KR20040039367A

KR20040039367A - 신규 펩티드, 신규 흡착재, 흡착기 및 흡착방법

Info

Publication number: KR20040039367A
Application number: KR10-2004-7003892A
Authority: KR
Inventors: 오기노에이지; 니시모토타케히로; 노무라미치오; 후루요시시게오
Original assignee: 가네가후치 가가쿠 고교 가부시키가이샤
Priority date: 2001-09-18
Filing date: 2002-09-18
Publication date: 2004-05-10
Also published as: CN1282658C; EP1435360A1; CN1555383A; US7153945B2; EP1435360A4; US20070059800A1; KR100960743B1; US20050038228A1; EP1435360B1; DE60233419D1; WO2003025011A1; CA2460048A1; JP2003088381A; JP4685294B2

Abstract

본 발명은 체액(예를 들면 혈액, 혈장 등)에 존재하는 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체를 체액 전처리 없이 효율적으로 선택 흡착할 수 있는 흡착재, 흡착장치, 흡착방법을 제공한다.

수불용성 담체에 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체에 결합 활성을 가지는 화합물을 고정함으로써, 현저하게 뛰어난 흡착능력을 가지는 흡착재를 얻을 수 있다.

Description

신규 펩티드, 신규 흡착재, 흡착기 및 흡착방법{NOVEL PEPTIDE, NOVEL ADSORBENT, ADSORPTION UNIT AND ADSORPTION METHOD}

면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체에 친화성을 나타내는 단백질은 여러 가지 알려져 있는데, 그 중에서도 프로테인 (protein) A, 프로테인 G가 잘 연구되어 있다. 프로테인 A, 프로테인 G는 모두 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체에 강한 친화성을 가지는데, 프로테인 A는 IgG3에 대한 친화성이 낮은데 대해서, 프로테인 G는 IgG3에 대해서도 결합한다(일본 특허 제02764021호 공보). 또한, 프로테인 G 유전자는 C1, C2, C3이라고 불리는 3종의 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체결합 펩티드를 코드하는 뉴클레오티드 서열을 가지고 있는 것이 명확히 되어 있고, 대응하는 아미노산 서열은 서열표의 서열번호 3, 4, 5에 나타낸 하기와 같다(일본 특허 제02764021호 공보).

C1(서열번호 3)

Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr

Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val

Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys

Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly

Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr

Phe Thr Val Thr Glu

C2(서열번호 4)

Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr

Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val

Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys

Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly

Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr

Phe Thr Val Thr Glu

C3(서열번호 5)

Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr

Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Lys Ala Val

Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys

Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly

Val Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr

Phe Thr Val Thr Glu

또한 C2와 IgG(Fc)의 복합체의 X선 구조 해석으로부터, C2의 Glu26, Lys27, Lys30, Gln31, Asn34, Asp39, Glu41, Trp42가 Fc에 결합하는 것이 명확히 되어 있다(Sauer-Eriksson AE, Kleywegt GJ, Uhlen M, Jones TA Crystals structure of the C2 fragment of streptococcal protein G in complex with the Fc domain of human IgG. Structure 1995 Mar 15;3(3):265-78).

면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체에 친화성을 나타내는 펩티드, 단백질의 중요한 이용의 하나로서 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체의 정제, 분리, 제거를 목적으로 하는 흡착재에의 적용을 생각할 수 있다. 그러나, 본 발명자들은 상기 C1, C2, C3 펩티드의 열 안정성이 낮고, 고압증기 멸균에 견딜 수 없는 것 및 방사선 멸균을 실시하면 결합 활성이 현저하게 저하한다는 것을 발견했다.

본 발명은 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체에 친화성을 가지는 신규의 펩티드, 상기 펩티드를 코드하는 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 DNA, 상기 DNA분자를 함유하는 미생물, 상기 펩티드의 생산에 있어서의 그 미생물 또는 상기 DNA분자의 사용에 관한 것이다. 또한 상기 펩티드의 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체에의 친화성을 이용한 수용액, 특히 체액(예를 들면 혈액, 혈장, 혈청 등)에 존재하는 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체를 선택적으로 흡착하는 흡착재, 이 흡착재를 이용한 흡착기 및 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체의 흡착방법에 관한 것이다.

도 1은 3종류의 겔, 토요펄 HW-65, 셀룰로파인 GC-700m, Biogel-A5m을 이용해서, 유속과 압력 손실의 관계를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 2는 본 발명의 면역 글로블린및(또는) 면역 복합체의 흡착기의 일례의 개략 단면도이다.

본 발명은 이러한 문제를 감안하여 프로테인 G 유래의 펩티드의 Fc결합 아미노산(전술)도 포함해서 아미노산의 최적화를 행하고, 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체에 대한 친화성은 원래의 펩티드(상술 C3)와 동등, 또는 그 이상이며, 또한, 멸균조작에 대한 안정성을 가지는 신규의 펩티드, 상기 펩티드를 코드하는 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 DNA, 상기 DNA분자를 함유하는 미생물, 상기 펩티드의 생산에 있어서의 그 미생물 또는 상기 DNA분자의 사용, 또한 그 이용예인, 수용액 특히 체액(예를 들면 혈액, 혈장, 혈청 등)에 존재하는 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체를 선택적으로 흡착하는 흡착재를 제공하고, 또한, 이 흡착재를 이용한 흡착기 및 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체의 흡착방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명자들은 상기 과제를 달성하기 위해서, 화학적 및 유전자 공학적 수법을 이용해서 수많은 펩티드를 취득하고, 얻어진 펩티드의 특징을 여러 가지 과학적 수법을 구사함으로써 본 발명을 완성시키기에 이르었다.

즉, 본 발명은 서열표의 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열을 가지는 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체 친화성 펩티드;서열표의 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열 중 1개 이상을 코드하는 뉴클레오티드 서열;서열표의 서열번호 2로 나타내는 염기 서열 중 1개 이상을 포함하는 상기 뉴클레오티드 서열;서열표의 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 하나 이상 가지는 재조합 DNA;서열표의 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 하나 이상 가지는 재조합 DNA를 1개 이상 함유하는 미생물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 서열표의 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열 중 1개 이상을 함유하고, 또한, 70개 이하의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드가 고정된 수불용성 담체를 포함하는 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체의 흡착재;상기 흡착재와, 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체를 포함하는 체액을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 체액 중의 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체의 흡착방법;액의 입구 및 출구를 가지고, 또한 1개 이상의 필터를 가지는 용기 내에 상기 흡착재가 충전되어 이루어지는 흡착기에 관한 것이다.

이하에 본 발명을 상술한다.

본 발명의 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체 친화성 펩티드는 하기 아미노산 서열 B(서열표의 서열번호 1)로 나타내어진다.

Thr Thr Tyr Lys Leu Val

Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr

Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala

Glu Arg Ala Phe Arg X01 Tyr Ala X02 Asp

Asn Gly Val X03 Gly X04 Trp Thr Tyr Asp

Pro Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu

Cys

(단, X01은 Asn, Lys, Gln의 3종의 아미노산에서 선택된 1종, X02는 Thr, Asn의 2종의 아미노산에서 선택된 1종, X03은 Glu, Asp의 2종의 아미노산에서 선택된 1종, X04는 Leu, Val, IIe, Met의 4종의 아미노산에서 선택된 1종임)

본 명세서에 있어서, 「친화성」이란, 어떤 화합물에 대해서 결합 활성을 가지는 성질을 의미한다. 즉, 본 발명의 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체 친화성 펩티드는 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체에 대해서 결합 활성을 가지는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 펩티드는 하기 연구로 얻어진 것이다.

