CN102272598A - 用以诊断自体免疫疾病之人工合成肽、方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

在此揭示用来侦测或诊断自体免疫疾病，特别是过敏性紫斑症(Henoch-

purpura，HSP)，的人工合成肽、方法与试剂盒。所揭示之人工合成肽、方法与试剂盒是利用从β-2-糖蛋白-1(β-2-glycoprotein-1，β-2-GP1)衍生而来的人工合成肽来侦测自体免疫疾病的自体抗体。

Description

用以诊断自体免疫疾病之人工合成肽、方法及试剂盒

发明领域

本揭示内容是有关于用来侦测或诊断自体免疫疾病的人工合成肽、方法与试剂盒。详言之，本揭示内容所提供的人工合成肽、方法与检测试剂盒，是利用从β-2-糖蛋白-1(β-2-glycoprotein-1，β-2-GP1)衍生而来的人工合成肽来侦测自体免疫疾病的自体抗体，因此可轻易地侦测或诊断自体免疫疾病。

发明背景

紫斑症(purpura)是由于微管结构中的血液过度渗漏至皮肤或黏膜后所造成的现象。传统上依据所出现紫斑的大小，将紫斑分成瘀点斑(petchiae)(即，直径不超过2公厘的点状出血)、紫斑(purpura)(直径在2公厘至1公分间)或瘀斑(ecchymoses)(直径超过1公分以上)。虽然紫斑本身并没有立即性的危险，然而却是潜藏、致命性疾病的前兆。因此，确诊或是确定没有危险是必要的。

过敏性紫斑症(Henoch-

purpura，HSP)是一种系统性微管结构发炎或血管发炎，特征是皮肤或肾脏会出现IgA沉积，其指标性病兆为非血小板减少型紫斑、腹痛、关节炎及肾炎。HSP是一种常见的儿童微管结构发炎，但任何岁数的人都可能出现HSP，只是一般好发在2-11岁左右的儿童。迄今，并无任何单一测试可供检测HSP之用，因此医师需仰赖病史与一系列的身体检查，与少数关键性实验测试来确认HSP的诊断结果。代表性测试包括完整的血液细胞记数，其中包括血小板数目、外围血液抹片、凝血酶原以及活化部分凝血质的时间，检查尿液样品中是否有血尿，以及皮肤和/或肾脏切片。

因此，亟需一种可早期诊断、侦测或确认一患有HSP或疑似患有HSP之个体情况的改良方法，藉以对有需求的个体提供早期治疗。

发明内容

本揭示内容系关于从一种蛋白质，β-2-糖蛋白-1(β-2-glycoprotein-1，β-2-GP1)，的抗原决定部位衍生而来的人工合成肽的用途，这些人工合成肽可被患有过敏性紫斑症(Henoch-

purpura，HSP)的个体体内的自体抗体认得，且能与患有HSP之个体身上的自体免疫自体抗体反应。

因此，本揭示内容第一态样是提供一种人工合成肽，其可轻易地侦测或诊断出患有HSP或疑似患有HSP之个体体内的自体抗体。这些人工合成肽是衍生自β-2-GP1，且包含一氨基酸序列，此氨基酸序列与任一选自序列编号：3、序列编号：5、序列编号：7、序列编号：11及序列编号：12群组中之序列的氨基酸序列至少80％相同。同时，依据本揭示内容所合成的肽被证明适合用来专一性地诊断HSP。

因此，本揭示内容另一态样是提供一种用来侦测或诊断出患有HSP或疑似患有HSP之个体的方法，包含以下步骤：自该个体取得一生物样本；利用将该生物样本与依据本揭示内容一实施态样所制备之人工合成肽彼此混合，而侦测出该生物样本中的自体抗体，该自体抗体可与该人工合成肽在一免疫反应中反应而形成一复合物。较佳是，该人工合成肽是衍生自β-2-GP1，且包含一与序列编号：3、序列编号：5、序列编号：7、序列编号：11或序列编号：12之序列至少80％相同的氨基酸序列。在一实施方式中，此免疫反应为酵素连接之免疫吸附物分析(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。在另一较佳实施方式中，该自体抗体可与自β-2-GP1衍生而来的该人工合成肽形成一复合物，该人工合成肽包含一与序列编号：3之序列至少90％相同的氨基酸序列。此自体抗体包含一种免疫球蛋白A(IgA)。在一实施方式中，此生物样本是选自皮肤切片样本、全血样本、血清样本、血浆样本、尿液样本、黏液样本及其之纯化或过滤后的形式。

