MX2008011054A

MX2008011054A - Prolongacion de supervivencia de un aloinjerto, mediante la inhibicion de actividad de complemento.

Info

Publication number: MX2008011054A
Application number: MX2008011054A
Authority: MX
Inventors: Russell P Rother; Hao Wang; Zhen Zhong
Original assignee: Alexion Pharma Inc
Priority date: 2006-03-02
Filing date: 2007-03-02
Publication date: 2009-03-03
Also published as: RU2445975C2; ES2530637T3; RS53864B1; PL1988882T3; PT1988882E; JP2013155202A; CN101437501B; EP2918269A1; HRP20150182T1; EP1988882A2; CA2644020A1; KR20140124023A; RU2008139118A; JP2009528369A; DK1988882T3; AU2007224250B2; BRPI0708424A2; NZ570802A; US20100135992A1; EP1988882B1

Abstract

Se presentan métodos para prolongar la supervivencia de células, tejidos u órganos alotransplantados. Estos métodos se dirigen a administrar al receptor de aloinjerto un inhibidor de actividad de complemento junto con uno o más inmunosupresores y/o métodos de inmunosupresión. El inhibidor de la actividad de complemento se administra en forma crónica. Estos métodos han sido determinados para ayudar a prevenir el rechazo crónico de los aloinjertos. Estos métodos pueden ser utilizados adicionalmente en casos en los cuales el receptor ha sido sensibilizado previamente al aloinjerto, o en donde existe un desacoplamiento ABO entre el aloinjerto y el receptor.

Description

PROLONGACIÓN DE SUPERVIVENCIA DE UN ALOIN JERTO MEDIANTE LA INHIBICIÓN DE ACTIVIDAD DE COMPLEMENTO Solicitud Relacionada La presente solicitud reclama el beneficio y la prioridad de la solicitud de patente provisional norteamericana número 60/778,859 presentada el 2 de marzo del 2006, cuya descripción total está incorporada a la presente invención como referencia. Campo de la Invención La presente descripción se refiere a métodos para prolongar la supervivencia de un aloinjerto en un mamífero. En particular, la presente descripción se refiere a prolongar la supervivencia de un aloinjerto administrando un inhibidor de complemento o formación de complemento terminal, especialmente un inhibidor de disociación de complemento C5, además de uno o más fármacos o métodos que t son inmunosupresores. Antecedentes de la Invención El transplante de órganos es el tratamiento preferido para la mayor parte de los pacientes con falla de órganos crónica. Aunque el trasplante de riñon, hígado, pulmón y corazón ofrece una excelente oportunidad de rehabilitación, conforme los receptores regresan a un estilo de vida más normal, están limitados por la capacidad de adaptación médica/quirúrgica de los receptorés potenciales, una escasez cada vez mayor de donantes y la falla prematura de la función del órgano transplantado. El transplante de células, tejidos y órganos se ha vuelto muy común, y con frecuencia es un procedimiento para salvar la vida. El transplante de órganos es el tratamiento preferido para la mayoría de los pacientes con falla de órganos crónica. A pesar de la gran mejoría en tratamientos para inhibir el rechazo, el rechazo continúa siendo el impedimento mayor para un transplante de órganos exitoso. El rechazo incluye no únicamente rechazo agudo, sino también rechazo crónico. Los rangos de supervivencia de un año para ríñones transplantados promedian 88.3%, con ríñones de donantes fallecidos y 94.4% con ríñones recibidos de donantes vivos. Los rangos de supervivencia de 5 años correspondientes para los ríñones transplantados son de 63.3% y 76.5% (OPTN/SRTR Annual Report, 2002). Para hígados los rangos de supervivencia de un año son de 80.2% y 76.5% para hígados de donantes fallecidos y vivos, respectivamente. Los rangos de supervivencia de injerto de hígado de cinco años correspondiente son de 63.5% y 73.0% (OPTN/SRTR Annual Report, 2002). El uso de fármacos inmunosupresores, especialmente ciclosporina A, y más recientemente tacrolimus, ha mejorado en forma importante el rango de éxito del transplante de órganos, especialmente, evitando el rechazo agudo. Sin embargo tal como lo muestran los números anteriores, aún existe la necesidad de mejorar los rangos de éxito, tanto a corto plazo como especialmente a largo plazo. Tal como se puede apreciar a partir de los números anteriores para transplantes de riñon e hígado, los rangos de falla de cinco años para estos órganos transplantados son del orden de 25-35%. En el año del 2001 sólo hubieron más de 23,000 pacientes que recibieron un transplante de órganos, de los cuales aproximadamente 19,000 fueron de riñon o hígado (OPTN/SRTR Annual Report, 2002). Sólo para este año de transplantes, con las técnicas presentes se puede esperar que aproximadamente 5,000-6,000 de estos ríñones e hígados transplantados fallarán dentro de 5 años. Estos números no incluyen otros órganos transplantados o tejidos o células transplantadas tales como médula ósea. Existen múltiples tipos de transplantes. Estos se describen en la publicación de Abbas y asociados 2000. Un injerto transplantado de un individuo al mismo individuo es denominado un injerto antologo o autoinjerto. Un injerto transplantado entre dos individuos genéticamente idénticos o singenéticos es denominado un injerto singeneico. Un injerto transplantado entre dos individuos genéticamente diferentes de la misma especie, es denominado un injerto alogénico o aloinjerto. Un injerto transplantado entre individuos de diferente especie es denominado un injerto xenogeico o xenoinjerto. Las moléculas que se reconocen como extrañas en los aloinjertos, son denominadas aloantígenos y las que están en xenoinjertos, son denominadas xenoantígenos. Los linfocitos o anticuerpos que reaccionan con los aloantígenos o xenoantígenos, se describen como siendo a los reactivos o xenorreactivos, respectivamente. Normalmente más de 40,000 transplantes de riñon, corazón, pulmón, hígado y páncreas se llevan a cabo en los Estados Unidos cada año (Abbas y asociados, 2000). Otros posibles transplantes incluyen, pero no se limitan a tejido vascular, ojos, córneas, lentes, piel, médula ósea, músculos, tejido conectivo, tejido gastrointestinal, tejido nervioso, huesos, células madre, isletos, cartílagos, hepatocitos y células hematopoyéticas. Desafortunadamente, existen muchos más candidatos para un transplante, que los donantes disponibles. Para superar este inconveniente, se ha realizado un mayor esfuerzo para aprender a como utilizar los xenoinjertos. Aunque existe un progreso en este campo, el hecho es que actualmente la mayoría de los transplantes son aloinjertos. Un transplante alogeneico, aunque actualmente es más probable que tenga éxito que un transplante xenogeneico, debe de superar más obstáculos para que sea exitoso. Existen varios tipos de ataques inmunológicos realizados por el receptor contra el órgano donante, lo cual puede conducir el rechazo del aloinjerto. Estos incluyen rechazo hiperagudo, rechazo vascular agudo (incluyendo rechazo humoral acelerado y rechazo humoral agudo de novo) y rechazo crónico. El rechazo normalmente es un resultado de un ataque de anticuerpos humoral o transmitido por célula T, aunque puede incluir factores secundarios adicionales, tales como los efectos del complemento y citocinas. Una brecha siempre en crecimiento entre el número de pacientes que requieren transplante de órganos y el número de órganos de donantes disponibles, se ha vuelto un problema importante a nivel mundial. Park y asociados, 2003. Los individuos que han desarrollado anticuerpos anti-HLA se dice que están inmunizados o sensibilizados. Gloor, 2005. La sensibilización HLA es la barrera mayor para una utilización óptima de órganos de donantes vivos en transplantes clínicos (Warren y asociados, 2004) debido al desarrollo de rechazo transmitido por diversos anticuerpo (ABMR). Por ejemplo, más del 50% de todos los individuos que esperan un transplante de riñón son pacientes presensibilizados (Glotz y asociados, 2002) que tienen niveles elevados de aloanticuerpos ampliamente reactivos, que resultan de múltiples transfusiones, antes de los aloinjertos fallados, o embarazo (Kupiec-Weglinski, 1996). El papel de ABMR es actualmente una de las áreas de estudio más dinámicas en transplantes, debido al reconocimiento de que este tipo de rechazo puede conducir ya sea a pérdida aguda o crónica de la función del aloinjerto. Mehra y asociados, 2003. Numerosos casos de ABMR, incluyendo rechazo hiperagudo (HAR) o rechazo humoral acelerado (ACHR), han sido reportados, los cuales están caracterizados por lesión de aloinjerto aguda que es resistente a terapia potente anti-célula T, la detección de anticuerpos específicos donantes en la circulación y el depósito de componentes de complemento en el injerto. ABMR con aloanticuerpos en circulación elevados y activación de complemento que ocurre en el 20 a 30% de casos de rechazo agudo, tiene un peor pronóstico que el rechazo celular. Mauiyyedi y asociados, 2002. Los pacientes altamente presensibilizados, quienes exhiben altos niveles de aloanticuerpos, normalmente parecen de un HAR inmediato y agresivo. En la práctica clínica, con grandes esfuerzos y avances significativos en tecnología, se evita HAR obteniendo una correspondencia cruzada linfocitotóxica pretransplante para identificar pacientes sensibilizados con anticuerpos específicos para antígenos HLA del donante. Sin embargo, los anticuerpos en la circulación contra HLA del donante u otros antígenos endotelíales sin MHC también pueden ser responsables de una forma retardada de rechazo humoral agudo, lo cual está asociado con una incidencia incrementada de pérdida de injerto. Collins y asociados, 1999. Por consiguiente, el desarrollo de un modelo animal presensibilizado novedoso que mimetice ABMR en instalaciones clínicas, podría ser benéfico para estudios en el mecanismo, y para el progreso muy necesario, en el manejo del rechazo de aloinjerto en receptores presensibilizados.

Algunos pacientes altamente presensibilizados se pueden beneficiar de programas de intervención tales como inmunoabsorción (Palmer y asociados, 1989; Ross y asociados, 1993; Kriaa y asociados, 1995), plasmaferesis e inmunoglobulina intravenosa (Sonnenday y asociados, 2002; Rocha y asociados, 2003), que han sido diseñados e implementados para eliminar temporalmente los anticuerpos anti-donante. Sin embargo, además de sus beneficios, las terapias antes mencionadas llevan con ellas numerosos inconvenientes, ya que algunos individuos son menos susceptibles a sus efectos (Kriaa y asociados, 1995; Hakim y asociados, 1990; Glotz y asociados, 1993; Tyan y asociados, 1994); son extremadamente costosos, tardados y riesgosos (Salama y asociados, 2001). Además, el efecto temporal y variable de estos protocolos ha limitado su impacto Glotz y asociados, 2002; Kupin y asociados, 1991; Schweitzer y asociados, 2000. Por consiguiente, podría ser benéfico el desarrollo de estrategias novedosas para reducir el riesgo y costo en la prevención de ABMR para receptores presensibilizados que reciben un aloinjerto. Breve Descripción de la Invención Por consiguiente, se proporcionan métodos para prolongar la supervivencia de células, tejidos y órganos transplantados. En particular, se proporcionan métodos para prolongar la supervivencia de células, tejidos u órganos alotransplantados.

Estos métodos se dirigen al uso de uno o más métodos inmunosupresores y/o inmunosupresivos además de un inhibidor de la actividad de complemento. También se proporciona el uso de uno o más inmunosupresores y un inhibidor de la actividad de complemento en la fabricación de uno o más medicamentos o paquetes de medicamentos. Dichos medicamentos o paquetes de medicamento son útiles para prolongar la supervivencia de un aloinjerto en un mamífero. Los ejemplos de aloinjerto son células, tejidos u órganos alotransplantados e incluyen, pero no se limitan a tejido vascular, ojos, córnea, lentes, piel, médula ósea, músculos, tejido conectivo, tejido gastrointestinal, tejido nervioso, huesos, células madre, isletos, cartílagos, hepatocitos, células hematopoyéticas, corazón, hígado, pulmón, riñon, y páncreas. En ciertos aspectos, la descripción proporciona un método para prolongar la supervivencia de un aloinjerto de riñon en un mamífero receptor, en donde el método comprende administrar al mamífero a) un fármaco que inhibe la actividad de complemento e b) al menos una terapia inmunosupresora en donde la terapia seleccionada de i) al menos un fármacos inmunosupresor o ii) un tratamiento inmunomodulador. En ciertas modalidades, el mamífero es un humano. En ciertas modalidades, el aloinjerto es MHC incompatible. En ciertas modalidades, el aloinjerto MHC incompatible es un aloinjerto HLA incompatible. En ciertas modalidades, el receptor es ABO incompatible para el aloinjerto. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento inhibe la formación de C5b o C5a. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la formación de C5b o C5a es un anticuerpo completo o un fragmento de anticuerpo. En ciertas modalidades, el anticuerpo completo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado, quimerizado o desinmunizado o fragmento de anticuerpo. En ciertas modalidades, el anticuerpo completo o fragmento de anticuerpo inhibe la disociación del complemento C5. En ciertas modalidades, el fragmento de anticuerpo es seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo Fab, F'(ab')2, Fv, un anticuerpo de dominio y un anticuerpo de cadena simple. En ciertas modalidades, el fragmento de anticuerpo es pexelizumab. En ciertas modalidades, el anticuerpo completo es eculizumab. En ciertas modalidades, el eculizumab se administra en forma crónica. En ciertas modalidades, el eculizumab se administra una vez cada 2 semanas. En ciertas modalidades, el inhibidor de la actividad de complemento se selecciona del grupo que consiste en un i) receptor de complemento soluble, ii) CD59, iii) CD55, iv) CD46, y v) un anticuerpo para C5, C6, C7, C8 o C9. En ciertas modalidades, el fármaco inmunosupresor inhibe la actividad de célula T o actividad de célula B. En ciertas modalidades, el fármaco inmunosupresor inhibe la actividad de célula T y actividad de célula B. En ciertas modalidades, el fármaco inmunosupresor se selecciona del grupo que consiste en ciclosporina A, tacrolimus, sirolimus, OKT3, un corticosteroide, daclizumab, basiliximab, azatiopreno, mofetil de micofenolato, metotrexato', 6-mercaptopurina, anticuerpo anticélula T, ciclofosfamida, leflunamida, brequinar, ATG, ALG, 15-desoxispergualin, LFI 5-0195, CTLA-4-lg (belatacept), rituxan y bredinin. En ciertas modalidades, se administra más de un fármaco inmunosupresivo. En ciertas modalidades, el método comprende administrar i) un fármaco que inhibe la actividad de complemento y ii) ciclosporina A. En ciertas modalidades, el método comprende administrar i) un fármaco que inhibe la actividad de complemento y ii) LF15-0195. En ciertas modalidades, el método comprende administrar i) un fármaco que inhibe la actividad de complemento, ii) ciclosporina A, iii) LF15-0195. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento es un anticuerpo que inhibe la disociación del complemento C5. En ciertas modalidades, se utiliza un método de tratamiento inmunomodulador, por ejemplo, plasmaferesis, esplenectomía o inmunoabsorción, en combinación con un inhibidor de actividad del complemento. En ciertas modalidades, el aloinjerto sobrevive durante un tiempo al menos 20% mayor que si el del método se fuera llevar a cabo sin el fármaco que inhibe la actividad de complemento. En ciertas modalidades, el aloinjerto sobrevive durante un tiempo al menos el 40% mayor que si el método se llevara a cabo sin el fármaco que inhibe la actividad de complemento. En ciertas modalidades, el aloinjerto sobrevive durante el tiempo de vida restante del mamífero. En ciertas modalidades, el aloinjerto sobrevive durante al menos tres meses. En ciertas modalidades, el aloinjerto sobrevive durante al menos seis meses. En ciertas modalidades, el aloinjerto sobrevive durante al menos un año. En ciertas modalidades, el aloinjerto sobrevive durante al menos cinco años. En ciertas modalidades, el aloinjerto sobrevive durante el resto de la vida del humano. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 14 días. En ciertas "modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 28 días. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 3 meses. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra crónicamente durante al menos 6 meses. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 1 año. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 5 años. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante el resto de la vida del mamífero. En ciertas . modalidades, al menos un fármaco inmunosupresivo se administra en forma crónica durante el resto de la vida del mamífero. En ciertas modalidades, se administra al menos ciclosporina A en forma crónica el resto de la vida del mamífero. En ciertas modalidades, se administra al menos LF15-0195 en forma crónica el resto de la vida del mamífero. En ciertos aspectos, la descripción proporciona un método para prolongar la supervivencia de un aloinjerto de riñon en un mamífero receptor, en donde el método comprende administrar al mamífero a) un fármaco que inhibe la actividad de complemento y b) al menos una terapia inmunosupresiva en donde la terapia se selecciona de i) al menos un fármaco inmunosupresivo o ii) un tratamiento inmunomodulador, en donde el mamífero es presensibilizado para dicho aloinjerto. En ciertas modalidades, el mamífero es un humano. En ciertas modalidades, el aloinjerto es MHC desacoplado. En ciertas modalidades, el aloinjerto MHC incompatible es un aloinjerto HLA incompatible. En ciertas modalidades, el receptor es ABO incompatible para el aloinjerto. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica.

En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento inhibe la formación de C5b o C5a. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la formación de C5b o C5a es un anticuerpo total o un fragmento de anticuerpo. En ciertas modalidades, el anticuerpo total o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo humano humanizado quimerizado o desinmunizado o fragmento de anticuerpo. En ciertas modalidades, el anticuerpo total o fragmento de anticuerpo inhibe la disociación de complemento C5. En ciertas modalidades, el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo Fab, F'(ab')2, Fv, un anticuerpo de dominio y un anticuerpo de cadena simple. En ciertas modalidades, el fragmento de anticuerpo es pexelizumab. En ciertas modalidades, el anticuerpo completo es eculizumab. En ciertas modalidades, el eculizumab se administra en forma crónica. En ciertas modalidades, el eculizumab se administra una vez cada 2 semanas. En ciertas modalidades, el inhibidor de la actividad de complemento se selecciona del grupo que consiste en i) un receptor de complemento soluble, ii) CD59, iii) CD55, iv)CD46 y v) un anticuerpo para C5, C6, C7, C8 o C9. En ciertas modalidades, el fármaco inmunosupresor inhibe la actividad de célula T o actividad celular. En ciertas modalidades, el fármaco inmunosupresivo inhibe la actividad de célula T y actividad de célula B. En ciertas modalidades, el fármaco ¡nmunosupresor se selecciona del grupo que consiste en ciclosporina A, tacrolimus, sirolimus, OKT3, un corticosteroide, daclizumab, basiliximab, azatiopreno, mofetil de micofenolato, metotrexato, 6-mercaptopurina, anticuerpo anti-célula T, ciclofosfamida, leflunamida, brequinar, ATG, ALG, 15-desoxispergualin, LF15-0195, CTLA-4-lg (belatacept), rituxan y bredinin. En ciertas modalidades, se administra más de un fármaco inmunosupresivo. En ciertas modalidades, el método comprende administrar i) un fármaco que inhibe la actividad de complemento y ii) ciclosporina A. En ciertas modalidades, el método comprende administrar i) un fármaco que inhibe la actividad de complemento y ii) LF15-0195. En ciertas modalidades, el método comprende administrar i) un fármaco que inhibe la actividad de complemento, ii) ciclosporina A, iii) LF15-0195. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento es un anticuerpo que inhibe la disociación del complemento C5. En ciertas modalidades, se utiliza un método de tratamiento inmunomodulador, por ejemplo, plasmaferesis, esplenectomía o inmunoabsorción, en combinación con un inhibidor de actividad del complemento. En ciertas modalidades, en donde el animal es presensibilizado a un aloinjerto, el aloinjerto sobrevive durante un tiempo de al menos 20% más que si el método se llevara a cabo sin el fármaco que inhibe la actividad de complemento. En ciertas modalidades, el aloinjerto sobrevive durante un tiempo al menos el 40% mayor que si el método se llevara a cabo sin el fármaco que inhibe la actividad de complemento. En ciertas modalidades, el aloinjerto sobrevive durante el tiempo de vida restante del mamífero. En ciertas modalidades, el aloinjerto sobrevive durante al menos tres meses. En ciertas modalidades, el aloinjerto sobrevive durante al menos seis meses. En ciertas modalidades, el aloinjerto sobrevive durante al menos un año. En ciertas modalidades, el aloinjerto sobrevive durante al menos cinco años. En ciertas modalidades, el aloinjerto sobrevive durante el resto de la vida del humano. En ciertas modalidades, en donde un mamífero es presensibilizado a un aloinjerto, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 14 días. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 28 días. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 3 meses. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra crónicamente durante al menos 6 meses. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 1 año. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 5 años. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante el resto de la vida del mamífero. En ciertas modalidades, en donde un mamífero se presensibiliza a un aloinjerto, se administra en forma crónica al menos un fármaco inmunosupresivo durante el resto de vida del mamífero. En ciertas modalidades, se administra al menos ciclosporina A en forma crónica el resto de la vida del mamífero. En ciertas modalidades, se administra al menos LF15-0195 en forma crónica el resto de la vida del mamífero. En ciertos aspectos, la descripción proporciona el uso de un fármaco que inhibe la actividad de complemento de un fármaco inmunosupresivo en la fabricación de un medicamento o paquete de medicamento para prolongar la supervivencia de un aloinjerto de riñon en un mamífero. En ciertas modalidades, más de un fármaco inmunosupresivo se incluye en el medicamento o paquete de medicamento. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento y el fármaco inmunosupresivo están en una formulación adecuada para la administración concurrente al mamífero. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento y el fármaco inmunosupresivo están en una formulación o formulaciones adecuadas para administración secuencial al mamífero. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento es una formulación adecuada para administración crónica al mamífero.

En ciertas modalidades, el fármaco inmunosupresivo es una formulación adecuada para administración crónica al mamífero.