우선, 일본 특허 제02764021호 공보에 기재된 비교 대조가 되는 펩티드(아미노산 서열 A:서열표의 서열번호 6)

Thr Thr Tyr Lys Leu Val

Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr

Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala

Glu Lys Ala Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp

Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp

Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu

를 코드하고, 벡터에 삽입하기 위한 제한 효소 부위를 가지는 DNA로서 서열표의 서열번호 7(염기 서열 A)을 제조했다. 상기 염기 서열의 제한 효소 부위(NdeI, Hind III)는 후술하는 실시예에 이용한 벡터(pUCNT:국제공개W094/03613공보)에 맞추기 위한 것이고, 제한 효소 부위가 다르다면 그 제한 효소 부위에 맞출 필요가 있지만, 당분야의 상식이므로 상세한 설명은 생략한다. 염기 서열 A로 나타내어진 DNA를 벡터 pUCNT에 삽입하고, 이것을 이용해서 대장균(HB101)을 형질 전환하고, 균체를 배양, 파쇄, 상징액을 정제해서 펩티드를 얻었다. 이 펩티드를 담체에 고정화해서 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체 흡착재를 얻었는데, γ선 조사(25kGy)에 의해 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체 흡착능력은 크게 저하했다.

다음에 염기 서열 A를 기초로 일부의 염기 서열을 바꾼 DNA 라이브러리를 제조하고, 어느 위치의 아미노산을 어느 아미노산으로 치환하면 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체에 대한 결합이 강해질 것인지 및 γ선 멸균 안정성이 높아질지에 대해서 자세히 검토하였다.

그 결과, 하기의 염기 서열 B(서열표의 서열번호 2)로 나타내어진 DNA의 5'말단에 (cat atg), 3'말단에 (taa gct t)을 부여해서 벡터에 삽입하고, 이것을 이용해서 대장균 HB101을 형질 전환한 생산균이 생산된다. 하기의 아미노산 서열 B(서열표의 서열번호 1)를 포함하는 펩티드가 최적인 것을 발견했다.

(염기 서열 B:서열표의 서열번호 2)

acc acc tat aaa ctg gtt

atc aac ggt aaa acc ctg aaa ggt gaa acc

acc acc aag gct gtt gac gct gaa acc gct

gag cgc gca ttt cgg X01 tat gct X02 gac

aac ggt gtc X03 ggt X04 tgg a㏄ tat gac

ccc gct acc aaa acc ttt acc gtt acc gaa

tgc

단,

X01:aac, aat, aaa, aag, caa 또는 cag

X02:aca, acg, a㏄, act, aac 또는 aat

X03:gaa, gag, gac 또는 gat

X04:cta, ctg, ctc, ctt, tta, ttg, gta, gtg, gtc, gtt, ata, atc, att 또는 atg

(아미노산 서열 B:서열표의 서열번호 1)

Thr

Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr

Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Lys Ala Val

Asp Ala Glu Thr Ala Glu Arg Ala Phe Arg

X01 Tyr Ala X02 Asp Asn Gly Val X03 Gly

X04 Trp Thr Tyr Asp Pro Ala Thr Lys Thr

Phe Thr Val Thr Glu Cys

단,

X01:Asn, Lys 또는 Gln

X02:Thr 또는 Asn

X03:Glu 또는 Asp

X04:Leu, Val, Ile 또는 Met

아미노산 서열 B로 나타내어지는 펩티드를 담체에 고정화해서 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체 흡착재를 얻고, γ선 조사(25kGy)를 해도, 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체 흡착능력은 미조사 흡착재와 동등했다.

예를 들면, 서열표의 서열번호 8(C36 펩티드)에 나타낸,

Met Thr

Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr

Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Lys Ala Val

Asp Ala Glu Thr Ala Glu Arg Ala Phe Arg

Gln Tyr Ala Thr Asp Asn Gly Val Glu Gly

Met Trp Thr Tyr Asp Pro Ala Thr Lys Thr

Phe Thr Val Thr Glu Cys

아미노산 서열 B를 함유하는 펩티드인를 생리 식염액에 용해해서 500㎍/mL로 하고, 수산화나트륨 수용액으로 pH=7.0으로 제조한 펩티드 수용액을 80℃로 30분간 가열하고, 가열처리하지 않은 펩티드 수용액과 IgG 결합능력을 비교한 바, 의미있는 차이는 보여지지 않았다. IgG 결합능력은 IgG를 담체에 고정화한 컬럼(IgG Sepharose Fast Flow:파머시아사제)에 펩티드 수용액을 통액하고, 소정의 방법으로 용출해서 회수된 펩티드량을 HPLC로 분석했다.

이상과 같은 서열번호 1의 아미노산 서열을 함유하는 서열로서는, 예를 들면 서열표의 서열번호 10, 11, 13 및 15로 나타내는 서열을 예로서 들 수 있다.

다음에 본 발명의 뉴클레오티드 서열, 재조합 DNA 및 미생물에 대해서 설명한다.

본 발명의 뉴클레오티드 서열은, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열 중 1개 이상을 코드하는 것을 특징으로 한다.

상기 뉴클레오티드 서열로서는, 서열번호 2로 나타내는 염기 서열 중 1개 이상을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 서열번호 2의 염기 서열을 함유하는 서열로서는, 예를 들면 서열표의 서열번호 9, 12, 14 또는 16로 나타내는 서열을 예로서들 수 있다.

본 발명의 재조합 DNA는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 하나 이상 가지는 것을 특징으로 한다.

상기 재조합 DNA에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 서열번호 2로 나타내는 염기 서열 중 1개 이상을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 재조합 DNA는, 예를 들면, 문헌 [Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)] 등에 기재된 공지의 화학적 수법이나 유전자 공학적 수법으로 제작할 수 있다.

상기 재조합 DNA의 제작에 있어서, 예를 들면, 상술한 염기 서열 A를 기초로 일부의 염기 서열을 바꾼 DNA 라이브러리를 제작하고, 해당 DNA 라이브러리 및 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체를 사용한 면역 스크리닝 방법으로 선택된 DNA를 사용할 수 있다.

상기 재조합 DNA의 종류는 불문하지만, 플러스미드 또는 파지인 것이 유전자 조작이 용이하기 때문에 바람직하다. 플러스미드 제작에 있어서는, 예를 들면 pUCNT 벡터(W094/03613호 공보) 외, 시판되는 대장균 유래의 벡터를 사용할 수 있다.

본 발명의 미생물은, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 하나 이상 가지는 재조합 DNA를 1개 이상 함유하는 것을 특징으로 한다.

상기 미생물에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 서열번호 2로 나타내는 염기 서열 중 1개 이상을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 미생물은, 예를 들면 문헌 [Basic Methods in Molecular Bio logy, Appleton & Lange(1986)] 등에 기재된 공지의 유전자 공학적 수법, 예를 들면 인산 칼슘법으로, 상기 재조합 DNA를 미생물로 형질 전환함으로써 제작할 수 있다.

상기 미생물의 제작에서 사용하는 미생물로서는 대장균 HB101주 등의 대장균 등을 예로 들 수 있다.

