CN1555383A - 新型肽、新型吸附材料、吸附器和吸附方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供不对体液进行预处理而能高效地选择性吸附体液(例如血液、血浆等)中存在的免疫球蛋白和/或免疫复合体的吸附材料、吸附器和吸附方法。通过将对免疫球蛋白和/或免疫复合体具有结合活性的化合物固定到水不溶性载体上，可以获得吸附能力明显优良的吸附材料。
Description
技术领域
本发明涉及对免疫球蛋白和/或免疫复合体具有亲和力的新型肽、编码该肽的核苷酸序列、含有该序列的重组DNA、含有该DNA分子的微生物以及所述微生物或所述DNA在所述肽的制备中的应用。进一步地，本发明涉及利用了所述肽对免疫球蛋白和/或免疫复合体的亲和力的吸附材料，该材料用于选择性吸附水溶液，特别是体液(例如血液、血浆和血清等)中存在的免疫球蛋白和/或免疫复合体；本发明还涉及使用了该吸附材料的吸附器和吸附免疫球蛋白和/或免疫复合体的方法。
背景技术
已知有多种蛋白对免疫球蛋白和/或免疫复合体显示亲和力，其中，对蛋白A和蛋白G进行了仔细研究。蛋白A和蛋白G都对免疫球蛋白和/或免疫复合体具有很强的亲和力，但蛋白A对IgG3的亲和力低，而蛋白G对IgG3也能结合(特许第02764021号公报)。另外，还已知蛋白G基因含有编码被称为C1、C2和C3的三种与免疫球蛋白和/或免疫复合体结合的肽的核苷酸序列，对应的氨基酸序列如下列序列表中的SEQ ID NO：3、4、5所示：
C1(SEQ ID NO：3)
Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr
Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val
Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys
Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly
Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr
Phe Thr Val Thr Glu
C2(SEQ ID NO：4)
Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr
Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val
Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys
Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly
Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr
Phe Thr Val Thr Glu
C3(SEQ ID NO：5)
Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr
Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Lys Ala Val
Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys
Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly
Val Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr
Phe Thr Val Thr Glu
进一步地，从C2和IgG(Fc)的复合体的X射线结构分析已知C2的Glu26、Lys27、Lys30、Gln31、Asn34、Asp39、Glu41、Trp42与Fc结合(Sauer-Eriksson AE，Kleywegt GJ，Uhlen M，Jones TA Crystal structure of theC2 fragment of streptococcal protein G in comples with the Fc domain of humanIgG.Structure 1995年3月15日；3(3)：265-78)。
对免疫球蛋白和/或免疫复合体具有亲和力的肽或蛋白的重要用途之一被认为是用于旨在纯化、分离、除去免疫球蛋白和/或免疫复合体的吸附材料。但是，本发明人发现上述C1、C2和C3肽的热稳定性低，不能耐高压蒸汽灭菌，另外，如果进行辐射灭菌，则结合活性显著降低。
发明概述
鉴于上述问题，本发明提供下述新型肽：使含有来自蛋白G的肽的氨基酸(包括上述结合Fc的氨基酸)最优化，从而其对免疫球蛋白和/或免疫复合体的亲和力与起始的肽(上述C3)相比等同或者更大，并且，在灭菌操作中保持稳定；本发明还提供编码该肽的核苷酸序列、含有该核苷酸序列的重组DNA、含有该DNA分子的微生物以及所述微生物或所述DNA在所述肽的制备中的应用；进一步地，本发明还提供所述应用的应用例，即选择性吸附水溶液，特别是体液(例如血液、血浆和血清等)中存在的免疫球蛋白和/或免疫复合体的吸附材料；本发明还提供使用了该吸附材料的吸附器和吸附免疫球蛋白和/或免疫复合体的方法。
本发明人为了完成上述课题，用化学和基因工程方法获得了大量肽，采用各种科学方法鉴定所得的肽的特征，从而完成本发明。
即，本发明涉及具有序列表中SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的免疫球蛋白和/或免疫复合体亲和肽、编码序列表中SEQ ID NO：1所示的至少一种氨基酸序列的核苷酸序列、包含序列表中SEQ ID NO：2所述碱基序列的至少一种的核苷酸序列、包含一个或多个编码序列表中SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的核苷酸序列的重组DNA以及含有至少一个下述重组DNA的微生物，所述DNA包含一个或多个编码序列表中SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的核苷酸序列。
另外，本发明还涉及：含有序列表中SEQ ID NO：1所示的至少一种氨基酸序列，并且由固定有下述肽的水不溶性载体组成的吸附免疫球蛋白和/或免疫复合体的材料，所述肽由至多70个氨基酸残基组成；吸附体液中免疫球蛋白和/或免疫复合体的方法，其特征在于，使上述吸附材料和包含免疫球蛋白和/或免疫复合体的体液接触；在具有液体入口和出口，并且具有至少一个过滤器的容器内填充上述吸附材料而构成的吸附器。
发明详述
本发明的免疫球蛋白和/或免疫复合体亲和肽由以下氨基酸序列B(序列表的SEQ ID NO：1)表示：
Thr Thr Tyr Lys Leu Val
Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr
Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala
Glu Arg Ala Phe Arg X01 Tyr Ala X02 Asp
Asn Gly Val X03 Gly X04 Trp Thr Tyr Asp
Pro Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu
Cys
(其中，X01是选自Asn、Lys、Gln三种氨基酸中的一种，X02是选自Thr、Asn两种氨基酸中的一种，X03是选自Glu、Asp两种氨基酸中的一种，X04是选自Leu、Val、Ile、Met四种氨基酸中的一种)。
在本说明书中，“亲和力”是指对具体化合物具有结合活性的性质。即，本发明免疫球蛋白和/或免疫复合体亲和肽的特征在于对免疫球蛋白和/或免疫复合体具有结合活性。
本发明的肽是通过下述研究获得。
首先，制备序列表的SEQ ID NO：7(碱基序列A)所示的DNA，其编码特许第02764021号公报记载的作为比较对照的肽(氨基酸序列A：序列表的SEQ ID NO：6)，
Thr Thr Tyr Lys Leu Val
Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr
Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala
Glu Lys Ala Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp
Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp
Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu
并且具有用于将上述DNA插入载体的限制酶位点。上述碱基序列的限制酶位点(NdeI，HindIII)用于后述实施例中所用的载体(pUCNT：国际公开WO94/03613公报)。不同的限制酶位点要求不同的载体，这是本领域的常识，因此不作详细说明。将碱基序列A所示的DNA插入载体pUCNT，用其转化大肠杆菌(HB101)，然后将菌体进行培养，匀浆，纯化上清，得到肽。将所得的肽固定到载体上，得到免疫球蛋白和/或免疫复合体吸附材料，但γ射线(25kGy)导致其免疫球蛋白和/或免疫复合体吸附能力大大降低。
其次，以碱基序列A为基础，制备具有部分改变的碱基序列的DNA文库，研究将哪个位置的氨基酸取代成什么氨基酸后对免疫球蛋白和/或免疫复合体的结合增强，并且在γ射线灭菌中的稳定性更高。
结果发现，在下述碱基序列B(序列表SEQ ID NO：2)所示的DNA的5’末端添加(cat atg)、3’末端添加(taa gct t)，然后插入载体，用其转化大肠杆菌HB101得到生产菌，由该菌产生的包含下述碱基序列B(序列表SEQ ID NO：1)的肽最适合。
(碱基序列B：序列表SEQ ID NO：2)
acc acc tat aaa ctg gtt
atc aac ggt aaa acc ctg aaa ggt gaa acc
acc acc aag gct gtt gac gct gaa acc gct
gag cgc gca ttt cgg X01 tat gct X02 gac
aac ggt gtc X03 ggt X04 tgg acc tat gac
ccc gct acc aaa acc ttt acc gtt acc gaa
tgc
其中，X01为aac、aat、aaa、aag、caa和cag中的任意一个；
X02为aca、acg、acc、act、aac和aat中的任意一个；
X03为gaa、gag、gac和gat中的任意一个；
X04为cta、ctg、ctc、ctt、tta、ttg、gta、gtg、gtc、gtt、ata、atc、att和atg中的任意一个
(氨基酸序列B：序列表SEQ ID NO：1)
Thr
Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr
Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Lys Ala Val
Asp Ala Glu Thr Ala Glu Arg Ala Phe Arg
X01 Tyr Ala X02 Asp Asn Gly Val X03 Gly
X04 Trp Thr Tyr Asp Pro Ala Thr Lys Thr
Phe Thr Val Thr Glu Cys
其中，
X01为Asn、Lys和Gln中的任意一个；
X02为Thr和Asn中的任意一个；
X03为Glu和Asp中的任意一个；
X04为Leu、Val、Ile和Met中的任意一个。
将氨基酸序列B所示的肽固定到载体上，得到免疫球蛋白和/或免疫复合体吸附材料，即使进行γ射线照射(25kGy)，免疫球蛋白和/或免疫复合体吸附材料的吸附能力与未照射的吸附材料相同。
例如，将含有氨基酸序列B的肽——序列表SEQ ID NO：8(C36肽)所示的：
Met Thr
Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr
Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Lys Ala Val
Asp Ala Glu Thr Ala Glu Arg Ala Phe Arg
Gln Tyr Ala Thr Asp Asn Gly Val Glu Gly
Met Trp Thr Tyr Asp Pro Ala Thr Lys Thr
Phe Thr Val Thr Glu Cys
溶于生理盐水，使其终浓度为500μg/mL，用氢氧化钠水溶液调至pH＝7.0，得到肽水溶液，将该肽水溶液在80℃加热30分钟，与未进行加热处理的肽水溶液的IgG结合能力比较，结果没有发现显著性差异。IgG结合能力通过下述方法分析：使肽水溶液通过固相IgG柱(IgG Sepharose FastFlow：Pharmacia公司)，用规定的方法洗脱，用HPLC测定回收的肽的量。
含有上述氨基酸序列SEQ ID NO：1的序列包括序列表中SEQ IDNO：10、11、13和15所示的序列等。
下面说明本发明的核苷酸序列、重组DNA和微生物。
本发明核苷酸序列的特征在于编码SEQ ID NO：1所示的至少一个氨基酸序列。
上述核苷酸序列优选由SEQ ID NO：2所示的至少一种碱基序列构成。含有上述SEQ ID NO：2的碱基序列的序列包括SEQ ID NO：9、12、14和16所示的序列等。
本发明重组DNA的特征在于含有一个或多个编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
上述重组DNA中，优选核苷酸序列由SEQ ID NO：2所示的至少一种碱基序列构成。
本发明的重组DNA可以通过例如Molecular Cloning 2nd Edt.，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)等记载的公知的化学方法或基因工程方法制备。
上述重组DNA的制备过程中，例如，可以制作以上述碱基序列A为基础，改变其中一部分碱基序列而得到的DNA文库，通过免疫筛选方法选择目的DNA，该免疫筛选方法使用上述DNA文库和免疫球蛋白和/或免疫复合体。
不论上述重组DNA是什么种类，它是质粒或噬菌体时，基因操作容易，因此是优选的。制备质粒时，除了pUCNT载体(WO94/03613号公报)之外，还可以使用例如市售的来自大肠杆菌的载体。
本发明微生物的特征在于其含有至少一种重组DNA，该重组DNA包含一个或多个编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
上述微生物中，优选核苷酸序列由SEQ ID NO：2所示的至少一种碱基序列构成。
本发明的微生物可以通过例如Basic Methods in Molecular Biology，Appleton & Lange(1986)等记载的公知的基因工程方法，例如磷酸钙法，用上述重组DNA转化微生物而制备。
用于制备上述微生物(转化体)的微生物包括大肠杆菌HB101株等大肠杆菌等。
下面说明本发明的吸附材料。本发明免疫球蛋白和/或免疫复合体的吸附材料的特征在于：含有水不溶性载体，该载体上固定了一种肽，该肽含有SEQ ID NO：1所示的至少一种氨基酸序列并由至多70个氨基酸残基构成。
用于上述吸附材料的肽只要是含有SEQ ID NO：1所示的至少一种氨基酸序列，并且氨基酸残基为70个或以下的肽即可，没有特殊限制。上述肽含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，因此其特征在于对免疫球蛋白和/或免疫复合体具有亲和力。
另外，由于可能进行灭菌操作，因此上述肽优选热稳定性好的肽。所述热稳定性优良的肽是在冷冻干燥的固体状态或水溶液状态下，即使在80℃以上加热30分钟也不损害肽固有的性质，并且，在将肽固定到载体后，即使进行高压蒸汽灭菌(115℃30分钟、121℃20分钟或者126℃15分钟)或放射线灭菌(25kGy)也不失去灭菌前的特性的肽。
用于本发明吸附材料的水不溶性载体包括玻璃珠、硅胶等无机载体，交联聚乙烯醇、交联聚丙烯酸酯、交联聚丙烯酰胺、交联聚苯乙烯等合成高分子和/或结晶纤维素、交联纤维素、交联琼脂糖和交联葡聚糖等多糖类构成的有机载体，以及这些载体组合得到的有机-有机、有机-无机等复合载体等，其中亲水性载体由于非特异性吸附较少，对免疫球蛋白和/或免疫复合体的吸附选择性较好，因此优选。
