CN111065924A - β-2-糖蛋白1衍生肽及其用于治疗抗磷脂综合征的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种含有结合抗磷脂抗体(aPLA)并且被能够诱导产生抗磷脂抗体(aPLA)的CD4+ T细胞识别的基序的分离肽。本发明还提供了检测aPLA和能够诱导产生aPLA的CD4+ T细胞的方法。本发明还提供了治疗抗磷脂综合征(APS)的方法。

Description

β-2-糖蛋白1衍生肽及其用于治疗抗磷脂综合征的用途
技术领域
本发明提供一种含有结合抗磷脂抗体(aPLA)并且被能够诱导产生抗磷脂抗体(aPLA)的CD4+T细胞识别的基序的分离肽。本发明还提供了检测aPLA和能够诱导产生aPLA的CD4+T细胞的方法。本发明还提供了治疗抗磷脂综合征(APS)的方法。
背景技术
抗磷脂综合征(APS)被描述为由循环抗磷脂抗体(aPLA)导致的复发性血栓栓塞事件和/或妊娠并发症的常见危险因素1。现在普遍认为血浆磷脂结合蛋白β-2-糖蛋白1(β2GP1)是aPLA的主要抗原靶点2。β2GP1是由被称为“寿司(sushi)”结构域的5个短的共有重复域组成的43kDa的蛋白质。β2GP1存在两个不同的构象：环形等离子体构象和鱼钩形构象3。在结构域I和结构域V中的表位参与维持环形构象，而结构域V与阴离子表面的结合则在结构域I中诱导了鱼钩形构象和隐蔽表位的暴露3，4。该隐蔽表位被描述为位于第39位和第43位周围；然而，Iverson等人已经确定了在结构域I中参与致病的抗β2GP1抗体识别的额外残基5，6。Ioannou等人也研究了包括残基R39至R43在内的突变，这些残基描述了复杂且可能不连续的表位7。他们的数据表明表位并非是“经典的”，或几个表位存在于结构域I中并且甚至可能存在于β2GP1中的其它位置。
APS的体液免疫生理学研究和用抗CD20单克隆抗体(rituximab)治疗APS患者引起了人们对B细胞作为治疗靶点的兴趣。抗CD20治疗的APS患者具有抗β2GP1、抗心磷脂(aCL)和狼疮抗凝物(LAC)抗体滴度的正态分布，以及改善的临床症状8。抗β2GP1抗体的亚型主要是IgG，这表明这些抗体的产生需要抗原特异性CD4+T辅助细胞9。Hattori等人已经表明β2GP1诱导来自APS患者的T细胞的体外增殖反应。这些β2GP1特异性CD4+T细胞能够通过HLA-DR相互作用诱导自体外周血B细胞产生抗β2GP1抗体10，11。β2GP1上主要的T细胞表位的身份尚未确定。似乎所有五个β2GP1结构域能够诱导取决于APS患者的T细胞增殖反应11。此外，源自β2GP1的肽库的T细胞反应的分析表明，CD4+T细胞对不同肽的反应与HLA无关12。尽管诱导T细胞增殖的特定结构域和肽还没有明确定义，先前研究已经证明了β2GP1特异性T细胞存在于APS患者中10，12。因此，仍然需要鉴定APS患者中的β2GP1结构域特异性T细胞。此外，虽然使用了不同的工具，但目前APS患者的诊断仍是费时费力的。因此，需要一种能够改进APS诊断，特别是具有高敏感性和高特异性的诊断的诊断工具和方法。
发明内容
因此，本发明的一个方面提供了具有氨基酸序列SEQ ID NO：51的分离肽：
X1-X2-X3-X4-X5-F-X7-X8
其中，
X1、X2、X3和X8是非极性氨基酸残基，各自独立地选自包括A、V、I、L、M、F、W、C、P和G的组，
X4和X5是极性氨基酸残基，各自独立地选自包括Y、T、S、H、K、R、E、D、Q和N的组，
X7是选自包括A、V、I、L、M、F、W、C、P、G、Y、T、S、H、K、R、E、D、Q和N的组的氨基酸残基。
本发明的另一个方面提供了包含MHC II类分子和本发明的肽的MHC组合物。
本发明的另一个方面提供了一种药物组合物，其包含有效预防、减少或抑制需要其的受试者的抗磷脂综合征(APS)的一个或多个症状的量的本发明的肽，和用于施用所述肽的药学上可接受的载体。
本发明的另一个方面提供了一种用于治疗受试者的抗磷脂综合征(APS)的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明的MHC组合物。
本发明的另一个方面提供了本发明的MHC组合物，其用于治疗抗磷脂综合征(APS)。
本发明的另一个方面提供了一种用于预防和/或抑制受试者的抗磷脂综合征(APS)的一个或多个症状的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明的肽或本发明的药物组合物。
本发明的另一个方面提供了本发明的肽，其用于用于预防和/或抑制抗磷脂综合征(APS)的一个或多个症状的方法。
本发明的另一个方面提供一种用于诊断受试者的抗磷脂综合征(APS)的方法，其中，在来自受诊断的受试者的样本中检测存在或不存在抗磷脂抗体(aPLA)，并且其中，抗磷脂抗体的存在意味着APS疾病，并且其中，使用免疫测定检测抗磷脂抗体，包括以下步骤：
(i)提供样本；
(ii)在允许抗磷脂抗体与本发明的肽形成复合体的条件下，使本发明的肽与样本接触；
(iii)检测复合体。
本发明的另一个方面提供了一种用于检测样本中存在抗磷脂抗体的方法，包括：
(i)提供样本，
(ii)在允许抗磷脂抗体与本发明的肽形成复合体的条件下，使本发明的肽与样本接触；
(iii)使用免疫测定检测复合体。
本发明的另一个方面提供了本发明的肽用于检测抗磷脂抗体的用途。
本发明的另一个方面提供了一种用于诊断受试者的抗磷脂综合征(APS)的方法，其中，在来自受诊断的受试者的样本中检测存在或不存在能够诱导抗磷脂抗体的产生的CD4+T细胞，并且其中，所述CD4+T细胞的存在意味着APS疾病，包括以下步骤：
(i)提供样本；
(ii)使样本与本发明的MHC组合物接触；
(iii)通过测量所述组合物与所述样本中的CD4+T细胞的结合来检测CD4+T细胞，其中，组合物与CD4+T细胞的结合意味着所述样本中存在CD4+T细胞。
本发明的另一个方面提供了本发明的MHC组合物用于检测、制备或消耗CD4+T细胞的用途。
本发明的另一个方面提供了一种用于检测样本中存在或不存在抗磷脂抗体的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的肽。
本发明的另一个方面提供了一种用于检测样本中存在或不存在能够诱导产生抗磷脂抗体的CD4+T细胞的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的MHC组合物。
附图说明
图1显示了结构域I-II和简并的(reduced)β2GP1诱导APS患者的T细胞增殖。(A)通过免疫印迹纯化并分析β2GP1重组结构域。数据代表三次独立的实验。(B-D)在结构域I-II、II-IV、Vβ2GP1、简并的β2GP1和破伤风毒素(TTx)存在的情况下，对APS患者的PBMC进行增殖测定的流式细胞术分析。CD3-CD28是阳性增殖对照。CD4+CFSElow群体位于CD3+细胞上。数据是9个不同供体的平均值±SEM。统计显著性通过Mann-Whitney U分析确定。
图2显示了β2GP1的肽1携带有用于CD4+T细胞增殖的抗原决定簇。(A)用于增殖测定的肽分布的表。(B)在池(pool)I、池II或池III存在的情况下，对APS患者的PBMC进行增殖测定的流式细胞术分析。CD3-CD28显示了阳性增殖对照。(C)在p1(SEQ ID NO：32)、p4(SEQID NO：35)、p6(SEQ ID NO：33)、p10(SEQ ID NO：44)和p11(SEQ ID NO：45)存在的情况下对APS患者的PBMC进行增殖测定的流式细胞术分析。CD3-CD28是阳性增殖对照。CD4+CFSElow群体位于CD3+细胞上。数据是9个不同供体的平均值±SEM。统计显著性通过Mann-Whitney U分析确定。(D)对用重组结构域I-II脉冲的APS患者的PBMS上的载有p1(SEQ ID NO：32)的染色的pMHC II类四聚体进行的流式细胞术分析。pMHC-OVA(卵清蛋白)、pMHC-TTx(破伤风毒素)是阴性对照。群体位于CD3+细胞上。
图3显示了包含X1-X2-X3-X4-X5-F-X7-X8基序的aPLA表位。IgG ctl(对照)或aPLA与肽包被的孔结合的代表性图片。aPLA与p1-(SEQ ID NO：32)、p6-(SEQ ID NO：33)、p4-(SEQID NO：35)和p3-(SEQ ID NO：39)包被的孔结合的定量。数据是9个不同供体的平均值±SEM。统计显著性通过Mann-Whitney U分析确定。
