CN113039198A

CN113039198A - 表位

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Publication number: CN113039198A
Application number: CN201980060450.0A
Authority: CN
Inventors: 薛玮; 凯瑟琳·温迪·库克; 琳达·吉莉安·达兰特; 维多利亚·安妮·布伦特维勒
Original assignee: Scancell Ltd
Current assignee: Scancell Ltd
Priority date: 2018-09-14
Filing date: 2019-09-11
Publication date: 2021-06-25
Also published as: EP3850002A2; KR20210087021A; GB201815041D0; US20220288178A1; WO2020053304A2; JP2022511316A; WO2020053304A3; SG11202100579UA; CA3109330A1; BR112021004238A2; JP2024112969A; AU2019340456A1

Abstract

本发明涉及包含可以用作癌症免疫治疗的靶标的含有高瓜氨酸(Hcit)的表位。该高瓜氨酸化T细胞表位(i)与MHC II类或MHC I类结合的预测结合得分<30，所述得分使用在线IEDB预测程序(http://www.iedb.org/)预测，(ii)具有形成螺旋构象结构的至少5个连续氨基酸。这些修饰的肽可用作疫苗或用作T细胞受体(TCR)和过继性T细胞转移疗法的靶标。

Description

表位

本发明一般涉及表位，更具体地涉及可以用作癌症免疫治疗靶标的含有高瓜氨酸(Hcit)的表位。这些修饰的肽可用作疫苗或用作T细胞受体(TCR)和过继性T细胞转移疗法的靶标。

赖氨酸可以在称为氨甲酰化的过程中被化学修饰为高瓜氨酸(Ospelt等人.2017；Lac等人.2018)(图1)。该反应在异氰酸与赖氨酸上的胺(NH₂)基反应生成高瓜氨酸时发生。胺基的氨甲酰化会导致分子电荷的变化，进而改变抗原特性，并可能导致生成独特的T细胞表位(Burska等人，2014；Mydel等人，2010)。异氰酸与氰酸盐处于稳定平衡中，可以由尿素的自发降解产生，但是在正常的生理条件下，尿素和氰酸盐的浓度对于任何重要的蛋白质氨甲酰化而言都是过低的。在炎性条件下，氨甲酰化主要受髓过氧化物酶(MPO)的驱动，该酶在过氧化氢存在下将硫氰酸盐转化为异氰酸(Wang等人，2007；Holzer等人，2012)。MPO由包括嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞的免疫细胞表达(Eruslanov等人，2014)。过去已经针对氨甲酰化在肾功能不全尿毒症和慢性收缩性心力衰竭中的作用而对氨甲酰化进行了广泛的研究。然而，最近人们的兴趣集中在它在类风湿性关节炎(RA)疾病的炎症和引发中的作用(Mydel等人，2010；Kollipara和Zahedi 2013；Lac等人，2018；Ospelt等人，2017)。用氨甲酰化蛋白免疫的小鼠发展出针对相应抗原的关节炎。另外，在患有胶原蛋白诱导的关节炎的小鼠中检测到了抗氨甲酰化蛋白的抗体，但未检测到抗瓜氨酸化蛋白抗体(ACPA)(Stoop等人，2014；Mydel等人，2010)。在RA患者中发现了与氨甲酰化序列结合的抗体；例如Hcit纤维蛋白原(Scinocca等人，2014)、Hcit胶原蛋白(Turunen等人，2016)和Hcit波形蛋白(Shi等人，2011；Turunen等人，2015)。抗氨甲酰化蛋白抗体以及ACPA在RA发病之前出现。这些发现提示氨甲酰化是RA发病机理中的关键过程(Shi等人，2014)。实际上，用Hcit丝聚蛋白肽免疫小鼠诱发了强烈的Hcit特异性B细胞应答，从而导致糜烂性关节炎的发展(Mydel等人，2010)。吸烟致病性关系与MPO依赖性蛋白质氨甲酰化增强有关(Wang等人，2007；Makrygiannakis等人，2008)。在6名慢性阻塞性肺病(COPD)吸烟者或戒烟者样本中，有4名可以检测到针对Hcit波形蛋白的自身抗体(Lugli等人，2015)。这表明在慢性炎症条件下，MPO可以被激活，并使胞外蛋白或凋亡过程中释放的蛋白氨甲酰化，随后这些蛋白析出并被B细胞识别，从而导致自身抗体的产生。相对于本领域中普遍存在的高瓜氨酸化肽与炎性反应和自身免疫疾病相关联的观点，发明人发现某些高瓜氨酸化肽引起T细胞应答，并且可用作癌症免疫疗法的靶标，用作疫苗或用作T细胞受体(TCR)和过继性T细胞转移疗法的靶标。

根据本发明的第一方面，提供了一种高瓜氨酸化T细胞表位，该表位(i)与MHC II类或I类的预测结合得分<30，该得分使用在线IEDB预测程序(http://www.iedb.org/)预测，和(ii)具有形成螺旋构象结构的至少5个连续氨基酸。

发明人出乎意料地发现，可以提高对来自表达于活MPO阴性细胞内的胞内抗原的表位的T细胞应答，在表位中，赖氨酸已被高瓜氨酸置换。此外，含有高瓜氨酸的肽不仅使基于T细胞的疗法(包括但不限于肿瘤疫苗)的开发而且使TCR和过继性T细胞转移疗法的开发成为可能。这种T细胞应答与自身免疫疾病中的应答形成对比，所述自身免疫疾病中的应答是由与胞外抗原或从死亡细胞中析出的抗原形成复合物的自身抗体驱动的。这些免疫复合物通过其Fc区与免疫细胞相互作用，进一步驱动自身免疫疾病的发病机理。这也与WO2014/023957A2相反，WO2014/023957A2公开了蛋白质的瓜氨酸化可以通过活化细胞内的PAD酶而在活细胞中发生，并且可以对那些瓜氨酸化的肽产生免疫应答。本发明的T细胞表位可以是MHC I类或MHC II类表位，即可以与MHC II类或I类分子形成复合物并在MHC I类或MHC II类分子上呈递。技术人员可以通过确定在多肽存在下MHC是否可以重新折叠来确定给定的多肽是否与MHC分子形成复合物。如果多肽不与MHC形成复合物，则MHC将不会重新折叠。通常使用仅识别折叠状态的MHC的抗体来证实重新折叠。更多详细信息可以在Garboczi等人,Proc Natl Acad Sci USA.1992Apr15；89(8):3429-33中找到。表位中的所有赖氨酸氨基酸残基可被转化为高瓜氨酸。可替代地，表位中赖氨酸氨基酸残基中的1、2、3或4个可被转化为高瓜氨酸，其余的则不转化。因此，本发明的表位可以具有1、2、3或4个高瓜氨酸残基。本发明的表位的长度可以是多达25个氨基酸。它们的长度可以是至少5个氨基酸，并且可以不超过18、19、20、21、22、23或24个氨基酸。本发明的T细胞表位可以是自身抗原或与肿瘤相关抗原，并且可以刺激针对肿瘤的免疫应答。

发明人已经表明，基于主要组织相容性复合物MHC II与HLA-DR4、DR1或DP4以高预测亲和力结合通过采用表位预测算法来选择被高瓜氨酸化的表位，在HLA转基因小鼠ALDOA中存在识别来自以下分子的高瓜氨酸化肽的T细胞库：波形蛋白(VIME)、醛缩酶(ALDOA)、细胞角蛋白8(CyK8或K2C8)、免疫球蛋白结合蛋白(BiP)、核仁磷酸蛋白(NPM)、α-烯醇化酶(ENO1或ENOA)、β-连环蛋白(CTNNB1)或热休克蛋白(HSP60或CH60)(表1至4)。有趣的是，在该研究中，发明人发现了对通过非SE等位基因HLA-DP4和SE等位基因HLA-DR1限制的氨甲酰化的波形蛋白、ALDOA、烯醇化酶、BiP、核仁磷酸蛋白和细胞角蛋白8肽的CD4 T细胞应答，表明氨甲酰化肽对MHC II类比仅SE等位基因具有更广泛的结合特异性。另外，本发明人还表明，鉴定了对通过HLA-A2等位基因限制的氨甲酰化的醛缩酶和细胞角蛋白8肽的CD8 T细胞应答。

首先使用在线IEDB预测程序(http://www.iedb.org/)基于高预测结合得分选择在预测结合核心中包含赖氨酸残基的肽，接着将所述肽的赖氨酸残基置换为Hcit，然后进行进一步分析。尽管使用了IEDB来预测表位的结合得分，但预测结合强度与T细胞应答之间没有强相关性，仅4/10种肽刺激T细胞应答。这可能是由于IEDB算法不允许包含修饰的氨基酸。令人惊讶地，当表位中包括含有5个或更多个氨基酸的螺旋形的肽时，100％的表位刺激了T细胞应答(表1至4)。

使用在线IEDB预测程序(版本2.20，Vita等人,Nucleic Acids Res.2015Jan 28；43(Database issue):D405–D412)，本发明的高瓜氨酸化T细胞表位与MHC II类或I类的预测结合得分＜30。IEDB建议的选择使用一致法(Consensus approach)(Wang等人,BMCBioinformatics.11:568,2010；Wang等人,PLoS Comput Biol.4(4):e1000048,2008)，如果该分子有任何相应的预测物，则结合NN-align、SMM-align、CombLib和Sturniolo。否则，使用NetMHCIIpan。一致法考虑了四种方法中的任何三种的组合(如果可用)，其中Sturniolo是最终选择。预期的预测性能基于对MHC II类结合预测的性能的大规模评估：2008年的研究基于10,000多种结合亲和力(Wang等人，2008)，2010年的研究基于40,000多种结合亲和力(Wang等人，2010)和2012年的研究比较了泛特异性方法(Zhang等人，2012)。2008年和2010年的研究可用评估预测工具的补充信息。

对于CombLib和SMM_align，以IC50nM为单位给出预测输出。因此，较低的数字表示较高的亲和力。作为粗略的指导方针，将IC50值小于50nM的肽视为高亲和力，小于500nM视为中等亲和力，小于5000nM视为低亲和力。大多数已知的表位具有高亲和力或中等亲和力，包括本发明的那些表位。一些表位具有低亲和力，但已知的T细胞表位的IC50值均不大于5000nM。对于每个表位，通过将肽的得分与从SWISSPROT数据库中选择的500万种随机15聚体的得分进行比较，可以针对三种方法(组合文库(combinatorial library)、SMM_align和Sturniolo)中的每种方法生成百分等级。“预测结合得分”是百分等级得分。

作为与MHC II类或I类结合的预测结合得分＜30的替代方案，本发明的表位的IC50可以为3000nM或更小，优选为1000nM或更小，最优选为500nm或更小。可以使用本文实施例9中所述的测定来确定结合，并且本领域技术人员知道如何确定IC50。通过与已知的MHC-II结合表位如HepB 181-192竞争结合，可以证实与MHC-II的结合。例如，表位醛缩酶A 74-93Hcit、醛缩酶A 140-157Hcit、醛缩酶A 217-235Hcit、醛缩酶A 238-256Hcit、Cyk8 101-120Hcit、Cyk8 112-131Hcit、Cyk8 182-202Hcit、Cyk8 371-388Hcit和Cyk8 281-399Hcit均显示出大于60％的对HepB与HLA-DP4结合的抑制。因此，本发明的某些肽可显示出至少50％、60％、70％或80％的对HepB与HLA-DP4结合的抑制。通过与已知的MHC-I结合表位竞争结合，可以证实与MHC-I的结合。

本发明的高瓜氨酸化T细胞表位具有形成螺旋构象结构的至少5个连续的氨基酸，即在α螺旋区域内具有至少5aa的α螺旋结构。本领域技术人员知道许多用于确定氨基酸序列是否形成螺旋的技术。例如，可以使该肽结晶并使用X射线晶体学确定其结构。可替代地，可以使用NMR。此外，氨基酸是否可以形成螺旋状可以使用生物信息学分析(Alland等人.2005；Néron等人.2009)和计算机建模来预测，例如使用在线蛋白质折叠程序PEP-FOLD3，http://bioserv.rpbs.univ-paris-diderot.fr/services/PEP-FOLD3/；Lamiable等人,Nucleic Acids Res.2016Jul 8；44(W1):W449-54；Shen等人,J.Chem.Theor.Comput.2014；10:4745-4758；Thévenet等人,Nucleic Acids Res.2012.40,W288-293。

用满足这些标准的肽来免疫HLA转基因小鼠刺激强烈的CD4或CD8 T细胞应答。发明人首次表明，针对Hcit表位的T细胞库也存在于健康供体和癌症患者中。将外周血单核细胞(PBMC)分离，消耗CD25细胞，用CFSE标记，并在用Hcit表位刺激后进行增殖监测。从健康供体和癌症患者确定增殖，大多数供体对至少一个Hcit表位产生CD4 T细胞应答。

本发明的免疫原性肽是高瓜氨酸化的。所有这些肽(100％)都是免疫原性的。预测的HLA-DP4结合亲和力高(<30)，核心区域中存在高瓜氨酸残基，根据3D建模该肽本质上为两亲性且具有主要的螺旋构象结构，并且在小鼠和人序列之间存在同源性，则可以定义为免疫原性。回顾性地应用该模型以包括波形蛋白和ALDOA时，正确地预测了8/9(88％)肽。

出人意料的是，发明人发现某些高瓜氨酸表位与肿瘤相关联，因此可以用于增强针对这样的肿瘤的免疫应答。发明人已经鉴定了导致T细胞强免疫的氨甲酰化(或高瓜氨酸)，该氨甲酰化(或高瓜氨酸)可以发生在包括但不限于以下的特定蛋白上：波形蛋白、ALDOA、细胞角蛋白8、免疫球蛋白结合蛋白、核仁磷酸蛋白(NPM)、α-烯醇化酶、β-连环蛋白和HSP60。高瓜氨酸肽接种刺激了介导有效肿瘤疗法的特异性CD4和CD8应答。由于CD4和CD8T细胞分别识别MHC-II和MHC-I分子呈递的肽，氨甲酰化蛋白需要进行加工并进入MHC I类或II类途径。这可以在表达MPO的抗原呈递细胞内，该细胞可以将MHC-I或MHC-II上的氨甲酰化表位呈递给活化的CD8或CD4 T细胞。然后，这些细胞可以通过释放对肿瘤细胞具有细胞生长抑制作用或细胞毒性作用和/或募集其他免疫效应细胞(如CD8 T细胞)的细胞毒性细胞因子来介导旁观者抗肿瘤效应(Hung等人，1998)。如果是这种情况，因为CD4 T细胞将不必直接识别肿瘤细胞，高瓜氨酸肽特异性应答应在MHC-II阴性肿瘤上起作用。在该研究中，未看见高瓜氨酸肽对MHC-II阴性肿瘤的抗肿瘤应答。因此，肿瘤疗法在很大程度上取决于对肿瘤细胞的直接识别，提示高瓜氨酸肽通过肿瘤细胞自身在II类MHC上呈递。对于CD8介导的肿瘤疗法，也可以是同样的情况，即在肿瘤上通过MHC I类直接呈递高瓜氨酸肽。这是出乎意料的，因为肿瘤细胞不表达MPO，因此肿瘤细胞本身不可能将赖氨酸转化为高瓜氨酸。转化必须依赖于产生异氰酸的浸润细胞，该异氰酸扩散到肿瘤细胞中并导致氨甲酰化。针对MPO表达，对体外和体内生长的肿瘤细胞的染色揭示了B16肿瘤细胞不表达该酶。体内MPO的表达主要限于嗜中性粒细胞、巨噬细胞和单核细胞亚群，这些亚群被认为是引起炎症驱动的蛋白质氨甲酰化的原因(Wang等人2007；Cedervall，Hamidi和Olsson 2018)。染色数据证实了这一点，在肿瘤和脾脏中的CD11b+细胞中检测到MPO表达，而CD11b是由嗜中性粒细胞、粒细胞、巨噬细胞和单核细胞的表达标志物。在肿瘤环境中对表达MPO的细胞的进一步分析表明，表达MPO的CD11b+细胞被分为表达高水平Ly6C和不表达Ly6G的亚群，或者表达较低水平Ly6C的Ly6G+亚群。这些标志物已被定义为分别区分单核细胞型髓系来源抑制性细胞(MDSC)群和粒细胞型髓系来源抑制性细胞群(Youn等人2012；Zhao等人2016)。消耗(Depletion)研究揭示了，去除Ly6G+级分对肿瘤的生长的作用较小，而与肽接种组合，似乎对肿瘤疗法的影响较小，提示Ly6G+细胞在肿瘤环境中作为蛋白质氨甲酰化的MPO来源可能起较小的作用。消耗Ly6C+细胞对肿瘤生长有更深远的影响，其作为独立疗法提供了显著的治疗肿瘤的效果。Ly6C消耗与肽接种的组合将通过多肽疫苗所见的治疗性抗肿瘤效应显著降低至单独通过抗体消耗所见的水平。这提示Ly6C+细胞级分，特别是高Ly6C细胞，作为负责肿瘤中氨甲酰化的MPO的来源的作用。比较急性炎症诱导后野生型小鼠和MPO敲除小鼠之间氨甲酰化蛋白水平，显示野生型小鼠中水平显著升高，表明MPO在体内蛋白质氨甲酰化中起主要作用(Kollipara和Zahedi 2013)。有趣的是，肿瘤中MPO的产生与Ly6C+细胞有关，而在脾脏中，该细胞群似乎不产生MPO，提示存在某些组织特异性。在许多癌症中，已确定浸润细胞内有MPO表达，并与不良预后有关(Castillo-Tong等人，2014；Droeser等人，2013)。由于致癌性转化，癌细胞显示出高水平的过氧化氢，这通常还与抗氧化剂失衡相关联(Benfeitas等人，2017)。这导致对核DNA和线粒体DNA的破坏，进而促进过氧化氢生成，从而导致过氧化氢产生的恶性循环。来自免疫浸润物的MPO和来自肿瘤细胞的过氧化氢的结合导致产生异氰酸，然后异氰酸可以扩散穿过细胞膜并诱导肿瘤细胞内胞质蛋白的氨甲酰化(Roberts等人，2011)。有趣的是，吸烟者的血清硫氰酸盐水平升高，这被认为会驱动氨甲酰化增加并增加某些自身免疫疾病的风险，但也可能成为癌症疫苗的靶标(Martinez等人2016；Ospelt等人2017)。是否由肿瘤或MDSC产生过氧化氢仍有待证明，但我们已经表明氰酸钾可扩散到肿瘤细胞中并导致蛋白质的氨甲酰化。发明人在本文中已经证明MDSC可以在体外驱动肿瘤蛋白的氨甲酰化，从而支持MDSC介导的在肿瘤中的氨甲酰化的作用。然后，像瓜氨酸化蛋白一样，氨甲酰化蛋白可以在自噬过程中被消化并呈递在MHC-II上(Brentville等人，2016)。氨甲酰化蛋白也可以交叉呈递至MHC-I呈递途径上以呈递在MHC-I上。MHC II类抗原加工途径可能受许多因素影响，例如外源性抗原的内在化和加工、每个MHC II类分子的肽结合基序以及MHC II类:肽复合物的运输和稳定性。MHC II类肽结合槽的两端均是开放的，并且与MHC I类分子相比受肽长度的约束较小。与MHC II类分子结合的肽的长度范围为13至25个氨基酸，并且通常从MHC分子中突出(Kim等人，2014；Sette等人，1989)。这些肽含有连续拉伸的九个氨基酸，称为核心区域。这些氨基酸中的一些直接与肽结合槽相互作用(Andreatta等人，2017)。核心肽两侧的氨基酸均从肽结合槽中突出。这些被称为肽侧翼区。它们还可以影响肽结合以及随后与T细胞的相互作用(Arnold等人，2002；Carson等人，1997；Godkin等人，2001)。MHC II类肽的长度允许将长肽(例如15至20聚体)用于筛选。例如，要覆盖波形蛋白，如果筛选每个肽，则需要429种肽。然而，由于中央结合核心区域，可以使用偏移(offset)4个氨基酸的15聚体或偏移5个氨基酸的20聚体。例如，在波形蛋白中，这将需要114x 15聚体的重叠肽；这些覆盖了全部466个氨基酸，并且以11个氨基酸重叠。可替代地，如果使用以15个氨基酸重叠的20聚体，则需要91x 20聚体肽。其中，60种肽含有赖氨酸残基。为了筛选60种肽，将这些组合成较小的肽池，并且合并到体外测定中或用于体内鼠类免疫研究中。这种类型的筛选是设计新表位(neoepitope)个性化疫苗以筛选数百种肽的标准。例如，Liu等人检查卵巢上皮癌患者中对新生抗原(neoanitgen)的应答(Liu等人，2019)。他们筛选了75种肽，发现27种刺激了T细胞应答。Bobisse等人筛选了776种肽，发现15种(2％)刺激了T细胞应答(Bobisse等人，2018)。

该方法也是鉴定MHC I类肽的可行方式，因为更长的20聚体肽也可以包含嵌套的MHCI限制性表位，该方法已用于鉴定MHCII和MHCI限制性CD4和CD8应答。鉴于这样的方法在为个体癌症患者鉴定癌症疫苗新抗原靶标上的用途，对于为了开发疫苗来治疗其肿瘤表达瓜氨酸化抗原的多种癌症患者的单一抗原而言，这同样是可行且合理的方式。这将需要在多个供体中进行测试以确保鉴定出与不同的MHC-II和MHC-I分子结合的表位。在每个供体中，可以单独使用，也可以合并使用相同的114x 15聚体或91x20聚体重叠肽。

