ＶＨ）領域である。また前述した通り、配列番号１５に記載のアミノ酸配列のうち５０番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）から５４番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）が抗体ＡのＨ鎖のＣＤＲ１、６９番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）から８５番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）が抗体ＡのＨ鎖のＣＤＲ２、１１８番目のトレオニン酸（Ｔｈｒ）から１２８番目のチロシン（Ｔｙｒ）が抗体ＡのＨ鎖のＣＤＲ３である。そこで、２０番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）から４９番目のトレオニン（Ｔｈｒ）までのフレームワーク領域（ＦＲ）１、５５番目のトリプトファン（Ｔｒｐ）から６８番目のグリシン（Ｇｌｙ）までのＦＲ２、８６番目のリジン（Ｌｙｓ）から１１７番目のアルギニン（Ａｒｇ）までのＦＲ３、および１２９番目のトリプトファン（Ｔｒｐ）から１３９番目のセリン（Ｓｅｒ）までのＦＲ４のアミノ酸配列について、ヒト抗体由来のアミノ酸配列を設計し、当該アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（１）前述した４つのＦＲのアミノ酸配列について、マウス抗体（抗体Ａ）のアミノ酸配列からヒト抗体のアミノ酸配列に変更したもの（以下、ヒト化抗体Ａともいう）を、統合計算化学システム「ＭＯＥ」（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ社製）を用いて設計した。設計したヒト化抗体ＡのＶＨ領域（ｈＡＨ１）のアミノ酸配列を配列番号２５に、ｈＡＨ１をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２６に示した。
（２）（１）で設計した、ヒト化抗体ＡのＶＨ領域（ｈＡＨ１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２６に記載の配列からなるポリヌクレオチド）に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列（ＧＡＡＴＴＣ）およびＮｈｅＩ認識配列（ＧＣＴＡＧＣ）を付加し、かつクローニング後にフレームシフトをしないように調整したポリヌクレオチドを全合成（ＦＡＳＭＡＣ社に委託）し、それぞれプラスミドにクローニングした。
（３）実施例１（４）で作製したｐＣＡＧ－ｄｈｆｒを鋳型として配列番号２７（５’－ＴＴＴＡＡＡＴＣＡ［ＧＣＧＧＣＣＧＣ］ＧＣＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＧＡＡＡＴＡＡＣＣＴＣＴＧ－３’）および配列番号２８（５’ーＧＣＡＡＧＴＡＡＡＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＧＴＧＧＴＡＡＡ［ＣＧＡＴＣＧ］ＣＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣＧＴー３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号２７中の角かっこは制限酵素ＮｏｔＩ認識配列を示し、配列番号２８中の角かっこは制限酵素ＰｖｕＩ認識配列を示している）を用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表３に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で１分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより増幅したＰＣＲ産物（ＳＶ４０プロモーター、ｄｈｆｒ、ＳＶ４０のＰｏｌｙＡまでの領域を）をｄｈｆｒ－Ｐ１と命名した。
（４）ヒト抗体の重鎖定常領域を含んだｐＦＵＳＥｓｓ－ＣＨＩｇ－ｈＧ１（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）、ヒト抗体の軽鎖定常領域を含んだｐＦＵＳＥ２ｓｓ－ＣＬＩｇ－ｈｋ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）および（３）で作製したｄｈｆｒ－Ｐ１をそれぞれ制限酵素ＮｏｔＩおよびＰｖｕＩで消化・精製し、ライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで、ＳＶ４０プロモーター、ｄｈｆｒおよびＳＶ４０のＰｏｌｙＡを含んだｐＦＵＳＥｓｓ－ＣＨＩｇ－ｈＧ１およびｐＦＵＳＥ２ｓｓ－ＣＬＩｇ－ｈｋを得た。ｐＦＵＳＥｓｓ－ＣＨＩｇ－ｈＧ１にＳＶ４０プロモーター、ｄｈｆｒおよびＳＶ４０のＰｏｌｙＡを組込んだプラスミドをｐＦＵ－ＣＨＩｇ－ｄｈｆｒと命名し、ｐＦＵＳＥ２ｓｓ－ＣＬＩｇ－ｈｋにＳＶ４０プロモーター、ｄｈｆｒおよびＳＶ４０のＰｏｌｙＡを組込んだプラスミドをｐＦＵ－ＣＬＩｇ－ｄｈｆｒと命名した。
（５）（２）で作製した、ｈＡＨ１をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体を培養し、プラスミド抽出後、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩで消化することで、ｈＡＨ１をコードするポリヌクレオチド（配列番号２６に記載の配列を含んだポリヌクレオチド）を調製した。
（６）（４）で作製したｐＦＵ－ＣＨＩｇ－ｄｈｆｒを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩで消化・精製後、（５）で調製したポリヌクレオチドとライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで、ヒト化抗体Ａの重鎖（Ｈ鎖）を発現するプラスミドを作製した。
作製したプラスミドのうち、ｈＡＨ１（配列番号２５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２６）を含むプラスミドをｐＦＵ－ｈＡＨ１と命名した。
実施例５ 小型化抗体（Ｆａｂ）発現ベクターの構築（その１）
下記に示す方法で、ｈＡＨ１および抗体ＡのＬ鎖を発現可能なベクターを構築した。
下記に示す方法で、ｈＡＨ１および抗体ＡのＬ鎖を発現可能なベクターを構築した。
（１）ｐＦＵ－ｈＡＨ１を鋳型として配列番号２９（５’－ＧＡＧ［ＣＣＡＴＧＧ］ＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＧＣＡＡＣＣＡＧＧ－３’）および配列番号３０（５’ーＡＴＴ［ＡＡＧＣＴＴ］ＡＴＴＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＴＴＴＡＴＡＡＴＣＧＣＣＡＣＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧＣＴＣＡＡＣＴＴＴＣー３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号２９中の角かっこは制限酵素ＮｃｏＩ認識配列を示し、配列番号３０中の角かっこは制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を示している）を用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表３に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で１５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲによりｈＡＨ１にＦａｂ発現に必要な定常領域およびＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を付加したアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを増幅し、得られたＰＣＲ産物をｈＡＨ１－ＦＬＡＧ－Ｐと命名した。
（２）（１）で得られたｈＡＨ１－ＦＬＡＧ－ＰおよびｐＥＴ２６ｂ（ノバジェン社製）をそれぞれ制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、精製後にライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することでｈＡＨ１を含んだｐＥＴ－ｈＡＨ１を得た。
