CN102585016B - 一种可同时抑制t、b淋巴细胞功能的免疫融合蛋白、其制备方法及其应用 - Google Patents
一种可同时抑制t、b淋巴细胞功能的免疫融合蛋白、其制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种可同时抑制T、B淋巴细胞功能的免疫融合蛋白、其制备方法及其应用。本发明的融合蛋白具有细胞毒性T细胞相关抗原4(cytotoxicT-lymphocyte-associatedprotein4,CTLA-4)和穿膜蛋白活化物(transmembraneactivatorandCAMLinteracter,TACI)胞外功能结构域的功能区,能与抗原提呈细胞表面分子B7(CD80)和B淋巴细胞活化因子(BlyS)特异地、高亲和性结合,具有抑制T淋巴细胞和B淋巴细胞活化的能力。由于自身免疫性疾病(autoimmunitydiseases)是T淋巴细胞和B淋巴细胞免疫功能亢进而导致的一类疾病,因此Ultra-T/B免疫融合蛋白具有治疗类风湿关节炎(RA)、银屑病、系统性红斑狼疮(SLE)、硬皮病、I型糖尿病(TypeIdiabetes)等一类疾病的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一种可同时抑制T、B淋巴细胞功能的免疫融合蛋白、其制备方法及其应用,属于生物工程技术领域。
背景技术
自身免疫性疾病(autoimmunity diseases)是机体免疫系统对自身成分发生免疫应答的疾病状态,往往是由于T淋巴细胞和B淋巴细胞免疫功能亢进而导致的一类疾病。自身免疫性疾病在人群中的发病率约为3%~5%。自身免疫疾病种类很多,包括类风湿关节炎(RA)、银屑病、系统性红斑狼疮(SLE)、硬皮病、I型糖尿病(Type I diabetes)等一类疾病。
T淋巴细胞和B淋巴细胞是人体免疫系统的两种最为重要的功能细胞,在机体免疫应答和免疫反应中扮演重要角色。T淋巴细胞介导细胞免疫,B淋巴细胞介导体液免疫,二者既相互区别又相互联系。T细胞激活时需要其细胞膜上的抗原识别受体(TCR)识别抗原提呈细胞(APC)表面的主要组织相容性复合体(MHC)沟槽中特异抗原肽,构成T淋巴细胞免疫活化的第一信号。T淋巴细胞和抗原提呈细胞(APC)表面众多的协同刺激分子(costimulatory molecules)和相应受体(costimulatory molecules receptor,CMR)构成活化的第二刺激信号,例如CD4与MHC II类分子配对;CD8与MHC I类分子配对;CD28与B7(CD80)配对;LFA2(CD2)与LFA3(CD58)配对;LFA1与ICAM1配对等均可作为第二信号,其中以CD28与B7(CD80)相互作用在T淋巴细胞活化时最为重要。同样地,B淋巴细胞对胸腺依赖抗原(TDAg)的刺激反应中需要与T淋巴细胞相互作用,B淋巴细胞才能活化。首先B淋巴细胞通过胞膜上的抗原识别受体(BCR)与抗原结合,抗原内化后,经胞内溶酶体等加工处理成顺序决定簇抗原,顺序决定簇抗原与MHC II类分子结合表达于细胞膜表面,B淋巴细胞作为抗原提呈细胞(APC)将抗原递呈给辅助性T淋巴(T h)细胞,Th细胞活化并表达膜分子和分泌多种淋巴因子(IL-2,IL-4,IL-6等),在这些分子作用下B淋巴细胞表达高亲和力的BCR和丰富的MHCII类分子。在B淋巴细胞活化中CD40分子与CD40L的结合,B淋巴细胞活化因子(BlyS)分别与其三种受体即B细胞成熟抗原(BCMA)、穿膜蛋白活化物(TACI)和B细胞活化因子受体(BAFF-R)的结合,为B细胞活化的第二刺激信号。
综上所述,T淋巴细胞和B淋巴细胞活化中共刺激信号(第二刺激信号)扮演着重要的角色,没有共刺激信号T淋巴细胞和B淋巴细胞将不能活化。鉴于自身免疫性疾病往往是由于T淋巴细胞和B淋巴细胞过度活化,功能亢进而导致的一类疾病。所以,阻断T淋巴细胞和B淋巴细胞活化共刺激信号可以降低免疫反应,达到治疗自身免疫性疾病的目的,是目前治疗自身免疫性疾病的措施之一。下表是全球已上市和在研临床III期以上阻断共刺激信号抗体类药物的品种列表。
表1上市和在研临床III期以上阻断共刺激信号抗体类药物的品种列表