另一方面，本揭示内容是有关一种可用来侦测或诊断出患有HSP或疑似患有HSP之个体的检验试剂盒。此检验试剂盒包含一容器；多种用来侦测一生物样本中之一自体抗体的试剂，其中该些试剂包含至少一种衍生自β-2-GP1的人工合成肽，该些人工合成肽是依据本揭示内容一实施方式所述的操作步骤进行合成，该些肽包含一与序列编号：3、序列编号：5、序列编号：7、序列编号：11或序列编号：12之序列至少80％相同的氨基酸序列；以及一说明书，放在该容器中，用来说明如何使用这些从β-2-GP1衍生而来的人工合成肽，来侦测该生物样本中的自体抗体。在一实施例中，此检验试剂盒更包含一负对照组，其代表在一健康人身上可与该些自β-2-GP1衍生而来的人工合成肽(其具有与任一选自序列编号：3、序列编号：5、序列编号：7、序列编号：11或序列编号：12之序列至少80％相同的氨基酸序列)形成一复合物的自体抗体的量。该些生物样本是选自皮肤切片样本、全血样本、血清样本、血浆样本、尿液样本、黏液样本及其之纯化或过滤后的形式。

透过以下的详细明与附随之申请专利范围将可更了解本揭示内容的这些及其他特征。需知以上的概述及以下的详细说明仅为例示，用来阐述本揭示内容，而非用以限制本揭示内容之范畴。

附图简述

为让本揭示内容之上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式之说明如下：

第1A-1C图绘示出依据本发明一实施方式在患有急性HSP之儿童身上所测量到的血浆中(A)IgG，(B)IgM，(C)IgA抗心肌脂抗体(aCL)的量(以OD值表示)，每一群数据的平均值则是以一水平线来代表；

第1D图是患有(A)急性HSP与(C)目前处于缓解期之HSP患者身上的IgA aCL抗体量的比较，虚线代表互相比较之数据，*代表在统计学上有明显差异；

第2A-2C图绘示出依据本发明一实施方式在患有急性HSP之儿童身上所测量到的血浆中(A)IgG，(B)IgM，(C)IgA抗内皮细胞抗体的量(以OD值表示)，每一群数据的平均值则是以一水平线来代表；

第2D图是患有(A)急性HSP与(C)目前处于缓解期之HSP患者身上的IgA抗内皮细胞抗体(AECA)量的比较，虚线代表互相比较之数据，*代表在统计学上有明显差异；

第3A～3C图绘示出依据本发明一实施方式在患有急性HSP之儿童身上所测量到的血浆中(A)IgG，(B)IgM，(C)IgA抗β-2-GP1抗体的量(以OD值表示)，每一群数据的平均值则是以一水平线来代表；

第3D图是患有(A)急性HSP与(C)目前处于缓解期之HSP患者身上的IgA抗β-2-GP1抗体量的比较，虚线代表互相比较之数据，*代表在统计学上有明显差异；

第4A图绘示出依据本发明一实施方式在患有急性HSP之儿童身上所测量到的IgA aCL抗体与IgA抗β-2-GP1抗体间的关系；

第4B图绘示出依据本发明一实施方式在患有急性HSP之儿童身上所测量到的IgA AECA抗体与IgA抗β-2-GP1抗体间的关系；

第5A-5B图绘示出依据本发明一实施方式，多株性IgA(即，IgA群，50μg/ml)与从7位儿童患者血浆样本中所分离出来的IgA(即，HSP群，50μg/ml)，与(A)β-2-GP1或(B)aCL间的反应性比较；

