ES2302339T3 - Genes de quimioquina cx3c de mamifero. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN UNA NUEVA FAMILIA DE QUIMIOQUINAS, LA FAMILIA CX 3 C, DE UN MAMIFERO, R EACTIVOS RELACIONADOS CON LA MISMA, INCLUYENDO ANTICUERPOS ESPECIFICOS, Y PROTEINAS PURIFICADAS. SE PROPORCIONAN ASIMISMO METODOS PARA UTILIZAR DICHOS REACTIVOS Y KITS DE DIAGNOSTICO RELACIONADOS.

Description

Genes de quimioquina CX3C mamífero.

La presente invención es una continuación en parte de la solicitud de EEUU en tramitación junto con la presente nº de serie U.S. 08/849.006, presentada el 16 de mayo, 1996, que es una continuación en parte de la solicitud de EEUU nº de serie 08/590.828, presentada el 24 de enero, 1996.

Campo de la invención

La presente invención contempla composiciones relacionadas con proteínas que actúan en el control del desarrollo, diferenciación, tráfico y fisiología de células de mamífero, por ejemplo, células del sistema inmunológico de un mamífero. En particular, proporciona proteínas que regulan o evidencian el desarrollo, diferenciación y función de diversos tipos celulares, incluyendo células hematopoyéticas.

Antecedentes de la invención

El componente en circulación del sistema circulatorio de mamíferos comprende diversos tipos de células, incluyendo eritrocitos y leucocitos de los linajes celulares eritroide y mieloide. Veáse, por ejemplo, Rapaport (1987), Introduction to Hematology (2º ed.), Lippincott, Filadelfia, PA; Jandl (1987), Blood: Textbook of Hematology, Little, Brown and Co., Boston, MA.; y Paul (ed.) (1993), Fundamental Immunology (3ª ed.), Raven Press, N.Y.

Durante algún tiempo se ha sabido que la respuesta inmunológica de mamíferos está basada en una serie de interacciones celulares complejas, denominadas "red inmunológica". Investigaciones recientes han proporcionado nuevas revelaciones sobre el funcionamiento interno de esta red. Aunque sigue estando claro que muchas de las respuestas giran, de hecho, entorno a interacciones de tipo red de linfocitos, macrófagos, granulocitos y otras células, los inmunólogos ahora sostienen la opinión, en general, que hay proteínas solubles, conocidas como linfoquinas, citoquinas o monoquinas, que desempeñan un papel crítico en el control de estas interacciones celulares. Por tanto, existe un interés considerable en el aislamiento, caracterización y mecanismos de acción de los factores moduladores celulares, una comprensión que debería conducir a avances significativos en el diagnóstico y terapia de numerosas anomalías médicas, por ejemplo, del sistema inmunológico y otros trastornos.

Las linfoquinas, al parecer, median en actividades celulares en una diversidad de formas. Se ha demostrado que apoyan la proliferacion, crecimiento y diferenciación de células pluripotenciales hematopoyéticas para producir grandes números de progenitores, que comprenden diversos linajes celulares que forman un complejo sistema inmunológico. Estas interacciones entre componentes celulares son necesarias para una respuesta inmunológica sana. Estos diferentes linajes celulares a menudo responden de una manera diferente cuando las linfoquinas se administran junto con otros agentes.

Las quimioquinas son una superfamilia grande y diversa de proteínas. La superfamilia se subdivide en tres ramas, basándose en si las dos primeras cisteínas en el motivo de quimioquina clásico están adyacentes (denominada rama "C-C" ) o están separadas por un resto intermedio ("C-X-C"), o una nueva rama que carece de las dos cisteínas en el correspondiente motivo, representada por las quimioquinas conocidas como linfotactinas. Véase, por ejemplo, Schall y Bacon (1994), Current opinion in Immunology, 6:865-873; y Bacon y Schall (1996), Int. Arch. Allergy & Immunol., 109:97-109.

Se han identificado muchos factores que influyen en el proceso de diferenciación de las células precursoras, o que regulan la fisiología o propiedades de migración de los tipos celulares específicos. Estas observaciones indican que existen otros factores cuyas funciones en la función inmunológica hasta este momento son desconocidas. Estos factores proporcionan actividades biológicas cuyos espectros de efectos pueden estar diferenciados de los factores de activación o diferenciación conocidos. La ausencia de conocimientos acerca de las propiedades estructurales, biológicas y fisiológicas de los factores reguladores que regulan la fisiología celular in vivo evita la modificación de los efectos de dichos factores. Así, los trastornos médicos en los que no resulta apropiada una regulación del desarrollo o fisiología de las células pertinentes permanecen intratables.

También se hace referencia a la entrada de la base de datos EMBL HSC20F041; nº de registro Z44443 (21 de septiembre, 1995, XP002030091); y la entrada de la base de datos EMBL MM309; nº de registro R75309 (10 de junio, 1995, XP002030089).

Sumario de la invención

La presente invención revela la existencia de una clase, previamente desconocida, de moléculas que contienen un motivo de quimioquina que se denominan, en la presente, quimioquinas CX3C. Las CX3Cquinas tienen tres aminoácidos que separan las cisteínas en la correspondiente región del motivo de quiminoquina. Basándose en el análisis de la secuencia de las dos secuencias de proteínas de CX3C descritas a continuación, resulta evidente que las CX3Cquinas no pertenecen a las familias de quimioquinas C, C-C, o C-X-C. Representan los primeros miembros conocidos de una clase, desconocida hasta ahora, de quimioquinas denominadas CX3Cquinas o, como alternativa, la familia CX3C de quimioquinas que contienen un motivo estructural CXXXC.

La presente invención proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión al antígeno de éste, que se une específicamente a una quimioquina CX3C de mamífero; un ácido nucleico aislado y un vector de expresión que codifica una quimioquina CX3C de mamífero o su fragmento; una proteína sustancialmente pura que es reconocida específicamente por el sitio de unión del anticuerpo; y una quimioquina CX3C sustancialmente pura, o un péptido de ésta, o una proteína de fusión que comprende un fragmento de 30 aminoácidos de la secuencia de la quimioquina CX3C.

En las realizaciones de anticuerpo/fragmento de unión al antígeno, el anticuerpo puede ser específicamente inmunorreactivo con una proteína madura seleccionada del grupo que consiste en los polipéptidos de SEQ ID NO:2, 4 y 8; generado contra una quimioquina CX3C humana o de ratón purificada o producida de forma recombinante; un anticuerpo monoclonal, Fab, o F(ab)2; inmunorreactivo con el antígeno desnaturalizado; o un anticuerpo marcado. En cierta realizaciones, una quimioquina CX3C se detecta en una muestra biológica mediante un método in vitro que consiste en poner en contacto un anticuerpo, o su fragmento de unión al antígeno, que tiene afinidad por una proteína de quimioquina CX3C, con una muestra biológica; incubar el anticuerpo, o el fragmento de unión al antígeno, con la muestra biológica para formar un complejo de anticuerpo o fragmento de unión al antígeno:proteína de quimioquina CX3C; y detectar el complejo. En una realización preferida, la muestra biológica es humana.

Se proporciona una realización de kit que posee una composición, descrita anteriormente, con material de instrucciones para el uso de la composición; o la segregación de la composición en un recipiente.

La realización de ácido nucleico de la invención incluye ácidos nucleicos aislados y un vector de expresión que codifica una proteína de quimioquina CX3C, en la que la proteína se une específicamente con un anticuerpo generado contra un inmunógeno seleccionado de porciones del polipéptido maduro de SEQ ID NO:2, 4 y 8. El ácido nucleico puede codificar un polipéptido de quimioquina CX3C con coincidencia de secuencia completa con un dominio de quimioquina CX3C humana que aparece en la naturaleza; codificar una proteína de quimioquina CX3C que comprende una secuencia seleccionada de los polipéptidos de SEQ ID NO:2, 4 y 8; o comprender una secuencia seleccionada de los ácidos nucleicos de SEQ ID NO:1, 3 ó 7. En otras realizaciones, el ácido nucleico es capaz de hibridarse de forma selectiva con un ácido nucleico que codifica una proteína de quimioquina CX3C, por ejemplo, un segmento que codifica la proteína madura de SEQ ID NO:1, 3 ó 7. En diversas realizaciones preferidas, el ácido nucleico aislado se detecta en una muestra biológica mediante un método que pone en contacto una muestra biológica con una sonda de ácido nucleico capaz de hibridarse selectivamente con el ácido nucleico; incubar la sonda de ácido nucleico con la muestra biológica para formar un híbrido de la sonda de ácido nucleico con las secuencias de ácido nucleico complementarias presentes en la muestra biológica; y determinar el grado de hibridación de la sonda de ácido nucleico con las secuencias de ácido nucleico complementarias. En este método, preferiblemente la sonda de ácido nucleico es capaz de
hibridarse con un ácido nucleico que codifica una proteína que consiste en los polipéptidos de SEQ ID NO:2, 4 u 8.

En las realizaciones de proteínas, la proteína de quimioquina CX3C aislada será preferiblemente de aproximadamente 11.000 a 15.000 daltons cuando está en forma no glicosilada, y la proteína de quimioquina CX3C se une específicamente a un anticuerpo generado contra un inmunógeno; los polipéptidos de SEQ ID NO:2, 4 u 8; y la quimioquina CX3C carece de los motivos estructurales de cisteína y secuencia característica de una quimioquina C, CC, o CXC. En diversas realizaciones, la proteína de quimioquina CX3C aislada se selecciona de CX3Cquina humana o CX3Cquina de ratón; consiste en un polipéptido que comprende una secuencia de SEQ ID NO:2, 4 u 8; se produce de forma recombinante, o es una proteína que aparece en la naturaleza.

La presente invención también incluye una célula transfectada con el ácido nucleico que codifica una quimioquina CX3C, por ejemplo, en el que el ácido nucleico tiene la SEQ ID NO:1, 3 ó 7.

La invención también proporciona un método in vitro para modular la fisiología o el desarrollo de una célula, poniendo en contacto la célula con una quimioquina CX3C, o un anticuerpo o fragmento de la invención. En realizaciones preferidas, la fisiología es la atracción, y la célula es un monocito de sangre periférica o una célula T.

La invención también proporciona una formulación farmacéutica que comprende al menos un ingrediente activo seleccionado de: (a) la quimioquina CX_{3}C de la invención; o (b) el anticuerpo o fragmento de la invención; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La invención también proporciona el uso de una quimioquina CX_{3}C de la invención en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir el cáncer o la infección.

La invención también proporciona el uso de un anticuerpo o fragmento de la invención en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir la esclerosis múltiple o la inflamación neurogénica.

Descripción detallada de la invención I. Generalidades

La presente invención proporciona secuencias de ADN que codifican proteínas de mamífero que muestran propiedades estructurales o motivos característicos de una citoquina o quimioquina. Para un análisis de la familia de las quimioquinas véase, por ejemplo, Lodi, et al. (1994), Science 263:1762-1767; Gronenborn y Clore (1991), Protein Engineering, 4:263-269; Miller y Kranger (1992), Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 89:2950-2954; Matsushima y Oppenheim (1989), Cytokine, 1:2-13; Stoeckle y Baker (1990), New Biol., 2:313-323; Oppenheim, et al. (1991), Ann. Rev. Immunol., 9:617-648; Schall (1991), Cytokine, 3:165-183; y The Cytokine Handbook, Academic Press, NY. Las proteínas descritas en la presente se denominan CX3Cquinas porque inicialmente se identificaron como que compartían características estructurales significativas con las quimioquinas, pero cuyas características estructurales también mostraban peculiaridades de secuencia, por ejemplo, motivos estructurales, diferenciadas de las otras ramas conocidas de las moléculas de quimioquinas.

Como se indicará a continuación, las secuencis de SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6 no forman parte de la invención.

La realización mejor caracterizada de esta familia de proteínas se descubrió en un ser humano y se denominó quimioquina CX3C humana (GenBank nº de registro H14940). Véase, SEQ ID NO:1-4. Otra CX3Cquina, representada por una molécula de ratón, denominada CX3Cquina de ratón, también se describe en la presente. Véase, SEQ ID NO:5-8. Las descripciones a continuacón se dirigen, a modo de ejemplo, a realizaciones de primates y roedores, por ejemplo, seres humanos y ratones, pero son aplicables, de manera similar, a las realizaciones relacionadas de otras fuentes, por ejemplo, fuentes naturales. Estas fuentes deberían incluir diversos vertebrados, de forma típica animales de sangre caliente, por ejemplo, aves y mamíferos, en particular animales domésticos, y primates.

En la secuencia humana (SEQ ID NO:1-4), la secuencia señal se extiende desde aproximadamente Met1 a Gly24 y, por tanto, el polipéptido maduro comienza en aproximadamente Gln25 y termina en aproximadamente Val397. Un dominio de quimioquina se extiende desde aproximadamente Gln25 a aproximadamente Gly100; una región tallo, que posee muchos sitios de glicosilación potenciales, se extiende desde aproximadamente Gly101 a aproximadamente Gln341; una región transmembrana comienza en aproximadamente Ala342 y termina en aproximadamente Thr361; y un dominio intracelular, que contiene dos sitios de fosforilación de tirosina en los restos 382 y 392, se extiende desde aproximadamente Tyr362 a Val397.

En la quimioquina CX3C de ratón (SEQ ID NO:7 y 8), la secuencia codificadora se extiende desde los nucleótidos 62-1249. La secuencia señal se extiende desde aproximadamente Met1 hasta Gly24. Por tanto, el polipéptido maduro se extiende desde aproximadamente Gln25 hasta Val395. Un dominio de quimioquina se extiende desde aproximadamente Gln25 a aproximadamente Gly100; la región tallo se extiende desde aproximadamente Gly101 hasta Gln339; el dominio transmembrana se extiende desde aproximadamente Ala340 hasta Phe358; y el dominio citoplásmico se extiende desde aproximadamente Ala359 hasta Val395.

Las proteínas de CX3Cquina de esta invención se definen, en parte, mediante sus propiedades fisicoquímicas y biológicas. Las propiedades biológicas de las CX3Cquinas humanas y de ratón descritas en la presente, por ejemplo, CX3Cquina humana y CX3Cquina de ratón, se definen mediante su secuencia de aminoácidos, y el tamaño maduro. También deberían compartir propiedades biológicas. Las moléculas de CX3Cquina humanas y de ratón muestran una coincidencia de aminoácidos de aproximadamente 70-80%, dependiendo si se comparan las secuencias señal o madura. Los expertos en la técnica reconoceán que pueden tolerarse algunas variaciones en la secuencia, por ejemplo, sustituciones conservativas o posiciones alejadas de las estructuras helicoidales, sin alterar significativamente la actividad biológica de la molécula.

La tabla 1 muestra un alineamiento de secuencia de la secuencia de aminoácidos de una CX3Cquina humana (CX3C) con la quimioquina C-X-C Gro\alpha (Gro), la quimioquina C linfotactina (LTn), y la quimioquina C-C proteína inflamatoria de macrófagos 1\beta (MIP-1\beta).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Comparación de diversas quimioquinas

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Las CX3Cquinas están presentes en tipos de tejidos específicos, por ejemplo, tejidos neurales, y la interacción de la proteína con un receptor será importante para mediar en diversos aspectos de la fisiología o desarrollo celular. Los tipos celulares que expresan mensajeros que codifican CX3Cquinas sugieren que señales importantes en la diferenciación y desarrollo celular son mediadas por ellas. Véase, por ejemplo, Gilbert (1991), Developmental Biology (3ª ed.), Sinauer Associates, Sunderland, MA; Browder, et al. (1991), Developmental Biology (3ª ed.), Saunders, Philadelphia, PA.; Russo, et al. (1992), Development: The Molecular Genetic Approach, Springer-Verlag, Nueva York, N.Y.; y Wilkins (1993), Genetic Analysis of Animal Development (2ª ed.), Wiley-Liss, Nueva York, N.Y. Además, la expresión de la CX3Cquina debería servir para definir cierta subpoblaciones celulares.

En la presente se aclara el perfil productor de quimioquinas CX3C de diversas células. La selección de un banco de ADNc generado a partir de cerebro proporcionó una nueva citoquina, denominada CX3Cquina humana. La CX3Cquina humana muestra una similitud distante con miembros de las familias de quimioquinas C, C-C, y C-X-C, con un número diferente, hasta la fecha desconocido, de restos aminoácidos que separan las cisteínas características en el motivo que es peculiar a las quimioquinas y parcialmente las define. Estas observaciones sugieren que las CX3Cquinas representan nuevas adiciones a la superfamilia de las quimioquinas.

La bioquímica de proteínas de las quimioquinas CX3C se evaluó en sistemas de expresión de mamíferos. Células 293 de riñón embrionario humanas (HEK 293) transfectadas con un constructo de expresión de mamífero que codifica una quimioquina CX3C de longitud completa se marcaron metabólicamente con ^{35}S-cisteína y metionina. La quimioquina CX3C se produce como una proteína de Mr -95 kDa; los sobrenadantes transfectados control no contenían esta especie. La neuraminidasa y las glicosidasas reducían el Mr de la quimioquina CX3C de -95 kDa a -45 kDa, lo cual sugiere que la forma recombinante está sustancialmente glicosilada. El ADNc de la quimioquina CX3C, que codifica una proteína unida a la membrana predicha, codifica una glicoproteína que es liberada desde las células mediante un mecanismo desconocido.

Las actividades promigratorias de la quimioquina CX3C se han evaluado en ensayos de microquimiotaxis. La quimioquina CX3C parece ser un potente atrayente de monocitos de sangre periférica y células T. La actividad promigratoria para neutrófilos sanguíneos ha sido difícil de demostrar.

El gen de la quimioquina CX3C se ha cartografiado en el cromosoma 16 humano. Los estudios de cartografiados también indican la posibilidad de un pseudogén o gen relacionado en el cromosoma 14 humano. La secuenciación de los fragmentos de ADN genómico sugiere que el gen de la quimioquina CX3C tiene un intrón que comienza cerca o en el codón que codifica Ile 64. Otros límites de intrón/exón aún deben cartografiarse, pero esto será fácil de lograr mediante métodos convencionales.

La forma unida a membrana de la CX3Cquina posee propiedades proadherentes para monocitos y células T en la circulación. Una forma segregada o soluble, que consiste en el dominio de quimioquina y la región tallo, es capaz de inhibir su actividad proadhesiva. Esto sugiere que la forma unida a membrana de la CX3Cquina puede ser un potente regulador de los leucocitos en la circulación y, por tanto, puede estar implicada en diversas enfermedades inflamatorias, por ejemplo, la artritis. La forma soluble puede emplearse como regulator de la proadherencia, en especial en trastornos de respuesta inmunitaria comprometida.

Las propiedades de las quimioquinas CX3C como quimioatrayente de células T y monocitos, acopladas con su distribución en el cerebro y otros órganos, sugiere que la quimioquina CX3C puede estar implicada en la patogénesis de trastornos inflamatorios de SNC, tales como la esclerosis múltiple, y otras patologías que implican una inflamación neurogénica. Sin embargo, puesto que la distribución de la quimioquina CX3C no está limitada al cerebro, el espectro completo de estados inflamatorios, infecciosos e inmunorreguladores en los que se cree que están implicados otras quimioquinas también debe considerarse para la quimioquina CX3C. Véase, por ejemplo, Frank, et al. (eds.) (1995), Samter's Immnologic Diseases, 5ª ed., vols. I y II, Little, Brown, and Co., Boston, MA.

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II. Definiciones

La expresión "composición de unión" se refiere a moléculas que se unen con especificidad a una CX3Cquina, por ejemplo, en una interacción antígeno-anticuerpo. Sin embargo, otros compuestos, por ejemplo, proteínas de receptores, también pueden asociarse específicamente con las CX3Cquinas para excluir otras moléculas. De forma típica, la asociación se realizará como una interacción proteína-proteína natural fisiológicamente pertinente, de forma covalente o no covalente, y puede incluir miembros de un complejo de multiproteínas, incluyendo compuestos vehículo o compañeros de dimerización. La molécula puede ser un polímero o un reactivo químico. Esto no implica necesariamente que la CX3Cquina sea el ligando o el receptor de una interacción ligando-receptor, a menos que la interacción muestre una especificidad similar, por ejemplo, una afinidad específica. Un análogo funcional puede ser un ligando con modificaciones estructurales, o puede ser una molécula totalmente no relacionada, por ejemplo, que tenga una forma molecular que interaccione con los determinantes de unión del ligando apropiados. Los ligandos pueden actuar como agonistas o antagonistas del receptor, véase, por ejemplo, Goodman, et al. (eds.) (1990), Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8ª ed.) Pergamon Press, Tarrytown, N.Y.