다음에 본 발명의 흡착재에 대해서 설명한다. 본 발명의 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체의 흡착재는 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열 중 1개 이상을 함유하고, 또한, 70개 이하의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드가 고정화된 수불용성 담체를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 흡착재에 이용하는 펩티드로서는 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열을 1개 이상 함유하고, 아미노산 잔기가 70개 이하의 것이면 특별히 제한되지 않는다. 상기 펩티드는 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열을 함유하기 때문에, 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체에 친화성을 가지는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 펩티드로서는 멸균조작이 가능해지기 때문에 열 안정성이 뛰어난 펩티드가 바람직하다. 해당 열 안정성이 뛰어난 펩티드는, 동결건조한 고체 상태 또는 수용액 상태로 8C℃이상으로 30분간 가열해도 펩티드 본래의 성질을 손상되지 않는 것, 또는 펩티드를 담체에 고정화한 후, 고압증기멸균(115℃ 30분간, 121℃ 20분간, 또는, 126℃ 15분간) 또는 방사선 멸균(25kGy)을 실시해도 멸균전의 특성을 잃어버리지 않는 것이다.

본 발명의 흡착재에 이용하는 수불용성 담체로서는, 유리 비즈, 실리카 겔 등의 무기 담체;가교 폴리비닐알코올, 가교 폴리아크릴레이트, 가교 폴리아크릴아미드, 가교 폴리스티렌 등의 합성 고분자나, 결정성 셀룰로오스, 가교 셀룰로오스, 가교 아가로오스, 가교 덱스트란 등의 다당류를 포함하는 유기 담체;나아가서는 이것들의 조합에 의해 얻을 수 있는 유기-유기, 유기-무기 등의 복합 담체 등을 들 수 있지만, 그 중에서도 친수성 담체는 비특이흡착이 비교적 적고, 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체의 흡착 선택성이 양호하기 때문에 바람직하다.

여기에서 말하는 친수성 담체란, 담체를 구성하는 화합물을 평판상으로 만들었을 때의 물과의 접촉각이 60도 이하인 담체를 나타낸다. 이러한 담체로서는 셀룰로오스, 키토산, 덱스트란 등의 다당류, 폴리비닐알코올, 에틸렌-아세트산 비닐 공중합체 비누화물, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리메타크릴산 메틸, 폴리아크릴산 그래프트화 폴리에틸렌, 폴리아크릴아미드그래프트화 폴리에틸렌 또는 유리 등을 포함하는 담체를 대표예로서 들 수 있다.

시판품으로서는, 다공질 셀룰로오스 겔인 GCL 2000, GC700, 알릴덱스트란과 메틸렌비스아크릴아미드를 공유결합으로 가교한 Sephacryl S-1000, 아크릴레이트계의 담체인 Toyopearl, 아가로오스계의 가교담체인 Sepharose CL4B, 에폭기로 활성화된 폴리메타크릴아미드인 오이퍼키드C250L 등을 예시할 수 있다. 단, 본 발명에 있어서는, 이것들의 담체, 활성화 담체만으로 한정되는 것이 아닌 것은 말할 필요도 없다. 상술의 담체는 각각 단독으로 이용할 수 있고, 임의의 2종류 이상을 혼합할 수 있다.

또한, 본 발명에 이용하는 수불용성 담체로서는, 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체의 흡착이라고 하는 본 흡착재의 사용목적 및 펩티드의 친화성을 이용한 본 발명의 방법으로 봐서 표면적이 큰 것이 바람직하고, 적당한 크기의 작은 구멍을 다수 가지는, 즉 다공질인 것이 바람직하다. 구체적인 다공질 담체로서는 상기 예시한 친수성 담체의 시판품 등을 예로 들 수 있다.

본 발명에서 이용되는 다공질 담체의 배제 한계 분자량은 15만 이상이지만, 면역 글로블린의 클래스 G(IgG)의 분자량은 14만 이상 17만 이하의 분자이기 때문에, 다공질 담체에서 보다 효율적으로 흡착하기 위해서는, 배제 한계 분자량이 면역 글로블린의 클래스 G의 분자량보다도 큰 25만 이상이 바람직하다. 또 면역 글로블린을 그 구성요소로 하는 면역 복합체의 분자량을 특정하는 것은 곤란하지만, 면역 글로블린의 클래스 G 4분자가 항원과 복합체를 만들 경우, 그 분자량은 계산상 56만 이상이 된다. 따라서, 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체가 다공질 담체의 내부에 들어가기 위해서는, 배제 한계 분자량이 60만 이상인 것이 보다 바람직하고, 용이하게 들어가도록 하기 위해서는 300만 이상의 배제 한계 분자량이 더욱 바람직하다.

다음에 수불용성 담체의 다공구조에 대해서는, 흡착재의 단위체적당의 흡착능력으로 생각해서, 표면 다공성(담체 외부가 다공성으로 내부가 치밀하게 되어 있는 구조)보다도 전다공성(담체 전체가 다공질이며, 분자는 내부까지 도달가능한 구조)이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 수은 압입법에 의한 공공(空孔) 용적이20%이상이며, 또한, 수은 압입법에 의한 비표면적이 1㎎/g이상인 것이 바람직하다.

수불용성 담체의 형태로서는, 비즈상, 섬유상, 막상(중공사도 포함한다) 등 모두 가능하고 임의의 형태를 고를 수 있다. 특정한 배제 한계 분자량을 가지는 담체 제작의 용이함을 위해 비즈상이 특히 바람직하게 이용된다. 비즈상의 평균입경은 10 내지 2500㎛의 것이 쓰기 쉽고, 특히 리간드 고정화 반응의 용이함의 점에서 25㎛ 내지 800㎛의 범위가 바람직하다.

또한 수불용성 담체 표면에 리간드의 고정화 반응에 이용할 수 있는 관능기가 존재하고 있는 경우, 리간드의 고정화에 적합하다. 이들 관능기의 대표예로서는, 수산기, 아미노기, 알데히드기, 카르복실기, 티올기, 실란올기, 아미드기, 에폭시기, 숙시닐이미드기, 산 무수물기 등을 들 수 있다.

또 본 발명에 이용하는 수불용성 담체로서는, 경질 담체, 연질 담체 모두 이용할 수 있지만, 체외 순환 치료용의 흡착재로서 사용하기 위해서는, 컬럼에 충전하여 통액할 때 등에 눈막힘을 일으키지 않는 것이 중요하다. 그 때문에 충분한 기계적 강도가 요구된다. 따라서, 본 발명에 이용하는 수불용성 담체는 경질 담체인 것이 보다 바람직하다.

본 명세서중에서는, 경질 담체란, 예를 들면 입상 겔의 경우, 이하의 조건으로 겔을 유리제 원통상 컬럼(내경 9mm, 컬럼길이 150mm)에 균일하게 충전하여 수성 유체를 흘려보냈을 때의 압력손실△P와 유량의 관계가 0.3kg/㎠까지 직선관계에 있는 것을 말한다.