表中alefacept、abatacept、belatacept和atacicept的结构均为受体-Fc融合蛋白。该类结构已经被证实是除了抗体药物以外,能清除体内多余配体分子的一种有效手段。目前上市的有etanercept(1998)、alefacept(2003)、abatacept(2006)、rilonacept(2008)和belatacept(2011)均为此结构,其中不乏“重磅炸弹”级药物,etanercept在2009年和2010年全球销售额达80亿和84亿美元。受体-Fc融合蛋白中受体结构域在融合蛋白中执行结合配体的功能,而Fc部分(包括轻链恒定区)具有多种作用:易检测,可使用通用的抗人二抗进ELISA检测;易纯化,通过与protein A的结合而使用亲和层析方便地纯化;增加半衰期,IgG重链恒定区约有氨基酸残基330个,轻链恒定区约有氨基酸残基110个,组合成4肽链后分子量超过100kDa,大大延长药物在体内的半衰期;可提供额外的生物学效应如补体激活、ADCC效应等免疫调节活性。此外,与抗体药物相比受体-Fc融合蛋白不必进行繁琐的抗体筛选和人源化过程,具有亲和力高、免疫源性低等优点。
CD28:CTLA-4/B7(CD80)为T淋巴细胞重要的共刺激信号(第二刺激信号)。细胞毒性T细胞相关抗原4(CTLA-4/CDl52)和CD28同为免疫球蛋白超基因家族成员,二者具有70%的同源性,均为表达于T细胞表面的跨膜受体。CD28和CTLA-4是一对具有正负调节功能的重要共刺激分子,二者竞争性结合B7分子,但CTLA4与其配体B7分子亲和力较CD28大20倍。CD28与APC上的B7-1和B7-2的结合后能够传递共刺激信号给T淋巴细胞,增强CD3/TCR复合体或CD2分子的作用,诱导T淋巴细胞活化和分泌多种细胞因子。CTLA-4则抑制T淋巴细胞的增殖、活化,诱导活化的T淋巴细胞凋亡,是机体免疫系统维持的关键环节。CD28和CTLA-4的天然配体为存在于APC表面的B7分子家族,包括B7-1(CD80)、B7-2(CD86)和B7-3。B7-1和B7-2表达于激活的单核细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞,B7-3主要在角质细胞上表达。
B淋巴细胞活化因子(BlyS)与其受体则为B淋巴细胞的重要活化信号。B淋巴细胞活化因子(B lymphocyte stimulator,Blys)又被称为THANK(TNF homologuethat activates apotosis,nuclear factor-κB,and c-JUN NH2-terminal kinase),TALL1(TNF and apoptosis ligand-related leukocyte expressed ligand-1),BAFF(B cellactivating faetors belonging to the TNF family),zTNF4及TNF 13B,是1999年发现的肿瘤坏死因子(TNF)配体超家族成员。作为B细胞的共刺激因子,Blys的主要作用是刺激B淋巴细胞增殖、分化和分泌抗体,其正常表达维持依赖和不依赖T细胞抗原刺激的B细胞活化和增殖至关重要。Blys还参与T细胞介导的免疫功能。Blys受体分别为B细胞成熟抗原(B cell maturation antigen,BCMA)、穿膜蛋白活化物(transmembrane activator and CAML interacter,TACI)和BAFF-R,这三种受体与Blys的亲和力都达到Sub-nanomolar级,其中BCMA及TACI均为BLyS与肿瘤坏死因子家族另一成员APRIL(a proliferation-inducing ligand,一种诱发增殖的配体)的共受体,BAFF-R是BLyS的特异性受体。Blys的过量表达或缺陷均能引起机体的免疫失衡进而诱发各种自身免疫性疾病。B淋巴细胞活化因子(Blys)是目前治疗自身免疫性疾病良好的靶标。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足之处,提供一种可同时抑制T、B淋巴细胞功能的免疫融合蛋白、其制备方法及其应用。
本发明的可同时抑制T、B淋巴细胞功能的免疫融合蛋白,所述的免疫融合蛋白包括两部分:一部分为序列如SEQ ID.1所示的氨基酸序列组成的多肽链;另一部分为序列如SEQ ID.2所示的氨基酸序列组成的多肽链。
本发明的可同时抑制T、B淋巴细胞功能的免疫融合蛋白的制备方法,包括以下步骤:
1)将B淋巴细胞活化因子(BlyS)三种受体之一的穿膜蛋白活化物(TACI)胞外功能结构域和人免疫球蛋白κ轻链恒定区Cκ编码基因通过重叠PCR方法连接,得到核苷酸序列如SEQ ID.3所示的TACI/C κ编码基因;