第5C～5D图绘示出依据本发明一实施方式，多株性IgA或是从两位儿童患者血浆样本中所分离出来的IgA(即，IgA1与IgA2)与(C)β-2-GP1或(D)aCL间的剂量依赖性关系；

第6图绘示出依据本发明一实施方式，从两份随机选择的样本中所分离出来的IgA(即，IgA2与IgA6，浓度均为10μg/ml)与包括β-2-GP1、OVA及凝血酶原在内的各种蛋白质间的结合专一性；

第7A-7H图绘示出依据本发明一实施方式，7种IgA样本(即，IgA1～7，浓度均为10μg/ml)与15段β-2-GP1人工合成肽(即，P-1至P-15)间的反应性(以OD值来表示)；其中以IgA与β-2-GP1的结合作为正对照组，与缓冲溶液(PBS)间的结合作为负对照组，OD值高于正对照组者被认为两者的结合具有显著性；

第8图为第7图结果的综合整理，其中从7位急性HSP患者身上分离出来的IgA与任一人工合成肽3、5或7(第8A图)或是人工合成肽11或12(第8B图)间的结合具有显著性；以及

第9图绘示出急性HSP儿童患者身上，其血浆中IgA抗人工合成肽3、5、7、11、12及6(即，P3、P5、P7、P11、P12及P6)抗体的量。

发明详述

所述实施方式与专有名词是为了阐述发明内容之用，并非用以限制本揭示内容范畴。本揭示内容范畴也涵盖并未特意揭示于此，但习知技艺人士在阅读过本揭示内容后可轻易推知的其他实施方式。

以衍生自β-2-GP1的肽做为是否出现过敏性紫斑症(Henoch-

purpura，HSP)的标记

本揭示内容提供从自体抗原衍生而来的专一性标记或肽，做为是否出现HSP的判断依据。这些肽可用来侦测、诊断或确认是否有HSP。

在本揭示内容研发过程中所执行的实验使发明人得以鉴别出一种自体抗原，特别是，一种分离自患有HSP之个体身上的血浆蛋白质，β-2-糖蛋白-1(β-2-glycoprotein-1，β-2-GP1)。因此，可将这些能被HSP之专一性自体抗体认得的β-2-GP1衍生肽当成一种工具，让医师能正确地诊断及确认一临床HSP病况，进而能提供治疗给亟需治疗的个体。

在某些实施方式中，本揭示内容提供依据以自β-2-GP1衍生而来的人工合成肽与自体抗体间的侦测结果，来侦测、诊断或确认HSP的人工合成肽、方法和检验试剂盒。

「个体(subject)」一词在本文中代表将受到本发明诊断之任何一种动物(例如，人类)，包括，但不限于，人类、非人类的灵长类。一般来说，当指人类个体时，「患者(patient)」一词及「个体(subject)」一词在本文中可彼此交替使用。

「患有HSP或疑似患有HSP之个体」一词在本文中涵盖一开始曾被诊断出HSP但其严重程度尚未确认的个体。此名词更涵盖曾患有HSP但其病症已减轻的个体。

β-2-糖蛋白-1是一种人类血浆蛋白质，已被高度纯化、结晶并研究，其系由一条内含345个氨基酸的多肽组成，分子量约为50kDa。一般认为β-2-糖蛋白-1的功能是在内生性凝血系统中做为一种抗凝剂，当以阴离子性磷脂ELISA试验来分析自体免疫病患者体内的「抗磷脂(antiphospholipid，aPL)」抗体时，β-2-糖蛋白-1是与这些aPL抗体结合时不可或缺的一部分。此外，β-2-糖蛋白-1也会和低密度脂蛋白(lowdensity lipoprotein，LDL)结合，并被认为是一种在唾液免疫分析时用来侦测心血管疾病的又用标记物(参见美国专利第5,900,356号及美国专利公开案第2003/0100036A1)。