图4显示了包含基序的结构域和肽抑制aPLA活性。(A)结构域I-II、III-IV、V、简并的β2GP1的β2GP1抑制aPLA诱导的TNF产生。(B)IgG ctl(对照)或aPLA与结构域I-II、III-IV、V和β2GP1包被的孔结合的代表性图片。aPLA与结构域I-II、III-IV、V或β2GP1包被的孔结合的定量。aPLA与结构域I-II、III-IV、V、简并的β2GP1的β2GP1包被的孔结合。(C)aPLA诱导的TNF产生被结构域I-II(SEQ ID NO：37)、p1(SEQ ID NO：32)、p4(SEQ ID NO：35)、p6(SEQ ID NO：33)、p10(SEQ ID NO：44)和p11(SEQ ID NO：45)抑制。(D)IgG ctl(对照)或aPLA与结构域I-II、p1、p4、p6、p10和p11包被的孔结合的代表性图片。aPLA与结构域I-II、p1、p4、p6、p10和p11包被的孔结合的定量分析。aPLA与用结构域I-II、III-IV、V、简并的β2GP1的β2GP1包被的孔结合。数据是9个不同供体的平均值±SEM。统计显著性通过Mann-Whitney U分析确定。
具体实施方式
本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用整体并入。仅提供本文所讨论的出版物和申请用于本申请的提交日期之前的公开。本文并无内容将被解释为承认本发明无权凭借在先的发明而提前公布。另外，材料、方法和实例仅为说明性的，并不旨在限制。
在冲突的情况下，以包括定义的本说明书为准。除非另外限定，本文所使用的全部技术和科学术语都具有与本发明所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。如本文所使用的，提供以下定义以促进对本发明的理解。
术语“包含/包括”通常在含有的意义上使用，也就是说，允许存在一个或多个特征或组分。正如在说明书和权利要求书中所使用的，术语“包含/包括”可以包括“由......组成”和/或“基本由......组成”有关方面描述的类似实施方案。
如本说明书和权利要求书中所用，单数形式的不定冠词“a”、“an”和定冠词“the”包括复数指代对象，上下文另有明确指示除外。
如说明书和权利要求书中所使用的，在例如本文的“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”、和“B”。
如本文所用，“氨基酸分子”或“氨基酸残基”是指本领域已知的任何天然存在的氨基酸、任何氨基酸衍生物或任何氨基酸模拟物，包括修饰的或不常见的氨基酸。在某些实施方案中，肽的残基是连续的，没有任何非氨基酸中断氨基酸残基的序列。在其他实施方案中，该序列可以包含一个或多个非氨基酸部分，例如接头。
如本文所用，术语“受试者”或“患者”在本领域中是众所周知的，并且在本文中可互换使用以指哺乳动物，包括狗、猫、大鼠、小鼠、猴、牛、马、山羊、绵羊、猪、骆驼，最优选为人类。在一些实施方案中，所述受试者是需要治疗的受试者或患有疾病或病症例如抗磷脂综合症(APS)的受试者。在其他实施方案中，受试者是需要预防和/或抑制抗磷脂综合征(APS)的症状的受试者。该术语不表示特定的年龄或性别。因此，旨在覆盖成年和新生受试者，无论是男性还是女性。
本发明是基于令人惊讶的发现，即用于抗磷脂抗体(aPLA)和CD4+T细胞的结合肽表位是由氨基酸的极性而不是由氨基酸序列决定的。实际上，已经表征了触发CD4+T细胞增殖的β2GP1的结构域I中的序列。将该序列与先前报道的aPLA结合的不连续表位R39-R43进行比较，发现在β2GP1中存在不确定的基序，其中极性决定了与aPLA相互作用的基序的特征和特异性。体外研究已经进一步证明了含有这些基序的β2GP1的肽和结构域能够与aPLA相互作用并抑制其单核细胞活化活性。这样的发现令人惊讶地提供了高灵敏度和高特异性的诊断工具和治疗方法。
本发明的一个方面提供了具有氨基酸序列SEQ ID NO：51的分离肽：
X1-X2-X3-X4-X5-F-X7-X8
其中，
X1、X2、X3和X8是非极性氨基酸残基，各自独立地选自包括A、V、I、L、M、F、W、C、P和G的组。在一些优选的实施方案中，X8是C氨基酸残基，
X4和X5是极性氨基酸残基，各自独立地选自包括Y、T、S、H、K、R、E、D、Q和N的组，
X7是任意的氨基酸残基，优选任何天然L-氨基酸残基，更优选地，X7是选自包括A、V、I、L、M、F、W、C、P、G、Y、T、S、H、K、R、E、D、Q和N的组的任意氨基酸残基。
本发明的分离肽可以具有反向的氨基酸序列(从C-末端至N-末端读取)，即X8-X7-F-X5-X4-X3-X2-X1(SEQ ID NO：52)。
在一些优选的实施方案中，本发明的分离肽具有选自包括ILFSSFLC(SEQ ID NO：27)、GGMRKFIC(SEQ ID NO：28)、PVVTSFPL(SEQ ID NO：29)、ILFASFLC(SEQ ID NO：30)、GGMRAFIC(SEQ ID NO：31)的组的序列。
在其他优选的实施方案中，本发明的分离肽具有选自包括SEQ ID Nos：5至31、48、49和50的组的序列。
在其他实施方案中，本发明的分离肽还包含在N-末端和/或C-末端的接头，其中在N-末端和/或C-末端的接头独立地选自包括具有至少3个氨基酸残基的长度的接头肽序列、聚合物或其组合的组。在一些优选的实施方案中，接头肽序列包含任何氨基酸残基，优选任何天然L-氨基酸残基，或选自包括聚Gly和富含Gly的接头、16-氨基酸的富含Gly的接头(GGGGSLVPRGSGGGGS)(SEQ ID NO：1)、8-氨基酸的富含Gly的接头(GSGSGS)(SEQ ID NO：2)、GSGGGTGGGSG(SEQ ID NO：3)、PLTG(SEQ ID NO：59)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：60)、GGGGS(SEQ ID NO：61)、GGGGSGGGGSVSR(SEQ ID NO：62)、GGGGSVSR(SEQ ID NO：63)、PLTGGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：64)的组。在其他优选实施方案中，聚合物选自包括DSG、DSS、BS3、TSAT(三官能团的)、BS(PEG)5、BS(PEG)9、DSP、DTSSP、DST、BSOCOES、EGS、磺基-EGS、DMA、DMP、DMS、DTBP、DFDNB、BMOE、BMB、BMH、TMEA(三官能团的)、BM(PEG)2、BM(PEG、)3、DTME、AMAS、BMPS、GMBS和磺基-GMBS、MBS和磺基-MBS、SMCC和磺基-SMCC、EMCS和磺基-EMCS、SMPB和磺基-SMPB、SMPH、LC-SMCC、磺基-KMUS、SM(PEG)2、SM(PEG)4、SM(PEG)6、SM(PEG)8、SM(PEG)12、SM(PEG)24、SPDP或SPDP、LC-SPDP和磺基-LC-SPDP、SMPT、PEG4-SPDP、PEG12-SPDP、SIA、SBAP、SIAB、磺基-SIAB、ANB-NOS、磺基-SANPAH、ATFB、SDA和磺基-SDA、LC-SDA和磺基-LC-SDA、SDAD和磺基-SDAD、DCC、EDC或EDAC、BMPH、EMCH、MPBH、KMUH、PDPH、PMPI、SPB的组。
在一些实施方案中，在N-末端和/或C-末端的接头肽序列独立地选自包括GGGGSLVPRGSGGGGS(SEQ ID NO：1)、GSGSGS(SEQ ID NO：2)、GSGGGTGGGSG(SEQ ID NO：3)、PLTG(SEQ ID NO：59)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：60)、GGGGS(SEQ ID NO：61)、GGGGSGGGGSVSR(SEQ ID NO：62)、GGGGSVSR(SEQ ID NO：63)、PLTGGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：64)的组。
在其他实施方案中，在N-末端和/或C-末端的接头肽序列独立地选自包括GGGGSLVPRGSGGGGS(SEQ ID NO：1)、GSGSGS(SEQ ID NO：2)、GSGGGTGGGSG(SEQ ID NO：3)的组。
所描述的接头可操作地连接两个感兴趣的肽/多肽，使得通过接头连接的多肽的表达和活性(例如，抗体结合和/或受体结合)是持久且最佳的。