MHC II类分子是高度多形态的，肽结合基序高度简并，已鉴定出可以结合多种MHCII类分子的许多混杂肽(promiscuous peptide)(Consogno等人，2003年)。从MHC II类:肽复合物的晶体学研究中已经鉴定了对肽结合至关重要的氨基酸(Corper等人，2000；Dessen等人，1997；Fremont等人，1996；Ghosh等人，1995；Latek等人，2000；Li等人，2000；Lee,，Wucherpfennig,，and，Wiley，2001；Brown等人，1993；Smith等人，1998；Stern等人，1994；Scott等人，1998；Fremont等人，1998)。这些研究表明，P1、P4、P6和P9始终指向MHC，而P-1、P2、P5、P8和P11始终指向TCR。英国人群中最常见的HLA-DR等位基因的肽结合基序如图2a所示，这些HLA等位基因的频率列于表1(Thomsen和Nielsen 2012)。HLA DR基序显示跨不同HLA-DR等位基因的锚点位置(P1、P4、P6和P9)处的特定氨基酸偏好，这与肽的来源无关(Barra等人，2018)。从图2a所示的基序可见，赖氨酸不是很好的锚点残基，并且很少存在于P1、P4、P6和P9中。相反，赖氨酸倾向于存在于P2、P5和P8处。这些位置始终面向TCR，并且在MHC:TCR相互作用中可能是重要的。

等位基因	拥有等位基因的个体％	样本量
			DRB1*04	32	57,732
DRB1*03	28	57,732
			DRB1*07	28	57,732
DRB1*15	28	57,732
			DBR1*01	22	57,732

表1英国人群中的HLA-DR等位基因频率

相反，MHC I类分子显示出更多受限制的肽结合特性。通过预测算法分析已知的天然结合肽(Jurtz等人，2017)，还鉴定出对与MHC I类结合至关重要的氨基酸(Jurtz等人，2017)，这表明P2和P9朝向MHC定向，充当结合锚点残基(HLA-B*0801除外)。图2b和2c显示了英国人群中常见的HLA等位基因的肽结合基序。从图2b和2c所示的基序可见，赖氨酸不是良好的锚点残基，并且很少存在于P2或P9中(HLA A*0301除外)。相反，赖氨酸可以存在于在MHC:TCR相互作用中可能很重要的其他位置处。这提示将赖氨酸改变为高瓜氨酸将改变被识别的T细胞库。

本发明的表位可以来自胞质蛋白。可以被氨甲酰化并且通常在肿瘤中表达的胞质蛋白是醛缩酶A(图3a和3b)、波形蛋白(图3c)、细胞角蛋白8(图3d)、BiP(图3e)、核仁磷酸蛋白(图3f)、α-烯醇化酶(图3g)、β-连环蛋白(图3h)和HSP60(图3i)。本发明的表位可以来自这些蛋白质中的任一种。

在癌细胞中，波形蛋白在EMT期间对细胞骨架重组很重要(Liu等人，2015；Poliodudaki等人，2015)。在EMT期间，上皮细胞标志物被下调，间质标志物(如波形蛋白)被上调，这导致增殖和转移增加。波形蛋白是三阴性乳腺癌、胃癌和非小细胞肺癌(NSCLC)预后不良的标志物(Otsuki等人，2011；Yamashita等人，2013；Tadokoro等人，2016)。越来越多的证据提示，高瓜氨酸化波形蛋白和抗高瓜氨酸化波形蛋白抗体参与了RA的发病机理(Ospelt等人，2017)。波形蛋白是RA中主要且良好表征的自身抗原。从细胞核延伸到质膜的波形蛋白网络被认为充当支架，提供细胞机械结构支持，从而维持细胞和组织的完整性(Lundkvist等人，2004)。最近，已经描述了识别波形蛋白的高瓜氨酸化的抗体，并且还表明波形蛋白可以形成其自身的氨甲酰化抗原类别，该氨甲酰化抗原类别在动物模型中可以以修饰特异性的方式被识别(Ospelt等人，2017)。我们首次说明了高瓜氨酸化的波形蛋白肽导致强烈的免疫T细胞应答和抗肿瘤免疫。

醛缩酶是一种糖酵解蛋白，已证明醛缩酶执行包括与细胞骨架蛋白相互作用在内的许多附加功能。醛缩酶，作为在细胞质中发现的糖酵解酶，像波形蛋白一样也可以被高瓜氨酸化。在哺乳动物中，存在三种同工型(A、B和C)的醛缩酶，这三种同工型由三种不同的基因编码。三种人醛缩酶同工酶在序列上相似，人A型与B型之间的同一性为66％，B型与C型之间的同一性为68％，A型与C型之间的同一性为78％(图3a)。ALDOA基因编码果糖二磷酸醛缩酶A，该果糖二磷酸醛缩酶催化果糖-1,6-二磷酸可逆转化为甘油醛-3-磷酸和胚胎的肌肉和大脑中表达的二羟丙酮磷酸。ALDOA在包括肺鳞状细胞癌(LSCC)和肾上腺皮质肿瘤在内的许多癌症中高表达(Du等人，2014年；Kjellin等人，2014年)。ALDOA的上调与结肠癌、肾细胞癌和结肠直肠癌的不良预后有关(Dai等人，2018；Huang等人，2018；Ye等人，2018)。ALDOA表达沉默降低了癌细胞系的细胞增殖、迁移、侵袭和EMT表型，提示ALDOA可能是疗法的重要靶标。醛缩酶B(ALDOB)优先在肝脏、肾脏和肠上皮细胞中表达，醛缩酶C(ALDOC)在脑中表达。增殖受缺氧条件、致癌信号和Myc癌蛋白调节的癌细胞增强了糖酵解作用，这导致肿瘤细胞中糖酵解酶的表达增加。肿瘤微环境中的缺氧是实体瘤生长期间的主要因素。因此，糖酵解酶的上调对于肿瘤存活是必要的。AldoA启动子包含缺氧反应元件，该元件在细胞中在缺氧应激反应中被上调(Semenza等人，1996)。在LSCC中，ALDOA的上调与转移和不良预后相关联，而ALDOA的消耗则降低了肿瘤细胞运动和肿瘤发生的能力(Du等人，2014)。除糖酵解功能外，还存在其他潜在的ALDOA可能参与致癌作用的机制。已经提示，ALDOA在细胞周期调节中起关键作用。ALDOA沉默抑制了癌细胞增殖，并且不干扰细胞能量代谢，提示这与糖酵解功能无关(Ritterson Lew和Tolan，2012)。也存在证据表明，ALDOA与MKI67(增殖标志物)(Ritterson Lew和Tolan，2012)和MELK(细胞周期依赖性蛋白激酶)(Zhang等人2017)关联而调节癌细胞增殖。这些功能共同提示，ALDOA在肿瘤生长和转移中起到积极的作用。已显示ALDOA在多种恶性肿瘤中高表达，包括肺癌(Du等人，2014)、骨肉瘤(Chen等人，2014)、结肠直肠癌(Peng等人，2012)、口腔鳞状细胞癌(Lessa等人，2013)、肾上腺皮质肿瘤(Kjellin等人，2014)和肝细胞癌(Hamaguchi等人，2008)。由于ALDOA在实体瘤如非小细胞肺癌、宫颈癌、乳腺癌和肝细胞癌中可能显著升高，因此ALDOA表达升高可以作为这些癌症的诊断和预后标志物(Zhang等人，2017)。在RA患者中，ALDOA已被证明是自身抗原(Goeb等人，2009)。二维凝胶和质谱鉴定出的ALDOA肽可以由早期RA患者的血清瓜氨酸化(RLQSIGTENTEENR和KDGADFAKWRRCVLK)(Goeb等人，2009)。在朊病毒病中，也已经展示瓜氨酸化的ALDOA(Jang等人，2008；Jang等人，2010)。然而，到目前为止，没有关于ALDOA的氨甲酰化的证据。我们首次说明了导致强烈的免疫应答和抗肿瘤免疫的ALDOA的氨甲酰化和高瓜氨酸化肽。尚无针对ALDOA的抗氨甲酰化T或B细胞应答的报道。我们首次说明了ALDOA的氨甲酰化和高瓜氨酸化肽导致强烈的免疫应答和抗肿瘤免疫。

角蛋白是最大的中间丝蛋白家族，具有广泛的组织分布、多种功能和疾病关联性(Chou，Skalli和Goldman，1997；Chang等人，2013)。它们通过形成从质膜散发的胞质支架而在维持细胞的形状和刚性中起到重要作用(Fuchs和Cleveland，1998)。除结构功能外，它们还参与调节细胞周期进程、细胞凋亡、对应激的细胞应答、蛋白质合成、细胞大小和膜贩运的信号传导途径(Paramio和Jorcano，2002；Coulombe和Omary，2002；Oshima，2002)。角蛋白8(以前称为细胞角蛋白8：Cyk8)与角蛋白18聚合，这对角蛋白是首个在胚胎发生中表达的。在成年组织中，这对蛋白的表达限于简单的(如肝、胰腺、肾脏)上皮细胞和混合的(如乳腺、肺)上皮细胞(Moll等人，1982；Owens和Lane，2003；Franke等人，1981；Olson等人，1981，Blobel等人，1984)。在腺癌和鳞状细胞癌中已观察到这对蛋白的过表达(Oshima，Baribault和Caulin，1996；Vaidya等人，1989)。据报道，角蛋白8和18的表达连同波形蛋白导致乳腺细胞癌和黑素瘤的耐药性、侵袭和转移增加(Thomas等人，1999)。Cyk8的异常表达被发现于在非小细胞肺癌中，并且也存在于NSCLC患者的血清中(Fukunaga等人，2002)。在RA患者中已发现Cyk8自身抗体，且Cyk8自身抗体被描述为与RA相关联的所谓抗角蛋白抗体的真正抗原中的一种(Wang等人，2015)。尚未报道有针对Cyk8的抗氨甲酰化T或B细胞应答。我们首次说明了高瓜氨酸化的Cyk8肽诱导强烈的T细胞应答和抗肿瘤免疫。

结合免疫球蛋白(BiP)/葡萄糖调节蛋白78(GRP78)/热休克蛋白(5a(HSP5a)是HSP70的成员，BiP的相对分子量范围为72kDa至83kDa(Blass等人，2001)。在哺乳动物中，BiP通常被发现于ER内腔中，充当未折叠蛋白反应(UPR)的关键调节剂(Lewy，Grabowski和Bloom，2017)。BiP通过与新生肽上暴露的疏水残基相互作用来阻止细胞中未折叠蛋白的积累(Dorner，Wasley和Kaufman 1992)。除ER外，越来越多的证据表明在细胞质、线粒体、细胞核中以及在细胞表面上也可以发现BiP(Lee，2014；Luo和Lee，2013；Ni，Zhang和Lee，2011)。已经发现BiP优选在应激的癌细胞表面上表达，BiP在所述应激的癌细胞中参与关键致癌信号传导途径的调节。ER应激有效地增强了癌细胞表面上BiP的表达(Arap等人，2004；Gonzalez-Gronow等人，2009；Zhang等人，2010)。在一些肿瘤起始细胞(tumour initiatingcell，TIC)的细胞表面上也检测到了BiP，在转移性和化学抗性癌细胞和支持肿瘤细胞的低氧内皮细胞中也检测到了BiP水平升高(Arap等人，2004；Gonzalez-Gronow等人，2009；Lee，2014)。已经从癌症患者中鉴定并分离出抗BiP抗体。抗BiP IgG抗体与BiP的N末端区域结合，该BiP分离自前列腺癌患者的血清并增强细胞存活和增殖(Gonzalez-Gronow等人，2006)。人抗BiP mAb识别C端区域的最后20个氨基酸残基对细胞增殖没有影响，也不会诱导细胞凋亡(Jakobsen等人，2007)。据报道，在RA患者的血清中检测到抗瓜氨酸化BiP(抗citBiP)抗体(Shoda等人，2011)。尚未报道有针对Bip的抗氨甲酰化T或B细胞应答。我们首次说明了可以针对BiP而刺激抗氨甲酰化的T细胞应答，并且这些可以介导肿瘤疗法。

核仁磷酸蛋白是一种核仁/胞质蛋白，其在包括核糖体生物发生、mRNA加工和染色质重构在内的细胞代谢中起多种作用(Box等人，2016)。多种人类癌症中都已报道了NPM的过表达，该多种人类癌症包括胰腺(Zhu等人，2015)、前列腺(Leotoing等人，2008)、肝(Yun等人，2007)、结肠(Nozawa等人，1996)、胃(Tanaka等人，1992)，甲状腺(Pianta等人，2010)以及胶质母细胞瘤(Holmberg Olausson等人，2015)中的那些人类癌症。此外，在某些癌症(如膀胱癌)中，疾病进展至晚期也与NPM表达相关(Tsui等人，2004)。NPM还与急性髓性白血病和非霍奇金淋巴瘤中的染色体易位有关。在35％的AML患者中，NPM是突变的并且异常地位于白血病细胞的细胞质中(Falini等人，2005)。AML患者具有正常核型，而NPM向细胞质的转移是由于外显子12中的突变(Falini等人，2005)。然而NPM经历了许多翻译后修饰，包括泛素化、磺酰化、磷酸化、聚(ADP-核糖基)化和瓜氨酸化(Hagiwara等人，2002；Tanikawa等人，2009)。尚未报道有针对NPM的抗氨甲酰化T或B细胞应答。我们首次说明了可以针对NPM而刺激抗氨甲酰化的T细胞应答，并且这些可以介导肿瘤疗法。

α-烯醇化酶是催化糖酵解中倒数第二个步骤的糖酵解酶(Miles等人，1991)。许多肿瘤甚至在常氧条件下也通过糖酵解转换成产生其能量，这一过程称为“瓦博格效应”。因此，ENO1在多种肿瘤中过表达(Zhao等人，2015；Cappello等人，2009；Fu等人，2015；Principe等人，2015)。由于ENO1在大多数细胞中普遍表达且丰富，因此ENO1在自噬过程中也被降解。先前的研究表明ENO1也可以被瓜氨酸化(Lundberg等人，2008；Gerstner等人，2016)。尚未报道有针对ENO1的抗氨甲酰化T或B细胞应答。我们首次说明了可以针对ENO1而刺激抗氨甲酰化的T细胞应答，并且这些可以介导肿瘤疗法。

β连环蛋白是一种原癌基因，是WNT途径的重要组成部分(Moon等人，2002)。该基因的突变常见于多种癌症：在原发性肝细胞癌、结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌和胶质母细胞瘤。据估计，来自所有癌症的进行测序的所有组织样本中约10％显示出CTNNB1基因有突变。这些突变大多数集中在β-连环蛋白的N末端片段的微小区域，即β-TrCP结合基序上。该基序的功能丧失突变本质上使得β连环蛋白泛素化和降解不可能进行。这将导致β-连环蛋白在没有任何外部刺激的情况下转位至细胞核，并持续驱动其靶基因的转录(Gay等人，2015)。WNT家族成员已被鉴定为类风湿性关节炎的驱动因素和潜在治疗靶标(Miao et al。2013)。在基底细胞癌(BCC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、前列腺癌(CaP)、毛基质瘤(PTR)和成神经管细胞瘤(MDB)中也注意到了核β-连环蛋白水平的增加。这些观察结果可能暗示也可能不暗示β-Catenin基因突变：其他WNT途径组分也可能是有错误的。在腺瘤性结肠息肉病(APC)基因的β-Catenin募集基序中也经常看到类似的突变。APC的遗传性功能丧失突变导致被称为家族性腺瘤性息肉病的病症。受影响的个体在其大肠中会生长出数百个息肉。这些息肉大多数在性质上是良性的，但随着时间的推移，它们有可能转化为致命的癌症。大肠癌中APC的体细胞突变也并非是不常见的。乳腺癌中β-连环蛋白的异常表达与三阴性表型相关联(Geyer等人，2011)。β-连环蛋白和APC属于参与大肠癌发展的关键基因(连同其他基因，例如K-Ras和SMAD4)。β-连环蛋白将受影响的细胞先前的上皮表型改变为侵入性间充质样类型的潜力极大地促进了转移的形成。尚未报道有针对β-连环蛋白的抗氨甲酰化T或B细胞应答。

HSP60是一种分子伴侣蛋白，已知在原核生物和真核细胞细胞器中辅助蛋白质折叠。真核生物中的HSP60通常被认为是线粒体分子伴侣(也称为Cpn60)，但近几年来，已经清楚它也存在于细胞质、细胞表面、胞外空间以及外周血中(Cappello等人，2008)。已注意到HSP60在许多癌症中高表达，并且HSP60似乎在各种人类癌症的诊断-预后以及预防和治疗方面具有潜力(Saini和Sharma，2017)。它有利于某些类型的肿瘤细胞的存活，在某些情况下，它甚至可能是肿瘤细胞生长所必需的。肿瘤的免疫原性还可能取决于肿瘤细胞是否表达和分泌HSP60(Feng等人，2001；Lv等人，2012)。最近报道了类风湿性关节炎和肿瘤细胞系中存在瓜氨酸化HSP60(Lu等人，2016；Jiang等人，2013)。还裂解了B16DP4肿瘤，并通过质谱分析了该肿瘤的HSP60氨甲酰化。残基K191、K202、K205、K218、K222、K359、K481和K58均被氨甲酰化。到目前为止，尚无氨甲酰化HSP60的证据。但是，我们提供了在鼠肿瘤样品中存在高瓜氨酸残基的首个证据。

本发明的T细胞表位可以包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：i)以下氨基酸序列中的一个或多个氨基酸序列，其中一个或多个(优选全部)赖氨酸(K)残基被高瓜氨酸置换：

ii)i)的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸序列，不同之处在于非赖氨酸位置上具有1、2或3个氨基酸取代和/或1、2或3个氨基酸插入和/或1、2或3个氨基酸缺失。抗原可在非赖氨酸位置上具有总共1、2、3、4或5个选自取代、插入和取代的氨基酸修饰。

优选的是，如果本发明的T细胞抗原包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：i)以下氨基酸序列中的一个或多个氨基酸序列，其中一个或多个(优选全部)赖氨酸(K)残基被高瓜氨酸置换：

ii)i)的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸序列，不同之处在于非赖氨酸位置上具有1、2或3个氨基酸取代和/或1、2或3个氨基酸插入和/或1、2或3个氨基酸缺失。表位可在非赖氨酸位置上具有总共1、2、3、4或5个选自取代、插入和取代的氨基酸修饰。

本发明的T细胞表位可以包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：i)以下氨基酸序列中的一个或多个氨基酸序列：

其中“Hcit”代表高瓜氨酸，或ii)i)的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸序列，不同之处在于非高瓜氨酸位置上具有1、2或3个氨基酸取代和/或1、2或3个氨基酸插入和/或1、2或3个氨基酸缺失。表位肽可在非高瓜氨酸位置上具有总共1、2、3、4或5个选自取代、插入和取代的氨基酸修饰。

发明人出乎意料地发现，衍生自波形蛋白和ALDOA的高瓜氨酸化肽可用于增强针对肿瘤的免疫应答，所述肿瘤包括但不限于胰腺肿瘤、肾肿瘤、黑素瘤、头颈肿瘤、乳腺肿瘤和肺部肿瘤。发明人已经表明以下十一种肽产生了T细胞应答，并且测试了这些肽中的5/5*(*)针对高瓜氨酸化波形蛋白、ALDOA或细胞角蛋白8表位的体内抗肿瘤应答：

发明人出乎意料地发现，衍生自波形蛋白、ALDOA、烯醇化酶、BiP、核仁磷酸蛋白、细胞角蛋白8和HSP60的进一步的高瓜氨酸化肽可用于增强针对肿瘤的免疫应答，所述肿瘤包括但不限于胰腺肿瘤、肾肿瘤、黑素瘤、头颈肿瘤、乳腺肿瘤和肺部肿瘤。发明人已经表明以下十四种肽产生了T细胞应答，并且测试了这些肽中的四种(*)针对高瓜氨酸化波形蛋白、BiP、NPM或α-烯醇化酶表位的体内抗肿瘤应答：

波形蛋白、ALDOA、细胞角蛋白8、BiP、NPM、α-烯醇化酶、β-连环蛋白和HSP60在该基因已被克隆的物种(小鼠、大鼠、绵羊、牛、马、兔、猪、鸡和人)之间是高度保守的。因此，本发明的表位，任选地与包含编码这样的肽的序列的核酸组合，可用于治疗人和非人哺乳动物的癌症。癌症可以是胰腺癌、肾癌、黑素瘤、头颈癌、乳腺癌或肺癌、伯基特氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、黑素瘤、胰腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、急性淋巴细胞性白血病或急性髓性白血病。

本发明在其范围内还包括表位及其在医学中的用途，特别是在治疗癌症的方法中的用途，该表位具有上述氨基酸序列和与上述氨基酸序列具有实质同一性的序列，例如与上述氨基酸序列具有70％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的序列。通常通过以下方式确定两条氨基酸序列或两条核酸序列的同一性百分比：为最佳比较目的而对序列进行比对(例如，可以在第一序列中引入缺口以与第二序列进行最佳比对)，并比较相应位置的氨基酸残基或核苷酸。“最佳比对”是导致最高同一性百分比的两条序列的比对。同一性百分比通过比较序列中相同氨基酸残基或核苷酸的数目来确定(即，同一性％＝相同位置数/位置总数×100)。

可以使用本领域技术人员已知的数学算法来完成对两条序列之间的同一性百分比的确定。比较两条序列的数学算法的一个例子是Karlin和Altschul的算法，如(Karlin和Altschul，1993)中所改进。Altschul等人的NBLAST和XBLAST程序中已经编入了这样的算法(Altschul等人，1990)。可以用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索，其中得分＝100，字长＝12，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，其中得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如(Altschul等人，1997)中所述使用GappedBLAST。可替代地，可以使用PSIBlast执行迭代搜索，以检测分子之间的远距离关系。当使用BLAST、GappedBLAST和PSIBlast程序时，可以使用各个程序的默认参数(例如XBLAST和NBLAST)。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。用于序列比较的数学算法的另一个实例是Myers和Miller的算法(Myers和Miller，1989)。作为GCG序列比对软件包的一部分的ALIGN程序(版本2.0)中已经编入了这种算法。本领域已知的用于序列分析的其他算法包括如(Torelli和Robotti 1994)中所述的ADVANCE和ADAM以及如(Pearson和Lipman 1988)中所述的FASTA。在FASTA中，ktup是设置搜索的灵敏度和速度的控制选项。