依据本揭示内容一实施方式，将β-2-GP1多肽之全长随机分成15段，每一段中可有或无重迭的氨基酸，且每一段肽断片含有约18至57个人类β-2-GP1的氨基酸残基。可利用习知技艺中标准的肽合成方法，来合成这些β-2-GP1的衍生肽。在一实例中，是以固相肽合成仪(ABI433Apeptide synthesizer，Applied Biosystems Inc.，Life Technologies Corp.，Foster City，CA，USA)，并依据设备商所提供的标准流程来合成这些β-2-GP1的衍生肽，并将所合成的肽分别命名为P-1(序列编号：1)、P-2(序列编号：2)、P-3(序列编号：3)、P-4(序列编号：4)、P-5(序列编号：5)、P-6(序列编号：6)、P-7(序列编号：7)、P-8(序列编号：8)、P-9(序列编号：9)、P-10(序列编号：10)、P-11(序列编号：11)、P-12(序列编号：12)、P-13(序列编号：13)、P-14(序列编号：14)和P-15(序列编号：15)，其详细内容揭示于一较佳实施例中的表1。

此领域具有通常知识水平的人可依据现今能够预测多肽序列中一多肽构形变化所可能会有的影响的方法，例如计算机仿真程序，透过建议并测试经过修饰的β-2-GP1衍生肽，来决定此经过修饰的β-2-GP1衍生肽是否仍保留原来的功能或构形，而能「设计(design)」或「修饰(modify)」本揭示内容中所揭示的这些β-2-GP1衍生肽。可明确地修饰这些β-2-GP1衍生肽以改变这些肽之一与生理活性无关的特定特征。举例来说，可取代或删除半胱胺酸残基以防止不欲求的二硫键结。类似的，可在不影响本揭示内容所述肽活性(亦即，其在免疫分析中与HSP专一性抗体结合的能力)的情况下，改变和/或删除某些特定氨基酸。因此，本揭示内容也涵盖所揭示这些β-2-GP1衍生肽的功能性衍生物，包括那些具有保留性取代氨基酸的肽。氨基酸之保留性取代涵盖以来自以下群组中之氨基酸所进行的取代：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；(g)E、D；和(h)C、M。

以衍生自β-2-GP1的肽来侦测自体抗体

以本揭示内容所合成的β-2-GP1衍生肽做为工具，来侦测或结合个体体内的HSP专一性抗体。因此，本揭示内容提供一种用来侦测或诊断一患有HSP或疑似患有HSP之个体的方法，包含以下步骤：自该个体取得一生物样本；利用将该生物样本与依据上述方式所制备而成之人工合成β-2-GP1肽彼此混合，使该自体抗体可与该人工合成肽在一免疫反应中反应而形成一复合物，而侦测出该生物样本中的自体抗体。较佳是，该人工合成β-2-GP1肽包含一与序列编号：3、序列编号：5、序列编号：7、序列编号：11或序列编号：12之序列至少80％相同的氨基酸序列。更明确的说，该人工合成β-2-GP1肽包含一与序列编号：3、序列编号：5、序列编号：7、序列编号：11或序列编号：12之序列至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一最佳实施方式中，此人工合成β-2-GP1肽包含一与序列编号：3之序列至少90％相同的氨基酸序列。序列间的相同百分比代表将一序列与一特定长度之目标多肽序列比较时，在一连续直线序列中相同氨基酸数目的多寡。在本文中，所谓一序列的「相同」代表在两条不同的序列中，互相进行比较的氨基酸残基相同。因此，100％相同代表当比较两条不同多肽中的20个氨基酸时，在两条不同多肽中的20个氨基酸完全相同。在本文中所述的生物样本包括，但不限于，皮肤切片样本、全血样本、血清样本、血浆样本、尿液样本、黏液样本及其之纯化或过滤后的形式。

可利用习知技术来侦测抗体的结合，例如利用放射线免疫分析、酵素连接之免疫吸附物分析(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、「三明治」式免疫分析、原位免疫分析(例如，利用胶体金、酵素或放射线同位素标定等)、西方墨点法、凝集分析(例如，胶体凝集分析、血液凝集分析等)、补体固定分析、免疫荧光分析和免疫电泳分析等等。在一实施例中，利用ELISA来侦测抗体结合。在一实施例中，自体抗体包含免疫球蛋白A(IgA)。在某些实施例中，这些自体抗体是从体液中测得，包括，但不限于，全血、血清、血浆、尿液、黏液及其之纯化或过滤后的形式。在一较佳实施例中，这些自体抗体是从血浆样本中测得。在其他实施方式中，也可从能显示皮肤中白血球与IgA沉降的皮肤切片样本中测得这些自体抗体。