本文所述的接头是指设计为用于连结(例如，结合、连接)两个蛋白质序列的肽序列，其中所述接头通常本质上不布置在两个蛋白质或肽序列之间。在本发明的上下文中，短语“连接的”或“结合的”或“连结的”通常是指两个连续或相邻的氨基酸序列之间的功能性连接，以产生自然界中通常不存在的多肽。通常，连接的肽是连续的或彼此相邻，并且在结合时保留它们各自的可操作性和功能。接头也称为间隔区。
接头肽序列可以具有任何合适的长度以连接一个或多个感兴趣的蛋白质，并且优选地被设计为足够柔性，以允许连接的一个或两个肽的适当折叠和/或功能和/或活性。因此，接头肽的长度可以为不超过3个、不超过5个、不超过10个、不超过15个、不超过20个、不超过25个、不超过30个、不超过35个、不超过40个、不超过45个、不超过50个、不超过55个、不超过60个、不超过65个、不超过70个、不超过75个、不超过80个、不超过85个、不超过90个个、不超过95个、或不超过100个氨基酸。在一些实施方案中，接头肽可以具有至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少15个、至少18个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、或至少50个氨基酸的长度。在一些实施方案中，接头包含至少3个且不超过60个氨基酸、至少3个且不超过55个氨基酸、至少3个且不超过50个氨基酸、至少3个且不超过45个氨基酸、至少3个且不超过40个氨基酸、至少3个且不超过35个氨基酸、至少3个且不超过30个氨基酸、至少3个且不超过25个氨基酸、至少3个且不超过20个氨基酸、或至少3个且不超过15个氨基酸。在某些实施方案中，接头包含3至20个氨基酸，并且在具体实施方案中，包含3和4个氨基酸。在包含接头的多肽组合物中，接头肽序列(例如氨基酸序列)的5′端(例如末端)与一个蛋白质序列(例如全长蛋白质或蛋白质结构域、片段或变体)的3′端相邻并共价连接，以及接头氨基酸序列的3′端与另一个蛋白质序列的5′端相邻并共价连接。以这种方式产生的多肽组合物通常被称为融合或嵌合蛋白/多肽，并且通常通过在适当的系统中表达(例如转录、翻译)编码该多肽组合物的核酸序列来制备。制备融合和/或嵌合多肽的方法是本领域众所周知的(参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Springs HarborLaboratory，1992，纽约)，其全部内容通过引用并入本文。
在一个优选的实施方案中，本发明的分离肽包含至少15个氨基酸残基。在另一个优选的实施方案中，本发明的分离肽包含20个氨基酸残基。
本发明中的术语“肽”表示通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羧基之间的肽键彼此连接的一系列氨基酸残基，通常为L-氨基酸。本发明优选的肽的长度为15或20个残基，并且通常由5至30个氨基酸残基组成，优选为由8至20个氨基酸残基组成。在某些实施方案中，本发明的至少一个肽的大小可以包括但不限于约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约11个、约12个、约13个、约14个、约15个、约16个、约17个、约18个、约19个、约20个、约21个、约22个、约23个、约24个、约25个、约26个、约27个、约28个、约29个、约30个、或更多个氨基酸残基，以及其中可导出的任何范围。
“免疫原性肽”、“免疫原性表位”或“肽表位”是包含等位基因特异性基序或超基序的肽，使得该肽会结合抗磷脂抗体(aPLA)和/或被能够诱导产生抗磷脂抗体(aPLA)的CD4+T细胞识别。
为了鉴定APS患者的β2GP1结构域特异性T细胞，从9例APS患者中分离了PBMC(表1)，并用天然β2GP1、简并的β2GP1和重组β2GP1结构域I-II、重组β2GP1结构域III-IV和重组β2GP1结构域V(图1A)刺激了3个健康对照(HC)。通过5，6-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)稀释测定法来测试PBMC的增殖。与HC相反，在初代培养中检测到CD4+T细胞对APS患者的β2GP1结构域I-II和简并的β2GP1的增殖反应(图1B和1C)。尽管由简并的β2GP1所暴露的隐蔽表位通过在APS患者的正常T细胞库中的β2GP1反应性T细胞识别出，但天然β2GP1不能显著刺激T细胞增殖(图1C)。用破伤风类毒素(TTx)和CD3-CD28-珠子进行增殖控制，即特异性和非特异性T细胞增殖刺激，表明HC和APS产生的T细胞的增殖能力没有改变(图1D)。这些结果表明，β2GP1结构域I-II中存在诱导T细胞增殖的β2GP1肽的核心序列。
表1
提供aPLA的9例患者的临床和实验室资料
Figure BPA0000283956450000111
已经鉴定出β2GP1的含有T细胞决定簇的候选区域，测试了APS患者针对β2GP1肽池的增殖反应。为此，测试了来自APS患者和HC的PBMC针对含有4个至5个β2GP1结构域I-II肽的肽池的增殖，该肽池来自存在于β2GP1结构域I-II的138个氨基酸序列中的13种合成的重叠20-mer肽库(图2A)。通过CFSE稀释测定，鉴定了初代培养物中针对β2GP1结构域I-II肽池III的增殖反应(图2B)。CD3-CD28触发的HC和APC的T细胞增殖显示出相似的反应。β2GP1结构域I-II肽池III包含五种始终不溶于水的肽，具有被β2GP1反应性T细胞识别的表位的隐蔽特征。有趣的是，该肽池包含aPLA靶向的区域，即肽n°6(p6)18。然后检查了对池III中包含的各个β2GP1肽的反应。对前导肽n°1(p1)(SEQ ID NO：32)的T细胞增殖反应显著增强(但对肽n°4、n°6、n°10、或n°11则没有)，而对CD3-CD28，HC的T细胞增殖显示出相似的反应(图2C)。为了证实特异性针对p1(SEQ ID NO：32)的循环T细胞的存在，定义了先前使用的APS患者的HLA II类单倍型资料(表2)。然后将其用于pMHCII-p1四聚体DRB3*02：02染色，以检测来自APS患者的β2GP1结构域I-II脉冲的T细胞群中的特异性循环T细胞。尽管如预期的那样，采用阴性对照pMHC-OVA(带有卵清蛋白肽的四聚体)未观察到群体，但pMHC-p1阳性群体强烈地存在于β2GP1结构域I-II特异性脉冲的T细胞群体中(图2D)。pMHC-TTx染色用作阳性对照(图2D)。这些结果表明，APS患者的免疫显性的β2GP1特异性CD4+T细胞表位存在于对应于MISPVLILFSSFLCHVAIAG(SEQ ID NO：4)的氨基酸序列中，该氨基酸序列对应于β2GP1的信号肽。
表2
来自表1的6例患者的单倍型资料
Figure BPA0000283956450000121
为了鉴定先前报道的含有aPLA结合的不连续表位R39-R43的p1(SEQ ID NO：32)和p6(SEQ ID NO：33)之间潜在的共有基序，将它们的序列进行比对并观察到在苯丙氨酸周围存在一个共同基序。该基序似乎是由固有的物理特性(极性和非极性)决定的，而不是由氨基酸序列决定的。为了研究p1(SEQ ID NO：32)与患者来源的抗β2GP1抗体的相互作用的能力以及鉴定基序中的关键残基，生成了包括共同基序(数据未显示)的p1(SEQ ID NO：32)和p6(SEQ ID NO：33)的丙氨酸扫描库以进行ELISA表位映射分析。aPLA能够结合p1(SEQ IDNO：32)，其结合效力与结合p6(SEQ ID NO：33)一样。p1(SEQ ID NO：32)的突变17A、L8AF9A、S11A、F12A和C14A显著降低了aPLA的结合。类似地，突变R58A(R39)、G59A(G40)、G60A(G41)、M61A(M42)、R62A(R43)、F64A和C66A参与aPLA与p6(SEQ ID NO：33)的结合(数据未显示)。尽管存在于基序中的氨基酸序列不同，但aPLA与两种肽的相互作用相似。似乎与aPLA相互作用的基序(X1-X2-X3-X4-X5-F-X7-X8)对极性或非极性性质的依赖性大于亲水性类别或残基的电荷。丙氨酸是非极性的，但是它降低了aPLA与I7A、L8A、F9A、C14A p1突变的肽以及与R58A、G59A、G60A、M61A、C66A p6突变的肽结合的能力。这些数据表明，氨基酸的大小以及形成静电或氢键的能力也会有助于aPLA与基序之间的相互作用。
