TWI467178B - 用以診斷自體免疫疾病之人工合成胜肽、方法及套組 - Google Patents

Description

用以診斷自體免疫疾病之人工合成胜肽、方法及套組

本揭示內容是有關於用來偵測或診斷自體免疫疾病的人工合成胜肽、方法與套組。詳言之，本揭示內容所提供的人工合成胜肽、方法與檢測套組，是利用從β-2-糖蛋白-1(β-2-glycoprotein-1,β-2-GPl)衍生而來的人工合成胜肽來偵測自體免疫疾病的自體抗體，因此可輕易地偵測或診斷自體免疫疾病。

紫斑症(purpura)是由於微管結構中的血液過度滲漏至皮膚或黏膜後所造成的現象。傳統上依據所出現紫斑的大小，將紫斑分成瘀點斑(petchiae)(即，直徑不超過2公釐的點狀出血)、紫斑(purpura)(直徑在2公釐至1公分間)或瘀斑(ecchymoses)(直徑超過1公分以上)。雖然紫斑本身並沒有立即性的危險，然而卻是潛藏、致命性疾病的前兆。因此，確診或是確定沒有危險是必要的。

過敏性紫斑症(Henoch-purpura,HSP)是一種系統性微管結構發炎或血管發炎，特徵是皮膚或腎臟會出現IgA沉積，其指標性病兆為非血小板減少型紫斑、腹痛、關節炎及腎炎。HSP是一種常見的兒童微管結構發炎，但任何歲數的人都可能出現HSP，只是一般好發在2~11歲左右的兒童。迄今，並無任何單一測試可供檢測HSP之用，因此醫師需仰賴病史與一系列的身體檢查，與少數關鍵性實驗測試來確認HSP的診斷結果。代表性測試包括完整的血液細胞記數，其中包括血小板數目、週邊血液抹片、凝血酶原以及活化部分凝血質的時間，檢查尿液樣品中是否有血尿，以及皮膚和/或腎臟切片。

因此，亟需一種可早期診斷、偵測或確認一患有HSP或疑似患有HSP之個體情況的改良方法，藉以對有需求的個體提供早期治療。

本揭示內容係關於從一種蛋白質，β-2-糖蛋白-1(β-2-glycoprotein-1,β-2-GPl)，的抗原決定部位衍生而來的人工合成胜肽的用途，這些人工合成胜肽可被患有過敏性紫斑症(Henoch-purpura,HSP)的個體體內的自體抗體認得，且能與患有HSP之個體身上的自體免疫自體抗體反應。

因此，本揭示內容第一態樣是提供一種人工合成胜肽，其可輕易地偵測或診斷出患有HSP或疑似患有HSP之個體體內的自體抗體。這些人工合成胜肽是衍生自β-2-GPl，且包含一氨基酸序列，此氨基酸序列與任一選自序列編號：3、序列編號：5、序列編號：7、序列編號：11及序列編號：12群組中之序列的氨基酸順序至少80%相同。同時，依據本揭示內容所合成的胜肽被證明適合用來專一性地診斷HSP。

因此，本揭示內容另一態樣是提供一種用來偵測或診斷出患有HSP或疑似患有HSP之個體的方法，包含以下步驟：自該個體取得一生物樣本；利用將該生物樣本與依據本揭示內容一實施態樣所製備之人工合成胜肽彼此混合，而偵測出該生物樣本中的自體抗體，該自體抗體可與該人工合成胜肽在一免疫反應中反應而形成一複合物。較佳是，該人工合成胜肽是衍生自β-2-GPl，且包含一與序列編號：3、序列編號：5、序列編號：7、序列編號：11或序列編號：12之序列至少80%相同的氨基酸序列。在一實施方式中，此免疫反應為酵素連接之免疫吸附物分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。在另一較佳實施方式中，該自體抗體可與自β-2-GPl衍生而來的該人工合成胜肽形成一複合物，該人工合成胜肽包含一與序列編號：3之序列至少90%相同的氨基酸序列。此自體抗體包含一種免疫球蛋白A(IgA)。在一實施方式中，此生物樣本是選自皮膚切片樣本、全血樣本、血清樣本、血漿樣本、尿液樣本、黏液樣本及其之純化或過濾後的形式。