为了提供此领域具有通常知识水平的人恰当可使用本揭示内容之工具，特为研发了组装有本揭示内容该些人工合成β-2-GP1肽的检测试剂盒，用以诊断、侦测或确认HSP。在较佳的实施方式中，以可与本揭示内容该些人工合成β-2-GP1肽反应的自体抗体之有无，作为一个体之预诊用途。举例来说，相较于对照组，当侦测到样本中含有高量能与该些人工合成β-2-GP1肽反应的自体抗体时，即代表有HSP。诊断所提供的信息，也可用来引导将来治疗HSP的方向。举例来说，如果发现一个体身上存在有能自体抗原(即，β-2-GP1)反应的自体抗体时，即可在对HSP治疗还有效的初期，及早开始HSP的治疗。

在一实施方式中，本发明提供利用至少一人工合成β-2-GP1肽做为诊断HSP的检验试剂盒。试剂盒中包含以下组件：一容器；多种试剂，以便侦测一生物样本中的一自体抗体，其中该些试剂包含依据本揭示内容所制备而成之至少一种人工合成的β-2-GP1肽，且该肽包含一与序列编号：3、序列编号：5、序列编号：7、序列编号：11或序列编号：12之序列至少80％相同的氨基酸序列；以及指示说明书，例如书面说明、录音或录像带、VCR、CD-ROM等用来执行检验试剂盒中各分析试验的说明。此检验试剂盒还可更包含一负对照组，用来代表一健康人体内可与该人工合成的β-2-GP1肽形成复合物的自体抗体之量，其中该人工合成的β-2-GP1肽包含一与序列编号：3、序列编号：5、序列编号：7、序列编号：11或序列编号：12之序列至少80％相同的氨基酸序列。

除非另行定义，文中所使用之所有专业与科学用语与习知技艺者所熟悉之意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等之方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述之较佳实施方法与材料仅做示范之用。于本申请书中所提到之所有参考文献均全体纳入参考，以揭露并叙述该文献所记载之相关方法及/或材料。此外，文中所讨论之文献仅揭露本发明申请日前之习知技术。并且无任何文献显示本发明内容曾为习知技术所揭露。本发明内容所得到之实际数据会因个别的实施条件而与本发明揭露于说明书内容中之数据有所不同。

须知若无特别于上下文中清楚记述其他意义，则说明书内容及后附申请专利范围中所使用之如「一(“a”or“an”)」与「该(the)」等特定用语均包含其复数形态。

以下将详细说明本揭示内容较佳实施方式，这些实施方式的实例已绘示在附随图示中。各图标中相同组件以相同组件号码表示。

实施例

以下实施例是用来阐明本揭示内容特定态样并帮助习知技艺者了解并实施本揭示内容。但本揭示内容范畴并不限于这些实施例中。

材料与方法

患者在本研究中，纳入25位在台大医院登入且被诊断为急性HSP之儿童患者(诊断是依据美国风湿病学院1990年颁定标准来判定的(Mills JA et al.，Arthritis Rheum 199033：1114-1121))，以及另外23位年龄、性别相仿之健康儿童做为对照组。另外，并从15位处于缓解期之患者身上收集血清样本。