然后使用Prosite资源(SIB，瑞士生物信息研究所)进行了生物信息学分析，在人类蛋白质组中发现了X1-X2-X3-X4-X5-F-X7-X8基序(N-末端至C-末端)(SEQ ID NO：51)，以及X8-X7-F-X5-X4-X3-X2-X1基序，其反向基序(C-末端到N-末端)(SEQ ID NO：52)。β2GP1的结构域I中存在四个序列：两个X1-X2-X3-X4-X5-F-X7-C基序(SEQ ID NO：53)和两个X8-X7-F-X5-X4-X3-X2-X1基序(SEQ ID NO：52)(表3)。X8-X7-F-X5-X4-X3-X2-X1基序(SEQ ID NO：52)存在于p1(SEQ ID NO：32)和p3(SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：34)中。因此评估了aPLA与p3(SEQ IDNO：39)相互作用的能力。包括略有不同的基序，该基序存在于p4(SEQ ID NO：35)中，以研究简并(degenerated)的基序是否能够与aPLA相互作用。不出所料，与p1(SEQ ID NO：32)和p6(SEQ ID NO：33)相比，aPLA与p3的结合具有相似的效果(图3)。进一步观察到，尽管p4(SEQID NO：35)与aPLA相互作用的效力较弱，但与它们显著结合(图3)。总而言之，这些数据证明aPLA与X1-X2-X3-X4-X5-F-X7-C基序(SEQ ID NO：53)相互作用，并且更普遍地与X1-X2-X3-X4-X5-F-X7-X8基序(SEQ ID NO：51)相互作用，其中残基的极性比亲水性类别更重要。即使通过在关键苯丙氨酸残基之前或之后插入或删除氨基酸对基序进行了轻微修饰，该基序也可以与aPLA相互作用。最后，aPLA能够以有义(in sense)或反义(anti-senses)结合基序。
表3
存在于aPLA相关受体和蛋白质中的不同基序
Figure BPA0000283956450000141
Vlachoyiannopoulos等人19确定了CD40和p3之间能够与aPLA相互作用的共有基序。尽管此序列在这一对氨基酸(即极性氨基酸和苯丙氨酸)之间具有一个额外的非极性氨基酸(X8-X7-F-NPaa-X5-X4-X3-X2-X1，NPaa＝非极性氨基酸残基)(SEQ ID NO：56)，它与初始基序紧密相关。另外，似乎并不完全需要X1-X2-X3-X4-X5-F-X7-X8基序(SEQ ID NO：51)中存在的两个极性氨基酸(数据未显示)。因此，相对于X8-X7-F-X4-X3-X2-X1(SEQ ID NO：52)和X8-X7-F-NPaa-X5-X4-X3-X2-X1基序(SEQ ID NO：56)进行了额外的生物信息学分析。在含有这些基序的蛋白质中，鉴定了β2GP1结构域I、TLR1、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9和GPIbα(表3)。除了包含基序X1-X2-X3-X4-X5-F-X7-X8(SEQ ID NO：51)和X8-X7-F-X5-X4-X3-X2-X1(SEQ IDNO：52)的鉴定的蛋白质之外，文献中描述的所有潜在的aPLA受体都具有这两个基序中的至少一个。这些结果表明，X1-X2-X3-X4-X5-F-X7-C(SEQ ID NO：53)和其他紧密相关的基序构成了研究aPLA的不同研究小组获得的有争议数据之间的潜在联系。
为了检查β2GP1的重组结构域、p1(SEQ ID NO：32)、p4(SEQ ID NO：35)和p6(SEQID NO：33)抑制从如本文(表1)所示的实验中所研究的APS患者分离的aPLA的活性的功能性能力，评估了用aPLA活化的人单核细胞中TNF的产生，所述aPLA先前已经用肽或重组结构域处理过。虽然将人单核细胞与经β2GP1和简并的β2GP1预处理的aPLA孵育对aPLA的活性没有影响，但将aPLA与结构域I-II、结构域III-IV和结构域V孵育会显著降低由aPLA诱导的TNF产生(图4A)。对TNF产生的这种抑制涉及aPLA与β2GP1、简并的β2GP1、结构域I-II和结构域III的结合，而不是与结构域V的结合(图4B)。同样，与肽n°1、n°4和n°6(p1、p4和p6)进行预孵育可减少由aPLA诱导的TNF的产生，而p10(SEQ ID NO：44)和p11(SEQ ID NO：45)没有效果(图4C)。这种抑制涉及p1、p4和p6与aPLA的相互作用，而不是p10或p11与aPLA的相互作用(图4D)。我们观察到p1和p6具有相似的aPLA结合活性，而p4与aPLA相互作用的效力明显较低(图4D)。这些结果与结构域I-II中存在四个与aPLA相互作用的基序一致，而p1和p6仅具有一个基序(考虑到p1(SEQ ID NO：32)和revp1(SEQ ID NO：48)不是同时可用的)。如图3所示，由于稍微简并的基序，p4与aPLA的相互作用不太有效(图4D和图3A)。综上所述，本文呈现的结果清楚地表明，存在于p1、p4和p6中而不是存在于p10或p11中的aPLA识别的基序能够在功能上降低aPLA的活性。他们进一步证明，结构域III-IV(表3)中存在的与aPLA相互作用的基序(X8-X7-F-X4-X3-X2-X1)(SEQ ID NO：58)与aPLA有效地相互作用并抑制了其活性，尽管程度要小于结构域I-II(SEQ ID NO：37)(图4B)，但证实了表3中暴露的潜在靶标。
本公开涉及与APS患者中针对β2GP1及其相关表位的自身抗体的产生相关的T细胞反应。已经确定，β2GP1信号肽(p1)诱导APS患者而非健康供体的CD4+T细胞增殖。此外，自身反应性CD4+T细胞在APS患者的血液样本中被检测到，并结合了载有p1的HLA-DRB3*02：02四聚体，从而认可了特异性HLA-DR等位基因与APS易感性有关的事实10，20，21。进一步观察到，信号肽包含与R39-R43表位相似的基序。因此，已经确定了与aPLA相互作用的基序(X1-X2-X3-X4-X5-F-X7-X8)(SEQ ID NO：51)更多地取决于极性或非极性性质，而不是氨基酸的亲水性类别。β2GP1的重组结构域以及含有该基序或紧密相关基序的单个肽能够抑制aPLA对人单核细胞的活性。本公开提供了从潜在的aPLA相关受体上获得的有争议结果的有吸引力的解释。X1-X2-X3-X4-X5-F-X7-C(SEQ ID NO：53)和X1-X2-X3-X4-X5-F-X7-X8相关基序(SEQ ID NO：51)确实是存在于文献13中描述的所有aPLA相关受体中(表3)。然而，生物信息学分析表明，X1-X2-X3-X4-X5-F-X7-C基序(SEQ ID NO：53)存在于整个人类蛋白质组内的16种不同蛋白质中并且是可以接近的(表4)。
表4
Figure BPA0000283956450000161
Figure BPA0000283956450000171
尽管公认β2GP1结构域I是aPLA的靶标，但表位的确切序列在很大程度上仍然未知。在此，已经鉴定出X1-X2-X3-X4-X5-F-X7-X8(SEQ ID NO：51)是常见的与aPLA相互作用的基序。虽然在成熟的β2GP1中不存在包含与aPLA相互作用的基序的信号肽(p1)，但CD4+T细胞能够识别p1序列。这表明信号肽可以触发自身免疫反应。一致地，显示出细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)的信号肽中的多态性导致自身免疫倾向22。有趣的是，p1中存在的与aPLA相互作用的基序也存在于revp1中，对应于p1的回文形式。此外，p1触发了APS患者自身反应性T细胞增殖(图2C和2D)。Smith等人23提出蛋白质的互补序列可能在诱导自身免疫中起作用。这一理论被以下发现证实：自身免疫可以通过针对与自身抗原反义或互补的肽的免疫反应、然后诱导与自身抗原交叉反应的抗独特型抗体(自身抗体)而引发24。此外，作为APS致病性的潜在起源，p1的回文序列可以解释aPLA与p3和与结构域III的相互作用，其中，结合序列是反义的。β2GP1中存在六个有义(sense)和反义(antisense)表位。在结构域I中发现其中的五个(表3)，并且这可能是其被鉴定为aPLA的主要相互作用蛋白的原因。