La expresión "complejo de agente de unión:proteína de CX3Cquina", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un complejo de un agente de unión y una proteína de CX3Cquina que se forma por la unión específica del agente de unión a la proteína de CX3Cquina, por ejemplo, preferiblemente el dominio de quimioquina. La unión específica del agente de unión significa que el agente de unión tiene un sitio de unión específica que reconoce un sitio sobre la proteína de CX3Cquina. Por ejemplo, anticuerpos generados contra una proteína de CX3Cquina y que reconocen un epitopo sobre la proteína de CX3Cquina son capaces de formar un complejo de agente de unión:proteína de CX3Cquina mediante unión específica. De forma típica, la formación de un complejo de agente de unión:proteína de CX3Cquina permite medir la proteína de CX3Cquina en una mezcla de otras proteínas y productos biológicos. La expresión "complejo de anticuerpo:proteína de CX3Cquina" se refiere a una realización en la que el agente de unión es un anticuerpo. El anticuerpo puede ser monoclonal, policlonal, o un fragmento de unión de un anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fab o F(ab)2. El anticuerpo será preferiblemente un anticuerpo policlonal con fines de reacción cruzada.

Las secuencias de ácidos nucleicos "homólogas", cuando se comparan, muestran una significativa similitud. Los patrones de homología en ácido nucleicos son medidas de la homología utilizadas en general en la técnica mediante comparación de las secuencias y/o relación filogenética, o se basan en las condiciones de hibridación. Las condiciones de hibridación se describen con más detalle a continuación.

Un ácido nucleico "aislado" es un ácido nucleico, por ejemplo, un ADN, un ARN, o un polímero mixto, que está sustancialmente separado de otros componentes biológicos que en la naturaleza acompañan a una secuencia nativa, por ejemplo, proteínas y secuencias genómicas flanqueantes de la especie origen. El término incluye una secuencia de ácido nucleico que se ha retirado de su entorno natural, e incluye aislados de ADN clonado o recombinante y análogos sintetizados químicamente, o análogos sintetizados biológicamente mediante sistemas heterólogos. Una molécula sustancialmente pura incluye formas aisladas de la molécula. Un ácido nucleico aislado normalmente contendrá moléculas de ácidos nucleicos homogéneas, pero en algunas realizaciones contendrá ácidos nucleicos con una pequeña heterogeneicidad de secuencia. Esta heterogeneicidad se encuentra, de forma típica, en los extremos del polímero o las porciones que no son críticas para una función o actividad biológica deseada.

Tal como se utiliza en la presente, la expresión "proteína de CX3Cquina" incluye, cuando se utiliza en un contexto de proteínas, una proteína que tiene secuencias de aminoácidos, en particular procedentes de porciones del motivo de quimioquina, que aparecen en SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8, o un fragmento significativo de dicha proteína, por ejemplo, preferiblemente el dominio de quimioquina, aunque la secuencia de SEQ ID NO:6 no forma parte de la presente invención. La invención también incluye un polipéptido que muestra una estructura similar a la CX3Cquina humana o de ratón, por ejemplo, que interacciona con componentes de unión específicos de CX3Cquinas. Estos componentes de unión, por ejemplo, anticuerpos, se unen, de forma típica, a una CX3Cquina con alta afinidad, por ejemplo, al menos aproximadamente 100 nM, normalmente más que aproximadamente 30 nM, preferiblemente más que aproximadamente 10 nM, y más preferiblemente más que aproximadamente 3 nM.

Los términos "polipéptido" o "proteína", tal como se utilizan en la presente, incluyen un fragmento significativo o segmento de una porción del motivo de quimioquina de una CX3Cquina, e incluyen un tramo de restos aminoácidos de al menos aproximadamente 8 aminoácidos, en general al menos 10 aminoácidos, más en general al menos 12 aminoácidos, a menudo al menos 14 aminoácidos, más a menudo al menos 16 aminoácidos, de forma típica al menos 18 aminoácidos, de forma más típica al menos 20 aminoácidos, normalmente al menos 22 aminoácidos, más normalmente al menos 24 aminoácidos, preferiblemente al menos 26 aminoácidos, más preferiblemente al menos 28 aminoácidos y, en realizaciones particularmente preferidas, al menos aproximadamente 30 o más aminoácidos, por ejemplo, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, etc.

Un ácido nucleico "recombinante" se define mediante su método de producción o mediante su estructura. Haciendo referencia a su método de producción, por ejemplo, un producto fabricado mediante un proceso, el proceso es el uso de las técnicas de ácidos nucleicos recombinantes, por ejemplo, que implican la intervención humana en la secuencia de nucleótidos, de forma típica la selección o producción. Como alternativa, puede ser un ácido nucleico fabricado generando una secuencia que comprende la fusión de dos fragmentos que no están contiguos en la naturaleza, pero pretende excluir los productos de la naturaleza, por ejemplo, los mutantes que aparecen en la naturaleza. Así, por ejemplo, se incluyen los productos fabricados transformando células con cualquier vector que no aparece en la naturaleza, como son los ácidos nucleicos que comprenden secuencias derivadas utilizando cualquier proceso con oligonucleótidos sintéticos. A menudo esto se hace para sustituir un codón por un codón redundante que codifica el mismo aminoácido o un aminoácido conservativo, mientras que introduce o elimina, de forma típica, un sitio de reconocimiento de secuencia. Como alternativa, se realiza para juntar segmentos de ácidos nucleicos de funciones deseadas para generar una única entidad genética que comprende una combinación deseada de funciones que no aparece en las formas naturales disponibles habitualmente. Los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción son, a menudo, dianas para estas manipulaciones artificiales, pero otras dianas específicas de sitio, por ejemplo, promotores, sitios de replicación de ADN, secuencias reguladoras, secuencias control u otras características útiles pueden incorporarse mediante el diseño. Se pretende un concepto similar para un polipéptido recombinante, por ejemplo, de fusión. Se incluyen, de forma específica, ácidos nucleicos sintéticos que, mediante la redundancia del código genético, codifican polipéptidos similares a los fragmentos de estos antígenos, y fusiones de secuencias procedentes de diversos variantes de especie diferentes. También puede realizarse la mutación de los sitios de ruptura de
proteasas.

La "solubilidad" se refleja mediante la sedimentación medida en unidades Svedberg, que son una medida de la velocidad de sedimentación de una molécula bajo condiciones particulares. La determinación de la velocidad de sedimentación se ha realizado, de forma clásica, en una ultracentrífuga analítica, pero en la actualidad se realiza, de forma típica, en una ultracentrífuga convencional. Véase, Freifelder (1982), Physical Biochemistry (2ª ed.), W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA; y Cantor y Schimmel (1980), Biophysical Chemistry, partes 1-3, W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA. Como determinación bruta, una muestra que contiene un polipéptido putativamente soluble se centrifuga en una ultracentrífuga de tamaño normal convencional a aproximadamente 50K rpm durante aproximadamente 10 minutos, y las moléculas solubles se quedan en el sobrenadante. Una partícula o polipéptido soluble será, de forma típica, menor que aproximadamente 30S, de forma más típica menor que aproximadamente 15S, normalmente menor que aproximadamente 10S, más normalmente menor que aproximadamente 6S y, en realizaciones particulares, preferiblemente menor que aproximadamente 4S, y más preferiblemente menor que aproximadamente 3S. La solubilidad de un polipéptido o fragmento depende del entorno y del polipéptido. Muchos parámetros afectan a la solubilidad del polipéptido, incluyendo la temperatura, el entorno electrolítico, el tamaño y las características moleculares del polipéptido, y la naturaleza del disolvente. De forma típica, la temperatura en la que el polipéptido se emplea varía de aproximadamente 4ºC a aproximadamente 65ºC. Normalmente, la temperatura de uso es mayor que aproximadamente 18ºC y de forma más habitual es mayor que aproximadamente 22ºC. Para fines de diagnóstico, la temperatura normalmente será aproximadamente la temperatura ambiente o más alta, pero menor que la temperatura de desnaturalización de los componentes en el ensayo. Para fines terapéuticos, la temperatura será normalmente la temperatura corporal, de forma típica aproximadamente 37ºC para seres humanos, aunque en ciertas situaciones la temperatura puede aumentar o disminuir in situ o in vitro.

El tamaño y estructura del polipéptido se debería evaluar, en general, en un estado sustancialmente estable, y normalmente no es estado desnaturalizado. El polipéptido puede estar asociado con otros polipéptidos en una estructura cuaternaria, por ejemplo, para conferir solubilidad, o puede estar asociado con lípidos o detergentes de una manera que se aproxime a las interacciones de bicapa lipídica naturales.

El disolvente será normalmente un tampón biológicamente compatible, del tipo utilizado para la conservación de las actividades biológicas, y normalmente se aproximará a un disolvente fisiológico. Normalmente, el disolvente tendrá un pH neutro, de forma típica entre aproximadamente 5 y 10, y preferiblemente aproximadamente 7,5. En algunas ocasiones se añadirá un detergente, de forma típica uno suave no desnaturalizante, por ejemplo, CHS (hemisuccinato de colesterilo) o CHAPS (sulfonato de 3-[3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propano), o a una concentración lo suficientemente baja como para evitar una ruptura significativa de las propiedades estructurales o fisiológicas de la proteína.

"Sustancialmente puro", en un contexto de proteínas, significa, de forma típica, que la proteína está aislada de otras proteínas, ácidos nucleicos y otros productos biológicos contaminantes derivados del organimo fuente original. La pureza o el "aislamiento" pueden ensayarse mediante métodos convencionales, y normalmente será al menos aproximadamente 50% puro, más habitualmente al menos aproximadamente 60% puro, en general al menos aproximadamente 70% puro, más en general al menos aproximadamente 80% puro, a menudo al menos aproximadamente 85% puro, más a menudo al menos aproximadamente 90% puro, preferiblemente al menos aproximadamente 95% puro, más preferiblemente al menos aproximadamente 98% puro y, en las realizaciones más preferidas, al menos 99% puro. Se aplican conceptos similares, por ejemplo, a anticuerpos o ácidos nucleicos.

Una "similitud sustancial", en el contexto de la comparación de secuencias de ácidos nucleicos, significa que los segmentos, o sus hebras complementarias, cuando se comparan, son idénticos cuando se alinean de forma óptima, con las inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas, en al menos aproximadamente 50% de los nucleótidos, en general al menos 56%, más en general al menos 59%, normalmente al menos 62%, más normalmente al menos 65%, a menudo al menos 68%, más a menudo al menos 71%, de forma típica al menos 74%, de forma más típica al menos 77%, normalmente al menos 80%, más normalmente al menos aproximadamente 85%, preferiblemente al menos aproximadamente 90%, más preferiblemente al menos aproximadamente 95% al 98% o más y, en realizaciones particulares, tanto como aproximadamente 99% o más de los nucleótidos. Como alternativa, una similitud sustancial existe cuando los segmentos se hibridan bajo condiciones de hibridación selectiva con una hebra, o su complemento, de forma típica utilizando una secuencia derivada de SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7. De forma típica, se produce una hibridación selectiva cuando existe al menos aproximadamente 55% de similitud a lo largo de un tramo de al menos aproximadamente 30 nucleótidos, preferiblemente al menos aproximadamente 65% a lo largo de un tramo de al menos aproximadamente 25 nucleótidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 75%, y lo más preferible al menos aproximadamente 90% a lo largo de aproximadamente 20 nucleótidos. Véase, Kanehisa (1984), Nuc.. Acids Res., 12:203-213. La longitud de la comparación de la similitud, como se describe, puede ser a lo largo de tramos más largos y, en ciertas realizaciones, será a lo largo de un tramo de al menos aproximadamente 17 nucleótidos, normalmente al menos aproximadamente 20 nucleótidos, más normalmente al menos aproximadamente 24 nucleótidos, de forma típica al menos aproximadamente 28 nucleótidos, de forma más típica al menos aproximadamente 40 nucleótidos, preferiblemente al menos aproximadamente 50 nucleótidos, y más preferiblemente al menos de aproximadamente 75 a 100 o más nucleótidos, por ejemplo, 150, 200, etc.

Unas "condiciones rigurosas", haciendo referencia a la homología o la similitud sustancial en el contexto de la hibridación, serán condiciones rigurosas combinadas de sal, temperatura, disolventes orgánicos y otros parámetros, de forma típica los que se controlan en las reacciones de hibridación. La combinación de parámetros es más importante que la medida de cualquier parámetro individual. Unas condiciones de temperatura rigurosas normalmente incluyen temperaturas mayores que aproximadamente 30ºC, más normalmente mayores que aproximadamente 37ºC, de forma típica mayores que aproximadamente 45ºC, de forma más típica mayores que aproximadamente 55ºC, preferiblemente mayores que aproximadamente 65ºC, y más preferiblemente mayores que aproximadamente 70ºC. Unas condiciones de sales rigurosas normalmente serán menores que aproximadamente 1000 mM, habitualmente menores que aproximadamente 500 mM, más habitualmente menores que aproximadamente 400 mM, de forma típica menores que aproximadamente 300 mM, preferiblemente menores que aproximadamente 200 mM, y más preferiblemente menores que aproximadamente 150 mM. Véase, por ejemplo, Wetmur y Davidson (1968), J. Mol. Biol., 31:349-370. Una sonda de ácido nucleico que se una a un ácido nucleico diana bajo condiciones rigurosas es específica para dicho ácido nucleico diana. Esta sonda tiene una longitud, de forma típica, de más de 11 nucleótidos, y es suficientemente idéntica o complementaria con un ácido nucleico diana a lo largo de la región especificada por la secuencia de la sonda para unirse a la diana bajo condiciones de hibridación rigurosas.

Las CX3Cquinas de otras especies de mamífero pueden ser clonadas y aisladas mediante una hibridación cruzada entre especies con relación cercana. Véase, por ejemplo, a continuación. La similitud puede ser relativamente baja entre especies lejanamente relacionadas y, por tanto, resulta recomendable la hibridación de especies con relación cercana. Como alternativa, la preparación de una preparación de anticuerpos que muestren menos especificidad de especie puede ser útil en las estrategias de clonación de expresión.

Las expresiones "se une específicamente con un anticuerpo" o "es específicamente inmunorreactivo con", cuando hacen referencia a una proteína o péptido, se refieren a una reacción de unión que es determinativa de la presencia de la proteína en presencia de una población heterogénea de proteínas y otros componentes biológicos. Por tanto, bajo condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos especificados se unen a una proteína particular y no se unen significativamente a otras proteínas presentes en la muestra. La unión específica a un anticuerpo bajo estas condiciones puede requerir un anticuerpo que se selecciona por su especificidad por una proteína particular. Por ejemplo, anticuerpos generados contra el inmunógeno de la proteína de CX3Cquina humana con la secuencia de aminoácidos que aparece en SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8 pueden seleccionarse para obtener anticuerpos específicamente inmunorreactivos con proteínas de CX3Cquina y no con otras proteínas. Estos anticuerpos reconocen proteínas muy similares a la proteína de CX3Cquina de ratón homóloga.

III. Ácidos nucleicos

La CX3Cquina humana es un ejemplo de una clase más grande de proteínas relacionadas desde el punto de vista estructural y funcional. Estas proteínas de quimioquina solubles actúan para trasmitir señales entre diferentes tipos celulares. Las realizaciones preferidas, tal como se describen, serán útiles en procedimientos convencionales para aislar genes de diferentes individuos o de otras especies, por ejemplo, animales de sangre caliente, tales como aves y mamíferos. Una hibridación cruzada puede permitir el aislamiento de genes relacionados que codifican proteínas de individuos, razas o especies. Una serie de estrategias diferentes están disponibles para aislar con éxito un clon de ácido nucleico adecuado basándose en la información proporcionada en la presente. Los estudios de hibridación de análisis de la transferencia Southern pueden determinar cualitativamente la presencia de genes homólogos en genomas humanos, de mono, rata, perro, vaca y conejo bajo condiciones de hibridación específicas.

Las secuencias complementarias también se usarán como sondas o cebadores. Basándose en la identificación del amino-terminal probable, otros péptidos deberían ser particularmente útiles, por ejemplo, acoplados con técnicas de vector anclado o de PCR complementaria de poli-A, o con ADN complementario de otros péptidos. Además, la traducción inversa utilizando la redundancia del código genético puede proporcionar genes sintéticos que pueden codificar proteínas esencialmente idénticas, a menudo con una selección de uso de codones preferida para la expresión en una célula hospedante dada.

Las técnicas para la manipulación de ácidos nucleicos de genes que codifican proteínas de CX3Cquina, tales como la subclonación de secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos en vectores de expresión, marcaje de sondas, hibridación de ADN y similares, se describen, en general, en Sambrook, et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed.), vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, que se incorpora en la presente como referencia. Este manual se denomina en lo sucesivo en la presente "Sambrook, et al".

Existen diversos métodos para aislar secuencias de ADN que codifican proteínas de CX3Cquina. Por ejemplo, se aisla ADN de un banco de genómico o de ADNc utilizando sondas oligonucleotídicas marcadas que tienen secuencias idénticas o complementarias con las secuencias descritas en la presente. Pueden emplearse sondas de longitud completa, o sondas oligonucleotídicas que pueden generarse mediante comparación de las secuencias descritas. Estas sondas pueden utilizarse directamente en ensayos de hibridación para aislar ADN que codifica proteínas de CX3Cquina, o pueden diseñarse cebadores, por ejemplo, utilizando secuencias flanqueantes, para su uso en técnicas de amplificación, tales como PCR, para el aislamiento de ADN que codifica proteínas de CX3Cquina.

Para preparar un banco de ADNc se aisla ARNm de células que expresan una proteína de CX3Cquina. Se prepara ADNc a partir del ARNm y se acopla a un vector recombinante. El vector se transfecta hacia un hospedante recombinante para la propagación, selección y clonación. Los métodos para fabricar y seleccionar bancos de ADNc son muy conocidos. Véase, Gubler y Hoffman (1983), Gene, 25:263-269, y Sambrook, et al.

Para un banco genómico, puede extraerse el ADN de un tejido y romperse de forma mecánica o digerirse con enzimas para producir fragmentos, por ejemplo, de aproximadamente 12-20 kb. Entonces se separan los fragmentos mediante centrifugación en gradiente y se clonan en vectores de bacteriófago lambda. Estos vectores y fagos se encapsulan in vitro, como se describe en Sambrook, et al. Los fagos recombinantes se analizan mediante hibridación en placas como se describe en Benton y Davis (1977), Science, 196:180-182. La hibridación de colonias se realiza como se describe, en general, por ejemplo, en Grunstein, et al. (1975), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:3961-3965.

También puede identificarse el ADN que codifica una proteína de CX3Cquina en bancos de ADNc o genómicos por su capacidad para hibridarse con las sondas de ácido nucleico descritas en la presente, por ejemplo, en ensayos de hibridación de colonias o en placa. Las correspondientes regiones del ADN se aislan mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook, et al. Como alternativa, pueden evaluarse bases de datos de secuencias, por ejemplo, GenBank, para secuencias similares o correspondientes.

También pueden emplearse diversos métodos para amplificar secuencias diana, tales como la reacción en cadena de polimerasa, para preparar ADN que codifica proteínas de CX3Cquina. La tecnología de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) se emplea para amplificar estas secuencias de ácidos nucleicos directamente a partir del ARNm, a partir del ADNc, y a partir de bancos genómico o de bancos de ADNc. Las secuencias aisladas que codifican proteínas de CX3Cquina también pueden utilizarse como moldes para la amplificación de PCR.

De forma típica, en las técnicas de PCR, se sintetizan cebadores oligonucleotídicos complementarios con dos regiones 5' en dos hebras de la región del ADN que se va a amplificar. La reacción en cadena de polimerasa entonces se lleva a cabo utilizando los dos cebadores opuestos. Véase, Innis, et al. (eds.) (1990), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego, CA. Los cebadores pueden seleccionarse para que amplifiquen las regiones completas que codifican una proteína de CX3Cquina de longitud completa, o para que amplifiquen segmentos de ADN más pequeños, según se desee. Cuando estas regiones se han amplificado mediante PCR, pueden secuenciarse y pueden prepararse sondas oligonucleotídicas a partir de la secuencia, obtenida utilizando técnicas convencionales. Estas sondas entonces pueden utilizarse para aislar ADN que codifica proteínas de CX3Cquina.