侦测抗-心肌脂抗体  简言之，在96孔盘(Coaster，Cambridge，MA，USA)中的每一孔中涂布浓度为50μg/ml之溶于乙醇中的心肌脂(cardiolipin)，然后风干。在4℃下进行隔夜培育，接着加入10％溶于磷酸缓冲液(PBS，pH 7.4)之牛血清。然后，加入从患者身上收集的血浆样本(对IgG和IgM来说，稀释比例为1∶100，对IgA来说，稀释比例为1∶50)和IgA部分(如指定浓度)，每一浓度执行二重复，然后在室温下培育1.5小时。同时，以相同浓度之健康人IgA(多人混合)(JacksonImmunoResearch，West Grove，PA，USA)做为负对照组。以TBS清洗后，利用HRP-共轭之山羊抗-人类IgG/A/M(BioSource International，Camarillo，CA，USA)和过氧化酶受质-四甲基beezidine(Kirkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg，MD，USA)来侦测已结合的人类IgG/A/M。以Thermomax读盘机(Molecular Devices Inc.，Sunnyvale，CA，USA)在波长450nm下来读取结果，背景值则是在波长650nm下读取。

侦测抗-内皮细胞抗体(AECA)  在涂布有明胶的96-孔微价盘中(Nunc^TM，Demark)，以1x10⁵个细胞/孔的浓度，将人类脐静脉内皮细胞(human umbilical venous endothelial cells，HUVEC)加到每一培养孔中，接着进行培育。经过3-4天培育，当细胞生长至几近全满时(confluent)，在室温下以0.2％的戊二醛(溶于PBS中)将细胞固定约10分钟，然后加入1％溶于磷酸缓冲液之牛血清白蛋白(BSA/PBS)，在37℃下反应约1小时。以PBS清洗，分别加入血浆样本(以1％的BSA/PBS进行稀释，对IgG和IgM来说，稀释比例为1∶100，对IgA来说，稀释比例为1∶50)，在37℃下培育2小时。以TBS清洗后，利用HRP-共轭之山羊抗-人类IgG/A/M(BioSource International，Camarillo，CA，USA)和过氧化酶受质-四甲基beezidine(Kirkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg，MD，USA)来侦测已结合的人类IgG/A/M。以Thermomax读盘机(Molecular DevicesInc.，Sunnyvale，CA，USA)在波长450nm下来读取结果，背景值则是在波长650nm下读取。

侦测β-2-GP1抗体  简言之，在96孔的高结合性盘(Coaster，Cambridge，MA，USA)的每一孔中涂布浓度为10μg/ml之溶于Tris缓冲液(TBS，0.05M Tris-HCl和NaCl，pH 7.5)中的β-2-GP1(HaematologicTechnologies，Essex Junction，VT，USA)或是其他不相关的蛋白质(凝血酶原和OVA)，然后风干。在4℃下进行隔夜培育，接着加入内含0.3％明胶的TBS溶液。然后，加入从患者身上收集的血浆样本(对IgG和IgM来说，稀释比例为1∶100，对IgA来说，稀释比例为1∶50)和IgA部分(如指定浓度)，均溶于TBS/0.1％明胶中，每一浓度执行二重复，然后在室温下培育1.5小时。同时，以相同浓度之健康人IgA(多人混合)(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA，USA)做为负对照组。以TBS清洗后，利用HRP-共轭之山羊抗-人类IgG/A/M(BioSource International，Camarillo，CA，USA)和过氧化酶受质-四甲基beezidine(Kirkegaard & PerryLaboratories，Gaithersburg，MD，USA)来侦测已结合的人类IgG/A/M。以Thermomax读盘机(Molecular Devices Inc.，Sunnyvale，CA，USA)在波长450nm下来读取结果，背景值则是在波长650nm下读取。

纯化IgA抗体  以可结合半乳糖之lectin来分离血清中IgA的商用试剂盒，Immobilized Jacan(PIERCE，USA)，从7份对CL和β-2-GP1呈现正反应的血浆样本中，分离出循环之IgA免疫蛋白。

制备人工合成之β-2-GP1衍生性肽  为了找出β-2-GP1上可与自体抗体结合的抗原表位，随机将β-2-GP1分成15段的肽断片，每一肽断片间可有或无重迭的氨基酸残基，然后，利用自动化固相肽合成仪(ABI433A peptide synthesizer，Applied Biosystems Inc.，Life Technologies Corp.，Foster City，CA，USA)，并依据设备商所提供的标准流程(依据N-9-芴甲氧基羰基化学)来合成这些β-2-GP1的衍生肽，每一肽的一级结构揭示于表1中。