（３）（２）で得られたｐＥＴ－ｈＡＨ１を鋳型として、配列番号３１（５’－ＡＴＴ［ＧＡＡＴＴＣ］ＴＡＴＧＡＡＡＴＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＡＣＣＧＣ－３’）および配列番号３２（５’ーＡＴＴ［ＡＡＧＣＴＴ］＜ＧＣＧＧＣＣＧＣ＞ＴＴＡＴＴＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＴＴＴＡＴＡＡＴＣＧー３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号３１中の角かっこは制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列を示し、配列番号３２中の角かっこは制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を、山かっこは制限酵素ＮｏｔＩ認識配列をそれぞれ示している）を用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表３に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲによりＰｅｌＢシグナル＋ｈＡＨ１＋定常領域の一部＋ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを増幅し、得られたＰＣＲ産物をＰｅｌＢ－ｈＡＨ１－Ｐと命名した。
（４）（３）で得られたＰｅｌＢ－ｈＡＨ１－ＰおよびｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）をそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、精製後、ライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することでｈＡＨ１を含んだｐＵＣ－ｈＡＨ１を得た。
（５）実施例３（５）で得たｐＡＰ－ＡＬを鋳型として、配列番号３３（５’－ＧＣＣ［ＣＴＣＧＡＧ］ＣＡＡＡＧＴＧＴＴＣＴＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣ－３’）および配列番号３４（５’ーＡＴＡ［ＡＡＧＣＴＴ］ＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣー３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号３３中の角かっこは制限酵素ＸｈｏＩ認識配列を示し、配列番号３４中の角かっこは制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を示している）を用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表４に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより抗体ＡのＬ鎖のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを増幅し、得られたＰＣＲ産物をＡＬ－Ｐと命名した。
（６）ｐＥＴ２６ｂ（ノバジェン社製）を鋳型として配列番号３５（５’－ＴＡＴ［ＧＣＧＧＣＣＧＣ］ＧＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＣＣ－３’）および配列番号３６（５’ーＧＡＧＡＡＣＡＣＴＴＴＧ［ＣＴＣＧＡＧ］ＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＧＡＧー３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号３５中の角かっこは制限酵素ＮｏｔＩ認識配列を示し、配列番号３６中の角かっこは制限酵素ＸｈｏＩ認識配列を示している）を用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表４に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で１５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより遺伝子発現に必要なリボソームバインディングサイトおよびＰｅｌＢシグナルをコードするポリヌクレオチドを増幅し、得られたＰＣＲ産物をＰｅｌＢ－Ｐと命名した。
（７）（５）で得られたＡＬ－Ｐおよび（６）で得られたＰｅｌＢ－Ｐはオーバーラップする部分を含んでいる。そこでこれら２つ（ＡＬ－ＰおよびＰｅｌＢ－Ｐ）を鋳型として配列番号３５および配列番号３４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表５に示す組成の反応液を調製し、当該反応液
を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で１５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより遺伝子発現に必要なリボソームバインディングサイト、ＰｅｌＢシグナルおよびＡＬをコードするポリヌクレオチドを増幅し、得られたＰＣＲ産物をＰｅｌ－ＡＬ－Ｐと命名した。
を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で１５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより遺伝子発現に必要なリボソームバインディングサイト、ＰｅｌＢシグナルおよびＡＬをコードするポリヌクレオチドを増幅し、得られたＰＣＲ産物をＰｅｌ－ＡＬ－Ｐと命名した。
（８）（７）で得られたＰｅｌ－ＡＬ－Ｐおよび（４）で得られたｐＵＣ－ｈＡＨ１をそれぞれ制限酵素ＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、精製後ライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することでｈＡＨ１、ヒトＩｇＧ１の定常領域の一部および抗体Ａ（マウ
ス）のＬ鎖を含んだＦａｂ発現ベクターｐＵＣ－Ｆａｂ－ｈＡＨ１ｍＡＬを得た。
ス）のＬ鎖を含んだＦａｂ発現ベクターｐＵＣ－Ｆａｂ－ｈＡＨ１ｍＡＬを得た。
実施例６ 小型化抗体（Ｆａｂ）発現ベクターの構築（その２）
実施例５（８）で得られたｐＵＣ－Ｆａｂ－ｈＡＨ１ｍＡＬはＨ鎖がヒト化されている一方、Ｌ鎖は抗体Ａ（マウス）のＬ鎖を使用している。したがって、前記ヒト化Ｈ鎖（ｈＡＨ１）を抗体Ａ（マウス）のＨ鎖に置換することで小型化マウス抗体Ａ発現ベクターを作製した。
実施例５（８）で得られたｐＵＣ－Ｆａｂ－ｈＡＨ１ｍＡＬはＨ鎖がヒト化されている一方、Ｌ鎖は抗体Ａ（マウス）のＬ鎖を使用している。したがって、前記ヒト化Ｈ鎖（ｈＡＨ１）を抗体Ａ（マウス）のＨ鎖に置換することで小型化マウス抗体Ａ発現ベクターを作製した。
（１）実施例３（５）で得たｐＡＰ－ＡＨを鋳型として、配列番号３７（５’－ＡＧＴＧ［ＴＧＧＣＣＡ］ＡＡＧＡＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＣＡＡＣＡＧＴＣＴＧＧ－３’）および配列番号３８（５’ーＴＣＡ［ＧＣＧＧＣＣＧＣ］ＴＴＡＴＴＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＴＴＴＡＴＡＡＴＣＡＣＣＡＣＡＡＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＣＡＡＴー３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号３７中の角かっこは制限酵素ＭｓｃＩ認識配列を示し、配列番号３８中の角かっこは制限酵素ＮｏｔＩ認識配列を示している）を用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表３に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で１分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより増幅したＰＣＲ産物（マウス抗体ＡのＨ鎖＋ＦＬＡＧタグ）をｍＡＨ－Ｐと命名した。
（２）（１）で得られたｍＡＨ－Ｐおよび実施例５（８）で得られたｐＵＣ－Ｆａｂ－ｈＡＨ１ｍＡＬをそれぞれ制限酵素ＭｓｃＩおよびＮｏｔＩで消化、精製後ライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換
体からプラスミドを抽出することで抗体ＡのＨ鎖の一部および抗体ＡのＬ鎖を含んだＦａｂ発現ベクターｐＵＣ－Ｆａｂ－ｍＡＨｍＡＬを得た。
体からプラスミドを抽出することで抗体ＡのＨ鎖の一部および抗体ＡのＬ鎖を含んだＦａｂ発現ベクターｐＵＣ－Ｆａｂ－ｍＡＨｍＡＬを得た。
実施例７ 小型化抗体（Ｆａｂ）の調製
実施例５および６で得られた発現ベクターから、以下に示す方法で小型化抗体を発現させた。
実施例５および６で得られた発現ベクターから、以下に示す方法で小型化抗体を発現させた。
（１）実施例５（８）で得たｐＵＣ－Ｆａｂ－ｈＡＨ１ｍＡＬまたは実施例６（２）で得たｐＵＣ－Ｆａｂ－ｍＡＨｍＡＬで形質転換された大腸菌株ＪＭ１０９を、０．１％（ｗ／ｖ）のグルコースおよび１００μｇ／Ｌのカルベニシリンを添加した３ｍＬの２×ＹＴ培地（１６ｇ／Ｌトリプトン、１０ｇ／Ｌイーストエキストラクト、５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）にそれぞれ植菌し３７℃で一晩、振盪培養した。