예를 들면, 양단에 공경 15㎛의 필터를 장착한 유리제 원통상 컬럼(내경 9㎜, 컬럼길이 150㎜)에 아가로스 겔(Bio-Rad사제의 Biogel-A5m, 입경 50 내지 100메시), 비닐계 폴리머 겔(토요 소타쯔 공업(주)제의 토요펄 HW-65, 입경 50 내지 100㎛) 및 셀룰로오스 겔(짓소(주)제의 셀룰로파인 GC-700m, 입경 45 내지 105㎛)을 각각 균일하게 충전하고, 페리스터틱 펌프로 물을 흘려보내 유량과 압력 손실△P의 관계를 구했다(도 1). 세로축에 유속(cm/분)을 가로축에 압력손실(kg/㎠)을 플로트했다. 이 도에 있어서, ○은 토요펄 HW-65, △는 셀룰로파인 GC-700m, ●는 Biogel-A5m를 나타낸다. 이 결과, 토요펄 HW-65 및 셀룰로파인 GC-700m에서는 압력증가에 거의 비례해서 유량이 증가하는데 대해서, Biogel-A5m에서는 압밀화를 일으켜 압력을 증가시켜도 유량이 증가하지 않는 것을 알 수 있다.

다음에 상기 펩티드를 수불용성 담체에 고정화하는 방법에 대해서 설명한다.

면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체에 친화성을 가지는 펩티드, 즉 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열 중 1개 이상을 함유하고, 또한, 70개 이하의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드를 상기 수용성 담체에 고정화할 때는, 해당 펩티드의 입체장해를 작게 함으로써 흡착효율을 향상시키고, 또한 비특이적 흡착을 억제하기 위해서, 친수성 스페이서를 통해서 고정화하는 것이 보다 바람직하다. 친수성 스페이서로서는, 예를 들면 양 말단을 카르복실기, 아미노기, 알데히드기, 에폭시기등으로 치환한 폴리알킬렌옥사이드의 유도체 등을 이용하는 것이 바람직하다.

상기 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체 친화성 펩티드 및 상기 친수성 스페이서의 고정화 방법은 특별히 한정되지 않는다. 일반적으로 단백질이나 펩티드를 담체에 고정화할 경우에 채용되는 방법을 이용할 수 있고, 예를 들면, (1)담체를 브롬화 시안, 에피클로로히드린, 디글리시딜에테르, 토실클로라이드, 트레실클로라이드, 히드라진 등과 반응시켜 담체를 활성화시키고(담체가 원래 가지고 있는 관능기를 리간드로서 고정화하는 화합물이 보다 반응하기 쉬운 관능기로 바꾸고), 리간드로서 고정화하는 화합물과 반응시켜 고정화하는 방법, (2)담체와 리간드로서 고정화하는 화합물이 존재하는 계에 카르보디이미드와 같은 축합시약, 또는, 글루탈알데히드와 같이 분자중에 복수의 관능기를 가지는 시약을 가하여 축합, 가교하는 것에 의한 고정화 방법 등을 들 수 있다. 체외 순환 치료 및 혈액 정화에 이용할 수 있는 흡착재인 것을 고려하여, 흡착재의 멸균시 또는 치료시에 단백질류가 담체보다 용이하게 이탈하지 않는 고정화 방법을 적용하는 것이 보다 바람직하다.

다음에 본 발명의 흡착방법은 상기 흡착재와 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체를 포함하는 체액을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 것이다.

면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체 친화성 펩티드를 고정화한 담체를 포함하는 흡착재를, 혈액, 혈장, 혈청 등의 체액과 접촉시켜 체액 중의 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체를 흡착하는 방법에는 여러 가지 방법이 있다. 대표적인 방법으로서는, (1)체액을 꺼내 백 등에 저류시키고, 이것을 흡착재에 혼합해서 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체를 흡착한 후, 흡착재를 여과하여 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체의 제거된 체액을 얻는 방법, (2)체액의 입구와 출구를 가지고, 출구에 체액은 통과시키지만 흡착재는 통과시키지 않는 필터를 장착한 용기에 흡착재를 충전하고, 이것에 체액을 흐르게 하는 방법 등이 있다. 어느 방법을 이용해도 좋지만, 후자의 방법은 조작도 간단하고, 또 체외 순환로에 설치함으로써,환자의 체액으로부터 효율적으로 온라인으로 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체를 제거하는 것이 가능해서 본 발명의 흡착재는 이 방법에 적합하다.

본 발명의 흡착기는 액체 유입구 및 유출구를 가지고, 또한 1개 이상의 필터를 가지는 용기 내에 본 발명의 흡착재를 충전시키는 것을 특징으로 한다.

다음에 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체를 흡착하는 상기 흡착재를 이용한 본 발명의 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체의 흡착기를, 그 개략 단면도에 근거해서 설명한다.

도 2 중에 나타내는 흡착기(7)는, 액체의 유입구(1), 액체의 유출구(2), 본 발명의 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체의 흡착재(3), 액체 및 액체에 포함되는 성분은 통과할 수 있지만 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체의 흡착재는 통과할 수 없는 필터(4 및 5) 및 컬럼(6)을 가진다.

이 용기의 형상 및 재질에 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는 예를 들면 용량 20 내지 400㎖정도, 지름 2 내지 10㎝정도의 통모양 용기를 이용할 수 있다.

상기 필터로서는, 액체 및 액체에 포함되는 성분은 통과할 수 있지만 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체의 흡착수는 통과할 수 없는 것이면, 특별히 제한되지 않는다.

하기 실시예에 의해 본 발명을 더욱 자세하게 설명하는데, 본 발명은 하기 실시예만으로 한정되지 않는다. 또한, 본 명세서에 있어서는, 각종 아미노산 잔기를 다음 약호로 기재한다. Ala;L-알라닌 잔기, Arg;L-아르기닌 잔기, Asp;L-아스파르트산 잔기, Asn;L-아스파라긴 잔기, Cys;L-시스테인 잔기, Gln:L-글루타민 잔기, Glu;L-글루탐산 잔기, Gly;L-글리신 잔기, His;L-히스티딘 잔기, Ile;L-이소로이신 잔기, Leu;L-루신 잔기, Lys;L-리신 잔기, Met;L-메티오닌 잔기, Phe;L-페닐알라닌 잔기, Pro;L-프롤린 잔기, Ser;L-세린 잔기, Thr;L-트레오닌 잔기, Trp;L-트립토판 잔기, Tyr;L-티로신 잔기, Val:L-발린 잔기.

또 본 명세서에 있어서는 펩티드의 아미노산 서열을, 그 아미노 말단(이하 N말단이라고 한다)이 좌측에 위치하고, 카르복실 말단(이하 C말단이라고 한다)이 오른쪽에 위치하도록 통상의 방식에 따라서 기술한다.

(실시예 1)

다공질 담체(Kac)에의 IgG 결합 단백질(C36)의 고정화

·C36 펩티드의 생산

서열표의 서열번호 8의 C36 펩티드를 코드하는 DNA를, pUCNT 벡터(W094/03613공보)에 5'측을 NdeI, 3'측을 Hind III의 각각 제한 효소 부위를 이용해서 연결할 수 있도록 서열표의 서열번호 9로서 설계, 합성했다.