利用配备有半制备性十八烷基管柱(C18 column)的逆相高效率液态管柱层析(RP-HPLC)来纯化所合成的β-2-GP1肽。RP-HPLC中的移动相乃是内含0.1％三氟乙酸(TFA)的丙烯腈/水溶剂系统，在波长220nm下侦测并记录每一波峰。收集每一次纯化后的流出物并将组成份相同者合并，然后利用真空亲液性处理回收。所收集的每一肽的最终纯度则是以分析性RP-HPLC来决定，其纯度可达到95％甚至更高。举例来说，序列编号：11之合成肽的纯度就高达95.23％。将合成肽保持在-20℃的冷冻状态下，直到使用时才解冻。

以电喷洒离子化质谱仪(electrospray ionization mass spectroscopy，ESI-MS)来确认所纯化的β-2-GP1肽的分子量。举例来说，以ESI-MS测定之序列编号：11之合成肽的分子量为6244.4Da(其理论分子量为6247.2Da)。

表1人工合成之β-2-GP1衍生肽

侦测IgA抗-β-2-GP1衍生肽抗体简言之，在96孔的高结合性盘(Coaster，Cambridge，MA，USA)的每一孔中涂布浓度为10μg/ml之溶于Tris缓冲液(TBS，0.05M Tris-HCl和NaCl，pH 7.5)中的β-2-GP1肽1-15，然后风干。在4℃下进行隔夜培育，接着加入内含0.3％明胶的TBS溶液。然后，加入从患者身上收集的血浆样本(对IgA来说，稀释比例为1∶50)和IgA部分(如指定浓度)，均溶于TBS/0.1％明胶中，每一浓度执行二重复，然后在室温下培育1.5小时。同时，以相同浓度之健康人IgA(多人混合)(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA，USA)做为负对照组。以TBS清洗后，利用HRP-共轭之山羊抗-人类IgG/A/M(BioSourceInternational，Camarillo，CA，USA)和过氧化酶受质-四甲基联苯胺(Kirkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg，MD，USA)来侦测已结合的人类IgG/A/M。以Thermomax读盘机(Molecular Devices Inc.，Sunnyvale，CA，USA)在波长450nm下来读取结果，背景值则是在波长650nm下读取。

结果

β-2-GP1是急性HSP的抗原

本研究发明人发现，相较于健康人，被诊断出急性HSP的患者体内有相当高浓度的IgA抗-心肌脂(IgA aCL)(第1图)、IgA抗-内皮细胞(IgAAECA)(第2图)、和IgA抗-β-2-GP1抗体(第3图)，且IgA抗-β-2-GP1抗体与IgA aCL或IgA AECA任一者均有相关性，暗示β-2-GP1可能是引起急性HSP的抗原，因此，可做为一种用来诊断及侦测HSP患者的生物标记。

为了确认β-2-GP1是引发HSP的抗原或是可做为将来诊断及侦测HSP患者的生物标记，从7位体内表现出高量IgA抗-心肌脂抗体及IgA抗-β-2-GP1抗体的患者身上收取血清并分离出总IgA，接着移除其中不相关的血清蛋白。确认纯化后的IgA抗体会和β-2-GP1结合，而非心肌脂(第5A及5B图)。进一步分析两名HSP患者的血清样本(在此称为IgA1与IgA2)，显示IgA与β-2-GP1间的结合呈现剂量相关(第5C及5D图)，所结合的IgA抗-β-2-GP1抗体复合物的量会随着IgA浓度上升而上升。以另外两种不相关蛋白质，卵白蛋白(OVA)和凝血酶原作负对照组，确认IgA自体抗体与β-2-GP1间的结合具有专一性。详言之，将上述的血清样本(以下称IgA2与IgA6)混合并分别与OVA和凝血酶原反应，发现IgA自体抗体与OVA或凝血酶原间的结合量非常低，可以忽略不计。