（２）培養した各形質転換体を１サンプルあたり４本の１００ｍＬのバッフルフラスコに２０ｍＬの０．１％（ｗ／ｖ）のグルコースおよび１００μｇ／Ｌのカルベニシリンを添加した２×ＹＴ培地に各２００μＬ植菌し、３７℃で３時間振盪培養した。
（３）培養温度を３０℃に変更し３０分間振盪培養した後に、終濃度で１ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）を添加し更に２０時間培養した。培養終了後、４℃で８０００ｒｐｍ、２０分間遠心することで菌体と培養上清を分離し、培養上清を得た。
（４）（３）の培養で得られた培養上清から以下の方法で小型化抗体を精製した。
（４－１）１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した０．５ｍＬの抗ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティーゲル（シグマアルドリッチ社製）に、（３）の培養で得られた培養上清を添加した。
（４－２）（４－１）で平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）４ｍＬで溶出した。溶出後すぐに溶出液の１／４量の１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を添加することでｐＨを中性領域に戻した。
（４－３）（４－２）で中性化した溶出液を、１０ＫＤａカットの限外ろ過膜（ミリポア社製）で１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に緩衝液交換しながら濃縮した。
（４－１）１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した０．５ｍＬの抗ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティーゲル（シグマアルドリッチ社製）に、（３）の培養で得られた培養上清を添加した。
（４－２）（４－１）で平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）４ｍＬで溶出した。溶出後すぐに溶出液の１／４量の１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を添加することでｐＨを中性領域に戻した。
（４－３）（４－２）で中性化した溶出液を、１０ＫＤａカットの限外ろ過膜（ミリポア社製）で１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に緩衝液交換しながら濃縮した。
前記方法により高純度に精製した、ｐＵＣ－Ｆａｂ－ｍＡＨｍＡＬ（実施例６）から発現した小型化マウス抗体Ａを約０．３ｍｇ、およびｐＵＣ－Ｆａｂ－ｈＡＨ１ｍＡＬ（実施例５）から発現したＨ鎖がヒト化Ｈ鎖（ｈＡＨ１）、Ｌ鎖が抗体Ａ（マウス）のＬ鎖である小型化抗体（以降、ｈＡＨ１ｍＡＬともいう）を約０．１ｍｇ、それぞれ調製した。
実施例８ 小型化抗体（Ｆａｂ）が有する親和性
（１）実施例７（４）で調製した各小型化抗体を、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（ＧＥヘルスケア社製）にて８μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬおよび０．１２５μｇ／ｍＬに希釈した。
（１）実施例７（４）で調製した各小型化抗体を、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（ＧＥヘルスケア社製）にて８μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬおよび０．１２５μｇ／ｍＬに希釈した。
（２）実施例１で調製したヒトｇｐ１３０受容体を１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１０μｇ／ｍＬとなるように希釈し、センサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケア社製）へアミンカップリング法を用いて固定化した（固定化量３５２ＲＵ相当）。
（３）ヒトｇｐ１３０受容体を固定化したチップへ（１）で調製した各小型化抗体の希釈溶液を接触時間２００秒、解離時間８００秒、流速３０μＬ／分、温度２５℃の条件で流し、固定化したヒトｇｐ１３０受容体との相互作用をＢｉａｃｏｒｅＴ２００（ＧＥヘルスケア社製）にて測定した。測定後のチップは０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）で洗浄することで再生した。
得られた測定結果を解析ソフトにて親和性の解析を行なった結果、小型化マウス抗体Ａの親和性はｋａ＝１．４１×１０５［１／Ｍｓ］、ｋｄ＝８．４２×１０－５［１／ｓ］、ＫＤ＝５．９８×１０－１０［Ｍ］（０．６０ｎＭ）であり、小型化マウス抗体ＡのうちＶＨ領域をヒト化した小型化抗体ｈＡＨ１ｍＡＬの親和性はｋａ＝１．７８×１０５［１／Ｍｓ］、ｋｄ＝８．２１×１０－５［１／ｓ］、ＫＤ＝４．６０×１０－１０［Ｍ］（０．４６ｎＭ）であった。このことからｇｐ１３０受容体に対するｈＡＨ１ｍＡＬの親和性はマウス由来の抗体（抗体Ａ）とほぼ同等であることが分かった。
実施例９ 抗体ＡのＶＬ領域のヒト化（配列設計）
配列番号２０に記載のアミノ酸配列のうち２３番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から１２７番目のロイシン（Ｌｅｕ）までのアミノ酸残基が抗体Ａの軽鎖可変（ＶＬ）領域である。また前述した通り、配列番号２０に記載のアミノ酸配列のうち４６番目のアスパラギン（Ａｓｎ）から５５番目のチロシン（Ｔｙｒ）までが抗体ＡのＬ鎖のＣＤＲ１、７１番目のロイシン（Ｌｅｕ）から７７番目のセリン（Ｓｅｒ）までが抗体ＡのＬ鎖のＣＤＲ２、１１０番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から１１８番目のトレオニン（Ｔｈｒ）までが抗体ＡのＬ鎖のＣＤＲ３である。そこで、２３番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から４５番目のシステイン（Ｃｙｓ）までのフレームワーク領域（ＦＲ）１、５６番目のトリプトファン（Ｔｒｐ）から７０番目のチロシン（Ｔｙｒ）までのＦＲ２、７８番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１０９番目のシステイン（Ｃｙｓ）までのＦＲ３、および１１９番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）から１２７番目のロイシン（Ｌｅｕ）までのＦＲ４のアミノ酸配列について、ヒト抗体由来のアミノ酸配列を設計し、当該アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを作製した。
配列番号２０に記載のアミノ酸配列のうち２３番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から１２７番目のロイシン（Ｌｅｕ）までのアミノ酸残基が抗体Ａの軽鎖可変（ＶＬ）領域である。また前述した通り、配列番号２０に記載のアミノ酸配列のうち４６番目のアスパラギン（Ａｓｎ）から５５番目のチロシン（Ｔｙｒ）までが抗体ＡのＬ鎖のＣＤＲ１、７１番目のロイシン（Ｌｅｕ）から７７番目のセリン（Ｓｅｒ）までが抗体ＡのＬ鎖のＣＤＲ２、１１０番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から１１８番目のトレオニン（Ｔｈｒ）までが抗体ＡのＬ鎖のＣＤＲ３である。そこで、２３番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から４５番目のシステイン（Ｃｙｓ）までのフレームワーク領域（ＦＲ）１、５６番目のトリプトファン（Ｔｒｐ）から７０番目のチロシン（Ｔｙｒ）までのＦＲ２、７８番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１０９番目のシステイン（Ｃｙｓ）までのＦＲ３、および１１９番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）から１２７番目のロイシン（Ｌｅｕ）までのＦＲ４のアミノ酸配列について、ヒト抗体由来のアミノ酸配列を設計し、当該アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（１）前述した４つのＦＲのアミノ酸配列をマウス抗体のアミノ酸配列からヒト抗体のアミノ酸配列に変更したもの（以下、ヒト化抗体Ａともいう）を、統合計算化学システム「ＭＯＥ」（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ社製）を用いて設計した。