另一方面，本揭示內容是有關一種可用來偵測或診斷出患有HSP或疑似患有HSP之個體的檢驗套組。此檢驗套組包含一容器；多種用來偵測一生物樣本中之一自體抗體的試劑，其中該些試劑包含至少一種衍生自β-2-GPl的人工合成胜肽，該些人工合成胜肽是依據本揭示內容一實施方式所述的操作步驟進行合成，該些胜肽包含一與序列編號：3、序列編號：5、序列編號：7、序列編號：11或序列編號：12之序列至少80%相同的氨基酸序列；以及一說明書，放在該容器中，用來說明如何使用這些從β-2-GPl衍生而來的人工合成胜肽，來偵測該生物樣本中的自體抗體。在一實施例中，此檢驗套組更包含一負控制組，其代表在一健康人身上可與該些自β-2-GPl衍生而來的人工合成胜肽(其具有與任一選自序列編號：3、序列編號：5、序列編號：7、序列編號：11或序列編號：12之序列至少80%相同的氨基酸序列)形成一複合物的自體抗體的量。該些生物樣本是選自皮膚切片樣本、全血樣本、血清樣本、血漿樣本、尿液樣本、黏液樣本及其之純化或過濾後的形式。

透過以下的詳細明與附隨之申請專利範圍將可更了解本揭示內容的這些及其他特徵。需知以上的概述及以下的詳細說明僅為例示，用來闡述本揭示內容，而非用以限制本揭示內容之範疇。

所述實施方式與專有名詞是為了闡述發明內容之用，並非用以限制本揭示內容範疇。本揭示內容範疇也涵蓋並未特意揭示於此，但習知技藝人士在閱讀過本揭示內容後可輕易推知的其他實施方式。

以衍生自β-2-GPl的胜肽做為是否出現過敏性紫斑症(Henoch- purpura,HSP)的標記

本揭示內容提供從自體抗原衍生而來的專一性標記或胜肽，做為是否出現HSP的判斷依據。這些胜肽可用來偵測、診斷或確認是否有HSP。

在本揭示內容研發過程中所執行的實驗使發明人得以鑑別出一種自體抗原，特別是，一種分離自患有HSP之個體身上的血漿蛋白質，β-2-糖蛋白-1(β-2-glycoprotein-1,β-2-GPl)。因此，可將這些能被HSP之專一性自體抗體認得的β-2-GPl衍生胜肽當成一種工具，讓醫師能正確地診斷及確認一臨床HSP病況，進而能提供治療給亟需治療的個體。

在某些實施方式中，本揭示內容提供依據以自β-2-GPl衍生而來的人工合成胜肽與自體抗體間的偵測結果，來偵測、診斷或確認HSP的人工合成胜肽、方法和檢驗套組。

「個體(subject)」一詞在本文中代表將受到本發明診斷之任何一種動物(例如，人類)，包括，但不限於，人類、非人類的靈長類。一般來說，當指人類個體時，「患者(patient)」一詞及「個體(subject)」一詞在本文中可彼此交替使用。

「患有HSP或疑似患有HSP之個體」一詞在本文中涵蓋一開始曾被診斷出HSP但其嚴重程度尚未確認的個體。此名詞更涵蓋曾患有HSP但其病症已減輕的個體。

β-2-糖蛋白-1是一種人類血漿蛋白質，已被高度純化、結晶並研究，其係由一條內含345個氨基酸的多胜肽組成，分子量約為50kDa。一般認為β-2-糖蛋白-1的功能是在內生性凝血系統中做為一種抗凝劑，當以陰離子性磷脂ELISA試驗來分析自體免疫病患者體內的「抗磷脂(antiphospholipid,aPL)」抗體時，β-2-糖蛋白-1是與這些aPL抗體結合時不可或缺的一部分。此外，β-2-糖蛋白-1也會和低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)結合，並被認為是一種在唾液免疫分析時用來偵測心血管疾病的又用標記物(參見美國專利第5,900,356號及美國專利公開案第2003/0100036A1)。