氨基酸取代是指氨基酸残基在相同位置处被置换氨基酸残基取代。可以在任何位置插入被插入的氨基酸残基，并且可以插入被插入的氨基酸残基，使得一些或全部被插入的氨基酸残基彼此紧邻，或者可以插入被插入的氨基酸残基，使得被插入的氨基酸残基均不与另一个被插入的氨基酸残基紧邻。

本发明的抗原可以在其C末端和/或N末端包含一个、两个或三个额外的氨基酸。本发明的抗原可以包含上述氨基酸序列，其中不同之处在于存在一个氨基酸取代和一个氨基酸插入、一个氨基酸取代和一个氨基酸缺失、或一个氨基酸插入和一个氨基酸缺失。本发明的抗原可以包含上述氨基酸序列，其中不同之处在于存在一个氨基酸取代、一个氨基酸插入和一个氨基酸缺失。

被插入的氨基酸和置换氨基酸可以是天然存在的氨基酸或可以是非天然存在的氨基酸，并且例如可以包含非天然侧链。在Douat-Casassus等人,J.Med.Chem,2007Apr 5；50(7):1598-609和Hoppes等人,J.Immunol2014Nov 15；193(10):4803-13以及其中的参考文献中进一步讨论了这样的改变的肽配体。如果取代和/或插入多于一个氨基酸残基，则置换/被插入的氨基酸残基可以彼此相同或彼此不同。每个置换氨基酸可以具有与被置换的氨基酸不同的侧链。

优选地，本发明的抗原与MHC结合于MHC分子的肽结合槽中。通常，上述氨基酸修饰不会损害肽结合MHC的能力。在优选的实施方式中，氨基酸修饰改善了肽结合MHC的能力。例如，可以在肽锚定至MHC的位置进行突变。这样的锚点位置和在这些位置的优选残基是本领域已知的。

本发明的抗原可用于引发免疫应答。如果是这种情况，则重要的是免疫应答对预期的靶标具有特异性，以避免可能与“脱靶”免疫应答相关联的不想要的副作用的风险。因此，优选本发明的多肽的氨基酸序列与来自任何其他蛋白质的(特别是另一种人蛋白质)的肽的氨基酸序列不匹配。本领域技术人员会理解如何搜索已知蛋白质序列的数据库，以确定根据本发明的表位是否存在于另一种蛋白质中。

本发明的表位可以通过Merrifield合成(也称为固相合成)或任何其他肽合成方法容易地合成。GMP级多肽是由Multiple Peptide Systems,San Diego,CA通过固相合成技术生产的。可替代地，如果需要，可以根据本领域已知的方法重组产生该肽。这样的方法通常涉及使用包含编码待表达多肽的核酸序列的载体以在体内表达该多肽；例如，在细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞中表达。可替代地，可以使用体外无细胞系统。这样的系统是本领域已知的，并且可以例如从Life Technologies,Paisley,UK商购获得。抗原可以是分离的和/或可以以基本上纯的形式提供。例如，它们可以以基本上不含其他多肽或蛋白质的形式提供。可以使用Fmoc化学或本领域技术人员已知的其他标准技术来合成本发明的肽。

在第二方面，本发明提供了第一方面的抗原和MHC分子的复合物。优选地，抗原与MHC分子的肽结合槽结合。MHC分子可以是MHC II类。MHC II类分子可以是DP或DQ等位基因，例如HLA-DR4、HLA-DR1、HLA-DP4、HLA-DP2、HLA-DP5、HLA-DQ2、HLA-DQ3、HLA-DQ5和HLA-DQ6。首选HLA-DR4、HLA-DR1和HLA-DP4。MHC分子可以是MHC I类。MHCI类分子可以是A、B或C等位基因，例如HLA-A2、HLA-A1、HLA-A3、HLA-A24、HLA-A32、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B15、HLA-B35、HLA-B44、HLA-C3、HLA-C7、HLA-C6、HLA-C5。HLA-A2是优选的。本发明的复合物可以是分离的和/或基本上纯的形式。例如，复合物可以以基本上不含其他多肽或蛋白质的形式提供。应当注意，在本发明的上下文中，术语“MHC分子”包括重组MHC分子、非天然存在的MHC分子和MHC的功能等同片段，包括其衍生物或变体，只要保留肽结合即可。例如，MHC分子可以以可溶形式和/或以多聚形式与连接至固体支持物的治疗部分融合。

产生可与本发明的抗原形成复合物的可溶性重组MHC分子的方法是本领域已知的。合适的方法包括但不限于从大肠杆菌细胞或昆虫细胞表达和纯化。可替代地，可以合成产生或使用无细胞系统产生MHC分子。

本发明的表位和/或表位-MHC复合物可以与能够引起治疗作用的部分缔合。这样的部分可以是已知具有免疫原性的载体蛋白。KLH(钥孔戚血蓝蛋白)是疫苗组合物中使用的合适载体蛋白的实例。可替代地，本发明的表位和/或表位-MHC复合物可以与融合伴侣缔合。融合伴侣可以用于检测目的，或用于使所述表位或MHC连接至固体支持物，或用于MHC寡聚化。MHC复合物可以并入生物素化位点，例如使用BirA酶可以向所述生物素化位点添加生物素(O’Callaghan等人,1999Jan 1；266(1):9-15)。其他合适的融合伴侣包括但不限于产生可检测产物的荧光或发光标记、放射性标记、核酸探针和造影剂、抗体或酶。检测方法可以包括流式细胞术、显微镜检查、电泳或闪烁计数。

本发明的表位-MHC复合物可以以可溶形式提供或可以通过连接至合适的固体支持物而被固定。固体支持物的实例包括但不限于珠、膜、琼脂糖凝胶(sepharose)、磁珠、板、管、柱。表位-MHC复合物可以连接至ELISA板、磁珠或表面等离子体共振生物传感器芯片。将表位-MHC复合物连接至固体支持物的方法是技术人员已知的，包括例如使用亲和结合对，例如生物素与链霉亲和素、或抗体和抗原。在优选的实施方式中，表位-MHC复合物用生物素标记并连接至链霉亲和素包被的表面。

本发明的表位-MHC复合物可以是多聚形式，例如，二聚体、或四聚体、或五聚体、或八聚体、或更大的形式。Greten等人,Clin.Diagn.Lab.Immunol.2002Mar；9(2):216-20及其参考文献描述了产生多聚肽MHC复合物的合适方法的实例。通常，可以使用生物素残基标记的表位-MHC来产生并通过荧光标记的链霉亲和素来复合表位-MHC多聚体。可替代地，可以通过使用免疫球蛋白作为分子支架来形成多聚表位-MHC复合物。在该系统中，MHC分子的胞外结构域与免疫球蛋白重链的恒定区通过将它们分隔开的短氨基酸接头而融合。还已经使用诸如右旋糖酐的载体分子产生了表位-MHC多聚体(WO02072631)。由于亲合力作用，多聚表位-MHC复合物可用于改善对结合所述复合物的结合部分(如T细胞受体)的检测。

本发明的表位可以与MHC复合而呈递在细胞表面上。因此，本发明还提供了在其表面上呈递本发明的复合物的细胞。这样的细胞可以是哺乳动物细胞，优选地是免疫系统的细胞，并且特别是特化的抗原呈递细胞，例如树突状细胞或B细胞。其他优选的细胞包括T2细胞(Hosken等人,Science.1990Apr20；248(4953):367-70)。呈递本发明的表位或复合物的细胞可以是分离的，优选是以群的形式，或以基本上纯的形式提供。所述细胞可以非天然地呈递本发明的复合物，或者可替代地，所述细胞可以以高于其在天然条件下的水平呈递复合物。这样的细胞可以通过用本发明的表位冲激所述细胞来获得。冲激涉及使用通常在10^-5至10^-12M范围内的多肽浓度将细胞与表位一起孵育数小时。可以重组产生细胞。呈递本发明的表位的细胞可用于分离被所述细胞活化或与所述细胞结合的T细胞和T细胞受体(TCR)，如下文更详细地描述的。

本发明的表位和复合物可用于鉴定和/或分离与本发明的表位和/或复合物特异性结合的结合部分。这样的结合部分可以用作免疫治疗剂，并且可以包括抗体和TCR。

在第三方面，本发明提供了结合本发明的表位的结合部分。优选地，当所述多肽与MHC复合时，结合部分结合抗原。在后一种情况下，结合部分可以部分地结合MHC，前提是它也结合抗原。结合部分可以仅结合表位，并且该结合可以是具有特异性的。结合部分可以仅结合表位-MHC复合物，并且该结合可以是具有特异性的。

当参考结合本发明的复合物的结合部分而使用时，“具有特异性的”在本文中通常用于指这样的情况，即除了本发明的表位-MHC复合物以外，结合部分未显示出与一种或多种替代性表位-MHC复合物的任何显著结合。

结合部分可以是T细胞受体(TCR)。TCR使用国际免疫遗传学(IMGT)TCR命名法进行描述，并链接到TCR序列的IMGT公共数据库。由IMGT命名法定义的独特序列是众所周知的，并且对于TCR领域技术人员来说是可得到的。例如，它们可以在“T cell ReceptorFactsbook”,(2001)LeFranc and LeFranc,Academic Press,ISBN 0-12-441352-8；Lefranc,(2011),Cold Spring Harb Protoc 2011(6):595-603；Lefranc,(2001),CurrProtoc Immunol Appendix 1:Appendix 1O；Lefranc,(2003),Leukemia 17(1):260-266，以及在IMGT网站(www.IMGT.org)中找到。

本发明的TCR可以是本领域技术人员已知的任何格式。例如，TCR可以是αβ异二聚体，或者它们可以是单链格式(例如WO9918129中所描述的那些)。单链TCR包括以下类型的αβTCR多肽：Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vβ、Vα-L-Vβ-Cβ或Vα-Cα-L-Vβ-Cβ，任选地为相反方向，其中Vα和Vβ分别是TCRα和TCRβ可变区，Cα和Cβ分别是TCRα和TCRβ恒定区，L是接头序列。TCR可以是可溶形式(即不具有跨膜结构域或胞质结构域)，或可以包含全长α链和β链。TCR可以在细胞(如T细胞)的表面上提供。该细胞可以是哺乳动物细胞，例如人细胞。

该细胞可用于医学，特别是用于治疗癌症。癌症可以是实体瘤或血液肿瘤。癌症可以是胰腺癌、肾癌、黑素瘤、头颈癌、乳腺癌、肺癌、伯基特氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、黑素瘤、胰腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、急性淋巴细胞性白血病或急性髓性白血病。所述细胞对于待治疗对象可以是自体的，或者对于待治疗对象可以不是自体的。

相对于天然的/天然存在的TRAC/TRBC序列，本发明的TCR的α和/或β链恒定结构域可以被截短。此外，TRAC/TRBC可能包含修饰。例如，α链胞外序列可包括相对于天然的/天然存在的TRAC的修饰，其中TRAC的氨基酸T48(参考IMGT编号)被置换为C48。例如，β链胞外序列可包括相对于天然的/天然存在的TRBC1或TRBC2的修饰，其中TRBC1或TRBC2的S57(参考IMGT编号)被置换为C57。这些相对于天然α和β链胞外序列的半胱氨酸取代使得能够形成非天然链间二硫键，该非天然链间二硫键稳定了重新折叠的可溶性TCR，即通过重新折叠胞外α和β链形成的TCR(WO 03/020763)。这种非天然二硫键促进正确折叠的TCR在噬菌体上展示。(Li等人,Nat Biotechnol 2005Mar；23(3):349-54)。此外，使用稳定的二硫键连接的可溶性TCR使得能够更方便地评估结合亲和力和结合半衰期。WO 03/020763中描述了用于形成非天然二硫键的替代位置。

本发明的特定TCR包括如下的TCR：这些TCR包含本文图28至35、图37至45和图47至52中列出的成对的α和β链可变区。本领域技术人员将理解，可以排除这些氨基酸序列的C末端的约10至20个氨基酸，因为这些氨基酸形成恒定结构域的一部分。本发明的TCR可以包含α链可变结构域和β链可变结构域，其中成对的α和β链可变区的CDR在本文的图28至35、图37至45和图47至52中列出。因此，本发明的TCR可以包含以下CDR：

本文定义的TCR序列参考IMGT命名法进行描述，IMGT命名法是众所周知的，并且对于TCR领域技术人员来说是可得到的。例如，参见：LeFranc和LeFranc,(2001).“T cellReceptor Factsbook”,Academic Press；Lefranc,(2011),Cold Spring Harb Protoc2011(6):595-603；Lefranc,(2001),Curr Protoc Immunol Appendix1:Appendix 10O；和Lefranc,(2003),Leukemia 17(1):260-266。简而言之，αβTCR由两条二硫键连接的链组成。通常认为每条链(α和β)具有两个结构域，即可变结构域和恒定结构域。短连接区将可变结构域和恒定结构域连接起来，并且通常被视为α可变区的一部分。另外，β链通常在连接区旁边包含短多样性区，该短多样性区通常也被视为β可变区的一部分。

每条链的可变结构域位于N端，并包含嵌入框架序列(FR)中的三个互补决定区(CDR)。CDR包含针对肽-MHC结合的识别位点。存在数种编码α链可变区(Vα)的基因和数种编码β链可变区(Vβ)的基因，所述基因通过它们的框架、CDR1和CDR2序列以及通过部分定义的CDR3序列区别开来。Vα和Vβ基因在IMGT命名法中分别以前缀TRAV和TRBV指代(Folch和Lefranc,(2000),Exp Clin Immunogenet17(1):42-54；Scaviner和Lefranc,(2000),ExpClin Immunogenet 17(2):83-96；LeFranc和LeFranc,(2001),“T cell ReceptorFactsbook”,Academic Press)。同样，存在数个连接基因或J基因，对于α和β链分别称为TRAJ或TRBJ，对于β链，存在被称为TRBD的多样性基因或D基因(Folch和Lefranc,(2000),Exp Clin Immunogenet 17(2):107-114；Scaviner和Lefranc,(2000),Exp ClinImmunogenet 17(2):97-106；LeFranc和LeFranc,(2001),“T cell Receptor Factsbook”,Academic Press)。T细胞受体链的巨大多样性是由各种V、J和D基因之间的组合重排(包括等位基因变体)和连接多样性引起的(Arstila等人,(1999),Science 286(5441):958-961；Robins等人,(2009),Blood 114(19):4099-4107.)TCRα和β链的恒定区或C区分别被称为TRAC和TRBC(Lefranc,(2001),Curr Protoc Immunol Appendix 1:Appendix 10)。可以使本发明的TCR工程化以包括突变。产生突变的高亲和力TCR变体的方法(如噬菌体展示和定点诱变)是本领域技术人员已知的(例如，参见WO 04/044004和Li等人,Nat Biotechnol2005Mar；23(3):349-54)。

本发明的TCR也可以用成像化合物标记，例如适合于诊断目的的标记。这样的标记的高亲和力TCR可用于检测选自CD1-抗原复合物、细菌超抗原和MHC-肽/超抗原复合物的TCR配体的方法，该方法包括使TCR配体与对TCR配体具有特异性的高亲和力TCR(或多聚高亲合力TCR复合物)接触；并检测与TCR配体的结合。在多聚高亲和力TCR复合物中，例如在Zhu等人,J.Immunol.2006Mar 1；176(5):3223-32中描述的那些中(例如使用生物素化异二聚体形成的)，荧光链霉亲和素(可商购获得的)可用于提供可检测的标记。荧光标记的多聚体适用于FACS分析，例如检测携带对高亲和力TCR具有特异性的肽的抗原呈递细胞。

根据本发明，含有高瓜氨酸的肽可以用作通过T细胞受体(TCR)进行的癌症免疫疗法的靶标。TCR被设计为识别在APC表面上呈递的与MHC分子复合的短肽抗原(Davis等人，1998)。鉴定特定的含高瓜氨酸的肽对于开发新的免疫疗法是有利的。这样的治疗性TCR可以用作可溶性靶向剂，以将细胞毒性或免疫效应剂递送至肿瘤(Boulter等人，2003；Liddy等人，2012；Lissin，Hassan和Jakobsen，2013)，或者可替代地，它们可用于工程改造T细胞以进行过继疗法(June等人，2014)。

本发明的TCR(或其多价复合物)可以可替代地或另外地与治疗剂缔合(例如以共价或以其他方式连接)，所述治疗剂可以是例如用于细胞杀伤的毒性部分或免疫刺激剂(如白介素或细胞因子)。与非多聚野生型的或高亲和力的T细胞受体异二聚体相比，本发明的多价高亲和力TCR复合物可具有增强的对TCR配体的结合能力。因此，根据本发明的多价高亲和力TCR复合物特别用于体外或体内追踪或靶向呈递特定抗原的细胞，并且还用作产生具有这样的用途的其他多价高亲和力TCR复合物的中间体。因此，可以在药学上可接受的制剂中提供高亲和力TCR或多价高亲和力TCR复合物以用于体内使用。

本发明的高亲和力TCR可用于产生可溶性双特异性试剂。优选实施方式是包含通过接头与抗CD3特异性抗体片段融合的可溶性TCR的试剂。WO10/133828中描述了包括如何产生这样的试剂的更多详细信息。本发明的TCR可用作治疗试剂。在这种情况下，TCR可以是可溶形式，并且可以优选地与免疫效应物融合。合适的免疫效应物包括但不限于：细胞因子，例如IL-2和IFN-α；超抗原及其突变体；趋化因子，如IL-8、血小板因子4、黑素瘤生长刺激蛋白；与免疫细胞(如T细胞或NK细胞)上的抗原结合的抗体(例如抗CD3，抗CD28或抗CD16)，包括其片段、衍生物和变体；和补体激活剂。

在另一方面，本发明提供了编码本发明的TCR的核酸、包含编码本发明的TCR的核酸的TCR表达载体以及携带这种载体的细胞。核酸可以是cDNA。TCR可以在单个开放阅读框或在两个不同的开放阅读框中进行编码。还包括在本发明的范围内的是：携带第一表达载体和第二表达载体的细胞，所述第一表达载体包含编码本发明的TCR的α链的核酸，所述第二表达载体包含编码本发明的TCR的β链的核酸。可替代地，一个载体可以同时编码本发明的TCR的α和β链。

可以根据本领域已知的方法合成这样的核酸分子。由于遗传密码的简并性，本领域普通技术人员将理解，不同核苷酸序列的核酸分子可编码相同的氨基酸序列。

本发明提供了包含根据本发明的核酸序列的载体。除了仅编码本发明的多肽的核酸序列之外，载体还可以包含一种或多种编码一种或多种另外的多肽的其他核酸序列。这些另外的多肽一旦表达，则可以与本发明的多肽的N末端或C末端融合。载体可包括编码肽或蛋白质标签(例如生物素化位点、FLAG标签、MYC标签、HA标签、GST标签、Strep标签或多组氨酸标签)的核酸序列。

合适的载体是本领域已知的，包括选择启动子和诸如增强子元件的其他调节元件在内的载体构建也是本领域已知的。在本发明的上下文中使用的载体理想地包含适合于引入细胞的序列。例如，载体可以是表达载体、多肽的编码序列受其自身的顺式作用调节元件的控制的载体、设计为促进基因在宿主细胞中的整合或基因置换的载体等。

在本发明的上下文中，术语“载体”涵盖诸如质粒、噬菌体、噬菌粒、病毒或其他媒介的DNA分子，该DNA分子包含一个或多个异源或重组的核苷酸序列(例如，本发明的上述核酸分子，其受功能性启动子并且可能还受增强子控制)，并且就本领域普通技术人员所理解的意义而言，能够充当载体。适合的噬菌体和病毒载体包括但不限于λ(X)噬菌体、EMBL噬菌体、猿猴病毒40、牛乳头瘤病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、腺病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、莫洛尼鼠白血病病毒、哈维鼠肉瘤病毒、鼠乳腺肿瘤病毒、慢病毒和劳斯氏肉瘤病毒。

本发明还提供了包含本发明载体的细胞。该细胞可以是抗原呈递细胞，并且优选是免疫系统的细胞。特别地，该细胞可以是特化的抗原呈递细胞，例如树突状细胞或B细胞。该细胞可以是哺乳动物细胞。

本发明的另一方面提供了一种在其表面上展示本发明的TCR的细胞。该细胞可以是T细胞。有许多适合于用编码本发明TCR的DNA或RNA转染T细胞的方法(参见例如Robbins等人,J.Immunol.2008May 1；180(9):6116-31)。表达本发明的TCR的T细胞适合用于对诸如包括本文所述的那些癌症的疾病进行基于继发疗法的治疗。如本领域技术人员所知，存在许多可以用来进行过继疗法的合适方法(参见例如Rosenberg等人,Nat RevCancer.2008Apr；8(4):299-308)。

旨在用于过继疗法的本发明的TCR在由转染的T细胞表达时通常是糖基化的。众所周知，可以通过转染的基因的突变来修饰转染的TCR的糖基化模式(Kuball J等人,J ExpMed.2009 Feb 16；206(2):463-75)。

本发明的结合部分可以是抗体。如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，即含有特异性结合抗原的抗原结合位点的分子，无论所述分子是天然的还是部分或全部合成产生的。术语“抗体”包括抗体片段、抗体的衍生物、抗体的功能等同物和同源物、人源化抗体，其中包括包含免疫球蛋白结合结构域的任何多肽(无论所述多肽是天然的还是全部或部分合成的)以及具有为抗体结合结构域或与抗体结合结构域同源的结合结构域的任何多肽或蛋白。因此，包括包含与另一种多肽融合的免疫球蛋白结合结构域或等同物的嵌合分子。EP-A-0120694和EP-A-0125023中描述了嵌合抗体的克隆和表达。人源化抗体可以是具有非人(例如鼠)抗体的可变区和人抗体的恒定区的修饰抗体。制备人源化抗体的方法在例如美国专利第5225539号中描述。抗体的实例是：免疫球蛋白同种型(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)及其同种型亚类；包含抗原结合结构域的片段，例如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双抗体(diabodies)。抗体可以是多克隆或单克隆的。单克隆抗体在本文中可以被称为“mab”。