Los oligonucleótidos para utilizar como sondas normalmente se sintetizan químicamente según el método de triéster de fosforamidita en fase sólida, descrito en primer lugar por Beaucage y Carruthers (1983), Tetrahedron Lett., 22(20):1859-1862, o empleando un sintetizador automático, como se describe en Needham-VanDevanter, et al. (1984), Nucleic Acids Res., 12:6159-6168. La purificación de los oligonucleótidos se realiza, por ejemplo, mediante electroforesis en gel de acrilamida nativa o mediante HPLC de intercambio aniónico, como se describe en Pearson y Regnier (1983), J. Chrom., 255:137-149. La secuencia del oligonucleótido sintético puede verificarse utilizando, por ejemplo, el método de degradación química de Maxam, A.M. y Gilbert, W. en Grossman, L. y Moldave (eds.) (1980), Methods in Enzymology, 65:499-560, Academic Press, Nueva York.

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Se identificó un ácido nucleico aislado que codifica una proteína de CX3Cquina humana. La secuenca de nucleótidos y el correspondiente marco de lectura abierto se proporciona en SEQ ID NO:1 y 2; y otras secuencias se proporcionan en SEQ ID NO:3 y 4. Igualmente se identificó una secuencia de ratón, y sus nucleótidos y correspondiente marco de lectura abierto se indican como SEQ ID NO:5-8.

Estas CX3Cquinas muestran una similitud limitada con porciones de quimioquinas, en particular con los dominios de quimioquinas. Véase, por ejemplo, Matsushima y Oppenheim (1989), Cytokine, 1:2-13; Oppenheim, et al. (1991), Ann. Rev. Immunol., 9:617-648; Schall (1991), Cytokine, 3:165-183; y Gronenborn y Clore (1991), Protein Engineering, 4:263-269. En particular, la CX3Cquina humana muestra similitud con la clase C de quimioquinas en la porción carboxi-terminal, en particular con respecto a la longitud y en las posiciones correspondientes, en la numeración de la secuencia humana madura, con la secuencia cys-ala-asp-pro en las posiciones 50-53; y la secuencia trp-val en las posiciones 57-58. Las CX3Cquinas tienen una cola carboxilo-terminal mucho más larga que los miembros de las familias de quimioquinas CC o CXC, y esta región "tallo" puede desempeñar un papel en la presentación de quimioquinas. De forma notable, el espaciamiento de los restos cisteína conservados en las familias de quimioquinas CXC y CC está ausente en la realización de la CX3Cquina humana. Otras características de comparación son evidentes entre las familias de quimioquinas y CX3Cquina. Véase, por ejemplo, Lodi, et al. (1994), Science, 263:1762-1766. En particular, pueden determinarse los restos de lámina \beta y de \alpha-hélice utilizando, por ejemplo, el programa informático RASMOL, véase, Sayle y Milner-White (1995), TIBS, 20:374-376; o Gronenberg, et al. (1991), Protein Engineering, 4:263-269; y se definen otras características estructurales en Lodi, et al. (1994), Science, 263:1762-1767. Estas características secundarias y terciarias ayudan a definir aún más las características estructurales de C, CC y CXC, junto con el espaciamiente de los restos cisteína apropiados.

Basándose en la formación de modelos estructurales y los descubrimientos en las regiones de unión de las quimioquinas, se predice que los restos en la proteína humana madura, que carecen de una señal de 24 restos, 26 (his), 28 (gln), 40 (ile), 42 (glu), 47 (arg) y 48 (leu), deben ser importantes para la unión de las quimioquinas a las células. Los residuos en el amino-terminal probablemente no están implicados en la unión al receptor ni en la especificidad.

Además, se predice que los límites de los exones se corresponden con segmentos de la proteína, incluyendo la secuencia señal hasta aproximadamente el segundo resto (his) en la proteína madura; desde aquí hasta aproximadamente tres restos pasada la tercera cys (cerca de arg-ala); y desde aquí hasta el final. El tercer exón parece mostrar una similitud relativamente alta con las otras quimioquinas. El segundo exón probablemente sea el más característico de las quimioquinas CX3C, y sería el segmento preferido para emplear en la búsqueda de homología en otros variantes, por ejemplo, de especie u otros. En particular, los segmentos que se espera sean los preferidos para producir anticuerpos específicos de quimioquinas CX3C incluirán péptidos o secuencias en la región desde el segundo resto de la proteína madura (his) hasta aproximadamente el tercer resto después de la tercera cisteína (arg). Los fragmentos de al menos aproximadamente 8-10 restos en esta región serían péptidos especialmente interesantes, por ejemplo, los que comienzan en las posiciones de restos de la proteína madura 1, 2, 3, etc. Estos fragmentos terminarían, de forma típica, en esa región, por ejemplo, en los restos 37, 36, 35, etc. Otros péptidos interesantes de diversa longitud incluirían los que comienzan o terminan en otras posiciones de la proteína, por ejemplo, en los restos 87, 86, etc., con unas longitudes que varían, por ejemplo, de aproximadamente 8 a 20, 25, 30, 35, 40, etc. Los correspondientes fragmentos de otras CX3Cquinas de mamífero, por ejemplo ratón, serán realizaciones preferidas.

Esta invención proporciona ADN aislado o fragmentos que codifican una proteína de CX3Cquina. Además, esta invención proporciona ADN aislado o recombinante que codifica una proteína o polipéptido que es capaz de hibridarse bajo condiciones apropiadas, por ejemplo, alta rigurosidad, con las secuencias de ADN descritas en la presente. Esta proteína o polipéptido biológicamente activo puede ser un ligando intacto, o un fragmento, y tiene una secuencia de aminoácidos según se describe en SEQ ID NO:2, 4 u 8. Las realizaciones preferidas serán secuencias naturales de longitud completa, procedentes de aislados con un tamaño, por ejemplo, de aproximadamente 11.000 a 12.500 daltons cuando no están glicosiladas, o fragmentos de al menos aproximadamente 6.000 daltons, más preferiblemente de al menos aproximadamente 8.000 daltons. En la forma glicosilada, la proteína puede ser mayor que 12.500 daltons. Además, esta invención contempla el uso de ADN aislado o recombinante, o sus fragmentos, que codifican proteínas que son homólogas con una proteína de CX3Cquina, o que se aislaron utilizando ADNc que codifica una proteína de CX3Cquina, tal como una sonda. El ADN aislado puede tener las respectivas secuencias reguladoras en los flancos 5' y 3', por ejemplo, promotores, potenciadores, señales de adición de poli-A, y otros.

IV. Fabricación de CX3Cquinas

Pueden obtenerse ADN que codifican una CX3Cquina, o su fragmento, mediante síntesis química, selección de bancos de ADNc, o selección de bancos genómicos preparados a partir de una amplia variedad de líneas celulares o muestras de tejidos. La redundancia del código genético proporciona un número de secuencias polinucleotídicas que deberían codificar la misma proteína.

Estos ADN pueden expresarse en una amplia variedad de células hospedantes para la síntesis de una proteína de longitud completa, o fragmentos, que, a su vez, pueden emplearse para generar anticuerpos policlonales o monoclonales; para estudios de unión; para la construcción y expresión de moléculas modificadas; y para estudios de estructura/función. Cada CX3Cquina, o sus fragmentos, por ejemplo, el dominio de quimioquina, puede expresarse en células hospedante que se han transformado o transfectado con los vectores de expresión apropiados. Estas moléculas pueden purificarse sustancialmente para que estén exentas de contaminantes celulares o proteicos, distintos de los derivados del hospedante recombinante y, por tanto, son particularmente útiles en composiciones farmacéuticas cuando se combinan con un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. El antígeno, por ejemplo, una CX3Cquina, o sus porciones, pueden expresarse como fusiones con otras proteína, o pueden poseer un marcador de epitopo. Esto es aplicable también a los sitios de unión al antígeno.

Los vectores de expresión son, de forma típica, constructos de ADN o ARN autorreplicantes que contienen el gen del antígeno deseado, o sus fragmentos, normalmente unidos operablemente con los elementos de control genéticos apropiados que son reconocidos en una célula hospedante adecuada. El tipo específico de elementos de control necesarios para llevar a cabo la expresión dependerá de la célula hospedante concreta utilizada. En general, los elementos de control genético pueden incluir un sistema promotor procariota o un sistema de control de la expresión del promotor eucariota y, de forma típica, incluirán un promotor transcripcional, un operador opcional para controla el inicio de la transcripción, potenciadores de la transcripción para elevar el nivel de la expresión del ARNm, una secuencia que codifica un sitio de unión a ribosomas adecuados, y secuencias que terminen la transcripción y la traducción.. Los vectores de expresión también contienen normalmente un origen de la replicación que permite al vector replicarse independientemente de la célula hospedante.

Los vectores de esta invención incluyen ADN que codifica una CX3Cquina, o su fragmento, que codifica de forma típica, por ejemplo, una proteína o polipéptido biológicamente activo. El ADN puede estar bajo el control de un promotor vírico y puede codificar un marcador de selección. Esta invención contempla también el uso de estos vectores de expresión que son capaces de expresar ADNc eucariota que codifica una proteína de CX3Cquina en un hospedante procariota o eucariota, en el que el vector es compatible con el hospedante y en el que el ADNc eucariota que codifica la proteína se inserta en el vector, de forma que con el crecimiento del hospedante que contiene el vector se expresa el ADNc en cuestión. Normalmente, los vectores de expresión se diseñan para la replicación estable en sus células hospedantes, o para la amplificación para aumentar en gran medida el número total de copias del gen deseable por célula. No siempre es necesario que un vector de expresión se replique en una célula hospedante, por ejemplo, es posible efectuar una expresión transitoria de la proteína, o su fragmento, en diversos hospedantes utilizando vectores que no contengan un origen de la replicación que sea reconocido por la célula hospedante. También es posible utilizar vectores que provoquen la integración de un gen de CX3Cquina, o sus fragmentos, en el ADN del hospedante mediante recombinación, o integrar un promotor que controle la expresión de un gen endógeno.

Los vectores, tal como se utilizan en la presente, contemplan plásmidos, virus, bacteriófagos, fragmentos de ADN integrables, y otros vehículos que permitan la integración de fragmentos de ADN en el genoma del hospedante. Los vectores de expresión son vectores especializados que contienen elementos de control genético que llevan a cabo la expresión de genes unidos operablemente. Los plásmidos son la forma de vector que se utiliza con más frecuencia, pero muchas otras formas de vectores que tienen una función equivalente son adecuados para su uso en la presente. Véase, por ejemplo, Pouwels, et al. (1985 y suplementos), Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y.; y Rodriquez, et al. (eds.) (1988), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses Buttersworth, Boston, MA.

Las células hospedantes adecuadas incluyen procariotas, eucariotas inferiores y eucariotas superiores. Los procariotas incluyen organismos gram-negativo y gram-positivo, por ejemplo, E. coli y B. subtilis. Los eucariotas inferiores incluyen levaduras, por ejemplo, S. cerevisiae y Pichia, y especies del género Dictyostelium. Los eucariotas superiores incluyen líneas celulares de cultivos de tejidos establecidos de células animales, de origen no mamífero, por ejemplo, células de insecto y de ave, y de origen mamífero, por ejemplo, humanos, primates y roedores.

Los sistemas de hospedante-vector procariotas incluyen una amplia variedad de vectores para muchas especies diferentes. Tal como se utiliza en la presente, E. coli y sus vectores se utilizarán genéricamente para incluir vectores equivalentes utilizados en otros procariotas. Un vector representativo para amplificar el ADN es pBR322 o sus derivados. Los vectores que pueden utilizarse para expresar CX3Cquinas o fragmentos de una CX3Cquina incluyen, pero no se limitan a los vectores que contienen el promotor lac (serie pUC); el promotor trp (pBR322-trp); el promotor Ipp (la serie pIN); los promotores lambda-pP o pR (pOTS); o promotores híbridos, tales como ptac (pDR540). Véase, Brosius, et al. (1988), "Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and Ipp-derived Promoters", en Rodriguez y Denhardt (eds.), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, 10:205-236, Buttersworth, Boston, MA.

Los eucariotas inferiores, por ejemplo, levaduras y Dictyostelium, pueden transformarse con vectores que contienen secuencias de CX3Cquina. Para los fines de esta invención, el hospedante eucariota inferior más común es la levadura del panadero, Saccharomyces cerevisiae. Se utilizará genéricamente para representar a los eucariotas inferiores, aunque también está disponible una serie de otras cepas y especies. Los vectores de levadura consisten, de forma típica, en un origen de la replicación (a menos que sean del tipo integrante), un gen de selección, un promotor, ADN que codifica la proteína deseada o sus fragmentos, y secuencias para la terminación de la traducción, la poliadenilación y la terminación de la transcripción. Los vectores de expresión adecuados para levaduras incluyen promotores constitutivos, tales como 3-fosfoglicerato quinasa y diversos otros promotores de genes de enzimas glicolíticas, o promotores inducibles, tal como el promotor de la alcohol deshidrogenasa 2 o el promotor de metalotionina. Los vectores adecuados incluyen derivados de los siguientes tipos: autorreplicantes de bajo número de copias (tales como la serie YRp), autorreplicantes con alto número de copias (tales como la serie YEp); tipos integrantes (tal como la serie YIp), o minicromosomas (tales como la serie YCp).

Las células de cultivos de tejidos de eucariotas superiores son, de forma típica, las células hospedantes preferidas para la expresión de la proteína CX3Cquina funcionalmente activa. En principio, pueden utilizarse muchas líneas celulares de cultivo de tejidos de eucariotas superiores, por ejemplo, sistemas de expresión de baculovirus de insecto, de origen invertebrado o vertebrado. Sin embargo, se prefieren las células de mamífero para lograr un procesamiento apropiado, cotraduccional y postraduccionalmente.

La transformación o transfección y propagación de estas células es rutinaria. Las líneas celulares útiles incluyen células HeLa, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO), líneas celulares de riñón de cría de rata (BRK), líneas celulares de insecto, líneas celulares de ave, y líneas celulares de mono (COS). Los vectores de expresión para estas líneas celulares normalmente incluyen un origen de la replicación, un promotor, un sitio de inicio de la traducción, un sitio de ruptura del ARN (por ejemplo, si se emplea ADN genómico), un sitio de poliadenilación, y un sitio de terminación de la transcripción. Estos vectores también pueden contener un gen de selección o un gen de amplificación. Los vectores de expresión adecuados pueden ser plásmidos, virus o retrovirus que porten promotores derivados, por ejemplo, de fuentes tales como adenovirus, SV40, parvovirus, virus de vacuna, o citomegalovirus. Los ejemplos representativos de vectores de expresión adecuados incluyen pCDNA1; pCD, véase, Okayama, et al. (1985), Mol. Cell Biol., 5:1136-1142; pMC1neo Poly-A, véase, Thomas, et al. (1987), Cell, 51:503-512; y un vector de baculovirus, tal como pAC 373 o pAC 610.

Es probable que las CX3Cquinas no necesiten glicosilarse para producir las respuestas biológicas. Sin embargo, a veces puede ser deseable expresar un polipéptido de CX3Cquina en un sistema que proporcione un patrón de glicosilación específico o definido. En este caso, el patrón normal será el que proporciona naturalmente el sistema de expresión. Sin embargo, el patrón puede modificarse mediante la exposición del polipéptido, por ejemplo, en forma no glicosilada, a proteínas de glicosilación apropiadas introducidas en un sistema de expresión heterólogo. Por ejemplo, el gen de CX3Cquina puede cotransformarse con uno o más genes que codifican enzimas glicosilantes de mamífero o de otra clase. También se entiende que la glicosilación excesiva puede ser perjudicial para la actividad biológica de la CX3Cquina, y que un experto en la técnica puede realizar ensayos rutinarios para optimizar el grado de glicosilación que confiere una actividad biológica óptima.

Una CX3Cquina, o su fragmento, puede modificarse para que esté unida mediante fosfatidil inositol (PI) a una membrana celular, pero que puede retirarse de las membranas mediante un tratamiento con una enzima de ruptura del fosfatidil inositol, por ejemplo, fosfatidil inositol fosfolipasa-C. Esto libera el antígeno en una forma biológicamente activa y permite la purificación mediante procedimientos convencionales de la química de proteínas. Véase, por ejemplo, Low (1989), Biochem. Biophys. Acta, 988:427-454; Tse, et al. (1985), Science, 230:1003-1008; y Brunner, et al. (1991), J. Cell Biol., 114:1275-1283.

Ahora que se han caracterizado las CX3Cquinas, pueden prepararse sus fragmentos o derivados mediante procesos convencionales para sintetizar péptidos. Éstos incluyen procesos tales como los descritos en Stewart y Young (1984), Solid Phase Pentide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky y Bodanszky (1984), The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Nueva York, NY; y Bodanszky (1984), The Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Nueva York, NY. Por ejemplo, puede emplearse un proceso de azida, un proceso de cloruro de ácido, un proceso de anhídrido de ácido, un proceso de anhídrido mixto, un proceso de éster activo (por ejemplo, éster p-nitrofenílico, éster N-hidroxisuccinimídico, o éster cianometílico), un proceso de carbodiimidazol, un proceso de oxidación-reducción, o un proceso de diciclohexilcarbodiimida (DCCD)/aditivo. Las síntesis en fase sólida y en fase de disolución son ambas aplicables a los anteriores procesos.

La proteína preparada, y sus fragmentos, puede aislarse y purificarse de la mezcla de reacción mediante separación de los péptidos, por ejemplo, mediante extracción, precipitación, electroforesis y diversas formas de cromatografía y similares. Las CX3Cquinas de esta invención pueden obtenerse con diversos grados de pureza dependiendo de su uso deseado. Puede lograrse la purificación mediante el uso de técnicas de purificación de proteínas conocidas o mediante el uso de anticuerpos o compañeros de unión descritos en la presente, por ejemplo, en una cromatografía de afinidad inmunoabsorbente. Véase, por ejemplo, Coligan, et al. (eds.) (1995 y suplementos periódicos), Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, Nueva York, NY. Esta cromatografía de afinidad inmunoabsorbente se realiza uniendo primero los anticuerpos a un soporte sólido y después poniendo en contacto los anticuerpos unidos con lisados solubilizados de las células fuente apropidadas, lisados de otras células que expresan el ligando, o lisados o sobrenadantes de células que producen la CX3Cquinas como resultado de técnicas de ADN recombinante, véase a continuación.

Pueden seleccionarse múltiples líneas celulares para detectar una que exprese una CX3Cquina en niveles altos comparada con otras células. Se seleccionan diversas líneas celulares, por ejemplo, una línea de células estromáticas tímica de ratón TA4, por sus favorables propiedades de manejo. Las CX3Cquinas naturales pueden aislarse a partir de fuentes naturales, o mediante su expresión a partir de una célula transformada utilizando un vector de expresión apropiado. La purificación de la proteína expresada se logra mediante procedimientos convencionales, o puede combinarse con procedimientos de modificación para una purificación eficaz con alta eficacia a partir de lisados o sobrenadantes celulares. Puede emplearse un epitopo u otro marcador, por ejemplo, segmentos FLAG o His_{6}, para estas características de purificación.

V. Anticuerpos

Pueden generarse anticuerpos contra diversas CX3Cquinas, incluyendo variantes individuales, polimórficos, alélicos, de raza o de especie, y sus fragmentos, en sus formas que aparecen en la naturaleza (de longitud completa) y en sus formas recombinanates. Además, pueden generarse anticuerpos contra CX3Cquinas en su forma activa o nativa, o en su forma inactiva o desnaturalizada. También pueden emplearse anticuerpos antiidiotípicos.

A. Producción de anticuerpos

Puede emplearse una serie de inmunógenos para producir anticuerpos específicamente reactivos con proteínas de CX3Cquina. La proteína recombinante es un inmunógeno preferido para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales. La proteína que aparece en la naturaleza también puede emplearse en forma pura o impura. También pueden emplearse péptidos sintéticos, fabricados utilizando las secuencias de proteína de CX3Cquina de ratón o humana descritas en la presente, como inmunógeno para la producción de anticuerpos contra CX3Cquinas, por ejemplo, sus dominios de unión a quimioquinas. La proteína recombinante puede expresarse en células eucariotas o procariotas como se describe en la presente, y purificarse como se describe. Puede emplearse material plegado, como aparece en la naturaleza, o desnaturalizado, según sea apropiado, para producir anticuerpos. Pueden generarse anticuerpos monoclonales o policlonales para su uso posterior en inmunoensayos para medir la proteína.