依據本揭示內容一實施方式，將β-2-GPl多胜肽之全長隨機分成15段，每一段中可有或無重疊的氨基酸，且每一段胜肽斷片含有約18至57個人類β-2-GPl的氨基酸殘基。可利用習知技藝中標準的胜肽合成方法，來合成這些β-2-GPl的衍生胜肽。在一實例中，是以固相胜肽合成儀(ABI433A peptide synthesizer,Applied Biosystems Inc.,Life Technologies Corp.,Foster City,CA,USA)，並依據設備商所提供的標準流程來合成這些β-2-GP1的衍生胜肽，並將所合成的胜肽分別命名為P-1(序列編號：1)、P-2(序列編號：2)、P-3(序列編號：3)、P-4(序列編號：4)、P-5(序列編號：5)、P-6(序列編號：6)、P-7(序列編號：7)、P-8(序列編號：8)、P-9(序列編號：9)、P-10(序列編號：10)、P-11(序列編號：11)、P-12(序列編號：12)、P-13(序列編號：13)、P-14(序列編號：14)和P-15(序列編號：15)，其詳細內容揭示於一較佳實施例中的表1。

此領域具有通常知識水準的人可依據現今能夠預測多胜肽順序中一多胜肽構形變化所可能會有的影響的方法，例如電腦模擬程式，透過建議並測試經過修飾的β-2-GPl衍生胜肽，來決定此經過修飾的β-2-GPl衍生胜肽是否仍保留原來的功能或構形，而能「設計(design)」或「修飾(modify)」本揭示內容中所揭示的這些β-2-GPl衍生胜肽。可明確地修飾這些β-2-GPl衍生胜肽以改變這些胜肽之一與生理活性無關的特定特徵。舉例來說，可取代或刪除半胱胺酸殘基以防止不欲求的二硫鍵結。類似的，可在不影響本揭示內容所述胜肽活性(亦即，其在免疫分析中與HSP專一性抗體結合的能力)的情況下，改變和/或刪除某些特定氨基酸。因此，本揭示內容也涵蓋所揭示這些β-2-GPl衍生胜肽的功能性衍生物，包括那些具有保留性取代氨基酸的胜肽。氨基酸之保留性取代涵蓋以來自以下群組中之氨基酸所進行的取代：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；(g)E、D；和(h)C、M。

以衍生自β-2-GPl的胜肽來偵測自體抗體

以本揭示內容所合成的β-2-GPl衍生胜肽做為工具，來偵測或結合個體體內的HSP專一性抗體。因此，本揭示內容提供一種用來偵測或診斷一患有HSP或疑似患有HSP之個體的方法，包含以下步驟：自該個體取得一生物樣本；利用將該生物樣本與依據上述方式所製備而成之人工合成β-2-GPl胜肽彼此混合，使該自體抗體可與該人工合成胜肽在一免疫反應中反應而形成一複合物，而偵測出該生物樣本中的自體抗體。較佳是，該人工合成β-2-GPl胜肽包含一與序列編號：3、序列編號：5、序列編號：7、序列編號：11或序列編號：12之序列至少80%相同的氨基酸序列。更明確的說，該人工合成β-2-GPl胜肽包含一與序列編號：3、序列編號：5、序列編號：7、序列編號：11或序列編號：12之序列至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在一最佳實施方式中，此人工合成β-2-GPl胜肽包含一與序列編號：3之序列至少90%相同的氨基酸序列。序列間的相同百分比代表將一序列與一特定長度之標的多胜肽序列比較時，在一連續直線順序中相同氨基酸數目的多寡。在本文中，所謂一序列的「相同」代表在兩條不同的序列中，互相進行比較的氨基酸殘基相同。因此，100%相同代表當比較兩條不同多胜肽中的20個氨基酸時，在兩條不同多胜肽中的20個氨基酸完全相同。在本文中所述的生物樣本包括，但不限於，皮膚切片樣本、全血樣本、血清樣本、血漿樣本、尿液樣本、黏液樣本及其之純化或過濾後的形式。