En ciertos aspectos, la descripción proporciona un método para prolongar la supervivencia de un aloinjerto en un mamífero receptor, en donde el método comprende administrar al mamífero a) un fármaco que inhibe la actividad de complemento y b) al menos una terapia inmunosupresiva en donde la terapia se selecciona de i) al menos un fármaco inmunosupresivo que comprende LF15-0195 o ii) un tratamiento inmunomodulador. En ciertas modalidades, el mamífero es un humano. En ciertas modalidades, el aloinjerto es MHC desacoplado. En ciertas modalidades, el aloinjerto MHC incompatible es un aloinjerto HLA incompatible. En ciertas modalidades, el receptor es ABO incompatible para el aloinjerto. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento inhibe la formación de C5b o C5a. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la formación de C5b o C5a es un anticuerpo total o un fragmento de anticuerpo. En ciertas modalidades, el anticuerpo total o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo humano humanizado quimerizado o desinmunizado o fragmento de anticuerpo. En ciertas modalidades, el anticuerpo total o fragmento de anticuerpo inhibe la disociación de complemento C5. En ciertas modalidades, el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un un anticuerpo Fab, F'(ab')2, Fv, un anticuerpo de dominio y un anticuerpo de cadena simple. En ciertas modalidades, el fragmento de anticuerpo es pexelizumab. En ciertas modalidades, el anticuerpo completo es eculizumab. En ciertas modalidades, el eculizumab se administra en forma crónica. En ciertas modalidades, el eculizumab se administra una vez cada 2 semanas. En ciertas modalidades, el inhibidor de la actividad de complemento se selecciona del grupo que consiste en i) un receptor de complemento soluble, ii) CD59, Mi) CD55, iv)CD46 y v) un anticuerpo para C5, C6, C7, C8 o C9. En ciertas modalidades, el fármaco inmunosupresor inhibe la actividad de célula T o actividad celular. En ciertas modalidades, el fármaco inmunosupresivo inhibe la actividad de célula T y actividad de célula B. En ciertas modalidades, el fármaco inmunosupresor se selecciona del grupo que consiste en ciclosporina A, tacrolimus, sirolimus, OKT3, un corticosteroide, daclizumab, basiliximab, azatiopreno, mofetil de micofenolato, metotrexato, 6-mercaptopurina, anticuerpo anticélula T, ciclofosfamida, leflunamida, brequinar, ATG, ALG, 15-desoxispergualin, LF15-0195, CTLA-4-lg (belatacept), rituxan y bredinin. En ciertas modalidades, se administra más de un fármaco inmunosupresivo. En ciertas modalidades, el método comprende administrar i) un fármaco que inhibe la actividad de complemento y i¡) ciclosporina A. En ciertas modalidades, el método comprende administrar i) un fármaco que inhibe la actividad de complemento y ii) LF15-0195. En ciertas modalidades, el método comprende administrar i) un fármaco que inhibe la actividad de complemento, ii) ciclosporina A, iii) LF15-0195. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento es un anticuerpo que inhjbe la disociación del complemento C5. En ciertas modalidades, se utiliza un método de tratamiento inmunomodulador, por ejemplo, plasmaferesis, esplenectomía o inmunoabsorción, en combinación con un inhibidor de actividad del complemento. En ciertas modalidades, el aloinjerto supervive durante un tiempo al menos el 20% mayor que si el método se llevara a cabo sin el fármaco que inhibe la actividad de complemento. En ciertas modalidades, el aloinjerto sobrevive durante un tiempo al menos el 40% mayor que si el método se llevara a cabo sin el fármaco que inhibe la actividad de complemento. En- ciertas modalidades, el aloinjerto sobrevive durante el tiempo de vida restante del mamífero. En ciertas modalidades, el aloinjerto sobrevive durante al menos tres meses. En ciertas modalidades, el aloinjerto sobrevive durante al menos seis meses. En ciertas modalidades, el aloinjerto sobrevive durante al menos un año. En ciertas modalidades, el aloinjerto sobrevive durante al menos cinco años. En ciertas modalidades, el aloinjerto sobrevive durante el resto de la vida del humano.

En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 14 días. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 28 días. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 3 meses. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra crónicamente durante al menos 6 meses. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 1 año. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 5 años. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante el resto de la vida del mamífero. En ciertas modalidades, al menos un fármaco inmunosupresivo se administra en forma crónica durante el resto de vida del mamífero. En ciertas modalidades, se administra al menos ciclosporina A en forma crónica el resto de la vida del mamífero. En ciertas modalidades, se administra al menos LF15-0195 en forma crónica el resto de la vida del mamífero. En ciertos aspectos, la descripción proporciona un método para prolongar la supervivencia de un aloinjerto en un mamífero receptor, en donde el método comprende administrar al mamífero a) un fármaco el cual inhibe la actividad de complemento y b) al menos una terapia inmunosupresiva, en donde la terapia se selecciona de i) al menos un fármaco inmunosupresivo que comprende LF15-0195 o ii) un tratamiento inmunomodulador, en donde el mamífero es presensibilizado para dicho aloinjerto. En ciertas modalidades, el mamífero es un humano. En ciertas modalidades, el aloinjerto es MHC desacoplado. En ciertas modalidades, el aloinjerto MHC incompatible es un aloinjerto HLA incompatible. En ciertas modalidades, el receptor es ABO incompatible para el aloinjerto. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento inhibe la formación de C5b o C5a. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la formación de C5b o C5a es un anticuerpo total o un fragmento de anticuerpo. En ciertas modalidades, el anticuerpo total o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo humano humanizado quimerizado o desinmunizado o fragmento de anticuerpo. En ciertas modalidades, el anticuerpo total o fragmento de anticuerpo inhibe la disociación de complemento C5. En ciertas modalidades, el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un Fab, un F'(ab')2, un Fv, un anticuerpo de dominio y un anticuerpo de cadena simple. En ciertas modalidades, el fragmento de anticuerpo es pexelizumab. En ciertas modalidades, el anticuerpo completo es eculizumab. En ciertas modalidades, el eculizumab se administra en forma crónica. En ciertas modalidades, el eculizumab se administra una vez cada 2 semanas. En ciertas modalidades, el inhibidor de la actividad de complemento se selecciona del grupo que consiste en i) un receptor de complemento soluble, ii) CD59, iii) CD55, iv) CD46 y v) un anticuerpo para C5, C6, C7, C8 o C9. En ciertas modalidades, el fármaco inmunosupresor inhibe la actividad de célula T o actividad celular. En ciertas modalidades, el fármaco inmunosupresivo inhibe la actividad de célula T y actividad de célula B. En ciertas modalidades, el fármaco inmunosupresor se selecciona del grupo que consiste en ciclosporina A, tacrolimus, sirolimus, OKT3, un corticosteroide, daclizumab, basiliximab, azatiopreno, mofetil de micofenolato, metotrexato, 6-mercaptopurina, anticuerpo anticélula T, ciclofosfamida, leflunamida, brequinar, ATG, ALG, 15-desoxispergualin, LF15-0195, CTLA-4-lg (belatacept), rituxan y bredinin. En ciertas modalidades, se administra más de un fármaco inmunosupresivo. En ciertas modalidades, el método comprende administrar i) un fármaco que inhibe la actividad de complemento y ii) ciclosporina A. En ciertas modalidades, el método comprende administrar i) un fármaco que inhibe la actividad de complemento y ii) LF15-0195. En ciertas modalidades, el método comprende administrar i) un fármaco que inhibe la actividad de complemento, ii) ciclosporina A, iii) LF15-0195. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento es un anticuerpo que inhibe la disociación del complemento C5. En ciertas modalidades, se utiliza un método de tratamiento inmunomodulador, por ejemplo, plasmaferesis, esplenectomía o inmunoabsorción, en combinación con un inhibidor de actividad del complemento. En ciertas modalidades, en donde el animal es presensibilizado a un aloinjerto, el aloinjerto sobrevive durante un tiempo de al menos 20% más que si el método se llevara a cabo sin el fármaco que inhibe la actividad de complemento. En ciertas modalidades, el aloinjerto sobrevive durante un tiempo al menos el 40% mayor que si el método se llevara a cabo sin el fármaco que inhibe la actividad de complemento. En ciertas modalidades, el aloinjerto sobrevive durante el tiempo de vida restante del mamífero. En ciertas modalidades, el aloinjerto sobrevive durante al menos tres meses. En ciertas modalidades, el aloinjerto sobrevive durante al menos seis meses. En ciertas modalidades, el aloinjerto sobrevive durante al menos un año. En ciertas modalidades, el aloinjerto sobrevive durante al menos cinco años. En ciertas modalidades, el aloinjerto sobrevive durante el resto de la vida del humano. En ciertas modalidades, en donde un mamífero es presensibilizado a un aloinjerto, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 14 días. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 28 días. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 3 meses. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra crónicamente durante al menos 6 meses. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 1 año. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 5 años. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante el resto de la vida del mamífero. En ciertas modalidades, en donde un mamífero se presensibiliza a un aloinjerto, se administra en forma crónica al menos un fármaco inmunosupresivo durante el resto de vida del mamífero. En ciertas modalidades, se administra al menos ciclosporina A en forma crónica el resto de la vida del mamífero. En ciertas modalidades, se administra al menos LF15-0195 en forma crónica el resto de la vida del mamífero. En ciertos aspectos, la descripción proporciona el uso de un fármaco que inhibe la actividad de complemento de un fármaco inmunosupresivo en la fabricación de un medicamento o paquete de medicamento para prolongar la supervivencia a un aloinjerto en un mamífero, en donde al menos un fármaco inmunosupresor comprende LF15-0195. En ciertas modalidades, más de un fármaco inmunosupresivo se incluye en el medicamento o paquete de medicamento. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento y el fármaco inmunosupresivo están en una formulación adecuada para la administración concurrente al mamífero. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento y el fármaco inmunosupresivo están en una formulación o formulaciones adecuadas para administración secuencial al mamífero. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento es una formulación adecuada para administración crónica al mamífero. En ciertas modalidades, el fármaco inmunosupresivo es una formulación adecuada para administración crónica al mamífero.

En ciertos aspectos, la descripción proporciona un paquete farmacéutico que comprende un fármaco que inhibe la actividad de complemento y al menos un fármaco inmunosupresivo, en donde el fármaco que inhibe la actividad de complemento y el fármaco inmunosupresivo se formulan para administración crónica, en donde al menos un fármaco inmunosupresivo comprende LF15-0195. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento es un anticuerpo en una formulación liofilizada que comprende el anticuerpo y un lipoprotector. En ciertas modalidades, un fármaco inmunosupresivo es una formulación liofilizada que comprende el fármaco inmunosupresivo y un lipoprotector. En ciertas modalidades, el fármaco y el fármaco inmunosupresivo está en la misma formulación liofilizada que comprende el fármaco, el fármaco inmunosupresivo y un lipoprotector. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento está en un sistema de inyección que comprende una jeringa que comprende un cartucho, en donde el cartucho contiene el fármaco en una formulación adecuada para inyección. En ciertas modalidades, el fármaco inmunosupresor es un sistema de inyección que comprende una jeringa que comprende un cartucho, en donde el cartucho contiene el fármaco inmunosupresor en una formulación adecuada para inyección. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento y el fármaco inmunosupresivo están en un sistema de inyección que comprende una jeringa que comprende un cartucho, en donde el cartucho contiene el fármaco y el fármaco inmunosupresivo en una formulación adecuada para inyección. En ciertas modalidades, el fármaco que inhibe la actividad de complemento se encuentra en una forma de dosis de unidad. En ciertas modalidades, el fármaco inmunosupresivo está presente en una forma de dosis de unidad.

En ciertas modalidades, el anticuerpo inhibe la formación de un complemento terminal o C5a. En ciertas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo completo o un fragmento de anticuerpo. En ciertas modalidades, el anticuerpo completo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado, quimerizado o desinmunizado o fragmento de anticuerpo. En ciertas modalidades, el anticuerpo completo o fragmento de anticuerpo inhibe la disociación del complemento C5. En ciertas modalidades, el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un Fab, un F(ab')2, un Fv, un anticuerpo de dominio, y un anticuerpo de cadena simple. En ciertas modalidades, el fragmento de anticuerpo es pexelizumab. En ciertas modalidades, el anticuerpo completo es eculizumab. La solicitud contempla combinaciones de cualesquiera de los aspectos y modalidades anteriores. Breve Descripción de los Dibujos Las figuras 1A a 1D muestran niveles de anticuerpo antidonante en receptores presensibilizados versus no sensibilizados bajo diferentes tratamientos. Las figuras 2A y 2B muestran la comparación entre una terapia triple utilizando anticuerpo anti-C5, CsA y CyP en receptores de aloinjerto presensibilizados y una terapia de combinación utilizando únicamente un anticuerpo anti-C5, CsA y CyP en receptores de aloinjerto presensibilizados. La figura 2, compara la supervivencia de aloinjerto-corazón en varios receptores bajo diferentes tratamientos tal como se indica. La figura 2B muestra la histología e inmunohistología, por ejemplo, para infiltración de linfocitos en aloinjertos de corazón de receptores en diferentes grupos. La figura 3, muestra una actividad de complemento terminal bloqueada mediante anticuerpo anti-C5 tal como se compara con agentes inmunosupresivos. Las figuras 4A-4D comparan niveles de anticuerpos antidonante en receptores presensibilizados de aloinjertos bajo monoterapia con anticuerpo anti-C5 solo, terapia de combinación doble con anticuerpo anti-C5 y CsA, y terapia de combinación triple con anticuerpo anti-C5, CsA y CyP. La figura 5 muestra el cambio de proporciones de isotipos IgG en receptores de aloinjerto que fueron no tratados o fueron tratados bajo diferentes tratamientos. La figura 6, muestra una expresión de alto nivel de proteínas Bcl-2 y Bcl-xl en injertos de corazón en supervivencia a largo plazo de injertos de corazón, en comparación con injertos de corazón de animales no tratados. La figura 7A a 7C, muestran un segundo transplante mejorado (re-transplante) del injerto acomodado procedente de un primer receptor de transplante. Las figuras 8A y 8B muestran resultados de experimentos de retransplante. Las figuras 9A y 9B muestran resultados de los experimentos de transplante. Las figuras 10A a 10D muestran los niveles de anticuerpo antidonante en receptores presensibilizados versus no sensibilizados bajo diferentes tratamientos. Las figuras 11A a 11C muestra que mAb anti-C5 en combinación con CsA y LF, logra una supervivencia indefinida en injertos de riñon en ratones presensibilizados. La figura 12, muestra que la actividad hemolítica de complemento se inhibió completamente en sueros de ratón BALB/c presensibilizados. Las figuras 13A y 13B muestran el cambio de proporciones de isotipos IgG en receptores de aloinjerto que fueron no tratados o tratados bajo diferentes tratamientos. La figura 14, muestra la expresión de proteínas protectoras en supervivencia a largo plazo de injertos de riñon de receptores presensibilizados. Descripción Detallada de la Invención Revisión general: Rechazo de transplantes o injertos El rechazo hiperagudo ocurre a los pocos minutos o hasta horas después del transplante y se debe a anticuerpos preformados para los antígenos de tejido transplantado. Se caracteriza por hemorragia y oclusión trombótica de la vasculatura del injerto. El enlace del anticuerpo al endotelio activa el complemento, y el anticuerpo y complemento inducen un número de cambios en el endotelio del injerto que promueven la trombosis intravascular y conducen a oclusión vascular, siendo el resultado que el órgano injertado padece de daño isquémico irreversible (Abbas y asociados, 2000). El rechazo hiperagudo con frecuencia es transmitido por aloanticuerpos IgM preexistentes, por ejemplo, los dirigidos contra los antígenos del grupo de sangre ABO expresados en los glóbulos rojos. Este tipo de rechazo, transmitido por anticuerpos naturales, es la razón principal del rechazo de los xenotransplantes. El rechazo hiperagudo debido a los anticuerpos IgM naturales, ya no es un problema importante con los aloinjertos debido a que los aloinjertos normalmente son seleccionados para coincidir con el tipo ABO del donante y el receptor. El rechazo hiperagudo del aloinjerto ABO incompatible también puede ocurrir, normalmente transmitido por anticuerpos IgG dirigidos contra aloantígenos de proteína, tales como moléculas MHC extrañas o contra aloantígenos menos bien definidos expresados en células endoteliales vasculares. Dichos anticuerpos pueden surgir como resultado de la exposición previa a los aloantígenos a través de transfusión sanguínea, transplante previo o múltiples embarazos (esta exposición previa es requerida como "presensibilización"). Abbas y asociados, 2000. El rechazo agudo es un proceso de lesión vascular y parenquimal transmitida por células T, macrófagos y anticuerpos que normalmente comienza después de la primera semana de transplante. Abbas y asociados, 2001. Los linfocitos T juegan un papel central en el rechazo agudo respondiendo a los aloantígenos, incluyendo moléculas MHC, presentes en células endoteliales y parenquimales vasculares. Las células T activadas originan la lisis directa de células de injerto o producen citocinas que reclutan y activan células inflamatorias, lo cual causa necrosis. Las células tanto CD4+ como CD8 + pueden contribuir al rechazo agudo. La destrucción de células alogeneicas en injerto, es altamente específica y un sello característico de la exterminación de linfocito T citotóxico CD8 + . Abbas y asociados, 2000. Las células CD4+ T pueden ser importantes para transmitir un rechazo de injerto agudo mediante secreción de citocinas e inducción de reacciones tipo hipersensibilidad tipo retardada en injertos, con cierta evidencia disponible que indica que las células T CD4+ son suficientes para transmitir el rechazo agudo. Abbas y asociados, 2000. Los anticuerpos también pueden transmitir rechazo agudo después de que un receptor de injerto monta una respuesta inmune humoral para los antígenos de los vasos sanguíneos y los anticuerpos que son producidos se enlazan a la pared del vaso y activan el complemento. Abbas y asociados, 2000. El rechazo crónico está caracterizado por fibrosis con pérdida de estructuras de órganos normales que ocurren durante un período prolongado. La patogénesis de rechazo crónico es menos bien comprendida que la de rechazo agudo.

La oclusión arterial de injerto puede ocurrir como resultado de la proliferación de células de músculo liso íntimo. Este proceso es denominado aterosclerosis acelerada o de injerto y se puede desarrollar en cualquier transplante de órgano vascutarizado a los 6 meses hasta un año después del transplante. Para que un transplante sea exitoso, se deben superar los diversos modos de rechazo. Se utilizan múltiples métodos para prevenir el rechazo. Esto puede requerir administración de inmunosupresores, con frecuencia varios tipos que evitan los diversos modos de ataque, por ejemplo inhibición de ataque de célula T, anticuerpos y citocina y efectos de complemento. La clasificación previa de donantes para que coincida con los del receptor, también en un factor importante para prevenir el rechazo, especialmente para prevenir el rechazo hiperagudo. La inmunoabsorción de anticuerpos anti-HLA antes del injerto, puede reducir el rechazo hiperagudo. Antes del transplante el receptor o huésped se le debe administrar reactivos anti-célula T, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal OKT3, Anti-Timocito Globulina A (ATG), ciclosporina A o tacrolimus (FK 506). Además, se pueden administrar glucocorticoides y/o azatioprina (u otros análogos de purina) al huésped antes del transplante. Los fármacos utilizados para ayudar a prevenir el rechazo de transplante incluyen, pero no se limitan a ATG o ALG, OKT3, daclizumab, basiliximab, corticosteroides, 15-desoxispergualin, LF 15-0195, ciclosporinas, tacrolimus, análogos de purina tales como azatioprina, metotrexato, mofetil de micofenolato, 6-mercaptopurina, bredinin, brequinar, leflunamida, ciclofosfamida, sirolimus, anticuerpos monoclonales anti-CD4, CTLA4-lg, riruxan, anticuerpos monoclonales anti-CD154, anticuerpos monoclonales anti-LFA1, anticuerpos monoclonales anti-LFA-3 y anticuerpos monoclonales anti-CD2 y anti-CD45. Los aloinjertos son rechazados en parte por la activación de células T. El receptor del transplante monta una respuesta de rechazo después del reconocimiento de célula T CD4+ de antígenos extraños en el aloinjerto. Estos antígenos son codificados por el complejo de histocompatibilidad mayor (MHC). Existen moléculas MHC tanto clase I como clase II. En humanos las moléculas MHC clase I son HLA-A, HLA-B y HLA-C. Las moléculas MHC clase II son denominadas HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP. En ratones, las moléculas MHC clase I son H-2K, H-2D y H-2L y las moléculas MHC clase II son l-A y l-E. Cuando las células CD4+ T se enlazan a los antígenos MHC extraños se activan y pasan por proliferación clonal. Las células T activadas secretan citocinas que ayudan a la activación de monocitos/macrófagos, células B y células T CD8+ citotóxicas. Los monocitos/macrófagos activados liberan agentes que dan como resultado daño de tejido, las células B producen aloanticuerpos que conducen a destrucción de tejido transmitida por complemento y las células T CD8+ exterminan las células de injerto en una forma específica del antígeno a través de la inducción de apoptosis y lisis celular. Agentes inmunosupresivos Los numerosos fármacos utilizados para retardar el rechazo de injerto (es decir prolongar su supervivencia) trabaja en una variedad de formas. Se utilizan ampliamente agentes inmunosupresivos. Ver la publicación de Stepkowski, 2000, para una revisión del mecanismo de acción de varios fármacos inmunosupresivos. Ciclosporina A es uno de los fármacos inmunosupresivos más ampliamente utilizados para inhibir el rechazo de aloinjerto. Es un inhibidor de interleucina-2 o IL-2 (previene la transcripción de mARN de interleucina 2). Más directamente, la ciclosporina inhibe la activación de calcineurin que normalmente ocurre al momento del estímulo del receptor de célula T. El calcineurin desfosforila NFAT (factor nuclear de células T activadas), habilitando a que entren al núcleo y enlacen al promotor de interleucina-2. Al bloquear este proceso, la ciclosporina A inhibe la activación de células T CD4+ y la cascada resultante de eventos que podrían ocurrir de otra forma. Tacrolimus es otro inmunosupresor que actúa inhibiendo la producción de interleucina-2. Los bloqueadores de receptor de rapamicin (Sirolimus), SDZ RAD, y interleucina-2 son fármacos que inhiben la acción de interleucina-2 y por consiguiente evitan la cascada de eventos descritos anteriormente. Los inhibidores de biosíntesis de purina y pirimidina también se utilizan para inhibir el rechazo de injerto. Esto se evita en la síntesis de ADN y por consiguiente inhiben la división celular incluyendo la capacidad que tienen de dividirse las células T. El resultado es la inhibición de la actividad de célula T, evitando la formación de nuevas células T. Los inhibidores de síntesis de purina incluyen azatioprina, metotrexato, mofetil de micofenolato (MMF) y mizoribina (bredinin). Los inhibidores de síntesis de pirimidina incluyen sodio de brequinar y leflunomida. La ciclofosfamida es un inhibidor tanto de la síntesis de purina como de pirimidina. Aún otro método para inhibir la activación de célula T, es tratar el receptor con anticuerpos para células T. OKT3 es un anticuerpo monoclonal de murido contra CD3 el cual es parte del receptor de célula T. Este anticuerpo inhibe el receptor de célula T y suprime la activación de célula T. Otros numerosos fármacos y métodos para retrasar el rechazo de alotransplantes son conocidos utilizados por los expertos en la técnica. Un método ha sido agotar las células T, por ejemplo mediante radiación. Esto con frecuencia se ha utilizado en transplantes de médula ósea, especialmente si existe una incompatibilidad parcial del HLA mayor. La administración al receptor de un inhibidor (bloqueador) de la interacción del ligando CD40-CD40 y/o bloqueador de la interacción CD28-B7 ha sido utilizada (Patente Norteamericana Número 6,280,957). La solicitud de patente PCT publicada WO 01/37860 enseña la administración de un anticuerpo monoclonal anti-CD3 y IL-5 para inhibir la respuesta inmune Th1. La solicitud de patente PCT publicada WO 00/27421 enseña un método para la profilaxis o tratamiento de rechazo del transplante de córnea, administrando un antagonista de factor-a de necrosis de tumor. Glotz y asociados (2002) muestra que la administración de inmunoglobulinas intravenosas ( I V I g ) puede inducir a una disminución profunda y sostenida en los tituladores de los anticuerpos anti-HLA, permitiendo de esta forma un transplante de un órgano incompatible-HLA. Los protocolos similares han incluido intercambios de plasma (Taube y asociados, 1984) o técnicas de inmunoabsorción acopladas a agentes inmunosupresivos (Hiesee y asociados, 1992) o una combinación de éstos (Montgomery y asociados, 2000). Changelian y asociados (2003) enseña un modelo en el cual la inmunosupresion es originada por un inhibidor oral de cinasa Janus 3 (JAK3), la cual es una enzima necesaria para la señalización adecuada de los receptores de citocina que utiliza la cadena gamma común (ye) (I nterleucinas-2, -4, -7, -9, -15, -21), siendo el resultado una inhibición de la activación de célula T. Los ácidos nucleicos antisentido contra ICAM-1, han sido utilizados solos o en combinación con un anticuerpo monoclonal específico de antígeno 1 asociado con fusión de leucocitos (LFA-1) en un estudio de transplante de aloinjerto de corazón (Stepkowski, 2000). En forma similar, se ha utilizado un anticuerpo anti-ICAM-1 en combinación con un anticuerpo anti-LFA-1 para tratar aloinjertos de corazón (Stepkowski, 2000). Los oligonucleótidos antisentido han sido utilizados adicionalmente junto con ciclosporina en modelos de aloinjerto de corazón o riñón de rata, dando como resultado un efecto sinérgico para prolongar la supervivencia de los injertos (Stepkowski, 2000). El rechazo de transplante crónico ha sido tratado administrando un antagonista de TGF-ß el cual es una citocina implicada en la diferenciación, proliferación y apoptosis (publicación de Solicitud de Patente Norteamericana Número US 2003/0180301 ). Complemento y transplante/rechazo de injerto El papel de complemento en el rechazo de transplante es bien conocido. Esto es especialmente cierto en casos de xenotransplante, aunque el complemento también juega un papel importante en el rechazo de alotransplante . Para una revisión ver la publicación de Platt and Saadi, 1999. Un aspecto del papel del complemento es que la lesión de reperfusión-isquemia puede ocurrir al momento en que un injerto de órgano es reperfusionado con la sangre del receptor. El complemento también puede originar ciertas manifestaciones del rechazo del aloinjerto. El sistema de complemento se describe con detalle en la Patente Norteamericana Número 6,355,245. El sistema de complemento actúa junto con otro sistemas inmunológicos del cuerpo para defenderse contra la intrusión de patógenos celulares y virales. Existen al menos 25 proteínas de complemento, las cuales se encontraron como una recolección compleja de proteínas de plasma y cofactores de membrana. Las proteínas de plasma hicieron hasta aproximadamente el 10% de las globulinas en suero de vertebrados. Los componentes de complemento lograron sus funciones de defensa inmune interactuando en una serie de disociación de enzimas intricadas aunque precisas y eventos de enlace de membranas. La cascada de recomplemento resultante, conduce a la producción de productos con funciones opsónicas, inmunorreguladores y líticas. La cascada de complemento progresa a través de la trayectoria clásica o la trayectoria alternativa. Estas trayectorias comparten muchos componentes, y aunque difieren en sus pasos iniciales, convergen y comparten los mismos componentes de "complemento terminal" (C5 a C9) responsables de la activación y destrucción de células objetivo. La trayectoria de complemento clásica normalmente se inicia mediante reconocimiento de anticuerpos y enlace a un sitio antigénico en una célula objetivo. La trayectoria alternativa normalmente es un anticuerpo independiente y puede iniciarse a través de ciertas moléculas en superficies de patógenos. Ambas trayectorias convergen en el punto en donde el componente de complemento es disociado a través de una proteasa activa (la cual es diferente en cada trayectoria) para producir C3a y C3b. Otras trayectorias que activan el complemento de ataque y puede actuar posteriormente en las secuencias de eventos que conducen a varios aspectos de la función de complemento. C3a es una anafilatoxina. C3b se enlaza a células bacterianas y a otras, así como a ciertos viruses y complejos inmunes, y la etiqueta para eliminación de la circulación. C3b en este papel es conocido como opsonin. La función opsonic de C3b se considera la más importante acción anti-infecciosa del sistema de complemento. Los pacientes con lesiones genéticas que bloquean la función C3b están propensos a infectarse por una amplia variedad de organismos patogénicos, no obstante que los pacientes con lesiones posteriores en la secuencia de cascadas de complemento, es decir pacientes con lesiones que bloquean las funciones C5, se encuentran más propensos únicamente a infección por Neisseria, y posteriormente un poco más propensos (Fearon, 1983). C3b también forma un complejo con otros componentes únicos para que cada trayectoria forme convertasa C4 clásica o alternativa, que disocia C5 en C5a y C5b. C3 por lo tanto se considera como la proteína central en la secuencia de reacción de complemento ya que es esencial tanto para las trayectorias alternativas como clásicas (Wurzner y asociados, 1991). Esta propiedad de C3b es regulada por el factor I de proteasa de suero, que actúa en C3b para producir iC3b. Aunque aún es funcional como opsonin, iC3b no puede formar una convertasa activa C5. C5 es una globulina beta de 190 kDa encontrada en suero normal en aproximadamente 75 pg/mL (0.4 µ?). C5 es glucosilada, con aproximadamente 1.5-3 por ciento de su masa atribuida a carbohidratos. C5 madura es un heterodímero de una cadena alfa de 115 kDa de 999 aminoácidos que está enlazada por disulfuro a una cadena beta 75 kDa de 656 aminoácidos. C5 se sintetiza como un producto de proteína precursora de cadena simple de un gen de una sola copia (Haviland y asociados, 1991). La secuencia de cADN de la transcripción de este gen anticipa el precursor pro-C5 secretado de 1659 aminoácidos junto con una secuencia líder de 18 aminoácidos. El precursor pro-C5 está disociado después de que el aminoácido 655 y 659 producen la cadena beta como un fragmento de terminal amino (residuos de aminoácido +1 a 655) y la cadena alfa como un fragmento de terminal carboxilo (residuos de aminoácido 660 a 1658), con cuatro aminoácidos eliminados entre los dos. C5a se disocia de la cadena alfa de C5 ya sea mediante convertasa C5 alternativa o clásica como un fragmento de terminal amino que comprende los primeros 74 aminoácidos de la cadena alfa (es decir residuos de aminoácido 660-733).