为了解决aPLA结合表位的问题，几个研究小组使用结构域I的点突变进行了表位映射6，7。他们确定了D8、D9、K19、S38、R39、G40、M42、R43和T50是参与(或有助于)aPLA-结构域I相互作用的残基。尽管这些突变中有44％存在于β2GP1结构域I基序中，但如果包括直接与基序相邻的突变，该比例会增加到100％。此外，相邻的突变与基序处于相同的位置6，7。需要进行其他研究以进一步详细定义为达到对aPLA的最高亲和力所需的确切序列，但这些并行研究表明，提出的基序可能会比本研究中暴露的基序稍大。另一个研究小组强调了CD40的239-245位残基与β2GP1的26-32位残基之间的序列同源性19。β2GP1的26-32位残基对应于p3并属于X1-X2-X3-X4-X5-NPaa-F-X7-X8基序(SEQ ID NO：55)的X1-X2-X3-X4-X5(SEQ ID NO：57)部分(图3和图5)。已显示用一组微生物制剂免疫的小鼠产生了高滴度的抗β2GP1抗体。该细菌组由六种不同的制剂组成，其中包括肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)或流感嗜血杆菌(haemophilus infiuenzae)26。使用生物信息学分析(Prosite资源，SIB)，已发现用于不同制剂的所有细菌菌株均携带X1-X2-X3-X4-X5-F-X7-C基序(SEQ ID NO：53)。不仅细菌菌株而且病毒毒株都携带X1-X2-X3-X4-X5-F-X7-C基序(SEQ ID NO：53)。包括具有已确立APS或具有血栓栓塞现象的APS的患者在内的一些案例或临床研究表明，aPLA水平升高与HIV、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)，丙型肝炎病毒、或疱疹病毒6感染之间存在相关性27-30。生物信息学分析表明，所有这些病毒毒株均携带X1-X2-X3-X4-X5-F-X7-C基序(SEQ ID NO：53)。这些数据综合证明了在本公开中表征的与aPLA相互作用的基序X1-X2-X3-X4-X5-F-X7-C(SEQ ID NO：53)、当然还有X1-X2-X3-X4-X5-F-X7-X8-相关基序(SEQ ID NO：51)与其他先前描述的表位强烈相关，从而着重于残基的极性性质而不是特定序列。
此处进行的aPLA表位的表征会使得能够更好的理解针对aPLA所述的令人惊讶的候选受体数目13。本文已经表明，建议作为aPLA受体的所有TLR在其细胞外区域携带至少一个基序。因此，TLR2具有一个X1-X2-X3-X4-X5-F-X7-C基序(SEQ ID NO：53)和TLR4具有三个X1-X2-X3-X4-F-X7-X8基序(SEQ ID NO：51)。如图4D所示，X1-X2-X3-X4-X5-F-X7-C基序(SEQ IDNO：53)可能比X1-X2-X3-X4-F-X7-X8基序(SEQ ID NO：54)更有效地结合aPLA，但是在TLR4上存在三个X1-X2-X3-X4-F-X7-X8基序(SEQ ID NO：54)可以解释TLR2和TLR4被提议作为aPLA受体。膜联蛋白A2、ApoER2和GPIbα也具有至少一种aPLA可接近的基序(表3)。描述最多的与aPLA相互作用的蛋白β2GP1具有不少于5个基序，主要存在于结构域I中，也存在于结构域III中。携带X1-X2-X3-X4-X5-F-X7-X8基序(SEQ ID NO：51)的其他几个靶标(例如参与凝血过程的蛋白质)对于APS也很重要。因此，凝血酶、蛋白酶激活的受体2(PAR-2和3)以及补体C5、补体C4a或补体C4b是一些携带X1-X2-X3-X4-X5-F-X7-X8基序(SEQ ID NO：51)的aPLA靶向蛋白(数据未显示)。
本发明提供了机会以提供出于诊断目的的用于检测aPLA、特别是检测β2GP1抗体的准确工具。此外，存在于肽中的与aPLA相互作用的基序具有抑制aPLA活性的能力，并代表了替代抗凝血剂的APS预防策略。最后，含有与细胞死亡诱导物相关的本发明的肽的组合物可以用于特异性破坏APS患者的自身反应性T细胞，从而提供了一种极好的治疗方法。
根据本发明的另一方面，将本发明的肽负载在MHC II类分子上，以提供用于诊断和/或治疗抗磷脂综合征(APS)的MHC组合物。因此，本发明还提供了包含MHC II类分子和本发明的肽的MHC组合物。
在本发明的一个实施方案中，MHC组合物还包含细胞死亡诱导物。在本发明的MHC组合物的另一个实施方案中，细胞死亡诱导物与链霉亲和素(streptavidine)相关，并且MHC II类分子进一步通过结合部分如生物素而修饰。在另一个另外的实施方案中，细胞死亡的诱导物选自包括阿霉素、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、博来霉素、硼替佐米、环磷酰胺、I型核糖体失活蛋白皂草素和奥沙利铂的组。
在本发明的MHC组合物的优选实施方案中，MHC II类分子是四聚体或右旋聚体(dextramer)。在MHC发明的另一个优选的实施方案中，该组合物是可溶性组合物。在另一个优选的实施方案中，本发明的MHC组合物附着于不溶性载体或基质。
术语“主要组织相容性抗原”是指属于人类HLA系统的分子(小鼠中为H2)，分为两个大类。MHC I类分子由包含3个结构域(α1、α2和α3)的单个多态链形成，其与细胞表面的β2微球蛋白相关。I类分子由在人类中称为A、B和C的3个基因座编码。此类分子将肽呈递给CD8+亚群的T淋巴细胞。在细胞上出现的“II类分子”是由2条多态链组成的跨膜蛋白，每条多态性链包含2条链(α1和α2，以及β1和β2)。这些II类分子由在人类中的3个基因座DP、DQ和DR编码。为了本发明的目的，“MHC分子-本发明的肽”复合体能够与CD4+T细胞结合是必需的和充分的。
在一个实施方案中，将呈递相关MHC II类分子的细胞与本发明的肽一起孵育。然后，将细胞原样地用于结合同源TCR，要么以可溶相然后进行facs分析，要么在板或珠子上固定化(insolubilisation)后进行。这些技术在本领域中已被很好地描述。在另一个实施方案中，裂解细胞，并通过例如色谱法制备负载有本发明肽的MHC II类分子。然后可以将具有或不具有标记物的MHC-肽组合物以可溶相使用以与CD4+T细胞群体相互作用，或固定在板或珠子或任何合适的固相支持物上以检测CD4+T细胞。
在另一个实施方案中，MHC II类分子通过使用细胞转染或转导的cDNA技术产生。cDNA构建体可以包含全长II类分子，其具有用于如上所述的表面锚定和使用细胞的膜内序列，或不具有用于分泌的膜内序列。此类分泌的II类分子可以纯化，并且可以如上所述以可溶形式或在固定于固体表面(如板或珠子)上后使用。
MHC分子可以进一步通过结合部分(肽标签如His标签，结合部分如生物素，结合蛋白如GST、MBP，抗体标签如HA标签)修饰。MHC分子也可以用可检测标记物(例如发色基团、放射性标记物、磁珠)修饰。
在又一个实施方案中，包含MHC II类分子的cDNA构建体也包含本发明的肽的序列，使得工程化分子组成性表达与MHC分子融合的本发明的肽。在该实施方案中，有利的是，本发明的肽包含在II类分子的序列和本发明的肽的序列之间的接头，以允许本发明的肽的适当折叠并呈递进入II类分子的裂缝。这些接头通常是具有丝氨酸和/或甘氨酸的3至15个氨基酸的多肽序列，为表位提供足够的柔性以将其拴在β链上。接头可以还包含蛋白酶特异性识别位点(例如，对于凝血酶)，使得在表达和折叠后，肽以其正常构象存在。
在负载本发明的肽之前或之后，MHC II类分子的可溶形式可以通过使几个分子相互反应或通过将此类分子固定于固相(例如珠子或板)上而以二聚体或聚合物形式使用。这些方法在本领域中描述。MHC分子可以多聚体例如四聚体或右旋聚体的形式出现。
本发明的肽可以使用重组DNA技术在细菌、酵母、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞中产生。有限长度的肽可以通过化学肽合成来制备，其中肽是通过将不同的氨基酸彼此连接来制备的。化学合成特别适合于包含例如D-氨基酸、具有非天然存在的侧链的氨基酸、或具有修饰的侧链的天然氨基酸，例如甲基化的半胱氨酸。
化学肽合成方法已有很好的描述，可以从公司如Applied Biosystems和其他公司订购肽。肽合成可以固相肽合成(SPPS)或以与液相肽合成相反的方式进行。最著名的SPPS方法是叔丁氧羰基和9-芴基甲氧基羰基固相化学。在肽合成过程中，使用了几个保护基。例如，羟基和羧基官能团通过叔丁基基团保护，赖氨酸和色氨酸通过叔丁氧羰基基团保护，天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和组氨酸通过三苯甲基基团保护，精氨酸通过pbf基团保护。在具体实施方案中，此类保护基团可以留在在合成后的肽上。
或者，可以通过使用编码本发明的肽的核酸分子在包括所述编码核苷酸序列的适当表达载体中来合成肽，特别是肽与MHC分子的融合蛋白。可以使用自动DNA合成仪和众所周知的遗传密码的密码子-氨基酸关系容易地制备此类DNA分子。这种DNA分子也可以使用寡核苷酸探针和常规杂交方法，作为基因组DNA或作为cDNA获得。可以将此类DNA分子并入包括质粒的表达载体，其适于在合适的宿主例如细菌(例如大肠杆菌)、酵母细胞、动物细胞或植物细胞中表达该DNA并产生多肽。