可利用習知技術來偵測抗體的結合，例如利用放射線免疫分析、酵素連接之免疫吸附物分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、「三明治」式免疫分析、原位免疫分析(例如，利用膠體金、酵素或放射線同位素標定等)、西方墨點法、凝集分析(例如，膠體凝集分析、血液凝集分析等)、補體固定分析、免疫螢光分析和免疫電泳分析等等。在一實施例中，利用ELISA來偵測抗體結合。在一實施例中，自體抗體包含免疫球蛋白A(IgA)。在某些實施例中，這些自體抗體是從體液中測得，包括，但不限於，全血、血清、血漿、尿液、黏液及其之純化或過濾後的形式。在一較佳實施例中，這些自體抗體是從血漿樣本中測得。在其他實施方式中，也可從能顯示皮膚中白血球與IgA沉降的皮膚切片樣本中測得這些自體抗體。

為了提供此領域具有通常知識水準的人恰當可使用本揭示內容之工具，特為研發了組裝有本揭示內容該些人工合成β-2-GPl胜肽的檢測套組，用以診斷、偵測或確認HSP。在較佳的實施方式中，以可與本揭示內容該些人工合成β-2-GPl胜肽反應的自體抗體之有無，作為一個體之預診用途。舉例來說，相較於控制組，當偵測到樣本中含有高量能與該些人工合成β-2-GPl胜肽反應的自體抗體時，即代表有HSP。診斷所提供的資訊，也可用來引導將來治療HSP的方向。舉例來說，如果發現一個體身上存在有能自體抗原(即，β-2-GPl)反應的自體抗體時，即可在對HSP治療還有效的初期，及早開始HSP的治療。

在一實施方式中，本發明提供利用至少一人工合成β-2-GPl胜肽做為診斷HSP的檢驗套組。套組中包含以下組件：一容器；多種試劑，以便偵測一生物樣本中的一自體抗體，其中該些試劑包含依據本揭示內容所製備而成之至少一種人工合成的β-2-GPl胜肽，且該胜肽包含一與序列編號：3、序列編號：5、序列編號：7、序列編號：11或序列編號：12之序列至少80%相同的氨基酸序列；以及指示說明書，例如書面說明、錄音或錄影帶、VCR、CD-ROM等用來執行檢驗套組中各分析試驗的說明。此檢驗套組還可更包含一負控制組，用來代表一健康人體內可與該人工合成的β-2-GPl胜肽形成複合物的自體抗體之量，其中該人工合成的β-2-GPl胜肽包含一與序列編號：3、序列編號：5、序列編號：7、序列編號：11或序列編號：12之序列至少80%相同的氨基酸序列。

除非另行定義，文中所使用之所有專業與科學用語與習知技藝者所熟悉之意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等之方法及材料皆可應用於本發明方法中。文中所述之較佳實施方法與材料僅做示範之用。於本申請書中所提到之所有參考文獻均全體納入參考，以揭露並敘述該文獻所記載之相關方法及/或材料。此外，文中所討論之文獻僅揭露本發明申請日前之習知技術。並且無任何文獻顯示本發明內容曾為習知技術所揭露。本發明內容所得到之實際數據會因個別的實施條件而與本發明揭露於說明書內容中之數據有所不同。

須知若無特別於上下文中清楚記述其他意義，則說明書內容及後附申請專利範圍中所使用之如「一(“a”or“an”)」與「該(the)」等特定用語均包含其複數形態。

以下將詳細說明本揭示內容較佳實施方式，這些實施方式的實例已繪示在附隨圖示中。各圖示中相同元件以相同元件號碼表示。

實施例

以下實施例是用來闡明本揭示內容特定態樣並幫助習知技藝者了解並實施本揭示內容。但本揭示內容範疇並不限於這些實施例中。

材料與方法

患者 　在本研究中，納入25位在台大醫院登入且被診斷為急性HSP之兒童患者(診斷是依據美國風濕病學院1990年頒定標準來判定的(Mills JAet al .,Arthritis Rheum 1990 33:1114-1121))，以及另外23位年齡、性別相仿之健康兒重做為控制組。另外，並從15位處於緩解期之患者身上收集血清樣本。