这里所述的亲水性载体是指使构成载体的化合物成平板状时与水的接触角在60度以下的载体。这种载体包括纤维素、壳聚糖和葡聚糖等多糖类、聚乙烯醇、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物皂化物(けん化物)、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸接枝聚乙烯、聚丙烯酰胺接枝聚乙烯或玻璃等载体。
市售品包括多孔纤维素凝胶GCL2000、GC700、烯丙基葡聚糖和亚甲基二丙烯酰胺共价结合而成的交联Sephacryl S-1000、丙烯酸酯类载体Toyopearl、琼脂糖类交联载体Sepharose CL4B、用环氧基活化的聚甲基丙烯酰胺Eupergit C250L等。本发明当然不限于上述载体、活化载体。这些载体可以单独使用，也可以两种或两种以上任意组合使用。
另外，从吸附免疫球蛋白和/或免疫复合体的主吸附材料的使用目的，以及利用肽亲和力的本发明的方法考虑，优选本发明所用的水不溶性载体表面积大，具有大量适当大小的细孔，即多孔性。具体的多孔载体包括上述列举的亲水性载体的市售品等。
本发明所用的多孔性载体的排除界限分子量为15万以上，但免疫球蛋白G(IgG)分子量为14万～17万，因此，为了通过多孔性载体更高效吸附IgG，优选载体的排除界限分子量比免疫球蛋白G的分子量高，为25万以上。难于特别规定以免疫球蛋白为其构成要素的免疫复合体的分子量，但免疫球蛋白G4分子与抗原形成复合体时，其分子量理论上为56万以上。因此，为了使免疫球蛋白和/或免疫复合体进入多孔性载体的内部，更优选排除界限分子量为60万以上，为了使其容易进入，进一步优选300万以上的排除界限分子量。
其次，对于水不溶性载体的多孔结构，从吸附材料每个单位体积的吸附能力方面考虑，与表面多孔性(载体外部为多孔性，内部为致密结构)相比，更优选全多孔性(整个载体全部为多孔性，分子可以达到内部的结构)。更优选地，通过汞压入法测得的空隙容积为20％以上，优选通过汞压入法测得的比表面积为1m2/g以上。
水不溶性载体的形态可以是珠状、纤维状、膜状(包括中空纤维)，还可以选择任意的形态。从制备具有特定排除界限分子量的载体的容易程度方面考虑，特别优选使用珠。珠的平均粒径为10～2500μm的载体容易使用，特别是从配体固定反应的容易程度方面考虑，优选25μm～800μm的范围。
进一步地，当水不溶性载体表面存在用于配体固定反应的官能团时，对配体的固定有利。所述官能团的代表性例子包括羟基、氨基、醛基、羧基、巯基、硅烷醇基、酰胺基、环氧基、琥珀酰亚氨基和酸酐基等。
本发明所用的水不溶性载体可以使用硬质载体或软质载体中的任意一种，但是，为了用作体外循环治疗用的吸附材料，将其填充到柱子中，并使液体流过时不发生孔堵塞这一点是重要的，为此要求充分的机械强度。因此，用于本发明的水不溶性载体更优选硬质载体。
本说明书中，硬质载体是指一种载体，以粒状凝胶为例，按照下述条件将凝胶均匀填充到圆筒状玻璃柱(内径9mm，柱长150mm)中，水性流体流过时的压力损失AP与流量的关系是在0.3kg/cm2以下满足直线关系。
例如，在两端装有孔径15μm的过滤器的圆筒状玻璃柱(内径9mm，柱长150mm)中，分别均匀填充琼脂糖凝胶(Bio-Rad公司的Biogel-A5m，粒径50～100目)、乙烯类聚合物凝胶(东洋曹达工业有限公司的トヨパ-ルHW-65，粒径50～100μm)和纤维素凝胶(チツソ有限公司的セルロフアインGC-700m，粒径45～105μm)。通过蠕动泵使水流过柱，求出流量与压力损失ΔP的关系(图1)。以流速(cm/分)为纵轴，压力损失(kg/cm2)为横轴绘图。在该图中，○表示トヨパ-ルHW-65，△表示セルロフアインGC-700m，●表示Biogel-A5m。结果表明，トヨパ-ルHW-65和セルロフアイン GC-700m中，流量与压力增加基本成正比，而Biogel-A5m中引起固结，即使压力增加，流量也不增加。
下面说明将上述肽固定到水不溶性载体的方法。
将对免疫球蛋白和/或免疫复合体具有亲和力的肽，即，含有SEQ IDNO：1所示的至少一种氨基酸序列，并且由至多70个氨基酸残基构成的肽固定到上述水不溶性载体时，为了通过减小该肽的立体障碍来提高吸附效率，进而抑制非特异性吸附，优选通过亲水性间隔基进行固定。亲水性间隔基优选使用两末端用羧基、氨基、醛基或环氧基等取代的聚环氧化物的衍生物等。
对上述免疫球蛋白和/或免疫复合体亲和肽，以及上述亲水性间隔基的固定方法没有特别限定，可以采用将蛋白或肽固定到载体时通常使用的方法，例如，(1)使载体与溴化氰、环氧氯丙烷、二环氧甘油醚、甲苯磺酰氯、トレシルクロライド(tresyl chloride)、肼等反应，使载体活化(将载体本身具有的官能团变成与作为配体的被固定的化合物更加容易反应的官能团)，与作为配体的被固定的化合物反应，从而固定的方法；(2)往存在载体和作为配体的被固定的化合物的系统中，加入碳化二亚胺等缩合试剂或戊二醛等每分子具有多个官能团的试剂，通过缩合、交联进行固定的方法等。从用作体外循环治疗和血液净化用的吸附材料的方面考虑，优选采用在吸附材料灭菌时或治疗时使蛋白比载体更不容易脱离的固定方法。
本发明吸附方法的特征在于，使上述吸附材料和包含免疫球蛋白和/或免疫复合体的体液接触。
有多种方法可以使吸附材料与血液、血浆或血清等体液接触，从而吸附体液中的免疫球蛋白和/或免疫复合体，其中所述吸附材料由固定有免疫球蛋白和/或免疫复合体亲和肽的载体构成。代表性的方法包括(1)取出体液并储存于袋中，将其与吸附材料混合，吸附免疫球蛋白和/或免疫复合体后，过滤除去吸附材料，从而获得除去了免疫球蛋白和/或免疫复合体的体液；(2)将吸附材料填充到下述容器中，使体液流过该容器的方法，其中所述容器具有体液的入口和出口，在出口装有允许体液通过而不允许吸附材料通过的过滤器。可以采用上述的任意一种方法，但后一方法操作简单，并且通过引入到体外循环闭路可以从患者体液中高效地在线除去免疫球蛋白和/或免疫复合体，本发明的吸附材料适合于这种方法。
本发明吸附器的特征在于，在下述容器中填充本发明的吸附材料，该容器具有液体入口和出口，并且有至少一个过滤器。
下面以其断面轮廓图为基础说明采用上述吸附材料的本发明用于吸附免疫球蛋白和/或免疫复合体的吸附器。
图2所示的吸附器7具有液体流入口1、液体流出口2、本发明用于吸附免疫球蛋白和/或免疫复合体的吸附材料3、液体和液体中所含成分能通过而用于吸附免疫球蛋白和/或免疫复合体的吸附材料不能通过的过滤器4和5、以及柱6。
对该容器的形状和材质没有特别限制，优选用例如容量为20～400ml左右、直径为2～10cm左右的筒状容器。
对所述过滤器没有特别限制，只要是液体和液体中所含成分能通过而用于吸附免疫球蛋白和/或免疫复合体的吸附材料不能通过的过滤器。
附图说明
图1表示用三种凝胶——トヨパ-ルHW-65、セルロフアイン GC-700m、Biogel-A5m研究流速与压力损失的关系的结果图。
图2是本发明一例用于吸附免疫球蛋白和/或免疫复合体的吸附器的断面略图。
符号说明
1：液体流入口
2；液体流出口
3：吸附材料
4：过滤器
5：过滤器
6：柱子
7：吸附器
发明的最佳实施形态
下面通过实施例进一步详细说明本发明，但本发明不限于这些实施例。另外，在本说明书中，各种氨基酸残基用下列简写表示：Ala，L-丙氨酸残基；Arg，L-精氨酸残基；Asp，L-天冬氨酸残基；Asn，L-天冬酰氨残基；Cys，L-半胱氨酸残基；Gln，L-谷氨酰胺残基；Glu，L-谷氨酸残基；Gly，L-甘氨酸残基；His，L-组氨酸残基；Ile，L-异亮氨酸残基；Lys，L-赖氨酸残基；Met，L-蛋氨酸残基；Phe，L-苯丙氨酸残基；Pro，L-脯氨酸残基；Ser，L-丝氨酸残基；Thr，L-苏氨酸残基；Trp，L-色氨酸残基；Tyr，L-酪氨酸残基；Val，L-缬氨酸残基。另外，在本说明书中，肽的氨基酸序列按照常法记录，使其氨基末端(以下称为N末端)位于左侧，羧基末端(以下称为C末端)位于右侧。
(实施例1)将IgG结合蛋白(C36)固定到多孔载体(Kac)上
C36肽的制备
以序列表SEQ ID NO：8所示的编码C36肽的DNA为基础，设计、合成序列表SEQ ID NO：9所示的DNA，分别使用5’-末端和3’-末端的Nde I和Hind III限制酶位点将其连接到pUCNT载体上(WO94/03613)。
用DNA连接试剂盒Ver.2(宝酒造社)按照产品说明书将具有SEQ IDNO：9所示序列的DNA连接到已被限制酶Nde I和Hind III(宝酒造社)消化的pUCNT载体上，由此制备pUCNT-C36载体。用DNA连接试剂盒Ver.1(宝酒造社)按照产品说明书将该pUCNT-C36载体导入大肠杆菌HB101株(Funakoshi出售)，以氨苄青霉素抗性为指标筛选转化体。用Flexi Prep(注册商标)(Amersham Pharmacia Biotech)按照产品说明书从上述转化体提取质粒DNA，通过测序确认pUCNT-C36载体具有上述设计的DNA序列。