可以采用抗体(例如单克隆抗体)并使用重组DNA技术来产生保留原始抗体特异性的其他抗体或嵌合分子。这样的技术可能涉及将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补决定区(CDR)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区(例如，参见EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400)。杂交瘤(或产生抗体的其他细胞)可能经历基因突变或其他变化，这可能会或可能不会改变所产生抗体的结合特异性。

已经显示，完整抗体的片段可以执行结合抗原的功能。结合片段的实例是(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由VH域组成的dAb片段(Ward,E.S等人,Nature.1989 Oct 12；341(6242):544-6)；(v)分离的CDR区；vi)F(ab')2片段，即包含两个连接的Fab片段的双价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过允许两个结构域缔合的肽接头连接以形成抗原结合位点(Bird等人,Science.1988 Oct 21；242(4877):423-6；Huston等人,Proc Natl Acad Sci U S A.1988 Aug；85(16):5879-83)；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和(ix)“双抗体”，通过基因融合而构建的多价或多特异性片段(WO94/13804；P.Hollinger等人,Proc Natl Acad Sci U S A.1993Jul 15；90(14):6444-8)。双抗体是多肽的多聚体，每个多肽包含有包含免疫球蛋白轻链结合区的第一结构域和包含免疫球蛋白重链结合区的第二结构域，这两个结构域连接在一起(例如通过肽接头)，但是不能彼此缔合形成抗原结合位点：抗原结合位点是通过多聚体中一个多肽的第一结构域与多聚体中另一个多肽的第二结构域缔合而形成的(WO94/13804)。在使用双特异性抗体的情况下，这些可以是可以按多种方式制造(Hollinger&Winter,CurrOpin Biotechnol.1993 Aug；4(4):446-9)(例如用化学方法制备或由杂交的杂交瘤制备)的常规双特异性抗体，或者可以是上述任何双特异性抗体片段。使用scFv二聚体或双抗体而不是完整抗体可能是更优选的。双抗体和scFv可以仅使用可变结构域而无需Fc区来构建，从而潜在地降低抗独特型反应的作用。其他形式的双特异性抗体包括在Traunecker等人,EMBO J.1991 Dec；10(12):3655-9中描述的单链“Janusins”。与双特异性完整抗体相反，双特异性双抗体也可能有用，因为它们可以很容易地在大肠杆菌中构建和表达。可以使用噬菌体展示(WO94/13804)从文库中容易地选择具有适当结合特异性的双抗体(和许多其他多肽，例如抗体片段)。如果双抗体的一个臂保持恒定，例如具有针对抗原X的特异性，那么可以以改变另一个臂来制作文库，并选择具有适当特异性的抗体。“抗原结合结构域”是抗体的包括与抗原的一部分或全部特异性结合并互补的区域的一部分。在抗原较大的情况下，抗体只能与抗原的特定部分结合，该部分称为表位。抗原结合结构域可以由一个或多个抗体可变结构域提供。抗原结合结构域可包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。

结合部分可以是被设计成特异性结合本发明的抗原-MHC复合物的抗体样分子。特别优选的是TCR模拟抗体，例如在WO2007143104和Sergeeva等人,Blood.2011Apr 21；117(16):4262-72和/或Dahan和Reiter.Expert Rev Mol Med.2012Feb 24；14:e6中描述的那些。

在本发明中还包括了基于工程化蛋白质支架的结合部分。蛋白质支架衍生自稳定的、可溶的天然蛋白质结构，该蛋白质结构被修饰以提供针对目标靶分子的结合位点。工程化的蛋白质支架的实例包括但不限于：基于葡萄球菌蛋白A的Z结构域的亲和体(affibodies)，所述Z结构域在其两个a螺旋上提供结合界面(Nygren,FEBS J.2008Jun；275(11):2668-76)；衍生自脂蛋白的anticalins，其在β-桶状折叠的开口端并入了针对小配体的结合位点(Skerra,FEBS J.2008Jun；275(11):2677-83)；纳米抗体，和DARPins。工程化的蛋白质支架通常被靶向以结合与抗体相同的抗原性蛋白，并且是潜在的治疗剂。它们可以充当抑制剂或拮抗剂，或充当向靶分子如毒素，向体内特定组织递送的递送媒介(Gebauerand Skerra,Curr Opin Chem Biol.2009Jun；13(3):245-55)。短肽也可用于结合靶蛋白。Phylomer是衍生自细菌基因组的天然结构化肽。这样的肽代表各种各样的蛋白质结构折叠，并且可以用于在体内抑制/破坏蛋白质-蛋白质相互作用(Watt,NatBiotechnol.2006Feb；24(2):177-83)。

发明人已经表明，肿瘤在体外培养后使蛋白高瓜氨酸化。通过ELISA分析来自体外培养的B16F1细胞的样品的高瓜氨酸化蛋白的水平。裂解液也由体外培养的B16F1细胞产生，然后用或不用作为氰酸盐来源的氰酸钾(KCNO)处理该裂解液。与KCNO孵育后，细胞中的氨甲酰化作用显著增加。这表明，来自整个肿瘤细胞的蛋白质可以在高氰酸盐环境下经历氨甲酰化，这意味着异氰酸可以穿过细胞膜诱导细胞内氨甲酰化。由于体外研究证明了表达MPO的MDSC可以刺激B16肿瘤细胞的氨甲酰化作用，因此来自整个肿瘤细胞的蛋白质也可以经历由MDSC介导的氨甲酰化。通过用KCNO体外处理来进行ALDOA和波形蛋白重组蛋白的氨甲酰化，并通过ELISA评估氨甲酰化。与细胞系一样，两种蛋白质的氨甲酰化在用KCNO处理后均显著增加，证明两种蛋白质均含有可进行高瓜氨酸化的赖氨酸。随后，通过质谱分析氨甲酰化的重组蛋白样品，以确定高瓜氨酸分子的存在。质谱证明，可以将ALDOA和波形蛋白在包括上文讨论的表位内的修饰的多个位点处进行高瓜氨酸化，即ALDOA中的K87、K140和K147以及波形蛋白中的K120。其他位点包括醛缩酶中的K13、K14、K28、Kl42、K87、K99、K101、K108、K139、K140、K147、K153、K200、K208、K230、K243、K289、K294、K312、K317、K318、K322、K320，以及波形蛋白中的K104、K120、K168、K188、K313、K373、K402、K439、K445。还裂解了B16DP4肿瘤，并通过质谱分析了该肿瘤的HSP60氨甲酰化。残基K191、K202、K205、K218、K222、K359、K481和K58均被氨甲酰化。这些结果一起表明了，在正确的条件下，这些蛋白质会经历氨甲酰化。

如所讨论的，发明人已经发现某些修饰的表位与肿瘤相关联，并且高瓜氨酸化肽刺激T细胞应答，这可用于提高针对肿瘤的免疫应答。本发明提供了用于医学的第一方面的表位、第二方面的复合物和/或第三方面的结合部分，第一方面的表位、第二方面的复合物和/或第三方面的结合部分可以用于治疗癌症的方法。还提供了第一方面的表位、第二方面的复合物和/或第三方面的结合部分在制备用于治疗癌症的药物中的用途以及治疗癌症的方法，所述方法包括将本发明的第一方面的表位、第二方面的复合物和/或第三方面的结合部分施用至需要这种治疗的对象。根据本发明的表位可以单独或作为池组合使用。另外，它们可以与其他治疗剂例如抗癌剂组合使用，所述抗癌剂包括但不限于检查点阻断药例如伊匹单抗、派姆单抗和纳武单抗。

发明人首次说明高瓜氨酸化肽可以刺激有效的T细胞应答。本发明提供了用于针对对象的肿瘤组织局部刺激免疫应答的合适手段。高瓜氨酸化的应答是CD4介导的，识别修饰的表位，而与野生型的未修饰肽没有交叉反应性。刺激的CD4应答通常是Th1，产生最少的IL-10。CD4介导的应答在存在CD4阻断抗体的情况下可被消除，但在存在CD8阻断抗体的情况下则不能被消除。高瓜氨酸化的应答也可以是CD8介导的，识别修饰的表位，而与野生型的未修饰肽没有交叉反应性。CD8介导的应答在存在CD8阻断抗体的情况下可被消除，但在存在CD4阻断抗体的情况下则不能被消除。对这些Hcit肽具有特异性的T细胞可以在体内靶向肿瘤细胞以引起强烈的抗肿瘤效应，从而为将Hcit表位用作癌症治疗的疫苗靶标提供了第一个证据。针对疫苗靶标的免疫应答刺激包括患者的天然免疫应答和旨在针对肿瘤指导免疫应答的免疫治疗疗法(例如检查点抑制剂、针对肿瘤抗原的CAR-T和其他肿瘤免疫疗法)。在各种临床环境中，这样的对免疫应答的支持或诱导可能是有益的，以便引发和维持免疫应答，并逃避通常阻止这种活化的肿瘤介导的免疫抑制。对于自身免疫疾病的治疗，可以耐受这些应答。

所有肽均抑制生物素化Hep B与HLA-DP4的结合，但水平不同。醛缩酶A 74-93Hcit、醛缩酶A 140-157Hcit、醛缩酶A 217-235Hcit、醛缩酶A 238-256Hcit、Cyk8 101-120Hcit、Cyk8 112-131Hcit、Cyk8 182-202Hcit、Cyk8 371-388Hcit和Cyk8 281-399Hcit均显示大于60％的抑制。这些结果教导了，识别与任何这些肽复合的HLA-DP4的TCR均可用于肿瘤治疗。

在一些实施方式中，细胞免疫应答对应激诱导的翻译后修饰的肽是具有特异性的，其中免疫应答包括表达TCRαβ或γδ的T细胞的活化。本发明涉及：TCR；个体TCR亚基(单独或组合)及其亚结构域；可溶性TCR(sTCR)，例如可溶性αβ二聚TCR，其在恒定结构域残基之间具有不存在于天然TCR的至少一个链间二硫键；克隆TCR，所述TCR进行工程化进入自体或异体T细胞或T细胞祖细胞中；及所述TCR的制备方法；以及带有所述TCR的其他细胞。

癌症可以是包括雌激素受体阴性乳腺癌在内的乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、非小细胞肺癌、包括子宫内膜癌在内的卵巢癌、包括胰腺导管腺癌在内的胰腺癌、白血病、黑素瘤、肾癌、头颈癌或肺癌。癌症可以是伯基特氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、胰腺腺癌、结肠癌、急性淋巴细胞性白血病或急性髓性白血病。

本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含与佐剂或其他药学上可接受的疫苗组分一起配制的本发明的表位。在特定实施方式中，佐剂是TLR配体，例如CpG(TLR9)、MPLA(TLR4)、咪喹莫特(TLR7)、聚I:C(TLR3)或amplivant TLR1/2配体、GMCSF、油乳剂、细菌产品或整个灭活细菌。

如本文所用，术语“治疗”包括可使人或非人动物受益的任何方案。所述多肽部分可以与药学上可接受的载体组合使用以形成药物组合物。这样的载体可以包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、脂质体、水、甘油、乙醇及其组合。

可以设想，注射将是本发明组合物的治疗性施用的主要途径，尽管也可以使用通过导管或其他手术管进行递送。一些合适的施用途径包括静脉内、皮下、皮内、腹膜内和肌内施用。可以在由粉末制剂复原后使用液体制剂。

对于静脉内注射或在患病部位注射，活性成分将为不含热原，具有合适的pH，等渗并且维持稳定性的非肠胃可接受(parentally acceptable)的水溶液形式。本领域相关技术人员充分地能够使用例如等渗溶媒(如氯化钠注射液、林格氏注射液或乳酸林格氏注射液)制备合适的溶液。根据需要可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。

口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊剂、粉末剂或液体形式。片剂可包含固体载体，例如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包含液体载体，例如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、右旋糖或其他糖溶液或二醇(例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇)。当制剂是液体时，它可以是例如含有非磷酸盐缓冲剂的pH 6.8至7.6的生理盐溶液，或冻干粉末。

该组合物可以以局部方式施用至肿瘤部位或其他所需部位，或者可以以靶向肿瘤或其他细胞的方式递送。在一些实施方式中，在没有佐剂的情况下施用该肽以用于细胞免疫应答，所述细胞免疫应答包括活化表达TCRαβ或γδ的T细胞。

优选以“治疗有效量”将组合物施用至个体，该“治疗有效量”足以显示出对个体的益处。实际施用的量以及施用的速率和时程将取决于所治疗的疾病的性质和严重程度。治疗处方(例如对剂量的决定)由全科医师和其他医生负责，并且通常要考虑待治疗的疾病、个别患者的病情、递送部位，施用方法以及医师已知的其他因素。本发明的组合物特别地与治疗癌症有关，并且与预防在初始治疗或手术后这样的病症的复发有关。上文提及的技术和方案的示例可以在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Remington，1980)中找到。组合物可单独施用或与其他治疗组合施用，组合施用取决于待治疗病症而同时或依次进行。其他癌症治疗包括本领域已知的其他mAb、其他化学治疗剂、其他放疗技术或其他免疫疗法。本发明的组合物的一种特定应用是作为外科手术的辅助，即帮助降低去除肿瘤后癌症复发的风险。本发明的组合物可以全部或部分通过化学合成而产生。组合物可以根据确立已久的标准液体或优选固相肽合成方法容易地制备，所述固相肽合成方法的一般描述可广泛获得(参见例如，Solid Phase Peptide Synthesis,2nd edition(Stewart1984)中，以及The Practice of Peptide Synthesis(Bodanzsky 1984)和ABI Inc.的AppliedBiosystems 430A用户手册中)或者它们可以在溶液中通过液相方法或固相、液相和溶液化学的任何组合来进行制备，例如，通过首先完成相应的肽部分，然后，如果需要和合适的话，在移除存在的任何保护基团之后，通过由相应的碳酸或磺酸或其反应性衍生物的反应引入残基X来进行制备。

本发明的表位、复合物、核酸分子、载体、细胞和结合部分可以是非天然存在的和/或纯化的和/或工程化的和/或重组的和/或分离的和/或合成的。

优选地，本发明的表位包含选自以下的序列、基本上由选自以下的序列组成或由选自以下的序列组成：

本发明还提供了鉴定结合本发明的复合物的结合部分的方法，该方法包括使候选结合部分与复合物接触以及确定该候选结合部分是否结合该复合物。

本发明每个方面的优选特征加以必要变更而适用每个其他方面。本文提及的现有技术文件以法律许可的最大程度并入。

实施例

现在将参考以下实施例和附图进一步描述本发明。

图1：赖氨酸向Hcit的化学反应转化(Jaisson，Pietrement和Gillery，2011)

尿素增加或硫氰酸盐的分解导致氰酸盐积累和形成Hcit残基的赖氨酸氨甲酰化增加。

图2：HLA-DR、HLA-A和HLA-B分子的结合基序的序列标识表示(Sequence logorepresentation)a：使用NNAlign对6个HLA-DR分子的结合基序进行序列标识表示。在正y轴上，在每个肽位置处富集的氨基酸，而在负y轴上，为相应的消耗的氨基酸。MHC II类DR分子具有在P1、P4、P6和P9处相互作用的结合基序。序列标识中柱形的高度表明了定义基序时某个位置的重要性，而该柱形中每个字母的高度表示该位置的氨基酸偏好(Andreatta等人，2011)。序列标识是使用WebLogo程序计算的(Crooks等人，2004)。b：使用NetMHCpan对5个HLA-A分子的结合基序进行序列标识表示。在正y轴上，在每个肽位置处富集的氨基酸，而在负y轴上，为相应的消耗的氨基酸。MHC II类A分子具有在P2和P9处相互作用的结合基序。序列标识中柱形的高度表明了定义基序时某个位置的重要性，而该柱形中每个字母的高度表示该位置的氨基酸偏好(Andreatta等人，2011)。c：使用NetMHCpan对4个HLA-B分子结合基序进行序列标识表示。在正y轴上，在每个肽位置处富集的氨基酸，而在负y轴上，为相应的消耗的氨基酸。MHC II类B分子具有在P2和P9处相互作用的结合基序。序列标识中柱形的高度表明了定义基序时某个位置的重要性，而该柱形中每个字母的高度表示该位置的氨基酸偏好(Andreatta等人，2011)。

图3：人醛缩酶、波形蛋白、细胞角蛋白8、BiP、NPM、α-烯醇化酶、β-连环蛋白和HSP60的序列

a：人醛缩酶的氨基酸序列

醛缩酶(也称为果糖二磷酸ALDOA)是一种糖酵解酶。脊椎动物编码这种酶的三种形式；由ALDOA编码的ALDOA A主要在肌肉中表达，ALDOA B(ALDOB)主要在肝脏中表达，ALDOA C(ALDOC)主要在大脑中表达。对ALDOA、ALDOB和ALDOC进行序列比对。

b：人ALDOA A的氨基酸序列

c：人波形蛋白的氨基酸序列

d：人细胞角蛋白8的氨基酸序列

e：人BiP的氨基酸序列

f：人NPM的氨基酸序列

g：人α-烯醇化酶的氨基酸序列

h：人β-连环蛋白的氨基酸序列

i：人HSP60的氨基酸序列

图4：筛选由含有高瓜氨酸残基的肽产生的IFNγELISpot反应

筛选转基因HLA-DR4、HLA-HHDII/DR1或HLA-HHDII/DP4小鼠对含有高瓜氨酸残基的肽的反应。所有小鼠均接受3剂以CpG/MPLA作为佐剂的肽。然后通过离体ELISpot评估IFNγ应答。在HLA-DR4(a)和HLA-HHDII/DR1(c)小鼠中看到了对含有Hcit的波形蛋白肽的应答。在HLA-HHDII/DR4(b)和HLA-HHDII/DR1(d)小鼠中看到了对含有Hcit的ALDOA肽的应答。进行统计分析，p值表示为*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

图5：对波形蛋白的IFNγ应答是具有品系特异性的还评估了HLA-HHDII/DR4和C57Bl/6小鼠中对波形蛋白116-134Hcit肽的离体IFNγELISpot应答(a)。评估了HLA-HHDII/DR1和HLA-DR4小鼠中对波形蛋白116-134wt肽的应答(b)。另外，测定了响应于波形蛋白116-134Hcit肽的IL-10(c)和IL-17(d)应答。对于所有研究，均使用3剂以CpG/MPLA作为佐剂的肽来免疫小鼠，并在第21天评估了应答。所述应答均无统计学意义。

图6：对ALDOA的IFNγ应答是具有品系特异性的

评估了HLA-DR4小鼠中对ALDOA 74-93Hcit和ALDOA 140-157Hcit的离体IFNγELISpot应答(a)。离体ELISpot还用于评估HLA-HHDII/DR4小鼠中对ALDOA肽的IL-10(b)和IL-17(c)应答。对于所有研究，均使用3剂以CpG/MPLA作为佐剂的肽来免疫小鼠，并在第21天评估了应答。肽与仅培养基的对照刺激相比，显示出显著的p值。

图7：小鼠中Hcit特异性IFNγ应答的表征

评估了转基因HLA-DR4(a)和HLA-HHDII/DR1(b)小鼠中用波形蛋白116-135Hcit肽免疫的小鼠的脾细胞中的IFNγELISpot应答。评估了转基因HLA-HHDII/DR4(c)和HLA-HHDII/DR1(d)小鼠中用ALDOA 74-93Hcit和ALDOA 140-157Hcit肽免疫的小鼠的应答。包括wt肽作为对照。对小鼠给予三次具有CpG/MPLA的肽的免疫，并在第21天收集脾脏。用单独的肽或与抗CD4或抗CD8阻断抗体组合的肽再刺激脾细胞。Hcit肽与wt肽以及与肽加阻断抗体相比，显示出显著的p值。

图8：不同物种中，含有高瓜氨酸的T细胞表位的序列比对

来自人波形蛋白(a)、ALDOA(b)、烯醇化酶(c)、Bip(d)、β-连环蛋白(e)、Cyk8(f)和NPM(g)和HSP60(h)亚基的Hcit T细胞表位与来自其他物种(小鼠、大鼠、牛、猪、马、猫、狗、兔和绵羊)的等同序列之间的比对，从而描述同源性。

图9：波形蛋白和ALDOA的体外氨甲酰化

通过在氰酸钾(KCNO)存在下孵育，将B16F1细胞或重组波形蛋白或重组ALDOA A蛋白氨甲酰化。然后使用氨甲酰化ELISA评估氨甲酰化(a)。比较未处理样品与处理的样品，显示出P值。误差棒显示标准偏差。通过在SCIEX 6600 TripleTof质谱仪上经带有50um电极的Duospray(TurboV)源进行质谱分析来评估氨甲酰化重组蛋白，并评估了来自ALDOA(b)或波形蛋白(c)的赖氨酸残基的氨甲酰化修饰。

图10：筛选对细胞角蛋白8(Cyk8)肽的IFNγELISpot应答

筛选转基因HLA-HHDII/DR4小鼠对含有高瓜氨酸残基的Hcy Cyk8肽池的应答。所有小鼠均接受3剂以CpG/MPLA作为佐剂的肽。然后通过离体ELISpot评估IFNγ应答(a)。针对野生型交叉反应性，在3次免疫后，评估了对Cyk8 101Hcit、112Hcit、371Hcit和381Hcit的应答(b)。进行统计分析，p值表示为*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

图11：HHDII/DP4小鼠中细胞角蛋白8(Cyk8)Hcit肽应答的特征

用单独的Hcit肽免疫HHDII/DP4小鼠。然后在第21天进行离体ELISpot。在存在CD4/CD8阻断抗体的情况下，用培养基、hcit肽、野生型(wt)肽或Hcit肽再刺激脾细胞(a-b，d-e)。用较短的Cy8 117Hcit肽进行免疫也诱导了免疫应答(f)。

图12：HHDII/DR1小鼠中细胞角蛋白8(Cyk8)Hcit肽应答的特征

用合并的肽免疫HHDII/DR1小鼠，然后在第21天进行离体ELISpot以筛选应答(a)。然后用单独的Hcit肽(b-d)或wt肽(e)免疫小鼠。在ELISpots中，在存在CD4/CD8阻断抗体的情况下，用培养基、hcit肽、野生型(wt)肽或Hcit肽再刺激脾细胞。