서열번호 9를 가지는 DNA를, 제한 효소 Nde I 및 Hind III(다까라주조사제)절단으로 개열(開裂)한 pUCNT 벡터와, DNA Ligation Kit Ver. 2(다까라주조사제)를 이용해서 그 취급 설명서에 따라서 연결하여 pUCNT-C36 벡터를 제작했다. DNA Ligation Kit Ver.1(다까라주조사제)을 이용해서 상기 취급 설명서에 따라 이 pUCNT-C36 벡터를 대장균 HB1O1주(후나코시판)에 도입하고, 항생 물질 안피시린에 대한 저항성을 지표로 하여 형질 전환체를 선택했다. 또한, 이 형질 전환체로부터 Flexi Prep(등록상표)(Amersham 파머시아 Biotech사제)을 이용해서 상기 취급 설명서에 따라 플러스미드 DNA를 추출, 시퀀싱함으로써 pUCNT-C36 벡터가 고안된 DNA서열을 가지고 있는 것을 확인했다.

다음에 이 형질 전환체를 6L의 L-브로스(5g/L NaCl, 10g/L 박토트립신, 5g/L 효모 추출물) 중에서 37℃에서 20시간 진탕 배양하고, 균체를 원심분리(히타찌 RPR9-2 로터를 이용해서 4℃에서 6000rpm, 20분간)로 회수했다. 여기에서 얻어진 침전을 300㎖의 TE 완충액(20mM Tris-HCl, 1mM EDTA:PH7.5)에 현탁한 뒤에, 초음파 파쇄처리(BRANSON250을 이용해서 얼음중에서 6분간 3회)를 실시하고, 원심분리(히타찌 RPR16 로터를 이용해서 4℃에서 15000rpm, 20분간)로 상징액을 회수했다. 여기서 얻어진 상징액에 대해서, 70℃, 10분간의 열처리를 한 후, 다시 원심분리(히타찌 RPR16 로터를 이용해서 4℃에서 15000rpm, 20분간)로 그 상징액 300㎖를 회수했다. 본 상징액으로부터 고속 액체 크로마토그래피(컬럼:일본 오터즈사제 μBondasphere C18)을 이용해서 40㎖의 아세토니트릴 용액을 유속 5㎖/min으로 흘려 보내서 컬럼을 활성화한 후, 300㎖의 샘플을 동 유속으로 흐르게 하고, 0.1% TFA+64% 아세토니트릴 용액 200㎖으로 컬럼을 세정, 계속해서 0.1% TFA(트리플루오로 아세트산)+40% 아세토니트릴 용액 200㎖으로 목적하는 C36 펩티드를 용출, 분취 했다. 이것을 증발기로 100㎖로 농축한 뒤에 동결 건조하여 고순도 정제 샘플을 취득했다.

·셀룰로오스 겔의 에폭시화

셀룰로오스계 다공질 경질 겔에서 구상 단백질의 배제 한계 분자량 500만 이상의 당사 시험 제품 Kac 겔 90㎖에 물을 가하여 총 양을 180㎖로 한 후, 2N 수산화나트륨 60㎖를 가하여 40℃로 했다. 여기에 에피클로로히드린 21㎖을 가하고, 40℃로 교반하면서 2시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 충분히 물로 세정하여 에폭시 활성화 Kac 겔을 얻었다.

·C36 펩티드의 고정화

C36 펩티드 10㎎을 0.05M 붕산 완충액(pH1O) 0.5㎖에 용해하고, 0.01N 수산화나트륨 수용액을 가하여 pH1O으로 재조정, 총 양을 1.0㎖로 했다(C36 펩티드 용액). 상기 에폭시 활성화 Kac 겔 1㎖에 펩티드 용액(전량)을 가하고, 37℃로 16시간 진탕한 후, 충분량의 PBS(150mM 염화나트륨을 포함하는 10mM 인산 완충액)로 세정하여 Kac-C36을 얻었다.

(실시예 2)

다공질 담체(Sephacryl S1000)에의 IgG 결합 단백질(B04)의 고정화

·B04 펩티드의 생산

서열표의 서열번호 10에 나타내는 펩티드의 합성을, 펩티드 신디사이저 Model 4170형(파머시아 LKB사제)을 이용해서 고상 합성법으로 하기와 같이 했다.C말단의 글루타민을 결합한 지지체인 Fmoc-글루타민 NovaSyn KA 0.1m㏖(파머시아 LKB사제)을 이용해서 상기 펩티드 신디사이저에 입력되어 있는 합성 프로그램에 의해, N말단의 방향을 향해서 순서대로 탈보호기 반응 및 축합반응을 반복해서 펩티드쇄을 연장했다. 즉, 피페리딘에 의해 상기 아미노산이 가지는 α-아미노기의 보호기인 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기(이하 Fmoc라고 한다)의 제거를 행하고, N'N-디메틸포름아미드(이하 DMF라고 한다)로 세정하고, 2-(1h-벤조트리아졸-1-일) -1,1,3,3-테트라메틸우로늄테트라플루오로보레트와 N'N-디이소프로필에틸아민으로 축합반응을 행하고, DMF로 세정하는 조작을 반복했다. 아미노산은 moc-L-Ala, Fmoc-L-Asn(Trt), Fmoc-L-Asp(OtBu), Fmoc-L-Cys(Trt), Fmoc-L-Gln(Trt), Fmoc-L-Glu(OtBu), Fmoc-L-Gly, Fmoc-L-Ile, Fmoc-L-Leu, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-L-Phe, Fmoc-L-Thr(tBu), Fmoc-L-Trp, Fmoc-L-Tyr(tBu), Fmoc-L-Val로서 이용하고, 그것들의 사용량을 기질에 대해서 약 5배몰(0.5m㏖)양으로 하여 바이알 중에서 이용했다.(여기에서, Trt, tBu, Boc 및 OtBu는 각각 트리틸기, 제3부틸에스테르, 제3부틸옥시카르보닐기 및 O-제3부틸기를 나타낸다.)

·탈보호기 반응 및 펩티드쇄의 절단

전체 아미노산에 관한 반응조작이 종료한 뒤, 얻어진 지지체를 3G-3구멍의 유리 필터 위에서, tert-아밀알코올, 아세트산 및 디에틸에테르를 이용해서 순차 세정하고, 이어서 진공 건조함으로써 건조 지지체를 얻었다. 바이알 중에서, 얻어진 지지체 1g에, 트리플루오로아세트산(이하 TFA라고 한다) 20㎖, 1,2-에탄디티올 260㎕ 및 아니솔 780㎕를 가하고 실온에서 1.5시간 교반했다. 그 후, 이 혼합물을3G-3구멍의 유리 필터로 지지체와 여별하고, 이 여액을 35℃로 감압 농축했다. 여기에 미리 냉각해 둔 무수 디에틸에테르를 침전이 나타나지 않게 될 때까지 가해서 교반하고, 이어서 원심분리하여 조(粗) 펩티드 펠릿을 수집했다. 다시 이 조 펩티드를 무수디에틸에테르로 수회 세정한 후, 감압 하에서 건조시켜 목적으로 하는 반정제된 펩티드를 얻었다.