检查感兴趣的肽的物理和化学性质(例如溶解性、稳定性)，以确定该肽是否适合用于本发明所定义的应用/是否将会适合所述应用。通常，这是通过调节肽的序列来优化的。任选地，可以在合成后使用本领域已知的技术对肽进行修饰(化学修饰，例如添加/删除官能团)。
本发明的另一个方面提供了一种药物组合物，其包含有效预防、减少或抑制需要其的受试者的抗磷脂综合征(APS)的一个或多个症状的量的本发明的肽，和用于施用该肽的药学上可接受的载体。
用于递送肽的药物组合物是本领域众所周知的。这样的组合物通常包含基于有机材料的药物载体。此外，已知有多种方法可以用于物理封装技术之前的聚合物-肽缀合，分为基于表面活性剂的技术和聚合物载体。基于表面活性剂的技术主要为脂质体、微乳液和固体脂质纳米颗粒。该领域在聚合物领域中得到进一步拓宽。使用聚合物修饰的脂质体、固体微球、聚电解质复合物、乳液、水凝胶和可注射的聚合物可以增强肽的递送。
本发明的另一个方面提供了一种用于治疗受试者的抗磷脂综合征(APS)的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的本发明的MHC组合物。
本发明的另一个方面提供了本发明的MHC组合物，其用于治疗抗磷脂综合征(APS)。
本发明的肽和本发明的MHC组合物的“治疗有效量”或“有效量”优选地使疾病症状的严重性降低，疾病无症状时期的频率和持续时间的增加，寿命延长，疾病缓解，或由感病性导致的损害或残疾的预防或减少。本领域普通技术人员将能够基于诸如受试者的体型大小、受试者的症状的严重程度以及所选择的特定组合物或施用途径等因素来确定治疗有效量。
本发明的另一个方面提供了一种用于预防和/或抑制受试者的抗磷脂综合征(APS)的一个或多个症状的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的本发明的肽或本发明的药物组合物。
本发明的另一个方面提供了一种本发明的肽，其用于预防和/或抑制抗磷脂综合征(APS)的一个或多个症状的方法。
本发明还提供了本发明的肽在制造用于治疗和/或预防抗磷脂综合征(APS)的药物中的用途。
本发明的另一个方面提供一种用于诊断受试者的抗磷脂综合征(APS)的方法，其中，在来自诊断的受试者的样本中检测存在或不存在抗磷脂抗体(aPLA)，并且其中，抗磷脂抗体的存在意味着APS疾病，并且其中使用免疫测定检测抗磷脂抗体，包括以下步骤：
(i)提供样本；
(ii)在允许抗磷脂抗体与本发明的肽形成复合体的条件下，使本发明的肽与样本接触；
(iii)检测复合体。
在诊断方法中，优选将肽固定在表面或珠子上，和/或优选使用针对抗磷脂的Fc部分的第二抗体检测该复合体，其中优选地，抗磷脂抗体是IgG抗体，并且第二抗体是抗IgG抗体，和/或优选用可检测的标记物来标记第二抗体。在优选的实施方案中，所述免疫测定选自免疫沉淀、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)或荧光免疫测定、化学发光(chemilumineszent)测定、凝集测定、散射比浊测定、浊度测定、免疫印迹、竞争性免疫测定、非竞争性免疫测定、均相免疫测定、非均相免疫测定、生物测定和报告测定如荧光素酶测定的组。优选地，免疫测定为ELISA。
本发明的另一个方面提供了一种用于检测样本中存在抗磷脂抗体的方法，包括：
(i)提供样本，
(ii)在允许抗磷脂抗体与本发明的肽形成复合体的条件下，使本发明的肽与样本接触；
(iii)使用免疫测定检测复合体。
在诊断方法中，优选将肽固定在表面或珠子上，和/或优选使用针对抗磷脂的Fc部分的第二抗体检测复合体，其中优选地，抗磷脂抗体是IgG抗体，并且第二抗体是抗IgG抗体，和/或优选用可检测的标记物来标记第二抗体。在优选的实施方案中，所述免疫测定选自免疫沉淀、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)或荧光免疫测定、化学发光测定、凝集测定、散射比浊测定、浊度测定、免疫印迹、竞争性免疫测定、非竞争性免疫测定、均相免疫测定、非均相免疫测定、生物测定和报告测定如荧光素酶测定的组。优选地，免疫测定为ELISA。
本发明还包括用于确定样本(例如，体液)中存在aPL抗体的诊断性免疫测定，所述样本取自怀疑患有aPL抗体介导的疾病的受试者，所述诊断性免疫测定包括使体液样本与特异性结合aPL抗体的本发明的肽接触，并通过本领域熟知的方法确定样本中是否存在aPL抗体，并且如果存在，则定量样本中存在的aPL抗体的量。这种免疫测定包括：(a)用特异性结合aPL抗体的本发明的肽包被微量滴定板的孔；(b)洗涤孔以洗去未结合的肽；(c)将从受试者获得的样本的测试样本加入洗去了未结合的肽的孔中；(d)将从受试者获得的样本的测试样本添加到孔中，并孵育预定时间；(e)清洗孔以除去未结合的测试样本；(f)将与标记物缀合的抗人IgG添加到板的孔中，并孵育预定时间；(g)洗涤孔以洗去未结合的抗人IgG缀合物；(h)添加用于标记的缀合物的底物并使底物/标记物反应持续预定时间；(i)测量底物/标记物反应的终产物，以确定测试样本中抗aPL抗体的存在。还包括如上所述的诊断性免疫测定，其中免疫测定是定量的。
本发明的另一个方面提供了本发明的肽用于检测抗磷脂抗体的用途。
本发明的另一个方面提供了一种用于诊断受试者的抗磷脂综合征(APS)的方法，其中，在来自受诊断的受试者的样本中检测存在或不存在能够诱导抗磷脂抗体的产生的CD4+T细胞，并且其中，所述CD4+T细胞的存在意味着APS疾病，包括以下步骤：
(i)提供样本；
(ii)使样本与本发明的MHC组合物接触；
(iii)通过测量所述组合物与所述样本中的CD4+T细胞的结合来检测CD4+T细胞，其中，组合物与CD4+T细胞的结合意味着所述样本中存在CD4+T细胞。
在一些优选的实施方案中，该方法进一步包括分离与所述组合物结合的CD4+T细胞的步骤，和/或所述样本是血液样本。
本发明的另一方面提供了本发明的MHC组合物用于检测、制备或消耗CD4+T细胞的用途。
同样，本发明涉及一种治疗APS的方法，该方法包括用根据本发明的诊断方法诊断APS，并且在所述诊断方法中的结果指示为APS时向受试者施用根据本发明的MHC组合物。
用于本发明的诊断方法的样本可以来自不同的来源。应当理解，本文所考虑的“样本”还包括从其原始状态进行修饰的样本，例如通过纯化、稀释、或添加任何其他一种或多种组分，例如向溶液中添加化学物质或生化物质，例如酸、碱、缓冲液、盐、溶剂、活性染料、去污剂、乳化剂、螯合剂。样本优选是生物样本，例如体液样本。生物样本的非限制性实例包括全血或其组分(例如血浆、血清)、尿液、唾液、淋巴液、胆汁液、痰、眼泪、脑脊液、支气管肺泡灌洗液(bronchioalveolar lavage fluid)、滑液、精液、腹水肿瘤液、母乳和脓汁。所述生物样本可以来自健康个体，或患有特定疾病或病症如抗磷脂综合症(APS)的个体。例如，个体可能正患有或怀疑患有自身免疫性疾病，例如抗磷脂综合症(APS)。可以从受试者收集生物样本并直接使用。或者，可以在使用前对生物样本进行处理。例如，可以在使用前将生物样本纯化、浓缩、分离成各种组分、或以其他方式修饰。将理解的是，本文考虑的生物样本包括培养的生物材料，包括来自培养的细胞的样本，例如从培养的细胞或细胞团收集的培养基。因此，生物样本可以指由整个生物体或其组织的一部分(subset)、细胞或组成部分、或其碎片或部分制备的溶解物、匀浆或提取物。生物样本也可以在使用前进行修饰，例如，通过纯化一种或多种组分、稀释和/或离心。
本发明的另一个方面提供了一种用于检测样本中存在或不存在抗磷脂抗体的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的肽。
本发明的进一步的方面提供了一种用于检测样本中存在或不存在能够诱导产生抗磷脂抗体的CD4+T细胞的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的MHC组合物。
本发明提供了用于检测样本中存在或不存在抗磷脂抗体、或存在或不存在能够诱导产生抗磷脂抗体的CD4+T细胞的试剂盒。因此，该试剂盒包含本发明的肽或本发明的MHC组合物。该试剂盒可以用于诊断或预后受试者的自身免疫性疾病，例如APS。