Aproximadamente el 20 por ciento de la masa 11 kDa de C5a se atribuye al carbohidrato. El sitio de disociación para la acción de convertasa está en o inmediatamente adyacente al residuo de aminoácido 733. El compuesto que puede enlazar a, o estar adyacente a este sitio de disociación puede tener el potencial de bloquear el acceso de las enzimas de convertasa C5 para el sitio de disociación y por consiguiente actuar como un inhibidor de complemento. C5 también puede activarse por medio de otra actividad de convertasa C5. La digestión de tripsina limitada (Minta and Man, 1977; Wetsel and Kolb, 1982) y el tratamiento de ácido (Yamamoto and Gewurz, 1978; Vogt y asociados, 1989) también pueden disociar C5 y producir C5b activo. C5a es otra anafilotoxina. C5b combina con C6, C7 y C8 para formar el complejo C5b-8 en la superficie de la célula objetivo. Al momento del enlace de varias moléculas C9, el complejo de ataque de membrana (MAC, C5b-9, complejo de complemento terminal-TCC) se forma. Cuando números suficientes de MACs se insertan en membranas de célula objetivo, las aberturas que crean (poros MAC) transmiten una rápida tisis osmótica de las células objetivo. Las bajas concentraciones, no líticas de MACs pueden producir otros efectos. En particular, la inserción de membrana de pequeños números de complejos C5b-9 en células endoteliales y plaquetas puede originar la activación de célula perjudicial. En algunos casos la activación puede preceder la lisis celular. Tal como se mencionó anteriormente, C3a y C5a son anafilotoxinas. Estos componentes de complemento activados pueden activar la desgranulación de células mástil, que liberan histamina y otros transmisores de inflamación, dando como resultado la contracción de músculo liso, permeabilidad vascular incrementada, activación de leucocitos y otros fenómenos inflamatorios que incluyen proliferación celular que da como resultado la hipercelularidad. C5a también funciona como un péptido quimiotáctico que sirve para atraer granulocitos proinflamatorios al sitio de la activación de complemento. Los anticuerpos de receptor de enlace-complemento a aloantígenos donantes se consideran como la causa principal de rechazo de injerto hiperagudo. Debido a las pruebas de correspondencia cruzada pretransplante, este prototipo de rechazo humoral ahora es raramente observado (Régele y asociados, 2001). En la actualidad los datos muestran que los mecanismos inmune humorales deben contribuir a otros tipos de rechazo de aloinjerto (Régele y asociados, 2001). Los altos niveles de anticuerpos reactivos en panel que indican presensibilización humoral, se encontraron como asociados con supervivencia de injerto de riñón inferior (Opelz, 1992), la aparición de aloanticuerpos durante el periodo post-transplante ha sido reportada para anticipar un resultado de injerto deficiente (Jeannet y asociados, 1970; Halloran y asociados, 1992), y la eliminación selectiva de receptor IgG mediante inmunoabsorción invertida de algunos episodios de rechazo, indican la contribución de mecanismos inmune humorales para el rechazo (Persson y asociados, 1995; Bóhmig y asociados, 2000). La activación de complemento dentro de un injerto debe indicar la lesión de injerto transmitida por anticuerpos. El producto de disociación de complemento C4d es un marcador para la activación de la trayectoria clásica dependiente del anticuerpo. Los depósitos de capilaridad C4d en biopsias de aloinjerto de riñon, estuvieron asociados con un resultado de injerto deficiente. La evidencia recientemente en incremento indica que la activación de complemento contribuye en forma significativa a la sensibilización de receptores de aloinjerto y al desarrollo de lesión de tejido en aloinjertos (Platt y asociados, 1999). Los anticuerpos son los transmisores de activación de la trayectoria de complemento clásica más profundamente investigados. Clínicamente, los aloanticuerpos son conocidos por activar el complemento (Baldwin y asociados, 2001). Halloran y Collins indican que el depósito C4d en capilares peritubulares de aloinjertos renales, es un marcador sensible y de diagnóstico de rechazo humoral agudo que se correlaciona fuertemente con la presencia de anticuerpos específicos del donante en la circulación (Collins y asociados, 1999; Halloran, 2003). La evidencia de evidencia de soporte adicional se observa en animales con la inhibición de complemento (Pratt y asociados, 1996; Pruitt y asociados, 1991; Forbes y asociados, 1978) o deficiencia (Pratt y asociados, 2000; Baurer y asociados, 1995) que exhibe una lesión inflamatoria significativamente reducida y respuestas inmune anti-donante disminuidas. En ABMR, el complemento se sugiere que sea activado por la trayectoria clásica y juega un papel importante en la patogénesis (Collard y asociados, 1997). Aunque el papel del complemento en HAR o rechazo vascular agudo (AVR) después del xenotransplante ha estado bien documentado (Platt y asociados, 1999), aún no se ha aclarado en forma precisa los mecanismos de complemento en la patogénesis de ABMR después del alotransplante. El componente C5 del complemento se disocia para formar productos con múltiples efectos proinflamatorios y por lo tanto representa un objetivo atractivo para la inhibición de complemento dentro de la respuesta inflamatoria transmitida-inmune. Tal como se describió anteriormente, C5a es una anafilatoxina poderosa y factor quimiotáctico. La activación celular mediante C5a induce la liberación de múltiples transmisores inflamatorios adicionales (José y asociados, 1983). Las trayectorias de activación de complemento (trayectoria de lectina de enlace a manan, clásica, o alternativa) conduce finalmente a la formación de un complejo de ataque de membrana citolítica C5b-9 (Kirschfunk, 2001), que puede transmitir tanto lesión a tejido directa por lisis celular, como activación de célula proinflamatoria en dosis sublíticas (Saadi y asociados, 1995; Papadimitriou y asociados, 1991). Por consiguiente, el bloqueo de la generación tanto C5a como C5b puede ser requerido para la inhibición óptima de la respuesta inflamatoria transmitida por complemento después del transplante. Al mismo tiempo, la inhibición de la cascada de complemento en C5 no daña la generación de C3b, conserva la opsonización transmitida por C3b de microorganismos patogénicos, así como la solubilización y despeje de complejos inmunes (Liszewski, 1993). El efecto benéfico de mAb anti-C5 ha sido reportado previamente en varios modelos experimentales incluyendo reperfusión al miocardio (Vakeva y asociados, 1998), lupus eritematoso sistémico (Wang y asociados, 1996) y artritis reumatoide (Wang y asociados, 1995); así como en ensayos clínicos humanos (Kirschfink, 2001) de enfermedad autoinmune, derivación cardiopulmonar e infarto al miocardio agudo. Además, ia desactivación de complemento por un bloqueo funcional del Ab monoclonal anti-C5 (mAb) evitó HAR en modelos de xenotransplante (Kroshus y asociados, 1995; Wang y asociados, 1999). Los métodos para retardar el rechazo de alotransplante mediante administración de inhibidores de complemento han sido probados. La solicitud de patente PCT publicada WO 92/10205, describe el uso de una combinación de ciclosporina y un receptor de complemento soluble (sCR1) para inhibir el rechazo de un alotransplante cardiaco en un modelo de rata presensibilizado. El receptor de complemento 1 enlaza a los complementos C3b y C4b. Las formas solubles del receptor de complemento 1 ocurre naturalmente o puede generarse a través de procedimientos ADN recombinantes. Estos receptores de complemento soluble han inhibido in vitro las consecuencias de la activación de complemento (Patente Norteamericana Número 6,057,131). En WO 92/10205, a las ratas, que habían sido presensibilizadas para el aloinjerto cardiaco que recibieron, se les administró en forma intramuscular ciclosporina A en 10 mg/kg/día comenzando dos días antes del transplante y continuaron hasta el momento del rechazo del injerto. Además, se administró el receptor 1 de complemento soluble (sCR1) como un bolo intravenoso simple en 15 mg/kg inmediatamente antes de la reperfusión del injerto. Los animales de control sin tratamiento con fármacos tuvieron un injerto rechazado en un promedio de 3.8 días. A los que se les administró ciclosporina A sola rechazando los injertos en un promedio de 57 días. Esto fue muy variable con dos ratas rechazando rápidamente a los 2 y 4 días y una tercera rata rechazando a los 166 días). Las ratas a las que se les administró sCR1 solo, rechazaron los injertos en un promedio de 44 días. Las ratas a las que se les administró la combinación de ciclosporina A y sCR1 rechazaron los injertos en un promedio de 147 días. La combinación de ciclosporina A crónica y bolo sCR1 simple, se observó para dar como resultado un efecto sinérgico que prolonga en gran medida el tiempo hasta el rechazo del injerto. Los estudios anteriores realizados por Pruitt and Bollinger (1991) utilizaron un modelo similar de un aloinjerto de rata presensibilizada que muestran que la administración de sCR1 sola para desactivar el complemento, dio como resultado un tiempo incrementado antes del rechazo del injerto. Sims y asociados (Patente Norteamericana Número ,135,9216) sugiere el uso de inhibidores de complemento, por ejemplo CD59 o anticuerpos contra C7 o C9 para bloquear la formación del complejo C5b-9, para tratar el endotelio vascular de órganos y tejidos que serán transplantados. Esto podría evitar la necrosis de célula iniciada por C5b-9. Los desactivadotes C5b-9 pueden agregarse al perfusionado o medio de almacenamiento para proteger las células de revestimiento vascular de que pasen por activación de complemento durante almacenamiento in vitro. Además, el órgano o tejido puede ser protegido de efectos citolíticos y trombóticos que surgen de la activación de complemento iniciada al momento del transplante, sin circunviniendo de esta forma el rechazo agudo transmitido por complemento. Sims y asociados (Patente Norteamericana Número 5,573,940 y Patente Norteamericana Número 6,100,443) también enseñan un método para expresar CD59 en el tejido u órgano transplantado para proteger al órgano transplantado de rechazo. Esto se puede lograr transfectando las células que están siendo transplantadas. Aunque los diversos fármacos desarrollados hasta la fecha en combinación con métodos para preclasificar donantes y receptores para que coincidan con el aloinjerto del donante con el receptor, han sobreincrementado la duración de tiempo promedio de la supervivencia de aloinjertos, muchos aloinjertos sin embargo son rechazados durante el tiempo de vida del receptor. En general, los avances de la técnica anterior han sido dirigidos principalmente a superar el rechazo de injerto agudo. Además, el papel de los componentes de complemento terminales activados en rechazo de aloinjerto transmitido por anticuerpos no ha sido revisado utilizando inhibidores que se dirijan específicamente a la cascada de complemento en el nivel de proteína C5. Los métodos aquí descritos y tal como se ejemplifican en la sección de Ejemplos, adelantan la técnica del alotransplante, inhibiendo el rechazo crónico de aloinjertos, en particular, aloinjertos en un receptor presensibilizado. Los métodos nuevos se presentan para prolongar en forma adicional la supervivencia del aloinjerto utilizando una combinación adecuada de fármacos inmunosupresivos en combinación con una administración crónica de un inhibidor de complemento.

Métodos y usos Los métodos aquí descritos se utilizan para prolongar la supervivencia del aloinjerto. Los métodos generalmente incluyen administrar un inhibidor de actividad de complemento en combinación con uno o más inmunosupresores. Los inhibidores de complemento adecuado son conocidos para los expertos en la técnica. Los anticuerpos pueden elaborarse para componentes individuales de complemento activado, por ejemplo, anticuerpos para C5a, C7, C9, etc. (ver por ejemplo Patente Norteamericana Número 6,534,058; solicitud de Patente Norteamericana publicada 2003/0129187; y Patente Norteamericana Número 5,660,825). Las «proteínas son conocidas por inhibir la lisis transmitida por complemento, incluyendo CD59, CD55, CD46 y otros inhibidores de C8 y C9 (ver por ejemplo Patente Norteamericana Número 6,100,443). La Patente Norteamericana Número 6,335,245 enseña un anticuerpo que enlaza a C5 y evita que sea disociada en C5a y C5b evitando de esta forma la formación no únicamente de C5a sino también del complejo C5b-9. Las proteínas conocidas como receptores de complemento y que enlazan al complemento también son conocidas (ver Solicitud de Patente PCT Publicada WO 92/10205 y Patente Norteamericana Número 6,057,131). El uso de formas solubles de receptores de complemento, por ejemplo CR1 soluble, también puede inhibir las consecuencias de la activación de complemento tal como ráfaga oxidativa de neutrófilo, hemolisis transmitida por complemento y producción de C3a y C5a. Los expertos en la técnica reconocen lo anterior en parte, sino es que como todos los métodos conocidos para inhibir complemento y su activación. Los inmunosupresores adecuados incluyen pero no se limitan a ATG o ALG, OKT3, daclizumab, basiliximab, corticosteroides, 15-desoxispergualina, LFI 5-0195, ciclosporinas, tacrolimus, azatioprina, metotrexato, mofetil de micofenolato, 6-mercaptopurina, bredinin, brequinar, leflunamida, ciclofosfamida , sirolimus, anticuerpos monoclonales anti-CD4, CTLA4-lg, rituxan, anticuerpos monoclonales anti-CD154, anticuerpos monoclonales anti-LFA1, anticuerpos monoclonales anti-LFA-3, anticuerpos monoclonales anti-CD2 y anti-CD45. Un aloinjerto puede incluir un órgano, parte de un órgano, tejido o célula transplantada. Estos incluyen pero no se limitan a corazón, hígado, pulmón, páncreas, riñon, tejido vascular, ojos, córnea, lentes, piel médula ósea, músculo, tejido conectivo, tejido gastrointestinal, tejido nervioso, huesos, células madre, isletos, cartílagos, hepatocitos y células hematopoyéticas. Al menos parte de- la razón de la falla de los aloinjertos, es que una respuesta por parte del receptor de un aloinjerto es la activación del complemento. Esto da como resultado la formulación de C5a y C5b-9 que son moléculas proinflamatorias potentes que ayudan a originar la falla de injerto. Sin pretender enlazarse a teoría propuesta alguna, los solicitantes tienen la teoría de que la inhibición de la formación de C5a y C5b-9 o la inhibición de C5a y C5b-9 que estuvo presente, puede ayudar a evitar la falla del injerto. Además, se tiene la teoría de que siempre que el aloinjerto esté presente, el receptor continuará intentando montar una respuesta inmune contra el injerto, y esta respuesta incluirá intentos de producir C5a y C5b-9. Si no se evita, esta respuesta de complemento conducirá al rechazo vascular agudo a corto plazo y puede contribuir a rechazo de injerto crónico a largo plazo. Los métodos de la técnica anterior para utilizar inhibidores de al actividad de complemento estuvieron limitados a la administración de otros inhibidores únicamente al momento del transplante. Esto ayudó a prevenir el rechazo agudo, aunque tal como lo describen los resultados aquí ilustrados, se obtienen resultados mejorados mediante la administración de dichos inhibidores durante un término más largo. Esta administración a largo plazo ayuda a evitar el rechazo crónico del aloinjerto en forma opuesta a ayudar únicamente a evitar un rechazo agudo. El resultado es una supervivencia a largo plazo del aloinjerto en comparación ya sea con no administrar un inhibidor de actividad de complemento o administrar dicho inhibidor únicamente en el momento del transplante del aloinjerto. Aunque muy comúnmente se desea que el aloinjerto sobreviva durante la vida de tiempo restante del receptor, existen veces cuando el aloinjerto es necesario únicamente durante un periodo de tiempo más corto, por ejemplo, un órgano puente, para puentear el momento hasta que el propio órgano del receptor puede recuperarse por si solo, tiempo en el cual el aloinjerto ya no será necesario. La duración de tiempo de dicho injerto, variará necesariamente, aunque normalmente será más del tiempo en el cual puede ocurrir un rechazo agudo y puede ser lo suficientemente largo para que ocurra un rechazo crónico. Este periodo de supervivencia deseado para un injerto puente puede ser de varios meses, por ejemplo, seis meses. Para probar que la inhibición a largo plazo de la actividad de complemento prolongará la supervivencia del aloinjerto, se llevaron a cabo experimentos en los cuales se inhibió la activación de complemento en un modo crónico y no meramente al momento del transplante. El tratamiento crónico significa un tratamiento durante un periodo prolongado hasta el tiempo de vida del aloinjerto. Este puede ser un tratamiento diario, aunque no se limita al tratamiento diario. El tratamiento crónico mantendrá una cantidad efectiva del fármaco en el receptor del aloinjerto. Por ejemplo, un método preferido es incluir el anticuerpo monoclonal anti-C5 eculizumab en el tratamiento. En estudios de personas que padecen de hemoglobinuria nocturna paroxismal (PNH), eculizumab ha sido administrado en una dosis de 900 mg/paciente una vez cada 12 a 14 días. Esta dosificación se ha encontrado que bloque en forma completa y consistente la actividad de complemento terminal y ha inhibido en gran parte los síntomas de PHN (Hillmen y asociados, 2004). La dosis administrada tiene la capacidad de bloquear los efectos de complemento durante aproximadamente dos semanas antes de que eculizumab sea desactivada o eliminada del cuerpo. Por consiguiente, un tratamiento crónico de eculizumab puede ser, por ejemplo, la administración de 900 mg al receptor del aloinjerto una vez cada dos semanas durante el resto del tiempo de vida del paciente. En forma similar, se pueden suministrar otros fármacos en forma crónica según sea necesario, ya sea esto en una base diaria u otro programa requerido para mantener una cantidad efectiva del fármaco en el receptor del aloinjerto. Debido a que es bien sabido que el rechazo del injerto puede ser originado por más de sólo la activación del complemento, por ejemplo, actividad de célula T, los experimentos incluyeron inmunosupresores tales como ciclosporina para ayudar en forma adicional a prevenir el rechazo del injerto. Un método preferido para inhibir la actividad de complemento es utilizar un anticuerpo monoclonal que enlaza al complemento C5 y evita que C5 sea disociado. Esto evita la formación tanto de C5a como C5b-9 y al mismo tiempo permite la formación de C3a y C3b que son benéficos para el receptor. Dichos anticuerpos que son específicos para el complemento humano son conocidos (Patente Norteamericana Número 6,355,245). Estos anticuerpos descritos en la Patente Norteamericana Número 6,355,245 incluyen tanto un anticuerpo completo o de longitud total (ahora denominado eculizumab) como un anticuerpo de cadena simple (ahora denominado pexelizumab). Un anticuerpo similar contra C5 de ratón es denominado BB5.1 (Freí y asociados, 1987). BB5.1 fue utilizado en los experimentos que se establecen más adelante. Los anticuerpos que inhiben la actividad de complemento no necesitan ser anticuerpos monoclonales. Pueden ser, por ejemplo, anticuerpos policlonales. Pueden ser además fragmentos de anticuerpo. Un fragmento de anticuerpo incluye pero no se limita a un Fab, un F(ab'), F(ab')2, un anticuerpo de cadena simple, un anticuerpo de domino y un Fv. Además, es bien sabido para los expertos en la técnica que los anticuerpos pueden ser humanizados (Jones y asociados, 1986), qumerizados o desinmunizados. Un anticuerpo también puede comprender una parte Fe mutada, de modo que el Fe mutante no active el complemento. Los anticuerpos que serán utilizados en la presente descripción pueden ser cualquiera. de estos. Es preferible utilizar anticuerpos humanizados cuando el receptor de aloinjerto es un humano. Administración y formulaciones La administración del inhibidor de la actividad de complemento se lleva a cabo de acuerdo con métodos conocidos para los expertos en la técnica. Estos inhibidores se administran preferentemente antes del momento del transplante del aloinjerto o al momento del transplante con la administración continuando en una forma crónica. Estos inhibidores pueden ser administrados en forma adicional durante un episodio de rechazo en el caso de que ocurra dicho episodio. La presente descripción también proporciona usos de un fármaco que inhiben la actividad de complemento y un agente inmunosupresivo en la fabricación de un medicamento o paquete de medicamento. Dicho medicamento o paquete de medicamento es útil para prolongar la supervivencia del aloinjerto en un receptor, en particular, supervivencia crónica del aloinjerto. En modalidades preferidas, el medicamento o paquete de medicamento se formula y prepara de modo que sea adecuado para administración crónica al receptor del aloinjerto, por ejemplo, formulaciones estables son las empleadas. En ciertas modalidades, el medicamento o paquete de medicamento se formula y prepara de modo que sea adecuado para administración concurrente del fármaco que inhibe la actividad de complemento y el fármaco inmunosupresivo al receptor del aloinjerto. En ciertas modalidades, el medicamento o paquete de medicamento se formula y prepara de modo que sea adecuado para la administración secuencial (en cualquier orden) del fármaco que inhibe la actividad de complemento y el fármaco inmunosupresivo al receptor del aloinjerto. Un paquete farmacéutico de la presente descripción puede comprender un fármaco que inhibe la actividad de complemento y al menos un agente inmunosupresivo. El paquete farmacéutico puede comprender además una etiqueta para administración crónica. El paquete farmacéutico también puede comprender una etiqueta para auto-administración por parte de un paciente, por ejemplo, un receptor de un injerto de transplante o instrucciones para un cuidador de un receptor de un injerto de transplante. En ciertas modalidades, el fármaco y el agente en el paquete farmacéutico están en una formulación o formulaciones separadas que son adecuadas para administración crónica y/o autoadministración. La presente descripción también proporciona formulaciones liofilizadas y formulaciones adecuadas para inyección. Ciertas modalidades proporcionan una formulación de anticuerpo liofilizado que comprende un anticuerpo que inhibe la actividad de complemento y un lipoprotector. En modalidades preferidas, la formulación de anticuerpo es adecuada para administración crónica, por ejemplo, una formulación de anticuerpo es estable. Las modalidades alternativas proporcionan un sistema de inyección que comprende una jeringa; la jeringa comprende un cartucho que contiene un anticuerpo que inhibe la actividad de complemento y está en una formulación adecuada para inyección.