Los métodos para producir anticuerpos policlonales son conocidos por los expertos en la técnica. De forma típica, un inmunógeno, preferiblemente una proteína purificada, se mezcla con un adyuvante y se inmunizan animales con la mezcla. La respuesta inmunológica de los animales a la preparación de inmunógeno se controla tomando muestras de sangre y determinando la valoración de la reactividad contra la proteína de CX3Cquina o el fragmento de interés. Cuando se obtienen unas valoraciones altas apropiadas de anticuerpo contra el inmunógeno, normalmente después de repetidas inmunizaciones, se recoge sangre del animal y se preparan antisueros. Si se desea puede realizarse un fraccionamiento posterior de los antisueros para enriquecerlos con anticuerpos reactivos con la proteína. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane; o Coligan.

Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales mediante diversas técnicas familiares para los expertos en la técnica. De forma típica, células de bazo procedentes de un animal inmunizado con un antígeno deseado se inmortalizan, normalmente mediante fusión con una célula de mieloma (véase, Kohler y Milstein (1976), Eur. J. Immunol., 6:511-519, que se incorpora en la presente como referencia). Otros métodos alternativos para la inmortalización incluyen la transformación con virus de Epstein Barr, oncogenes, o retrovirus, u otros métodos conocidos en la técnica. Las colonias que surgen de células inmortalizadas individuales se seleccionan para la producción de anticuerpos con la especificidad y afinidad deseadas por el antígeno, y el rendimiento de los anticuerpos monoclonales producidos por estas células puede potenciarse mediante diversas técnicas, incluyendo la inyección en la cavidad peritoneal de un hospedante vertebrado. Como alternativa, se pueden aislar secuencias de ADN que codifiquen un anticuerpo monoclonal, o su fragmento de unión, mediante la selección de un banco de ADN para detectar células B humanas según, por ejemplo, el protocolo general indicado por Huse, et al. (1989), Science, 246:1275-1281.

Pueden generarse anticuerpos, incluyendo los fragmentos de unión y la versiones monocatenarias, contra fragmentos predeterminados de CX3Cquinas mediante una inmunización de animales con conjugados de los fragmentos con proteínas portadoras, como se describió anteriormente. Se preparan anticuerpos monoclonales a partir de células que segregan el anticuerpo deseado. Estos anticuerpos pueden seleccionarse para la unión a CX3Cquinas normales o defectuosas, o seleccionarse para la actividad agonista o antagonista, por ejemplo, mediada a través de un receptor. Estos anticuerpos monoclonales normalmente se unirán con una K_{D} de al menos aproximadamente 1 mM, más habitualmente al menos aproximadamente 300 \muM, de forma típica al menos aproximadamente 10 \muM, de forma más típica al menos aproximadamente 30 \muM, preferiblemente al menos aproximadamente 10 \muM, y más preferiblemente al menos aproximadamente 3 \muM o mejor.

En algunos casos resulta deseable preparar anticuerpos monoclonales a partir de diversos hospedantes mamíferos, tales como ratones, roedores, primates, seres humanos, etc. La descripción de las técnicas para preparar estos anticuerpos monoclonales puede encontrarse, por ejemplo, en Stites, et al. (eds.), Basic and Clinical Immunology (4ª ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y las referencias citadas en ello; Harlow y Lane (1988), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2ª ed.), Academic Press, Nueva York, NY; y, en particular, en Kohler y Milstein (1975), Nature, 256:495-497, que analiza un método para generar anticuerpos monoclonales. Resumido brevemente, este método implica inyectar un inmunógeno a un animal. El animal entonces se sacrifica y se recogen células del bazo, que entonces se fusionan con células de mielona. El resultado es una célula híbrida o "hibridoma" que es capaz de reproducirse in vitro. La población de hibridomas entonces se selecciona para aislar los clones individuales, que segregan cada uno una única especie de anticuerpo contra el inmunógeno. De esta manera, las especies de anticuerpos individuales obtenidas son los productos de células B individuales inmortalizadas y clonadas procedentes del animal inmune, generadas en respuesta a un sitio específico reconocido sobre la sustancia inmunogénica.

Otras técnicas adecuadas implican la selección de bancos de anticuerpos en vectores de fagos o vectores similares. Véase, por ejemplo, Huse, et al. (1989), "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda", Science, 246:1275-1281; y Ward, et al. (1989), Nature, 341:544-546. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención pueden emplearse con o sin modificación, incluyendo anticuerpos quiméricos o humanizados. Con frecuencia, los polipéptidos y anticuerpos se marcan uniendo, de forma covalente o no covalente, una sustancia que proporciona una señal detectable. Se conoce una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación y se indican con gran detalle en la bibliografía científica y de patentes. Los marcadores adecuados incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, restos fluorescentes, restos quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las patentes que indican el uso de estos marcadores incluyen las patentes de EEUU nº 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241. También pueden producirse inmunoglobulinas recombinantes. Véase, Cabilly, patente de EEUU nº 4.816.567; y Queen, et al. (1989), Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 86:10029-10033.

Los anticuerpos de esta invención son útiles para la cromatografía de afinidad para aislar una proteína de
CX3Cquina. Pueden prepararse columnas en las que los anticuerpos están unidos a un soporte sólido, por ejemplo, partículas, tales como agarosa, SEPHADEX, o similares, en las que un lisado o sobrenadante celular pueden hacerse pasar a través de la columna, la columna se lava, seguido de concentraciones crecientes de un desnaturalizante suave, con lo que la proteína de CX3Cquina purificada se libera.

Los anticuerpos también pueden utilizarse para seleccionar bancos de expresión para productos de expresión concretos. Normalmente, los anticuerpos utilizados en estos procedimientos estarán marcados con un resto que permita una detección fácil de la presencia del antígeno por la unión del anticuerpo.

Pueden emplearse anticuerpos contra CX3Cquinas para la identificación de poblaciones celulares que expresan CX3Cquinas. Mediante el ensayo de los productos de expresión de células que expresan CX3Cquinas es posible diagnosticar una enfermedad, por ejemplo, trastornos inmunocomprometidos.

Los anticuerpos generados contra cada CX3Cquina también serán útiles para generar anticuerpos antiidiotípicos. Éstos son útiles para detectar o diagnosticar diversos trastornos inmunológicos relacionados con la expresión de los respectivos antígenos.

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B. Inmunoensayos

Una proteína particular puede medirse mediante una diversidad de métodos de inmunoensayo. Para un informe acerca de los procedimientos inmunológicos y de inmunoensayos en general, véase, Stites y Terr (eds.) (1991), Basic and Clinical Immunology (7ª ed.). Además, los inmunoensayos de la presente invención pueden realizarse en muchas configuraciones, que se describen con detalle en Maggio (ed.) (1980), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Florida; Tijan (1985), "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam; y Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, supra, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia. Véase también Chan (ed.) (1987), Immunoassay: A Practical Guide Academic Press, Orlando, FL; Price y Newman (eds.) (1991), Principles and Practice of Immunoassays, Stockton Press, NY; y Ngo (ed.) (1988), Non-isotopic Immunoassays, Plenum Press, NY.

Los inmunoensayos para la medida de las proteínas de CX3Cquina pueden realizarse mediante una diversidad de métodos conocidos por los expertos en la técnica. Brevemente, los inmunoensayos para medir las proteínas pueden ser ensayos de unión competitiva o no competitiva. En los ensayos de unión competitiva, la muestra que se va a analizar compite con un analito marcado por los sitios de unión específica sobre un agente de captura unido a una supericie sólida. Preferiblemente, el agente de captura es un anticuerpo específicamente reactivo con las proteínas de CX3Cquina producidas como se describió anteriormente. La concentración del analito marcado unido al agente de captura es inversamente proporcional a la cantidad de analito libre presente en la muestra.

En un inmunoensayo de unión competitiva, la proteína de CX3Cquina presente en la muestra compite con una proteína marcada por la unión a un agente de unión específico, por ejemplo, un anticuerpo específicamente reactivo con la proteína de CX3Cquina. El agente de unión puede estar unido a una superficie sólida para llevar a cabo la separación de la proteína marcada unida de la proteína marcada no unida. Como alternativa, el ensayo de unión competitiva puede realizarse en fase líquida y puede emplearse una diversidad de técnicas conocidas en la técnica para separar la proteína marcada unida de la proteína marcada no unida. Después de la separación se determina la cantidad de proteína marcada unida. La cantidad de proteína presente en la muestra es inversamente proporcional a la cantidad de unión de proteína marcada.

Como alternativa, puede realizarse un inmunoensayo homogéneo en el que no sea necesaria una etapa de separación. En estos inmunoensayos, el marcador sobre la proteína se altera mediante la unión de la proteína a su agente de unión específico. Esta alteración en la proteína marcada da como resultado una disminución en la señal emitida por el marcador, de forma que la medida del marcador al final del inmunoensayo permite la detección o cuantificación de la proteína.

Las proteínas de CX3Cquina también pueden determinarse mediante una diversidad de métodos de inmunoensayo no competitivo. Por ejemplo, puede emplearse un inmunoensayo de "sandwich" en fase sólida de dos sitios. En este tipo de ensayo, un agente de unión a la proteína, por ejemplo un anticuerpo, se une a un soporte sólido. Un segundo agente de unión a la proteína, que también puede ser un anticuerpo, y que se une a la proteína en un sitio diferente, se marca. Después de que se haya producido la unión en ambos sitios sobre la proteína, el agente de unión marcado no unido se retira y se mide la cantidad de agente de unión marcado unido a la fase sólido. La cantidad de agente de unión marcado es directamente proporcional a la cantidad de proteína en la muestra.

Puede emplearse un análisis de la transferencia Western para determinar la presencia de proteínas de CX3Cquina en una muestra. Se realiza una electroforesis, por ejemplo, con una muestra de tejido sospechosa de contener la proteína. Después de la electroforesis para separar las proteínas, y la transferencia de las proteína a un soporte sólido adecuado, por ejemplo, un filtro de nitrocelulosa, el soporte sólido se incuba con un anticuerpo reactivo con la proteína. Este anticuerpo puede estar marcado o, como alternativa, puede detectarse mediante la posterior incubación con un segundo anticuerpo marcado que se une al anticuerpo primario.

Los formatos de inmunoensayos descritos anteriormente emplean componentes de ensayo marcados. El marcador puede acoplarse directa o indirectamente al componente deseado del ensayo según métodos muy conocidos en la técnica. Puede emplearse una amplia variedad de marcadores y métodos. De forma tradicional, se ha utilizado un marcador radiactivo que incorpora ^{3}H, 125_{I}, 35_{S}, 14_{C}, o 32_{P}. Los marcadores no radiactivos incluyen ligandos que se unen a anticuerpos marcados, fluoróforos, agentes quimioluminiscentes, enzimas, y anticuerpos que pueden actuar como miembros de parejas de unión específica para un ligando marcado. La elección del marcador depende de la sensibilidad requerida, la facilidad de conjugación con el compuesto, los requerimientos de estabilidad, y los instrumentos disponibles. Para un informe acerca de los diversos sistemas de marcaje o productores de señales que pueden emplearse, véase la patente de EEUU nº 4.391.904, que se incorpora en la presente como referencia.

Los anticuerpos reactivos con una proteína concreta también pueden medirse mediante una diversidad de métodos de inmunoensayo. Para un informe acerca de los procedimientos inmunológicos y de inmunoensayo aplicables a las medidas de anticuerpos mediante las técnicas de inmunoensayo, véase Stites y Terr (eds.), Basic and Clinical Immunology (7ª ed.), supra; Maggio (ed.), Enzyme Immunoassay, supra; y Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, supra.

Brevemente, los inmunoensayos para medir los antisueros reactivos con las proteínas de CX3Cquina pueden ser ensayos de unión competitiva y no competitiva. En los ensayos de unión competitiva, la muestra del analito compite con un analito marcado por los sitios de unión específica sobre un agente de captura unido a una superficie sólida. Preferiblemente, el agente de captura es una proteína de CX3Cquina recombinante purificada como se describió anteriormente. También pueden utilizarse otras fuentes de proteínas de CX3Cquina, incluyendo proteínas que aparecen en la naturaleza aisladas o parcialmente purificadas. Los ensayos no competitivos incluyen ensayos de "sandwich", en los que el analito de la muestra se mantiene unido entre dos reactivos de unión específicos del analito. Uno de los agentes de unión se emplea como agente de captura y se une a una superficie sólida. El segundo agente de unión se marca y se emplea para medir o detectar el complejo resultante por medios visuales o instrumentales. Puede emplearse una serie de combinaciones de agente de captura y agente de unión marcado. También puede utilizarse una diversidad de diferentes formatos de inmunoensayo, técnicas de separación y marcadores, similares a los descritos anteriormente para la medida de las proteínas de CX3Cquina.

VI. CX3Cquinas purificadas

Las secuencias de aminoácidos de la CX3Cquina humana aparecen en SEQ ID NO:2 y 4. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de ratón aparecen en SEQ ID NO:5, 6, 7 y 8.

La proteína purificada o los péptidos definidos son útiles para generar anticuerpos mediante métodos convencionales, como se describió anteriormente. Los péptidos sintéticos o la proteína purificada, por ejemplo, los dominios de quimioquina, pueden presentarse a un sistema inmunológico para generar anticuerpos monoclonales y policlonales. Véase, por ejemplo, Coligan (1991), Current Protocols in Immunology, Wiley/Greene, NY; y Harlow y Lane (1989), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, que se incorporan en la presente como referencia. Como alternativa, un receptor de CX3Cquina puede ser útil como reactivo de unión específica, y puede aprovecharse su especificidad de unión, por ejemplo, para la purificación de un ligando de CX3Cquina.

La composición de unión específica puede emplearse para seleccionar un banco de expresión preparado a partir de una línea celular que expresa una CX3Cquina. Muchos métodos para la selección están disponibles, por ejemplo, tinción convencional de un ligando expresado sobre la superficie o mediante inmunopurificación. La selección de expresión intracelular también puede realizarse mediante diversos procedimientos de tinción o inmunofluorescencia. Las composiciones de unión pueden emplearse para purificar por afinidad o separar células que expresan el ligando.

Los segmentos peptídicos, junto con la comparación con genes homólogos, también pueden utilizarse para producir los oligonucleótidos apropiados para seleccionar un banco. Puede emplearse el código genético para seleccionar los oligonucleótidos apropiados útiles como sondas para la selección. En combinación con las técnicas de la reacción en cadena de polimerasa (PCR), los oligonucleótidos sintéticos serán útiles para seleccionar los clones deseados a partir de un banco, incluyendo los variantes polimórficos y alélicos naturales.

Las secuencias peptídicas permiten la preparación de péptidos para generar anticuerpos que reconozcan estos segmentos, y permiten la preparación de oligonucleótidos que codifiquen dichas secuencias. La secuencia también permite la preparación sintética, por ejemplo, véase Dawson, et al. (1994), Science, 266:776-779. Puesto que parece que las CX3Cquinas son proteínas solubles, el gen normalmente poseerá una secuencia señal N-terminal que se elimina tras el procesamiento y secreción, y un sitio de ruptura putativo se encuentra entre los aminoácidos 24 (gly) y 25 (gln) en SEQ ID NO:2 ó 4, aunque puede estar desplazado ligeramente en cualquiera de las dos direcciones. El análisis de las características estructurales en comparación con las secuencias conocidas con la relación más cercada revela similitudes con otras citoquinas, en particular con la clase de proteínas conocidas como quimioquinas. Dentro de las quimioquinas hay dos subgrupos, los subgrupos CC y CXC. La familia de CX3Cquinas comparte diversas características con cada uno de estos grupos, pero su combinación de características es diferenciada y define una nueva familia de quimioquinas relacionadas.

Aunque otras características estructurales surgen de las secuencias descritas en SEQ ID NO:1 a 8, se proporciona la característica de "quimioquina sobre una varilla" a lo largo de la región tallo que posee muchos sitios que pueden proporcionar un dominio muy glicosilado. La estructura de tallo puede ser importante en la presentación de la quimioquina CX3C a otras células. De hecho, parece que la región tallo puede ser procesada para liberar la quimioquina soluble. Esto sugiere la posibilidad de sustituir el dominio de quimioquina CX3C por otras quimioquinas para realizar una presentación eficaz a las células diana apropiadas.

Además, es probable que las regiones "tallo" afecten a la solubilidad y a los aspectos farmacológicos de la proteína. Como tal, esta región será la diana del análisis para evaluar y modular características tales como la farmacocinética. El truncamiento de esa porción puede afectar la semivida, depuración y accesibilidad de los dominios de quimioquina.

VII. Variantes físicos

Esta invención también incluye proteínas o péptidos que tengan una sustancial similitud de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de una CX3Cquina. Los variantes naturales incluyen variantes individuales, polimórficos, alélicos, de raza o de especie.

La similitud de secuencia de aminoácidos, o similitud de secuencia, se determina optimizando los apareamientos de restos introduciendo, si es necesario, los huecos requeridos. Esto cambia cuando se consideran las sustituciones conservativas como apareamientos. Las sustituciones conservativas incluyen, de forma típica, sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina.

Las secuencias de aminoácidos homólogas incluyen variaciones naturales polimórficas, alélicas e interespecíficas en cada respectiva secuencia de proteína. Las proteínas o péptidos homólogos típicos tendran una similitud de 50-100% (si pueden introducirse huecos), una similitud de 75-100% (si se incluyen las sustituciones conservativas) con la secuencia de aminoácidos de la CX3Cquina. Las medidas de similitud serán al menos aproximadamente 50%, en general al menos 60%, más en general al menos 65%, habitualmente al menos 70%, más habitualmente al menos 75%, preferiblemente al menos 80%, y más preferiblemente al menos 80% y, en realizaciones particularmente preferidas, al menos 85% o más. Véase, también, Needleham, et al. (1970), J. Mol. Biol., 48:443-453; Sankoff, et al. (1983), Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison, capítulo uno, Addison-Wesley, Reading, MA; y los paquetes de programas informáticos de IntelliGenetics, Mountain View, CA; y the University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, WI.

Los ácidos nucleicos que codifican proteínas de CX3Cquina de mamífero se hibridarán, de forma típica, con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7 bajo condiciones rigurosas. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican proteínas de CX3Cquina humana se hibridarán normalmente con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:1 bajo condiciones de hibridación rigurosas. En general, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 10ºC menos que el punto de fusión térmico (Tf) de la secuencia de sonda a una fuerza iónica y pH definidos. La Tf es la temperatura (con una fuerza iónica y pH definidos) en la que 50% de la secuencia diana se hibrida con una sonda perfectamente apareada. De forma típica, las condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración de sales sea de aproximadamente 0,2 molar a pH 7 y la temperatura sea de al menos aproximadamente 50ºC. Otros factores pueden afectar significativamente a la rigurosidad de la hibridación, incluyendo, entre otros, la composición de bases y el tamaño de las hebras complementarias, la presencia de disolventes orgánicos, tal como formamida, y el grado de desapareamiento de bases. Una realización preferida incluirá ácidos nucleicos que se unen a las secuencias descritas en formamida al 50% y NaCl 200 mM a 42ºC.

Un ADN de CX3Cquina aislado puede modificarse con facilidad mediante sustituciones de nucleótidos, deleciones de nucleótidos, inserciones de nucleótidos, e inversiones cortas de tramos de nucleótidos. Estas modificaciones producen nuevas secuencias de ADN que codifican antígenos de CX3Cquina, sus derivados, o proteínas que tengan una actividad fisiológica, inmunogénica o antígenica muy similar.