設計した１３種のヒト化抗体ＡのＶＬ領域（それぞれＡＶＬ１からＡＶＬ１３と命名）のうち、ＡＶＬ１のアミノ酸配列を配列番号３９に、ＡＶＬ１をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号４０に、ＡＶＬ２のアミノ酸配列を配列番号４１に、ＡＶＬ２をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号４２に、ＡＶＬ３のアミノ酸配列を配列番号４３に、ＡＶＬ３をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号４４に、ＡＶＬ４のアミノ酸配列を配列番号４５に、ＡＶＬ４をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号４６に、ＡＶＬ５のアミノ酸配列を配列番号４７に、ＡＶＬ５をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号４８に、ＡＶＬ６のアミノ酸配列を配列番号４９に、ＡＶＬ６をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号５０に、ＡＶＬ７のアミノ酸配列を配列番号５１に、ＡＶＬ７をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号５２に、ＡＶＬ８のアミノ酸配列を配列番号５３に、ＡＶＬ８をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号５４に、ＡＶＬ９のアミノ酸配列を配列番号５５に、ＡＶＬ９をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号５６に、ＡＶＬ１０のアミノ酸配列を配列番号５７に、ＡＶＬ１０をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号５８に、ＡＶＬ１１のアミノ酸配列を配列番号５９に、ＡＶＬ１１をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号６０に、ＡＶＬ１２のアミノ酸配列を配列番号６１に、ＡＶＬ１２をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号６２に、ＡＶＬ１３のアミノ酸配列を配列番号６３に、ＡＶＬ１３をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号６４に、それぞれ示す。
（２）配列番号４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２および６４に記載のポリヌクレオチドに、制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列（ＧＡＡＴＴＣ）およびＢｓｉＷＩ認識配列（ＣＧＴＡＣＧ）をそれぞれ付加し、かつクローニング後にフレームシフトをしないように調整したポリヌクレオチドを全合成（ＦＡＳＭＡＣ社に委託）し、それぞれプラスミドにクローニングした。
（３）（２）で作製した、ヒト化抗体ＡのＶＬ領域をコードする１３種類のポリヌクレオチドをそれぞれ含むプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９株をそれぞれ形質転換した。得られた形質転換体を培養し、プラスミド抽出後、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｓｉＷＩで消化することで、１３種類のヒト化抗体ＡのＶＬ領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２および６４に記載の配列からなるポリヌクレオチド）を調製した。
（４）実施例４（４）で作製したｐＦＵ－ＣＬＩｇ－ｄｈｆｒを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｓｉＷＩで消化・精製後、（３）で調製した１３種類のヒト化抗体ＡのＶＬ領域をコードするポリヌクレオチドとそれぞれライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することでヒト化抗体ＡのＬ鎖を発現するプラスミドを作製した。
作製したプラスミドのうち、ＡＶＬ１（配列番号３９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４０）を含むプラスミドをｐＦＵ－ＡＬ１と命名し、ＡＶＬ２（配列番号４１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４２）を含むプラスミドをｐＦＵ－ＡＬ２と命名し、ＡＶＬ３（配列番号４３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４４）を含むプラスミドをｐＦＵ－ＡＬ３と命名し、ＡＶＬ４（配列番号４５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４６）を含むプラスミドをｐＦＵ－ＡＬ４と命名し、ＡＶＬ５（配列番号４７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４８）を含むプラスミドをｐＦＵ－ＡＬ５と命名し、ＡＶＬ６（配列番号４９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号５０）を含むプラスミドをｐＦＵ－ＡＬ６と命名し、ＡＶＬ７（配列番号５１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号５２）を含むプラスミドをｐＦＵ－ＡＬ７と命名し、ＡＶＬ８（配列番号５３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号５４）を含むプラスミドをｐＦＵ－ＡＬ８と命名し、ＡＶＬ９（配列番号５５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号５６）を含むプラスミドをｐＦＵ－ＡＬ９と命名し、ＡＶＬ１０（配列番号５７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号５８）を含むプラスミドをｐＦＵ－ＡＬ１０と命名し、ＡＶＬ１１（配列番号５９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６０）を含むプラスミドをｐＦＵ－ＡＬ１１と命名し、ＡＶＬ１２（配列番号６１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６２）を含むプラスミドをｐＦＵ－ＡＬ１２と命名し、ＡＶＬ１３（配列番号６３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６４）を含むプラスミドをｐＦＵ－ＡＬ１３と命名した。
実施例１０ 抗体ＡのＶＬ領域のヒト化（フレームライブラリー作製）
実施例９で得られたヒト化抗体ＡのＶＬ領域をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドから、以下に示す方法によりフレームライブラリーを作製した。
実施例９で得られたヒト化抗体ＡのＶＬ領域をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドから、以下に示す方法によりフレームライブラリーを作製した。
（１）実施例９で作製した１３種類のヒト化抗体ＡのＬ鎖がクローニングされたプラスミドのうち、ｐＦＵ－ＡＬ１、ｐＦＵ－ＡＬ２、ｐＦＵ－ＡＬ３、ｐＦＵ－ＡＬ４、ｐＦＵ－ＡＬ５、ｐＦＵ－ＡＬ６、ｐＦＵ－ＡＬ７、ｐＦＵ－ＡＬ８およびｐＦＵ－ＡＬ９をそれぞれ５０ｎｇ／μＬとなるように混合したものを鋳型とし、配列番号６５（５’－ＡＴＴＡ［ＣＴＣＧＡＧ］ＧＡＣＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴ－３’）および配列番号６６（５’－ＧＡＧＧＴＴＡＣＧＧＡＧＧＡＧＣＴＣＡＣＧＴＴ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマー（配列番号６５中の角かっこは制限酵素ＸｈｏＩ認識配列を示している）としＰＣＲを行なった。ＰＣＲは表４に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で３０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物はヒト化Ｌ鎖の可変領域にある４つのＦＲのうちＦＲ１をコードしておりこれをＡＬ－ＦＲ１Ａと命名した。
（２）実施例９で作製した１３種類のヒト化抗体ＡのＬ鎖がクローニングされたプラスミドのうち、ｐＦＵ－ＡＬ１０、ｐＦＵ－ＡＬ１１およびｐＦＵ－ＡＬ１２をそれぞれ５０ｎｇ／μＬとなるように混合したものを鋳型とし、配列番号６７（５’－ＡＴＴＡ［ＣＴＣＧＡＧ］ＧＡＧＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧ－３’）および配列番号６６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマー（配列番号６７中の角かっこは制限酵素ＸｈｏＩ認識配列を示している）としＰＣＲを（１）と同様に行なった。得られたＰＣＲ産物はヒト化Ｌ鎖の可変領域（ＶＬ領域）にある４つのＦＲのうちＦＲ１をコードしておりこれをＡＬ－ＦＲ１Ｂと命名した。