Un anticuerpo empleado en varias modalidades de la presente descripción, inhibe preferentemente la formación del complemento terminal o C5a. En ciertas modalidades, el anticuerpo que inhibe la formación de complemento terminal o C5a es un anticuerpo completo o un fragmento de anticuerpo. El anticuerpo completo o fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo humano, humanizado, quimerizado o desinmunizado o fragmento de anticuerpo. En ciertas modalidades, el anticuerpo completo o fragmento de anticuerpo puede inhibir la disociación del complemento C5. En ciertas modalidades, el fragmento de anticuerpo es Fab, F(ab')2, un Fv, un anticuerpo de dominio o un anticuerpo de cadena simple. En ciertas modalidades, el fragmento de anticuerpo es pexelizumab. En ciertas modalidades alternativas, el anticuerpo completo es eculizumab. En ciertas modalidades, un fármaco tal como un anticuerpo que inhibe la actividad de complemento se encuentra en una forma de dosificación de unidad, que puede ser adecuada particularmente para auto-administración. En forma similar, un agente inmunosupresivo de la presente descripción también puede encontrarse en una forma de una dosis de unidad. Un producto formulado de la presente descripción puede incluirse dentro de un contenedor, normalmente por ejemplo, un frasco, un cartucho, una jeringa prellenada o pluma desechable. Un dosificador, tal como el aparato dosificador descrito en la Patente Norteamericana Número 6,302,855 también puede ser utilizado, por ejemplo, con un sistema de inyección de la presente descripción. En ciertas modalidades, eculizumab se suministra en un régimen de dosificación de 600 mg a través de 25 a 45 infusión IV minutos cada 7 ± 12 días durante las primeras 4 semanas, seguido de 900 mg para la quinta dosis 7 ± 2 días después, posteriormente 900 mg cada 14 ± 2 días posteriormente. La administración puede ser mediante infusión IV durante 25 a 45 minutos. Eculizumab puede diluirse a una concentración final de 5 mg/mL antes de la administración. Una formulación "estable" es una en la cual el fármaco (por ejemplo un anticuerpo) o agente en el mismo retiene esencialmente su estabilidad física y química y su integridad al momento de almacenamiento. Varias técnicas analíticas para medir la estabilidad de proteína están disponibles en la técnica y son revisadas en la publicación de Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., Pubs. (1991) y Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). La estabilidad se puede medir a una temperatura seleccionada durante un periodo de tiempo seleccionado. Por ejemplo, el grado de agregación después de la liofilización y almacenamiento se puede utilizar como un indicador de estabilidad de proteína. Por ejemplo, una formulación "estable" puede ser una en donde menos de aproximadamente el 10% y preferentemente menos de aproximadamente el 5% de la proteína, esté presente como un agregado en la formulación. En otras modalidades, cualquier incremento en la formación de agregado después de la liofilización y almacenamiento de la formulación liofilizada, puede ser determinado. Por ejemplo, una formulación liofilizada "estable" puede ser una en donde el incremento en agregado en la formulación liofilizada sea menor a aproximadamente 5% y preferentemente menor a aproximadamente 5%, cuando la formulación liofilizada se almacene a una temperatura de 2 a 8°C durante al menos un año. En otras modalidades, la estabilidad de la formulación de proteína se puede medir utilizando un ensayo de actividad biológica. Una formulación "reconstituida" es una la cual ha sido preparada disolviendo una formulación de proteína liofilizada en un diluyente, de modo que la proteína se disperse en la formulación reconstituida. La formulación reconstituida es adecuada para la administración (por ejemplo, administración parenteral) a un paciente que será tratado con la proteína de interés, en ciertas modalidades de la presente invención, puede ser una que sea adecuada para administración subcutánea. Una formulación reconstituida isotónica es preferible en ciertas modalidades. Por el término "isotónico" se entiende que la formulación de interés tiene esencialmente la misma presión osmótica que la sangre humana. Las formulaciones isotónicas generalmente tendrán una presión osmótica de aproximadamente 250 a 350 mOsm. La isotonicidad se puede medir utilizando un osmómetro tipo presión de vapor o congelación-hielo, por ejemplo. Una "lioprotector" es una molécula la cual, cuando se combina con un fármaco (por ejemplo, anticuerpo) de interés, evita o reduce significativamente la inestabilidad química y/o física del fármaco (por ejemplo, anticuerpo), al momento de la liofilización y almacenamiento subsecuente. Los lioprotectores de ejemplo incluyen azúcares tales como sacarosa o trehalosa; un aminoácido tal como glutamato monosódico o histidina; una metilamina tal como betaina, una sal liotrópica tal como sulfato de magnesio; un poliol tal como alcoholes de azúcar superiores o trihídricos, por ejemplo, glicerina, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol, y manitol; propilénglicol; polietiléng I icol ; Plurónicos; y combinaciones de los mismos. El lioprotector preferido es un azúcar sin reducción, tal como trehalosa o sacarosa . El lioprotector se agrega a la formulación pre-liofilizada en una "cantidad de lioprotección" lo cual significa que, después de la liofilización del fármaco (por ejemplo, anticuerpo) en la presencia de la cantidad de lioprotección del lioprotector, el fármaco (por ejemplo, anticuerpo) retiene esencialmente su estabilidad física y química e integridad al momento de la liofilización y almacenamiento.

El "diluyente" de interés en la presente invención, es uno el cual es farmacéuticamente aceptable (seguro y no tóxico para administración a un humano) y es útil para la preparación de una formulación reconstituida. Los diluyentes de ejemplo incluyen agua estéril, agua bacteriostática para inyección (BWFI), una solución amortiguada con pH (por ejemplo, solución salina amortiguada con fosfato), solución salina estéril, solución de Ringer o solución de dextrosa. Un "conservador" es un compuesto al cual puede agregarse el diluyente para reducir esencialmente la acción bacteriana en la formulación reconstituida, facilitando de esta forma la producción, por ejemplo, de una formulación reconstituida de usos múltiples. Los ejemplos de conservadores potenciales incluyen cloruro de amonio de octadecildimetilbencilo, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio (una mezcla de cloruros de alquilbencildimetilamonio en donde los grupos alquilo son compuestos de cadena larga), y cloruro de benzetonio. Otros tipos de conservadores incluyen alcoholes aromáticos tales como fenol, butilo y alcohol bencílico parabenos de alquilo tales como paraben de metilo o propilo, catecol, resorcinol, ciclohexanol , 3-pentanol, y m-cresol. Un "agente de generación de volumen" es un compuesto que agrega masa a la mezcla liofilizada y contribuye a la estructura física de la pasta liofilizada (por ejemplo facilita la producción de una pasta liofilizada esencialmente uniforme que mantiene una estructura de poro abierta). Los agentes de generación de volumen de ejemplo incluyen manitol, glicina, polietilénglicol y sorbitol. Por consiguiente, se puede preparar una formulación de anticuerpo liofilizada estable utilizando un lioprotector (preferentemente un azúcar tal como sacarosa o trehalosa), en donde la formulación liofilizada puede ser reconstituida para generar una formulación reconstituida estable que tiene una concentración de anticuerpo la cual es significativamente mayor (por ejemplo, de aproximadamente 2 a 40 veces más, preferentemente 3 a 10 veces más y más preferentemente 3 a 6 veces más) que la concentración de anticuerpo en la formulación pre-liofilizada. Dichas concentraciones de proteína superior en la formulación es reconstituida, se consideran particularmente útiles cuando la formulación está proyectada para administración subcutánea. A pesar de la concentración muy alta de proteína en la formulación reconstituida, la formulación reconstituida puede ser estable (es decir falla en desplegar niveles significativos o no aceptables de inestabilidad química o física de la proteína) a una temperatura de 2 a 8°C, durante al menos a aproximadamente 30 días. Ver por ejemplo la Patente Norteamericana No. 6,821,515. En ciertas modalidades, la formulación reconstituida es isotónica. Cuando se reconstituye con un diluyente que comprende un conservador (tal como agua bacterioestática para inyección, BWFI), la formulación reconstituida puede ser utilizada como una formulación de usos múltiples. Dicha formulación es útil, por ejemplo, cuando un paciente requiere administraciones frecuentes del fármaco o anticuerpo y/o agente para tratar una condición médica crónica. La ventaja de una formulación de usos múltiples es que facilita el uso para el paciente, reduce el desperdicio, permitiendo el uso completo de los contenidos completos del frasco, y da como resultado ahorros en costos significativos para el fabricante, ya que se empacan varias dosis en un solo frasco (costos menores en cuanto relleno y envío). » La presente descripción también proporciona un método para preparar una formulación que comprende los pasos de: (a) liofilizar una mezcla de un anticuerpo y un lioprotector; y (b) reconstituir la mezcla liofilizada del paso (a) en un diluyente, de modo que la formulación reconstituida sea isotónica y estable. Un artículo de fabricación también se proporciona en la presente invención, y comprende: (a) un contenedor que contiene una mezcla liofilizada de un anticuerpo y un lioprotector; y (b) instrucciones para reconstituir la mezcla liofilizada con un diluyente a una concentración de anticuerpo deseable en la formulación reconstituida. El artículo de fabricación puede comprender además un segundo contenedor el cual contiene un diluyente (por ejemplo, agua bacteriostática para inyección (BWFI) que comprende un alcohol aromático). Un sistema de inyección de la presente invención puede emplear una pluma de suministro de medicamento tal como se describe en la Patente Norteamericana No. 5,308,341. Las plumas de suministro de medicamento han sido desarrolladas para facilitar la auto-administración del medicamento. Un medicamento de la presente descripción puede ser un fármaco que inhibe la actividad de complemento, por ejemplo un anticuerpo específico para el complemento C5, y/o un agente inmunosupresivo. Una pluma de suministro de medicamento incluye un contenedor en frasco en el cual se puede recibir un frasco de insulina u otro medicamento. El sujetador en frasco es una estructura alargada generalmente tubular con extremos próximos y distales. El extremo distal del sujetador del frasco incluye montar medios para encajar una cánula de aguja de extremo doble. El extremo próximo también incluye montar medios para encajar un cuerpo de la pluma que incluye un conductor y un aparato de ajuste de dosis. Un frasco desechable que contiene un medicamento para utilizarse con el contenedor en frasco de la técnica anterior, incluye un extremo distal que tiene septo elastomérico perforable que puede ser perforado por un extremo de una cánula de aguja de extremo doble. El extremo próximo de este frasco incluye una tapa colocada en forma deslizable en encaje hermético con la pared cilindrica del frasco. Esta pluma de suministro de medicamento se utiliza, insertando el frasco de medicamento en el contenedor en frasco. Posteriormente se conecta un cuerpo de la pluma al extremo próximo del contenedor en frasco. El cuerpo de la pluma incluye un aparato de ajuste de dosis para designar una dosis de medicamento que será suministrada por la pluma y un aparato de conducción para impulsar el tapón del frasco en forma distal una distancia que corresponda a la dosis seleccionada . El usuario de la pluma, monta una cánula de aguja de extremo doble en el extremo distal del contenedor en frasco, de modo que el punto próximo de la cánula de la aguja perfore el septo que se encuentra en el frasco. Posteriormente el paciente selecciona una dosis y opera la pluma para impulsar en forma distal el tapón para suministrar la dosis seleccionada. El aparato de selección de dosis regresa a cero al momento de la inyección de la dosis seleccionada. El paciente posteriormente elimina y desecha la cánula de la aguja, y mantiene la pluma en suministro de medicamento de la técnica anterior en un lugar conveniente para la siguiente administración del medicamento requerida. El medicamento en el frasco será expulsado después de diversas administraciones de medicamento. Posteriormente el paciente separa el contenedor en frasco del cuerpo de pluma. Posteriormente el frasco vacío puede ser eliminado y desechado. Se puede insertar un nuevo frasco en el contenedor en frasco, y en el contenedor en frasco y el cuerpo de pluma pueden ser reemsamblados y utilizados tal como se explicó anteriormente. Por consiguiente, una pluma de suministro de medicamento tiene generalmente un mecanismo de una conducción para una dosis precisa y facilidad de uso. Un mecanismo de dosificación, tal como un botón giratorio permite al usuario ajustar la forma precisa la cantidad de medicamento que será inyectada a través de la pluma desde un frasco de medicamento previamente empacado. Para inyectar la dosis de medicamento, el usuario inserta la aguja debajo de la piel y oprime el botón una ves tanto como se vaya a oprimir. La pluma puede ser un aparato completamente mecánico o puede ser combinado con un circuito electrónico para ajustar y/o indicar en forma precisa la dosis de medicamento que es inyectada en el usuario. Ver Patente Norteamericana No. 6,192,891. La presente descripción también presenta formulaciones de liberación controlada o liberación prolongada adecuadas para auto-administración y/o administración crónica de un medicamento. Las diversas formulaciones pueden ser administradas a un paciente que necesita de tratamiento (por ejemplo, el receptor de un aloinjerto) con el medicamento (por ejemplo, un anticuerpo de la presente descripción y al menos un agente inmunosupresor) mediante administración intravenosa en la forma de un bolo o mediante infusión continua durante un periodo de tiempo, mediante rutas intramusculares, in.traperitoneales, intracerebroespinales, subcutáneas, intra-articulares, intrasinovial, intratecales, orales, tópicas, o mediante inhalación. En ciertas modalidades, se administra una formulación al paciente mediante administración subcutánea (es decir, debajo de la piel). Para dichos propósitos, la formulación puede ser inyectada utilizando una jeringa. Sin embargo, están disponibles otros aparatos para administración de una formulación tal como aparatos de inyección (por ejemplo, los aparatos Inject-ease® y Genject®); plumas inyectoras (tal como GenPen®); aparatos sin aguja (por ejemplo, Medi Jector® y BioJector®); y sistemas de suministro de parches subcutáneos. Los métodos y usos de la presente invención se describen con referencia a los siguientes Ejemplos, los cuales se presentan a manera de ilustración y no pretenden limitar en forma alguna la descripción. Se utilizan técnicas estándar conocidas en el arte o las técnicas descritas en forma específica más adelante. En la presente invención se utilizan las siguientes abreviaturas: ABMR, rechazo transmitido por anticuerpo; ACHR, rechazo humoral acelerado; ACR, rechazo celular agudo; AVR, rechazo vascular agudo; CsA, ciclosporina; CyP, ciclofosfamida; HAR, rechazo hiperagudo; MCP-1, proteína 1 quimotáctica de monocito; MST, tiempo de supervivencia promedio; POD, día postoperatorio. Ejemplo 1 Métodos Animales y Fármacos Inmunosupresivos: se eligieron como donantes y receptores, respectivamente ratones machos adultos C3H (H-2k) y ratones BALB/c (H-2d) (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine) con un peso de 25 a 30 gramos. En los grupos que reciben inmunosupresor, los receptores se inyectaron con CsA (15 mg/kg/día, s.c, diariamente a partir del día 0 hasta el rechazo del punto de extremo o hasta el día 100), o con CyP (40 mg/kg/día, i.v., el día 0 y 1), o con anti-C5 mAb (clon BB5.1, Alexion Pharmaceuticals Inc., 40 mg/kg/día, i.p., día 0-2, seguido de dos veces a la semana, día 0-60). Los animales se alojaron bajo condiciones convencionales en la Instalación para el Cuidado de Animales, de la University of Western Ontario, y se cuidaron de acuerdo con los lineamientos establecidos por el Canadian Council on Animal Care. Olfert y asociados, 1993. Presensibilización de la Piel: Se cortaron injertos de piel de grosor completo tomados de donantes C3H en piezas cuadradas de 1x1 cm2 y se transplantaron en la parte trasera del tórax de los receptores BALB/c una semana antes del transplante del corazón procedente de los mismos donantes. Se definió el rechazo como necrosis completa de los injertos de la piel. Transplante Abdominal y Cardiaco Cervical: Siete días después de la presensibilización de la piel, de transplantaron corazones de ratón C3H en el abdomen de receptores BALB/c presensibilizados, anastomosando al aorta del donante y la aorta del receptor, y la arteria pulmonar del donante y la vena cava inferior del receptor. En los grupos con re-transplante, se transplantaron segundos injertos de corazón recolectados ya sea de ratones C3H naive o de receptores BALB/c presensibilizados sobrevivieron un largo plazo, en el área cervical de los receptores que lleva una supervivencia a largo plazo del primer injerto de corazón abdominal anastomosando la aorta del donante y la arteria carótida del receptor, y la arteria pulmonar del donante y la vena yugular externa del receptor (de extremo a la parte lateral). Los injertos de corazón se monitorearon diariamente hasta el rechazo a menos que se indicará de otra forma, y el rechazo se definió como un término total de la pulsación. Grupos Experimentales: se asignaron en forma aleatoria receptores presensibilizados a ocho grupos, consistiendo cada uno de ocho animales: Grupo 1, ratón sin tratamiento; Grupo 2, ratón tratado con CsA; Grupo 3, ratón tratado con CyP; Grupo 4, ratón tratado con CsA plus CyP; Grupo 5, ratón tratado con anti-C5 mAb; Grupo 6, ratón tratado con anti-C5 mAb plus CsA; Grupo 7, ratón tratado con anti-C5 mAb plus CyP; Grupo 8, ratón tratado con anti-C5 mAb en combinación con CsA y CyP. Cuando ya no fueron palpables los impulsos cardiacos o en POD100, los injertos se eliminaron para histología de rutina, se recolectaron muestras de suero de análisis de inmunohistoquímica, y de manchado western, para análisis citométricos de flujo y ensayo hemolítico de complemento. Se colocaron cinco animales adicionales y se sacrificaron en grupos de 6 y 8 en POD3 (MST para grupos 1-5, 7) para permitir comparaciones en un punto de tiempo uniforme. También se recolectaron muestras de suero en POD 11, 21, 28 y 60 en el Grupo 8 para detectar los cambios secuenciales de los niveles de anticuerpo anti-donante y actividad de complemento. Además, los receptores presensibilizados tratados con terapia triple llevaron un primer injerto de corazón durante 100 días, se les re-transplantó un segundo corazón. Se utilizó un corazón C3H naive o un corazón C3H con supervivencia de 100 días de otro receptor BALB/c presensibilizado, como el segundo corazón. Se incluyeron ocho animales en cada grupo de re-transplante. Histología de Injerto: Se fijaron muestras de tejido en formaldehído amortiguada al 10%. Los especímenes se incrustaron posteriormente en parafina, y se seccionaron para manchado H&E. Las secciones microscópicas se revisaron en una forma ciega con respecto a severidad del rechazo por parte de un patólogo. Los criterios para rechazo de injerto incluyeron la presencia de vasculitis, trombosis, hemorragia, e infiltración de linfocitos. Estos cambios se calificaron como: 0, sin cambio; 1, cambio mínimo; 2, cambio leve; 3, cambio moderado; o 4, cambio marcado. Inmunohistoquímica: Se cortaron secciones de cuatro micrómetros de muestras de tejido incrustadas en gel Tissue-Tek O.C.T (Optimum Cutting Temperature, Skura Finetek, Torrance, CA) montadas en correderas de microscopios de vidrio recubiertas con gelatina y se tiñeron a través de un método de tinción de inmunoperoxidasa de avidina-biotina indirecta utilizando un equipo Elite Vectastain ABC (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA). Se tiñeron especímenes para células CD4+ y CD8+ con mAb CD4 anti-ratón de rata conjugado con biotina (clon YTS 191.1.2, Cedarlane Laboratories Ltd., Hornby, Ontario, Canadá) y mAb CD8 anti-ratón de rata conjugado con biotina (clon 53-6.7, Pharmingen, Franklin Lakes, NJ), respectivamente. Se detectó la infiltración de monocito/macrófago intrainjerto tiñendo con mAb Mac-1 antiratón de rata conjugado con biotina (Cedarlane Laboratories Ltd., Hornby, Ontario, Canadá). Se detectó el depósito IgG e IgM de ratón en injertos utilizando anti-raton-lgM y anti-ratón-IgG de cabra conjugado con biotina (Cedarlane). Para identificación de depósito de complemento, se incubaron en serie secciones con Abs policlonal anti-C3 ó anti-C5 de cabra (Quidel, San Diego, CA), IgG anti-cabra de conejo biotinilado (Vector Laboratories), y estreptavidina-conjugada-HRP (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA). Se lavaron las correderas con solución salina amortiguada con fosfato entre los pasos, y se revisó bajo microscopio de luz. Los controles negativos se llevaron a cabo omitiendo los anticuerpos primarios. Se calificó el inmunomanchado en cinco campos de alta potencia de cada sección, y se llevaron a cabo cinco experimentos independientes. Las secciones de manchado de inmunoperoxidasa se graduaron de 0 a 4+ de acuerdo con la intensidad de manchado: 0, negativo; 1+, equivocado; 2 + , manchado débil; 3 + , manchado moderado; y 4 + , manchado muy intenso. Citometría de Flujo: Se evaluaron anticuerpos IgG e IgM específico anti-donante en la circulación en el suero de receptor mediante citometría de flujo FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Glotz y asociados, (1993); Tyan y asociados (1994). Se aislaron esplenocitos de ratón C3H y se incubaron a una temperatura de 37°C durante 30 minutos con suero procedente de grupos de control y experimentales naive. Para teñir los IgG, lgG1, lgG2a, lgG2b e IgM, las células se lavaron e incubaron con anticuerpo de cabra conjugado-FITC para la parte Fe del IgG de ratón o con anticuerpo de cabra conjugado-ficoeritrina para la cadena-µ de IgM de ratón (Jackson I mmunoResearch Laboratories, West Grove, PA), o con lgG1 anti-ratón de cabra conjugado con FITC (CALTAG Laboratories, Burlingame, CA), o con lgG2a anti-ratón de cabra conjugado con FITC (CALTAG), o con lgG2b anti-ratón de cabra conjugado con FITC (CALTAG). Después de 1 hora de manchado a una temperatura de 4°C, las células se lavaron con PBS, se resuspendieron a 5x106/ml_, y analizaron mediante citometría de flujo para intensidad de fluorescencia de canal promedio, lo cual representa la reactividad de enlace de anticuerpo. Ensayo Hemolítico de Complemento: Se diluyó en serie mAb anti-C5 purificado dos veces (175-0.1 g/ml) en amortiguador GVB2+ (solución salina amortiguada-Veronal de gelatina: 0.1% gelatina, 141 mM NaCI, 0.5 mM gCI2, 0.15 mM CaCI2, y 1 8 mM de barbital de sodio) y se agregaron por triplicado (50pl/depósito) a una placa de 96 depósitos. Se diluyó suero de ratón BALB/c en 40% v/v con amortiguador GVB2+ y se agregó (50 µ?/ml) a las filas de la misma placa de 96 depósitos, de modo que la concentración final de suero de ratón BALB/c en cada depósito fuera del 20%. Posteriormente la placa se incubó a una temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos, mientras se prepararon eritrocitos de pollo. Los eritrocitos de pollo se lavaron 5x1 mi con amortiguador GVB2+ y se resuspendieron a una concentración final de 5x107/ml en GVB2 + . Se sensibilizaron cuatro mililitros de eritrocitos de pollo agregando anticuerpo policlonal RBC anti-pollo (Intercell Technologies, HopeweII, NJ, 0.1% v/v) y las células se incubaron a una temperatura de 4°C durante 15 minutos con vortizado frecuente. Posteriormente las células se lavaron con 2x1 mi con GVB2+ y se resuspendieron a un volumen final de 2.4 mi en GVB2 + . Los eritrocitos de pollo (30 pl/depósito,2.5x1 O6 células) se agregaron a la placa que contiene suero y mAb anti-C5 tal como se describió anteriormente, se mezclaron bien y se incubaron a una temperatura de 37°C durante 30 minutos. Posteriormente la placa se centrifugó en 1000xg durante 2 minutos, y se transfirieron 85 µ? de sobrenadante a una nueva placa de microtitulación de 96 depósitos. La placa se leyó en OD 415 nm utilizando un lector de microplaca y el porcentaje de hemolisis fue determinado utilizando esta fórmula: (muestra OD) - (control OD GVB2+) % de hemolisis = 100 x (control lisado al 100% OD) - (control OD GVB2+) con 100% de control lisado obtenido mediante la adición de 100 µ? GVB2+ que contiene 0.1% NP-40 para los 30 Mg/ml de los eritrocitos de pollo tal como se preparó anteriormente. Análisis de Manchado Western: La sonicación de muestras de corazón congeladas se llevó a cabo en amortiguador de Iisis RIPA (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) a una temperatura de 4°C durante 1 minuto en intervalos de 10-segundos, seguido de microcentrif ugación en 13,000 rpm durante 10 minutos a una temperatura de 4°C. Los sobrenadantes calificados se cuantificaron inmediatamente con triplicado con respecto al contenido de proteína utilizando un equipo de ensayo de proteína compatible-Detergente (BIO-RAD). Se separaron los Usados de corazón (10pg proteína/depósito) en NuPAGE, geles Bis-Tris de gradiente de 4-12% y sistema de amortiguador MES (Invitrogen) y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (0.45 pm de tamaño de poro; Invitrogen) utilizando un aparato de transferencia semi-seco (BIO-RAD). Las membranas se cortaron en forma adecuada en los pesos moleculares correctos para permitir el desarrollo de manchados con dos diferentes anticuerpos primarios por manchado, de modo que cada manchado se expusiera a un anticuerpo de prueba y a un anticuerpo de control interno para asegurar una carga de muestra igual. Los anticuerpos primarios de prueba incluyendo suero policlonal de conejo anti-Bcl-2 (N-19) (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) y suero policlonal de conejo anti-Bcl-XS/L (M-125) (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) se utilizaron para detectar la expresión intrainjerto de proteínas Bcl-2 y Bcl-xl. Se utilizaron sueros policlonales de conejo anti-calsequestrin (Calbiochem) como anticuerpos primarios de control interno (Kobayashi y asociados, 1999). Se llevó a cabo la detección de enlace de anticuerpo primario tal como se describió anteriormente (Arp y asociados, 1996) exponiendo manchados incubados lavados a una fracción IgG anti-conejo de cabra policlonal conjugado para peroxidasa de rábano (HRP; Roche Laboratories) y posteriormente se desarrollaron en forma adecuada mediante exposición para aumentar la quimioluminiscencia para anticuerpos conjugados-HRP (Roche Laboratories). Análisis Estadístico. Los datos se reportaron como el promedio ± SD. La supervivencia de aloinjerto de los grupos experimentales se comparó utilizando una prueba de clasificación-registro. Se analizaron los hallazgos histológicos e ¡nmunohistológicos utilizando la prueba Mann-Whitney U. Los datos citométricos de flujo y los datos de manchado western se analizaron utilizando un ANOVA de una vía. Las diferencias con valores p menores a 0.05 se consideraron significativas. Ejemplo 2 Presensibilización con injerto de piel de donante C3H induce ACHR transmitida por anticuerpo en injertos de corazón de receptores BALB/c. Para desarrollar un modelo de animal pequeño adecuado que mimetice a los pacientes presensibilizados en las clínicas y para estudiar ABMR, se ha desarrollado un modelo ABMR de ratón MHC completamente incompantible, novedoso mediante presensibilización de receptores de ratón. En este modelo, los receptores BALB/c se presensibilizaron con injertos de piel de donante C3H una semana antes del transplante de corazón procedente del mismo donante. Siete días después de la presensibilización, de piel del donante, se elevaron de manera remarcada los niveles en suero de IgG anti-donante pero no de anticuerpo IgM y llegaron a un nivel pico en los receptores BALB/c presensibilizados (Figura 1A). El transplante de corazón del mismo donante se llevó a cabo posteriormente en estos receptores sensibilizados en forma superior. Sin inmunosupresión, los injertos de corazón C3H se rechazaron rápidamente en 3.1 ± 0.4 días mediante ACHR, caracterizados por trombosis severa, hemorragia e infarto (Figura 1B-a). En contraste, los mismos injertos de corazón en receptores BALB/c no sensibilizados (con un tiempo de supervivencia promedio, MST de 8.2 ± 0.8 días) mostraron la histología normal al día 3 posterior de la operación (POD) (Figura 1B-b). Cuando se comparó con receptores BALB/c no sensibilizados el mismo día, los injertos de corazón en animales presensibilizados revelaron anticuerpo IgG masivo y depósito de complemento (C3 y C5), aunque una mínima infiltración de células CD4+ y CD8+ (Tabla 1). Además, los niveles IgG anti-donante en la circulación en receptores presensibilizados fueron significativamente mayores a los de los mismos receptores no sensibilizados que reciben un injerto de corazón en POD3 (P<0.01, Figura 1C). Sin embargo, el IgM anti-donante permaneció en niveles muy bajos tanto en la circulación (Figura 1C) como en los injertos de corazón (Tabla 1) y no mostraron diferencia significativa entre receptores no sensibilizados y presensibilizados. Además, los niveles normales de actividad hemolítica de complemento se mostraron tanto en receptores de corazón presensibilizados como no sensibilizados sin tratamiento (Figura 1D). Estos datos indican que este es un modelo de transplante ideal para el estudio de ABMR en receptores presensibilizados, en donde el complemento juega un papel importante en la patogénesis. Tabla 1. Comparación de cambios inmunohistolóqicos de aloinjertos de corazón C3H en receptores BALB/c no sensibilizados v presensibilizados en POD3 No Sensibilizados Presensibilizados Grupos igG 1 + 4+ igM 1 + 1 + C3 2+ 3+ C5 2+ 3+ CD4 0 1 + CD8 0 1 + Grados para manchado de inmunoperoxidasa: 0, negativo; 1+, equivocado; 2+, débil; 3+, moderado; 4+, intenso.