本发明的试剂盒可以包含进行本发明的方法所需的其他组分，例如缓冲液和/或稀释剂。该试剂盒可以包含用于从受试者获得样本的一种或多种装置。该试剂盒通常包含用于容纳各种组分的容器和在本发明的方法中使用试剂盒组分的说明。本发明的试剂盒可以包含固定有或可以固定有一种或多种试剂的合适支持物，例如，本发明的试剂盒可以包含包被有抗体、链霉亲和素(strepavidin)或生物素的支持物。合适的支持物的非限制性实例包括由聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、交联葡聚糖、聚氯乙烯、塑料珠、以及颗粒材料如滤纸、硝化纤维素膜、琼脂糖、交联的右旋糖酐和其他多糖制成的测定板(例如，微量滴定板)或试管。
本发明的试剂盒可以用于进行酶联免疫吸附测定(ELISA)。另外地或可替代地，本发明的试剂盒可以用于进行免疫印迹。这样的试剂盒还可以包含载体、包装或容器，其被分隔以容纳一个或多个容器，例如小瓶、管等，每个容器包含在本方法中待使用的分离元件之一。本发明的试剂盒通常包含：包含上述元件的容器；以及一个或多个其他容器，其包含从商业和用户的角度出发期望的材料，包括缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有使用说明的包装插页。另外，可以在容器上提供标签以指示该组合物用于特定的治疗或非治疗应用，并且还可以指示体内或体外使用的用法说明，例如本文所述的那些。用法说明和/或其他信息也可以包括在试剂盒随附的插页中。试剂盒优选包括用于处理和/或加工血液样本的装置。
本领域技术人员将理解，本文描述的发明易受到除了具体描述的之外的变化和修改的影响。应当理解，本发明包括所有这样的变化和修改，而不背离其精神或基本特征。本发明还包括本说明书中提及或指出的单独或共同的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征的任何和所有组合或任何两个或更多个。因此，本公开被认为是在所示出的所有方面中，而不是限制性的，本发明的范围由所附权利要求表示，并且等同含义和范围内的所有变化均旨在包括在其中。
参考以下实施例将更充分地理解前述描述。然而，这些实施例是实施本发明的示例性方法，并且不旨在限制本发明的应用和范围。
实施例
伦理声明
日内瓦医院输血中心提供了健康供体的血沉棕黄层。根据日内瓦医院伦理委员会和赫尔辛基宣言，血库获得了供体的知情同意，供体被告知他们的部分血液将用于研究目的。
患者特征
根据修订的札幌标准所定义的，所有患者均具有APS2。从健康志愿者的血浆中分离出对照抗体和外周血单核细胞(PBMC)。表1列出了该研究中使用的患者的特征。
细胞培养
如前所述，从健康志愿者的血沉棕黄层中分离出单核细胞14，15。通过流式细胞术评估，单核细胞纯度通常由＞90％CD14+细胞、＜1％CD3+细胞和＜1％CD19+细胞组成。将细胞在含有10％胎牛血清(FBS；Gibco BRL-Life Technologies)的RPMI中培养。每个实验均使用至少三个不同的单核细胞制剂进行。
重组β2GP1融合蛋白和肽库
产生分别对应于β2GP1的寿司(sushi)结构域I和II、结构域III、IV和V的重组融合蛋白。简而言之，将一系列编码这些结构域的β2GP1互补DNA(cDNA)构建体插入到载体pcDNA3.1_mycHis_A_A130的克隆位点BamHI/XhoI之间。通过Life Technology(Carlsbad，CA，USA)制备质粒，并将其转染到HEK293细胞中。使用镍树脂亲和色谱法(GE Healthcare)纯化融合蛋白，并用
Figure BPA0000283956450000281
Ultra(Milipore，Billerica，MA，USA)进行分离。然后将其浓度调节至在PBS中为5mg/ml。肽库由Mimotopes(Clayton，Australia)生成。将冻干的非水溶性肽在50％DMSO和7.5％乙酸中重构，然后在PBS中稀释。通过分析型RP-HPLC评估，所有肽具有95％的纯度。天然β2GP1是从人血浆中纯化的，纯度为96％(Prospecbio，USA)。
T细胞增殖测定
根据制造商的说明，通过在LymphoprepTM(Axis-Shield PoC)上进行密度梯度离心来分离外周血单核细胞(PBMC)。通过5，6-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)稀释测定法(eBioscience)来评估T细胞增殖。根据制造商的说明，PBMC用0.1μM CFSE(eBioscience)染色。在抗原(10μg/ml)存在下培养细胞10天。通过对CFSE稀释液的流式细胞术评估来测量T细胞增殖。增殖表示为细胞分裂指数(定义为与抗原一起培养的CFSElow T细胞的数目/不与抗原一起培养的CFSElow T细胞的数目)。在所有情况下，培养基均由补充有青霉素(100U/ml)和链霉素(0.1mg/ml)的X-VIVO 15(Lonza，Walkersville，MD)组成。
II类-肽的四聚体染色
染色是按照Benaroya研究所的方案(https：//tetramer.benaroyaresearch.org/more-inforesources/protocols)进行的。简而言之，我们用结构域I-II进行抗原特异性扩增，即在如下所述的四聚体染色之前，在抗原(10μg/ml)存在下将细胞培养10天(脉冲)。将10μg/mL PE标记的II类四聚体添加至细胞中，并在黑暗中于37℃保持3小时。随后，在流式细胞术分析之前，在冰上用荧光染料(AF647)标记的抗CD4染色细胞30分钟。
流式细胞术
将用CFSE(eBioscience)染色的单细胞悬浮液与抗CD32(Biolegend)一起孵育以防止非特异性抗体结合，然后用针对AF488-CD3、AF647-CD4、(BD Bioscience)主要组织相容性复合体(MHC)II类四聚体(Benaroya Research Institute)的抗体染色。用ACCURI C6流式细胞仪(BD Biosciences)评估染色。
HLA分型
通过标准方法在第二场水平分型(高分辨率分型，以前称为4-数字分型)上对患者进行HLA-DRB1/B3、DQB1和DPB1基因座的匹配，所述标准方法为微珠阵列上的PCR-SSO(Luminex Technology，LabType HD，OneLambda，Ingen，Chilly-Mazarin，France)、PCR-SSP(Genovision，Milan Analytika AG，Rheinfelden，Switzerland)和SBT(Protrans，Endotell AG，Allschwil，Switzerland)。
IgG纯化
如前所述，用Protein-G CL-4B Sepharose(GE Healthcare)从患者血浆中分离IgG级分16。为了测定IgG级分的内毒素和脂肽污染，我们通过对Protein G-Sepharose的一步亲和吸附从aPLA和IgG-ctl(对照)级分中去除了IgG，并测试了其余上清液的单核细胞活化的能力，如前所述17。另外，内毒素水平通过鲎变形细胞溶解物试验(Limulus AmebocyteLysate Endochrome Assay，Charles River Laboratories)进行测量，发现在测定中使用的浓度下，所有IgG级分均低于检出限(0.25EU/mL)。每个实验均使用至少2个不同的IgG制剂进行。
TNF产生
在与aPLA或对照IgG孵育之前，用10μg/ml的β2GP1的重组结构域或肽处理细胞。收集上清液用于通过ELISA(R&D系统)进行TNF定量。
ELISA表位映射分析
在与aPLA或对照IgG孵育之前，将MaxiSorpTM 96孔板(Nunc)用10μg/ml的β2GP1的重组结构域或肽包被。使用了与IR800CW(Rockland)缀合的第二抗人抗体。通过Odyssey系统(Li-Cor)检测并定量蛋白结合的抗体或肽结合的抗体。
免疫印迹
制备总细胞裂解物，并按前述方法进行免疫印迹分析16。用抗cmyc(Zymed)探测印迹。使用与IR800CW(Rockland)缀合的第二抗体。利用奥德赛(Odyssey)系统(Li-Cor)检测并定量抗体结合的蛋白。
统计分析
必要时，使用非参数Mann-Whitney U检验来评估组间的差异的显著性。*：p≤0.05；**：p≤0.005；***：p≤0.0005。所有数据均以至少3个独立实验的平均值±SEM表示。
表5：肽名称和SEQ ID No
肽名称 SEQ ID NO：
结构域I-II 37
p1 32
p2 38
p3 39
p4 35
p5 40
p6 33
p7 41
p8 42
p9 43
p10 44
p11 45
p12 46
p13 47
revp3 34
revCD40 36
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Figure IPA0000283956400000201