2)同样将CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4)胞外功能结构域与人的IgG4重链恒定区Fc(CH1、CH2和CH3)编码基因连接,得到核苷酸序列如SEQ ID.4所示的CTLA-4/IgG4Fc编码基因;其中IgG4Fc恒定区有两个氨基酸突变,第228位的S突变为P,第235位的L突变为E;
3)将克隆得到的上述扩增产物经限制性内切酶酶切后克隆至真核细胞表达载体;
4)真核细胞表达载体转染至工程细胞(CHO、293或NS0细胞)中,在上述细胞中组装成同抗体类似的4肽链结构,得到Ultra-T/B免疫融合蛋白。Ultra-T/B免疫融合蛋白为一种受体-Fc(Fragment cristallizable)融合蛋白。
本发明的可同时抑制T、B淋巴细胞功能的免疫融合蛋白,具有用于制备治疗由于T淋巴细胞和B淋巴细胞免疫功能亢进而导致自身免疫性疾病的药物的用途。
本发明中,一方面为使Ultra-T/B免疫融合蛋白在真核细胞,特别是CHO细胞中高表达,对融合蛋白的编码基因进行了优化,使其更适于在CHO细胞中表达;另一方面为进一步降低免疫融合蛋白可能具有与效应细胞(T淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞)FcγR的结合能力和提高IgG4的稳定性,对IgG4铰链区和CH2恒定区的氨基酸残基S228P,L235E(Fc氨基酸残基编号按Kabat数据库)进行了突变。在IgG四种亚类中本发明之所以选择IgG4是由于IgG4与C1q的结合能力最弱,不能经经典途径激活补体,产生补体介导的细胞毒作用(CDC效应),也不能结合单核巨噬细胞,不能介导抗体依赖的细胞毒作用(ADCC效应);但IgG4分子的缺点是形成的二聚体不够稳定以及有一定的结合中性粒细胞FcγR的能力,本发明中通过铰链区和CH2恒定区氨基酸的突变的可以克服IgG4分子的上述缺陷。
因此本发明的Ultra-T/B免疫融合蛋白可作为一种未来治疗自身免疫性疾病反复使用药物,可降低未来用于患者体内后由此产生的毒副作用。经ELISA方法检测Ultra-T/B免疫融合蛋白(或免疫融合蛋白305)在体外可以很好的结合可溶性CD80(B7)和B淋巴细胞活化因子(Blys)这两种T淋巴细胞和B淋巴细胞活化分子,将来用于体内可同时抑制T淋巴细胞和B淋巴细胞的活化作用,未来可用于类风湿关节炎(RA)、银屑病、系统性红斑狼疮(SLE)、硬皮病、I型糖尿病(Type I diabetes)等自身免疫性疾病的治疗。
说明书附图
图1a为TACI/C κ表达载体的构建过程中PCR扩增C κ和TACI的电泳图,其中,1,C κ扩增产物;2,TACI扩增产物;3,分子量标准;
图1b为TACI/C κ表达载体的构建过程中重叠PCR扩增TACI/C κ的电泳图,其中,1,TACI/C κ扩增产物;2,分子量标准;
图1c为TACI/C κ表达载体的构建过程中双酶切鉴定pHG-TACI/C κ载体的电泳图,其中,1,pHG-TACI/C κ载体;3,分子量标准;
图2a为CTLA-4/IgG4表达载体的构建过程中PCR扩增IgG4和CTLA-4的电泳图,其中,1,IgG4扩增产物;2,分子量标准;3,CTLA-4扩增产物;
图2b为CTLA-4/IgG4表达载体的构建过程中重叠PCR扩增CTLA-4/IgG4的电泳图,其中,1,CTLA-4/IgG4回收产物;2,分子量标准;
图2c为CTLA-4/IgG4表达载体的构建过程中双酶切鉴定pLG-CTLA-4/IgG4的电泳图,其中,1,pLG-CTLA-4/载体;2,分子量标准;
图3为双酶切鉴定Ultra-T/B免疫融合蛋白表达载体的电泳图,其中,1,分子量标准;2,Ultra-T/B免疫融合蛋白表达载体;
图4为Ultra-T/B免疫融合蛋白结构图;
图5为Ultra-T/B免疫融合蛋白与CD80(B7)的结合结果示意图;
图6为Ultra-T/B免疫融合蛋白与Blys的结合结果示意图;
图7为Ultra-T/B免疫融合蛋白纯化产物SDS-PAGE结果示意图,其中1,蛋白质Marker;2,纯化产物1(非还原);3,纯化产物2(非还原);4,蛋白质Marker;5,纯化产物1(还原);6,纯化产物2(还原)。
具体实施方式
实施例1构建Ultra-T/B免疫融合蛋白
包括以下步骤:
一、Ultra-T/B免疫融合蛋白基因的克隆
1、基因的合成
委托上海捷瑞生物工程有限公司合成TACI编码基因序列,其核苷酸序列如SEQ ID.5所示;同样,委托上海捷瑞生物工程有限公司合成CTLA-4编码基因序列,其核苷酸序列如SEQ ID.6所示。