MAb Anti-C5 en combinación con CsA y CyP evita ABMR y logra una supervivencia del injerto de corazón indefinida en receptores de ratón presensibilizados. El complemento ha mostrado jugar un papel importante en ABMR. Sin embargo, el efecto de bloqueo funcional de la cascada de complemento terminal en el nivel C5 el receptor es altamente sensibilizado, aún no es conocido. En el estudio aquí presentado, se utilizó el modelo presensibilizado para estudiar la eficacia de mAb anti-C5 ya sea solo o combinado con CsA y/o CyP en la prevención de ABMR. Tal como se presenta en la figura 2A, el tratamiento ya sea con CsA ó CyP o los dos fármacos en combinación no evitó ABMR si los injertos fueron rechazados en 3.0 ± 0.0 días, 3.3 ± 0.5 días y 3.5 ± 0.6 días, respectivamente, con características patológicas típicas de ACHR incluyendo trombosis intravascular y hemorragia intersticial (figura 2B-b, c, d), los cuales fueron indistinguibles de injertos de corazón en receptores BALB/c presensibilizados, no tratados (figura 2B-a). No estuvo disponible la monoterapia anti-C5 o combinada con CyP para mejorar la supervivencia de injerto y los injertos de corazón fueron rechazados por ACHR (Figura 2B-e, f) en 3.5 ± 0.6 días y 3.2 ± 0.4 días, respectivamente, (Figura 2A). Aunque la terapia de combinación de mAb de anti-C5 y CsA, el protocolo capaz de inducir supervivencia de aloinjerto de corazón a largo plazo en animales no sensibilizados, prolongó marginalmente la supervivencia de injerto en este modelo presensibilizado, los injertos de corazón también fueron rechazados por rechazo humoral severo con vasculitis, trombosis, hemorragia y mínima infiltración de célula (Figura 2B-g) en los 11.9 ± 1.8 días (Figura 2A). En contraste, la terapia triple de mAb anti-C5 en combinación con CsA y CyP logró una supervivencia de injerto de corazón indefinida durante 100 días (Figura 2A) en animales presensibilizados (P<0.01 vs. los animales sin tratamiento o tratados ya sea con monoterapia o dos fármacos en combinación) sin evidencia de rechazo (Figura 2B-h). En este modelo de ratón presensibilizado, tal como se muestra en la Tabla 2, únicamente se observó una infiltración de célula CD4 + y CD8+ intrainjerto menor en los receptores que rechazaron sus injertos de corazón a los 3 días. Sin embargo, el número de estas células T fue incrementada ligeramente si los injertos de corazón sobrevivieron más en receptores tratados con mAb anti-C5 más CsA al momento del rechazo (POD11) y en receptores tratados con terapia triple en etapas tempranas de supervivencia de injerto (por ejemplo, POD11). Además, con el tratamiento continuo de CsA en el grupo de terapia triple, se inhibió la infiltración de célula CD4+ y CD8+ en injertos de corazón de supervivencia a largo plazo en POD60 y 100. Además, la infiltración de célula Mac-1+ intrainjerto moderado, incluyendo monocitos y macrófagos, se descubrió en animales no tratados y tratados con CsA-, CyP- o CsA más CyP, en tanto que la infiltración de estas células se redujo significativamente en animales tratados con mAb anti-C5 (Tabla 2). Estos resultados indican que el bloqueo funcional de mAb anti-C5, habilita el uso y eficacia de agentes inmunosupresivos convencionales, evitando de esta forma ABMR y logrando una supervivencia indefinida del injerto de corazón en receptores presensibilizados. Tabla 2. Grados para manchado de inmunoperoxidasa de aloiniertos de corazón en receptores de ratón presensibilizados en necropsia C3 C5 CD8 Mac-1 IgG igM Fecha de la recolección Grupos CD4 de muestra (POD) No tratado 3 3+ 3+ 1 + 1 + 3+ 4+ 1 + CsA 3 3+ 3+ 1 + 1 + 3+ 4+ 1 + CyP 3 3+ 3+ 1 + 1 + 3+ 3+ . 1 + CsA+CyP 3 3+ 3+ 1 + 1 + 3+ 3+ 1 + Anti-C5mAb 3 3+ 0 1 + 1 + 2+ 4+ 1 + Anti-C5mAb+CsA 11 3+ 0 2+ 2+ 2+ 4+ 1 + Anti-C5mAb+CyP 3 3+ 0 1 + 1 + 2+ 3+ 1 + Anti-C5mAb+CsA+CyP 3 3+ 0 1 + 1 + 2+ 3+ 1 + Anti-C5mAb+CsA+CyP 11 3+ 0 2+ 2+ 1 + 3+ 1 + Anti-C5mAb+CsA+CyP 60 3+ 0 1 + 1 + 0 2+ 1 + Anti-C5mAb+CsA+CyP 100 3+ 2+ 0 0 0 2+ 1 + Grados: 0, negativo; 1+, equivoco; 2+, débil; 3+, moderado; 4+, intenso. mAb anti-C5 inhibe completamente la actividad hemolítica de complemento total y la deposición C5 local en receptores presensibilizados que reciben un aloinjerto de corazón. El rqAb anti-C5 mostró previamente bloquear la disociación de la proteína de complemento C5 en las moléculas pro- inflamatorias C5a y C5b-9 (Kroshus y asociados, 1995), y bloquear en forma completa y consistente la actividad de complemento terminal en ratones (Wang y asociados, 1999). En el estudio de este momento, se midió la terminal de complemento terminal evaluando la capacidad del suero de ratón del receptor para lisar eritrocitos de pollo presensibilizados con anticuerpos y se comparó en el mismo punto de tiempo (POD3). El tratamiento de ratones ya sea con CsA o CyP o los dos fármacos en combinación, no tuvo efecto en la actividad de complemento terminal, en tanto que el tratamiento con mAb anti-C5 ya sea solo o combinado con CsA y/o CyP inhibió completamente esta actividad (Figura 3; P<0.01, vs. animales naive y no tratados, así como animales tratados CsA-, CyP, ó CsA más CyP). Además, los sueros obtenidos de animales tratados con mAb anti-C5 en varios puntos de tiempo anteriores demostró actividad hemolítica similarmente disminuida, que sugiere que el complemento terminal de suero fue inhibido a lo largo del período de tratamiento. Además, la deposición local C5 en los injertos de corazón se evitó completamente en los receptores presensibilizados tratados con mAb anti-C5, pero no en los no tratados, o en los animales presensibilizados tratados con CsA-, CyP y CsA más CyP (Tabla 2). Tal como se anticipó, el tratamiento con mAb anti-C5 no evitó la deposición C3 en los injertos (Tabla 2). Estos resultados sugieren que la terapia anti-C5 bloqueó completamente la actividad de complemento total después de aloinjerto cardíaco en receptores altamente sensibilizados. Supervivencia a largo plazo de injertos de corazón en animales presensibilizados que son resistentes a lesión humoral en la presencia de un bajo nivel de anticuerpos y complemento antidonante en una situación de adapta.ción . Para investigar en forma adicional el papel del mAb anti-C5 en rechazo humoral, se midieron niveles de aloanticuerpo anti-donante en suero de receptores mediante citometría de flujo y el depósito de anticuerpo intra-injerto, utilizando técnicas de inmunomanchado en diferentes grupos. La figura 4A muestra que en receptores BALB/c presensibilizados no tratados POD3, hubieron altos niveles de anticuerpos IgG antidonante en la circulación. Cuando los receptores presensibilizados reciben monoterapia o dos fármacos en combinación, CsA y/o CyP se desactivan parcialmente los niveles IgG anti-donante en la circulación, en tanto que el tratamiento con mAb anti-C5 ya sea solo o combinado con CsA o CyP no afecta en forma adicional los niveles de anticuerpo anti-donante en el mismo día. En contraste, con terapia triple de mAb anti-C5 CsA y CyP, se desactivó gradualmente un alto nivel de IgG anti-donante en la circulación y alcanzó un nivel bajo en POD60, permaneciendo posteriormente en este nivel hasta el día 100 (Figura 4B). En forma similar a los niveles de anticuerpos de la circulación en diferentes grupos de tratamiento, la Tabla 2 muestra que el depósito fuerte de IgG anti-ratón estuvo presente en los injertos de corazón rechazados rápidamente de animales presensibilizados sin tratamiento o tratados con monoterapia o dos fármacos en terapia de combinación. En forma interesante, con terapia triple, el depósito de anticuerpo IgG fue atenuado gradualmente hasta un nivel leve en los injertos de corazón que sobreviven a largo plazo en POD 100 (Figura 4C-a, Tabla 2). En este modelo, IgM permaneció en niveles muy bajos ya sea en la circulación (Figura 4A, B) o injertos de corazón transplantados (Figura 4C-b, Tabla 2) en receptores presensibilizados con o sin tratamiento. Además, el tratamiento con mAb anti-C5 eliminó la actividad de complemento a un nivel indetectable hasta el día 60, seguido de una recuperación progresiva a niveles pre-agotamiento en POD 100, después de la interrupción de una terapia anti-C5 en receptores de ratón presensibilizados que reciben terapia triple (Figura 4D). Además, el depósito de intrainjerto C5 también fue detectado en animales presensibilizados de supervivencia de 100 días (Tabla 2). Estos datos demuestran que ocurre un acomodo de transplante en curso en receptores presensibilizados tratados con terap.ia triple, a pesar de la presencia de anticuerpos anti-injertos y activación de complemento. mAb anti-C5 en combinación con CsA y CyP reduce la proporción IgG 1 /lgG2a y conduce a un cambio en la subclase IgG a lgG2b en receptores con injerto acomodados. Para determinar si la terapia triple a base de mAb anti-C5 puede inducir a un cambio en la subclase IgG, lo cual puede estar asociado con el acomodo, se compararon niveles de suero de la subclase IgG anti-donante de lgG1, lgG2a e lgG2b entre receptores no tratados y los receptores con injerto de corazón acomodado. Los sueros de receptores no tratados contuvieron isotipo predominante I g G 1 , indicada por una alta proporción de lgG1/lgG2a (Figura 5A). En contraste, se observó una reducción significativa en la proporción de lgG1/lgG2a en los receptores que llevan injertos acomodados (Figura 5A, P<0.01). Además, los receptores presensibilizados con los injertos de corazón acomodados desplegaron un nivel acomodado de un nivel incrementado de lgG2b anti-donante en comparación con los mismos receptores con injertos rechazados (Figura 5B, P<0.01). Además, el patrón de los isotipos IgG en los receptores tratados ya sea con monoterapia o dos fármacos en combinación, es indistinguible del de los animales no tratados. Estos datos indican que el isotipo lgG1 anti-donante puede estar asociado con rechazo de injerto, en tanto que la producción de la sub-clase lgG2b anti-donante puede funcionar como un anticuerpo protector y juega un papel importante en la inducción del acomodo. mAb anti-C5 en combinación con CsA y CyP induce la expresión de Bcl-2 y Bcl-xl intrainjerto en receptores de ratón altamente sensibilizados. Para determinar si existe una relación causal entre la expresión intrainjerto de las proteínas protectoras y la resistencia del injerto a lesión humoral en este modelo, se emplearon análisis de manchado western para detectar proteínas de interés en tejido de injerto de corazón procedentes de receptores de ratón altamente sensibilizados. Se descubrió que los injertos de corazón con supervivencia a largo plazo expresan altos niveles de proteínas Bcl-2 y Bcl-xl en POD100, y estas proteínas fueron detectadas tan pronto como a los 12 días después del transplante de corazón en receptores altamente sensibilizados que reciben terapia triple a base de mAb anti-C5 (Figura 6). En contraste, no hubieron proteínas Bcl-2 y Bcl-xl expresadas en injertos de corazón de animales no tratados (Figura 6) o animales tratados ya sea con monoterapia o dos fármacos en terapia de combinación. Este resultado sugiere que la resistencia de injerto a lesión humoral en animales con supervivencia indefinida está asociada con la protección proporcionada por las proteínas Bcl-2 y Bcl-xl en este modelo presensibilizado. Receptores presensibilizados con un acomodo de primer injerto de corazón, aceptan un segundo injerto de corazón acomodado, pero rechazan un segundo injerto de corazón naive procedente de los mismos donantes. La capacidad de injertos acomodados para resistir el rechazo no ha sido probada directamente bajo condiciones patofisiológicas, en donde los injertos naive que pasan por rechazo después del alotransplante. En este modelo, para determinar si los receptores presensibilizados con un primer injerto de corazón en acomodo aceptarán un segundo injerto acomodado pero rechazarán un segundo intento naive, se llevaron a cabo escenarios de re-transplante. Después de que los injertos de corazón C3H acomodados han sobrevivido hasta el punto de los 100 días, el tiempo en el cual los bajos niveles de aloanticuerpos fueron detectados (Figura 4B) y la actividad de complemento ha regresado a niveles pretratamiento (Figura 4D), en receptores BALB/c presensibilizados tratados con terapia triple a base de mAb anti-C5, estos receptores recibieron un segundo injerto de corazón. En forma específica, ya sea un corazón C3H naive (Figura 7A) o acomodado 100 días (Figura 7B) de otro receptor BALB/c presensibilizado se transplantó en el cuello de los receptores presensibilizados que llevan un primer corazón C3H en acomodo. Estos receptores rechazaron un segundo corazón naive en 6.6 ± 1.1 días (Figura 8A) con AVR severo (Figura 8B-a) aunque el primer corazón continuó sobreviviendo. En contraste, cuando los corazones acomodados que habían ya sobrevivido durante 100 días en diferentes ratones presensibilizados fueron utilizados como segundos injertos, estos injertos fueron aceptados por receptores presensibilizados que llevan un primer injerto de corazón en acomodo (Figura 8A). No hubo signos de rechazo en los segundos injertos de corazón acomodados de 90 días después de un segundo transplante (Figura 8B-b). Estos datos indican que los injertos acomodados se vuelven resistente a los efectos de anticuerpos anti-donantes y de complemento que normalmente transmiten rechazo de aloinjerto en estos receptores presensibilizados. Además, el hecho de que el huésped del injerto acomodado rechace un nuevo injerto, sugiere que el acomodo implica cambios para el injerto. Receptores presensibilizados que son tratados con CsA rechazan injertos de corazón acomodados. Se llevó a cabo otro re-transplante para determinar si el acomodo en este modelo presensibilizado puede ser originado por los cambios en los injertos y/o los receptores. En forma específica, después de que se habían acomodado los injertos de corazón C3H en ratones BALB/c presensibilizados durante 100 días, el injerto de corazón acomodado posteriormente será re-transplantado en un segundo receptor BALB/c presensibilizado que está siendo tratado con CsA solo (Figura 7C), una terapia que puede evitar el rechazo celular pero no puede evitar el rechazo humoral acelerado de un corazón C3H fresco en receptores presensibilizados. Los injertos de corazón C3H acomodados fueron rechazados rápidamente en receptores BALB/c presensibilizados tratados con receptores CsA. Después de un re-transplante, la patología en injertos de corazón acomodados cambió de ACHR normal (Figura 9A) a severo con hemorragia intersticial masiva, pero pocos infiltrados celulares (Figura 9B). Además, los altos niveles de IgG anti-donante de los niveles normales de actividad hemolítica de complemento en estos receptores que reciben un corazón C3H acomodado, fueron similares a los de receptores presensibllizados tratados con CsA que reciben un corazón C3H naive. Este resultado indica además que el acomodo inducido por terapia triple a base de mAb anti-C5, puede originarse de mecanismos que implican cambios no únicamente para el injerto, sino también para el receptor. Ejemplo 3 Rechazo Vascular Agudo en Modelo de Transplante de Corazón Se llevaron a cabo experimentos para determinar si la inclusión de un inhibidor de formación de complemento terminal puede atenuar el rechazo vascular agudo y si el uso de dicho inhibidor junto con un inmunosupresor puede lograr supervivencia de aloinjerto a largo plazo. En este grupo de experimentos, se utilizó un anticuerpo monoclonal anti-C5 junto con ciclosporina. El modelo utilizado fue un transplante de corazón heterotópico de aloinjerto de ratones BALB/c en ratones C3H. Este modelo es un modelo de rechazo vascular agudo estricto con los ratones BALB/c y C3H teniendo un MHC fuertemente incompatible. Los transplantes y otros métodos se llevaron a cabo tal como se describe en la publicación de Wang y asociados (2003). Transplante Cardiaco Heterotópico Se llevó a cabo el transplante cardiaco heterotópico intra-abdominal tal como se describió anteriormente en la Publicación de Wang y asociados (2003). En síntesis, se llevó a cabo en el donante una esternotomía mediana, y el injerto de corazón perfusionó lentamente in situ con 1.0 mi solución de lactato de Ringer heparinizada fría a través de la vena cava inferior y la aorta antes de que la vena cava superior y las venas pulmonares fueran ligadas y divididas. La aorta ascendente y la arteria pulmonar fueron transectadas, y el injerto fue eliminado del donante. El injerto posteriormente fue revascularizado con anastomosis de extremo a parte lateral entre la arteria pulmonar del donante y la vena cava inferior del receptor así como la aorta del donante y la aorta abdominal del receptor utilizando una sutura de 11-0 de nylon. La palpitación de corazón injertado se monitoreó diariamente mediante palpación abdominal directa. El grado de pulsación se calificó como: A, palpitación fuerte; B, disminución notable en la intensidad de pulsación; o C, termino total de los impulsos cardiacos. Cuando los impulsos cardiacos ya no fueron palpables, el injerto se eliminó para histología de rutina. En ciertos casos, los ratones en los cuales el injerto aún estaba funcionando, fueron sacrificados para llevar a cabo histología.