Las secuencias modificadas pueden emplearse para producir antígenos mutantes o para potenciar la expresión. La expresión potenciada puede implicar la amplificación de genes, un aumento de la transcripción, un aumento de la traducción y otros mecanismos. Estos derivados de CX3Cquina mutantes incluyen mutaciones predeterminadas o específicas de sitio de la respectiva proteína o sus fragmentos. Una "CX3Cquina mutante" incluye un polipéptido que de otra forma entraría dentro de la definición de homología de la CX3Cquina humana como se indicó anteriormente, pero que tiene una secuencia de aminoácidos que se diferencia de la de la CX3Cquina que se encuentra en la naturaleza, por las deleciones, sustituciones o inserciones. En particular, una "CX3Cquina mutante específica de sitio" incluye, en general, proteínas que tienen una similitud significativa con una proteína que tienen la secuencia de SEQ ID NO:2, 4 u 8, y comparten diversas actividades biológicas, por ejemplo actividad antigénica o inmunogénica, con estas secuencias y, en realizaciones preferidas, contienen la mayor parte o toda la secuencia descrita. Esto se aplica también a los variantes polimórficos procedentes de diferentes individuos. Conceptos similares se aplican a diferentes proteínas de CX3Cquina, en particular las que aparecen en diversos animales de sanger caliente, por ejemplo, mamíferos y aves. Como se indicó anteriormente, se quiere recalcar que las descripciones pretenden, en general, incluir otras proteínas de CX3Cquina, no se limitan a las realizaciones humana o de ratón específicamente analizadas.

Aunque los sitios de mutación específica de sitio están predeterminados, no es necesario que los mutantes sean específicos de sitio. La mutagénesis de la CX3Cquina puede realizarse introduciendo inserciones o deleciones de aminoácidos. Las sustituciones, deleciones, inserciones o cualquiera de sus combinaciones pueden generarse para lograr un constructo final. Incluyen niveles de sustitución de aminoácidos de cero, uno, dos, tres, cinco, siete, diez, doce, quince, etc. Las inserciones incluyen fusiones amino- o carboxilo-terminales, por ejemplo, marcadores de epitopo. Puede realizarse una mutagénesis aleatoria en un codón diana y después los mutantes expresados pueden seleccionarse para la actividad deseada. Los métodos para realizar mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en el ADN que tienen una secuencia conocida son muy conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante las técnicas de mutagénesis de cebador M13 o de la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Véase, también, Sambrook, et al. (1989), y Ausubel, et al. (1987 y suplementos). Las mutaciones en el ADN normalmente no deberían colocar secuencias codificadoras fuera de los marcos de lectura, y preferiblemente no crearán regiones complementarias que puedan hibridarse para producir una estructura secundaria de ARNm, tales como bucles u horquillas.

La presente invención también proporciona proteínas recombinantse, por ejemplo, proteínas de fusión heterólogas utilizando segmentos de estas proteínas, de ambas CX3Cquinas, o sitios de unión al antígeno. Una proteína de fusión heteróloga es una fusión de proteínas o segmentos que normalmente no están fusionadas de esta manera en la naturaleza. Por tanto, el producto de fusión de una inmunoglobulina con un polipéptido de CX3Cquina es una molécula de proteína continua que tiene secuencia fusionadas con un enlace peptídico típico, fabricadas de forma típica como un único producto de la traducción, y que muestran propiedades derivadas de cada péptido de origen. Un concepto similar se aplica a las secuencias de ácido nucleico heterólogas.

Además, pueden fabricarse nuevos constructos combinando dominios funcionales similares procedentes de otras proteínas. Por ejemplo, los segmentos de unión a proteínas u otros segmentos pueden "intercambiarse" entre diferentes polipéptidos o fragmentos de fusión nuevos. Véase, por ejemplo, Cunningham, et al. (1989), Science, 243:1330-1336; y O'Dowd, et al. (1988), J. Biol. Chem., 263:15985-15992. Por tanto, se generarán nuevos polipéptidos quiméricos que muestran nuevas combinaciones de especificidades a partir del enlace funcional de especificidades de unión a proteínas y otros dominios funcionales.

VIII. Complejos de agente de unión:proteína de CX3Cquina

Una proteína de CX3Cquina que se una específicamente o sea específicamente inmunorreactiva con un anticuerpo generado contra un inmunógeno definido, tal como un inmunógeno que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8, se determina, de forma típica, en un inmunoensayo. El inmunoensayo utiliza un antisuero policlonal que se genera contra una proteína de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8. Este antisuero se selecciona para que tenga una baja reactividad cruzada contra otras quimioquinas, y esta reactividad cruzada se elimina mediante inmunoabsorción antes del uso en el inmunoensayo.

Para producir antisueros para su uso en un inmunoensayo, la proteína de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8 se aisla como se describió en la presente. Por ejemplo, la proteína recombinante puede producirse en una línea celular de mamífero. Una cepa endogámica de ratones, tal como balb/c, se inmuniza con la proteína de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8, utilizando un adyuvante convencional, tal como adyuvante de Freund, y un protocolo de inmunización de ratones convencional (véase Harlow y Lane, supra). Como alternativa, un péptido sintético, preferiblemente casi de longitud completa, derivado de las secuencias descritas en la presente y conjugado con una proteína portadora puede utilizarse como inmunógeno. Los sueros policlonales se recogen y se valoran contra la proteína de inmunógeno en un inmunoensayo, por ejemplo, un inmunoensayo en fase sólida con el inmunógeno inmovilizado sobre un soporte sólido. Se seleccionan antisueros policlonales con una valoración de 104 o mayor y se ensayan para determinar su reactividad cruzada contra quimioquinas C, C-C y CXC, utilizando un inmunoensayo de unión competitiva, tal como el descrito en Harlow y Lane, supra, en las páginas 570-573. Preferiblemente se emplean dos quimioquinas en esta determinación, junto con CX3Cquina humana o CX3Cquina de ratón.

Junto con una CX3Cquina, se utiliza la proteína quimiotáctica de monocitos-1 (MCP-1) y la proteína inflamatoria de macrófagos-1\alpha (Mip-1\alpha) para identificar anticuerpos que se unen específicamente a una CX3Cquina. Junto con una CX3Cquina humana, se utiliza la proteína quimiotáctica de monocitos-2 (MCP-2) y Mip-1\alpha para identificar anticuerpos que se unen específicamente a una CX3Cquina. Estas quimioquinas pueden producirse como proteínas recombinantes y aislarse utilizando técnicas de química de proteínas y de biología molecular convencionales, como se describe en la presente.

Pueden emplearse inmunoensayos en el formato de unión competitiva para la determinación de la reactividad cruzada. Por ejemplo, una proteína de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8 puede inmovilizarse sobre un soporte sólido. Las proteínas añadidas al ensayo compiten con la unión del antisuero al antígeno inmovilizado. La capacidad de las anteriores proteínas para competir con la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada se compara con la proteína de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8. El porcentaje de reactividad cruzada para las anteriores proteínas se calcula, utilizando cálculos convencionales. Los antisueros con menos de 10% de reactividad cruzada con cada una de las proteínas listadas anteriormente se seleccionan y se reúnen. Los anticuerpos de reactividad cruzada entonces se retiran del antisuero reunido mediante inmunoabsorción con las proteínas listadas anteriormente.

El antisuero reunido e inmunoabsorbido entonces se utiliza en un inmunoensayo de unión competitiva, como se describió anteriormente, para comparar una segunda proteína con la proteína de inmunógeno (por ejemplo, el motivo de quimioquina de CX3Cquina de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8). Para realizar esta comparación, las dos proteínas se ensayan cada una con una amplia variedad de concentraciones y se determina la cantidad de cada proteína requerida para inhibir 50% de la unión del antisuero a la proteína inmovilizada. Si la cantidad requerida de la segunda proteína es menor que el doble de la cantidad requerida de la proteína de SEQ ID NO:2, entonces se dice que la segunda proteína se une específicamente con un anticuerpo generado contra el inmunógeno.

Se entiende que las proteínas de CX3Cquina son una familia de proteínas homólogas que comprenden dos o más genes. Para un producto génico dado, tal como la proteína de CX3Cquina humana, la expresión se refiere no sólo a las secuencias de aminoácidos descritas en la presente, sino también a otras proteínas que son variantes polimórficas, alélicas, no alélicas o de especie. También se entiende que la expresión "CX3Cquina humana" o "CX3Cquina de ratón" incluidas mutaciones no naturales introducidas mediante una mutación deliberada utilizando la tecnología recombinante convencional, tal como mutación de sitio único, o el corte de secciones cortas del ADN que codifica las proteínas de CX3Cquina, o la sustitución por nuevos aminoácidos, o la adición de nuevos aminoácidos. Estas pequeñas alteraciones deben mantener sustancialmente la inmunoidentidad de la molécula original y/o su actividad biológica. Por tanto, estas alteraciones incluyen proteínas que son específicamente inmunorreactivas con una proteína de CX3Cquina concreta que aparece en la naturaleza, por ejemplo, la proteína de CX3Cquina humana que aparece en SEQ ID NO:2 ó 4. Las propiedades biológicas de las proteínas alteradas pueden determinarse expresando la proteína en una línea celular apropiada y midiendo, por ejemplo, un efecto quimiotáctico. Las modificaciones particulares de la proteína que se consideran pequeñas incluyen la sustitución conservativa de aminoácidos con propiedades químicas similares, como se describió anteriormente para la familia de CX3Cquinas en su conjunto. Mediante la alineación óptima de una proteína con la proteína de SEQ ID NO:2, 4 u 8, y empleando los inmunoensayos convencionales descritos en la presente para determinar la inmunoidentidad, o mediante el uso de ensayos de quimiotaxis de linfocitos, se puede determinar la composición de las proteínas de la invención.

IX. Variantes funcionales

El bloqueo de la respuesta fisiológica a las CX3Cquinas puede ser el resultado de la inhibición de la unión de la proteína a su receptor, por ejemplo, mediante una inhibición competitiva. Por tanto, los ensayos in vitro de la presente invención a menudo utilizarán proteína aislada, membradas de células que expresan una CX3Cquina asociada a membrana recombinante, fragmentes solubles que comprenden los segmentos de unión al receptor de estas proteínas, o fragmentos unidos sustratos en fase sólida. Estos ensayos también permiten la determinación diagnóstica de los efectos de las mutaciones y modificaciones en el segmento de unión, o las mutaciones y modificaciones en la proteína, por ejemplo, análogos de la proteína. Esta invención también comtempla el uso de ensayos de selección de fármacos competitivos, por ejemplo, en los que anticuerpos neutralizantes contra el antígeno o fragmentos del receptor compiten con un compuesto de ensayo por la unión a la proteína. De esta manera, los anticuerpos pueden emplearse para detectar la presencia de un polipéptido que comparta uno o más sitios de unión antigénicos de la proteína, y también pueden utilizarse para ocupar sitios de unión sobre la proteína que, de otra forma, interaccionarían con un
receptor.

Los "derivados" de antígenos de CX3Cquina incluyen mutantes de secuencia de aminoácidos, variantes de glicosilación, y conjugados covalentes o agregados con otros restos químicos. Los derivados covalentes pueden prepararse mediante el enlace de funcionalidades a grupos que se encuentra en las cadenas laterales de los aminoácidos de CX3Cquina o en los extremos N- o C-terminales, por medios que son muy conocidos en la técnica. Estos derivados pueden incluir, sin limitación, amidas o ésteres alifáticos del carboxilo terminal o de restos que contienen cadenas laterales de carboxilo, derivados de O-acilo de restos que contienen grupos hidroxilo, y derivados de N-acilo del aminoácido amino-terminal o de restos que contienen grupos amino, por ejemplo, lisina o arginina. Los grupos acilo se seleccionan del grupo de restos alquilo, incluyendo alquilo normal C3 a C18, formando, con ello, especies de alcanoílo aroílo. Véase, por ejemplo, Coligan, et al. (eds.) (1995 y suplementos periódicos), Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, Nueva York, NY. La unión covalente a proteínas portadoras puede ser importante cuando los restos inmunogénicos son haptenos.

En particular, se incluyen las alteraciones en la glicosilación, por ejemplo, fabricadas modificando los patrones de glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento, o en posteriores etapas del procesamiento. Los medios particulamente preferidos para lograr esto son mediante la exposición del polipéptido a enzimas glicosilantes derivadas de células que normalmente proporcionan este procesamiento, por ejemplo, enzimas de glicosilación de mamífero. También se contemplan enzimas de desglicosilación. También se incluyen las versiones con la misma secuencia de aminoácidos primaria que tengan otras pequeñas modificaciones, incluyendo restos aminoácidos fosforilados, por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina, u otros restos, incluyendo grupos ribosilo o reactivos de entrecruzamiento.

Un grupo principal de derivados son los conjugados covalentes de la CX3Cquina o sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos. Estos derivados pueden sintetizarse en cultivo recombinante, tal como fusiones N- o C-terminales, o mediante el uso de agentes conocidos en la técnica por su utilidad para entrecruzar proteínas a través de sus grupos laterales reactivos. Los sitios de derivatización de proteínas preferidos con agentes de entrecruzamiento son los grupos amino libres, los restos carbohidrato, y los restos cisteína.

También se proporcionan polipéptidos de fusión entre las CX3Cquinas y otras proteínas homólogas o heterólogas. Muchos factores del crecimiento y citoquinas son entidades homodiméricas, y un constructo repetido puede tener diversas ventajas, incluyendo una menor susceptibilidad frente a la degradación proteolítica. Además, muchos receptores requieren la dimerización para transducir una señal, y pueden resultar deseables diversas proteínas diméricas o repeticiones de dominios. Los polipéptidos heterólogos pueden ser fusiones entre diferentes marcadores de superficie, dando como resultado, por ejemplo, una proteína híbrida que muestra especificidad de unión al receptor. De forma similar, pueden construirse fusiones heterólogas que muestran una combinación de propiedades o actividades de las proteínas derivadas. Los ejemplos típicos son fusiones de un polipéptido indicador, por ejemplo, luciferasa, con un segmento o dominio de una proteína, por ejemplo, un segmento de unión al receptor, de forma que la presencia o localización de la proteína fusionada puede determinarse con facilidad. Véase, por ejemplo, Dull, et al., patente de EEUU nº 4.859.609. Otros compañeros de fusión génica incluyen \beta-galactosidasa bacteriana, trpE, proteína A, \beta-lactamasa, alfa-amilasa, alcohol deshidrogenasa, y factor de apareamiento alfa de levaduras. Véase, por ejemplo, Dawson, et al. (1994), Science, 266:776-779; y Godowski, et al. (1988), Science, 241:812-816. En particular, serán útiles las proteínas de fusión con porciones de los genes relacionados. Se contemplan conceptos similares de fusiones con sitios de unión al antígeno.

Estos polipéptidos también pueden tener restos aminoácidos que se han modificado químicamente mediante fosforilación, sulfonación, biotinilación, o la adición o eliminación de otros restos, en particular aquellos que tienen formas moleculares similares a los grupos fosfato. En algunas realizaciones, las modificaciones serán reactivos de marcaje útiles, o pueden actuar como dianas de purificación, por ejemplo, ligandos de afinidad.

Esta invención también contempla el uso de derivados de CX3Cquinas distintos de las variaciones en la secuencia de aminoácidos o glicosilación. Estos derivados pueden implicar la asociación covalente o agregada con restos químicos. Estos derivados incluyen: (1) sales, (2) modificaciones covalentes de cadenas laterales y restos terminales, y (3) complejos de adsorción, por ejemplo, con membranas celulares. Estos derivados covalentes o agregados son útiles como inmunógenos, como reactivos en inmunoensayos, o en métodos de purificación, tal como purificación por afinidad de ligandos u otros ligandos de unión. Por ejemplo, un antígeno de CX3Cquina puede inmovilizarse mediante enlace covalente a un soporte sólido, tal como SEPHAROSE activada con bromuro de cianógeno, mediante métodos muy conocidos en la técnica, o puede adsorberse sobre superficies de poliolefina, con o sin entrecruzamiento con glutaraldehído, para su uso en el ensayo o purificación de anticuerpos anti-CX3Cquina o su receptor. Las CX3Cquinas también pueden marcarse con un grupo detectable, por ejemplo, radioyodarse mediante un procedimiento de cloramina T, unirse covalentemente a quelatos de tierras raras, o conjugarse con otro resto fluorescente para su uso en ensayos de diagnóstico. La purificación de las CX3Cquinas puede realizarse mediante anticuerpos o receptores inmovilizados.

Los genes de CX3Cquina aislados permiten la transformación de células que carecen de la expresión de las correspondientes CX3Cquinas, por ejemplo, células o tipos de especies que carecen de las correspondientes proteínas y muestran una actividad de fondo negativa. La expresión de los genes transformados permite el aislamiento de líneas celulares antigénicamente puras, con variantes definidos o de especie única. Esta estrategia permite una detección más sensible y la discriminación de los efectos fisiológicos de las proteínas del receptor de CX3Cquina. Pueden aislarse y utilizarse fragmentos subcelulares, por ejemplo, citoplastos o fragmentos de membranas.

X. Usos

La presente invención proporciona reactivos que encontrarán uso en aplicaciones de diagnóstico, como se ha descrito en la presente, por ejemplo, en la descripción general de la anomalías del desarrollo, o a continuación en la descripción de los kits de diagnóstico.

Pueden emplearse nucleótidos de CX3Cquina, por ejemplo ADN o ARN de CX3Cquina humana o de ratón, como componente en un ensayo forense. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos proporcionadas pueden marcarse utilizando, por ejemplo, ^{32}P o biotina, y emplearse análisis de transferencia de polimorfismo de fragmentos de restricción convencionales de sondas, para proporcionar un carácter mensurable para ayudar a distinguir entre individuos. Estas sondas pueden utilizarse en técnicas forenses muy conocidas, tales como la huella genética. Además, pueden emplearse sondas de nucleótidos fabricadas a partir de secuencias de CX3Cquinas en ensayos in situ para detectar anomalías cromosómicas. Por ejemplo, pueden detectarse redisposiciones en el cromosoma de ratón que codifica un gen de CX3Cquina mediante técnicas in situ muy conocidas, empleando sondas de CX3Cquina probes junto con otros marcadores cromosómicos conocidos.

Pueden utilizarse anticuerpos y otros agentes de unión dirigidos contra ácidos nucleicos o proteínas de CX3Cquina para purificar la correspondiente molécula de CX3Cquina. Como se describe en los ejemplos a continuación, la purificación con anticuerpos de componentes de CX3Cquina es posible y practicable. Los anticuerpos y otros agentes de unión también pueden emplearse de una manera similar al diagnóstico para determinar si están presentes componentes de CX3Cquina en una muestra de tejido o población de células utilizando técnicas muy conocidas descritas en la presente. La capacidad de unir un agente de unión a una CX3Cquina proporciona un medio para diagnosticar trastornos asociados con la regulación defectuosa de CX3Cquinas. Los anticuerpos y otros agentes de unión a CX3Cquinas también pueden ser útiles como marcadores histológicos. Como se describe en los ejemplos a continuación, la expresión de CX3Cquinas está limitada a tipos de tejidos específicos. Si se dirige una una sonda, tal como un anticuerpo o un ácido nucleico, hacia una CX3Cquina, es posible utilizar la sonda para distinguir los tipos de tejidos y de células in situ o in vitro.

Esta invención también proporciona reactivos con significativo valor terapéutico. Las CX3Cquinas (que aparecen en la naturaleza o recombinantes), sus fragmentos, y los anticuerpos contra éstos, junto con compuestos identificados como que tienen actividad de unión a una CX3Cquina, son útiles en el tratamiento de trastornos asociados con una fisiología o desarrollo anómalos, incluyendo la proliferación anómala, por ejemplo, trastornos cancerosos, o trastornos degenerativos. La atrofia, degeneración, regeneración y proliferación anómalas pueden modularse mediante el tratamiento terapéutico apropiado utilizando las composiciones proporcionadas en la presente. Por ejemplo, una enfermedad o trastorno asociado con la expresión anómala o la señalización anómala por una CX3Cquina es una diana para un agonista o antagonista de la proteína. Es probable que las proteínas desempeñen un papel en la regulación o desarrollo de células neuronales o hematopoyéticas, por ejemplo, células linfoides, que afectan a las respuestas inmunológicas.

Son conocidos otros trastornos del desarrollo anómalo en tipos celulares que se ha demostrado que poseen ARNm de CX3Cquina mediante un análisis de la transferencia Northern. Véase Berkow (ed.), The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, NJ; y Thorn, et al. Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, NY. La anomalías del desarrollo o funcionales, por ejemplo, del sistema neuronal o inmunológico, provocan significativos trastornos y anomalías médicas que pueden ser susceptibles de prevención o tratamiento utilizando las composiciones que se proporcionan en la presente.