（３）実施例９で作製した１３種類のヒト化抗体ＡのＬ鎖がクローニングされたプラスミドのうち、ｐＦＵ－ＡＬ１３を５０ｎｇ／μＬとなるように調整したものを鋳型とし、配列番号６８（５’－ＡＴＴＡ［ＣＴＣＧＡＧ］ＧＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧ－３’）および配列番号６６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマー（配列番号６８中の角かっこは制限酵素ＸｈｏＩ認識配列を示している）としＰＣＲを（１）と同様に行なった。得られたＰＣＲ産物はヒト化Ｌ鎖の可変領域（ＶＬ領域）にある４つのＦＲのうちＦＲ１をコードしておりこれをＡＬ－ＦＲ１Ｃと命名した。
（４）実施例９で作製した１３種類のヒト化抗体ＡのＬ鎖がクローニングされたプラスミドを各５０ｎｇ／μＬとなるように混合したものを鋳型とし、配列番号６９（５’－ＡＡＣＧＴＧＡＧＣＴＣＣＴＣＣＧＴＡＡＣＣＴＣ－３’）および配列番号７０（５’－ＡＧＡＴＧＣＣＡＧＡＴＴＧＧＡＧＧＴＣＡＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとした以外は（１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。得られたＰＣＲ産物はヒト化Ｌ鎖の可変領域にある４つのＦＲのうちＦＲ２をコードしておりＡＬ－ＦＲ２と命名した。
（５）実施例９で作製した１３種類のヒト化抗体ＡのＬ鎖がクローニングされたプラスミドを各５０ｎｇ／μＬとなるように混合したものを鋳型とし、配列番号７１（５’－ＣＴＧＡＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＧＣＡＴＣＴ－３’）および配列番号７２（５’－ＧＴＣＡＡＧＧＧＡＴＴＧＧＴＧＧＡＣＣＡＣＴＧＣＴＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとした以外は（１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。得られたＰＣＲ産物はヒト化Ｌ鎖の可変領域にある４つのＦＲのうちＦＲ３をコードしておりＡＬ－ＦＲ３と命名した。
（６）実施例９で作製した１３種類のヒト化抗体ＡのＬ鎖がクローニングされたプラスミドを各５０ｎｇ／μＬとなるように混合したものを鋳型とし、配列番号７３（５’－ＣＡＧＣＡＧＴＧＧＴＣＣＡＣＣＡＡＴＣＣＣＴＴＧＡＣ－３’）および配列番号７４（５’－ＧＡＴ［ＡＡＧＣＴＴ］ＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマー（配列番号７４中の角かっこは制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を示している）とした以外は（１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。得られたＰＣＲ産物はヒト化Ｌ鎖の可変領域にある４つのＦＲのうちＦＲ４および定常領域をコードしておりＡＬ－ＦＲ４と命名した。
（７）（１）、（４）、（５）および（６）で得られたＰＣＲ産物（ＡＬ－ＦＲ１Ａ、ＡＬ－ＦＲ２、ＡＬ－ＦＲ３およびＡＬ－ＦＲ４）を鋳型とし、配列番号６５および配列番号７４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行なった。具体的には、表５に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。ＡＬ－ＦＲ１Ａ、ＡＬ－ＦＲ２、ＡＬ－ＦＲ３およびＡＬ－ＦＲ４はそれぞれオーバーラップする領域を含んでおり、得られたＰＣＲ産物はＬ鎖フレーム領域がヒト化されライブラリー化された抗体ＡのＬ鎖をコードしておりこれをｈＡＬ１Ａと命名した。
（８）（２）、（４）、（５）および（６）で得られたＰＣＲ産物（ＡＬ－ＦＲ１Ｂ、ＡＬ－ＦＲ２、ＡＬ－ＦＲ３およびＡＬ－ＦＲ４）を鋳型とし、配列番号６７および配列番号７４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーにした以外は（７）と同様の方法でＰＣＲを行ない、得られたＰＣＲ産物はＬ鎖フレーム領域がヒト化されライブラリー化された抗体ＡのＬ鎖をコードしておりこれをｈＡＬ１Ｂと命名した。
（９）（３）、（４）、（５）および（６）で得られたＰＣＲ産物（ＡＬ－ＦＲ１Ｃ、ＡＬ－ＦＲ２、ＡＬ－ＦＲ３およびＡＬ－ＦＲ４）を鋳型とし、配列番号６８および配列番号７４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーにした以外は（７）と同様の方法でＰＣＲを行ない、得られたＰＣＲ産物はＬ鎖フレーム領域がヒト化されライブラリー化された抗体ＡのＬ鎖をコードしておりこれをｈＡＬ１Ｃと命名した。
（１０）（７）、（８）および（９）で得られたＰＣＲ産物である、ｈＡＬ１Ａ、ｈＡＬ１ＢおよびｈＡＬ１Ｃをそれぞれ精製後、制限酵素ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同様に制限酵素ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し精製した実施例５（８）で作製したｐＵＣ－Ｆａｂ－ｈＡＨ１ｍＡＬとライゲーションした。得られたライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含んだＬＢプレート培地に散布することで、抗体ＡのＬ鎖フレーム領域がヒト化されライブラリーとなったヒト化Ｌ鎖フレームライブラリーのコロニーを得た。
実施例１１ ヒト化抗体Ａのスクリーニング（その１）
（１）実施例１０で得られたヒト化Ｌ鎖フレームライブラリーのコロニーを、あらかじめ１００μＬ／ｍＬのカルベニシリンおよび０．１％（ｗ／ｖ）のグルコースを含んだ２×ＹＴ培地を各ウェルに２００μＬ入れた９６穴ディープウェルプレートに植菌し、３７℃、１３００ｒｐｍで一晩振盪培養した。
（１）実施例１０で得られたヒト化Ｌ鎖フレームライブラリーのコロニーを、あらかじめ１００μＬ／ｍＬのカルベニシリンおよび０．１％（ｗ／ｖ）のグルコースを含んだ２×ＹＴ培地を各ウェルに２００μＬ入れた９６穴ディープウェルプレートに植菌し、３７℃、１３００ｒｐｍで一晩振盪培養した。
（２）あらかじめ１００μＬ／ｍＬのカルベニシリンおよび０．１％（ｗ／ｖ）のグルコースを含んだ２×ＹＴ培地を各ウェルに５００μＬ入れた９６穴ディープウェルプレートに（１）で培養した形質転換体を２５μＬ植菌し、３７℃、１３００ｒｐｍで２時間振盪培養した。
（３）温度を３０℃に変え、０．５時間振盪培養した後、１１ｍＭのＩＰＴＧ（ＩｓｏＰｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ＴｈｉｏＧａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、１００μＬ／ｍＬのカルベニシリンおよび０．１％（ｗ／ｖ）のグルコースを含んだ２×ＹＴ培地を２５μＬ／ウェル加えた（ＩＰＴＧは終濃度で０．５ｍＭ）。３７℃、１３００ｒｐｍで一晩振盪培養した後、４℃、２５００ｒｐｍで２０分間遠心することで小型化抗体（Ｆａｂ）の形で発現したヒト化抗体Ａを含んだ培養上清を得た。
（４）試料として（３）で得られた培養上清を、検出用抗体としてペルオキシターゼで標識された抗ＦＬＡＧタグ抗体（ロックランドイムノケミカルズ社製）を、それぞれ使用した以外は、実施例２（３）の記載と同様な方法でＥＬＩＳＡを行ない、ヒトｇｐ１３０受容体と結合能を示すクローンを選択した。選択したクローンを培養し、プラスミドを抽出した。
（５）試料として（４）で得られたプラスミドを、シーケンスプライマーとして配列番号７５（５’－ＣＡＣＣＴＴＣＣＡＣＴＧＴＡＣＴＴＴＧＧＣ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ使用した以外は、実施例３（６）の記載と同様な方法で配列解析を行なった。
配列解析の結果、抗体ＡのＬ鎖可変領域が配列番号７６および配列番号７７に記載のアミノ酸配列であるＬ鎖を得た。配列番号７６に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（配列番号７８）を含むＦａｂ発現ベクターをｐＵＣ－Ｆａｂ－ｈＡＨ１ｈＡＬ１と命名し、配列番号７７に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（配列番号７９）を含むＦａｂ発現ベクターをｐＵＣ－Ｆａｂ－ｈＡＨ１ｈＡＬ２と命名した。なおこれら発現ベクター中に含まれるＶＨ領域をコードするポリヌクレオチドは、ヒト化抗体ＡのＶＨ領域であるｈＡＨ１（配列番号２５）をコードするポリヌクレオチドであることから、発現する小型化抗体（Ｆａｂ）はＶＨ領域、ＶＬ領域、ともにヒト化されている。
実施例１２ ヒト化抗体Ａが有する親和性（その１）