Resultados Se dividieron los ratones (machos de 8 a 12 semanas de edad que pesan de 25 a 30 g) en seis grupos experimentales con de seis a ocho ratones por grupo. El transplante ocurrió el día 0. Se revisaron los cambios histológicos en el punto de extremo (siendo el punto de extremo la falla del injerto) o en algunos casos, se sacrificó un ratón antes de la falla del injerto. Las dosis de BB5.1 la cual se administró (40 mg/kg peso corporal tres veces por semana) fue conocida a partir de los estudios previos para inhibir completamente la actividad de complemento de terminal. Grupo 1' (control) - a los ratones se les administró 0.75 ml_ de solución salina en forma intraperitoneal en los días -1, 0, 1 y 2. En forma subsecuente estos ratones se trataron con 0.75 ml_ de solución salina intraperitoneal tres veces por semana (Lunes, Miércoles, Viernes) hasta el punto de extremo.

Grupo 2' (ciclosporina A sola) - a los ratones se les administró 15 mg/kg peso corporal de ciclosporina A en forma subcutánea en una base diaria que comenzó el día 0 (día de transplante) hasta el punto extremo. Grupo 3' (anticuerpo anti-complemento solo) - a los ratones se les administró el anticuerpo anti-ratón C5 BB5.1 (Frei y asociados, 1987) en una dosis de 40 mg/kg de peso corporal en forma intraperitoneal en los días -1, 0, 1 y 2 seguido de 40 mg/kg de peso corporal administrado tres veces a la semana (Lunes, Miércoles, Viernes) hasta el punto de extremo. Grupo 4' (anticuerpo anti-complemento hasta el día 14 posterior al transplante más ciclosporina A) - a los ratones se les administró el anticuerpo anti-ratón C5 BB5.1 en 40 mg/kg de peso corporal en forma intravenosa los días - 1 al día 14 también se les administró ciclosporina A en 15 mg/kg de peso corporal en una base diaria que comenzó el día 0 hasta el punto de extremo. Se debe observar que esto difiere de los otros grupos en cuanto a que BB5.1 fue administrado en forma intravenosa y en una base diaria. Grupo 5' (anticuerpo anti-complemento hasta el día 28 posterior al transplante más ciclosporina A) - a los ratones se les administró el anticuerpo anti-ratón C5 BB5.1 en 40 mg/kg de peso corporal en forma intraperitoneal los días -1, 0, 1 y 2 seguido de 40 mg/kg de peso corporal administrado tres veces a la semana (Lunes, Miércoles, Viernes) hasta el día 28 también se les administró ciclosporina A en 15 mg/kg de peso corporal en una base diaria que comenzó el día 0 hasta el punto de extremo. Grupo 6' (anticuerpo anti-complemento en forma crónica hasta 100 días más ciclosporina) - a los ratones se les administró el anticuerpo anti-ratón C5 BB5.1 en 40 mg/kg de peso corporal en forma intraperitoneal los días -1, 0, 1 y 2 seguido de 40 mg/kg de peso corporal administrado tres veces a la semana (Lunes, Miércoles, Viernes) hasta los 100 días y también se les administró ciclosporina A en 15 mg/kg de peso corporal en una base diaria que comenzó el día 0 hasta los 100 días. Los resultados de este experimento se muestran en las Tablas 3 y 4. La Tabla 3 muestra el tiempo de supervivencia para los injertos. La Tabla 4 establece las calificaciones histológicas. Tabla 3. Supervivencia de Aloinjerto Grupo (Tratamiento) Supervivencia Individual (días) Tiempo de Supervivencia Promedio (días) 1'. Salina 8, 8, 8, 8, 8, 9 8.3 ±0.5 2'. Ciclosporina A 14, 15, 15, 16, 16, 16, 17 15.5 ±1.1 3'. BB5.1 7, 8, 8, 8, 8, 9 8.0 ± 0.6 4'. BB5.1 hasta el día 14 + 35, 38, 43, 45, 46, 47 42.3 ±4.8 ciclosporina A 5'. BB5.1 hasta el día 28 + 77, 80, 80,81,82 80 ± 1.9 ciclosporina A 6' BB5.1 hasta el día 100 + >100 días (7 ratones; uno > 100 días ciclosporina A sacrificado para histología) Tabla 4 Calificaciones Promedio de Cambios Histológicos de Aloinjertos de Corazón en Necropsia Clasificaciones promedio: 0 - normal; 1 - cambio mínimo; 2 - cambio leve; 3 cambio moderado; 4 - cambio marcado. N/A - no disponible. *Vasc - vasculitos; Infar - infarto; Linf - infiltración linfoide; Trom - trombosis; Hemo - hemorragia; Fibrin - depósito de fibrina; PMN - infiltrado de célula polimorfonuclear Los resultados indican los efectos sinérgicos del uso de un fármaco de inhibición de complemento además de un inmunosupresor. En ratones no tratados los injertos fueron rechazados aproximadamente 8 días. El uso de la ciclosporina A de ¡nmunosupresor sola en una base diaria, crónica dio como resultado un incremento en la supervivencia del injerto hasta aproximadamente 15 días posteriores al transplante. El uso del anticuerpo anti-C5 BB5.1 para inhibir la formación de complemento terminal, no tuvo efecto por sí mismo, ocurriendo el rechazo del injerto a los 8 días posterior al transplante como en el grupo de control (Grupo 1'). La combinación de BB5.1 al día 28 posterior al transplante más ciclosporina A mostró un efecto sinérgico con la supervivencia del injerto siendo prolongada hasta aproximadamente día 80. Un resultado más sorprendente es el del Grupo 5', en el cual BB5.1 y ciclosporina A fueron administrados cada uno en forma crónica en forma posterior al transplante. En este caso, la supervivencia del injerto fue mayor a 100 días (como lo presentan muchos datos actualmente). Además, los resultados histológicos mostrados en la Tabla 4 como indican que la administración tanto de BB5.1 y ciclosporina A protegió el injerto de cambios en muchos mejores ya sea que BB5.1 o ciclosporina A solo, que la administración crónica de BB5.1 y ciclosporina A protegió el injerto hasta tal punto que incluso a los 100 días posterior al transplante, no hubieron cambios histológicos observados en corazones injertados. Un tiempo de supervivencia de 100 días en estos modelos se considera como el estándar de oro. Una supervivencia de 100 días en el modelo se considera que indica que habrá una supervivencia indefinida del aloinjerto. Cuando se detuvo la administración de BB5.1 después de 28 días, los injertos fueron protegidos pero no comenzaron a mostrar cambios histológicos de mínimos a leves en aproximadamente 80 días, el cual fue el tiempo en el que ocurrió la falla de injerto. Los ratones del Grupo 4' fueron tratados en forma diferente, ya que se les administró BB5.1 en una base diaria a través de administración intravenosa. Estos animales se enfermaron, mostraron pérdida de peso y retención de orina y fueron sacrificados en un momento en el cual los corazones injertados aún estaban palpitando, aunque su función había declinado. Este fue el primer grupo de ratones estudiado y no se sabe el porque se observaron estos efectos de enfermedad. Estos efectos de enfermedad no fueron observados cuando se administró BB5.1 en forma peritoneal con un programa de tres veces por semana. Tal como se aprecia más adelante en el Ejemplo 4, la administración diaria de BB5.1 a través de ruta peritoneal no originó efectos de enfermedad. Asimismo, la administración intravenosa no fue necesariamente la causa de enfermedad en estos animales. La administración intravenosa de eculizumab (un anticuerpo equivalente humano a BB5.1 en cuanto a que enlaza a humanos C5) ha sido administrado en forma exitosa y en forma intravenosa sin efectos de enfermedad para humanos en un estudio de PNH (Hillmen y asociados, 2004). Los inhibidores de complemento pueden ser administrados a través de otras rutas además de intravenosa e intraperitoneal, siendo todas de dichas rutas conocidas para los expertos en la técnica. Ejemplo 4 Rechazo Acelerado en un Modelo de Transplante de Corazón Presensibilizado Un segundo grupo de experimentos similar a los del Ejemplo 3, se llevó a cabo aunque el ratón receptor fue presensibilizado para el órgano donante. En estos experimentos, la presensibilización se llevó a cabo a través de un transplante previo de un injerto de piel. En general, la presensibilización puede ocurrir no únicamente como resultado de haber recibido un aloinjerto anterior, sino también puede ser originado por haber recibido múltiples transfusiones de sangre o en mujeres quienes han embarazadas. Además de dichos métodos de presensibilización, los aloinjertos con una incompatibilidad ABO, serán rápidamente atacados y rechazados debido a los anticuerpos formados previamente para los antígenos ABO, a menos que se tomen acciones para evitar dicho ataque. Algunos ratones en estos estudios se les administró ciclofosfamida además de BB5.1 y/o ciclosporina A. Para estos experimentos se presensibilizaron ratones receptores BALB/c con injertos de piel C3H una semana antes del transplante de corazón procedentes del mismo donante (utilizando el método de Pruitt y Bollinger, 1991). Este modelo está diseñado para mimetizar el transplante presensibilizado en humanos, especialmente en relación con rechazo humoral acelerado. Los ratones receptores fueron divididos en ocho grupos de seis a ocho ratones de cada grupo. Los tratamientos fueron como se indica a continuación. Grupo 1" (control) - a los ratones (machos de 8 a 12 semanas de edad que pesan de 25 - 30 g) se les administró 0.75 mL de solución salina en forma intraperitoneal en una base diaria que comenzó en el día -1 y continuó hasta el punto de extremo (rechazo de injerto). Grupo 2" (ciclosporina A sola) - a los ratones se les administró ciclosporina A en forma subcutánea en una dosis de 15 mg/kg de peso corporal comenzando el día 0 (día de transplante) hasta el punto de extremo. Grupo 3" (BB5.1 solo) - a los ratones se les administró el anticuerpo monoclonal de complemento anti-ratón BB5.1 en una dosis de 40 mg/kg de peso corporal administrado en forma peritoneal en una base diaria que comenzó el día -1 y continuó hasta el punto extremo. Grupo 4" (ciclofosfamida sola) - a los ratones se les administró in forma intravenosa ciclofosfamida en una dosis de 40 mg/kg de peso corporal en cada uno de los días 0 y 1. Grupo 5" (BB5.1 más ciclosporina A) - a los ratones se les administró en forma peritoneal BB5.1 en forma peritoneal en una dosis de 40 mg/kg de peso corporal en una base diaria que comenzó el día -1 y continuó hasta el punto de extremo. Estos ratones se les administró en forma adicional ciclosporina A en forma subcutánea una dosis de 15 mg/kg de peso corporal en una base diaria del día 0 hasta el punto de extremo. Grupo 6" (BB5.1 más ciclofosfamida) - a los ratones se les administró en forma peritoneal BB5.1 en una dosis de 40 mg/kg de peso corporal en una base diaria comenzando en el día -1 y continuando hasta el día de extremo. A estos ratones se les administró adicionalmente en forma intravenosa ciclofosfamida en una dosis de 40 mg/kg de peso corporal cada uno de los días 0 y 1. Grupo 7" (ciclosporina A más ciclofosfamida) - a los ratones se les administró ciclosporina A en forma subcutánea en una dosis de 15 mg/kg de peso corporal en una base diaria a partir del día 0 hasta el punto de extremo. A estos ratones se les administró en forma adicional en forma intravenosa ciclofosfamida en una dosis de 40 mg/kg de peso corporal en cada uno de los días 0 y 1. Grupo 8" (BB5.1 más ciclosporina A más ciclofosfamida) -a los ratones se les administró BB5.1 en forma intraperitoneal en una dosis de 40 mg/kg de peso corporal en una base diaria comenzando el día -1 y continuando hasta los 100 días. A estos ratones también se les administró ciclosporina A en forma subcutánea en una dosis de 15 mg/kg de peso corporal en una base diaria comenzando del día 0 hasta los 100 días. A estos ratones se les administró adicionalmente en forma intravenosa ciclofosfamida en una dosis de 40 mg/kg de peso corporal en cada uno de los días 0 y 1. Dos ratones en este grupo fueron sacrificados el día 60 para estudios histológicos (no había ocurrido aún rechazos) y los cuatro ratones restantes aún no habían rechazado sus injertos en el día 100. Además, se probó un grupo de ratones de control que no había sido presensibilizado y había recibido únicamente el tratamiento de solución salina como para el Grupo 1". Los resultados de estos experimentos se muestran en las Tablas 5 y 6. La Tabla 5 describe tiempos de supervivencia para los injertos y la Tabla 6 resumen los resultados histológicos.

Tabla 5 Supervivencia de Injerto *P < 0.01 grupo 1" vs. no presensibilización **P < 0.01 grupo 5" vs. grupos 1"-4" y 6"-7". *"P<0.01 grupo 8" vs. grupos 1"-7".