偵測抗-心肌脂抗體 　簡言之，在96孔盤(Coaster,Cambridge,MA,USA)中的每一孔中塗佈濃度為50μg/ml之溶於乙醇中的心肌脂(cardiolipin)，然後風乾。在4℃下進行隔夜培育，接著加入10%溶於磷酸緩衝液(PBS,pH 7.4)之牛血清。然後，加入從患者身上收集的血漿樣本(對IgG和IgM來說，稀釋比例為1：100，對IgA來說，稀釋比例為1：50)和IgA部分(如指定濃度)，每一濃度執行二重複，然後在室溫下培育1.5小時。同時，以相同濃度之健康人IgA(多人混合)(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA,USA)做為負控制組。以TBS清洗後，利用HRP-共軛之山羊抗-人類IgG/A/M(BioSource International,Camarillo,CA,USA)和過氧化酶受質-四甲基beezidine(Kirkegaard ＆ Perry Laboratories,Gaithersburg,MD,USA)來偵測已結合的人類IgG/A/M。以Thermomax讀盤機(Molecular Devices Inc.,Sunnyvale,CA,USA)在波長450nm下來讀取結果，背景值則是在波長650nm下讀取。

偵測抗-內皮細胞抗體(AECA) 在塗佈有明膠的96-孔微價盤中(Nunc^TM ,Demark)，以1 x 10⁵ 個細胞/孔的濃度，將人類臍靜脈內皮細胞(human umbilical venous endothelial cells,HUVEC)加到每一培養孔中，接著進行培育。經過3-4天培育，當細胞生長至幾近全滿時(confluent)，在室溫下以0.2%的戊二醛(溶於PBS中)將細胞固定約10分鐘，然後加入1%溶於磷酸緩衝液之牛血清白蛋白(BSA/PBS)，在37℃下反應約1小時。以PBS清洗，分別加入血漿樣本(以1%的BSA/PBS進行稀釋，對IgG和IgM來說，稀釋比例為1：100，對IgA來說，稀釋比例為1：50)，在37℃下培育2小時。以TBS清洗後，利用HRP-共軛之山羊抗-人類IgG/A/M(BioSource International,Camarillo,CA,USA)和過氧化酶受質-四甲基beezidine(Kirkegaard ＆ Perry Laboratories,Gaithersburg,MD,USA)來偵測已結合的人類IgG/A/M。以Thermomax讀盤機(Molecular Devices Inc.,Sunnyvale,CA,USA)在波長450nm下來讀取結果，背景值則是在波長650nm下讀取。

偵測 β-2-GPl抗體 　簡言之，在96孔的高結合性盤(Coaster,Cambridge,MA,USA)的每一孔中塗佈濃度為10μg/ml之溶於Tris緩衝液(TBS,0.05M Tris-HCl和NaCl，pH 7.5)中的β-2-GPl　(Haematologic Technologies,Essex Junction,VT,USA)或是其他不相關的蛋白質(凝血酶原和OVA)，然後風乾。在4℃下進行隔夜培育，接著加入內含0.3%明膠的TBS溶液。然後，加入從患者身上收集的血漿樣本(對IgG和IgM來說，稀釋比例為1：100，對IgA來說，稀釋比例為1：50)和IgA部分(如指定濃度)，均溶於TBS/0.1%明膠中，每一濃度執行二重複，然後在室溫下培育1.5小時。同時，以相同濃度之健康人IgA(多人混合)(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA,USA)做為負控制組。以TBS清洗後，利用HRP-共軛之山羊抗-人類IgG/A/M(BioSource International,Camarillo,CA,USA)和過氧化酶受質-四甲基beezidine(Kirkegaard ＆ Perry Laboratories,Gaithersburg,MD,USA)來偵測已結合的人類IgG/A/M。以Thermomax讀盤機(Molecular Devices Inc.,Sunnyvale,CA,USA)在波長450nm下來讀取結果，背景值則是在波長650nm下讀取。

純化IgA抗體 　以可結合半乳糖之lectin來分離血清中IgA的商用套組，Immobilized Jacan(PIERCE,USA)，從7份對CL和β-2-GPl呈現正反應的血漿樣本中，分離出循環之IgA免疫蛋白。