（１）実施例１１で得られた発現ベクターｐＵＣ－Ｆａｂ－ｈＡＨ１ｈＡＬ１およびｐＵＣ－Ｆａｂ－ｈＡＨ１ｈＡＬ２でそれぞれ形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株を、実施例７（１）から（３）と同様の方法で培養してＦａｂを発現させ、実施例７（４）と同様の方法で精製・濃縮した。ｐＵＣ－Ｆａｂ－ｈＡＨ１ｈＡＬ１から得られる、ＶＨ領域が配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなり、ＶＬ領域が配列番号７６に記載のアミノ酸配列からなる小型化抗体（以降、ｈＡＨ１ｈＡＬ１ともいう）を約２０μｇ、およびｐＵＣ－Ｆａｂ－ｈＡＨ１ｈＡＬ２から得られる、ＶＨ領域が配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなり、ＶＬ領域が配列番号７７に記載のアミノ酸配列からなる小型化抗体（以降、ｈＡＨ１ｈＡＬ２ともいう）を約１０μｇ、それぞれ取得した。
（１）実施例１１で得られた発現ベクターｐＵＣ－Ｆａｂ－ｈＡＨ１ｈＡＬ１およびｐＵＣ－Ｆａｂ－ｈＡＨ１ｈＡＬ２でそれぞれ形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株を、実施例７（１）から（３）と同様の方法で培養してＦａｂを発現させ、実施例７（４）と同様の方法で精製・濃縮した。ｐＵＣ－Ｆａｂ－ｈＡＨ１ｈＡＬ１から得られる、ＶＨ領域が配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなり、ＶＬ領域が配列番号７６に記載のアミノ酸配列からなる小型化抗体（以降、ｈＡＨ１ｈＡＬ１ともいう）を約２０μｇ、およびｐＵＣ－Ｆａｂ－ｈＡＨ１ｈＡＬ２から得られる、ＶＨ領域が配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなり、ＶＬ領域が配列番号７７に記載のアミノ酸配列からなる小型化抗体（以降、ｈＡＨ１ｈＡＬ２ともいう）を約１０μｇ、それぞれ取得した。
（２）センサーチップＣＭ５へのヒトｇｐ１３０受容体の固定化量を２３５．２ＲＵとした以外は実施例８と同様の方法で、ｈＡＨ１ｈＡＬ１およびｈＡＨ１ｈＡＬ２のヒトｇｐ１３０受容体に対する親和性を測定した。
結果、小型化抗体ｈＡＨ１ｈＡＬ１の親和性はｋａ＝２．５７×１０５［１／Ｍｓ］、ｋｄ＝５．６０×１０－５［１／ｓ］、ＫＤ＝２．１８×１０－１０［Ｍ］（０．２２ｎＭ）であった。また小型化抗体ｈＡＨ１ｈＡＬ２の親和性はｋａ＝１．１９×１０５［１／Ｍｓ］、ｋｄ＝７．０５×１０－５［１／ｓ］、ＫＤ＝５．９４×１０－１０［Ｍ］（０．５９ｎＭ）であった。
小型化マウス抗体Ａ（ヒト化前のマウス抗体）が有する親和性（ＫＤ値０．６０ｎＭ、実施例８）と比較し、ｈＡＨ１ｈＡＬ１が有する親和性は向上（ＫＤ値０．２２ｎＭ）しており、ｈＡＨ１ｈＡＬ２が有する親和性もほぼ同等（ＫＤ値０．５９ｎＭ）であることがわかる。したがって、ＶＨ領域が配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＶＬ領域が配列番号７６または７７に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドである抗体は、ＣＤＲ以外のアミノ酸がヒト化されており、かつヒト化前のマウス抗体と同等以上のヒトｇｐ１３０受容体に対する親和性を有していることがわかる。中でもＶＨ領域が配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＶＬ領域が配列番号７６または７７に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドである抗体は、ヒト化前のマウス抗体よりもヒトｇｐ１３０受容体に対する親和性も向上していることから、ＩＬ－６ファミリーサイトカインの異常によって引き起こされる疾病（例えば関節リウマチ等の自己免疫疾患）の治療用抗体の候補となり得ると考えられる。
実施例１３ ヒト化抗ｇｐ１３０受容体小型化抗体によるＩＬ－６シグナル抑制
（１）ヒトＩＬ－６に感受性があり、かつヒトＩＬ－６の添加により細胞増殖が促進される細胞株である７－ＴＤ－１（文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクトを介して、理研ＢＲＣから提供されたＲＩＫＥＮ ＢＲＣ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ Ｎｏ．ＲＣＢ１１９０）を１０％（ｗ／ｖ）のウシ血清を含んだＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で培養した。
（１）ヒトＩＬ－６に感受性があり、かつヒトＩＬ－６の添加により細胞増殖が促進される細胞株である７－ＴＤ－１（文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクトを介して、理研ＢＲＣから提供されたＲＩＫＥＮ ＢＲＣ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ Ｎｏ．ＲＣＢ１１９０）を１０％（ｗ／ｖ）のウシ血清を含んだＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で培養した。
（２）培養後、セルカウントを行ない、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェル（培地１ｍＬ）となるよう、２４ウェルプレートへ加えた。
（３）ヒトＩＬ－６（富士フイルム和光純薬社製）を終濃度で５０ｎｇ／ｍＬとなるようウェルに加え、実施例７で調製した小型化マウス抗体Ａおよび実施例１３で調製したｈＡＨ１ｈＡＬ１およびｈＡＨ１ｈＡＬ２を終濃度で１５０又は５００ｎｇ／ｍＬとなるよう加えた後、当該２４ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２の条件で１０日間静置培養した。
（４）（３）の培養後、ヒトＩＬ－６未添加、ヒトＩＬ－６のみ添加、ヒトＩＬ－６および抗体（各小型化抗体またはヒト抗体）を添加したウェルの細胞数を自動細胞測定装置Ｃｏｕｎｔｎｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にて測定した。
細胞数測定結果を図２に示した。図２（Ａ）から（Ｄ）に示したようにヒトＩＬ－６を添加することでウェル中の７－ＴＤ－１細胞数がヒトＩＬ－６未添加時と比較して増加していることから、７－ＴＤ－１はヒトＩＬ－６により細胞数が増殖することが確認できた。一方、図２（Ａ）に示したようにヒトＩＬ－６を添加したウェルに小型化マウス抗体Ａを添加した場合、添加した小型化抗体濃度依存的にウェル中の７－ＴＤ－１の増殖は抑制されたことから小型化マウス抗体Ａはヒトｇｐ１３０受容体に結合することでＩＬ－６のシグナル伝達を抑制できることがわかる。また図２（Ｂ）および（Ｃ）に示したように、ヒト化小型化抗体Ａ（ｈＡＨ１ｈＡＬ１およびｈＡＨ１ｈＡＬ２）においても添加したヒト化小型化抗体濃度依存的にウェル中の７－ＴＤ－１の増殖は抑制されたことから、ヒト化小型化抗体Ａ（ｈＡＨ１ｈＡＬ１およびｈＡＨ１ｈＡＬ２）はヒトｇｐ１３０受容体に結合することでＩＬ－６のシグナル伝達を抑制できることがわかる。なお図２（Ｄ）に示したように、ヒトｇｐ１３０受容体に特異的でないヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）（シグマ社製）を添加してもウェル中の７－ＴＤ－１の増殖は抗体添加量に依存せずに阻害されないことから、ヒトｇｐ１３０受容体に特異性のない抗体ではヒトＩＬ－６のシグナルを抑制できないことがわかる。
実施例１４ ヒト化抗体Ａのスクリーニング（その２）
（１）実施例１１に記載のスクリーニングを行なうことでヒトｇｐ１３０受容体と結合能を示したヒト化小型化抗体Ａを発現するクローンを選択した。選択したクローンを培養し、プラスミドを抽出後、配列番号７５に記載のオリゴヌクレオチドをシーケンスプライマーとして実施例３（６）の記載と同様な方法で配列解析を行なった。
（１）実施例１１に記載のスクリーニングを行なうことでヒトｇｐ１３０受容体と結合能を示したヒト化小型化抗体Ａを発現するクローンを選択した。選択したクローンを培養し、プラスミドを抽出後、配列番号７５に記載のオリゴヌクレオチドをシーケンスプライマーとして実施例３（６）の記載と同様な方法で配列解析を行なった。
（２）配列解析の結果、Ｌ鎖可変領域が配列番号８０に記載のアミノ酸配列であるＬ鎖を得た。得られた可変領域のアミノ酸配列が配列番号８０に記載のヒト化Ｌ鎖をｈＡＬ３と命名し、配列番号８０に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（配列番号８１）を含むＦａｂ発現ベクターをｐＵＣ－Ｆａｂ－ｈＡＨ１ｈＡＬ３と命名した。
実施例１５ ヒト化抗体Ａ発現ベクターの作製