然后，将该转化体在6L的L-肉汤(5g/L NaCl、10g/L细菌培养用胰蛋白酶(bactotrypsin)、5g/L酵母提取物)中于37℃振荡培养20小时，离心分离回收菌体(用日立RPR9-2转子，4℃，6000rpm，20分钟)。将按上述方法获得的沉淀混悬于300ml TE缓冲液(20mM Tris-HCl、1mM EDTA：pH为7.5)，进行超声处理(用BRANSON 250，在冰上，6分钟，三次)，离心分离回收上清液(用日立RPR16转子，4℃，15000rpm，20分钟)。将所得的上清液在70℃热处理10分钟后，进一步离心分离(用日立RPR16转子，4℃，15000rpm，20分钟)，回收上清液300ml。利用高效液相色谱(柱：日本Waters公司的μBondasphere C18)，使40mL乙腈溶液以5ml/min的速度流过，由此活化柱子，然后使300ml样品以同样的速度流过，用0.1％TFA+64％乙腈溶液200ml洗涤柱子，接着用0.1％TFA(三氟乙酸)+40％乙腈溶液200ml洗脱所需C36肽并分离，将其用蒸发器浓缩至100ml后冷冻干燥，得到高纯度的精制样品。
纤维素凝胶的环氧化
往本公司试制样品Kac凝胶90ml中加入水，使总量为180ml，该凝胶为纤维素类多孔性硬质硅胶，并且对于球状蛋白的排除界限分子量为500万以上。然后加入2N的氢氧化钠60ml，将温度调整为40℃。往其中加入环氧氯丙烷21ml，在40℃搅拌反应2小时。反应完毕后充分水洗，得到环氧活化的Kac凝胶。
C36肽的固定
将10mg C36肽溶于0.05M硼酸缓冲液(pH＝10)0.5ml中，加入0.01N的氢氧化钠水溶液，将pH重新调至10，使其总量为1.0ml(C36肽溶液)。往上述环氧活化的Kac凝胶1ml中加入肽溶液(全部)，在37℃振荡16小时，用足量的PBS(含150mM氯化钠的10mM磷酸缓冲液)洗净，得到Kac-C36。
(实施例2)将IgG结合蛋白(B04)固定到多孔载体(Sephacryl S1000)上
B04肽的制备
用4170型肽合成仪(Pharmacia LKB公司)，通过固相合成法如下合成序列表中SEQ ID NO：10所示的肽。用C末端结合谷氨酰胺的载体——Fmoc-谷氨酰胺NovaSyn KA(Pharmacia LKB公司)0.1mmol，根据肽合成仪上记载的合成程序，朝N末端方向依次反复进行脱保护基反应和缩合反应，以延长肽链。即，用哌啶除去各氨基酸上的α-氨基保护基——9-芴基甲基氧基羰基(以下称为Fmoc)，用N，N-二甲基甲酰胺(以下称为DMF)洗涤，然后用2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基尿鎓四氟硼酸酯(盐)和N，N-二异丙基乙胺进行缩合反应，用DMF洗涤。反复进行上述操作。氨基酸以Fmoc-L-Ala、Fmoc-L-Asn(Trt)、Fmoc-L-Asp(OtBu)、Fmoc-L-Cys(Trt)、Fmoc-L-Gln(Trt)、Fmoc-L-Glu(OtBu)、Fmoc-L-Gly、Fmoc-L-Ile、Fmoc-L-Leu、Fmoc-L-Lys(Boc)、Fmoc-L-Phe、Fmoc-L-Thr(tBu)、Fmoc-L-Trp、Fmoc-L-Tyr(tBu)、Fmoc-L-Val的形式使用，其用量为基质的约5倍摩尔量(0.5mmol)，在小瓶中使用(其中Trt、tBu、Boc和OtBu分别表示三苯甲基、叔丁基酯、叔丁基氧基羰基和O-叔丁基)。
脱保护基反应和肽链的切断
对所有氨基酸的反应操作完毕后，将所得的载体在3G-3孔玻璃过滤器上依次用叔戊醇、醋酸和二乙醚洗涤，然后通过真空干燥得到干燥载体。在小瓶中，往所得的载体1g中加入三氟乙酸(以下称为TFA)20ml、1，2-乙二硫醇260μl和苯甲醚780μl，室温搅拌1.5小时。然后，用3G-3孔玻璃过滤器过滤该混合物以分离载体，将滤液在35℃减压浓缩，往其中加入预先冷却的无水二乙醚直至出现沉淀，搅拌，然后离心分离，收集沉淀的粗制肽。接着将该粗制肽用无水二乙醚洗涤数次，然后减压干燥，得到目的半纯化肽。
肽的纯化
将上述半纯化肽溶于0.1％TFA中，以3000rpm的速度高速离心分离，所得的上清液用0.45μm的滤膜过滤，用滤液进行高效液相色谱。HPLC中，采用LC-10A型系统(岛津制作所)，柱子采用反相μBondasphere C18(日本Waters)。流动相中，用0.1％TFA水溶液作为A溶液，包含0.1％TFA的80％(v/v)乙腈/水作为B溶液，按照从A到B的线性浓度梯度进行洗脱，收集色谱峰对应的级分。反复进行级分收集操作数次并将其冷冻干燥，得到纯化的肽。所得的肽用气相蛋白测序仪477A(Applied Biosystems公司)和日立Custom离子交换树脂进行氨基酸序列分析，以便确认得到了具有后述序列表SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的肽。
Sephacryl S1000的环氧活化
往孔径为400nm的多孔硬质凝胶Sephacryl S1000(Amersham PharmciaBiotech：对球状蛋白的排除界限分子量约为800万)90ml中加入水，使其总量为180ml。然后加入2N的氢氧化钠60ml，将温度调整为40℃。往其中加入环氧氯丙烷21ml，在40℃搅拌反应2小时。反应完毕后充分水洗，得到环氧活化的Sephacryl S1000。
B04肽的固定
除将实施例1中的10mg C36肽变成30mg B04肽，以及将环氧活化Kac凝胶变成环氧活化Sephacryl S1000凝胶外，其它与实施例1同法操作，得到固定了B04肽的Sephacryl S1000-B04。
(实施例3)将IgG结合蛋白(C04)固定到多孔载体(GCL2000m)上
C04肽的制备
将编码序列表SEQ ID NO：11的C04肽的DNA设计成序列表SEQ IDNO：12所示，与实施例1同法合成，并使之连接到pUCNT载体上。
与实施例1同法将具有SEQ ID NO：12所示序列的DNA导入pUCNT载体，构建pUCNT-C04载体。
另外，与实施例1同法制备大肠杆菌转化体，经过6L的L-肉汤的培养，得到高纯度的C04肽，备用于各种研究。
GCL2000m的环氧活化
往纤维类多孔硬质凝胶GCL2000m(Chisso Corporation：对球状蛋白的排除界限分子量约为300万)90ml中加入水，使其总量为180ml。然后加入2N的氢氧化钠60ml，将温度调整为40℃。往其中加入环氧氯丙烷21ml，在40℃搅拌反应2小时。反应完毕后充分水洗，得到环氧活化GCL2000m。
C04肽的固定
除将实施例1中的C36肽变成C04肽，并将环氧活化Kac凝胶变成环氧活化GCL2000m凝胶外，其它与实施例1同法操作，得到固定了C04肽的GCL2000-C04。
(实施例4)将IgG结合蛋白(C15)固定到多孔载体(CNBr活化Sepharose4B)上
C15肽的制备
将编码序列表SEQ ID NO：13的C15肽的DNA设计成序列表SEQ IDNO：14所示，与实施例1同法合成，并使之连接到pUCNT载体上。
与实施例1同法将具有SEQ ID NO：14所示序列的DNA导入pUCNT载体，构建pUCNT-C15载体。
另外，与实施例1同法制备大肠杆菌转化体，经过6L的L-肉汤的培养，得到高纯度的C15肽，备用于各种研究。
C15肽的固定
将CNBr活化Sepharose 4B(Amersham Pharmcia Biotech：对球状蛋白的排除界限分子量约为2000万)1g用少量1mM盐酸水溶液溶胀15分钟，用1mM盐酸水溶液洗涤，然后用偶联缓冲液(0.5M氯化钠、0.1M碳酸氢钠、pH＝8.3)洗涤。1ml偶联缓冲液中溶解C15肽10mg，加入上述洗净的凝胶，在4℃反应16小时。用偶联缓冲液洗涤后，加入封闭缓冲液(0.2M甘氨酸、0.5M氯化钠、0.1M碳酸氢钠、pH＝8.3)，室温反应2小时。用两种后处理缓冲液(0.5M氯化钠、0.1M醋酸-醋酸钠缓冲液、pH＝4.0；0.5M氯化钠、0.1MTris-盐酸缓冲液、pH＝8.0)交替洗涤各三次，得到Sepharose 4B-C15。