製備人工合成之β-2-GPl衍生性胜肽 　為了找出β-2-GPl上可與自體抗體結合的抗原表位，隨機將β-2-GPl分成15段的胜肽斷片，每一胜肽斷片間可有或無重疊的氨基酸殘基，然後，利用自動化固相胜肽合成儀(ABI433A peptide synthesizer,Applied Biosystems Inc.,Life Technologies Corp.,Foster City,CA,USA)，並依據設備商所提供的標準流程(依據N^α -9-芴甲氧基羰基化學)來合成這些β-2-GPl的衍生胜肽，每一胜肽的一級結構揭示於表1中。

利用配備有半製備性十八烷基管柱(C18 column)的逆相高效率液態管柱層析(RP-HPLC)來純化所合成的β-2-GPl胜肽。RP-HPLC中的移動相乃是內含0.1%三氟乙酸(TFA)的丙烯腈/水溶劑系統，在波長220nm下偵測並記錄每一波峰。收集每一次純化後的流出物並將組成份相同者合併，然後利用真空親液性處理回收。所收集的每一胜肽的最終純度則是以分析性RP-HPLC來決定，其純度可達到95%甚至更高。舉例來說，序列編號：11之合成胜肽的純度就高達95.23%。將合成胜肽保持在-20℃的冷凍狀態下，直到使用時才解凍。

以電噴灑離子化質譜儀(electrospray ionization mass spectroscopy,ESI-MS)來確認所純化的β-2-GP1胜肽的分子量。舉例來說，以ESI-MS測定之序列編號：11之合成胜肽的分子量為6244.4Da(其理論分子量為6247.2Da)。

偵測IgA抗-β-2-GPl衍生胜肽抗體 　簡言之，在96孔的高結合性盤(Coaster,Cambridge,MA,USA)的每一孔中塗佈濃度為10μg/ml之溶於Tris緩衝液(TBS,0.05M Tris-HCl和NaCl，pH 7.5)中的β-2-GPl胜肽1-15，然後風乾。在4℃下進行隔夜培育，接著加入內含0.3%明膠的TBS溶液。然後，加入從患者身上收集的血漿樣本(對IgA來說，稀釋比例為1：50)和IgA部分(如指定濃度)，均溶於TBS/0.1%明膠中，每一濃度執行二重複，然後在室溫下培育1.5小時。同時，以相同濃度之健康人IgA(多人混合)(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA,USA)做為負控制組。以TBS清洗後，利用HRP-共軛之山羊抗-人類IgG/A/M(BioSource International,Camarillo,CA,USA)和過氧化酶受質-四甲基聯苯胺(Kirkegaard＆Perry Laboratories,Gaithersburg,MD,USA)來偵測已結合的人類IgG/A/M。以Thermomax讀盤機(Molecular Devices Inc.,Sunnyvale,CA,USA)在波長450nm下來讀取結果，背景值則是在波長650nm下讀取。

結果 β-2-GPl是急性HSP的抗原

本研究發明人發現，相較於健康人，被診斷出急性HSP的患者體內有相當高濃度的IgA抗-心肌脂(IgA aCL)(第1圖)、IgA抗-內皮細胞(IgA AECA)(第2圖)、和IgA抗-β-2-GPl抗體(第3圖)，且IgA抗-β-2-GPl抗體與IgA aCL或IgA AECA任一者均有相關性，暗示β-2-GPl可能是引起急性HSP的抗原，因此，可做為一種用來診斷及偵測HSP患者的生物標記。

為了確認β-2-GPl是引發HSP的抗原或是可做為將來診斷及偵測HSP患者的生物標記，從7位體內表現出高量IgA抗-心肌脂抗體及IgA抗-β-2-GPl抗體的患者身上收取血清並分離出總IgA，接著移除其中不相關的血清蛋白。確認純化後的IgA抗體會和β-2-GPl結合，而非心肌脂(第5A及5B圖)。進一步分析兩名HSP患者的血清樣本(在此稱為IgA1與IgA2)，顯示IgA與β-2-GPl間的結合呈現劑量相關(第5C及5D圖)，所結合的IgA抗-β-2-GPl抗體複合物的量會隨著IgA濃度上升而上升。以另外兩種不相關蛋白質，卵白蛋白(OVA)和凝血酶原作負控制組，確認IgA自體抗體與β-2-GPl間的結合具有專一性。詳言之，將上述的血清樣本(以下稱IgA2與IgA6)混合並分別與OVA和凝血酶原反應，發現IgA自體抗體與OVA或凝血酶原間的結合量非常低，可以忽略不計。