图13：筛选HLA-HHDII/DR4小鼠中由含有高瓜氨酸残基的肽产生的IFNγELISpot应答

筛选转基因HLA-HHDII/DR4小鼠对含有高瓜氨酸残基的肽的应答，该肽根据螺旋形状和预测的HLA-DP4结合来选择。所有小鼠均接受3剂以CpG/MPLA作为佐剂的肽。然后通过离体ELISpot评估IFNγ应答。看到了对含有Hcit的Bip(a)、烯醇化酶(b)、NPM(c)、波形蛋白(d)和醛缩酶(e和f)肽的应答。在存在CD4或CD8阻断抗体的情况下，评估对Hcit醛缩酶肽(e和f)的应答，以及评估与野生型(wt)肽的交叉反应性。

图14：可以培养对高瓜氨酸化肽的应答

然后在Hcit肽存在下使来自用Hcit肽免疫的转基因HLA-HHDII/DR4小鼠的脾细胞离体生长。接着通过ELISpot重新评估IFNγ应答。看到了对含有Hcit的Bip(a)、烯醇化酶(b)、NPM(c)和波形蛋白(d)肽的应答。还评估了在存在CD4或CD8阻断抗体的情况下的应答，以及与野生型(wt)肽的交叉反应性。

图15：筛选HLA-HHDII/DR1小鼠中由含有高瓜氨酸残基的肽产生的IFNγELISpot应答

筛选转基因HLA-HHDII/DR1小鼠对在HHDII/DP4小鼠中表现出应答的含有高瓜氨酸残基的醛缩酶肽的应答。所有小鼠均接受3剂以CpG/MPLA作为佐剂的肽。然后通过离体ELISpot评估IFNγ应答。评估了对醛缩酶204Hcit(A)和较短的醛缩酶209hcit(B)肽的应答。

图16：人类具有Hcit肽库

从14位健康供体和11位癌症患者中分离出PBMC，并通过CFSE增殖测定评估PBMC对Hcit肽的应答。PBMC进行CD25消耗，然后用CFSE标记，以及用10μg/ml肽刺激。在第10天评估了增殖。显示了健康供体BD0051(A)和肺癌患者LG10(B)的示例图。汇总图显示，对于健康供体(C)和患者(D)，在CD4+细胞中发现了大多数肽诱导的增殖。与健康供体(E)和癌症患者(F)的培养基对照相比，评估了每个供体中的CD4增殖。

图17：对供体进行的细胞因子表达分析

来自患者LG10的示例图显示了，在用肽刺激10天后的CFSE^low CD4+增殖群上对IFNγ、GraB和CD134进行染色(A)。流式细胞术数据汇总显示了，在肽刺激后表现出增殖的健康供体(B)和患者(C)响应者中，表达GraB、CD134和IFNγ的CD4+增殖细胞的百分比。

图18：人类具有Hcit肽库

从7位健康供体中分离出PBMC，并通过CFSE增殖测定评估对Hcit肽的应答。PBMC进行CD25消耗，然后用CFSE标记，以及用10μg/ml肽刺激。在第10天评估了增殖。

图19：用Hcit肽免疫的小鼠的存活率增加

通过在第一天在小鼠右侧腹皮下植入HLA匹配的转基因B16F1细胞来进行体内肿瘤存活研究。在第4天、第11天和第18天，用具有CpG/MPLA的肽免疫小鼠。在HLA-HHDII/DR1(a)或HLA-DR4小鼠(b)中用波形蛋白116-135Hcit免疫后评估了肿瘤生长。评估了HLA-HHDII/DR4(c)和HLA-HHDII/DR1(d)小鼠中用ALDOA肽免疫后的肿瘤生长。在植入B16F1以及IFNγ诱导型DR4细胞系的HLA-DR4小鼠中，用波形蛋白116-135Hcit免疫后，评估了肿瘤的生长。比较免疫小鼠的存活率与对照小鼠的存活率，进行统计分析，显示出显著的p值。

图20：用Cyk8 Hcit肽免疫的小鼠的存活率增加

通过在第一天在小鼠右侧腹皮下植入HLA匹配的转基因B16F1细胞来进行体内肿瘤存活研究。在第4天、第11天和第18天，用具有CpG/MPLA的肽免疫小鼠。在HLA-HLA-HHDII/DR1小鼠中，用Cyk8Hcit肽免疫后，评估了肿瘤的生长。

图21：IFNγ诱导型HLA肿瘤模型中用Hcit肽免疫的小鼠的存活率增加

通过在第一天在HLA-DP4转基因小鼠右侧腹皮下植入HLA匹配的转基因B16F1细胞来进行体内肿瘤存活研究，其中HLA受IFNγ诱导型启动子的控制。在第4天、第11天和第18天，用具有CpG/MPLA的肽免疫小鼠。在HLA-HHDII/DR4中，用Cyk8 371Hcit肽(a)或Bip562Hcit肽(b)、波形蛋白86Hcit、NPM 266Hcit或烯醇化酶156Hcit免疫后，评估了肿瘤的生长。

图22：MPO在抗肿瘤环境中由MDSC产生

使用流式细胞仪评估B16F1细胞(a)或CD45+肿瘤浸润细胞(b)上的MPO表达。将脾脏、血液和肿瘤细胞染色以确定CD45+细胞上MPO的表达(c)。评估了脾脏和肿瘤中表达G-MDSC(Ly6G+Ly6C^low)或M-MDSC(Ly6G-Ly6C^high)标志物的MPO+细胞的比例(d)。评估了来自Ly6G-Ly6C^high群的肿瘤浸润MPO+细胞的CD115和F4/80表达(d)。

图23：在响应于Hcit ALDOA肽所见的细胞群在抗肿瘤效应中的作用

在抗肿瘤研究过程中，将抗Ly6G(a)或抗Ly6C(b)抗体注射到小鼠中，以确定在响应于Hcit ALDOA肽所见的这些细胞群在抗肿瘤效应中的作用。所示的P值比较了给予了肽和抗体组合的组的存活与单独给予肽或给予单独抗体的组的存活。显示了来自对照小鼠或给予抗Ly6C Ab和ALDOA免疫的小鼠的TIL中MPO+细胞的百分比(c)。

图24：体外氨甲酰化：体外生长的骨髓源性MDSC(BM-MDSC)产生MPO并导致B16细胞的氨甲酰化

BM-MDSC来源自小鼠。进行染色以鉴定未刺激的和LPS刺激后的M-MDSC群和G-MDSC群中的MPO+细胞(a)。在硫氰酸钾和H₂O₂存在下，将B16细胞与MDSC进行共培养。然后通过用抗氨甲酰赖氨酸抗体染色来评估氨甲酰化的水平(b)。

图25：肿瘤存活取决于MHCII的表达

还使用缺乏适当的MHCII表达的B16F1细胞系进行了体内肿瘤存活研究。在第一天在右侧腹皮下植入转基因B16F1细胞。在第4天、第11天和第18天，用具有CpG/MPLA的肽免疫小鼠。对于波形蛋白116-135Hcit，在适当的小鼠品系中使用缺乏DR4的B16F1(a)和缺乏DR1的B16F1 HHDII(b)进行了抗肿瘤研究。对于ALDOA 74-93Hcit和ALDOA 140-157Hcit，在植入缺乏DP4表达的B16F1 HHDII后，确定了存活率(c)。比较免疫小鼠的存活率与对照小鼠的存活率，进行统计分析，显示出显著的p值。

图26：肿瘤存活取决于CD4应答

还在CD4或CD8消耗抗体存在的情况下，使用B16F1 HHDII/iDP4细胞系进行了体内肿瘤存活研究。在第一天在右侧腹皮下植入转基因B16F1 HHDII/DP4细胞。在第4天、第8天和第11天，用具有CpG/MPLA的肽免疫小鼠，并腹腔注射给予消耗抗体。比较免疫小鼠的存活率与还给予了抗体的免疫小鼠的存活率，进行统计分析，显示出显著的p值。

图27：树形图是用于显示ALDOA 74-93hcit的多样性的另一种说明性方式。

CD4的树形图对响应于ALDOA 74-93hcit的CFSE高(A)和CFSE低(B)TRA链进行了排序。CD4的树形图对响应于ALDOA 74-93hcit的CFSE高(C)和CFSE低(D)TRB链进行了排序。每个圆角矩形代表唯一的条目：V-J-uCDR3，其中斑点的大小表示相对频率。

图28：TCR9 a)序列3 hTRBV10-3-CDR3(AISERRDQETQY)，b)序列4hTRAV26-2-CDR3(ILRDVYDYKLS)。CDR以粗体显示。

图29：TCR10 a)序列15 hTRBV20-1-CDR3(SAPIHTDTQY)，b)序列16hTRAV36/DV7-CDR3(AVHDAGNMLT)。CDR以粗体显示。

图30：TCR11 a)序列17 hTRBV12-4-CDR3(ASRGGLASNEQF)，b)序列18hTRAV8-6-CDR3(AVSEGGGSYIPT)。CDR以粗体显示。

图31：TCR12 a)序列19 hTRBV19-CDR3(ASSLGTFYEQY)，b)序列20hTRAV13-1-CDR3(AASGNTNAGKST)。CDR以粗体显示。

图32：TCR13 a)序列21 hTRBV5-1-CDR3(ASSLGVMVVSTDTQY)，b)序列22hTRAV26-2-CDR3(ILRDRVSNFGNEKLT)。CDR以粗体显示。

图33：TCR14 a)序列23 hTRBV11-2-CDR3(ASSPTQGASYEQY)，b)序列24hTRAV3-CDR3(AVRDAGYSTLT)。CDR以粗体显示。

图34：TCR16序列3 hTRBV10-3-CDR3(AISERRDQETQY,图17a)a)序列25hTRAV13-1-CDR3(AASIDRDDKII)。CDR以粗体显示。

图35：TCR17 a)序列26 hTRBV28-CDR3(ATTQGSYNEQF)，b)序列27hTRAV20-CDR3(AVQAGSYIPT)。CDR以粗体显示。

图36：树形图是用于显示ALDOA 140-157hcit的多样性的另一种说明性方式。

CD4的树形图对响应于ALDOA 74-93hcit的CFSE高(A)和CFSE低(B)TRA链进行了排序。CD4的树形图对响应于ALDOA 140-157hcit的CFSE高(C)和CFSE低(D)TRB链进行了排序。每个圆角矩形代表唯一的条目：V-J-uCDR3，其中斑点的大小表示相对频率。

图37：TCR19 a)序列28 hTRBV20-1-CDR3(SARTSGTNTQY)，b))序列29hTRAV8-4-CDR3(AVSGRNDYKLS)。CDR以粗体显示。

图38：TCR20 a)序列30 hTRBV6-3-CDR3(ASSRSWTASGYT)，b)序列31hTRAV26-2-CDR3(ILRDGSGNEKLT))。CDR以粗体显示。

图39：TCR21 a)序列32 hTRBV12-3-CDR3(ASSVAQLAGKGEQF),序列25hTRAV13-1-CDR3(AASIDRDDKII(图23a)。CDR以粗体显示。

图40：TCR22 a)序列33 hTRBV2-CDR3(ASRRVMGYGYT)，b)序列34hTRAV21-CDR3(ALNSGGSNYKLT)。CDR以粗体显示。

图41：TCR23 a)序列35 hTRBV20-1-CDR3(SAGRAGTSGTYEQY)，b)序列36hTRAV26-2-CDR3(ILRSNFGNEKLT)。CDR以粗体显示。

图42：TCR24 a)序列37 hTRBV19-CDR3(ASSGGQFNQPQH)，b)序列38hTRAV6-CDR3(ALGQTGANNLF)。CDR以粗体显示。

图43：TCR25 a)序列39 hTRBV18-CDR3(ASSPEALANTGELF)，b)序列40hTRAV26-1-CDR3(IVRVGYNNNDMR)。CDR以粗体显示。

图44：TCR26 a)序列41 hTRBV24-1-CDR3(ATSDPSGPPYEQY)，b)序列42hTRAV26-2-CDR3(ILRAQGGSEKLV)。CDR以粗体显示。

图45：TCR27 a)序列43 hTRBV2-CDR3(ASRAGTGIGGYT))，b)序列44hTRAV21-CDR3(AVYSGGSNYKLT)。CDR以粗体显示。

图46：树形图是用于显示波形蛋白116-135hcit的多样性的另一种说明性方式。

CD4的树形图对响应于波形蛋白116-135hcit的CFSE高(A)和CFSE低(B)TRA链进行了排序。CD4的树形图对响应于波形蛋白116-135hcit的CFSE高(C)和CFSE低(D)TRB链进行了排序。每个圆角矩形代表唯一的条目：V-J-uCDR3，其中斑点的大小表示相对频率。

图47：TCR1 a)序列1 hTRBV28-CDR3(ASSLLGSSPLH)，b)序列2hTRAV38-2/DV8-CDR3(AYRSYNQGGKLI)。CDR以粗体显示。

图48：TCR4 a)序列5 hTRBV3-1-CDR3(ASSQEPSTHNEQF)，b)序列6hTRAV26-2-CDR3(ILKNYGGSQGNLI)。CDR以粗体显示。

图49：TCR5 a)序列7 hTRBV6-6-CDR3(ASSPGQPYGYT)，b)序列8hTRAV16-CDR3(ALSGPSYGQNFV)。CDR以粗体显示。

图50：TCR6 a)序列9 hTRBV6-1-CDR3(ASEGLASYNEQF)，b)序列10hTRAV9-2-CDR3(ALTGGGYQKVT)。CDR以粗体显示。

图51：TCR7 a)序列11 hTRBV27-CDR3(ASSFREGEKLF)，b)序列12hTRAV17-CDR3(ATAMNTGFQKLV)。CDR以粗体显示。

图52：TCR8 a)序列13 hTRBV4-2-CDR3(ASSREGLAGLNEQF)，b)序列14hTRAV29/DV5-CDR3(AASGWGDGGATNKLI)。CDR以粗体显示。

图53：HLA-DP4结合，a)HepB 181-193而非阴性对照肽与HLA-DP4的结合，b)生物素化HepB肽与未标记的HepB肽的竞争结合，c)含高瓜氨酸的醛缩酶肽和野生型醛缩酶肽与生物素化的HepB肽竞争结合HLA-DP4，d)含高瓜氨酸的细胞角蛋白8肽与生物素化HepB肽竞争结合HLA-DP4，e)含高瓜氨酸的波形蛋白肽和野生型波形蛋白肽与生物素化HepB肽竞争结合HLA-DP4。

方法

细胞系和培养

鼠黑素瘤B16F1细胞系(ATCC-CRL-6323)获得自美国组织培养物保藏中心(ATCC)。在缓冲至pH7的补加有10％胎牛血清(FCS)、L-谷氨酰胺(2mM)和碳酸氢钠的RPMI培养基1640(GIBCO/BRL)中培养B16F1。所使用的细胞系由供应商认证(STR分析)是不含支原体的，并且在十代以内使用。

质粒和转染

利用先前描述的方案(Brentville等人，2016)，使用Lipofectamine转染试剂(Invitrogen)来转染细胞系。使用ZFN技术(Sigma)敲除B16F1细胞的鼠MHC-I和/或MHC-II，并使用pVitro 2嵌合质粒用组成型HLA-DR4、HLA-DR1或HLA-DP4来转染该B16F1细胞。还用包含人HLA-A2前导序列的HHDII质粒转染细胞，其中人β2-微球蛋白(β2M)分子通过甘氨酸丝氨酸接头与人HLA-0201MHC 1类分子的α1和2结构域和鼠H-2Db 1类分子的跨膜和胞质结构域α3共价连接，与如前所述的内容相关(Xue等人，2016)。还使用pDC GAS嵌合HLA-DR401或HLA-DP4质粒用IFNγ诱导型HLA-DR4或HLA-DP4转染B16F1细胞，其中嵌合HLA-DR401或HLA-DP4受IFNγ诱导型启动子表达的控制。质粒的详细信息和转染方案先前已经进行了完整描述(Brentville等人，2016；Brentville等人，2019)。转染的细胞在存在博来霉素(300μg/ml)、潮霉素B(300μg/ml)或G418(500μg/ml)的情况下生长。

体外氨甲酰化和检测

按照先前描述的方案进行蛋白质的氨甲酰化(Shi等人，2011)。简而言之，将通过4次冷冻/解冻循环而制备的胎牛血清、重组人ALDOA(Sigma)或波形蛋白(Abcam)蛋白或B16F1细胞裂解液通过在存在1M KCNO的情况下在37℃下孵育10小时，进行体外氨甲酰化。对于B16F1细胞系，使细胞贴附在瓶中，然后向培养基中补加KCNO，使其终浓度为1M，过夜。处理后，使用细胞刮刀从瓶中移出细胞，并通过冷冻/解冻裂解细胞。然后将所有样品在dH₂O中充分透析。按照制造商的说明，使用OXIselect氨甲酰化ELISA(Cell Biolabs)检测氨甲酰化。°

质谱

通过在37℃下以1:50的胰蛋白酶比蛋白质的比例进行胰蛋白酶消化来制备样品。然后将样品在真空下干燥，并重悬于在0.1％甲酸/5％乙腈的LCMS级水溶液中，然后进行MS分析。对于MS分析，通过自动进样器(Eksigent Ekspert nanoLC 425LC系统，使用1-10μl/min泵模块以5μl/min的速度运行)以2min洗涤阱/洗脱配置，将样品注射到在35℃的柱温箱中的YMC Triart C18柱(300um id，3μm粒径，15cm)上。通过带有50μm电极的Duospray(TurboV)源，在87分钟的运行时间内，将样品梯度洗脱到SCIEX6600TripleTof质谱仪中。将6600TripleTof质谱仪设置为IDA模式(独立数据采集/数据相关采集)，每个循环碎裂30个离子，总循环时间为1.8s，TOFMS扫描累计250ms；每个产物离子扫描50ms。

使用PEAKS Studio 8.0(Bioinformatic Solutions Inc.Waterloo,Canada)分析数据，搜索SwissProt人类(Uniprot手动注释/固化)数据库，以25ppm母体质量误差容限，0.1Da碎片质量误差容限，搜索瓜氨酸(R)、脱酰胺(NQR)、氧化(M)的修饰。通过最小离子强度为5％，将位点确定为可信的修饰位点。

免疫原

通过Genscript(New Jersey,美国)合成纯度>90％的肽，然后将所述的肽以0.2mg至0.4mg的等分试样冻干保存在-80℃。在使用当天，将它们用磷酸盐缓冲盐水(PBS)复原至适当浓度。

免疫方案

使用C57Bl/6小鼠(Charles River,英国)、HLA-DR4小鼠(#4149型,Taconic,美国)、HLA-A2/DR1(HHDII/DR1,巴斯德研究所)、描述于专利WO2013/017545A1(EMMA储存库，法国)中的HLA-A2.1+/+HLA-DP4+/+hCD4+/+(HLA-HHDII/DP4)转基因小鼠(EM:02221，欧洲小鼠突变档案(European Mouse Mutant Archive))，均为8至12周龄。将肽在PBS中溶解为1mg/ml，然后用CpG ODN 1826和MPLA各自6μg/小鼠(Invivogen，UK)进行乳化(系列稀释)。将肽(25μg/小鼠)皮下注射到尾部的基部。在第1天、第7天和第14天免疫小鼠以进行肽免疫。除非另有说明，否则在第21天移出脾脏进行分析。

对于肿瘤攻击实验，在初次免疫前3天(除非另有说明)在右侧腹用B16F1细胞皮下攻击小鼠，然后如上进行免疫。对于B16F1，以2.5×10⁴个细胞/小鼠的剂量进行肿瘤植入；对于B16F1 DR4，以2.5×10⁴个细胞/小鼠的剂量进行肿瘤植入；对于B16F1 HHDII/DP4，以4×10⁵个细胞/小鼠的剂量进行肿瘤植入；对于B16 HHDII/DR1，以5×10⁵个细胞/小鼠的剂量进行肿瘤植入；对于B16F1 HHDII/诱导型DP4，以1×10⁵个细胞/小鼠的剂量进行肿瘤植入；对于B16F1诱导型DR4，以5×10⁴个细胞/小鼠的剂量进行肿瘤植入。对于涉及耗竭抗体的研究，在第8天、第10天、第12天、第15天、第17天和第19天，腹膜内施用250μg抗小鼠Ly6C抗体(克隆Monts,BioXcell)。在第8天腹腔内施用400μg抗小鼠Ly6G抗体(克隆1A8，Biolegend)，然后在第11天、第15天和第18天施用250μg。在第4天以500μg的剂量施用抗人CD4抗体(克隆OKT4，BioXcell)或抗小鼠CD8抗体(克隆2.43，BioXcell)，然后在第8和11天施用300μg剂量。每周监测肿瘤生长两次，一旦肿瘤直径达到≥15mm，就对小鼠实施人道安乐死。

免疫应答分析-离体ELISpot分析

根据制造商的说明(Mabtech，瑞典)，使用鼠IFNγ、IL-17和IL-10捕获和检测试剂进行ELISpot分析。简而言之，将抗IFNγ、IL-17和IL-10特异性抗体包被到96孔Immobilin-P板的孔上。将合成肽(各种浓度)和每孔5×10⁵个脾细胞一式四份地添加到板的孔中。一式三份地将肿瘤靶细胞(5×10⁴个/孔)添加到相关位置，并将板在37℃下孵育40小时。孵育后，通过生物素化的抗IFNγ、IL-10和IL-17抗体检测捕获的IFNγ、IL-10和IL-17，并用链霉亲和素碱性磷酸酶和发色底物显色。使用脂多糖(LPS；5μg/ml)作为阳性对照。对于MHC阻断研究，使用20μg/ml的来自Bioxcell的抗CD4阻断抗体(GK1.5)、或针对表达人CD4的HHDII/DP4小鼠使用抗CD4阻断抗体(RPA-T4)、以及抗CD8阻断抗体(2.43)。使用自动酶标仪(Cellular Technologies Ltd)对斑点进行分析和计数。