Ciertas quimioquinas también se han implicado en mecanismos de replicación víricos. Véase, por ejemplo, Cohen (1996), Science, 272:809-810; Feng, et al. (1996), Science, 272:872-877; y Cocchi, et al. (1995), Science, 270:1811-1816. Las quimioquinas CX3C pueden ser útiles en un contexto similar. Como alternativa, la estructura tallo puede ser muy importante en la presentación del dominio del ligando, y otras quimioquinas pueden ser sustituidas ventajosamente por el dominio de quimioquina en esta molécula. La modificación de la estructura "tallo" puede afectar a las propiedades farmacológicas de la CX3Cquina, incluyendo la semivida y actividad biológica.

Puede purificarse una CX3Cquina recombinante o anticuerpos de CX3Cquina y después administrarse a un paciente, por ejemplo, en forma estéril. Estos reactivos pueden combinarse para su uso terapéutico con otros ingredientes activos o inertes, por ejemplo, en vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables convencionales, por ejemplo, adyuvantes inmunogénicos, junto con estabilizantes y excipientes fisiológicamente inocuos. Estas combinaciones pueden esterilizarse mediante filtración y colocarse en formas de dosificación, tal como mediante liofilización en viales de dosificación, o conservarse en preparaciones acuosas estabilizadas. Esta invención también contempla el uso de anticuerpos o sus fragmentos de unión, incluyendo las formas que no se unen al complemento.

La selección de fármacos utilizando anticuerpos o receptores, o sus fragmentos, puede identificar compuestos que tengan afinidad de unión a CX3Cquinas, incluyendo el aislamiento de componentes asociados. Entonces pueden emplearse posteriores ensayos biológicos para determinar si el compuesto tiene actividad estimuladora intrínseca y, por tanto, es un bloqueante o antagonista porque bloquea la actividad de la proteína. De forma similar, un compuesto que tenga actividad estimuladora intrínseca puede activar el receptor y, por tanto, es un agonista porque estimula la actividad de una CX3Cquina. Esta invención también contempla el uso terapéutico de anticuerpos contra CX3Cquinas como antagonistas. Esta estrategia debería ser particularmente útil con otros variantes de especie de CX3Cquinas.

Las cantidades de reactivos necesarias para una terapia eficaz dependerán de muchos factores diferentes, incluyendo el medio de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del paciente, y otros medicamentos administrados. Por tanto, las dosificaciones de tratamiento deben valorarse para optimizar la seguridad y la eficacia. De forma típica, las dosificaciones utilizadas in vitro pueden proporcionar una guía útil para la cantidades útiles para la administración in situ de estos reactivos. El ensayo con animales de las dosis eficaces para el tratamiento de trastornos concretos proporcionará más indicaciones predictivas de la dosificación en seres humanos. Diversas consideraciones se describen, por ejemplo, en Gilman, et al. (eds.) (1990), Goodman y Gilman's: The Pharmacoloaical Bases of Therapeutics (8ª ed.), Pergamon Press; y (1990), Remington's Pharmaceutical Sciences (17ª ed.), Mack Publishing Co., Easton, PA. Los métodos para la administración se analizan en estos textos y a continuación, por ejemplo para la administración oral, intravenosa, intraperitoneal, o intramuscular, la difusión transdérmica y otros. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluirán agua, disolución salina, tampones y otros compuestos descritos, por ejemplo, en the Merck Index, Merck & Co., Rahway, NJ. Se espera que los intervalos de dosificación estarán normalmente en unas cantidades menores que concentraciones 1 mM, de forma típica menores que concentraciones aproximadamente 10 \muM, normalmente menores que aproximadamente 100 nM, preferiblemente menores que aproximadamente 10 pM (picomolar), y lo más preferible menores que aproximadamente 1 fM (fentomolar), con un vehículo apropiado. A menudo se utilizarán formulaciones de liberación lenta, o un aparato de liberación lenta, para la administración continua.

Las CX3Cquinas, sus fragmentos, y los anticuerpos contra éstas o sus fragmentos, antagonistas y agonistas, pueden administrarse directamente al hospedante que se va a tratar o, dependiendo del tamaño de los compuestos, puede resultar deseable conjugarlos con proteínas vehículo, tal como ovoalbúmina o albúmina de suero, antes de su administración. Las formulaciones terapéuticas pueden administrarse en muchas formulaciones de dosificación convencionales. Cuando sea posible que el ingrediente activo pueda administrarse solo, resulta preferible presentarlo como una formulación farmacéutica. Las formulaciones comprenden, de forma típica, al menos un ingrediente activo, como se definió anteriormente, junto con uno o más vehículos aceptables para éste. Cada vehículo debe ser farmacéutica y fisiológicamente aceptable, en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes y no perjudicial para el paciente. Las formulaciones incluyen las que son adecuadas para la administración oral, rectal, nasal, o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Las formulaciones pueden presentarse de forma conveniente en formas de dosificación unitarias y pueden prepararse mediante cualquier método conocido en la técnica farmacéutica. Véase, por ejemplo, Gilman, et al. (eds.) (1990), Goodman y Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8ª ed.), Pergamon Press; y (1990), Remington's Pharmaceutical Sciences (17ª ed.), Mack Publishing Co., Easton, PA; Avis, et al. (eds.) (1993), Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Dekker, NY; y Lieberman, et al. (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, NY. La terapia de esta invención puede combinarse o utilizarse en asociación con otros agentes terapéuticos.

Tanto las formas que aparecen en la naturaleza como las formas recombinantes de las CX3Cquinas de esta invención son particularmente útiles en kits y métodos de ensayo que son capaces de seleccionar compuestos para su actividad de unión a las proteínas. Se han desarrollados varios métodos de ensayos automáticos en los últimos años para permitir la selección de decenas de miles de compuestos en un corto periodo de tiempo. Véase, por ejemplo, Fodor, et al. (1991), Science, 251:767-773, y otras descripciones de bancos de diversidad química, que describen medios para ensayar la afinidad de unión mediante una pluralidad de compuestos. El desarrollo de ensayos adecuados pueden verse facilitado, en gran medida, por la disponibilidad de grandes cantidades de CX3Cquina soluble purificada, como se proporciona en esta invención.

Por ejemplo, normalmente pueden descubrirse antagonistas tras haber definido estructuralmente la proteína. El ensayo de potenciales análogos de proteínas ahora es posible tras el desarrollo de métodos de ensayos altamente automáticos que emplean un receptor purificado. En particular, se descubrirán nuevos agonistas y antagonistas utilizando las técnicas de selección descritas en la presente. De particular importancia resultan los compuestos que se ha descubierto que tienen una afinidad de unión combinada por múltiples receptores de CX3Cquina, por ejemplo, compuestos que pueden actuar como antagonistas de variantes de especie de una CX3Cquina.

Esta invención es particularmente útil para seleccionar compuestos empleando una proteína recombinante en una diversidad de técnicas de selección de fármacos. La ventaja de utilizar una proteína recombinante en la selección de ligandos específicos incluye: (a) una mejor fuente renovable de la CX3Cquina a partir de una fuente específica; (b) un número potencialmente mayor de ligandos por célula, que produce una mejor proporción de señal frente al ruido en ensayos; y (c) una especificidad de variante de especie (que, en teoría, proporciona una mayor especificidad biológica y de enfermedad).

Un método para la selección de fármacos utiliza células hospedantes eucariotas o procariotas que se transforman de modo estable con moléculas de ADN recombinante que expresan un receptor de CX3Cquina. Pueden aislarse células que expresan un receptor en aislamiento de los demás. Estas células, en forma viable o fijada, pueden utilizarse para ensayos de unión a ligando/receptor convencionales. Véase, también, Parce, et al. (1989), Science, 246:243-247; y Owicki, et al. (1990), Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 87:4007-4011, que describen métodos sensibles para detectar respuestas celulares. Los ensayos competitivos son particularmente útiles, en los que las células (fuente de la CX3Cquina) se ponen en contacto y se incuban con un anticuerpo o receptor marcado que tenga una afinidad de unión conocida por el ligando, tal como un ^{125}I-anticuerpo, y una muestra de ensayo cuya afinidad de unión a la composición de unión se va a medir. Las composiciones de unión marcadas unidas y libres entonces se separan para evaluar el grado de unión al ligando. La cantidad de compuesto de ensayo unido es inversamente proporcional a la cantidad de unión al receptor marcado de la fuente conocida. Puede utilizarse cualquiera de una serie de técnicas numerosas para separar el ligando unido del ligando libro para evaluar el grado de unión al ligado. Esta etapa de separación puede implicar, de forma típica, un procedimiento tal como la adhesión a filtros seguido de lavado, la adhesión a plástico seguido de lavado, o la centrifugación de las membranas celulares. También se pueden emplear células viables para seleccionar los efectos de fármacos sobre funciones mediadas por CX3Cquinas, por ejemplo, niveles de segundo mensajero, es decir, Ca^{++}; proliferación celular; cambios en el conjunto de inositol fosfato; y otros. Algunos métodos de detección permiten la eliminación de una etapa de separación, por ejemplo, un sistema de detección sensible a la proximidad. Los tintes sensibles al calcio serán útiles para detectar los niveles de Ca^{++}, con un fluorímetro o un aparato de selección de células de fluorescencia.

Otro método utiliza membranas de células hospedantes eucariotas o procariotas transformadas como fuente de una CX3Cquina. Estas células se transforman de forma estable con vectores de ADN que dirigen la expresión de una CX3Cquina, por ejemplo, una forma modificada unida a la membrana. Esencialmente, las membranas se preparan a partir de las células y se emplean en un ensayo de unión de receptor/ligando, tal como el ensayo competitivo indicado anteriormente.

Otra estrategia es utilizar una CX3Cquina solubilizada y no purificada o solubilizada y purificada procedente de células hospedantes eucariotas o procariotas transformadas. Esto permite un ensayo de unión "molecular" con las ventajas de una mayor especificidad, la capacidad de que puede ser automático, y una alta transferencia en ensayos de fármacos.

Otra técnica para la selección de fármacos implica una estrategia que proporciona una selección de alta transferencia de compuestos que tengan una afinidad de unión adecuada con un anticuerpo de CX3Cquina y se describe en detalle en Geysen, solicitud de patente europea 84/03564, publicada el 13 de septiembre, 1984. En primer lugar se sintetiza un gran número de diferentes compuestos de ensayo de péptidos pequeños sobre un sustrato sólido, por ejemplo, varillas de plástico u otra superficie adecuada, véase Fodor, et al., supra. Después todas las varillas se hacen reaccionar con el anticuerpo de CX3Cquina solubilizado y no purificado o solubilizado y purificado, y después se lavan. La siguiente etapa implica detectar el anticuerpo de CX3Cquina unido.

Un diseño de fármacos lógico también puede basarse en estudios estructurales de las formas moleculares de la CX3Cquina y otros efectores o análogos. Véase, por ejemplo, Methods in Enzymology, volúmenes 202 y 203. Los efectores pueden ser otras proteínas que median en otras funciones en respuesta a la unión al ligando, u otras proteínas que normalmente interaccionan con el receptor. Un medio para determinar qué sitios interaccionan con otras proteínas específicas es la determinación de la estructura física, por ejemplo, mediante técnicas de cristalografía de rayos X o de RMN bidimensional. Éstas proporcionan una guía sobre cuáles son los restos aminoácidos que forman las regiones de contacto moleculares. Para una descripción detallada de la determinación estructural de proteínas, véase, por ejemplo, Blundell y Johnson (1976), Protein Crystallography, Academic Press, NY.

Una CX3Cquina purificada puede revestirse directamente sobre placas para su uso en las técnicas de selección de fármacos mencionadas anteriormente. Sin embargo, pueden emplearse anticuerpos no neutralizantes contra estos ligandos como anticuerpos de captura para inmovilizar el respectivo ligando sobre la fase sólida.

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XI. Kits

Esta invención también contempla el uso de proteínas de CX3Cquina, sus fragmentos, péptidos y sus productos de fusión en una diversidad de métodos y kits de diagnóstico para detectar la presencia de una CX3Cquina o un receptor de CX3Cquina. De forma típica, el kit tendrá un compartimento que contenga un péptido de CX3Cquina definido o un segmento génico, o un reactivo que reconozca uno u otro, por ejemplo, fragmentos del receptor o anticuerpos.

Un kit para determinar la afinidad de unión de un compuesto de ensayo por una CX3Cquina comprenderá, de forma típica, un compuesto de ensayo; un compuesto marcado, por ejemplo, un receptor o anticuerpo que tenga una afinidad de unión conocida con la CX3Cquina; una fuente de CX3Cquina (que aparece en la naturaleza o recombinante); y un medio para separar el compuesto marcado unido del libre, tal como una fase sólida para inmovilizar la CX3Cquina. Después de seleccionar los compuestos, los que tengan una afinidad de unión adecuada con la CX3Cquina pueden evaluarse en ensayos biológicos adecuados, como los que son muy conocidos en la técnica, para determinar si actúan como agonistas o antagonistas del receptor. La disponibilidad de polipéptidos de CX3Cquina recombinantes también proporciona patrones bien definidos para calibrar estos ensayos.

Un kit preferido para determinar la concentración, por ejemplo de una CX3Cquina en una muestra comprenderá, de forma típica, un compuesto marcado, por ejemplo, un receptor o anticuerpo, que tenga una afinidad de unión conocida con la CX3Cquina, una fuente de CX3Cquina (que aparecen en la naturaleza o recombinante), y un medio para separar el compuesto marcado unido del libre, por ejemplo, una fase sólida para inmovilizar la CX3Cquina. Normalmente se proporcionan compartimentos que contienen reactivos e instrucciones.

Los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de unión al antígeno, específicos para la CX3Cquina o los fragmentos de ligando son útiles en aplicaciones de diagnóstico para detectar la presencia de niveles elevados de la CX3Cquina y/o sus fragmentos. Esto puede permitir el diagnóstico de las cantidades de las formas procesadas de modo diferente de la CX3Cquina, por ejemplo, la estructura de tallo sucesivamente degradada. Estos ensayos de diagnóstico pueden emplear lisados, células vivas, células fijadas, inmunofluorescencia, cultivos celulares, fluidos corporales, y también pueden implicar la detección de antígenos relacionados con el ligando en el suero, o similares. Los ensayos de diagnóstico pueden ser homogéneos (con una etapa de separación entre el reactivo libre y el complejo de antígeno-CX3Cquina) o heterogéneos (con una etapa de separación). Existen diversos ensayos comerciales, tales como el radioinmunoensayo (RIA), el ensayo inmunoabsorbente de enzimas ligados (ELISA), el inmunoensayo enzimático (EIA), la técnica de inmunoensayo enzimático multiplicado (EMIT), el inmunoensayo fluorescente de sustrato marcado (SLFIA), y similares. Por ejemplo, pueden emplearse anticuerpos no marcados empleando un segundo anticuerpo que está marcado y que reconoce el anticuerpo contra una CX3Cquina o contra un fragmento particular de ésta. Ensayos similares también se han analizado a fondo en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, NY; Chan (ed.) (1987), Immunoassay: A Practical Guide, Academic Press, Orlando, FL; Price y Newman (eds.) (1991), Principles and Practice of Immunoassays, Stockton Press, NY; y Ngo (ed.) (1988), Non-isotopic Immunoassays, Plenum Press, NY.

Los anticuerpos antiidiotípicos tienen un uso similar a la presencia de diagnóstico de anticuerpos contra una CX3Cquina, puesto que pueden ser un diagnóstico de diversos estados anómalos. Por ejemplo, la sobreproducción de CX3Cquinas puede dar como resultado la producción de diversas reacciones inmunológicas u otras reacciones médicas que pueden ser el diagnóstico de estados fisiológicos anómalos, por ejemplo, en el crecimiento, activación o diferenciación celular.

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Con frecuencia, los reactivos para ensayos de diagnóstico se suministran en kits, para optimizar la sensibilidad del ensayo. Para la presente invención, dependiendo de la naturaleza del ensayo, el protocolo y el marcador, se proporciona el anticuerpo o receptor marcado o no marcado, o la CX3Cquina marcada. Ésto se realiza normalmente junto con otros aditivos, tales como tampones, estabilizantes, materiales necesarios para la producción de señales, tales como sustratos para enzimas y similares. Preferiblemente, el kit también contendrá instrucciones para su uso apropiado y la eliminación de los contenidos después del uso. De forma típica, el kit tiene compartimentos para cada reactivo útil. De forma deseable, los reactivos se proporcionan como un polvo liofilizado seco, pudiéndose reconstituir los reactivos en un medio acuoso que proporciona las concentraciones apropiadas de reactivo para realizar el ensayo.

Muchos de los constituyentes mencionados anteriormente para la selección de fármacos y los ensayos de diagnóstico pueden utilizarse sin modificaciones, o pueden modificarse de una diversidad de formas. Por ejemplo, el marcaje puede conseguirse mediante la unión covalente o no covalente de un resto que proporcione, de forma directa o indirecta, una señal detectable. En cualquiera de estos ensayos, la proteína, el compuesto de ensayo, la CX3Cquina, o los anticuerpos contra ésta pueden marcarse directa o indirectamente. Las posibilidades para un marcaje directo incluyen los grupos de marcadores: radiomarcadores, tales como ^{125}I, enzimas (patente de EEUU nº 3.645.090), tales como peroxidasa y fosfatasa alcalina, y marcadores fluorescentes (patente de EEUU nº 3.940.475) capaces de controlar el cambio en la intensidad de fluorescencia, el desplazamiento de la longitud de onda, o la polarización de la fluorescencia. Las posibilidades para el marcaje indirecto incluyen la biotinilación de un constituyente, seguido de la unión a avidina acoplada con uno de los anteriores grupos de marcadores.

También existe numerosos métodos para separar el ligando unido del libre o, como alternativa, el compuesto de ensayo unido del libre. La CX3Cquina puede inmovilizarse sobre diversas matrices, seguido de lavado. Las matrices adecuadas incluyen plásticos, tales como una placa de ELISA, filtros, y esferas. Los métodos para inmovilizar la CX3Cquina sobre una matriz incluyen, sin limitación, la adhesión directa a plástico, el uso de un anticuerpo de captura, el acoplamiento químico, y la biotina-avidina. La última etapa en esta estrategia implica la precipitación del complejo de ligando/receptor o de ligando/anticuerpo mediante cualquiera de una serie de métodos, que incluyen los que utilizan, por ejemplo, un disolvente orgánico, tal como polietilenglicol, o una sal, tal como sulfato de amonio. Otras técnicas de separación adecuadas incluyen, sin limitación, el método de partículas magnetizables de anticuerpos de fluoresceína descrito en Rattle, et al. (1984), Clin. Chem., 30:1457-1461, y la separación de partículas magnéticas de anticuerpos dobles descrita en la patente de EEUU nº 4.659.678.

Los métodos para unir proteínas o sus fragmentos a los diversos marcadores se han descrito a fondo en la bibliografía y no requieren un análisis detallado en la presente. Muchas de las técnicas implican el uso de grupos carboxilo activados, mediante el uso de carbodiimida o ésteres activos para formar enlaces peptídicos, la formación de tioéteres mediante una reacción de un grupo mercapto con un halógeno activado, tal como cloroacetilo, o una olefina activada, tal como maleimida, para el enlace, o similares. Las proteínas de fusión también se pueden utilizar en estas aplicaciones.

Otro aspecto de diagnóstico de esta invención implica el uso de secuencias oligonucleotídicas o polinucleotídicas tomadas de la secuencia de una CX3Cquina. Estas secuencias pueden utilizarse como sondas para detectar los niveles del mensajero de CX3Cquina en muestras procedentes de fuentes naturales, o de pacientes sospechosos de sufrir un trastorno anómalo, por ejemplo, cáncer o un problema del desarrollo. La preparación de secuencias de nucleótidos de ARN y ADN, el marcaje de las secuencias, y el tamaño preferido de las secuencias ha recibido una amplia descripción y análisis en la bibliografía. Normalmente, una sonda oligonucleotídica debe tener al menos 14 nucleótidos, habitualmente al menos aproximadamente 18 nucleótidos, y las sondas polinucleotídicas pueden tener hasta varias kilobases. Pueden emplearse diversos marcadores, de forma más habitual radionúclidos, en particular ^{32}P. Sin embargo también pueden emplearse otras técnicas, tales como la utilización de nucleótidos modificados con biotina para su introducción en un polinucleótido. La biotina entonces actúa como el sitio para la unión a avidina o a anticuerpos, que pueden marcarse con una amplia variedad de marcadores, tales como radionúclidos, fluoróforos, enzimas o similares. Como alternativa, pueden emplearse anticuerpos que reconozcan dúplex específicos, incluyen dúplex de ADN, dúplex de ARN, dúplex híbridos de ADN-ARN, o dúplex de ADN-proteína. Los anticuerpos, a su vez, pueden estar marcados y el ensayo se realiza cuando el dúplex está unido a una superficie, de forma que tras la formación del dúplex sobre la superficie puede detectarse la presencia del anticuerpo unido al dúplex. El uso de sondas contra el nuevo ARN antisentido puede llevarse a cabo utilizando muchas técnicas convencionales, tales como la hibridación de ácidos nucleicos, la sección de más y menos, la utilización de sondas de recombinación, la traducción liberada de híbridos (HRT), y la traducción detenida de híbridos (HART). Esto también incluye las técnicas de amplificación, tales como la reacción en cadena de polimerasa (PCR).