β-2-GPl胜肽是有用的抗原或是可做為偵測或診斷HSP的生物標記

為了找出β-2-GPl上可與自體抗體結合的抗原表位，隨機將β-2-GPl分成15段的胜肽斷片，並依據上述實施方式分別合成出15段β-2-GPl之胜肽斷片。將所合成的β-2-GPl胜肽斷片分別稱為P1至P15，並分別給予序列編號：1至15之編號。

依據以上所述方式進行結合分析，結果顯示患有急性HSP之兒童血漿中IgA抗-β-2-GPl胜肽(包括P3、P5、P7、P11和P12，每一胜肽的序列編號分別為序列編號：3、5、7、11和12)抗體的量，明顯高於健康兒童體內的量(以OD表示，p<0.0001)，其中又以人工合成胜肽P3的結合強度最高(參見第7、8和9圖)。

產業利用性

本揭示內容提供利用專一性抗原或生物標記(即，β-2-GPl衍生胜肽)而能早期偵測或診斷HSP患者之一種新穎且快速的解決方案。依據本揭示內容所製成的這些人工合成胜肽、方法和套組，讓臨床醫師可依據客觀性標準或標記(即，β-2-GPl衍生胜肽)，而非較主觀性的判斷，例如，依據臨床醫師的經驗和病症發展的變化所做的判斷，而能輕易地偵測或診斷出患有HSP或疑似患有HSP之病患。

雖然本揭示內容已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本揭示內容，任何熟習此技藝者，在不脫離本揭示內容之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本揭示內容之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

為讓本揭示內容之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：

第1A~1C圖繪示出依據本發明一實施方式在患有急性HSP之兒童身上所測量到的血漿中(A)IgG，(B)IgM，(C)IgA抗心肌脂抗體(aCL)的量(以OD值表示)，每一群數據的平均值則是以一水平線來代表；

第1D圖是患有(A)急性HSP與(C)目前處於緩解期之HSP患者身上的IgA aCL抗體量的比較，虛線代表互相比較之數據，*代表在統計學上有明顯差異；

第2A~2C圖繪示出依據本發明一實施方式在患有急性HSP之兒童身上所測量到的血漿中(A)IgG，(B)IgM，(C)IgA抗內皮細胞抗體的量(以OD值表示)，每一群數據的平均值則是以一水平線來代表；

第2D圖是患有(A)急性HSP與(C)目前處於緩解期之HSP患者身上的IgA抗內皮細胞抗體(AECA)量的比較，虛線代表互相比較之數據，*代表在統計學上有明顯差異；

第3A~3C圖繪示出依據本發明一實施方式在患有急性HSP之兒童身上所測量到的血漿中(A)IgG，(B)IgM，(C)IgA抗β-2-GPl抗體的量(以OD值表示)，每一群數據的平均值則是以一水平線來代表；

第3D圖是患有(A)急性HSP與(C)目前處於緩解期之HSP患者身上的IgA抗β-2-GPl抗體量的比較，虛線代表互相比較之數據，*代表在統計學上有明顯差異；

第4A圖繪示出依據本發明一實施方式在患有急性HSP之兒重身上所測量到的IgA aCL抗體與IgA抗β-2-GPl抗體間的關係；

第4B圖繪示出依據本發明一實施方式在患有急性HSP之兒重身上所測量到的IgA AECA抗體與IgA抗β-2-GPl抗體間的關係；

第5A~5B圖繪示出依據本發明一實施方式，多株性IgA(即，IgA群，50μg/ml)與從7位兒重患者血漿樣本中所分離出來的IgA(即，HSP群，50μg/ml)，與(A)β-2-GPl或(B)aCL間的反應性比較；