（１）実施例１４で得たｐＵＣ－Ｆａｂ－ｈＡＨ１ＡＬ３を鋳型として、配列番号８２（５’－ＧＣＣＴＣＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＧＡＣＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＣＴＣ－３’）および配列番号８３（５’－ＡＡＴ［ＧＣＧＧＣＣＧＣ］ＴＡＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣ－３’）（配列番号８３中の角かっこは制限酵素ＮｏｔＩ認識配列を示している）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表６に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で３０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより、ｈＡＬ３をコードする遺伝子を増幅し精製後に得られたＰＣＲ産物をｈＡＬ３－Ｐ１と命名した。
（１）実施例１４で得たｐＵＣ－Ｆａｂ－ｈＡＨ１ＡＬ３を鋳型として、配列番号８２（５’－ＧＣＣＴＣＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＧＡＣＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＣＴＣ－３’）および配列番号８３（５’－ＡＡＴ［ＧＣＧＧＣＣＧＣ］ＴＡＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣ－３’）（配列番号８３中の角かっこは制限酵素ＮｏｔＩ認識配列を示している）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表６に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で３０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより、ｈＡＬ３をコードする遺伝子を増幅し精製後に得られたＰＣＲ産物をｈＡＬ３－Ｐ１と命名した。
（２）（１）で得られたｈＡＬ３－Ｐ１を鋳型として、配列番号８４（５’－ＣＴＡ［ＧＡＡＴＴＣ］ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣＧＧＣＴＧＡＣＣ－３’）および配列番号８３（配列番号８４中の角かっこは制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列を示している）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、配列番号８５に記載のアミノ酸配列からなるシグナル配列（ＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ）をｈＡＬ３に付加するため、配列番号８５に記載のアミノ酸配列をコードする配列番号８６（５’－ＡＴＧＡＣＣＣＧＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＧＣＣＴＧＣＴＣＧＣＣＴＣＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣ－３’）に記載のポリヌクレオチドを添加してＰＣＲを行なった。具体的には、表７に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で３０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより、ｈＡＬ３をコードする遺伝子に配列番号８５に記載のシグナル配列をコードする遺伝子を付加した遺伝子を増幅し精製後に得られたＰＣＲ産物をｈＡＬ３－Ｐ２と命名した。
（３）（２）で得られたｈＡＬ３－Ｐ２および図３に記載の発現ベクター（ｐＥＦｄ）をそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、精製後ライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで動物細胞においてｈＡＬ３を発現可能なｐＥＦｄ－ｈＡＬ３を得た。なお、図３に記載のｐＥＦｄベクターは配列番号８８に記載のＥＦ１αプロモーターのうち６２１番目のグアニンから７９８番目のグアニンまでのヌクレオチドが欠損しているプロモーター（ＥＦｄ ｐｒｏ）を有しており、ＳＶ４０のｐｏｌｙＡおよびｄｈｆｒ遺伝子も有している。
配列番号７５および８４をプライマーとして実施例３（６）の記載と同様な方法で配列解析を行なった。ｐＥＦｄ－ｈＡＬ３のｈＡＬ３周辺のアミノ酸配列を配列番号８７に示す。配列番号８７に記載の配列のうち、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から１９番目のアラニン（Ａｌａ）までがシグナル配列であり、２０番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）から１２５番目のリジン（Ｌｙｓ）までがｈＡＬ３の可変領域であり、１２６番目のアルギニン（Ａｒｇ）から２３２番目のシステイン（Ｃｙｓ）までがｈＡＬ３の定常領域である。
（４）実施例４で作製したｐＦＵ－ｈＡＨ１を鋳型として、配列番号８９（５’－ＧＣＣＴＣＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＧ－３’）および配列番号９０（５’－ＡＡＴ［ＧＣＧＧＣＣＧＣ］ＴＡＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧ－３’）（配列番号８９中の角かっこは制限酵素ＮｏｔＩ認識配列を示している）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行なった。具体的には、表６に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１．５分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより、ｈＡＨ１全長をコードする遺伝子を増幅し精製後に得られたＰＣＲ産物をｈＡＨ１－Ｐ１と命名した。
（５）（４）で得られたｈＡＨ１－Ｐ１を鋳型として、配列番号８４および配列番号９０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、配列番号８５に記載のアミノ酸配列からなるシグナル配列（ＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ）をｈＡＨ１に付加するため、配列番号８６に記載のポリヌクレオチドを添加してＰＣＲを行なった。具体的には、表７に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１．５分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。このＰＣＲにより、ｈＡＨ１をコードする遺伝子に配列番号８５に記載のシグナル配列をコードする遺伝子を付加した遺伝子を増幅し精製後に得られたＰＣＲ産物をｈＡＨ１－Ｐ２と命名した。
（６）（５）で得られたｈＡＨ１－Ｐ２および図３に記載の発現ベクター（ｐＥＦｄ）をそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、精製後ライゲーションした。当該ライゲーション産物で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、培養した形質転換体からプラスミドを抽出することで動物細胞においてｈＡＨ１を発現可能なｐＥＦｄ－ｈＡＨ１を得た。
配列番号８４、配列番号９１（５’－ＧＡＧＴＴＣＣＡＣＧＡＣＡＣＣＧＴＣＡＣ－３’）、配列番号９２（５’－ＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣ－３’）および配列番号９３（５’－ＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして実施例３（６）の記載と同様な方法で配列解析を行なった。ｐＥＦｄ－ｈＡＨ１のｈＡＨ１周辺のアミノ酸配列を配列番号９４に示す。配列番号９４に記載の配列のうち、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から１９番目のアラニン（Ａｌａ）までがシグナル配列であり、２０番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から１３９番目のアラニン（Ａｌａ）までがｈＡＨ１の可変領域であり、１４０番目のアラニン（Ａｌａ）から４６９番目のリジン（Ｌｙｓ）までがｈＡＨ１の定常領域である。
実施例１６ ヒト化抗体Ａが有する親和性（その２）
（１）実施例１５で作製したｐＥＦｄ－ｈＡＬ３およびｐＥＦｄ－ｈＡＨ１を調製し、ＣＨＯ細胞（ＤＧ４４株）にＮｅｏｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて遺伝子導入した。その後、４０ｍＬ／ＬのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含んだＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてシャーレ培養を行なった。遺伝子導入した細胞が増殖した時点で１２５ｍＬのフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に２０ｍＬの４０ｍＬ／ＬのＧｌｕｔａＭＡＸを含んだＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ Ｍｅｄｉｕｍを加えＣＯ２インキュベーター中で振盪培養（３７℃、８％のＣＯ２、１３０ｒｐｍ）した。