Figure IPA0000283956400000211
Figure IPA0000283956400000221
Figure IPA0000283956400000231

Claims (41)

1.一种具有氨基酸序列(SEQ ID NO：51)的分离肽
X1-X2-X3-X4-X5-F-X7-X8
其中，
X1、X2、X3和X8是非极性氨基酸残基，各自独立地选自包括A、V、I、L、M、F、W、C、P和G的组，
X4和X5是极性氨基酸残基，各自独立地选自包括Y、T、S、H、K、R、E、D、Q和N的组，
X7是选自包括A、V、I、L、M、F、W、C、P、G、Y、T、S、H、K、R、E、D、Q和N的组的氨基酸残基。
2.根据权利要求1所述的分离肽，其中，X8是C。
3.根据权利要求1或2所述的分离肽，其具有反向的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的分离肽，其具有选自包括SEQ ID NO：5至SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50的组的序列。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的分离肽，其具有选自包括SEQ ID NO：27至SEQ IDNO：31的组的序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的分离肽，其还包含在N-末端和/或C-末端的接头，其中在N-末端和/或C-末端的所述接头独立地选自包括长度为至少3个氨基酸残基的接头肽序列、聚合物、或其组合的组。
7.根据权利要求6所述的分离肽，其中，在N-末端和/或C-末端的所述接头肽序列独立地选自包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64的组。
8.根据权利要求6所述的分离肽，其包含至少15个氨基酸残基。
9.一种MHC组合物，其包含MHC II类分子和权利要求1-8中任一项所述的肽。
10.根据权利要求9所述的MHC组合物，其还包含细胞死亡诱导物。
11.根据权利要求10所述的MHC组合物，其中，所述细胞死亡诱导物与链霉亲和素相关，并且MHC II类分子进一步通过结合部分如生物素而被修饰。
12.根据权利要求10-11中任一项所述的MHC组合物，其中，所述细胞死亡诱导物选自包括阿霉素、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、博来霉素、硼替佐米、环磷酰胺、I型核糖体失活蛋白皂草素和奥沙利铂的组。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的MHC组合物，其中，所述MHC II类分子是四聚体或右旋聚体。
14.根据权利要求9-12中任一项所述的MHC组合物，其中，所述组合物是可溶性组合物。
15.根据权利要求9-14中任一项所述的MHC组合物，其中，所述组合物附着于不溶性载体或基质。
16.一种药物组合物，包含：有效预防、减少或抑制需要其的受试者的抗磷脂综合征(APS)的一个或多个症状的量的权利要求1-8中任一项所述的肽，和用于施用所述肽的药学上可接受的载体。
17.一种用于治疗受试者的抗磷脂综合征(APS)的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求10-15中任一项所述的MHC组合物。
18.权利要求10-15中任一项所述的MHC组合物，其用于治疗抗磷脂综合征(APS)。
19.一种用于预防和/或抑制受试者的抗磷脂综合征(APS)的一个或多个症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-8中任一项所述的肽或权利要求16所述的药物组合物。
20.权利要求1-8中任一项所述的肽，其用于预防和/或抑制抗磷脂综合征(APS)的一个或多个症状的方法。
21.一种用于诊断受试者的抗磷脂综合征(APS)的方法，其中，在来自受诊断的受试者的样本中检测存在或不存在抗磷脂抗体(aPLA)，并且其中，抗磷脂抗体的存在意味着APS疾病，并且其中，使用免疫测定检测所述抗磷脂抗体，包括以下步骤：
(i)提供样本；
(ii)在允许抗磷脂抗体与权利要求1-8中任一项所述的肽形成复合体的条件下，使权利要求1-8中任一项所述的肽与所述样本接触；
(iii)检测复合体。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，权利要求1-8中任一项所述的肽被固定在表面或珠子上。
23.根据权利要求21-22中任一项所述的方法，其中，所述复合体是使用针对抗磷脂的Fc部分的第二抗体检测的。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述抗磷脂抗体为IgG抗体，并且所述第二抗体为抗IgG抗体。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中，所述第二抗体用可检测的标记物来标记。
26.根据权利要求21-25中任一项所述的方法，其中，所述免疫测定选自免疫沉淀、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)或荧光免疫测定、化学发光测定、凝集测定、散射比浊测定、浊度测定、免疫印迹、竞争性免疫测定、非竞争性免疫测定、均相免疫测定、非均相免疫测定、生物测定和报告测定如荧光素酶测定的组。
27.根据权利要求21-25中任一项所述的方法，其中，所述免疫测定是ELISA。
28.一种用于检测样本中存在抗磷脂抗体的方法，包括：
(i)提供样本，
(ii)在允许抗磷脂抗体与权利要求1-8中任一项所述的肽形成复合体的条件下，使权利要求1-8中任一项所述的肽与所述样本接触；
(iii)使用免疫测定检测复合体。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，权利要求1-8中任一项所述的肽被固定在表面或珠子上。
30.根据权利要求28-29中任一项所述的方法，其中，所述复合体是使用针对抗磷脂的Fc部分的第二抗体检测的。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述抗磷脂抗体为IgG抗体，并且所述第二抗体为抗IgG抗体。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其中，所述第二抗体用可检测的标记物来标记。
33.根据权利要求28-32中任一项所述的方法，其中，所述免疫测定选自免疫沉淀、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)或荧光免疫测定、化学发光测定、凝集测定、散射比浊测定、浊度测定、免疫印迹、竞争性免疫测定、非竞争性免疫测定、均相免疫测定、非均相免疫测定、生物测定和报告测定如荧光素酶测定的组。
34.根据权利要求28-32中任一项所述的方法，其中，所述免疫测定是ELISA。
35.权利要求1-8中任一项所述的肽在检测抗磷脂抗体中的用途。
36.一种用于诊断受试者的抗磷脂综合征(APS)的方法，其中，在来自受诊断的受试者的样本中检测存在或不存在能够诱导抗磷脂抗体的产生的CD4+T细胞，并且其中，所述CD4+T细胞的存在意味着APS疾病，包括以下步骤：
(i)提供样本；
(ii)使所述样本与权利要求9-15中任一项所述的MHC组合物接触；
(iii)通过测量所述组合物与所述样本中的CD4+T细胞的结合来检测CD4+T细胞，其中，所述组合物与CD4+T细胞的结合意味着所述样本中存在CD4+T细胞。
37.根据权利要求36所述的方法，还包括分离与所述组合物结合的CD4+T细胞的步骤。
38.根据权利要求36-37中任一项所述的方法，其中，所述样本是血液样本。
39.权利要求9-15中任一项所述的组合物用于检测、制备或消耗CD4+T细胞的用途。
40.一种用于检测样本中存在或不存在抗磷脂抗体的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-8中任一项所述的肽。
41.一种用于检测样本中存在或不存在能够诱导产生抗磷脂抗体的CD4+T细胞的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求9-15中任一项所述的MHC组合物。
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