第5C~5D圖繪示出依據本發明一實施方式，多株性IgA或是從兩位兒重患者血漿樣本中所分離出來的IgA(即，IgA1與IgA2)與(C)β-2-GP1或(D)aCL間的劑量依賴性關係；

第6圖繪示出依據本發明一實施方式，從兩份隨機選擇的樣本中所分離出來的IgA(即，IgA2與IgA6，濃度均為10μg/ml)與包括β-2-GPl、OVA及凝血酶原在內的各種蛋白質間的結合專一性；

第7A~7H圖繪示出依據本發明一實施方式，7種IgA樣本(即，IgA 1~7，濃度均為10μg/ml)與15段β-2-GPl人工合成胜肽(即，P-1至P-15)間的反應性(以OD值來表示)；其中以IgA與β-2-GPl的結合作為正控制組，與緩衝溶液(PBS)間的結合作為負控制組，OD值高於正控制組者被認為兩者的結合具有顯著性；

第8圖為第7圖結果的綜合整理，其中從7位急性HSP患者身上分離出來的IgA與任一人工合成胜肽3、5或7(第8A圖)或是人工合成胜肽11或12(第8B圖)間的結合具有顯著性；以及

第9圖繪示出急性HSP兒童患者身上，其血漿中IgA抗人工合成胜肽3、5、7、11、12及6(即，P3、P5、P7、P11、P12及P6)抗體的量。

Claims (16)

1. 一種人工合成胜肽，具有序列編號：11之氨基酸順序。
2. 如請求項1所述之人工合成胜肽，其中該胜肽在一免疫分析中可與一患有或疑似患有過敏性紫斑症(Henoch-Schönlein purpura,HSP)的患者體內之一自體抗體形成一複合物(a complex)。
3. 如請求項2所述之人工合成胜肽，其中該免疫分析是一種酵素連接之免疫吸附物分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。
4. 如請求項2所述之人工合成胜肽，其中該自體抗體是一種IgA。
5. 一種自一個體之生物樣本偵測或診斷出該個體是否患有HSP或疑似患有HSP的方法，包含：將該生物樣本與一人工合成胜肽混合，使得該生物樣本中的一自體抗體可與該人工合成胜肽在一免疫分析中彼此反應而形成一複合物，因而偵測出該生物樣本中的該自體抗體，其中該人工合成胜肽為至少一種選自以下群組之序列：序列編號：3、序列編號：5、序列編號：7、序列編號：11及序列編號：12。
6. 如請求項5所述之方法，其中該人工合成胜肽包含序列編號：11及序列編號：12之序列。
7. 如請求項5所述之方法，其中該人工合成胜肽包含序列編號：5及序列編號：11之序列。
8. 如請求項5所述之方法，其中該免疫分析是一種酵素連接之免疫吸附物分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。
9. 如請求項5所述之方法，其中該自體抗體是一種IgA。
10. 如請求項5所述之方法，其中該生物樣本是選自以下群組：皮膚切片樣本、全血樣本、血清樣本、血漿樣本、尿液樣本、及黏液樣本。
11. 一種可自一個體之生物樣本偵測或診斷出該個體是否患有HSP或疑似患有HSP的檢驗套組，包含：一容器；一人工合成胜肽，其具有序列編號：11之胺基酸順序；及一說明書，放在該容器中，用來說明如何使用該人工合成胜肽，來偵測該個體之生物樣本中的自體抗體。
12. 如請求項11所述之檢驗套組，更包含另一選自下列之人工合成胜肽：序列編號：3、序列編號：5、序列編號：7、及序列編號：12之序列。
13. 如請求項12所述之檢驗套組，其中該另一人工合成胜肽為序列編號：5之序列。
14. 如請求項12所述之檢驗套組，其中該另一人工合成胜肽為序列編號：12之序列。
15. 如請求項11所述之檢驗套組，其中該自體抗體是一種IgA。
16. 如請求項11所述之檢驗套組，其中該生物樣本是選自以下群組：皮膚切片樣本、全血樣本、血清樣本、血漿樣本、尿液樣本、及黏液樣本。