Los kits de diagnóstico que también ensayan la presencia cualitativa o cuantitativa de otros marcadores también se contemplan. El diagnóstico o la prognosis puede depender de la combinación de múltiples indicaciones utilizadas como marcadores. Por tanto, los kits pueden ensayar combinaciones de marcadores. Véase, por ejemplo, Viallet, et al. (1989), Progress in Growth Factor Res., 1:89-97.

XII. Aislamiento de receptores

Después de aislar un compañero de unión de una interacción específica existen métodos para aislar el otro compañero. Véase, Gearing, et al. (1989), EMBO J., 8:3667-3676. Por ejemplo, pueden determinarse medios para marcar una CX3Cquina sin interferir en la unión con su receptor. Por ejemplo, un marcador de afinidad o un marcador de epitopo pueden condensarse con el extremo amino- o carboxilo-terminal del ligando. Un banco de expresión puede seleccionarse para la unión específica de la CX3Cquina, por ejemplo, mediante clasificación de células u otra selección para detectar subpoblaciones que expresen dicho componente de unión. Véase, por ejemplo, Ho, et al. (1993), Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 90:11267-11271. Como alternativa, puede utilizarse un método de inmunopurificación. Véase, por ejemplo, Seed y Aruffo (1987), Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 84:3365-3369. También puede aplicarse un sistema de selección de dos híbridos formando los constructos apropiados con las secuencias BAS-1 disponibles. Véase, por ejemplo, Fields y Song (1989), Nature, 340:245-246.

Pueden aplicarse técnicas de entrecruzamiento de proteínas con un marcador para aislar compañeros de unión de una CX3Cquina. Esto permite la identificación de proteínas que interaccionan específicamente con una CX3Cquina, por ejemplo, de una manera similar a una interacción ligando-receptor. De forma típica, la familia de quimioquinas se une a los receptores de la familia de receptores 7-transmembrana, y es probable que el receptor para la CX3Cquina muestre una estructura similar. Por tanto, resulta probable que el receptor sea encontrado mediante la expresión en un sistema que sea capaz de expresar dicha proteína de membrana en una forma capaz de mostrar una capacidad de unión al ligando.

El amplio alcance de esta invención se entenderá mejor haciendo referencia a los siguientes ejemplos, que no pretenden limitar la invención a sus realizaciones específicas.

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Ejemplos I. Métodos generales

Muchos de métodos convencionales a continuación se describen o se muestran como referencia, por ejemplo, en Maniatis, et al. (1982), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY; Sambrook, et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed.), volúmenes 1-3, CSH Press, NY; Ausubel, et al., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; o Ausubel, et al. (1987 y suplementos), Current Protocols in Molecular Biology, Wiley/Greene, NY; Innis, et al. (eds.) (1990), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, NY. Los métodos para la purificación de proteínas incluyen métodos tales como la precipitación con sulfato de amonio, la cromatografía en columna, la electroforesis, la centrifugación, la cristalización y otros. Véase, por ejemplo, Ausubel, et al. (1987 y suplementos periódicos); Deutscher (1990), "Guide to Protein Purification", Methods in Enzymology, vol. 182, y otros volúmenes en esta serie; y la bibliografía de fabricantes sobre el uso de productos de purificación de proteína, por ejemplo, Pharmacia, Piscataway, NJ, o Bio-Rad, Richmond, CA. La combinación con técnicas recombinantes permite la fusión con segmentos apropiados (marcadores de epitopo), por ejemplo, con una secuencia FLAG o un equivalente que pueda fusionarse, por ejemplo, a través de una secuencia que puede eliminarse con proteasas. Véase, por ejemplo, Hochuli (1989), Chemische Industrie, 12:69-70; Hochuli (1990), "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent", en Setlow (ed.), Genetic Engineering, Principle and Methods, 12:87-98, Plenum Press, NY; Crowe, et al. (1992), QIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA; y Coligan, et al. (eds.) (1995 y suplementos periódicos), Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, Nueva York, NY.

Las técnicas inmunológicas convencionales se describen, por ejemplo, en Coligan (1991), Current Protocols in Immunology, Wiley/Greene, NY; y Methods in Enzymology, volúmenes 70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116, 121, 132, 150, 162 y 163. Los ensayos para las actividades biológicas de células neurales se describen, por ejemplo, en Wouterlood (ed., 1995), Neuroscience Protocols, módulo 10, Elsevier; Methods in Neurosciences, Academic Press; y Neuro-
methods Humana Press, Totowa, NJ. La metodología de los sistemas de desarrollo se describe, por ejemplo, en
Meisami (ed.), Handbook of Human Growth and Developmental Biology, CRC Press; y Chrispeels (ed.), Molecular Techniques and Approaches in Developmental Biology, Interscience.

Los análisis FACS se describen en Melamed, et al. (1990), Flow Cytometry and Sorting, Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY; Shapiro (1988), Practical Flow Cytometry, Liss, Nueva York, NY; y Robinson, et al. (1993), Handbook of Flow Cytometry Methods, Wiley-Liss, Nueva York, NY.

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II. Aislamiento de un clon de CX3Cquina humana

Un clon que codifica la CX3Cquina humana se aisla de una fuente natural mediante muchos métodos posibles diferentes. Con las secuencias proporcionadas en la presente se seleccionan y/o construyen cebadores de PCR o sondas de hibridación para aislar segmentos de ADN genómico o transcritos inversos de ADNc. Las fuentes celulares apropiadas incluyen tejidos humanos, por ejemplo, bancos de cerebro. La distribución tisular a continuación también sugiere tejidos fuente. Los variantes genéticos y polimórficos o alélicos se aislan mediante la selección de una población de individuos.

La detección basada en PCR se realiza mediante métodos convencionales, preferiblemente utilizando cebadores procedentes de los extremos opuestos de la secuencia codificadora, pero pueden seleccionarse segmentos flanqueantes para fines específicos.

Como alternativa, se seleccionan sondas de hibridación. Se seleccionan sondas con un contenido concreto en AT o GC, dependiendo de la homología esperada y del desapareamiento esperado. Se seleccionan las condiciones de rigurosidad apropiadas para equilibrar una proporción apropiada entre la señal positiva y el fondo. Se emplean sucesivas etapas de lavado para recoger los clones con mayor homología.

Otros clones se aislan utilizando un procedimiento de selección basado en anticuerpos. Se aplican métodos de clonación de expresión convencionales que incluyen, por ejemplo, tinción FACS del producto de expresión asociado a membranas. Los anticuerpos se emplean para identificar los clones que producen una proteína reconocida. Como alternativa, los anticuerpos se emplean para purificar una quimioquina CX3C, con secuenciación de la proteína y un medio convencional para aislar un gen que codifica esa proteína.

Los métodos basados en la secuencia genómica también permitirán la identificación de secuencias que aparecen en la naturaleza, o también que muestran homología con las secuencias proporcionadas. Unos procedimientos similares permitirán el aislamiento de otros genes de primates.

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III. Aislamiento de un clon de CX3Cquina de roedor

Se emplearon métodos similares a los anteriores para aislar un gen de quiminoquina CX3C de ratón apropiado. Se emplearon materiales fuente similares a los indicados anteriormente para aislar genes naturales, incluyendo variantes genéticos, polimórficos, alélicos o de raza. También se aislaron variantes de especie utilizando métodos similares, por ejemplo, a partir de ratas, topos, rata almizclera, capibaras, etc.

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IV. Aislamiento de un clon de CX3Cquina aviar

Se selecciona una fuente aviar apropiada como anteriormente. Se utilizaron métodos similares para aislar una variante de especie, aunque el nivel de similitud será menor, de forma típica, para la quimioquina CX3C aviar comparada con la similitud de una secuencia humana y de ratón.

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V. Expresión, purificación y caracterización

Con un clon apropiado procedente de las etapas anteriores, se inserta la secuencia codificadora en un vector de expresión apropiado. Esto puede realizarse en un vector específicamente seleccionado para un sistema de expresión procariota, de levadura, insecto o vertebrado superior, por ejemplo, mamífero. Se aplican métodos convencionales para producir el producto génico, preferiblemente como una molécula segregada soluble, pero, en algunos casos, también se produce como una proteína intracelular. Las proteínas intracelulares requieren, de forma típica, una lisis celular para recuperar la proteína, y los cuerpos de inclusión insolubles son un material de partida habitual para la posterior purificación.

Con un clon que codifica una quimioquina CX3C de vertebrado se utilizan medios de producción recombinantes, aunque las formas naturales pueden purificarse a partir de las fuentes apropiadas. El producto de proteína se purifica mediante métodos convencionales de purificación de proteínas, en ciertos casos, por ejemplo, acoplados con métodos de inmunoafinidad. Los métodos de inmunoafinidad se utilizan como una etapa de purificación, según se describió anteriormente, o como un ensayo de detección para determinar las propiedades de separación de la proteína.

Preferiblemente, la proteína se segrega hacia el medio, y el producto soluble se purifica a partir del medio en una forma soluble. Como alternativa, según se describió anteriormente, los cuerpos de inclusión de sistemas de expresión procariotas son una fuente útil de material. De forma típica, la proteína insoluble se solubiliza a partir de los cuerpos de inclusión y se repliega utilizando métodos convencionales. Los métodos de purificación se desarrollan como se describió anteriormente.

En ciertas realizaciones, la proteína se fabrica en una célula eucariota que normalmente glicosila la proteína. Los métodos de purificación pueden verse afectados por esto, al igual que las actividades biológicas. La proteína intacta puede procesarse para liberar el dominio de quimioquina, probablemente debido a un acontecimiento de ruptura con proteasas en algún punto de la región tallo glicosilada cercano al límite de quimiquina/tallo. Aunque la proteína recombinante parece estar procesada, los procesos fisiológicos que normalmente lo hacen en las células nativas siguen siendo desconocidos.

El producto del método de purificación descrito anteriormente se caracteriza para determinar muchas características estructurales. Se aplican métodos físicos convencionales, por ejemplo, análisis de aminoácidos y secuenciación de proteínas. La proteína resultante se somete a una espectrocopía CD y otros métodos espectroscópicos, por ejemplo, RMN, ESR, espectroscopía de masas, etc. El producto se caracteriza para determinar su forma y tamaño molecular, por ejemplo, utilizando cromatografía en gel y técnicas similares. La comprensión de las propiedades cromatográficas conducirá a métodos de purificación más suaves o eficaces.

\newpage

La bioquímica de proteínas de las quimioquinas CX3C se evaluó en sistemas de expresión de mamíferos. Células 293 de riñón embrionario humanas (HEK 293) transfectadas con un constructo de expresión de mamífero que codifica una quimioquina CX3C de longitud completa se marcaron metabólicamente con ^{35}S-cisteína y metionina. La quimioquina CX3C se produce como una proteína de Mr -95 kDa; los sobrenadantes transfectados control no contenían esta especie. La neuraminidasa y las glicosidasas reducían el Mr de la quimioquina CX3C de -95 kDa a -45 kDa, lo cual sugiere que la forma recombinante está sustancialmente glicosilada. Por tanto, el ADNc de la quimioquina CX3C, que codifica una proteína unida a la membrana predicha, codifica una glicoproteína que es liberada desde las células mediante un mecanismo desconocido.

Pueden predecirse los sitios de glicosilación, por ejemplo, como se indica en Hansen, et al. (1995), Biochem. J., 308:801-813.

VI. Preparación de anticuerpos contra una CX3Cquina de vertebrado

Con la proteína producida como se indicó anteriormente se inmunizan animales para producir anticuerpos. Se genera un antisuero policlonal utilizando antígeno no purificado, aunque el suero resultante mostrará unos mayores niveles de fondo. Preferiblemtne, el antígeno se purifica utilizando técnicas de purificación de proteínas convencionales incluyendo, por ejemplo, cromatografía de afinidad empleando suero policlonal como se indicó anteriormente. La presencia de anticuerpos específicos se detecta utilizando fragmentos peptídicos sintéticos definidos. Los fragmentos preferidos incluyen el dominio de quimioquina.

Se genera un suero policlonal contra un antígeno purificado como se indicó anteriormente, o utilizando péptidos sintéticos. Una serie de péptidos sintéticos solapantes, que incluyen toda la secuencia codificador completa, si se presentan a un animal, éste producirá suero que reconozca la mayoría de los epitopos lineales sobre la proteína. Este antisuero se utiliza para purificar mediante afinidad una proteína que, a su vez, se emplea para introducir la proteína de longitud completa intacta en otro animal para producir otra preparación de antisuero.

Se emplean técnicas similares para generar anticuerpos monoclonales inducidos contra el antígeno no purificado o, preferiblemente, el antígeno purificado.

VII. Distribución celular y tisular

Se determina la distribución de la proteína o los productos génicos, por ejemplo, utilizando la inmunohistoquímica con un reactivo de anticuerpo, producido como se indicó anteriormente, o mediante la selección de ácidos nucleicos que codifican la quimioquina. Se emplea una hibridación o métodos de PCR para detectcar el ADN, ADNc o el contenido en mensajeros. La histoquímica permite la determinación de los tipos celulares específicos dentro de un tejido que expresan niveles mayores o menores del mensajero o ADN. Las técnicas de anticuerpos son útiles para cuantificar proteínas en una muestra biológica, incluyendo una muestra líquida o de tejido. Los inmunoensayos se desarrollan para cuatificar proteínas.

Se aplicaron técnicas de hibridación a los tipos tisulares de la tabla 2 con resultados positivos o negativos, según se indica. Los análisis de la transferencia tisular comerciales pueden tener contaminación celular procedente de las células residentes, por ejemplo, de sangre u otras células que pueblan el tejido. Los transcritos grandes y pequeños se corresponden con unos tamaños de aproximadamente 4 kb y menos que aproximadamente 2 kb, respectivamente.

TABLA 2 Distribución tisular y celular del gen de la CX3Cquina humana

2

Otros análisis de la distribución tisular indican una abundancia del mensajero humano en: corazón +++; cerebro +++; placenta -; pulmón ++; hígado -; músculo +; riñón -; páncreas +; bazo -; timo +; próstata ++; testículos +; ovario +; intestino delgado ++; colon ++; sangre periférica -; línea de leucemia promielocítica HL60 -; células HeLa S3 -; línea de leucemia mielógena crónica K562 -; línea de leucemia linfoblástica Molt4 -; línea RAJ1 de linfoma de Burkitt -; línea de adenocarcinoma colorrectal SW480 +; línea de carcinoma pulmonar A549 -; y línea de melanoma G361 -.

Los "análisis de la transferencia inversa" son análisis de la transferencia de bancos de ADNc con los insertos retirados, y el tamaño de las determinaciones se basa en el tamaño de los insertos en el banco de ADNc, y refleja las longitudes encontradas en los insertos del banco de ADNc, que pueden ser más pequeñas que la longitud completa cuando la transcripción inversa no se realizó en toda la longitud. Como tales, las determinaciones del tamaño no reflejan los tamaños naturales. Los resultados de éstas son: PBMC (células mononucleares de sangre periférica) +; PBMC (activadas utilizando condiciones de estimulación de células T, con anti-CD3 y PMA) -; Mot72 (clon Th0 en reposo) +; Mot 72 (activadas con anti-CD28 y anti-CD3) -; Mot72 \alpha (activadas con clon anérgico, antipéptido) -; Mot81 (clon Th0 en reposo) -; Mot81 (activadas con anti-CD28 y anti-CD3) -; HY06 (clon Th1 en reposo) -; HY06 (activadas con anti-CD28 y anti-CD3) -; HY06\alpha (activadas con clon anérgico, antipéptido)-; HY935 (clon Th2 en reposo) -; HY935 (activadas con anti-CD28 y anti-CD3) +; agrupación de BC de líneas transformadas con EBV +; esplenocitos en reposo +; esplenocitos + (activados utilizando condiciones de estimulación de células B, con anti-CD40 e IL-4) -; agrupación de células NK -; agrupación de NK (activadas durante 6 h con PMA e ionomicina) +; clon de células NK NKA6 -; clon de células NK NKB1 -; clon de células NK no citotóxicas +; y clon de NK estimulado para que sea citotóxico -. Otras células y tejidos: células CHO +; células de Jurkat (DNAX) +; células de Jurkat cells (de otra fuente) +; agrupación de células T normales +; agrupación de TCT (células T transformadas) -; riñón fetal -; pulmón fetal -; hígado fetal -; corazón fetal -; cerebro fetal +; vesícula biliar fetal +; intestino delgado fetal +; tejido adiposo fetal +; ovario fetal -; útero fetal +; placenta adulta -; testículos fetales +; bazo fetal +; y cerebro fetal +. Otras células: U937 (línea celular de monocitos en reposo) +; C- (monocitos elutriados activados con LPS, IFN-\gamma, y anti-IL-10) +; C+ (monocitos elutriados activados con LPS, IFN-\gamma, e IL-10) +; M1 (monocitos elutriados activados con LPS durante 1 h) +; M6 (monocitos elutriados activados con LPS durante 6 h) +; 30% DC (30% de células dendríticas CD1a+ en reposo, proliferadas en TNF-\alpha y GM-CSF) +; 70% DC (70% de células dendríticas CD1a+ en reposo, proliferadas en TNF-\alpha y GM-CSF) +; D1 (células dendríticas estimuladas durante 1 h en PMA e ionomicina) -; D6 (células dendríticas estimuladas durante 6 h en PMA e ionomicina) -; D5 DC (células dendríticas en reposo cultivadas durante 5 días en GM-CSF e IL-4) +; DC (células dendríticas cultivadas GM-CSF e IL-4, activadas con LPS) +; DC (activadas con GM-CSF, como las células D5) +; mezcla de DC (células dendríticas estimuladas con una mezcla de citoquinas) +; CD1a+ (células dendríticas CD1a+ 99% puras, enriquecidas a partir de 70% DC) +; CD14+ (fracción de CD14+ elegidas a partir de 70% DC, con morfología de tipo monocítica) -; CD1Aa+ (95% CD1a+ y CD86+ elegidas a partir de 70% DC) -; TF1 (línea precursora hematopoyética) +; Jurkat (línea de células T) +; MRC5 (línea celular de sarcoma de fibroblastos pulmonar) +; JY (línea de células B) +; U937 (línea celular premonocítica) +.

Puesto que el endotelio es un sitio principal de la acción de las quimioquinas, se realizó un ensayo de la transferencia Northern para determinar si la CX3Cquina se expresaba en este tejido. También se demostró que la CX3Cquina humana se expresaba en células endoteliales primarias activadas humanas por el ARNm y la expresión de proteínas. Esto sugiere que la CX3Cquina puede estar implicada en el tráfico de leucocitos en diversos órganos.

En resumen, el ARNm de la CX3Cquina humana se encuentra en monocitos, células dendríticas, células T y células B, por ejemplo, se encuentra en ciertas células inmunológicas.

VIII. Ensayos de microquimiotaxis

Las actividades promigratorias de la quimioquina CX3C se han evaluado en ensayos de microquimiotaxis. Véase, por ejemplo, Bacon, et al. (1988), Br. J., Pharmacol., 95:966-974. La quimioquina CX3C parece ser un potente atrayente de monocitos de sangre periférica y células T. La actividad promigratoria para neutrófilos sanguíneos ha sido difícil de demostrar.