β-2-GP1肽是有用的抗原或是可做为侦测或诊断HSP的生物标记

为了找出β-2-GP1上可与自体抗体结合的抗原表位，随机将β-2-GP1分成15段的肽断片，并依据上述实施方式分别合成出15段β-2-GP1之肽断片。将所合成的β-2-GP1肽断片分别称为P1至P15，并分别给予序列编号：1至15之编号。

依据以上所述方式进行结合分析，结果显示患有急性HSP之儿童血浆中IgA抗-β-2-GP1肽(包括P3、P5、P7、P11和P12，每一肽的序列编号分别为序列编号：3、5、7、11和12)抗体的量，明显高于健康儿童体内的量(以OD表示，p＜0.0001)，其中又以人工合成肽P3的结合强度最高(参见第7、8和9图)。

产业利用性

本揭示内容提供利用专一性抗原或生物标记(即，β-2-GP1衍生肽)而能早期侦测或诊断HSP患者之一种新颖且快速的解决方案。依据本揭示内容所制成的这些人工合成肽、方法和试剂盒，让临床医师可依据客观性标准或标记(即，β-2-GP1衍生肽)，而非较主观性的判断，例如，依据临床医师的经验和病症发展的变化所做的判断，而能轻易地侦测或诊断出患有HSP或疑似患有HSP之病患。

虽然本揭示内容已以实施方式揭露如上，然其并非用以限定本揭示内容，任何熟习此技艺者，在不脱离本揭示内容之精神和范围内，当可作各种之更动与润饰，因此本揭示内容之保护范围当视后附之申请专利范围所界定者为准。

Claims (14)

1.一种人工合成肽，包含一氨基酸顺序，其与任一选自序列编号：3、序列编号：5、序列编号：7、序列编号：11及序列编号：12群组中之序列的氨基酸顺序至少80％相同。

2.如权利要求1所述之人工合成肽，其中该些肽在一免疫分析中可与一患有或疑似患有过敏性紫斑症的患者体内之一自体抗体形成一复合物。

3.如权利要求2所述之人工合成肽，其中该免疫分析是一种酵素连接之免疫吸附物分析(ELISA)。

4.如权利要求2所述之人工合成肽，其中该自体抗体是一种IgA。

5.一种用来侦测或诊断出患有HSP或疑似患有HSP之个体的方法，包含：

自该个体取得一生物样本；及

将该生物样本与权利要求1所述之人工合成肽混合，使得该生物样本中的一自体抗体可与该人工合成肽在一免疫反应中彼此反应而形成一复合物，因而侦测出该生物样本中的该自体抗体。

6.如权利要求5所述之方法，其中该人工合成肽包含一与序列编号：3、序列编号：5、序列编号：7、序列编号：11及序列编号：12群组中之序列的氨基酸顺序至少90％相同之氨基酸序列。

7.如权利要求6所述之方法，其中该人工合成肽包含一与序列编号：3之氨基酸序列至少90％相同之氨基酸序列。

8.如权利要求5所述之方法，其中该免疫分析是一种酵素连接之免疫吸附物分析(ELISA)。

9.如权利要求5所述之方法，其中该自体抗体是一种IgA。

10.如权利要求5所述之方法，其中该生物样本是选自以下群组：皮肤切片样本、全血样本、血清样本、血浆样本、尿液样本、黏液样本及其之纯化或过滤后的形式。

11.一种可用来侦测或诊断出患有HSP或疑似患有HSP之个体的检验套组，包含：

一容器；

如权利要求1所述之人工合成肽；及

一说明书，放在该容器中，用来说明如何使用该人工合成肽，来侦测该个体之一生物样本中的一自体抗体。

12.如权利要求11所述之检验套组，其中该人工合成肽包含一与序列编号：3、序列编号：5、序列编号：7、序列编号：11及序列编号：12群组中之序列的氨基酸顺序至少90％相同之氨基酸序列。

13.如权利要求11所述之检验套组，其中该自体抗体是一种IgA。

14.如权利要求11所述之检验套组，其中该生物样本是选自以下群组：皮肤切片样本、全血样本、血清样本、血浆样本、尿液样本、黏液样本及其之纯化或过滤后的形式。

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