(实施例5)将IgG结合蛋白(C24)固定到多孔载体(Tresyl TOYOPEARL，TOSOH公司，对球状蛋白的排除界限分子量约为500万)上
C24肽的制备
将编码序列表SEQ ID NO：15的C24肽的DNA设计成序列表SEQ IDNO：16所示，与实施例1同法合成，并使之连接到pUCNT载体上。
与实施例1同法将具有SEQ ID NO：16所示序列的DNA导入pUCNT载体，构建pUCNT-C24载体。
另外，与实施例1同法制备大肠杆菌转化体，经过6L的L-肉汤的培养，得到高纯度的C24肽，备用于各种研究。
C24肽的固定
将C24肽5mg溶于1ml偶联缓冲液(0.5M氯化钠、0.1M碳酸缓冲液、pH＝8.3)中，加入干燥状态的AF-tresyl-TOYOPEARL 650 200mg，在4℃反应过夜。用0.5M氯化钠水溶液洗涤，然后加入封闭缓冲液(0.5M氯化钠、0.1M Tris-盐酸缓冲液、pH＝8.0)，室温反应2小时，再用0.5M氯化钠水溶液洗涤，得到TOYOPEARL-C24。
(实施例6)将IgG结合蛋白(C36)固定到多孔载体(Sepharose 6B)上
Sepharose 6B的环氧化
往琼脂糖类珠状凝胶Sepharose 6B(Amersham Pharmcia Biotech：对球状蛋白的排除界限分子量约为400万)90ml中加入水，使其总量为180ml。然后加入2N的氢氧化钠60ml，将温度调整为40℃。往其中加入环氧氯丙烷21ml，在40℃搅拌反应2小时。反应完毕后充分水洗，得到环氧活化Sepharose 6B凝胶。
C36肽的固定
除将实施例1中的环氧活化Kac凝胶变成环氧活化Sepharose 6B外，其它与实施例1同法操作，得到固定了C36肽的Sepharose 6B-C36。
(比较例1)将IgG结合蛋白(蛋白G)固定到多孔载体(GCL2000m)上
蛋白G的固定
除将实施例1中的C36肽10mg变成蛋白G(Sigma)4mg，环氧活化Kac凝胶变成实施例3中制备的环氧活化GCL2000m外，其它与实施例1同法操作，得到固定了蛋白G的GCL2000m-蛋白G。
(比较例2)将IgG结合蛋白(蛋白A)固定到多孔载体(Kac)上
蛋白A的固定
除将实施例1中的C36肽10mg变成蛋白A(Sigma)4mg外，其它与实施例1同法操作，得到固定了蛋白A的Kac-蛋白A。
(比较例3)将IgG结合蛋白(MG56)固定到多孔载体(Sepharose 6B)上
MG56肽的制备
对于具有在蛋白G的C3区域57个残基的N末端添加蛋氨酸而形成的序列的肽(序列表SEQ ID NO：17)，将其编码DNA设计成序列表SEQ IDNO：18所示，与实施例1同法合成，并使之连接到pUCNT载体上。
与实施例1同法将具有SEQ ID NO：18所示序列的DNA导入pUCNT载体，构建pUCNT-MG56载体。
另外，与实施例1同法制备大肠杆菌转化体，经过6L的L-肉汤的培养，得到高纯度的MG56肽，备用于各种研究。
肽的固定
将上述肽固定到多孔性Sepharose上，如下制备吸附材料。Sepharose采用硫代丙基-Sepharose 6B(Aersham Pharmcia Biotech)。往50mg硫代丙基-Sepharose 6B中加入蒸馏水50ml，室温放置15分钟，使树脂溶胀。然后除去蒸馏水，用含0.5M氯化钠的0.1M Tris-盐酸(pH＝7.5)偶联缓冲液替换。
另一方面，将上述纯化肽4mg溶于含0.5M氯化钠的0.1M Tris-盐酸(pH＝7.5)偶联缓冲液400μl中，加入经过溶胀的上述硫代丙基-Sepharose6B(150μl)，在4℃搅拌反应12小时。用足够量的PBS(含150mM氯化钠的10mM磷酸缓冲液、pH＝7.5)洗涤，得到Sepharose 6B-MG56。
(实施例7)合成的吸附材料的IgG吸附能力评价
实施例3中合成的吸附材料GCL2000m-C04和比较例1中合成的吸附材料GCL2000m-蛋白G各0.5ml通过钴60γ射线照射(25KGy，3小时)灭菌，委托Koga Isotope有限公司进行。
采集每种吸附材料100μl到小瓶中，加入健康人血清300μl，在37℃振荡2小时进行吸附反应。将该混悬液以5,000rpm的速度离心分离1分钟，委托Shionogi Biomedical Laboratories测定上清中的IgG浓度。
作为对照试验，将生理盐水100μl置于小瓶中，以此代替吸附材料，与上述方法同法处理，测定溶液中的IgG浓度。
通过下式计算IgG的吸附率(％)，结果如表1所示。
吸附率(％)＝{(V1r-V1t/V1r)}×100
V1r：对照试验溶液中的IgG浓度
V1t：吸附试验上清中的IgG浓度
表1
| 吸附材料 | 灭菌前的IgG吸附率(％) | 灭菌后的IgG吸附率(％) | |
| 实施例3 | GCL2000m-C04 | 97.1 | 90.2 |
| 比较例1 | GCL2000m-蛋白G | 98.6 | 59.8 |
(实施例8)合成的吸附材料的β1肾上腺素受体抗体吸附能力评价
实施例1中合成的吸附材料Kac-C36和比较例2中合成的吸附材料Kac-蛋白A各0.5ml通过钴60γ射线照射(25KGy，3小时)灭菌，委托KogaIsotope有限公司进行。
采集每种吸附材料100μl到小瓶中，加入扩张型心肌病患者的β1肾上腺素受体抗体阳性血清300μl，在37℃振荡2小时进行吸附反应。将该混悬液以5,000rpm的速度离心分离1分钟，通过ELISA法测定上清中的β1肾上腺素受体抗体滴度。下面详细说明ELISA法。往ELISA平皿中加入50μl委托仓敷防治株式会社合成的50μl/mlβ1肾上腺素受体的第2环部分肽(SEQ ID NO：19)溶液，在4℃放置过夜。将平皿洗涤后，加入脱脂乳(Difco公司)溶液100μl，室温静置1小时。将平皿洗涤后，加入受试物(加将上述上清稀释10倍所得的物质)50μl，在4℃放置过夜。将平皿洗涤后，加入经生物素标记的抗人IgG抗体(Southern Biotechnology)溶液100μl，室温静置1小时。将平皿洗涤后，加入底物溶液100μl，室温静置30分钟，然后测定405nm处的吸光度。用扩张型心肌病患者血清代替上述受试物获得的吸光度作为0％吸附能力，用健康人血清获得的吸光度作为100％吸附能力，计算每种吸附材料对β1肾上腺素受体的吸附能力，结果如表2所示。
表2
| 吸附材料 | β1肾上腺素受体抗体吸附率(％) | |
| 实施例1 | Kac-C36 | 77.8 |
| 比较例2 | Kac-蛋白A | 52.5 |
(实施例9)合成的吸附材料的类风湿因子吸附能力评价
实施例6中合成的吸附材料Sepharose 6B-C36和比较例3中合成的吸附材料Sepharose 6B-MG56各0.5ml通过钴60γ射线照射(25KGy，3小时)灭菌，委托Koga Isotope有限公司进行。
采集每种吸附材料100μl到小瓶中，加入风湿患者血清600μl，在37℃振荡2小时进行吸附反应。将该混悬液以5,000rpm的速度离心分离1分钟，委托Shionogi Biomedical Laboratories测定上清中的类风湿因子浓度。
作为对照试验，将生理盐水100μl置于小瓶中，以此代替吸附材料，与上述方法同法处理，测定溶液中的类风湿因子浓度。
通过下式计算类风湿因子的吸附率(％)，结果如表3所示。
吸附率(％)＝{(V2r-V2t/V2r)}×100
V2r：对照试验溶液中的类风湿因子浓度
V2t：吸附试验上清中的类风湿因子浓度
表3
| 吸附材料 | 类风湿因子吸附率(％) | |
| 实施例6 | Sepharose 6B-C36 | 56.3 |
| 比较例3 | Sepharose 6B-MG56 | 34.4 |
(实施例10)合成的吸附材料的免疫复合体吸附能力评价
实施例2、4、5中合成的吸附材料Sephacryl S1000-B04、Sepharose4B-C15和TOYOPEARL-C24各0.5ml通过钴60γ射线照射(25KGy，3小时)灭菌，委托Koga Isotope有限公司进行。
免疫复合体通过将人IgG溶液(10mg/ml)在63℃加热15分钟来制备。
采集每种吸附材料100μl到小瓶中，加入健康人血清300μl，该血清中加入了20μg/ml的上述免疫复合体溶液。在37℃振荡2小时进行吸附反应。将该混悬液以5,000rpm的速度离心分离1分钟，用Fujirebio有限公司的Furelyzer C1q-CIC试剂盒测定上清中的免疫复合体浓度。