Tabla 6 Calificaciones Promedio de Cambios Histológicos de Aloinjertos de Corazón en Necropsia Clasificaciones promedio: 0 - normal; 1 - cambio mínimo; 2 - cambio leve; 3 - cambio moderado; 4 - cambio marcado. N/A - no disponible. *Vasc - vasculitos; Infar - infarto; Linf - infiltración linfoide; Trom - trombosis; Hemo - hemorragia; Fibrin - depósito de fibrina; PMN - infiltrado de célula polimorfonuclear Los resultados mostrados en la Tabla 5 indican una diferencia entre el modelo de ratón presensibilizado y el modelo de ratón no presensibilizado tal como se utiliza en el Ejemplo 3. Los resultados indican que en la ausencia de presensibilización, los injertos son rechazados en aproximadamente 8 días en la ausencia de tratamiento con cualesquiera de los fármacos. La presensibilización de los animales origina un rechazo más rápido, el rechazo del injerto en los animales presensibilizados es aproximadamente a los 3 días en la ausencia de cualquier tratamiento de fármaco. El tratamiento ya sea con BB5.1, ciclosporina A o ciclofosfamida no tuvo efecto al momento de la supervivencia al injerto, siendo rechazados los injertos en aproximadamente 3 a 4 días, en cada uno de estos grupos de animales. La combinación de BB5.1 y ciclosporina A mostró cierto efecto, ocurriendo el rechazo aproximadamente el día 12. La combinación de BB5.1 y ciclofosfamida no tuvo efecto protector, ocurriendo el rechazo aproximadamente el día 3. En forma similar la combinación de ciclosporina A y ciclofosfamida no tuvo esencialmente efecto protector ocurriendo rechazo a los 3-4días. Muy sorprendentemente, la combinación de los tres fármacos (administración crónica de BB5.1 y ciclosporina más administración de ciclofosfamida al momento del transplante) mostró un efecto altamente sinérgico con todos los ratones sobreviviendo más de 100 días. Nuevamente, la supervivencia de 100 días en este modelo se considera como el estándar de oro y asume una supervivencia indefinida. Estos resultados, así como los resultados histológicos que se muestran en la Tabla 6, indican que la combinación de tratamiento crónico con un inhibidor de complemento y un inmunosupresor tal como ciclosporina A, en el tratamiento de un ratón presensibilizado, da como resultado cierta atenuación del rechazo acelerado. El tratamiento de estos animales adicionalmente con ciclosfosfamida al momento del transplante y el primer día después del transplante, da como resultado mayor tiempo de supervivencia, sin haberse observado el rechazo alrededor del día 100. Ejemplo 5 Aloiniertos de Riñón C3H Succumb para ABMR en Receptores BALB/c Presensibilizados Se desarrolló un modelo novedoso de ratón ABMR con características que mimetizan en forma muy cercana las preparaciones clínicas del alotransplante renal en pacientes altamente presensibilizados. Los ratones BALB/c receptores, fueron presensibilizados con injertos de piel de donante C3H completamente alogeneicos. Después de la presensibilización, los niveles de IgG anti-donante en la circulación se elevaron de forma marcada y alcanzaron niveles pico siete días después del injerto de piel (Figura 10A). En este momento, los aloinjertos de riñón de la cepa del mismo donante (C3H) fueron transplantados en los receptores presensibilizados; estos injertos fueron rechazados rápidamente en todos los animales en 8.5 ± 1.3 días (figura 11A). Los injertos rechazados mostraron características histológicas consistentes con el rechazo humoral acelerado, incluyendo 1) evidencia de vasculitis, hemorragia y edema en el intersticio, así como necrosis glomerular y tubular (Figura 10B-a); 2) depósito de injerto extensivo de IgG (Figura 10B-c), C3 (Figura 10B-e) y C5 (Figura 10B-g); 3) niveles significativamente mayores de IgG anti-donante en la circulación en comparación con los que se observaron entre receptores no sensibilizados evaluados el mismo día posterior al transplante (p<0.01; Figura 10C); 4) niveles normales de actividad de complemento (Figura 10D) y 5) infiltración intrainjerto masiva de células Mac1+, incluyendo monocitos y macrófagos (Figura 10B-/'). En contraste, los ratones BALB/c no presensibilizados, rechazaron injertos de riñón C3H a los 55.2 ±5.6 días y mostraron histología de injerto normal en POD8 (Figura 10B- 5) sin deposición detectable de IgG (Figura 10B-c/), poca o nada de filtración de células Mac-1 + (Figura 10B-y) y únicamente una deposición leve de C3 (Figura 10B- y C5 (Figura 10?-?). La presensibilización con piel de donante no pareció incrementar los niveles IgM anti-donante en la circulación (Figura 10C) o la actividad de complemento de suero (Figura 10D). Estos datos sugieren que este modelo de aloinjerto de riñón novedoso ofrece una herramienta excelente para investigar el papel potencial de complemento en rechazo de aloinjerto renal transmitido por anticuerpo en receptores altamente presensibilizados. mAb anti-C5 en Combinación con CsA y LF, Evita ABMR y Logra una Supervivencia Indefinida del Aloinjerto de Riñón en Receptores de Ratón Presensibilizados Los experimentos iniciales llevados a cabo durante el desarrollo de este modelo, evaluaron los efectos inmunosupresivos de CsA y ciclofosfamida (CyP) en la prolongación de supervivencia de injerto de riñón. Sin embargo, el tratamiento CyP estuvo asociado con nefrotoxicidad significativa, lo que prohibió una evaluación adicional (datos no mostrados). El tratamiento breve con LF no estuvo asociado con nefrotoxicidad, y un modelado adicional utilizó este agente como parte del régimen inmunosupresivo experimental. Esto se evaluó para ver si mAb anti-C5, ya sea solo o combinado con CsA y un tratamiento LF a corto plazo, puede evitar ABMR en receptores de ratón presensibilizados que reciben aloinjertos renales. Tal como se presenta en la figura 11 A, los injertos entre receptores presensibilizados tratados ya sea con monoterapia CsA o LF, o con los dos fármacos en combinación fueron rechazados en 9.3 ± 2.5 días, 6.0 ± 1.0 días y 11.7 ±2.1 días, respectivamente. Además, la monoterapia mAb anti-C5 o anti-C5 en combinación con CsA o LF, no tuvo la capacidad de mejorar la supervivencia de injerto, ocurriendo el rechazo en 7.0 ± 1.0 días, 7.0 ± 1.0 días y 8.3 ± 3.2 días, respectivamente (Figura 11A). Estos injertos de riñón rechazados también desarrollaron características patológicas típicas de rechazo humoral transmitida por anticuerpo (datos no mostrados), con el patrón de rechazo virtualmente idéntico al observado en receptores BALB/c presensibilizados no tratados (Figura 10B-a). El contraste, la terapia triple que consiste en mAb anti-C5, CsA y tratamiento LF a corto plazo, evita en forma efectiva el rechazo de injerto y logró una supervivencia indefinida del aloinjerto de riñón durante > de 100 días entre animales presensibilizados (Figura 10A). Además, la supervivencia a largo plazo de injertos de riñón demostró una función de riñón normal, tal como se indica mediante niveles de creatinina en suero dentro del rango normal (Figura 11 B; p<0.01 vs. ratones no tratados o los tratados ya sea con CsA o monoterapia LF o los dos fármacos en combinación). Los aloinjertos de riñón en POD100 en receptores presensibilizados tratados con terapia triple tuvieron histología normal (Figura 11C-a) sin infiltración de células CD4 + , CD8+ ó Mac1 + detectable (Figura 11B-J , c, d). Además, la infiltración intrainjerto masiva de células Mac-1+, se encontró en animales no tratados y tratados con CsA, LF o CsA más LF, en tanto que la infiltración de estas células se redujo en forma significativa en animales tratados mAb anti-C5 (Tabla 7). Estos resultados indican que el tratamiento con mAb anti-C5 funcionalmente de bloqueo junto con CsA y un LF de corto plazo evita ABMR, y permite la supervivencia indefinida de aloinjerto de riñón en receptores altamente presensibilizados. El Tratamiento mAb anti-C5 Inhibe Completamente la Actividad de Complemento Terminal y la Deposición Local C5 en Receptores Presensibilizados que Reciben Aloinjertos de Riñón Para determinar la eficacia sistémica y local del tratamiento mAb anti-C5 en este modelo, se evaluó la actividad de complemento, tal como se mide a través de un ensayo hemolítico de suero in vitro, entre ratones en diferentes grupos de tratamiento en el mismo punto de tiempo (POD7). El tratamiento de ratones ya sea con CsA o LF, o con los dos fármacos en combinación no tuvieron efecto inhibidor en la actividad de complemento terminal, en tanto que el tratamiento con mAb anti-C5 solo o combinado con CsA y/o LF inhibió completamente la actividad de complemento de suero (p<0.1, vs. ratones naive, ratones presensibilizados no tratados o animales tratados CsA-, LF-, o CsA más LF-) (Figura 12). La actividad hemolítica de complemento se restauró a niveles normales mediante POD100 después del término de tratamiento en POD60 (Figura 12). Además, el depósito C5 local (intrainjerto) se evitó completamente en los receptores presensibilizados tratados con mAb anti-C5, aunque fue evidente en animales presensibilizados no tratados y tratados con CsA-, LF- y CsA más LF- (Tabla 7). Tal como se anticipó, la terapia mAb anti-C5 no evitó la deposición intrainjerto C3 (Tabla 7). Estos resultados indican que la terapia mAb anti-C5 bloquea completamente la actividad de complemento terminal, aunque aún conserva los componentes de complemento tempranos después del transplante de riñon alogeneico en receptores presensibilizados. Los Injertos de Riñon de Supervivencia a Largo Plazo Resisten Lesión Humoral en Receptores Presensibilizados Mediante Acomodo Para investigar si la supervivencia a largo plazo de estos injertos de riñon está asociada con el desarrollo del acomodo, se midieron los niveles de anticuerpo anti-donante en circulación, actividad de complemento en suero y depósito de anticuerpo y complemento de injertos en ratones de los diferentes grupos de tratamiento al momento del rechazo. Los receptores BALB/c presensibilizados, no tratados produjeron altos niveles de anticuerpos IgG anti-donante en la circulación (figura 13A), los cuales se redujeron parcialmente al momento del tratamiento ya sea con CsA o LF solo o en combinación. La adición de anti-C5 ya sea a CsA o monoterapia LF, no atenuó en forma adicional los niveles de anticuerpo de anti-donante. Con terapia triple de mAb anti-C5, CsA y LF, se inhibieron de manera notable los niveles IgG anti-donante en la circulación y permanecieron bajos en POD100 (*p<0.01 vs. animales presensibilizados no tratados o los tratados ya sea con monoterapia o los dos fármacos en combinación). Sin embargo, este bajo nivel de anticuerpo fue aún mayor al de los animales naive (**p<0.05 vs. animales presensibilizados tratados con terapia triple). En forma consistente con los efectos de tratamiento en los niveles de anticuerpos anti-donante en la circulación, se observó una deposición IgG intrainjerto significativa en receptores presensibilizados no tratados o los que reciben ya sea CsA o monoterapia LF o combinación de dos fármacos (Tabla 7). En forma interesante, en POD100, la supervivencia a largo plazo de injertos de riñón de animales tratados con terapia triple, también demostró un depósito IgG leve (Figura 11C-e, Tabla 7). Además, la deposición de leve a moderada de C3 y C5 fue detectada en injertos de riñón de supervivencia de 100 días en animales presensibilizados (figura 11C- , g, Tabla 7). Los niveles IgM anti-donante ya sea en injertos de riñón en la circulación (Figura 13A) o transplantados (Tabla 7), permanecieron bajos en todos los receptores presensibilizados sin importar el tratamiento. Tomados en conjunto, estos datos demuestran que la terapia triple a base de mAb anti-C5 evita ABMR a pesar de la presencia del IgG intrainjerto demostrable y la deposición de complemento, lo que sugiere que la supervivencia de injerto a largo plazo sea lograda a través de un proceso de acomodo. La Subclase IgG Cambia a lgG2b en Receptores Presensibilizados con Supervivencia a Largo Plazo que Llevan Injertos de Riñón Acomodados Para demostrar si la terapia triple a base de mAb anti-C5 estuvo asociada con un cambio en la subclase IgG, se llevó a cabo una comparación entre los niveles de suero de las subclases IgG anti-donante entre receptores presensibilizados no tratados y los que llevan injerto de riñón acomodados. Los sueros de receptores presensibilizados no tratados contuvo predominantemente anticuerpos anti-donante lgG1, lgG2 y lgG3 (Figura 13B). Se observó el mismo patrón entre receptores presensibilizados tratados ya sea con CsA, LF, o los dos fármacos en combinación (datos no mostrados). En contraste, entre los receptores presensibilizados que llevan injertos acomodados (POD100), la subclase IgG anti-donante predominante fue lgG2b (Figura 13B, p<0.01). Estos datos sugieren que la producción de los anticuerpos lgG2b antidonante puede estar asociada con la inducción de acomodo del injerto. Las Proteínas Protectoras Bcl-2 y Bcl-xl se Expresan en Injertos de Riñón Acomodados Se hipotetiza que la resistencia de los injertos acomodados a bajos niveles de los aloanticuerpos y complemento, puede estar asociada con la expresión intrainjerto de proteínas protectoras tales como Bcl-xl y Bcl-2, reportadas previamente para ser activadas en la vasculatura de injertos acomodados en modelos de xenotransplante (Bach y asociados, 1997). La expresión de estas proteínas fue evaluada entre receptores presensibilizados que reciben terapia triple a base de mAb anti-C5. Los injertos de riñon acomodados de receptores presensibilizados tratados con terapia triple a base de mAb anti-C5 expresó altos niveles de proteínas Bcl-2 y Bcl-xl en POD100 (Figura 14). En contraste, la expresión de estas proteínas fue indetectable en injertos de riñon rechazados de animales presensibilizados no tratados (Figura 14) o de animales presensibilizados tratados ya sea con CsA o monoterapia LF o los dos fármacos en combinación (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que la resistencia de injertos acomodados a lesión humoral en estos animales presensibilizados puede estar asociada con protección proporcionada por las proteínas Bcl2 y Bcl-xl. Tabla 7 Manchado de inmunoperoxidasa de aloiniertos de riñón en receptores de ratón presensibilizados en necropsia* igG IgM C3 C5 Mac-1 Grupos No tratados 4+ 1 + 3+ 3+ 4+ CsA 4+ 1 + 3+ 3+ 4+ Anti-C5mAb 4+ 1 + 3+ 0 2+ LF 3+ 1 + 3+ 3+ 4+ 4+ 1 + 3+ 0 2+ Anti-C5mAb+CsA Anti-C5mAb+LF 3+ 1 + 3+ 0 2+ CsA+LF 3+ 1 + 3+ 3+ 4+ Anti-C5mAb+CsA+LF 2+ 1 + 3+ 2+ 0 * Los injertos fueron recolectados al momento del rechazo o en POD100 posterior al transplante (para el grupo de terapia triple). Se calificó la intensidad del manchado como sigue: 0, negativo; 1+, equivocado; 2+, débil; 3+, moderado; 4+, Intenso.

Ejemplo 6 Métodos de Ejemplo 5 Animales. Se eligieron donantes y receptores, respectivamente ratones macho adulto C3H (H-2k) y ratones BALB/c (H-2d) (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine) que pesan de 25 a 30 gramos. Los animales se alojaron bajo condiciones convencionales en la Animal Care Facility, The University of Western Ontario, y se cuidaron de acuerdo con los lineamientos establecidos por Canadian Council on Animal Care. Presensibilización de la Piel. Se cortaron injertos de piel de grosor completo tomados de donantes C3H en piezas de 1x1 cm2 y se transplantaron en las espaldas de los ratones receptores BALB/c. El rechazo se definió como necrosis completa de los injertos de piel. Transplante de Riñón Ortotópica. Siete días después de la presensibilización de la piel, se transplantaron ríñones de ratón C3H en el abdomen de receptores BALB/c presensibilizados mediante anastomosis del donante y aortas del receptor y la vena renal del donante y la vena cava inferior del receptor utilizando suturas de nylon 11-0. La uretra del donante también se suturó a la vejiga del receptor utilizando suturas 10-0. Se eliminaron los ríñones nativos inmediatamente después del injerto. El rechazo al injerto que conduce a la muerte del receptor, se utilizó como el punto final de rechazo de los transplantes de riñón.

Grupos Experimentales. Se asignaron en forma aleatoria receptores presensibilizados a ocho grupos, consistiendo cada uno de cinco animales: Grupo 1, ratones no tratados; Grupo 2, ratones tratados con CsA (15 mg/kg/día, s.c, diariamente a partir del día 0 hasta el punto final del estudio (rechazo de injerto o día posterior a la operación (POD)100); Grupo 3, ratones tratados con mAb anti-C5 (clon BB5.1, Alexion Pharmaceuticals, Inc., 40 mg/kg/día, i.p., diariamente, días 0-14, seguido de dos veces a la semana hasta el día 60); Grupo 4, ratones tratados con LF15-0195 (LF, 2 mg/kg/día, s.c, días 0-14); Grupo 5, ratones tratados con mAb anti-C5 más CsA; Grupo 6, ratones tratados con mAb anti-C5 más LF; Grupo 7, ratones tratados con CsA más LF; Grupo 8, ratones tratados con terapia triple que consiste en mAb anti-C5, CsA y LF. Al momento del rechazo, se eliminaron los injertos de riñón para histología de rutina, inmunoistoquímica y análisis de manchado western, y las muestras de suero se recolectaron para evaluación de niveles de anticuerpo anti-donante y actividad de complemento. Medida de Creatinina en Suero. Las muestras de suero se obtuvieron en el punto final del estudio (momento del rechazo o POD100) después del transplante de riñón. Se cuantificaron los niveles de creatinina en suero en muestras 10 µL· utilizando el procedimiento Sigma Diagnostics (Sigma, St. Louis, MO), el cual mide la creatinina a través de una modificación cinética de la reacción de Jaffe (Junge y asociados, 2004). Histología de Injerto. En necropsia, las muestras de tejido fueron procesadas para manchado de hematoxilina y eosina (H&E) (Wang, y asociados, Jl 2003) y se evaluaron con respecto a vasculitis, trombosis, hemorragia e infiltración de linfocitos; los cambios se calificaron como: 0, ninguno; 1, mínimo; 2, leve; 3, moderado ó 4 marcado en comparación con tejidos normales. Inmunoistoquímica. Las muestras de tejido incrustadas en gel de Temperatura de Corte Optima (O.C.T.) (Skura Finetek, Torrance, CA) se seccionaron y mancharon para células de infiltración CD4 + , CD8+ y Mac- y para deposición IgG, IgM, C3 y C5 utilizando el equipo Elite Vectastain ABC (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA). Los anticuerpos Biotinilados primarios incluyeron anti-CD4 (YTS 191.1.2, Cedarlane Laboratories Ltd., Homby, Ontario, Canadá), anti-CD8 (53-6.7, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) y anti-Mac-1 (Cedarlane). Se detectó la deposición IgG y IgM intrainjerto utilizando anti-ratón-lgG de cabra y anti-ratón-lgM de cabra Biotinilados (Cedarlane). Se detectó la deposición de complemento después de la incubación en serie con Abs policlonal anti-ratón C3 o anti-ratón C5 (Quidel, San Diego, CA), IgG anti-cabra de conejo biotinilado (Vector Laboratories), y estreptavidina conjugada con HRP (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA). Se llevaron a cabo controles negativos omitiendo los anticuerpos primarios. El inmunomanchado se calificó en cinco campos de alta potencia de cada sección, utilizando muestra de tejido de cinco animales por grupo experimental. La inmunoreactividad se graduó de 0 a 4+ de acuerdo con la intensidad de manchado tal como sigue: 0, negativo; 1+, equivocado; 2 + , débil; 3 + , moderado; y 4 + , manchado muy intenso. Citometría de Flujo. Se evaluaron anticuerpos IgG y IgM específicos anti-donante en la circulación en suero de receptor mediante citometría de flujo. En síntesis, se aislaron esplenocitos de ratón C3H y se incubaron a una temperatura de 37°C durante 30 minutos con muestras de suero obtenidas en los puntos de tiempo indicados, de ratones procedentes de varios grupos de tratamiento. Para manchar el IgG total o subclases de anticuerpo específicos, las células lavadas fueron incubadas con anticuerpos anti-ratón de cabra conjugados con FITC específicos de la parte Fe de IgG de ratón, lgG1 de ratón, lgG2a de ratón, lgG2b de ratón o lgG3 de ratón (todos procedentes de (CALTAG Laboratories, Burlingame, CA) o con anticuerpo de cabra conjugado con ficoeritrina específico de IgM de ratón (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) durante 1 hora a una temperatura de 4°C, se lavaron y analizaron en un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA) (Collins y asociados, 1999; Pratt y asociados, 1996). Los resultados se expresan como intensidad de fluorescencia de canal promedio como una medida del nivel de cada isotipo anti-donante en las muestras. Ensayo Hemolítico de Complemento. La actividad de complemento terminal en suero de ratón receptor se determinó a través de métodos estándar para evaluar la capacidad del suero para Usar eritrocitos de pollo presensibilizados con anticuerpos específicos de eritrocito tal como se describió anteriormente (Wang y asociados, 1999). Análisis de Manchado Western. Se sonicaron muestras de riñón congelados, se separaron mediante electroforesis y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF; Invitrogen). Se detectó la expresión intrainjerto de Bcl-2 V Bcl-X S/L utilizando el suero policlonal N-19 y M-125, (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) respectivamente. La anti-calsecuestrina policlonal (Calbiochem) sirvió como un control de carga de muestra (Kobayashi y asociados, 1999). Se detectó el enlace de anticuerpo mediante IgG anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano y se mejoró el desarrollo de quimioluminiscencia (Roche Laboratories) (Arp y asociados, 1996). Análisis Estadístico. Los datos se reportan como una desviación promedio ± estándar (SD). Se comparó la supervivencia de aloinjerto entre grupos experimentales utilizando la prueba de calificación-log. Se analizaron los hallazgos histológicos e inmunohistológicos utilizando el ANOVA en la clasificación. Se analizaron los datos de citometría de flujo y manchado western utilizando ANOVA de una vía. Las diferencias con valores p menores a 0.05 se consideraron como significativas. Se podrá apreciar que los métodos y composiciones de la presente descripción pueden incorporarse en la forma de una variedad de modalidades, aunque solo se describen en la presente invención unas cuantas de ellas. Los expertos en la técnica podrán apreciar que existen otras modalidades sin apartarse del espíritu de la presente invención. Por lo tanto, las modalidades descritas son ilustrativas y no deben construirse como restrictivas. LISTA DE REFERENCIAS Las publicaciones y otros materiales aquí utilizados son para iluminar los antecedentes de la descripción, y en particular, los casos que proporcionan detalles adicionales con respecto a la práctica, están incorporados en su totalidad a la presente invención como referencia, y por conveniencia, son referenciados por autor y fecha en el texto, y se agrupan respectivamente en la siguiente Lista de Referencias. Abbas AK, y asociados (2000). Cellular and Molecular Immunoloav (4o edición), p. 363-383 (W.B. Saunders Company, Nueva York). Arp y asociados (1996). J. Virol. 70:7349-7359. Baldwin y asociados (2001). Immunity 14:369-376. Bóhmig GA, y asociados (2000). Am. J. Kidney Dis. 35:667-673.