动物组织的分离与分析

将脾脏分解并用红细胞裂解缓冲液处理2分钟。收集肿瘤并将肿瘤机械分解。然后用抗CD45(efluor450，克隆30-F11)、抗CD11b(PE-Cy7，克隆M1/70)、抗Ly6C(APC，克隆HK1.4)和抗-Ly6G(FITC，克隆RB6-8C5)(Thermofisher)的1:50稀释液进行细胞染色。根据制造商的说明，使用胞内固定/透化缓冲液(ThermoFisher)来洗涤、固定和透化细胞。使用抗MPO(PE，克隆HM105，Hycult Biotech)的1:10稀释液针对细胞因子进行胞内染色。立即在配备有MACSQuant软件版本2.8.168.16380的MACSQuant 10流式细胞仪上分析染色的样品。

MDSC的体外产生以及与B16共培养

通过从小鼠中分离骨髓，然后在存在GM-CSF(1ng/ml)和IL-18(50ng/ml)的情况下培养6天，产生骨髓源性MDSC。对于共培养实验，将B16细胞以单层接种，然后与MDSC以1:10的比例孵育。如有说明，添加硫氰酸钾(200uM)和H₂O₂(10uM)。然后在染色之前将细胞孵育过夜。使用兔抗氨甲酰化(高瓜氨酸)多克隆抗体(#CAY22428-1ea#)以1/50进行CarbLy染色1小时，然后使用驴抗兔A647缀合二抗(#ab150063)以1/1000进行1小时。

外周血单核细胞(PBMC)分离

表5a和表5b给出了健康供体和患者的人口统计学信息。将外周血样本吸进肝素锂试管(Becton Dickinson)中，并在静脉穿刺后立即处理。使用Ficoll-Hypaque通过密度梯度离心来分离PBMC。分离后立即进行PBMC的增殖和培养的ELISpot测定。对于CD25消耗，如上所述处理PBMC，并使用抗CD25微珠和MACS细胞分离柱(Miltenyi)富集所述PBMC。

增殖测定-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)

简而言之，由5mM的在二甲基亚砜(DMSO)中的母液制备50μM的温PBS储备液。将CFSE快速添加到PBMC(5×10⁶个细胞/ml上样缓冲液(含5％v/v热灭活FCS的PBS))以达到5μM的终浓度。将PBMC在室温下于黑暗中孵育5分钟，然后通过用过量(×10v/v体积)的上样缓冲液洗涤两次(300g×10分钟)来去除未掺入细胞的CFSE。如上所述，补充细胞，使得在完全培养基中为1.5×10⁶个/mL，铺板并用溶媒(阴性对照)、PHA(阳性对照，终浓度10μg/ml)或肽(10μg/ml)刺激。

在第10天，从培养物中取出500μl细胞，在PBS中洗涤，并用抗CD4(PE-Cy5，克隆RPA-T4，ThermoFisher)、抗CD8(efluor 450，克隆RPA-T8，ThermoFisher)和抗CD134(PE-Cy7，克隆REA621，Miltenyi)的1:50稀释液进行染色。根据制造商的说明，使用胞内固定/透化缓冲液(ThermoFisher)来洗涤、固定和透化细胞。使用抗IFNγ(克隆4S.B3，ThermoFisher)或抗颗粒酶B(PE，克隆GB11，Thermofisher)的1:50稀释液针对细胞因子进行胞内染色。立即在配备有MACSQuant软件版本2.8.168.16380的MACSQuant 10流式细胞仪上分析染色的样品。

FACS细胞分选

在第10天，将培养孔中的内容物轻轻混合、合并(根据肽刺激)并在PBS中洗涤(300g×10分钟)。将沉淀轻轻重悬于含有10μl抗CD4 eFluo450(克隆RPA-T4，ThermoFisher，cat no 48-0049-42)和10μL抗CD8 APC(克隆RPA-T8，ThermoFisher，cat17-0088-41)的500μL PBS中。将细胞在4℃下染色30分钟，然后在1.0ml PBS中洗涤(5min×300g)，并重悬于300μl FACS分选缓冲液(PBS中补加有1mM EDTA、25mM HEPES和1％v/v HIFCS)中。从每个染色的样品中取出10μl样品，并添加90μl FACS分选缓冲液。在MACSQuantAnalyzer 10流式细胞仪上收集10,000个事件(event)，以确定增殖。其余细胞用于批量FACS分选。

在MoFlo XDP高速细胞分选仪中使用无菌条件分选细胞。将所有样品分入1.0mlRNA保护液(5份保护液(Qiagen):1份FACS分选缓冲液(Sigma))中，从而将CD4+ve/CFSEhigh和CD4+ve/CFSElow群分离。将分选的细胞(批量)储存于-80℃。

识别含有高瓜氨酸的肽的TCR的α和β链配对的确定。将来自在RNA保护液中的CD4^+ve/CFSE^high和CD4^+ve/CFSE^low群的分选细胞(批量)送至iRepertoire Inc(Huntsville,AL,美国)，以对TCRA和TCRB链进行NGS测序，从而证实TCR在CD4^+ve/CFSE^low细胞中扩增，而与非增殖性CD4^+ve/CFSE^high群相比，增殖为肽。简而言之，从分选的细胞中纯化RNA，进行RT-PCR，然后使用人TCRα和β250PER引物(iRepertoire Inc.，Huntsville，AL，美国)对cDNA进行扩增子拯救多重PCR(Amplicon rescued multiplex PCR，ARM-PCR)。有关引物的信息可在美国专利商标局(专利号7,999,092和9,012,148B2)中找到。在评估PCR/DNA样品后，使用Illumina MiSeq平台(Illumina,San Diego,CA,美国)合并10个样品库并对样品库进行测序。使用IRweb软件(iRepertoire)分析原始数据。识别并指定V、D和J基因的使用以及CDR3序列，并使用iRweb工具生成树形图。树形图将每个唯一的CDR3显示为彩色矩形，每个矩形的大小对应于库中每个CDR3的丰度，其位置由V区的使用来决定。

为了阐明TCRα和TCRβ链的同类配对并测序，IRepertoire使用他们的iPair^TM技术，将CD4^+ve/CFSE^low细胞群(批量分选，即同时进行批量测序)以1个细胞/孔接种到iCapture96孔板中。进行RT-PCR，并使用扩增子拯救多重PCR(arm-PCR)从单个细胞中扩增TCRα和β链。利用iPair^TM软件程序来分析数据，以确定特定链配对的频率，并根据与批量数据的比较对序列进行排序。

用于结合测定的DP4制备

2×T175产生2.5×10⁷个B16 HHDII/DP4(B16F1 B2M H2Ab1 dKO A35 HHDII/DP4H7/2E9/F9 p14)细胞。这对用Mem-PER^TMPlus膜蛋白提取试剂盒使用以下方案(thermo-scientific cat#89842)来进行5次制备是足够的。

用细胞刮刀将细胞从板的表面上刮下，将5×10⁶个细胞重悬于生长培养基中，然后以300g离心5分钟。将细胞沉淀用3ml的细胞洗涤溶液洗涤，并在300g下离心5分钟。移除并弃去上清液。将细胞重悬于1.5ml的细胞洗涤溶液中，转移至2ml的离心管中，并以300g离心5分钟。弃去上清液。将0.75ml通透缓冲液添加到细胞沉淀中，短暂涡旋以获得均匀的细胞悬液，并在4℃孵育10分钟并持续混合。将透化的细胞以16,000g离心15分钟，然后小心地移除含有胞浆蛋白的上清液，然后将所述细胞转移到新试管中。将0.5ml增溶缓冲液添加至沉淀中并重悬，接着在4℃孵育30分钟并持续混合，然后在4℃以16,000g离心15分钟。将含有溶解的膜和膜相关蛋白的上清液转移到新试管中。将等分试样在-80℃下冷冻，以备将来使用。冷冻前，添加12.5μl Halt^TM蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(不含EDTA)(100×)(thermo-scientific(目录号78445))。

DP4结合ELISA

用链霉亲和素(Sigma S4762，1mg/ml)(1/500稀释)的PBS溶液包被高结合板，并在4℃下孵育过夜。在室温下用在1％BSA的PBS溶液封闭板4小时，并以3×PBS/0.5％Tween洗涤。将450μl细胞制备裂解液与50μg生物素化肽一起孵育，并在37℃下孵育4小时：将裂解液/肽混合物以100μl/孔添加到板中，并在室温下孵育4小时。将板用PBS/0.5％Tween洗涤3次。将在1％BSA/PBS中以1/500稀释的Leinco抗人HLA-DP4克隆B7/21#H260(1mg/ml)以每孔100μl添加到裂解液中，并在室温下孵育1小时，然后以3×PBS/0.5％Tween洗涤。以每孔100μl添加在1％BSA/PBS中以1/500稀释的山羊抗小鼠IgG3-HRP(0.5mg/ml)，孵育1小时。洗涤板，并向每个孔中添加150μl的TMB底物。用50μl2N H₂SO₄终止反应，450nm对板读数。

DP4竞争测定

用链霉亲和素(Sigma S4762，1mg/ml)(1/500稀释)的PBS溶液包被高结合板，并在4℃下孵育过夜。在室温下用1％BSA的PBS溶液封闭板4小时，并以3×PBS/0.5％Tweenx洗涤。将450μl细胞制备裂解液(B16F1 B16 HHDII/DP4 H7/2E9/F9)与50μg测试肽(见下文)或10μg未标记的Hep B肽混合30分钟。添加10μg生物素化Hep B肽，并在37℃孵育4小时：

将裂解液/多肽混合物以100μl/孔添加到板中，并在室温下孵育4小时。将板用PBS/0.5％Tween洗涤3次。以每孔100μl添加在1％BSA/PBS中以1/500稀释的Leinco抗人HLA-DP4克隆B7/21#H260(1mg/ml)，并在室温下孵育1小时，然后以3×PBS/0.5％Tween洗涤。以每孔100μl添加在1％BSA/PBS中以1/500稀释的山羊抗小鼠IgG3-HRP(0.5mg/ml)，室温下孵育1小时，然后洗涤并向每个孔中添加150μl的TMB底物。用50μl2N H₂SO₄终止反应，450nm对板读数。

统计分析

使用GraphPad Prism软件版本7进行统计分析。通过酌情应用配对或不配对的方差分析或Studentt检验，进行ELISpot结果的比较分析，并相应地计算p值。通过对数秩检验对肿瘤存活率的比较进行评估。p<0.05值被认为是统计学显著的，p<0.01值被认为是高度显著的。

实施例1针对高瓜氨酸化波形蛋白116-135的CD4应答

使用在线IEDB预测程序(http://www.iedb.org/)，对波形蛋白进行了计算机生物信息学分析(表2)，以鉴定与人MHC II类具有高结合亲和力的肽序列。选择核心结合区含有赖氨酸并证明在人和小鼠之间具有同源性的最佳结合亲和力肽。赖氨酸残基被高瓜氨酸(Hcit)置换。所选择的肽在表1中汇总，回顾性地进行了PepFold(螺旋)分析。

波形蛋白肽应答的筛选

进行筛选以鉴定小鼠中潜在的高瓜氨酸化波形蛋白表位。用高瓜氨酸化肽池免疫小鼠。为了降低可能的交叉反应性的影响，对池中的肽进行选择以使它们不包含任何重叠的氨基酸序列。在第1天、第8天和第15天，以3次免疫施用每个池，其中每次免疫包含20μg每种肽并以CpG/MPLA作为佐剂。在第21天，处死小鼠，并通过离体ELISpot评估对免疫池中每种肽的免疫应答。考虑到不同的小鼠品系具有不同的MHC库，使用许多品系进行了筛选。评估在C57Bl/6背景下表达人DR4或HHDII/DR1的转基因品系中的肽应答(参见方法)。

检测到显著的对肽波形蛋白116-135Hcit的IFNγ应答。在HLA-DR4(图4a)和HHDII/DR1(图4c)小鼠中，含有Hcit波形蛋白116-135肽的池诱导了对波形蛋白116-135Hcit的显著应答。在HLA-DR4或HHDII/DR1小鼠中，其他肽没有显示出显著的IFNγ应答。因此，我们的预测仅鉴定了1/5的肽可诱导T细胞应答。另外，在HHDII/DP4和C57Bl/6小鼠中测试了对波形蛋白116-135Hcit的应答，但是未观察到IFNγ应答(图5a)。该结果表明，高瓜氨酸化波形蛋白肽116-135值得进一步研究。此外，用未修饰的肽(波形蛋白116wt)免疫HHDII/DR1或HLA-DR4小鼠未能诱导任何应答(图5b)。因此，免疫原性肽的关键特征是它们表达高瓜氨酸。

为了进一步表征由氨甲酰化肽诱导的应答，用Hcit肽免疫小鼠，并在存在CD4阻断抗体和CD8阻断抗体的情况下对于脾细胞评估与wt肽的交叉反应性和对Hcit肽的应答。DR4(图7a)和HHDII/DR1(图7b)转基因小鼠中的波形蛋白116-135Hcit IFNγ应答显示与未修饰的wt肽无交叉反应性。因此，免疫原性肽的关键特征是它们表达高瓜氨酸。在DR4(p<0.0001)和HHDII/DR1(p<0.0001)小鼠中，波形蛋白116-135Hcit应答均显著高于wt应答。在DR4(p＝0.0001)和HHDII/DR1(p＝0.0005)小鼠中，均看到与较短的跨氨基酸120-134的Hcit肽序列具有交叉反应性。通过添加CD4阻断抗体，两种品系中的波形蛋白116-135Hcit应答均显著降低(分别为p＝0.0054和p<0.0001)，但在存在CD8阻断抗体的情况下则没有。这些应答被消除揭示了应答是由CD4细胞介导的。因此，应答的关键特征是它是由CD4 T细胞介导的。来自小鼠的脾细胞显示，没有响应于用波形蛋白116-135Hcit肽进行的免疫而产生IL-10和IL-17(图5c和d)。

因此，DR4和DR1中的最小表位是在位置120和129具有高瓜氨酸的波形蛋白120-134。

接下来，我们测试了波形蛋白是否可以在我们的关键残基处被氨甲酰化。用氰酸钾对重组蛋白进行体外处理，并通过ELISA评估氨甲酰化。用氰酸钾处理后，氨甲酰化显著增加，这表明波形蛋白包含可能经历高瓜氨酸化的赖氨酸(图9a)。接下来，通过质谱分析氨甲酰化的重组蛋白样品，以确定高瓜氨酸分子的存在。质谱表明波形蛋白(图9c)可以在许多位点被高瓜氨酸化。这些结果共同显示，波形蛋白可以在正确的位点经历氨甲酰化。

实施例2针对高瓜氨酸化ALDOA的CD4应答

使用在线IEDB预测程序(http://www.iedb.org/)，对ALDOA进行了计算机生物信息学分析(表3)，以鉴定与人MHC II类具有高结合亲和力的肽序列。选择核心结合区含有赖氨酸并证明在人和小鼠之间具有同源性的最佳结合亲和力肽。赖氨酸残基被Hcit置换。所选择的肽在表3中汇总。回顾性地进行了PepFold(螺旋)分析。

ALDOA肽反应的筛选

进行筛选以鉴定转基因HHDII/DP4和HHDII/DR1小鼠中潜在的高瓜氨酸化的ALDOA表位。用人高瓜氨酸化肽池免疫小鼠。为了降低可能的交叉反应性的影响，对每个池中的肽进行选择以使它们不包含任何重叠的氨基酸序列。以3次免疫施用每个池，其中每次免疫包含20μg每种肽并以CpG/MPLA作为佐剂。21天后，处死小鼠，并通过HHDII/DP4(图4b)和HHDII/DR1小鼠(图4d)的离体ELISpot评估对免疫池中每种肽的免疫应答。在HHDII/DP4转基因小鼠中，跨氨基酸74-93(Ald 74Hcit)、140-157(Ald140Hcit)和238-256(Ald238Hcit)的肽均显示出刺激IFNγ应答，而在HHDII/DR1转基因小鼠中仅Ald140Hcit刺激了应答。因此，我们的预测鉴定了3/5的肽可诱导T细胞应答。在DR4小鼠中未见针对ALDOA74-93Hcit或140-157的应答(图6a)。在应答肽中，ALDOA 74-93Hcit和140-157Hcit肽在人和小鼠中是同源的，因此选择了这两种肽用于进一步研究。在HHDII/DP4小鼠中看到最小的对醛缩酶肽的IL-10(图6b)或IL-17(图6c)的应答。

针对与wt肽序列的交叉反应性，表征对ALDOA 74-93Hcit和140-157Hcit免疫的应答。在HHDII/DP4小鼠中，对于wt肽看到有限的应答，而Ald 74Hcit和Ald 140Hcit应答则显著高于74-93wt(p<0.0001)或140-157wt(p<0.0001)。因此，免疫原性肽的关键特征是它们表达高瓜氨酸。与波形蛋白应答一样，在存在CD4阻断抗体的情况下，对于ALDOA 74-93Hcit(p<0.0001)和ALDOA 140-157Hcit(p<0.0001)，针对ALDOA肽的应答显著降低。因此，应答的关键特征是它是由CD4 T细胞介导的。在用ALDOA 140-157Hcit免疫的HHDII/DR1小鼠中，针对Ald 140Hcit的IFNγ应答显著高于针对ALDOA 140-157wt的应答(图7d；p＝0.0047)。因此，免疫原性肽的关键特征是它们表达高瓜氨酸。

在哺乳动物中，存在三种同工型的ALDOA酶：ALDOA(A)；ALDOB(B)和ALDOC(C)，这三种同工型由三种不同的基因编码。它们是高度保守的，并且具有高度的氨基酸同源性(图3a)。ALDOA 74-93在所有三种同工型中高度保守，同工型A和B之间仅有5个氨基酸差异，而在同工型A和C之间仅有4个氨基酸差异。ALDOA140-157在所有三种同工型中高度保守，同工型A和B之间仅有7个氨基酸差异，而在同工型A和C之间仅有2个氨基酸差异。在小鼠、大鼠、鸡、狗、绵羊、牛、马、猪和人之间，波形蛋白和ALDOA也高度保守(图8)。由于该疫苗在人和小鼠中诱导T细胞应答，并且在小鼠中诱导抗肿瘤应答，因此可以假定在其他物种中也会看到类似的应答。

接下来，我们测试了ALDOA是否可以在我们的关键残基处被氨甲酰化。用氰酸钾对重组蛋白进行体外处理，并通过ELISA评估氨甲酰化。用氰酸钾处理后，氨甲酰化显著增加，这表明ALDOA包含可能经历高瓜氨酸化的赖氨酸(图9a)。接下来，通过质谱分析氨甲酰化的重组蛋白样品，以确定高瓜氨酸分子的存在。质谱表明，ALDOA(图9b)蛋白可以在许多位点被高瓜氨酸化。这些结果共同显示，ALDOA可能在正确的位点经历氨甲酰化。

实施例3预测鉴定含有高瓜氨酸的T细胞靶标

使用IEDB预测程序(http://www.iedb.org/)对波形蛋白和ALDOA进行的计算机生物信息学分析(表2和表3)鉴定了10种肽，但其中仅4种具有免疫原性。我们选择将IEDB与其他预测工具组合。使用PEP-FOLD3进行计算机建模，PEP-FOLD3是巴黎大学持有的新型计算框架(http://mobyle.rpbs.univ-paris-diderot.fr/cgi-bin/portal.py#forms::PEP-FOLD3)。该软件允许对5至50个氨基酸之间的线性肽进行全程的自由或偏向预测，并在事先已知相互作用位点时生成与蛋白质相互作用的肽的天然样构象。根据对每种肽进行100多种不同模拟的结果，计算出结构。

有趣的是，我们已经显示发现可产生高频T细胞应答的肽共有相同的结构，在该肽中，该结构具有至少5个氨基酸的螺旋状结构；缺乏螺旋与T细胞测定中的阴性应答有关。但是，强烈地预测到MHC结合并不自动意味着对于该肽存在有库，而是基于高结合亲和力、在核心区域中高瓜氨酸残基的存在、3D建模时肽具有明显螺旋构象结构以及小鼠和人序列之间的同源性，为进一步研究提供了选择更多有效的肽的信息。

使用这种预测的组合，合成了5种含有高瓜氨酸的CyK8肽(表4)。进行筛选以鉴定在转基因HHDII/DP4中潜在的高瓜氨酸化的Cyk8表位。用人高瓜氨酸化肽池免疫小鼠。为了降低可能的交叉反应性的影响，对每个池中的肽进行选择以使它们不包含任何重叠的氨基酸序列。以3次免疫施用每个池，其中每次免疫包含20μg每种肽并以CpG/MPLA作为佐剂。21天后，处死小鼠，并通过进行HHDII/DP4的离体ELISpot来评估对免疫池中每种肽的免疫应答(图10a)。在HHDII/DP4转基因小鼠中，跨氨基酸101-120(Cyk8 108,117Hcit)、112-131(CyK8 117,122,130Hcit)、182-201(CyK8 185,197,198Hcit)、371-388(CyK8 381hcit)和381-399(CyK8 381,393Hcit)的肽均显示出刺激IFNγ应答。针对与wt肽序列的交叉反应性，表征对CyK8 101-120Hcit、112-131Hcit、182-201Hcit、371-388Hcit和381-399Hcit免疫的应答。在HHDII/DP4小鼠中，对于任何wt肽，看到有限的交叉反应性应答，并且CyK8112Hcit、CyK371和CyK8 381Hcit应答则显著高于112-131wt(p<0.0001)、371-388(p<0.0001)或381-399wt(p<0.0001)。(图10b)。因此，免疫原性肽的关键特征是它们表达高瓜氨酸。所有这些肽(100％)都是具有免疫原性的。因此，预测的HLA-DP4结合亲和力高(<30)，核心区域中存在高瓜氨酸残基，根据3D建模该肽本质上为两亲性且具有主要的螺旋构象结构，并且在小鼠和人序列之间存在同源性，则定义免疫原性。回顾性地应用该模型以包括波形蛋白和ALDOA肽时，正确地预测了8/9(88％)肽。