（１）実施例１５で作製したｐＥＦｄ－ｈＡＬ３およびｐＥＦｄ－ｈＡＨ１を調製し、ＣＨＯ細胞（ＤＧ４４株）にＮｅｏｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて遺伝子導入した。その後、４０ｍＬ／ＬのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含んだＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてシャーレ培養を行なった。遺伝子導入した細胞が増殖した時点で１２５ｍＬのフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に２０ｍＬの４０ｍＬ／ＬのＧｌｕｔａＭＡＸを含んだＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ Ｍｅｄｉｕｍを加えＣＯ２インキュベーター中で振盪培養（３７℃、８％のＣＯ２、１３０ｒｐｍ）した。
（２）培養と上清回収を繰り返すことで得られた約８０ｍＬの培養液を、あらかじめ１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した１ｍＬのＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＬＸ（ＧＥヘルスケア社製）添加した。その後、平衡化で用いた緩衝液で洗浄を行ない、０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）４ｍＬで溶出した。溶出液に１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍＬを速やかに加えることでｐＨを中性領域にし、限外ろ過膜で濃縮、緩衝液交換を行なうことでＨ鎖がｈＡＨ１、Ｌ鎖がｈＡＬ３の全長のヒト化抗ｇｐ１３０受容体抗体（以降、ｈＡＨ１ｈＡＬ３と命名する）を約０．７４ｍｇ得た。
（３）センサーチップＣＭ５へのヒトｇｐ１３０受容体の固定化量を３７６ＲＵとした以外は実施例８と同様の方法でヒト化抗体ｈＡＨ１ｈＡＬ３の親和性を測定した。
結果、ｈＡＨ１ｈＡＬ３の親和性はｋａ＝１．２４×１０５［１／Ｍｓ］、ｋｄ＝７．２５×１０－５［１／ｓ］、ＫＤ＝５．８５×１０－１０［Ｍ］（０．５９ｎＭ）であった。
本結果ならびに実施例８および１２の結果をまとめて表８に示す。ヒト化抗体ｈＡＨ１ｈＡＬ３が有する親和性（ＫＤ値０．５９ｎＭ）は、小型化マウス抗体Ａ（ＫＤ値０．６０ｎＭ、実施例８）およびヒト化小型化抗体ｈＡＨ１ｈＡＬ２（ＫＤ値０．５９ｎＭ、実施例１２）が有する親和性と同等であることがわかる。したがって、ＶＨ領域が配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＶＬ領域が配列番号８０に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドである抗体は、ＣＤＲ以外のアミノ酸がヒト化されており、かつヒト化前のマウス抗体と同等のヒトｇｐ１３０受容体に対する親和性を有していることがわかる。
実施例１７ ヒト化抗ｇｐ１３０受容体抗体によるＩＬ－６シグナル抑制
（１）ヒトＩＬ－６の添加により細胞増殖が促進される細胞株である７－ＴＤ－１を１０％（ｗ／ｖ）のウシ血清を含んだＲＰＭＩ－１６４０培地（富士フイルム和光純薬社製）で培養した。培養後、セルカウントを行ない、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェル（培地１ｍＬ）となるよう、２４ウェルプレートへ加えた。
（１）ヒトＩＬ－６の添加により細胞増殖が促進される細胞株である７－ＴＤ－１を１０％（ｗ／ｖ）のウシ血清を含んだＲＰＭＩ－１６４０培地（富士フイルム和光純薬社製）で培養した。培養後、セルカウントを行ない、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェル（培地１ｍＬ）となるよう、２４ウェルプレートへ加えた。
（２）ヒトＩＬ－６（富士フイルム和光純薬社製）を終濃度で５０ｎｇ／ｍＬとなるよう添加し、実施例１６で調製したヒト化抗体ｈＡＨ１ｈＡＬ３、実施例２で調製した抗体Ａ、およびヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）（シグマ社製）を、それぞれ終濃度で１００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬとなるよう加えた後、当該２４ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２の条件で３日間静置培養した。
（３）培養後、ヒトＩＬ－６未添加、ヒトＩＬ－６のみ添加、ヒトＩＬ－６および各抗体を添加したウェルの細胞数を自動細胞測定装置Ｃｏｕｎｔｎｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にて測定した。
細胞数測定結果を図４に示した。図４（Ａ）から（Ｃ）に示したようにヒトＩＬ－６を添加することでウェル中の７－ＴＤ－１細胞数がヒトＩＬ－６未添加時と比較し増加した。ヒトｇｐ１３０受容体抗体に特異的でないヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）を加えても７－ＴＤ－１細胞の増殖は抑制されなかった（図４（Ｃ））。一方で、ヒト化抗体ｈＡＨ１ｈＡＬ３（図４（Ａ））や抗体Ａ（図４（Ｂ））は添加した抗体濃度依存的に７－ＴＤ－１細胞の増殖が抑制されたことから、これら抗体はヒトｇｐ１３０受容体に結合することでＩＬ－６のシグナル伝達を抑制できることがわかる。すなわちヒト化抗体ｈＡＨ１ｈＡＬ３は抗体Ａと同等のＩＬ－６シグナル阻害能を有していることが確認された。
Claims (6)
- 重鎖可変（ＶＨ）領域が配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
軽鎖可変（ＶＬ）領域が配列番号７６、７７または８０に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
かつヒトｇｐ１３０受容体に対するＫＤ値が０．６ｎＭ以下である、
抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体。 - ＶＬ領域が配列番号７６に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ヒトｇｐ１３０受容体に対するＫＤ値が０．３ｎＭ以下である、請求項１に記載の抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体。
- 重鎖可変（ＶＨ）領域が配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
軽鎖可変（ＶＬ）領域が配列番号７６、７７または８０に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
かつヒトＩＬ－６シグナルおよびその他ＩＬ－６ファミリーに属するサイトカインのシグナルを抑制することができる、
抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体。 - 配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体重鎖可変（ＶＨ）領域をコードするポリヌクレオチドを少なくとも含むベクター、および配列番号７６、７７または８０に記載のアミノ酸配列を含む抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体軽鎖可変（ＶＬ）領域をコードするポリヌクレオチドを少なくとも含むベクターで共形質転換し得られた、形質転換体。
- 配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体重鎖可変（ＶＨ）領域をコードするポリヌクレオチド、および配列番号７６、７７または８０に記載のアミノ酸配列を含む抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体軽鎖可変（ＶＬ）領域をコードするポリヌクレオチドを少なくとも含むベクターで形質転換し得られた、形質転換体。
- 請求項４または５に記載の形質転換体を培養して抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体を発現させる工程と、前記形質転換体の培養物から発現した抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体を回収する工程とを含む、抗ヒトｇｐ１３０受容体抗体の製造方法。
以上
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