IX. Cartografiado cromosómico

El gen de la quimioquina CX3C se ha cartografiado en el cromosoma 16 humano. Un panel de células híbridas somáticas de ratón de BIOS Laboratories (New Haven, CT) se combinó con PCR. Estos estudios de cartografiados también indican la posibilidad de un pseudogén o gen relacionado en el cromosoma 14 humano. La secuenciación de los fragmentos de ADN genómico sugiere que el gen de la quimioquina CX3C tiene un intrón que comienza cerca o en el codón que codifica Ile 64. Otros límites entre intrón/exón aún deben cartografiarse. Este emplazamiento está diferenciado de los emplazamientos de cartografiado cromosómico de las otras familias de quimioquinas C, CC o CXC, siendo este resulado coherente con que la CX3Cquina sea una familia génica diferente dentro de las quimioquinas.

X. Actividades biológicas, directas e indirectas

La línea de células de riñón embrionario humana 293 (HEK 293) se transfectó con la forma unida a membrana de la CX3Cquina humana (293-CX3Cquina), el dominio de quimioquina más la región "tallo", o un vector control sin un inserto. Las células transfectadas posteriormente se cultivaron con monocitos, células T, o células mononucleares de sangre periférica (PMN) para ensayar la adherencia relativa de estas células a la CX3Cquina. De forma específica, 5 x 10^{4} células por pocillo de células transfectadas HEK 293 se sembraron en una placa de 96 pocillos. Se añadieron a cada pocillo 2 x 10^{5} monocitos, células T, o PMN, marcadas metabólicamente con ^{35}S-metionina y cisteína (Amersham, Arlington Heights, IL). La placa entonces se incubó a 37ºC durante diversos tiempos. Los pocillos se lavaron 2 veces con RPMI suplementado con FCS al 1%. Las placas entonces se leyeron en un citofluorímetro Millipore a
485/530 nm.

En todos los casos, la adherencia a células HEK 293 transfectadas con la forma unida a membrana de la CX3Cquina fue significativamente potenciada cuando se compara con la CX3Cquina truncada o células con transfección ficticia. De forma interesante, sólo la forma unida a membrana posee esta actividad proadhesiva, lo cual lleva a la conclusión de que la CX3Cquina, en su forma unida a membrana, puede actuar como regulador de los leucocitos en la
circulación.

En otro experimento, la forma soluble recombinante del dominio de quimioquina de la CX3Cquina (rCx3C) se añadió a células HEK 293-CX3C y monocitos a una concentración de 1 \muM por pocillo, y se ensayó como se describió anteriormente. La rCX3C fue capaz de antagonizar la adhesión de los monocitos a células HEK 293-CX3C. Se realizó un experimento similar para investigar el efecto sobre la adherencia de células T. Se obtuvieron unos resultados comparables. Por tanto, la rCX3C puede actuar como un regulador negativo de los leucocitos en la circulación.

Se realizó una comparación de tres formas diferentes de la CX3Cquina humana para analizar las variaciones en la actividad quimioatrayente que pueden ser debidas a la estructura de la CX3Cquina. Se sometieron a CX3C 1.7 (dominio de quimioquina más la región tallo completa), CX3C 0.7 (dominio de quimioquina más media región tallo), y CX3C CK (sólo el dominio de quimioquina) al ensayo de quimiotaxis descrito anteriormente, y se analizó su capacidad para atraer a células T. CX3C 1.7 mostró una capacidad dependiente de la dosis ligeramente mejor para atraer a células T con relación a las otras formas de CX3Cquinas.

Se seleccionó un ensayo robusto y sensible como se describió anteriormente, por ejemplo, con células inmunológicas, células neuronales o células pluripotenciales. Se añadió la quimioquina al ensayo en dosis crecientes para observar si se detecta una respuesta a la dosis. Por ejemplo, en un ensayo de proliferación, las células se cultivan en placas. Se proporciona un medio de cultivo apropiado y se añade la quimioquina a las células en diversas cantidades. Se controla el crecimiento a lo largo de un periodo de tiempo que detectará un efecto directo sobre las células, o un efecto indirecto de la quimioquina.

Como alternativa, se emplea un ensayo de activación o de atracción. Se selecciona un tipo celular apropiado, por ejemplo, células hematopoyéticas, células mieloides (macrófagos, neutrófilos, células polimorfonucleares, etc.) o linfoides (células T, células B, o células NK), células neurales (neuronas, neuroglia, oligodendrocitos, astrocitos, etc.), o células pluripotenciales, por ejemplo, células progenitoras que se diferencian en otros tipos celulares, por ejemplo, células de criptas intestinales y tipos celulares indiferenciados.

Otros ensayos serán aquéllos que se han demostrado con otras quimioquinas. Véase, por ejemplo, Schall y Bacon (1994), Current Opinion in Immunology, 6:865-873; y Bacon y Schall (1996), Int. Arch. Allergy & Immunol., 109:97-109. Los efectos de las estructuras tallo truncadas se evaluarán de forma similar.

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XI. Relación entre estructura y actividad

Se determina la información sobre la presencia crítica de restos concretos utilizando procedimientos y análisis convencionales. Se realiza un análisis de mutagénesis convencional, por ejemplo, generando muchos variantes diferentes en posiciones determinadas, por ejemplo, en las posiciones identificadas anteriormente, y se evalúan las actividades biológicas de los variantes. Esto puede realizarse hasta el grado de determinar posiciones que pueden modificar la actividad, o para enfocarse en posiciones específicas para determinar los restos que puedan sustituirse para mantener, bloquear o modular una actividad biológica.

Como alternativa, el análisis de los variantes naturales puede indicar qué posiciones toleran mutaciones naturales. Esto puede surgir del análisis poblacional de la variación entre individuos, o a través de razas o especies. Se analizan muestras procedentes de individuos seleccionados, por ejemplo, mediante análisis de PCR y secuenciación. Esto permite la evaluación de los polimorfismos poblacionales. En particular, como se describió anteriormente, pueden surgir muchas de las actividades biológicas del dominio de quimioquinas unido a diferentes porciones o extensiones de la estructura tallo.

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XII. Selección de agonistas/antagonistas

Se seleccionaron agonistas o antagonistas por su capacidad para inducir o bloquear una actividad biológica. Los compuestos candidatos, por ejemplo, variantes de secuencia de CX3Cquinas naturales, se ensayan para sus actividades biológicas. Como alternativa, los compuestos se seleccionan, por sí solos o en combinaciones, para determinar sus efectos sobre la actividad biológica.

XIII. Aislamiento de un receptor para la quimioquina CX3C

Basándose en las propiedades proadherentes de la CX3Cquina, se descubrió que el receptor de la proteína G 7-transmembrana se expresaba en monocitos y células T. También se descubrió que el dominio de quimioquina era la única región de la CX3Cquina que podía unirse al receptor. Los ensayos de unión con receptores de quimioquina conocidos revelaron que la CX3Cquina no se une a los receptores CCR 1 a 5, CXCR 1 y 2, ni al receptor del antígeno Duffy. Sin embargo, la CX3Cquina puede unirse al receptor de quimioquina codificado por virus, CMV-US28.

Como alternativa, la quimioquina CX3C puede utilizarse como reactivo de unión específica para identificar su compañero de unión aprovechando su especificidad de unión, de forma similar a la manera en que se utilizaría un anticuerpo. Un reactivo de unión se marca como se describió anteriormente, por ejemplo, con fluorescencia o de otra manera, o se inmomviliza sobre un sustrato para los métodos de inmunopurificación. El receptor de quimioquina típico es un receptor 7-transmembrana.

La proteína purificada también puede emplearse para identificar otros compañeros de unión de la CX3Cquina como se describe, por ejemplo, en Fields y Song (1989), Nature, 340:245-246.

La composición de unión, por ejemplo, la quimioquina, se emplea para seleccionar un banco de expresión fabricado a partir de una línea celular que expresa un compañero de unión, es decir, un receptor. También se emplean técnicas de tinción convencionales para detectar o clasificar receptores intracelulares o expresados sobre la superficie, o se seleccionan mediante inmunopurificación células transformadas que lo expresan sobre la superficie. La selección de expresión intracelular se realiza mediante diversos procedimientos de tinción o inmunofluorescencia. Véase, también, McMahan, et al. (1991), EMBO J., 10:2821-2832.

Por ejemplo, en el día 0, se cultivan portaobjetos de Permanox de 2 cámaras prerrevestidos con 1 ml por cámara de fibronectina, 10 ng/ml en PBS, durante 30 min a temperatura ambiente. Se enjuagan una vez con PBS. Después se cultivan células COS a 2-3 x 10^{5} células por cámara en 1,5 ml de medio de crecimiento. Se incuba durante la noche a 37ºC.

En el día 1 para cada muestra se preparan 0,5 ml de una disolución de DEAE-dextrano 66 \mug/ml, cloroquina 66 \muM, y 4 \mug de ADN en DME exento de suero. Para cada grupo se prepara un control positivo, por ejemplo, de ADNc de quimioquina CX3C humana con una dilución de 1 y 1/200, y un control negativo ficticio. Se enjuagan las células con DME exento de suero. Se añade la disolución de ADN y se incuba durante 5 hr a 37ºC. Se retira el medio y se añaden 0,5 ml de DMSO al 10% en DME durante 2,5 min. Se retira y se lava una vez con DME. Se añaden 1,5 ml de medio de crecimiento y se incuba durante la noche.

En el día 2 se cambia el medio. En los días 3 ó 4 las células se fijan y se tiñen. Se enjuagan las células dos veces con disolución salina tamponada de Hank (HBSS) y se fijan en paraformaldehído (PFA) al 4%/glucosa durante 5 min. Se lavan 3 x con HBSS. Los portaobjetos pueden conservarse a -80ºC después de retirar todo el líquido. Para cada cámara se realizan incubaciones de 0,5 ml como sigue. Se añade HBSS/saponina (al 0,1%) con 32 \mul/ml de NaN_{3} 1 M durante 20 min. Las células entonces se lavan con HBSS/saponina 1 x. Se añade la quimioquina o el complejo de quiminoquina/anticuerpo a las células y se incuba durante 30 min. Las células se lavan dos veces con HBSS/saponina. Si resulta apropiado, se añade el primer anticuerpo durante 30 min. Se añade el segundo anticuerpo, por ejemplo, vector de anticuerpo antirratón, con una dilución 1/200, y se incuba durante 30 min. Se prepara una disolución de ELISA, por ejemplo, vector de disolución de peroxidasa de rábano Elite ABC, y se preincuba durante 30 min. Se emplea, por ejemplo, una gota de disolución A (avidina) y una gota de disolución B (biotina) por cada 2,5 ml de HBSS/saponina. Se lavan las células dos veces con HBSS/saponina. Se añade la disolución de HRP ABC y se incuba durante 30 min. Las células se lavan dos veces con HBSS, y se realiza un segundo lavado durante 2 min, el cual cierra las células. Después se añade el vector de ácido diaminobenzoico (DAB) durante 5 a 10 min. Se emplean 2 gotas de tampón más 4 gotas de DAB más 2 gotas de H_{2}O_{2} por cada 5 ml de agua destilada en vidrio. Se retira cuidadosamente la cámara y se enjuaga el portaobjetos en agua. Se seca al aire durante unos cuantos minutos, y después se añade una gota de Crystal Mount y se coloca un cubreobjetos. Se cuece durante 5 min a 85-90ºC.

Se evalúa la tinción positiva de las agrupaciones y se realizan subclonaciones progresivas para aislar genes individuales responsable de la unión.

Como alternativa, se emplean reactivos de quimioquina para purificar mediante afinidad o para clasificar células que expresan un receptor. Véase, por ejemplo, Sambrook, et al., o Ausubel, et al.

Otra estrategia es realizar una selección para un receptor unido a membrana mediante inmunopurificación. Se construye el ADNc del receptor como se describió anteriormente. El ligando puede inmovilizarse y emplearse para inmovilizar las células con expresión. La inmovilización puede lograrse mediante el uso de anticuerpos apropiados que reconozcan, por ejemplo, una secuencia FLAG de un constructo de fusión de quimioquina, o mediante el uso de anticuerpos generados contra el primer anticuerpo. Los ciclos repetidos de selección y amplificación conducen al enriquecimiento de los clones apropiados y el aislamiento final de los clones que expresan el receptor.

Pueden seleccionarse bancos de expresión de fagos por la quimioquina. Las técnicas de marcaje apropiadas, por ejemplo anticuerpos anti-FLAG, permitirán el marcaje específico de los clones apropiados.

Todas las referencias citadas en la presente se incorporan como referencia en el mismo grado que si cada publicación individual o solicitud de patente se indicara específica e individualmente para ser incorporada en su totalidad para todos los fines.

Las realizaciones específicas descritas en la presente se ofrecen sólo como ejemplo, y la invención sólo se limita por los términos de las reivindicaciones adjuntas, junto con el alcance completo de los equivalentes autorizados por dichas reivindicaciones.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Schering Corporation

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: GENES DE QUIMIOQUINA CX3C DE MAMÍFERO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 11

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Schering Corporation

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 2000 Galloping Hill Road

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Kenilworth

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Nueva Jersey

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EEUU

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 07033

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/649.006

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 16 de mayo, 1996

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/590.828

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 24 de enero, 1996

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Cynthia L. Foulke, Esq.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 32.364

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/CERTIFICADO: DX0569K2

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 908-298-2987

\vskip0.800000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 908-298-5388

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 534 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 89..424

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 111 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1654 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 86..1279

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 397 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 209 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 63..209

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 49 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3065 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 62..1249

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 396 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 96 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 115 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 92 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

\vskip1.000000\baselineskip

18

Claims (58)

1. Una proteína de quimioquina CX_{3}C aislada de aproximadamente 11000 a 12500 Daltons cuando está en forma no glicosilada y que contiene un motivo estructural CXXXC, en la que dicha proteína de quimioquina CX_{3}C se une específicamente con un anticuerpo generado contra un inmunógeno seleccionado del grupo que consiste en

(a) el polipéptido de SEQ ID NO:2 que comienza en Gln25;

(b) el polipéptido maduro de SEQ ID NO:4; y

(c) el polipéptido maduro de SEQ ID NO:8;

y dicha quimioquina CX_{3}C carece de los motivos estructurales de cisteína y secuencia característicos de una quimioquina C, CC, o CXC.

2. La proteína de quimioquina CX_{3}C aislada de la reivindicación 1, que se une a un receptor que tiene dominios 7-transmembrana y muestra al menos 95% de coincidencia de secuencia con:

(a) el polipéptido de SEQ ID NO:2 que comienza en Gln25;

(b) el polipéptido maduro de SEQ ID NO:4; o

(c) el polipéptido maduro de SEQ ID NO:8.

\vskip1.000000\baselineskip

3. La proteína de quimioquina CX_{3}C aislada de la reivindicación 2, que:

(a) se produce de forma recombinante, o

(b) es una proteína que aparece en la naturaleza.

\vskip1.000000\baselineskip

4. La proteína de quimioquina CX_{3}C rotada de la reivindicación 2, en la que dicha proteína de quimioquina CX_{3}C consiste en un polipéptido seleccionado del grupo de:

(a) el polipéptido de SEQ ID NO: 2 que comienza en Gln25;

(b) el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 4; y

(c) el polipéptido maduro de SEQ ID NO:8.

\vskip1.000000\baselineskip

5. La proteína de quimioquina CX_{3}C aislada de la reivindicación 1, que comprende un polipéptido de SEQ ID NO:2 que comienza en Gln25.

6. La proteína de quimioquina CX_{3}C aislada de la reivindicación 1, que comprende un polipéptido maduro de SEQ ID NO:4.

7. Un ácido nucleico aislado que codifica la proteína de quimioquina CX_{3}C de la reivindicación 2.

8. Un ácido nucleico aislado que codifica la proteína de quimioquina CX_{3}C de la reivindicación 4.

9. Un ácido nucleico aislado que codifica la proteína de quimioquina CX_{3}C de la reivindicación.

10. Un vector de expresión que contiene el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.

11. Una célula aislada transfectada con el vector de la reivindicación 10.

12. Un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión al antígeno de éste, que se une específicamente a la quimioquina CX_{3}C de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

13. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 12, que es específicamente inmunorreactivo con uno o más de:

(a) el polipéptido de SEQ ID NO:2 que comienza en Gln25;

(b) el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 4; y

(c) el polipéptido maduro de SEQ ID NO:6.

14. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 12 o la reivindicación 13, que es un anticuerpo monoclonal, Fab o F(ab)_{2}.

15. El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, que es un anticuerpo marcado.

16. Un método in vitro para detectar la proteína de quimioquina CX_{3}C de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en una muestra biológica, que comprende:

(a) poner en contacto dicha muestra biológica con el anticuerpo o fragmento de la reivindicación 12 bajo condiciones que permiten la formación de un complejo de anticuerpo o fragmento:polipéptido; y

(b) detectar dicho complejo.

\vskip1.000000\baselineskip

17. El método de la reivindicación 16, en el que dicha muestra biológica es de un ser humano.

18. Un método in vitro para modular la fisiología o desarrollo de una célula, que comprende:

(a) poner en contacto dicha célula con la quimioquina CX_{3}C de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; o

(b) poner en contacto dicha célula con el anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15.

\vskip1.000000\baselineskip

19. Una formulación farmacéutica que comprende al menos un ingrediente activo seleccionado de:

(a) la quimioquina CX_{3}C de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; o

(b) el anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

\vskip1.000000\baselineskip

20. La qumioquina CX_{3}C de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en medicina.

21. El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 para su uso en medicina.

22. La proteína de quimioquina CX_{3}C de la reivindicación 20, en la que el uso es para mediar en la fisiología o desarrollo de una célula.

23. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 21, en el que el uso es para modular la fisiología o desarrollo de una célula.

24. La proteína de quimioquina CX_{3}C de la reivindicación 20, en la que el uso es para modular la atracción de un monocito de sangre periférica o una célula T.

25. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 21, en el que el uso es para modular la atracción de un monocito de sangre periférica o una célula T.

26. El uso de la quimioquina CX_{3}C de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir el cáncer o la infección.

27. El uso de un anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir la esclerosis múltiple o la inflamación neurogénica.

28. El anticuerpo aislado, o un fragmento de unión al antígeno de éste, de la reivindicación 13, que es específicamente inmunorreactivo con un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 que comienza en Gln25.

29. El anticuerpo aislado, o un fragmento de unión al antígeno de éste, de la reivindicación 13, que es específicamente inmunorreactivo con un polipéptido maduro de SEQ ID NO:4.

30. El anticuerpo aislado, o un fragmento de unión al antígeno de éste, de la reivindicación 13, que es específicamente inmunorreactivo con un polipéptido maduro de SEQ ID NO:8.

31. El anticuerpo de la reivindicación 28 que es un anticuerpo monoclonal.

32. El anticuerpo de la reivindicación 29 que es un anticuerpo monoclonal.

33. El anticuerpo de la reivindicación 30 que es un anticuerpo monoclonal.

34. El anticuerpo de la reivindicación 28 que es un anticuerpo policlonal.

35. El anticuerpo de la reivindicación 29 que es un anticuerpo policlonal.

36. El anticuerpo de la reivindicación 30 que es un anticuerpo policlonal.

37. El anticuerpo de la reivindicación 28 que es un anticuerpo quimérico.

38. El anticuerpo de la reivindicación 29 que es un anticuerpo quimérico.

39. El anticuerpo de la reivindicación 30 que es un anticuerpo quimérico.

40. El anticuerpo de la reivindicación 28 que es un anticuerpo humanizado.

41. El anticuerpo de la reivindicación 29 que es un anticuerpo humanizado.

42. El anticuerpo de la reivindicación 30 que es un anticuerpo humanizado.

43. Un anticuerpo antiidiotípico que se une a un anticuerpo de la reivindicación 28.

44. Un anticuerpo antiidiotípico que se une a un anticuerpo de la reivindicación 29.

45. Un anticuerpo antiidiotípico que se une a un anticuerpo de la reivindicación 30.

46. El fragmento de la reivindicación 28 que es un Fab.

47. El fragmento de la reivindicación 29 que es un Fab.

48. El fragmento de la reivindicación 30 que es un Fab.

49. El fragmento de la reivindicación 28 que es un F(ab)_{2}.

50. El fragmento de la reivindicación 29 que es un F(ab)_{2}.

51. El fragmento de la reivindicación 30 que es un F(ab)_{2}.

52. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 28 que es recombinante.

53. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 29 que es recombinante.

54. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 30 que es recombinante.

55. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 12 unido a dicho polipéptido.

56. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de la reivindicación 28 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

57. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de la reivindicación 29 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

58. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de la reivindicación 30 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.