在存在CD4或CD8阻断抗体的情况下，评估了对Cyk8 101Hcit、112Hcit、371Hcit和381Hcit的应答。包含CD4阻断抗体时，对Cyk8 101Hcit、371Hcit和381Hcit的应答被抑制，而在包含CD8阻断抗体时，则没有被抑制(图11的a、d、e)。在存在CD8阻断抗体的情况下，对Cyk8 112Hcit的应答被抑制，而在存在CD4阻断抗体的情况下，对Cyk8 112Hcit的应答则没有被抑制。(图11b)。因为HHDII/DP4小鼠拥有HLA-A2 MHC I类等位基因，分析了Cyk8112Hcit肽序列的预测与HLA-A2结合的序列。测试了较短的Cyk8 117-125Hcit肽对HHDII/DP4小鼠免疫应答的刺激，并显示产生了对Cyk8 117Hcit肽的应答。这些应答在存在CD8阻断抗体的情况下被阻断，但是在存在CD4阻断抗体的情况下却没有被阻断，提示CD8介导了对该肽的应答(图11f)。对高瓜氨酸化Cyk8肽的应答显示CD4和CD8介导HHDII/DP4小鼠中的应答。

在HHDII/DR1转基因小鼠中，还对5种所选择的高瓜氨酸化Cyk8肽进行了筛选。检测到对Cyk8371Hcit和112Hcit肽的显著应答(p<0.0001)，显示与wt肽序列的交叉反应性最小(p<0.002)(图12a)。在存在CD8阻断抗体的情况下，看到了HHDII/DR1小鼠中对Cyk8112Hcit肽的应答丧失，但CD4阻断抗体的作用则较小(图12b)。该应答还表明存在与较短的Cyk8 117Hcit肽的交叉反应性(图12b)。用较短的Cyk8 117-125Hcit肽进行免疫显示，产生了对与Cyk8 112Hcit肽交叉反应的Cyk8 117Hcit肽的应答，而在存在CD8阻断抗体的情况下，该Cyk8 117Hcit应答也丧失了(图12c)。在存在CD4阻断抗体的情况下，HHDII/DR1小鼠中对Cyk8 371Hcit肽的应答丧失，但在存在CD8阻断抗体的情况下，应答没有丧失(图12c)。与离体分析相比，对Cyk8 112Hcit和Cyk8 371Hcit的应答可以在体外维持并表现出相似的应答特征，进一步证实了CD8和CD4分别介导应答(图12d)。对高瓜氨酸化Cyk8肽的应答显示了CD4和CD8介导的应答。

在HHDII/DR1小鼠中，测试了wt肽与Cyk8 112Hcit肽刺激应答的能力。以3次免疫施用Cyk8 112wt肽，其中每次免疫包含25μg肽并以CpG/MPLA作为佐剂。21天后，处死小鼠，并通过离体ELISpot评估对肽的免疫应答。HHDII/DR1小鼠显示对Cyk8 112wt免疫肽没有特异性应答或对Cyk8 112Hcit和Cyk8117Hcit肽没有特异性应答(图12e)。

还使用该基序鉴定了波形蛋白和ALDOA内的其他肽以及BiP、核仁磷酸蛋白、烯醇化酶、β-连环蛋白和HSP60内的肽(表5)。

选择了许多肽进行测试，并用人高瓜氨酸化肽池免疫HHDII/DP4小鼠。为了降低可能的交叉反应性的影响，对每个池中的肽进行选择以使它们不包含任何重叠的氨基酸序列。以3次免疫施用每个池，其中每次免疫包含20μg每种肽并以CpG/MPLA作为佐剂。21天后，处死小鼠，并通过进行离体ELISpot评估对免疫池中每种肽的免疫应答(图13a)。在HHDII/DP4转基因小鼠中，来自跨氨基酸316-336、328-346和562-579的BiP肽、来自跨氨基酸11-27、258-277和266-287的核仁磷酸蛋白(Npm)的肽、来自跨氨基酸156-176、245-264和400-419的烯醇化酶的肽、来自跨氨基酸86-108和390-408的波形蛋白的肽以及来自跨氨基酸204-219和209-217的醛缩酶的肽均显示出刺激IFNγ应答。针对与wt肽序列的交叉反应性，对应答进行表征。在HHDII/DP4小鼠中，对于任何wt肽看到有限的应答，而BiP 328Hcit、562Hcit、Npm258Hcit、Npm 266Hcit和醛缩酶204Hcit应答则显著高于相应的wt肽(p<0.05)(图13a-e)。因此，该预测模型也适用于更广泛的肽类，并且免疫原性肽的关键特征是它们表达高瓜氨酸。

为了进一步表征由氨甲酰化(含高瓜氨酸的)肽诱导的应答，用Hcit肽免疫小鼠，并在CD4或CD8阻断抗体存在下，评估脾细胞在培养7天后对Hcit肽的应答。对醛缩酶204Hcit的应答显示，在存在CD4和CD8阻断抗体的情况下应答丧失，尽管该应答丧失是应答部分丧失。因此，提示该序列可能包含CD4和CD8两种应答(图13e和f)。在存在CD8阻断抗体的情况下，对较短的醛缩酶209Hcit肽的应答丧失，提示存在CD8介导的对该肽的应答(图13f)。在存在CD4阻断抗体的情况下，对BiP 316Hcit、328Hcit和562Hcit的应答均显示出应答丧失，但存在CD8阻断抗体的情况下则没有显示出应答丧失(图14a)。在存在CD4阻断抗体的情况下，对烯醇化酶156Hcit、245Hcit和400Hcit的应答也丧失，而在存在CD8阻断抗体的情况下应答没有丧失(图14b)。在存在CD4阻断抗体的情况下，对于波形蛋白86Hcit和390Hcit应答，看到了相同的应答丧失(图14d)。在存在CD4阻断抗体的情况下，对11Hcit和258Hcit的Npm应答也显示出应答被阻断，但在存在CD8阻断抗体的情况下则没有显示应答被阻断(图14c)，然而，在存在CD8阻断抗体的情况下，Npm 266Hcit应答丧失，但在存在CD4阻断抗体的情况下应答没有丧失(图14c)。

由于在HHDII/DP4小鼠中对高瓜氨酸化醛缩酶204-219的应答提示了存在HHDII(HLA-A2)限制性CD8应答，因此连同在HHDII/DP4小鼠中显示引起CD8介导的应答的较短的209-217Hcit肽，对该肽测试了在HHDII/DR1小鼠中的应答。在HHDII/DR1小鼠中，这两种肽均刺激了对高瓜氨酸肽的强烈应答，且对wt序列具有较低的反应性(图15)。

因此，大多数应答的关键特征是它们是由CD4 T细胞介导的。另外，Hcit特异性应答也可以由CD8 T细胞介导。

实施例4健康人供体和癌症患者的应答

使用来自正常健康供体的PBMC进行研究，确定针对人氨基甲酰化表位的T细胞库的存在。将PBMC分离，并进行CD25消耗。将细胞用CFSE标记，并在用高瓜氨酸肽刺激后监测增殖。显示了一位健康供体和一位肺癌患者的示例图(图106a和b)。对于测试肽中的至少一种，测试的大多数健康供体均显示出高于背景两倍的CD4+T细胞增殖性应答(图16c和e)。在健康供体中，ALDOA 74-93Hcit(p＝0.0079)、ALDOA 140-157Hcit(p＝0.0122)和波形蛋白116-135Hcit(p<0.0001)诱导了显著的CD4增殖。总之，健康供体显示出可以对氨基甲酰化肽作出应答的CD4 T细胞库。

除了健康供体(表6a)，我们还检查了三位卵巢癌、一位乳腺癌和七位肺癌患者的应答库(表6b)。测试的11位患者中有7位显示出对一种或多种氨甲酰化肽的增殖性CD4应答(图16d和f)。在患者中，与仅使用培养基的对照组相比，ALDOA 74-93Hcit(p＝0.0353)诱导了显著的增殖应答。波形蛋白116-135Hcit应答缺乏显著性(p＝0.0605)。这提示，癌症患者还具有CD4 T细胞库，所述CD4 T细胞库能够对氨基甲酰化肽作出应答，并支持靶向氨甲酰化波形蛋白和ALDOA以用于癌症治疗。增殖性应答主要由CD4介导，如图16d所示。

还对大多数供体进行了细胞因子表达的分析(示例图如图17a所示)。对于每种肽，评估显示增殖性应答高于背景两倍的供体的CD134、IFNγ和GraB表达。确定表达每种标志物的增殖CD4细胞的百分比。这种染色显示了这些标记物的可变表达，然而，对IFNγ、颗粒酶B和CD134的检测提示，这些细胞是细胞毒性Th1表型(图17b和c)。

使用来自7位正常健康供体的PBMC进行研究，确定针对人的氨基甲酰化Cyk8表位的T细胞库的存在。将PBMC分离，并进行CD25消耗。将细胞用CFSE标记，并在用Cyk8 Hcit肽刺激后监测增殖。对于测试肽中的至少一种，测试的大多数健康供体均显示出高于背景两倍的CD4+T细胞增殖性应答(图18)。总之，健康供体显示出可以对氨基甲酰化Cyk8肽作出应答的CD4 T细胞库。

B.癌症患者

实施例5识别含有高瓜氨酸的肽的TCR的α和β链配对的确定

分析了响应于ALDOA 74-93Hcit而增殖的CD4 T细胞(CFSE低)与非增殖细胞(CFSE高)相比的TCR表达。对响应的CD4 T细胞的TCR克隆性的检查显示CD4+增殖细胞中对来自供体BD00016 ALDOA74Hcit的TCR Vβ和Vα序列的偏好(图27a-d)。与来自相同培养物的非增殖性CD4相比，这些应答似乎关于一对显性TCRVβ和TCRVα链而是寡克隆的，因此表明TCR库是集中的。

为了鉴定TCRVβ和TCRVα链的正确配对，将单个增殖细胞分选到96个单独的孔中，并使用iPair^TM技术对TCRα和TCRβ链进行测序。76/92孔同时包含TCRVβ和TCRVα链，其中89孔包含从批量分析中鉴定出的序列。38/89这些孔中仅包含TRB链，而11/89孔中仅包含TRA链。40/89孔同时包含TRA和TRB链(表7)。其余的具有成对链的孔包含TRA或TRB或两种序列，所述序列的高批量等级(bulk rank)>30，且频率小于<10％。

表7.ALDOA 74Hcit的TCRα和β链的iPair^TM测序和分析

这些TCR的完整序列如图28-35所示。

分析了响应于ALDOA 140-157Hcit而增殖的CD4 T细胞与非增殖细胞相比的TCR表达。对响应的CD4 T细胞的TCR克隆性的检查显示CD4+增殖细胞对来自供体BD00016 ALDOA140-157Hcit的的TCR Vβ和Vα序列的偏好(图36a-d)。与来自相同培养物的非增殖性CD4相比，这些应答似乎关于一对显性TCRVβ和TCRVα链而言是寡克隆的，因此表明TCR库是集中的。

为了鉴定TCRVβ和TCRVα链的正确配对，将单个增殖细胞分选到96个单独的孔中，并使用iPair^TM技术对TCRα和TCRβ链进行测序。60/75孔同时包含TCRVβ和TCRVα链，其中66孔包含从批量分析中鉴定的序列。20/66这些孔中仅包含TRB链，而12/66孔中仅包含TRA链。34/66孔同时包含TRA和TRB链(表8)。其余的具有成对链的孔包含TRA或TRB或两种序列，所述序列的高批量等级(bulk rank)>30，且频率小于<10％。

表8.ALDOA 140Hcit的TCRα和β链的iPair^TM测序和分析

这些TCR的完整序列如图37-45所示。

分析了响应于波形蛋白116-135Hcit而增殖的CD4 T细胞与非增殖细胞相比的TCR表达。对响应的CD4 T细胞的TCR克隆性的检查显示CD4+增殖细胞对来自供体BD00016ALDOA 140-157Hcit的TCR Vβ和Vα序列的偏好(图46a-d)。与来自相同培养物的非增殖性CD4相比，这些应答似乎关于一对显性TCRVβ和TCRVα链而言是寡克隆的，因此表明TCR库是集中的。

为了鉴定TCRVβ和TCRVα链的正确配对，将单个增殖细胞分选到96个单独的孔中，并使用iPair^TM技术对TCRα和TCRβ链进行测序。70/80孔同时包含TCRVβ和TCRVα链，73孔包含从批量分析中鉴定的序列。34/73这些孔中仅包含TRB链，而9/73孔中仅包含TRA链。30/73孔同时包含TRA和TRB链(表9)。其余的具有成对链的孔包含TRA或TRB或两种序列，所述序列的高批量等级(bulk rank)>30，且频率小于<10％。

表9.波形蛋白116Hcit的TCRα和β链的iPair^TM测序和分析

这些TCR的完整序列如图47-52所示。

实施例6高瓜氨酸肽免疫为侵袭性B16黑素瘤提供有效的疗法

为了确定在肿瘤环境中MHC-II上是否呈递刺激T细胞反应的表位，检查了我们的高瓜氨酸化肽以在B16肿瘤模型中进行肿瘤疗法。在第1天将肿瘤细胞植入小鼠，然后在第4、11和18天用肽和CpG/MPLA免疫小鼠。

分别用B16F1 HHDII/DR1或B16F1 DR4肿瘤攻击HHDII/DR1(图19a)或DR4(图19b)，然后用波形蛋白116-135Hcit肽免疫，并监测肿瘤的生长和存活。HHDII/DR1小鼠显示，与对照小鼠(p<0.0001)和野生型肽治疗的小鼠(p＝0.0051)相比，存活率显著提高了50％。具有CpG/MPLA的野生型肽未显示出明显的抗肿瘤应答。DR4小鼠显示出相似的应答，其中在波形蛋白116-135Hcit肽免疫的小鼠中总体存活率为70％，这与对照小鼠相比显著增加(p＝0.0042)。

用B16 HHDII/DP4肿瘤细胞攻击HHDII/DP4小鼠，然后用ALDOA高瓜氨酸肽免疫HHDII/DP4小鼠(图19c)。与对照小鼠相比，用ALDOA 74-93Hcit(90％p<0.0001)或ALDOA140-157Hcit(60％p＝0.0179)治疗的小鼠存活率显著提高。两种ALDOA高瓜氨酸肽的组合也显示出显著的存活率(90％p<0.0001)。在HHDII/DR1小鼠中，用ALDOA 140Hcit肽进行免疫可导致存活率与对照小鼠相比显著提高(p＝0.0027)(图19d)。未测试ALDOA 74-93Hcit，因为它在该小鼠品系中未诱导免疫应答。

在第1天将B16HHDII/DR1肿瘤细胞植入HHDII/DR1小鼠中，然后在第4、11和18天用Cyk8 371Hcit、112hcit或两种肽和CpG/MPLA免疫小鼠。通过进行单独的肽接种(p<0.05)和进行组合接种(p<0.01)，均看到了显著的对肿瘤生长的预防(图20)。

该数据表明，ALDOA 74-93Hcit和140-157Hcit肽、波形蛋白116-135Hcit肽以及Cyk8 371-388Hcit和112-131Hcit是天然存在的，并且可以通过CD4或CD8 T细胞应答而被靶向用于肿瘤疗法。然而，除非用IFNγ刺激，大多数黑素瘤肿瘤细胞不表达MHC II类。为了模拟自然发生的肿瘤，我们对B16F1细胞进行工程化，使其受小鼠IFNγ诱导型启动子控制而表达HLA-DR4。在存在小鼠IFNγ的情况下，HLA-DR4表达水平可能会上调(Brentville等人，2016；Cook等人，2018)。接着将这种IFNγ诱导型B16 DR4肿瘤植入HLA-DR4小鼠，然后用波形蛋白116-135Hcit肽进行免疫(图19e)。用波形蛋白116-135Hcit肽免疫的小鼠比未免疫的对照小鼠(p＝0.0102)存活率显著提高(40％)。这提示了，波形蛋白116-135Hcit特异性应答能够在体内产生足够的IFNγ，以上调B16肿瘤模型中HLA-DR4的表达并促进抗肿瘤效应。

在另一个相似的模型中，在第1天，将表达受小鼠IFNγ诱导型启动子控制的HLA-DP4的B16F1细胞植入HHDII/DP4小鼠，然后在第4、11和18天用Cyk8 371Hcit肽、BiP526Hcit、烯醇化酶156Hcit、NPM 266Hcit或波形蛋白86Hcit免疫小鼠。看到显著的对肿瘤生长的预防(分别为p＝0.0273，p＝0.0027，p＝0.0154，p＝0.0102和p＝0.0008)(图21)。

该数据表明，高瓜氨酸化的Cyk8 371、BiP 526、烯醇酶156、NPM 266和波形蛋白86肽天然地由肿瘤呈递，并且可以通过CD4 T细胞应答而被靶向。

实施例7肿瘤细胞不表达MPO，但嗜中性粒细胞和MDSC是肿瘤环境中MPO的来源

在证明含有高瓜氨酸的肽可以诱导肿瘤疗法后，我们接下来寻找确定在肿瘤环境中氨甲酰化来源的方法。我们的体外数据表明，在存在氰酸盐的情况下培养的细胞可以发生胞内氨甲酰化。在某些炎症条件下，由于MPO的作用，氰酸盐的水平增加。因此，我们评估了肿瘤上的MPO表达。对体外培养的肿瘤细胞的染色显示细胞不表达MPO(图22a)。已知MPO由某些免疫细胞表达，因此，还评估了体内生长的肿瘤的MPO表达。将B16肿瘤植入小鼠中，使该B16肿瘤生长至直径为10mm，然后将该肿瘤提取，分解并通过流式细胞术进行分析。MPO表达不存在于包括肿瘤细胞的CD45-ve级分中，但存在于CD45+ve级分中的表达CD11b的细胞群上(图22b)。对标志物Ly6C和Ly6G的分析揭示了CD11b+MPO+细胞群，所述细胞群表达Ly6G并表达较低水平的Ly6C，或不表达Ly6G并表达较高水平的Ly6C(图22b)。这些群在文献中分别被表征为粒细胞型(G-MDSC)和单核细胞型(M-MDSCs)(Rose，Misharin和Perlman，2012；Bronte等人，2016)。Ly6G+群体也可能含有嗜中性粒细胞，因为G-MDSC和嗜中性粒细胞均表达这种标志物模式。

为了评估在表达MPO的肿瘤内的细胞群与在脾脏中的细胞群是否不同，在这些组织中评估了产生MPO的细胞。与脾脏相比，肿瘤中的MPO水平升高(图22c)。脾细胞和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的染色揭示了细胞类型产生MPO的差异(图22d)。在脾脏中，MPO主要由Ly6G+Ly6C^low细胞(占MPO+细胞的65％)产生，而Ly6G-Ly6C^hi细胞(占MPO+细胞的12％)贡献最少。相反，在肿瘤中，MPO主要由Ly6G+Ly6C^low细胞(中值22％)和Ly6G-Ly6C^hi细胞(中值36％)产生更多，而Ly6G^-Ly6C^low细胞贡献较少。这提示在肿瘤中，G-MDSC样和M-MDSC样群均可能促成氨甲酰化。为了验证M-MDSC是单核细胞源性还是巨噬细胞源性的，针对巨噬细胞标志物CD115和F4/80，对其进行染色(图22e)。Ly6G^-Ly6C^hi细胞是巨噬细胞标志物阴性的，提示它们确实是髓系来源的。

接下来，我们的目标是确定这些细胞群是否在肿瘤微环境的氨甲酰化中起作用并因此对于抗肿瘤效应而言是必需的。将肿瘤植入HHDII/DP4小鼠中，然后用ALDOA高瓜氨酸肽免疫HHDII/DP4小鼠。然后分别不处理小鼠，或用Ly6G或Ly6C消耗抗体处理小鼠以去除嗜中性粒细胞/G-MDSC或单核细胞/M-MDSC。肽接种与100％存活率相关联，而肽和Ly6G+抗体与轻微而显著降低的抗肿瘤效应有关相关联(80％存活率，p＝0.04)(图23a)。然而，接种和Ly6G抗体的组合仍明显优于单独的抗体(0％存活率，p＝0.0017)。这提示Ly6G+群体在抗肿瘤效应中起的作用小。

接下来，使用抗体消耗Ly6C+群(图23b)。与对照组相比，单独的Ly6C消耗可提高存活率(20％存活率，p＝0.0012)。在本研究中，仅接种即可获得80％的存活率(p<0.0001)。然而，看到肽接种和Ly6C抗体的组合显著降低了仅使用疫苗时的存活率(存活率40％，p＝0.0480)。给予疫苗和抗体的组中的存活率与单独使用Ly6C抗体治疗所见的存活率相当。Ly6C抗体治疗后的肿瘤染色显示，表达MPO的CD45+细胞水平降低(图23c)。这些结果共同表明，Ly6C+细胞在肿瘤中作为导致肿瘤中蛋白质的氨甲酰化的MPO的来源的作用。这些结果也可能提示了，Ly6C+群在促进肿瘤生长中起着重要作用，因为消耗这些细胞提高了存活率。

为了提供进一步的证据来支持MDSC介导氨甲酰化的能力，在存在GMCSF和IL18的情况下，由骨髓源性细胞体外产生MDSC。通过流式细胞术染色测量G-MDSC和M-MDSC水平。在存在单独的培养基或存在LPS刺激的情况下，G-MDSC和M-MDSC均显示了产生MPO的证据(图24a)。这些结果表明，MDSC作为氨甲酰化所必需的MPO的来源的作用。

将体外培养的MDSC与B16肿瘤细胞共孵育，以确定是否可以在肿瘤细胞内诱导氨甲酰化。已知B16肿瘤细胞缺乏MPO的表达，但与表达MPO的MDSC以及额外的MPO底物KSCN和H₂O₂共孵育后，它们显示氨甲酰化水平提高(图24b)。这些结果表明，MDSC产生的MPO可以起使肿瘤细胞内的蛋白氨甲酰化的作用。