·펩티드의 정제

상기 조정제 펩티드를 0.1% TFA에 용해시키고, 3000rpm으로 고속 원심분리한 후 상징액을, 0.45㎛의 막 필터로 여과하고, 얻어진 여액을 고속 액체 크로마토그래피에 제공했다. HPLC는, ModelLC-10A 시스템(시마즈제작소제)을 이용하고, 컬럼은 역상 μBondasphere C18(일본 오터즈사제)을 이용했다. 이동상에는 A액으로서 0.1% TFA 수용액을, B액으로서 0.1% TFA 포함하는 80%(v/v) 아세토니트릴/물을 이용해서 A액에서 B액으로의 농도 직선 구배에 의해 용출시켰다. 얻어진 크로마토그래피의 상당 분획을 분취했다. 분취를 수회 반복하고 이것을 동결건조시켜 정제 펩티드를 얻었다. 얻어진 펩티드는 기상 단백질 서열분석기 477A형(어플라이드 바이오 시스템즈사제) 및 히타찌 커스텀 이온교환 수지를 이용한 아미노산분석에 의해 해석하여, 후술에 기재하는 서열표의 서열번호 10에 나타내는 아미노산 서열의 펩티드를 얻을 수 있는 것을 확인했다.

·Sephacryl S1000의 에폭시 활성화

다공질 경질 겔로 세공경이 400nm인 Sephacryl S1000(아머샴 파머시아 바이오테크사제:구상 단백질의 배제 한계 분자량 약 800만) 90㎖에 물을 가해 총 양을180㎖로 한 후, 2N 수산화나트륨 60㎖를 가하고 40℃로 했다. 여기에 에피클로로히드린 21㎖를 가하고, 40℃로 교반하 2시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 충분히 수세하여 에폭시 활성화 Sephacryl S1000을 얻었다.

·B04 펩티드의 고정화

실시예 1의 C36 펩티드 10㎎을 B04 펩티드 30㎎로 바꾸고, 에폭시 활성화 Kac 겔을 에폭시 활성화 Sephacryl S1000 겔로 바꾼 것 외에는, 실시예 1과 완전히 동일하게 조작을 행하여 B04 펩티드를 고정화한 Sephacryl S1000-B04를 얻었다.

(실시예 3)

다공질 담체(GCL 2000m)에의 IgG 결합 단백질(C04)의 고정화

·C04 펩티드의 생산

서열표의 서열번호 11의 C04 펩티드를 코드하는 DNA를, 서열표의 서열번호 12로 나타내는 바와 같이 설계하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 합성하여 pUCNT 벡터에 연결할 수 있도록 했다.

실시예 1과 동일한 방법으로 서열번호 12의 서열을 가지는 DNA를 pUCNT 벡터에 도입하여 PUcNT-co4 벡터를 제작했다.

다시 실시예 1과 동일한 방법으로 대장균의 형질 전환체를 제작, 그의 6L 배양을 거쳐 목적하는 C04 펩티드의 고순도 정제 샘플을 취득해서 각종 연구에 사용했다.

·GCL 2000m의 에폭시화

셀룰로오스계 다공질 경질 겔인 GCL 2000In(짓소(주)제:구상 단백질의 배제한계 분자량 300만) 90㎖에 물을 가하여 전량을 180㎖로 한 후, 2N 수산화나트륨 60㎖를 가하고 40℃로 했다. 이것에 에피클로로히드린 21㎖을 가하고 40℃로 교반하, 2시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 충분히 물로 세정하여 에폭시 활성화 GCL 2000m를 얻었다.

·C04 펩티드의 고정화

실시예 1의 C36 펩티드를 C04로 바꾸고, 에폭시 활성화 Kac 겔을 에폭시 활성화 GCL 2000m 겔로 바꾼 것 외에는, 실시예 1과 완전히 동일하게 조작을 하여 C04 펩티드를 고정화한 GCL 2000m-C04를 얻었다.

(실시예 4)

다공질 담체(CNBr 활성화 Sepharose 4B)에의 IgG 결합 단백질(C15)의 고정화

·C15 펩티드의 생산

서열표의 서열번호 13의 펩티드C15를 코드하는 DNA를, 서열표의 서열번호 14로 나타내는 바와 같이 설계하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 합성하여 pUCNT 벡터에 연결할 수 있도록 했다.

서열번호 14의 서열을 가지는 DNA를 실시예 1과 동일한 방법으로 pUCNT 벡터에 도입하여 pUCNT-C15벡터를 제작했다.

다시 실시예 1과 동일한 방법으로 대장균의 형질 전환체를 제작, 그의 6L 배양을 거쳐서 목적하는 C15 펩티드의 고순도 정제 샘플을 취득하여 각종 검토에 사용했다.

·C15 펩티드의 고정화

CNBr 활성화 Sepharose 4B(아머샴 파머시아 바이오테크사제:구상 단백질의 배제 한계 분자량 약 2000만) 1g을 1mM 염산 수용액 소량으로 15분간 팽창시켜 1mM염산수용액으로 세정하고, 다시 커플링 완충액(0.5M 염화나트륨, 0.1M 염화수소나트륨, pH 8.3)로 세정했다. 커플링 완충액 1㎖에 C15 펩티드 10㎎ 용해시키고, 상기 세정 겔을 첨가해서 4℃로 16시간 반응시켰다. 커플링 완충액으로 세정 후, 블록 버퍼(0.2M 글리신, 0.5M 염화나트륨, 0.1M 염화수소나트륨, pH 8.3)를 첨가하고 실온에서 2시간 반응시켰다. 2종류의 후처리 버퍼(0.5M 염화나트륨, 0.1M 아세트산 -아세트산 나트륨 완충액, pH4.0;0.5M 염화나트륨, 0.1M 트리스-염산 완충액, pH 8.0)로 교대로 3회씩 세정하여 Sepharose 4B-C15를 얻었다.

(실시예 5)

다공질 담체(토레실 토요펄(도소 주식회사제:구상 단백질의 배제 한계 분자량 약500만))에의 IgG 결합 단백질(C24)의 고정화

·C24 펩티드의 생산

서열표의 서열번호 15의 C24 펩티드를 코드하는 DNA를, 서열번호 16로 나타내는 바와 같이 설계하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 합성하여 pUCNT 벡터에 연결할 수 있게 했다.

서열번호 16의 서열을 가지는 DNA를 실시예 1과 동일한 방법으로 pUCNT 벡터에 도입하여 pUCNT-C24 벡터를 제작했다.

다시 실시예 1과 동일한 방법으로 대장균의 형질 전환체를 제작, 그의 6L 배양을 거쳐 목적하는 C24 펩티드의 고순도 정제 샘플을 취득하여 각종 검토에 사용했다.

·C24 펩티드의 고정화

C24 펩티드5㎎을 커플링 샘플(0.5M 염화나트륨, 0.1M 탄산 완충액, pH8.3) 1㎖에 용해시키고, AF-토레실 토요펄 650을 건조상태로 200㎎ 첨가하고 4℃로 철야 반응시켰다. 0.5M 염화나트륨 수용액으로 세정 후, 블록 버퍼(O.5M 염화나트륨, 0.1M 트리스-염산 완충액, pH8.0)를 첨가하고 실온에서 2시간 반응시켰다. 다시 0.5M 염화나트륨 수용액으로 세정하여 토요펄 C24를 얻었다.

(실시예 6)

다공질 담체(Sepharose 6B)에의 IgG 결합 단백질(C36)의 고정화

·Sepharose 6B의 에폭시화

아가로오스계 비즈상 겔인 Sepharose 6B(아머샴 파머시아 바이오테크사제:구상 단백질의 배제 한계 분자량 약 400만) 90㎖에 물을 가하여 전량을 180㎖로 한 후, 2N 수산화나트륨 60㎖를 가하고 40℃로 했다. 이것에 에피클로로히드린 21㎖를 가하고 40℃로 교반하에서 2시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 충분히 수세하여 에폭시 활성화 Sepharose 6B 겔을 얻었다.