作为对照试验，将生理盐水100μl置于小瓶中，以此代替吸附材料，与上述方法同法处理，测定溶液中的免疫复合体浓度。
通过下式计算免疫复合体的吸附率(％)，结果如表4所示。
吸附率(％)＝{(V3r-V3t/V3r)}×100
V3r：对照试验溶液中的免疫复合体浓度
V3t：吸附试验上清中的免疫复合体浓度
表4
| 吸附材料 | 灭菌前免疫复合体吸附率(％) | 灭菌后免疫复合体吸附率(％) | |
| 实施例2 | Sephacryl S1000-B04 | 92.4 | 91.6 |
| 实施例4 | Sepharose 4B-C15 | 85.2 | 84.1 |
| 实施例5 | TOYOPEARL-C24 | 81.5 | 80.5 |
(实施例11)合成的吸附材料的IgG吸附能力评价
按照实施例1的相同方法，将葡聚糖类珠状凝胶Sephadex G-150(Amersham Pharmcia Biotech：对球状蛋白的排除界限分子量约为30万)进行环氧化，通过在该凝胶上固定C36肽来合成吸附材料Sephadex G-150-C36。将吸附材料Sephadex G-150-C36和没有固定肽的Sephadex G-150各0.5ml通过钴60γ射线照射(25KGy，3小时)灭菌，委托Koga Isotope有限公司进行。
吸附试验与实施例7同法进行，结果如表5所示。
表5
| 吸附材料 | IgG吸附率(％) | |
| 实施例11 | Sephadex G-150-C36 | 59.7 |
| (对照) | Sephadex G-150 | 2.1 |
产业适用性
由上可知，本发明提供对免疫球蛋白和/或免疫复合体具有选择性吸附能力的新型肽、用于合成该肽的重组DNA、含有该DNA分子的微生物以及由上述肽构成的新型吸附材料。另外，利用填充上述吸附材料的体液处理装置，可以选择性地除去血液、血浆和血清等被处理液中的免疫球蛋白和/或免疫复合体。
序列表
<110>钟渊化学工业株式会社KANEKA CORPORATION
<120>新型肽、新型吸附材料、吸附器和吸附方法
<130>0-180/BLAP-4
<150>JP2001-283583
<151>2001-9-18
<160>19
<210>1
<211>57
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：目的肽
<400>1
Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr
l 5 10 15
Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Arg Ala Phe Arg X01
20 25 30
Tyr Ala X02 Asp Asn Gly Val X03 Gly X04 Trp Thr Tyr Asp Pro Ala
35 40 45
Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Cys
50 55
X01：Asn或Lys或Gln
X02：Thr或Asn
X03：Glu或Asp
X04：Leu或Val或Ile或Met
<210>2
<211>171
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：目的DNA
<400>2
acc acc tat aaa ctg gtt atc aac ggt aaa acc ctg aaa ggt gaa acc 48
Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr
1 5 10 15
acc acc aag gct gtt gac gct gaa acc gct gag cgc gca ttt cgg X01 96
Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Arg Ala Phe Arg X01
20 25 30
tat gct X02 gac aac ggt gtc X03 ggt X04 tgg acc tat gac ccc gct 144
Tyr Ala X02 Asp Asn Gly Val X03 Gly X04 Trp Thr Tyr Asp Pro Ala
35 40 45
acc aaa acc ttt acc gtt acc gaa tgc 171
Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Cys
50 55
X01：aac或aat或aaa或aag或caa或cag
X02：aca或acg或acc或act或aac或aat
X03：gaa或gag或gac或gat
X04：cta或ctg或ctc或ctt或tta或ttg或gta或gtg或gtc或gtt或ata或atc
或att或atg
<210>3
<211>55
<212>PRT
<213>链球菌G148(Streptococcus sp.G148)
<400>3
Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr
1 5 10 15
Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr
20 25 30
Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr
35 40 45
Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu
50 55
<210>4
<211>55
<212>PRT
<213>链球菌G148(Streptococcus sp.G148)
<400>4
Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr
1 5 10 15
Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr
20 25 30
Ala Asp Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr
35 40 45
Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu
50 55
<210>5
<211>55
<212>PRT
<213>链球菌G148(Streptococcus sp.G148)
<400>5
Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr
1 5 10 15
Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys Gln Tyr
20 25 30
Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr
35 40 45
Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu
50 55
<210>6
<211>56
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C3结构域
<400>6
Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr
1 5 10 15
Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys Gln
20 25 30
Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp Ala
35 40 45
Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu
50 55
<210>7
<211>181
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C3结构域DNA
<400>7
catatg acc acc tat aaa ctg gtt atc aac ggt aaa acc ctg aaa ggt gaa acc 54
Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr
1 5 10 15
acc acc aag gct gtt gac gct gaa acc gct gaa aaa gca ttt aaa cag 102
Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys Gln
20 25 30
tat gct aac gac aac ggt gtc gac ggt gtt tgg acc tat gac gac gct 150
Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp Ala
35 40 45
acc aaa acc ttt acc gtt acc gaa taagctt 181
Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu
50 55
<210>8
<211>58
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C36
<400>8
Met Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu
1 5 10 15
Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Arg Ala Phe Arg
20 25 30
Gln Tyr Ala Thr Asp Asn Gly Val Glu Gly Met Trp Thr Tyr Asp Pro
35 40 45
Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Cys
50 55
<210>9
<211>184
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C36-DNA
<400>9
cat atg acc acc tat aaa ctg gtt atc aac ggt aaa acc ctg aaa ggt gaa 51
Met Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu
1 5 10 15
acc acc acc aag gct gtt gac gct gaa acc gct gag cgc gca ttt cgg 99
Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Arg Ala Phe Arg
20 25 30
cag tat gct acg gac aac ggt gtc gaa ggt atg tgg acc tat gac ccc 147
Gln Tyr Ala Thr Asp Asn Gly Val Glu Gly Met Trp Thr Tyr Asp Pro
35 40 45
gct acc aaa acc ttt acc gtt acc gaa tgc taagctt 184
Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Cys
50 55
<210>10
<211>58
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：B04
<400>10
Met Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu
1 5 10 15
Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Arg Ala Phe Arg
20 25 30
Lys Tyr Ala Thr Asp Asn Gly Val Asp Gly Met Trp Thr Tyr Asp Pro
35 40 45
Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Cys
50 55
<210>11
<211>58
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C04
<400>11
Met Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu
1 5 10 15
Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Arg Ala Phe Arg
20 25 30
Lys Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Glu Gly Ile Trp Thr Tyr Asp Pro
35 40 45
Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Cys
50 55
<210>12
<211>184
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C04-DNA
<400>12
cat atg acc acc tat aaa ctg gtt atc aac ggt aaa acc ctg aaa gga gaa 51
Met Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu
1 5 10 15
acc acc acc aag gct gtt gac gct gaa acc gct gaa aga gca ttt agg 99
Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Arg Ala Phe Arg
20 25 30
aag tat gct aac gac aac ggt gtc gaa ggt atc tgg acc tat gac ccc 147
Lys Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Glu Gly Ile Trp Thr Tyr Asp Pro
35 40 45
gct acc aaa acc ttt acc gtt acc gaa tgc taagctt 184
Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Cys
50 55
<210>13
<211>58
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C15
<400>13
Met Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu
1 5 10 15
Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Arg Ala Phe Arg
20 25 30
Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Glu Gly Leu Trp Thr Tyr Asp Pro
35 40 45
Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Cys
50 55
<210>14
<211>184
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C15-DNA
<400>14
cat atg acc acc tat aaa ctg gtt atc aac ggt aaa acc ctg aaa ggt gaa 51
Met Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu
1 5 10 15
acc acc acc aag gct gtt gac gct gaa acc gct gag cgc gca ttt cga 99
Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Arg Ala Phe Arg
20 25 30
cag tat gct aac gac aac ggt gtc gag ggt ctg tgg acc tat gac ccc 147
Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Glu Gly Leu Trp Thr Tyr Asp Pro
35 40 45
gct acc aaa acc ttt acc gtt acc gaa tgc taagctt 184
Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Cys
50 55
<210>15
<211>58
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C24
<400>15
Met Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu
1 5 10 15
Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Arg Ala Phe Arg
20 25 30
Lys Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Met Trp Thr Tyr Asp Pro
35 40 45
Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Cys
50 55
<210>16
<211>184
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C24-DNA
<400>16
cat atg acc acc tat aaa ctg gtt atc aac ggt aaa acc ctg aaa ggt gaa 51
Met Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu
1 5 10 15
acc acc acc aag gct gtt gac gct gaa acc gc t gag cgc gca ttt cgg99
Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Arg Ala Phe Arg
20 25 30
aag tat gct aac gac aac ggt gtc gac ggt atg tgg acc tat gac ccc 147
Lys Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Met Trp Thr Tyr Asp Pro
35 40 45
gct acc aaa acc ttt acc gtt acc gaa tgc taagctt 184
Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Cys
50 55
<210>17
<211>57
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：MG56
<400>17
Met Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu
1 5 10 15
Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys
20 25 30
Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp
35 40 45
Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu
50 55
<210>18
<211>181
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：MG56-DNA
<400>18
cat atg acc acc tat aaa ctg gtt atc aac ggt aaa acc ctg aaa ggt gaa 51
Met Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu
1 5 10 15
acc acc acc aag gct gtt gac gct gaa acc gct gaa aaa gca ttt aaa 99
Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys
20 25 30
cag tat gct aac gac aac ggt gtc gac ggt gtt tgg acc tat gac gac 147
Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp
35 40 45
gct acc aaa acc ttt acc gtt acc gaa taagctt 181
Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu
50 55
<210>19
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：β1肾上腺素受体第197-222位
<400>19
His Trp Trp Arg Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp
1 5 10 15
Pro Lys Cys Cys Asp Phe Val Thr Asn Arg Cys
20 25
Claims (15)
1、具有序列表SEQ ID NO：1所示的下列氨基酸序列的免疫球蛋白和/或免疫复合体亲和肽：
Thr Thr Tyr Lys Leu Val
Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr
Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala
Glu Arg Ala Phe Arg X01 Tyr Ala X02 Asp
Asn Gly Val X03 Gly X04 Trp Thr Tyr Asp
Pro Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu
Cys
其中，
X01为Asn、Lys和Gln中的任意一个；
X02为Thr和Asn中的任意一个；
X03为Glu和Asp中的任意一个；
X04为Leu、Val、Ile和Met中的任意一个。
2、编码序列表SEQ ID NO：1所示的至少一种氨基酸序列的核苷酸序列。
3、权利要求2所述的核苷酸序列，其包括序列表SEQ ID NO：2所示的至少一种碱基序列。
4、具有一个或多个编码序列表SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的核苷酸序列的重组DNA。
5、权利要求4所述的重组DNA，其中所述核苷酸序列包括序列表SEQID NO：2所示的至少一种碱基序列。
6、权利要求4或5所述的重组DNA，该重组DNA为质粒或噬菌体。
7、含有至少一种重组DNA的微生物，其中所述重组DNA具有一个或多个编码序列表SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的核苷酸序列。
8、权利要求7所述的微生物，其中所述核苷酸包含序列表SEQ ID NO：2所示的至少一种碱基序列。
9、免疫球蛋白和/或免疫复合体的吸附材料，其包含下述水不溶性载体，该载体上固定有含有序列表SEQ ID NO：1所示的至少一种氨基酸序列，并且由至多70个氨基酸残基构成的肽。
10、权利要求9所述的免疫球蛋白和/或免疫复合体的吸附材料，其特征在于，所述肽是热稳定性优良的肽。
11、权利要求9所述的免疫球蛋白和/或免疫复合体的吸附材料，其特征在于，所述水不溶性载体为多孔性。
12、权利要求9所述的免疫球蛋白和/或免疫复合体的吸附材料，其特征在于，所述水不溶性载体为亲水性。
13、权利要求11所述的免疫球蛋白和/或免疫复合体的吸附材料，其中所述水不溶性载体的排除界限分子量为15万或以上。
14、体液中的免疫球蛋白和/或免疫复合体的吸附方法，其特征在于，使权利要求9所述的吸附材料与包含免疫球蛋白和/或免疫复合体的体液接触。
15、吸附器，其包括在下述容器中填充的权利要求9所示的吸附材料，该容器具有液体的入口和出口，并且有至少一个过滤器。
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