实施例8当肿瘤细胞在MHC-II上呈递肽时，肿瘤疗法主要由CD4细胞的直接作用介导

在肿瘤环境中，MDSC对于氨甲酰化似乎很重要，因此疫苗诱导CD4细胞可能不与肿瘤细胞直接相互作用。接下来，为了用氨甲酰化肽进行免疫以对存活率产生影响，我们的目标是确定肿瘤细胞是否需要呈递MHC-II。将不能表达HLA-DR4的肿瘤细胞植入HLA-DR4转基因小鼠中(图25a)。在此模型中，用波形蛋白116-135Hcit肽免疫的小鼠显示出20％的存活率，低于针对B16F1 DR4细胞的存活率，但仍比对照显著提高(p＝0.0010)。这提示，波形蛋白116-135Hcit应答可能通过识别肿瘤浸润APC和分泌促炎细胞因子而对HLA-DR4模型中的肿瘤具有间接作用。但是，在植入了不能表达DR1的B16F1 HHDII细胞的HHDII/DR1小鼠中，用波形蛋白116-135Hcit肽进行免疫没有提供比对照组小鼠更好的存活优势(图25b)。因此，通过MHC-II直接识别肿瘤细胞似乎在抗肿瘤效应中起主要作用，因为在肿瘤上表达适当MHC II类分子的模型中，肿瘤疗法得到了显着增强。在ALDOA免疫的小鼠中也是如此。在肿瘤细胞不能表达HLA-DP4的模型中，氨甲酰化ALDOA肽的抗肿瘤效应完全丧失(图25c)。因此，这些研究为肿瘤细胞在MHC II类分子上呈递氨甲酰化肽以及通过浸润CD4 T细胞直接识别这些肽提供了证据。

为了提供CD4 T细胞应答在肿瘤疗法中的作用的进一步证据，在第1天将B16HHDII/iDP4肿瘤细胞植入HHDII/DP4小鼠中，然后在第4、8和11天用肽和CpG/MPLA免疫小鼠。在进行肽免疫的同时，还用CD4或CD8消耗抗体治疗小鼠，并监测肿瘤的生长。用醛缩酶Hcit肽免疫的小鼠表现出70％的无肿瘤存活率(p＜0.0001)，而在对照的未免疫小鼠中存活率为10％(图26)。用醛缩酶wt肽免疫显示肿瘤存活与对照小鼠相比没有差异，表明肿瘤疗法应答是具有Hcit特异性的。消耗CD8 T细胞对醛缩酶Hcit肽介导的肿瘤疗法没有影响。然而，消耗CD4 T细胞导致肿瘤疗法的显著损失(p＝0.0124)，从而为CD4 T细胞应答在醛缩酶Hcit肽介导的肿瘤疗法中起重要作用提供了证据。因此，该研究为由肿瘤呈递氨甲酰化肽以及CD4 T细胞在肿瘤疗法中的直接作用提供了进一步的证据。

为了显示氰酸盐/异氰酸是否能穿过细胞膜，在存在或不存在与异氰酸动态平衡的氰酸钾的情况下，体外培养B16F1黑素瘤细胞系。作为阳性对照，还由体外培养的B16F1细胞产生了裂解液，然后用或不用KCNO处理该裂解液。与KCNO孵育后，整个细胞和细胞裂解液中的氨甲酰化均显著增加(图9a)。这表明，来自整个肿瘤细胞的蛋白质可以经历氨甲酰化，这意味着氰酸盐/异氰酸可以穿过细胞膜诱导胞内氨甲酰化。

还裂解了B16DP4肿瘤，并通过质谱分析了该肿瘤的HSP60氨甲酰化。K191、K202、K205、K218、K222、K359、K481和K58均被氨甲酰化。

实施例9高瓜氨酸肽与HLA-DP4结合

将已知的hepB HLA-DP4结合肽和3种不与HLA-DP4结合的肽进行生物素化处理，并与HLA-DP4制剂一起孵育(图53a)。生物素化Hep B牢固结合(OD 0.850)，相比之下，阴性肽与背景相比则无明显结合。

为确保Hep B的生物素化不干扰其结合，将HLA-DP4与等量的生物素化且未标记的Hep B肽进行孵育。未标记的肽竞争同样使结合降低47％(图53b)。

然后将生物素化HepB肽与5倍过量的未标记高瓜氨酸肽孵育。所有肽均抑制了生物素化Hep B与HLA-DP4的结合，但抑制水平不同(图53c-e)。醛缩酶A 74-93Hcit、醛缩酶A140-157Hcit、醛缩酶A 217-235Hcit、醛缩酶A 238-256Hcit、Cyk8 101-120Hcit、Cyk8112-131Hcit、Cyk8 182-202Hcit、Cyk8 371-388Hcit和Cyk8 281-399Hcit均显示大于60％的抑制(表10)。这些结果提示了，识别与任何这些肽复合的HLA-DP4的TCR均可用于肿瘤治疗。相比野生型肽，所有Hcit肽均显示了对生物素化Hep B与HLA-DP4的结合的强烈抑制，而波形蛋白116则除外，且波形蛋白116在HLA-DP4转基因小鼠中也不能诱导T细胞应答。

表10.含高瓜氨酸的肽与Hep B病毒肽竞争与HLA-DP4结合

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Claims

1.一种高瓜氨酸化T细胞表位，所述表位(i)与MHC II类或MHC I类结合的预测结合得分<30，所述得分使用在线IEDB预测程序(http://www.iedb.org/)预测，和(ii)具有形成螺旋构象结构的至少5个连续氨基酸。

2.根据权利要求1所述的表位，其特征在于，所述表位来自胞质蛋白。

3.根据权利要求1所述的表位，其特征在于，所述表位包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：

i)以下氨基酸序列中的一个或多个氨基酸序列，其中一个或多个赖氨酸(K)残基被高瓜氨酸置换：

NYIDKVRFLEQQNKILLAEL (波形蛋白116-135)

LARLDLERKVESLQEEIAFLK (波形蛋白215-235)

QIDVDVSKPDLTAALRDVRQQ (波形蛋白255-275)

EAEEWYKSKFADLSEAAN (波形蛋白286-303Hcit)

LPLVDTHSKRTLLKTVETRDGQV (波形蛋白431-454)

FKNTRTNEKVELQELNDRFA (波形蛋白96-115)

TNEKVELQELNDRFANYIDKVR (波形蛋白101-122)

KVRFLEQQNKLLAE (波形蛋白120-134)

DVRQQYESVAAKNLQEAE (波形蛋白271-288)

EAEEWYKSKFADLSEAANRN (波形蛋白286-305)

FSLADAINTEFKNTRTNEKVELQ (波形蛋白86-108)

KMALDIEIATYRKLLEGEE (波形蛋白390-408)

IGGVILFHETLYQKADDGRP (醛缩酶74-93)

KDGADFAKWRCVLKIGEH (醛缩酶140-157)

LSDHHIYLEGTLLKPNMVT (醛缩酶217-235)

HACTQKFSHEEIAMATVTA (醛缩酶238-256)

KCPLLKPWALTFSYGRALQ (醛缩酶289-307)

DLKRCQYVTEKVLAAVYKA (醛缩酶198-216)

AAQEEYVKRALANSLACQGK (醛缩酶323-342)

KVLAAVYKALSDHHIYLEG (醛缩酶208-226)

YVTEKVLAAVYKALSD (醛缩酶204-219Hcit)

VLAAVYKAL (醛缩酶209-217Hcit)

KFASFIDKVRFLEQQNKMLE (细胞角蛋白8 101-120)

LEQQNKMLETKWSLLQQQKT (细胞角蛋白8 112-131)

KMLETKWSL (细胞角蛋白8 117-125)

EINKRTEMENEFVLIKKDVDE (细胞角蛋白8 182-202)

LREYQELMNVKLALDIEI (细胞角蛋白8 371-388)

KLALDIEIATYRKLLEGEE (细胞角蛋白8 381-399)

ETKWSLLQQQKTARSNMDNMF (细胞角蛋白8 120-140)

EQIKSLNNKFASFIDKVRFL (细胞角蛋白8 93-112)

ENEFVLIKKDVDEAYMNKV (细胞角蛋白8 190-208)

GKHGDDLRRTKTEISEM (细胞角蛋白8 294-310)

RQLREYQELMNVKLALEI (细胞角蛋白8 369-388)

EIEGLKGQRASLEAAIADA (细胞角蛋白8 320-338)

EQRGELAIKDANAKLSELEA (细胞角蛋白8 339-358)

NDPSVQQDIKFLPFKVVEKKT (BiP 104-124)

EISAMVLTKMKETAEA (BiP 144-159)

GEDFDQRVMEHFIKLYKKKTG (BiP 255-275)

QKLRREVEKAKRALSSQHQAR (BiP 286-306)

EDFSETLTRAKFEELNMDLFR (BiP 316-336)

EELNMDLFRSTMKPVQKVL (BiP 328-346)

RIPKIQQLVKEFFNGKEPSRG (BiP 367-387)

TVTIKVYEGERPLTKDNHLLG (BiP 460-480)

RNELESYAYSLKNQIGDK (BiP 562-579)

KKELEEIVQPIISKLYGSAG (BiP 620-639)

PLRPQNYLFGCELKADK (NPM 11-27)

EGSPIKVTLATLKMSVQPTVSL (NPM 68-89)

EEEDVKLLSISGKRSAPGGGS (NPM 129-149)

SKGQESFKKQEKTPKTPKG (NPM 222-240)

GGSLPKVEAKFINYVKNCFR (NPM 258-277)

AKFINYVKNCFRMTDQEAIQDL (NPM 266-287)

MSILKIHAREIFDSRG (α-烯醇化酶1-16)

NDKTRYMGKGVSKAVEHI (α-烯醇化酶52-69)

TENKSKFGANAILGVSLAVCKA (α-烯醇化酶100-121)

GSHAGNKLAMQEFMILPVGAA (α-烯醇化酶156-176)

REAMRIGAEVYHNLKNVIK (α-烯醇化酶179-197)

NVIKEKYGKDATNVGDEGG (α-烯醇化酶194-212)

DVAASEFFRSGKYDLDFKSP (α-烯醇化酶245-264)

PDQLADLYKSFIKDYPVVS (α-烯醇化酶273-291)

WGAWQKFTASAGIQVVG (α-烯醇化酶301-317)

NKSCNCLLLKVNQIGSVTE (α-烯醇化酶333-352)

RSERLAKYNQLLRIEEELGS (α-烯醇化酶400-419)

GSKAKFAGRNFRNPLAK (α-烯醇化酶418-434)

EPSQMLKHAVVNLINYQD (β-连环蛋白127-144)

EKLLWTTSRVLKVLSVCSSNK (β-连环蛋白334-354)

TLHNLLLHQEGAKMAVRL (β-连环蛋白258-275)

AKMAVRLAGGLQKMVALLNK (β-连环蛋白269-288)

KTNVKFLAITTDCLQILAYG (β-连环蛋白288-307)

TYEKLLWTTSRVLKVLSV (β-连环蛋白332-349)

TSRVLKVLSVCSSNKPAIV (β-连环蛋白340-358)

YGLPVVVKLLHPPSHWPL (β-连环蛋白489-506)

HWPLIKATVGLIRNLALCPA (β-连环蛋白503-522)

IENIQRVAAGVLCELAQDK (β-连环蛋白607-625)

GVATYAAAVLFRMSEDKP (β-连环蛋白650-667)

IDLKDKYKNIGAKLVQDVAN (HSP60 84-103)

TVLARSIAKEGFEKISKGAN (HSP60 117-136)

GEALSTLVLNRLKVGLQVVA (HSP60 280-299)

TTSEYEKEKLNERLAKLS (HSP60 381-398)

GIIDPTVKVRTALLDAAGVA (HSP60 517-536)，或

ii)i)的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸序列，不同之处在于非赖氨酸位置上具有1、2或3个氨基酸取代和/或1、2或3个氨基酸插入和/或1、2或3个氨基酸缺失。

4.根据权利要求3所述的表位，其特征在于，所述表位包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：

i)以下氨基酸序列中的一个或多个氨基酸序列：

NYID-Hcit-VRFLEQQN-Hcit-ILLAEL (波形蛋白116-135Hcit),

LARLDLER-Hcit-VESLQEEIAFL-Hcit (波形蛋白215-235Hcit),

QIDVDVS-Hcit-PDLTAALRDVRQQ (波形蛋白255-275Hcit),

EAEEWY-Hcit-S-Hcit-FADLSEAAN (波形蛋白286-303Hcit),

LPLVDTHS-Hcit-RTLL-Hcit-TVETRDGQV (波形蛋白431-454Hcit),

F-Hcit-NTRTNE-Hcit-VELQELNDRFA (波形蛋白96-115Hcit)

TNE-Hcit-VELQELNDRFANYID-Hcit-VR (波形蛋白101-122Hcit)

KVRFLEQQN-Hcit-LLAE (波形蛋白120-134Hcit)

DVRQQYESVAA-Hcit-NLQEAE (波形蛋白271-288Hcit)

EAEEWY-Hcit-S-Hcit-FADLSEAANRN (波形蛋白286-305Hcit)

FSLADAINTEF-Hcit-NTRTNE-Hcit-VELQ (波形蛋白86-108Hcit)

Hcit-MALDIEIATYR-Hcit-LLEGEE (波形蛋白390-408Hcit)

IGGVILFHETLYQ-Hcit-ADDGRP (醛缩酶74-93Hcit),

Hcit-DGADFA-Hcit-WRCVL-Hcit-IGEH (醛缩酶140-157Hcit)

LSDHHIYLEGTLL-Hcit-PNMVT (醛缩酶217-235Hcit)

HACTQ-Hcit-FSHEEIAMATVTA (醛缩酶238-256Hcit)

Hcit-CPLL-Hcit-PWALTFSYGRALQ (醛缩酶289-307Hcit)

DL-Hcit-RCQYVTE-Hcit-VLAAVY-Hcit-A (醛缩酶198-216Hcit)

AAQEEYV-Hcit-RALANSLACQG-Hcit (醛缩酶323-342Hcit)

Hcit-VLAAVY-Hcit-ALSDHHIYLEG (醛缩酶208-226Hcit)

YVTE-Hcit-VLAAVY-Hcit-ALSD (醛缩酶204-219Hcit)

VLAAVY-Hcit-AL (醛缩酶209-217)

KFASFID-Hcit-VRFLEQQN-Hcit-MLE (细胞角蛋白8 101-120Hcit)

LEQQN-Hcit-MLET-Hcit-WSLLQQQ-Hcit-T (细胞角蛋白8 112-131Hcit)

Hcit-MLET-Hcit-WSL (细胞角蛋白8 117-125)

EIN-Hcit-RTEMENEFVLI-Hcit-Hcit-DVDE (细胞角蛋白8 182-202Hcit)

LREYQELMNV-Hcit-LALDIEI (细胞角蛋白8 371-388Hcit)

Hcit-LALDIEIATYR-Hcit-LLEGEE (细胞角蛋白8 381-399Hcit)

ET-Hcit-WSLLQQQ-Hcit-TARSNMDNMF (细胞角蛋白8 120-140Hcit)

EQI-Hcit-SLNN-Hcit-FASFID-Hcit-VRFL (细胞角蛋白8 93-112Hcit)

ENEFVLI-Hcit-Hcit-DVDEAYMN-Hcit-V (细胞角蛋白8 190-208Hcit)

G-Hcit-HGDDLRRT-Hcit-TEISEM (细胞角蛋白8 294-310Hcit)

RQLREYQELMNV-Hcit-LALEI (细胞角蛋白8 369-388Hcit)

EIEGL-Hcit-GQRASLEAAIADA (细胞角蛋白8 320-338Hcit)

EQRGELAI-Hcit-DANA-Hcit-LSELEA (细胞角蛋白8 339-358Hcit)

NDPSVQQDI-Hcit-FLPF-Hcit-VVE-Hcit-Hcit-T (BiP 104-124Hcit)

EISAMVLT-Hcit-M-Hcit-ETAEA (BiP 144-159Hcit)

GEDFDQRVMEHFI-Hcit-LY-Hcit-Hcit-Hcit-TG (BiP 255-275Hcit)

QKLRREVEKAKRALSSQHQAR (BiP 286-306Hcit)

EDFSETLTRA-Hcit-FEELNMDLFR (BiP 316-336Hcit)

EELNMDLFRSTM-Hcit-PVQ-Hcit-VL (BiP 328-346Hcit)

RIP-Hcit-IQQLV-Hcit-EFFNG-Hcit-EPSRG (BiP 367-387Hcit)

TVTI-Hcit-VYEGERPLT-Hcit-DNHLLG (BiP 460-480Hcit)

RNELESYAYSL-Hcit-NQIGD-Hcit- (BiP 562-579Hcit)

Hcit-Hcit-ELEEIVQPIIS-Hcit-LYGSAG (BiP 620-639Hcit)

PLRPQNYLFGCEL-Hcit-AD-Hcit- (NPM 11-27Hcit)

EGSPIKVTLATLKMSVQPTVSL (NPM 68-89Hcit)

EEEDV-Hcit-LLSISG-Hcit-RSAPGGGS (NPM 129-149Hcit)

S-Hcit-GQESF-Hcit-Hcit-QE-Hcit-TP-Hcit-TP-Hcit-G (NPM 222-240Hcit)

GGSLP-Hcit-VEA-Hcit-FINYV-Hcit-NCFR (NPM 258-277Hcit)

A-Hcit-FINYV-Hcit-NCFRMTDQEAIQDL (NPM 266-287Hcit)

MSIL-Hcit-IHAREIFDSRG (α-烯醇化酶1-16Hcit)

ND-Hcit-TRYMG-Hcit-GVS-Hcit-AVEHI (α-烯醇化酶52-69Hcit)

TEN-Hcit-S-Hcit-FGANAILGVSLAVC-Hcit-A (α-烯醇化酶100-121Hcit)

GSHAGN-Hcit-LAMQEFMILPVGAA (α-烯醇化酶156-176Hcit)

REAMRIGAEVYHNL-Hcit-NVI-Hcit- (α-烯醇化酶179-197Hcit)

NVI-Hcit-E-Hcit-YG-Hcit-DATNVGDEGG (α-烯醇化酶194-212Hcit)

DVAASEFFRSG-Hcit-YDLDF-Hcit-SP (α-烯醇化酶245-264Hcit)

PDQLADLY-Hcit-SFI-Hcit-DYPVVS (α-烯醇化酶273-291Hcit)

WGAWQ-Hcit-FTASAGIQVVG (α-烯醇化酶301-317Hcit)

N-Hcit-SCNCLLL-Hcit-VNQIGSVTE (α-烯醇化酶333-352Hcit)

RSERLA-Hcit-YNQLLRIEEELGS (α-烯醇化酶400-419Hcit)

GS-Hcit-A-Hcit-FAGRNFRNPLA-Hcit- (α-烯醇化酶418-434Hcit)

EPSQML-Hcit-HAVVNLINYQD (β-连环蛋白127-144Hcit)

E-Hcit-LLWTTSRVL-Hcit-VLSVCSSN-Hcit (β-连环蛋白334-354Hcit)

TLHNLLLHQEGA-Hcit-MAVRL (β-连环蛋白258-275Hcit)

A-Hcit-MAVRLAGGLQ-Hcit-MVALLN-Hcit (β-连环蛋白269-288Hcit)

-Hcit-TNV-Hcit-FLAITTDCLQILAYG (β-连环蛋白288-307Hcit)

TYE-Hcit-LLWTTSRVL-Hcit-VLSV (β-连环蛋白332-349Hcit)

TSRVL-Hcit-VLSVCSSN-Hcit-PAIV (β-连环蛋白340-358Hcit)

YGLPVVV-Hcit-LLHPPSHWPL (β-连环蛋白489-506Hcit)

HWPLI-Hcit-ATVGLIRNLALCPA (β-连环蛋白503-522Hcit)

IENIQRVAAGVLCELAQD-Hcit- (β-连环蛋白607-625Hcit)

GVATYAAAVLFRMSED-Hcit-P (β-连环蛋白650-667Hcit)

IDLKDKYKNIGAKLVQDVAN (HSP60 84-103Hcit)

TVLARSIA-Hcit-EGFE-Hcit-IS-Hcit-GAN (HSP60 117-136Hcit)

GEALSTLVLNRL-Hcit-VGLQVVA (HSP60 280-299Hcit)

TTSEYE-Hcit-E-Hcit-LNERLA-Hcit-LS (HSP60 381-398Hcit)

GIIDPTV-Hcit-VRTALLDAAGVA (HSP60 517-536Hcit)

其中“Hcit”代表高瓜氨酸，

或ii)i)的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸序列，不同之处在于非高瓜氨酸位置上具有1、2或3个氨基酸取代和/或1、2或3个氨基酸插入和/或1、2或3个氨基酸缺失。

5.一种根据前述权利要求中任一项所述的抗原与MHC分子的复合物，可选地，其中，所述MHC分子是MHC II类，可选地，该MHC II类选自HLA-DR4、HLA-DR1和HLA-DP4，或可选为HLA-A2。

6.一种结合部分，所述结合部分结合权利要求1至3中任一项所述的多肽。

7.根据权利要求6所述的结合部分，其特征在于，所述结合部分在多肽与MHC复合时结合所述多肽。

8.根据权利要求7所述的结合部分，其特征在于，所述结合部分是T细胞受体(TCR)或抗体。

9.根据权利要求7所述的结合部分，其特征在于，所述TCR在细胞表面上。

10.根据权利要求7所述的结合部分，其特征在于，TCR包括α链结构域和β链结构域，所述α链结构域和β链结构域具有以下CDR：

11.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽、根据权利要求4所述的复合物或根据权利要求6至9中任一项所述的结合部分在医学上的用途。

12.根据权利要求11所述的多肽、复合物和/或结合部分的用途，其特征在于，所述多肽、复合物和/或结合部分用于治疗或预防癌症。

13.一种药物组合物，包含：根据权利要求1至4中任一项所述的多肽、根据权利要求5所述的复合物、和/或根据权利要求6至10中任一项所述的结合部分；以及药学上可接受的载体。

14.一种鉴定结合根据权利要求5所述的复合物的结合部分的方法，所述方法包括：使候选结合部分与所述复合物接触，并确定所述候选结合部分是否结合所述复合物。