·C36 펩티드의 고정화

실시예 1의 에폭시 활성화 Kac 겔을 에폭시 활성화 Sepharose 6B로 바꾼 것 외에는, 실시예 1과 완전히 동일한 방법으로 C36 펩티드를 고정화한 Sepharose 6B-C36을 얻었다.

(비교예 1)

다공질 담체(GCL 2000m)에의 IgG 결합 단백질(프로테인 G)의 고정화

·프로테인 G의 고정화

실시예 1의 C36 펩티드 10㎎을 프로테인 G(시그마사제) 4mg으로 바꾸고, 에폭시 활성화 Kac 겔을 실시예 3에 있어서 제작한 에폭시 활성화 GCL 2000m 겔로 바꾼 것 외에는, 실시예 1과 완전히 동일한 방법으로 프로테인 G를 고정화한 GCL 2000m-프로테인 G를 얻었다.

(비교예 2)

다공질 담체(Kac)에의 IgG 결합 단백질(프로테인 A)의 고정화

·프로테인 A의 고정화

실시예 1의 C36 펩티드 1Omg을 프로테인 A(시그마사제) 4mg로 바꾼 것 외에는, 실시예 1과 완전히 동일한 방법으로 프로테인 A를 고정화한 Kac-프로테인 A를 얻었다.

(비교예 3)

다공질 담체(Sepharose 6B)에의 IgG 결합성 펩티드(MG56)의 고정화

·MG56 펩티드의 생산

N말단측에 메티오닌을 부가한 프로테인 G C3 도메인의 57잔기를 포함하는 서열을 가지는 펩티드(서열표의 서열번호 17)를 코드하는 DNA를, 서열번호 18로 나타내는 바와 같이 설계하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 합성하여 pUCNT 벡터에 연결할 수 있게 했다.

실시예 1과 동일한 방법으로 서열번호 18의 서열을 가지는 DNA를 pUCNT 벡터에 도입하여 pUCNT-MG56 벡터를 제작했다.

다시 실시예 1과 동일한 방법으로 대장균의 형질 전환체를 제작, 그것을 6L 배양하여 목적 MG56 펩티드의 고순도 정제 샘플을 취득하고 각종 검토에 사용했다.

·펩티드의 고정화

상기 펩티드를, 다공질 세파로오스 위에 고정화함으로써 이하와 같이 해서 흡착제를 제조했다. 세파로오스에는, 티오프로필세파로오스 6B(아머샴 파머시아 바이오테크사제)를 이용했다. 티오프로필세파로오스 6B 50㎎에 증류수 50㎖를 가하고, 실온에서 15분간 방치하여 수지를 팽윤시켰다. 그 다음에 증류물을 제거하고, 0.5M NaCl을 포함하는 0.1M 트리스 염산(pH7.5) 커플링 완충액에 치환했다.

한편, 0.5M NaCl을 포함하는 0.1M 트리스 염산(pH7.5) 커플링 완충액 400㎕에 상기 정제 펩티드 4㎎을 용해시키고, 팽윤시킨 상기 티오프로필세파로오스 6B 150㎕)를 가하고, 4℃로 12시간 교반한 후, 충분량의 PBS(150mM 염화나트륨을 포함하는 10mM 인산 완충액, pH7.5)로 세정함으로써 Sepharose 6B-MG56을 얻었다.

(실시예 7)

합성한 흡착재의 IgG 흡착능력 평가

실시예 3에 있어서 합성한 흡착재 GCL 2000m-C04 및 비교예 1에 있어서 합성한 흡착재 GCL 2000m-프로테인 G 각 0.5㎖에의 코발트 60 감마선 조사(25KGy, 3시간)에 의한 멸균을, 코가 아이소토프 주식회사에 의뢰해서 했다.

각 흡착재 100㎕를 바이알 중에 채취하고, 건강한 인간의 혈청 300㎕를 가하고, 37℃로 2시간 진탕하여 흡착반응을 행했다. 이 현탁액에 대해서 5,000rpm으로1분간 원심분리를 행하여 상징액중의 IgG 농도의 측정을 시오노기 바이오메티컬 실험실에 검사 의뢰해서 실시했다.

대조실험으로서 흡착재 대신에 생리 식염수 100㎕를 바이알 중에 채취하고, 상기와 동일한 처리를 한 후 용액중의 IgG 농도를 구했다.

IgG의 흡착율(%)은 하기 식에 의해 산출했다. 결과를 표 1에 나타낸다.

흡착율(%)={(V1r-V1t/V1r)}×100

V1r:대조 실험용액 중의 IgG 농도

V1t:흡착실험 상징액 중의 IgG 농도

	흡착제	멸균전 IgG 흡착율(%)	멸균후 IgG 흡착율(%)
실시예 3	GCL 2000m-C04	97.1	90.2
비교예 1	GCL 2000m-프로테인 G	98.6	59.8

(실시예 8)

합성한 흡착재의 β1 아드레노셉터 항체 흡착능력 평가

실시예 1에 있어서 합성한 흡착재 Kac-C36 및 비교예 2에 있어서 합성한 흡착재 Kac-프로테인 A 각 0.5㎖에 대한 코발트60 감마선 조사(25KGy, 3시간)에 의한 멸균을, 코가 아이소토프 주식회사에 의뢰해서 실시했다.

각 흡착재 100㎕를 바이알 중에 채취하여 β 1 아드레노셉터에 대한 항체가 양성인 확장형 심근증 환자 혈청 300㎕를 가하고, 37℃로 2시간 진탕하여 흡착반응을 행했다. 이 현탁액에 대해서 5,000rpm으로 1분간 원심분리를 행하고, 상징액중의 β1 아드레노셉터 항체가를 ELISA법으로 측정했다. 자세한 ELISA법의 내용을하기에 나타낸다.

구라보 방적 주식회사에 의해 위탁 합성된 β1 아드레노셉터의 2번째 루프 부분 펩티드(서열번호 19) 용액 50㎍/㎖를 ELISA 플레이트에 50㎕ 첨가하고 4℃에서 하룻밤 방치했다. 플레이트 세정 후, 스킴밀크(디프코사제) 용액을 100㎕ 첨가하고, 실온에서 1시간 정치(靜置)했다. 플레이트 세정 후, 시험 샘플(전술한 상징액을 10배 희석한 것)를 50㎕ 첨가하고 4℃에서 하룻밤 방치했다. 플레이트 세정 후, 바이오틴 표식 항 인간 IgG항체(사잔 바이오테크놀로지사제) 용액을 100㎕ 첨가하고 실온에서 1시간 정치(靜置)했다. 플레이트 세정 후, 기질용액을 100㎕ 첨가하고, 실온에서 30분 정치(靜置) 후, 405nm에 있어서의 흡광도를 측정했다. 전술의 검체 대신에 확장형 심근증 환자 혈청을 이용한 흡광도(흡착능력 0% 상당)와 건강한 정상인 혈청을 이용한 흡광도(흡착능력 100% 상당)로부터, β1 아드레노셉터에 대한 흡착능력을 산출했다. 결과를 표 2에 나타낸다.