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Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para prolongar la supervivencia de un aloinjerto de riñon en un mamífero receptor, caracterizado porque el método comprende administrar al mamífero a) un fármaco que inhibe la actividad de complemento y b) al menos una terapia inmunosupresiva, en donde la terapia se selecciona de i) al menos un fármaco inmunosupresivo o ii) un fármaco inmunomodulador.
2. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el mamífero es un humano.
3. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el aloinjerto es incompatible por MHC.
4. El método tal como se describe en la reivindicación 3, caracterizado porque aloinjerto incompatible por MHC es un aloinjerto incompatible por HLA.
5. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el receptor es incompatible por ABO para dicho aloinjerto.
6. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica.
7. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el fármaco que inhibe la actividad de complemento inhibe la formación de C5b ó C5a.
8. El método tal como se describe en la reivindicación 7, caracterizado porque el fármaco que inhibe la formación de C5b ó C5a es un anticuerpo completo o un fragmento de anticuerpo.
9. El método tal como se describe en la reivindicación 8, caracterizado porque el anticuerpo completo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano, humanizado, quimerizado o desinmunizado.
10. El método tal como se describe en la reivindicación 8, caracterizado porque el anticuerpo completo o fragmento de anticuerpo inhibe la disociación de complemento C5.
11. El método tal como se describe en la reivindicación 8, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo Fab, un F(ab')2, un Fv, un anticuerpo de dominio y un anticuerpo de cadena simple.
12. El método tal como se describe en la reivindicación 8, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo es pexelizumab.
13. El método tal como se describe en la reivindicación 8, caracterizado porque el anticuerpo completo es eculizumab.
14. El método tal como se describe en la reivindicación 13, caracterizado porque el eculizumab se administra en forma crónica.
15. El método tal como se describe en la reivindicación 13, caracterizado porque el eculizumab se administra una vez cada 2 semanas.
16. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de la actividad de complemento se selecciona del grupo que consiste en i) un receptor de complemento soluble, ii) CD59, iii) CD55, iv) CD46 y v) un anticuerpo para C5, C6, C7, C8 ó C9.
17. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el fármaco inmunosupresivo inhibe la actividad de célula-T o actividad de célula-B.
18. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el fármaco inmunosupresivo inhibe la actividad de célula-T y actividad de célula-B.
19. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el fármaco inmunosupresivo se selecciona del grupo que consiste en ciclosporina A, tacrolimus, sirolimus, OKT3, un corticoesteroide, daclizumab, basiliximab, azatiofreno, mofetil de micofenolato, metotrexato, 6-mercaptopurina, anticuerpos de anti-célula T, ciclofosfamida, leflunamida, brequinar, ATG, ALG, 15-desoxipergualina, un análogo de purina, rituxan, CTLA-4-lg (belatacept), IVIg, LF15-0195 y bredinina.
20. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque se administra más de un fármaco inmunosupresivo.
21. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el método comprende administrar i) un fármaco que inhibe la actividad de complemento y ii) ciclosporina A.
22. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el método comprende administrar i) un fármaco que inhibe la actividad de complemento y ii) LF15-0195.
23. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el método comprende administrar i) un fármaco que inhibe la actividad de complemento, ii), ciclosporina A, y iii) LF15-0195.
24. El método tal como se describe en la reivindicación 23, caracterizado porque el fármaco que inhibe la actividad de complemento es un anticuerpo que inhibe la disociación del complemento C5.
25. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante un tiempo al menos 20% mayor que si el método se llevara a cabo sin el fármaco que inhibe la actividad de complemento.
26. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante un tiempo al menos 40% mayor que si el método se llevara a cabo sin el fármaco que inhibe la actividad de complemento.
27. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante el resto de vida del mamífero.
28. El método tal como se describe en la reivindicación 2, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante al menos tres meses.
29. El método tal como se describe en la reivindicación 2, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante al menos seis meses.
30. El método tal como se describe en la reivindicación 2, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante al menos un año.
31. El método tal como se describe en la reivindicación 2, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante al menos cinco años.
32. El método tal como se describe en la reivindicación 2, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante el resto de la vida del humano.
33. El método tal como se describe en la reivindicación 6, caracterizado porque el aloinjerto que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 14 días.
34. El método tal como se describe en la reivindicación 6, caracterizado porque el aloinjerto que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 28 días.
35. El método tal como se describe en la reivindicación 6, caracterizado porque el aloinjerto que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 3 meses.
36. El método tal como se describe en la reivindicación 6, caracterizado porque el aloinjerto que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 6 meses.
37. El método tal como se describe en la reivindicación 6, caracterizado porque el aloinjerto que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 1 año.
38. El método tal como se describe en la reivindicación 6, caracterizado porque el aloinjerto que inhibe la actividad de complemento sé administra en forma crónica durante al menos 5 años.
39. El método tal como se describe en la reivindicación 6, caracterizado porque el aloinjerto que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante el resto de la vida del mamífero.
40. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque al menos un fármaco inmunosupresivo se administra en forma crónica durante el resto de la vida del mamífero.
41. El método tal como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque se administra al menos ciclosporina A en forma crónica durante el resto de la vida del mamífero.
42. El método tal como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque se administra al menos LF15-0195 en forma crónica durante el resto de la vida del mamífero.
43. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el tratamiento inmunomodulador es plasmaferesis, esplenectomia o inmunoadsorción.
44. Un método para prolongar la supervivencia de un aloinjerto de riñón en un mamífero receptor, caracterizado porque el método comprende administrar al mamífero a) un fármaco que inhibe la actividad de complemento y b) al menos una terapia inmunosupresiva en donde la terapia se selecciona de i) al menos un fármaco inmunosupresivo o ii) un tratamiento inmunomodulador, en donde el mamífero es presensibilizado a dicho aloinjerto.
45. El método tal^como se describe en la reivindicación 44, caracterizado porque el mamífero es un humano.
46. El método tal como se describe en la reivindicación 44, caracterizado porque el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica.
47. El método tal como se describe en la reivindicación 44, caracterizado porque el fármaco que inhibe la actividad de complemento inhibe la formación de C5b ó C5a.
48. El método tal como se describe en la reivindicación 47, caracterizado porque el fármaco que inhibe la formación de C5b ó C5a es un anticuerpo completo o un fragmento de anticuerpo.
49. El método tal como se describe en la reivindicación 48, caracterizado porque el anticuerpo completo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano, humanizado, quimerizado o desinmunizado.
50. El método tal como se describe en la reivindicación 48, caracterizado porque el anticuerpo completo o fragmento de anticuerpo inhibe la disociación de complemento C5.
51. El método tal como se describe en la reivindicación 48, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo Fab, un F(ab')2, un Fv, un anticuerpo de dominio y un anticuerpo de cadena simple.
52. El método tal como se describe en la reivindicación 48, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo es pexelizumab.
53. El método tal como se describe en la reivindicación 48, caracterizado porque el anticuerpo completo es eculizumab.
54. El método tal como se describe en la reivindicación 53, caracterizado porque el eculizumab se administra una vez cada 2 semanas.
55. El método tal como se describe en la reivindicación 44, caracterizado porque el inhibidor de la actividad de complemento se selecciona del grupo que consiste en i) un receptor de complemento soluble, ii) CD59, iii) CD55, iv) CD46 y v) un anticuerpo para C5, C6, C7, C8 ó C9.
56. El método tal como se describe en la reivindicación 44, caracterizado porque el fármaco inmunosupresivo inhibe la actividad de célula-T o actividad de célula-B.
57. El método tal como se describe en la reivindicación 44, caracterizado porque el fármaco inmunosupresivo inhibe la actividad de célula-T y actividad de célula-B.
58. El método tal como se describe en la reivindicación 44, caracterizado porque el fármaco inmunosupresivo se selecciona del grupo que consiste en ciclosporina A, tacrolimus, sirolimus, OKT3, un corticoesteroide, daclizumab, basiliximab, azatiofreno, mofetil de micofenolato, metotrexato, 6-mercaptopurina, anticuerpos de anti-célula T, ciclofosfamida, leflunamida, brequinar, ATG, ALG, 15-desoxipergualina, un análogo de purina, rituxan, CTLA-4-lg (belatacept), IVIg, LF15-0195 y bredinina.
59. El método tal como se describe en la reivindicación 44, caracterizado porque se administra más de un fármaco inmunosupresivo.
60. El método tal como se describe en la reivindicación 44, caracterizado porque el método comprende administrar i) un fármaco que inhibe la actividad de complemento y ii) ciclosporina A.
61. El método tal como se describe en la reivindicación 44, caracterizado porque el método comprende administrar i) un fármaco que inhibe la actividad de complemento y ii) LF15-0195.
62. El método tal como se describe en la reivindicación 44, caracterizado porque el método comprende administrar i) un fármaco que inhibe la actividad de complemento, ii), ciclosporina A, y iii) LF15-0195.
63. El método tal como se describe en la reivindicación 62, caracterizado porque el fármaco que inhibe la actividad de complemento es un anticuerpo que inhibe la disociación del complemento C5.
64. El método tal como se describe en la reivindicación 44, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante un tiempo al menos 20% mayor que si el método se llevara a cabo sin el fármaco que inhibe la actividad de complemento.
65. El método tal como se describe en la reivindicación 44, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante un tiempo al menos 40% mayor que si el método se llevara a cabo sin el fármaco que inhibe la actividad de complemento.
66. El método tal como se describe en la reivindicación 44, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante el resto de vida del mamífero.
67. El método tal como se describe en la reivindicación 45, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante al menos tres meses.
68. El método tal como se describe en la reivindicación 45, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante al menos seis meses.
69. El método tal como se describe en la reivindicación 45, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante al menos un año.
70. El método tal como se describe en la reivindicación 45, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante al menos cinco años.
71. El método tal como se describe en la reivindicación 45, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante el resto de la vida del humano.
72. El método tal como se describe en la reivindicación 46, caracterizado porque el aloinjerto que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 14 días.
73. El método tal como se describe en la reivindicación 46, caracterizado porque el aloinjerto que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 28 días.
74. El método tal como se describe en la reivindicación 46, caracterizado porque el aloinjerto que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 3 meses.
75. El método tal como se describe en la reivindicación 46, caracterizado porque el aloinjerto que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 6 meses.
76. El método tal como se describe en la reivindicación 46, caracterizado porque el aloinjerto que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 1 año.
77. El método tal como se describe en la reivindicación 46, caracterizado porque el aloinjerto que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 5 años.
78. El método tal como se describe en la reivindicación 46, caracterizado porque el aloinjerto que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante el resto de la vida del mamífero.
79. El método tal como se describe en la reivindicación 46, caracterizado porque al menos un fármaco inmunosupresivo se administra en forma crónica durante el resto de la vida del mamífero.
80. El método tal como se describe en la reivindicación 79, caracterizado porque se administra al menos ciclosporina A en forma crónica durante el resto de la vida del mamífero.
81. El método tal como se describe en la reivindicación 79, caracterizado porque se administra al menos LF15-0195 en forma crónica durante el resto de la vida del mamífero.
82. El método tal como se describe en la reivindicación 44, caracterizado porque el tratamiento inmunomodulador es plasmaferesis, esplenectomia o inmunoadsorción.
83. El uso de un fármaco que inhibe la actividad de complemento y un fármaco inmunosupresivo en la fabricación de un medicamento o paquete de medicamento para prolongar la supervivencia de un aloinjerto de riñon en un mamífero.
84. El uso tal como se describe en la reivindicación 83, caracterizado porque se incluye más de un fármaco inmunosupresivo en el medicamento o paquete de medicamento.
85. El uso tal como se describe en la reivindicación 83, caracterizado porque el fármaco que inhibe la actividad de complemento y el fármaco inmunosupresivo están en una formulación adecuada para administración concurrente a dicho mamífero.
86. El uso tal como se describe en la reivindicación 83, caracterizado porque el fármaco que inhibe la actividad de complemento y el fármaco inmunosupresivo están en una formulación o formulaciones adecuadas para administración secuencial a dicho mamífero.
87. El uso tal como se describe en la reivindicación 83, caracterizado porque el fármaco que inhibe la actividad de complemento está en una formulación adecuada para administración crónica al mamífero.
88. El uso tal como se describe en la reivindicación 83, caracterizado porque el fármaco inmunosupresivo está en una formulación adecuada para administración crónica al mamífero.
89. Un método para prolongar la supervivencia de un aloinjerto en un mamífero receptor, caracterizado porque el método comprende administrar a dicho mamífero a) un fármaco que inhibe la actividad de complemento y b) al menos una terapia inmunosupresiva en donde la terapia se selecciona de i) al menos un fármaco inmunosupresivo que comprende LF15-0195 o ii) un tratamiento inmunortiodulador.
90. El método tal como se describe en la reivindicación 89, caracterizado porque el mamífero es un humano.
91. El método tal como se describe en la reivindicación 89, caracterizado porque el aloinjerto es incompatible por MHC.
92. El método tal como se describe en la reivindicación 91, caracterizado porque aloinjerto incompatible por MHC es un aloinjerto incompatible por HLA.
93. El método tal como se describe en la reivindicación 89, caracterizado porque el receptor es incompatible por ABO para dicho aloinjerto.
94. El método tal como se describe en la reivindicación 89, caracterizado porque el aloinjerto se selecciona del grupo que consiste en i) corazón, ii) riñon, iii) pulmón, iv) páncreas, v) hígado, vi) tejido vascular, vii) ojo, viii) cornea, ix) lentes, x) piel, xi) médula ósea, xii) músculo, xiii) tejido conectivo, xiv) tejido gastrointestinal, xv) tejido nervioso, xvi) hueso, xvii) células madre, xviii) isletos, xix) cartílago, xx) hepatocitos y xxi) células hematopoyeticas.
95. El método tal como se describe en la reivindicación 89, caracterizado porque el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica.
96. El método tal como se describe en la reivindicación 89, caracterizado porque el fármaco que inhibe la actividad de complemento inhibe la formación de C5b ó C5a.
97. El método tal como se describe en la reivindicación 96, caracterizado porque el fármaco que inhibe la formación de C5b ó C5a es un anticuerpo completo o un fragmento de anticuerpo.
98. El método tal como se describe en la reivindicación 97, caracterizado porque el anticuerpo completo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano, humanizado, quimerizado o desinmunizado.
99. El método tal como se describe en la reivindicación 97, caracterizado porque el anticuerpo completo o fragmento de anticuerpo inhibe la disociación de complemento C5.
100. El método tal como se describe en la reivindicación 97, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo Fab, un F(ab')2, un Fv, un anticuerpo de dominio y un anticuerpo de cadena simple.
101. El método tal como se describe en la reivindicación 97, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo es pexelizumab.
102. El método tal como se describe en la reivindicación 97, caracterizado porque el anticuerpo completo es eculizumab.
103. El método tal como se describe en la reivindicación 102, caracterizado porque el eculizumab se administra en forma crónica.
104. El método tal como se describe en la reivindicación 102, caracterizado porque el eculizumab se administra una vez cada 2 semanas.
105. El método tal como se describe en la reivindicación 89, caracterizado porque el inhibidor de la actividad de complemento se selecciona del grupo que consiste en i) un receptor de complemento soluble, ii) CD59, iii) CD55, iv) CD46 y v) un anticuerpo para C5, C6, C7, C8 ó C9.
106. El método tal como se describe en la reivindicación 89, caracterizado porque el fármaco inmunosupresivo inhibe la actividad de célula-T o actividad de.célula-B.
107. El método tal como se describe en la reivindicación 89, caracterizado porque el fármaco inmunosupresivo inhibe la actividad de célula-T y actividad de célula-B.
108. El método tal como se describe en la reivindicación 89, caracterizado porque el fármaco inmunosupresivo se selecciona del grupo que consiste en ciclosporina A, tacrolimus, sirolimus, OKT3, un corticoesteroide, daclizumab, basiliximab, azatiofreno, mofetil de micofenolato, metotrexato, 6- mercaptopurina, anticuerpos de anti-célula T, ciclofosfamida, leflunamida, brequinar, ATG, ALG, 15-desoxipergualina, un análogo de purina, rituxan, CTLA-4-lg (belatacept), I VI g , LF15-0195 y bredinina.
109. El método tal como se describe en la reivindicación 89, caracterizado porque el método comprende administrar i) un fármaco que inhibe la actividad de complemento, ii), ciclosporina A, y iii) LF15-0195.
110. El método tal como se describe en la reivindicación 109, caracterizado porque el fármaco que inhibe la actividad de complemento es un anticuerpo que inhibe la disociación del complemento C5.
111. El método tal como se describe en la reivindicación 89, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante un tiempo al menos 20% mayor que si el método se llevará a cabo sin el fármaco que inhibe la actividad de complemento.
112. El métodoatal como se describe en la reivindicación 89, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante un tiempo al menos 40% mayor que si el método se llevara a cabo sin el fármaco que inhibe la actividad de complemento.
113. El método tal como se describe en la reivindicación 89, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante el resto de vida del mamífero.
114. El método tal como se describe en la reivindicación 90, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante al menos tres meses.
115. El método tal como se describe en la reivindicación 90, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante al menos seis meses.
116. El método tal como se describe en la reivindicación 90, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante al menos un año.
117. El método tal como se describe en la reivindicación 90, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante al menos cinco años.
118. El método tal como se describe en la reivindicación 90, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante el resto de la vida del humano.
119. El método tal como se describe en la reivindicación 95, caracterizado porque el aloinjerto que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 14 días.
120. El método tal como se describe en la reivindicación 95, caracterizado porque el aloinjerto que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 28 días.
121. El método tal como se describe en la reivindicación 95, caracterizado porque el aloinjerto que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 3 meses.
122. El método tal como se describe en la reivindicación 95, caracterizado porque el aloinjerto que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 6 meses.
123. El método tal como se describe en la reivindicación 95, caracterizado porque el aloinjerto que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 1 año.
124. El método tal como se describe en la reivindicación 95, caracterizado porque el aloinjerto que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 5 años.
125. El método tal como se describe en la reivindicación 95, caracterizado porque el aloinjerto que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante el resto de la vida del mamífero.
126. El método tal como se describe en la reivindicación 89, caracterizado porque al menos un fármaco inmunosupresivo se administra en forma crónica durante el resto de la vida del mamífero.
127. El método tal como se describe en la reivindicación 126, caracterizado porque se administra al menos ciclosporina A en forma crónica durante el resto de la vida del mamífero.
128. El método tal como se describe en la reivindicación 126, caracterizado porque se administra al menos LF15-0195 en forma crónica durante el resto de la vida del mamífero.
129. El método tal como se describe en la reivindicación 89, caracterizado porque el tratamiento inmunomodulador es plasmaferesis, esplenectomia o inmunoadsorción.
130. Un método para prolongar la supervivencia de un aloinjerto en un mamífero receptor, caracterizado porque el método comprende administrar a dicho mamífero a) un fármaco que inhibe la actividad de complemento y b) al menos una terapia inmunosupresiva en donde la terapia se selecciona de i) al menos un fármaco inmunosupresivo que comprende LF15-0195 o ii) un tratamiento inmunomodulador, en donde el mamífero es presensibilizado para el aloinjerto.
131. El método tal como se describe en la reivindicación 130, caracterizado porque el mamífero es un humano.
132. El método tal como se describe en la reivindicación 130, caracterizado porque el aloinjerto se selecciona del grupo que consiste en i) corazón, ii) riñon, iii) pulmón, iv) páncreas, v) hígado, vi) tejido vascular, vii) ojo, viii) cornea, ix) lentes, x) piel, xi) médula ósea, xii) músculo, xiii) tejido conectivo, xiv) tejido gastrointestinal, xv) tejido nervioso, xvi) hueso, xvii) células madre, xviii) isletos, xix) cartílago, xx) hepatocitos y xxi) células hematopoyeticas.
133. El método tal como se describe en la reivindicación 130, caracterizado porque el fármaco que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica.
134. El método tal como se describe en la reivindicación 130, caracterizado porque el fármaco que inhibe la actividad de complemento inhibe la formación de C5b ó C5a.
135. El método tal como se describe en la reivindicación 134, caracterizado porque el fármaco que inhibe la formación de C5b ó C5a es un anticuerpo completo o un fragmento de anticuerpo.
136. El método tal como se describe en la reivindicación 135, caracterizado porque el anticuerpo completo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano, humanizado, quimerizado o desinmunizado.
137. El método tal como se describe en la reivindicación 135, caracterizado porque el anticuerpo completo o fragmento de anticuerpo inhibe la disociación de complemento C5.
138. El método tal como se describe en la reivindicación 135, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo Fab, un F(ab')2, un Fv, un anticuerpo de dominio y un anticuerpo de cadena simple.
139. El método tal como se describe en la reivindicación 135, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo es pexelizumab.
140. El método tal como se describe en la reivindicación 135, caracterizado porque el anticuerpo completo es eculizumab.
141. El método tal como se describe en la reivindicación 140, caracterizado porque el eculizumab se administra una vez cada 2 semanas.
142. El método tal como se describe en la reivindicación 130, caracterizado porque el inhibidor de la actividad de complemento se selecciona del grupo que consiste en i) un receptor de complemento soluble, ii) CD59, iii) CD55, iv) CD46 y v) un anticuerpo para C5, C6, C7, C8 ó C9.
143. El método tal como se describe en la reivindicación 130, caracterizado porque el fármaco inmunosupresivo inhibe la actividad de célula-T o actividad de célula-B.
144. El método tal como se describe en la reivindicación 130, caracterizado porque el fármaco inmunosupresivo inhibe la actividad de célula-T y actividad de célula-B.
145. El método tal como se describe en la reivindicación 130, caracterizado porque el fármaco inmunosupresivo se selecciona del grupo que consiste en ciclosporina A, tacrolimus, sirolimus, OKT3, un corticoesteroide, daclizumab, basiliximab, azatiofreno, mofetil de micofenolato, metotrexato, 6-mercaptopurina, anticuerpos de anti-célula T, ciclofosfamida, leflunamida, brequinar, ATG, ALG, 15-desoxipergualina, un análogo de purina, rituxan, CTLA-4-lg (belatacept), IVIg, LF15-0195 y bredinina.
146. El método tal como se describe en la reivindicación 130, caracterizado porque el método comprende administrar i) un fármaco que inhibe la actividad de complemento, ii), ciclosporina A, y iii) LF15-0195.
147. El método tal como se describe en la reivindicación 146, caracterizado porque el fármaco que inhibe la actividad de complemento es un anticuerpo que inhibe la disociación del complemento C5.
148. El método tal como se describe en la reivindicación 130, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante un tiempo al menos 20% mayor que si el método se llevara a cabo sin el fármaco que inhibe la actividad de complemento.
149. El método tal como se describe en la reivindicación 130, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante un tiempo al menos 40% mayor que si el método se llevara a cabo sin el fármaco que inhibe la actividad de complemento.
150. El método tal como se describe en la reivindicación 130, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante el resto de vida del mamífero.
151. El método tal como se describe en la reivindicación 131, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante al menos tres meses.
152. El método tal como se describe en la reivindicación 131, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante al menos seis meses.
153. El método tal como se describe en la reivindicación 131, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante al menos un año.
154. El método tal como se describe en la reivindicación 131, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante al menos cinco años.
155. El método tal como se describe en la reivindicación 131, caracterizado porque el aloinjerto sobrevive durante el resto de la vida del humano.
156. El método tal como se describe en la reivindicación 133, caracterizado porque el aloinjerto que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 14 días.
157. El método tal como se describe en la reivindicación 133, caracterizado porque el aloinjerto que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 28 días.
158. El método tal como se describe en la reivindicación 133, caracterizado porque el aloinjerto que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 3 meses.
159. El método tal como se describe en la reivindicación 133, caracterizado porque el aloinjerto que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 6 meses.
160. El método tal como se describe en la reivindicación 133, caracterizado porque el aloinjerto que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 1 año.
161. El método tal como se describe en la reivindicación 133, caracterizado porque el aloinjerto que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante al menos 5 años.
162. El método tal como se describe en la reivindicación 133, caracterizado porque el aloinjerto que inhibe la actividad de complemento se administra en forma crónica durante el resto de la vida del mamífero.
163. El método tal como se describe en la reivindicación 133, caracterizado porque al menos un fármaco inmunosupresivo se administra en forma crónica durante el resto de la vida del mamífero.
164. El método tal como se describe en la reivindicación 163, caracterizado porque se administra al menos ciclosporina A en forma crónica durante el resto de la vida del mamífero.
165. El método tal como se describe en la reivindicación 163, caracterizado porque se administra al menos LF15-0195 en forma crónica durante el resto de la vida del mamífero.
166. El método tal como se describe en la reivindicación 130, caracterizado porque el tratamiento inmunomodulador es plasmaferesis, esplenectomia o inmunoadsorción.
167. El uso de un fármaco que inhibe la actividad de complemento y al menos un fármaco inmunosupresivo en la fabricación de un medicamento o paquete de medicamento para prolongar la supervivencia de un aloinjerto en un mamífero, en donde al menos un fármaco inmunosupresivo comprende LF15-0195.
168. El uso tal como se describe en la reivindicación 167, caracterizado porque se incluye más de un fármaco inmunosupresivo en el medicamento o paquete de medicamento.
169. El uso tal como se describe en la reivindicación 167, caracterizado porque el fármaco que inhibe la actividad de complemento y el fármaco inmunosupresivo están en una formulación adecuada para administración concurrente a dicho mamífero.
170. El uso tal como se describe en la reivindicación 167, caracterizado porque el fármaco que inhibe la actividad de complemento y el fármaco inmunosupresivo están en una formulación o formulaciones adecuadas para administración secuencial a dicho mamífero.
171. El uso tal como se describe en la reivindicación 167, caracterizado porque el fármaco que inhibe la actividad de complemento está en una formulación adecuada para administración crónica al mamífero.
172. El uso tal como se describe en la reivindicación 167, caracterizado porque el fármaco inmunosupresivo está en una formulación adecuada para administración crónica al mamífero.
173. Un paquete farmacéutico que comprende un fármaco que inhibe la actividad de complemento y al menos un fármaco inmunosupresivo, en donde el fármaco que inhibe la actividad de complemento y el fármaco inmunosupresivo se formulan para administración crónica, en donde al menos un fármaco inmunosupresivo comprende LF15-0195.
174. El paquete farmacéutico tal como se describe en la reivindicación 173, caracterizado porque el fármaco que inhibe la actividad de complemento es un anticuerpo en una formulación liofilizada que comprende el anticuerpo y un lioprotector.
175. El paquete farmacéutico tal como se describe en la reivindicación 173, caracterizado porque el fármaco inmunosupresivo está en una formulación liofilizada que comprende el fármaco inmunosupresivo y un lioprotector.
176. El paquete farmacéutico tal como se describe en la reivindicación 173, caracterizado porque el fármaco y el fármaco inmunosupresivo están en la misma formulación liofilizada que comprende el fármaco, el fármaco inmunosupresivo y un lioprotector.
177. El paquete farmacéutico tal como se describe en la reivindicación 173, caracterizado porque el fármaco que inhibe la actividad de complemento está en un sistema de inyección que comprende una jeringa que comprende un cartucho, en donde el cartucho contiene el fármaco en una formulación adecuada para inyección.
178. El paquete farmacéutico tal como se describe en la reivindicación 173, caracterizado porque el fármaco inmunosupresivo está en un sistema de inyección que comprende una jeringa que comprende un cartucho, en donde el cartucho contiene el fármaco inmunosupresivo en una formulación adecuada para inyección.
179. El paquete farmacéutico tal como se describe en la reivindicación 173, caracterizado porque el fármaco que inhibe la actividad de complemento y el fármaco inmunosupresivo están en un sistema de inyección que comprende una jeringa que comprende un cartucho, en donde el cartucho contiene el fármaco y el fármaco inmunosupresivo en una formulación adecuada para inyección.
180. El paquete farmacéutico tal como se describe en la reivindicación 173, caracterizado porque por que el fármaco que inhibe la actividad de complemento se encuentra en una forma de dosis de unidad.
181. El paquete farmacéutico tal como se describe en la reivindicación 173, caracterizado porque el fármaco inmunosupresivo se encuentra en una forma de dosis de unidad.
182. El paquete farmacéutico tal como se describe en la reivindicación 174, caracterizado porque el anticuerpo inhibe la formación de un complemento terminal o C5a.
183. El paquete farmacéutico tal como se describe en la reivindicación 174, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo completo o un fragmento de anticuerpo.
184. El paquete farmacéutico tal como se describe en la reivindicación 174, caracterizado porque el anticuerpo, en donde el anticuerpo completo o el fragmento de anticuerpo es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano, humanizado, quimerizado o desinmunizado.
185. El paquete farmacéutico tal como se describe en la reivindicación 174, caracterizado porque el anticuerpo completo o fragmento de anticuerpo inhibe la disociación del complemento C5.
186. El paquete farmacéutico tal como se describe en la reivindicación 174, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo Fab, un F(ab')2, un Fv, un anticuerpo de dominio y un anticuerpo de cadena simple.
187. El paquete farmacéutico tal como se describe en la reivindicación 174, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo es pexelizumab.
188. El paquete farmacéutico tal como se describe en la reivindicación 174, caracterizado porque el anticuerpo completo es eculizumab.