	흡착체	β1 아드레노셉터 항체 흡착율(%)
실시예 1	Kac-C36	77.8
비교예 2	Kac-프로테인 A	52.5

(실시예 9)

합성한 흡착재의 류머티즘 인자 흡착능력 평가

실시예 6에 있어서 합성한 흡착재 Sepharose 6B-C36 및 비교예 3에 있어서 합성한 흡착재 Sepharose 6B-MG56 각 0.5㎖에 대한 코발트60 감마선 조사(25KGy, 3시간)에 의한 멸균을 코가 아이소토프 주식회사에 의뢰해서 실시했다.

각 흡착재 100㎕를 바이알 중에 채취하고, 류머티즘 환자 혈청 600㎕를 가하고, 37℃로 2시간 진탕하여 흡착반응을 행했다. 이 현탁액을 5,000rpm으로 1분간원심분리를 행하고, 상징액중의 류머티즘 인자 농도의 농도측정을 시오노기 바이오메티컬 실험실에 검사 의뢰해서 실시했다.

대조실험으로서, 흡착재 대신에 생리 식염수 100㎕를 바이알 중에 채취하여 상기와 동일한 처리를 한 후, 용액중의 류머티즘 인자 농도를 구했다.

류머티즘 인자의 흡착율(%)은 하기 식에 의해 산출했다. 결과를 표 3에 나타낸다.

흡착율(%)={(V2r-V2t/V2r)}×100

V2r:대조 실험용액 중의 류머티즘 인자 농도

V2t:흡착실험 상징액 중의 류머티즘 인자 농도

	흡착체	류머티즘 인자 흡착율(%)
실시예 6	Sepharose 6B-C36	56.3
비교예 3	Sepbarose 6B-MG56	34.4

(실시예 10)

합성한 흡착재의 면역 복합체 흡착능력 평가

실시예 2, 4, 5에 있어서 합성한 흡착재 Sephacryl S1000-B04, Sepharose 4B-C15, 토요펄 C24 각각 0.5㎖에 대한 코발트60 감마선 조사(25KGy, 3시간)에 의한 멸균을 코가 아이소토프 주식회사에 의뢰해서 실시했다.

면역 복합체는, 인간 IgG용액(10㎎/㎖)을 63℃로 15분간 가열함으로써 제조했다.

각 흡착재 100㎕를 바이알 중에 채취하고, 20㎍/㎖가 되도록 앞서의 면역 복합체 용액을 첨가한 인간 건강한 정상인 혈청 300㎕를 가하고, 37℃로 2시간 진탕하여 흡착반응을 행했다. 이 현탁액에 대해서 5,000rpm으로 1분간 원심분리를 행하고, 후지레비오 주식회사제 프레라이저 C1q-CIC 키트를 이용해서 상징액중의 면역 복합체 농도를 측정했다.

대조실험으로서, 흡착재 대신에 생리 식염수 100㎕를 바이알 중에 채취하고, 상기와 동일한 처리를 한 후, 용액중의 면역 복합체 농도를 구했다.

면역 복합체의 흡착율(%)은, 하기 식에 의해 산출했다. 결과를 표 4에 나타낸다.

흡착율(%)={(V3r-V3t/V3r)}×1OO

V3r:대조 실험용액 중의 면역 복합체 농도

V3t:흡착 실험 상징액중의 면역 복합체 농도

	흡착체	멸균전 면역 복합체 흡착율(%)	멸균후 면역 복합체 흡착율(%)
실시예 2	Sephacryl S1000-B04	92.4	91.6
실시예 4	Sepbarose 4B-C15	85.2	84.1
실시예 5	토요펄 C24	81.5	80.5

(실시예 11)

합성한 흡착재의 IgG 흡착능력 평가

실시예 1과 동일한 방법으로 덱스트란계의 비즈상 겔인 Sephadex G-150(아머샴 파머시아 바이오테크사제:구상 단백질의 배제 한계 분자량 약 30만)의 에폭시화를 실시하여 C36 펩티드를 고정화함으로써 흡착재 Sephadex G-150-C36을 합성했다. 흡착재 Sphadex G-150-C36과 펩티드를 고정하지 않은 Sephadex G-150 각 0.5㎖에 대한 코발트60 감마선 조사(25KGy, 3시간)에 의한 멸균을 코가 아이소토프 주식회사에 의뢰해서 실시했다.

흡착실험은 실시예 7와 동일한 방법으로 실시했다. 결과를 표 5에 나타낸다.

	흡착체	IgG 흡착율(%)
실시예 11	Sephadex G-150-C36	59.7
(대조)	Sephadex G-150	2.1

본 발명에 따르면 상기 기재로부터 명백한 바와 같이, 체액 중에 존재하는 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체를 선택적으로 흡착하는 능력을 가지는 신규 펩티드, 해당 펩티드를 합성하기 위한 재조합 DNA, 해당 DNA를 함유하는 미생물 및 상기 펩티드로부터 신규의 흡착재가 제공된다. 또한, 상기 흡착재를 충전해서 이루어지는 체액처리장치를 이용함으로써 혈액, 혈장, 혈청 등의 피처리액중의 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체를 선택적으로 제거하는 것이 가능하다.

Claims

서열표의 서열번호 1로 나타낸 하기 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체에 친화성을 가지는 펩티드.

Thr Thr Tyr Lys Leu Val

Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr

Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala

Glu Arg Ala Phe Arg XO1 Tyr Ala X02 Asp

Asn Gly Val X03 Gly X04 Trp Thr Tyr Asp

Pro Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu

Cys

단,

X01:Asn, Lys 또는 Gln

X02:Thr 또는 Asn

X03:Glu 또는 Asp

X04:Leu, Val, Ile 또는 Met
서열표의 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열 중 1개 이상을 코드하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
제2항에 있어서, 서열표의 서열번호 2로 나타내는 염기 서열 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
서열표의 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 하나 이상 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA.
제4항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 서열표의 서열번호 2로 나타내는 염기 서열 중 1개 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA.
제4항 또는 제5항에 있어서, 플라스미드 또는 파지인 것을 특징으로 하는 재조합 DNA.
서열표의 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 하나 이상 가지는 재조합 DNA를 1개 이상 함유하는 것을 특징으로 하는 미생물.
제7항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 서열표의 서열번호 2로 나타내는 염기 서열 중 1개 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물.
서열표의 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열 중 1개 이상을 함유하고, 또한, 70개 이하의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드가 고정된 수불용성 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체에 대한 흡착재.
제9항에 있어서, 펩티드가 열 안정성이 뛰어난 펩티드인 것을 특징으로 하는 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체에 대한 흡착재.
제9항에 있어서, 수불용성 담체가 다공질인 것을 특징으로 하는 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체에 대한 흡착재.
제9항에 있어서, 수불용성 담체가 친수성인 것을 특징으로 하는 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체에 대한 흡착재.
제11항에 있어서, 수불용성 담체의 배제 한계 분자량이 15만 이상인 것을 특징으로 하는 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체에 대한 흡착재.
제9항 기재의 흡착재와, 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체를 포함하는 체액을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 체액 중의 면역 글로블린 및(또는) 면역 복합체의 흡착방법.
액체 유입구 및 유출구를 가지고, 또한 1개 이상의 필터를 가지는 용기 내에제9항 기재의 흡착재가 충전되어 있는 것을 특징으로 하는 흡착기.