2、表达载体的构建
●材料含Cκ和IgG4Fc恒定区(IgG4)氨基酸残基,其中IgG4Fc恒定区有两个氨基酸突变,第228位的S突变为P,第235位的L突变为E,(Fc氨基酸残基编号按Kaba数据库),由本单位构建。
●引物设计
1)PCR法分别扩增TACI和Cκ编码基因序列。首先以合成的TACI基因为模板,BL-F1和BL-R1为引物,扩增TACI编码基因。扩增条件为:95℃变性3min;然后94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s,30个循环;最后72℃延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后,用DNA片段回收试剂盒回收PCR产物。然后以含Cκ编码基因质粒为模板,BL-F2和BL-R2为引物,扩增Cκ编码基因,PCR反应条件基本同上,PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后,用DNA片段回收试剂盒回收PCR产物。
2)重叠PCR扩增TACI/Cκ编码基因序列。在PCR反应体系中加入回收TACI和Cκ编码基因PCR产物,95℃变性3min,随后按下列参数循环7次:94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸45s。然后加入引物BL-F1和BL-R2,再按下列参数循环30次:94℃变性45s,55℃退火45s,72℃延伸45s;最后72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后纯化回收。PCR扩增片段及载体pHG经HindIII和EcoRI双酶切后,在T4连接酶的作用下室温连接4小时后,转化大肠杆菌DH5α。12小时后挑取转化菌落。经菌落PCR(BL-F1和BL-R2为引物)及HindIII和EcoRI双酶切鉴定重组子。所获载体命名为pHG-TACI/Cκ。
3)同样,首先分别以AL-F1和AL-R1为引物扩增CTLA-4,AL-F2和AL-R2扩增为引物IgG4Fc恒定区。然后采用重叠PCR方法以CTLA-4和IgG4Fc为模板,AL-F1和AL-R2为引物得到CTLA-4/IgG4Fc编码基因。上述产物经HindIII和EcoRI双酶切后克隆至同样双酶切的pLG载体。所获载体命名为pLG-CTLA-4/IgG4。
4)载体pLG-CTLA-4/IgG4和pHG-TACI/Cκ经NotI和SalI双酶切后,回收酶切产物较长片段,在T4连接酶的作用下室温连接4小时后,转化大肠杆菌DH5α。12小时后挑取转化菌落,提取质粒。HindIII和EcoRI双酶切鉴定重组子。
结果:
1)TACI/Cκ的克隆
PCR扩增TACI和Cκ编码基因产物大小300bp左右,Cκ产物也为300bp左右,但较TACI稍大,见图1A。二者经重叠PCR扩增相连接后得到的TACI/Cκ产物大小为650bp左右,见图1B。经酶切鉴定和测序结果完全正确,见图1C。TACI/Cκ编码相应的核苷酸序列如SEQ ID.3所示。
TACI/Cκ编码相应的氨基酸序列如SEQ ID.1所示。其中包括信号肽序列、TACI胞外功能区和Cκ,命名为TACI/Cκ。
3)CTLA-4/IgG4的克隆
PCR扩增CTLA-4编码基因产物430bp左右,IgG4编码基因产物1000bp左右,见图2A。二者经重叠PCR扩增相连接后得到的CTLA-4/IgG4产物大小为1450bp左右,见图2B。酶切鉴定和测序结果完全正确,见图2C。CTLA-4-IgG4相应的核苷酸序列如SEQ ID.4所示。
CTLA-4-IgG4相应的氨基酸序列如SEQ ID.2所示。其中包括信号肽序列、CTLA-4胞外功能区和Fc恒定区,其中IgG4Fc恒定区有两个氨基酸突变,第228位的S突变为P,第235位的L突变为E,(Fc氨基酸残基编号按Kabat数据库)。
二、Ultra-T/B免疫融合蛋白表达载体的构建
载体pLG-CTLA-4/IgG4和pHG-TACI/Cκ经NotI和SalI双酶切后,经T4连接酶连接成Ultra-T/B免疫融合蛋白表达载体。Ultra-T/B免疫融合蛋白表达载体经HindIII和EcoRI双酶切鉴定可以切出4条带,其中两条大小分别为650bp和1450bp,分别为TACI/Cκ和CTLA-4/IgG4的编码基因,见图3。转染至CHO、NS0或293等真核细胞在内质网内组装成类抗体的4肽链结构,命名为Ultra-T/B免疫融合蛋白,其结构模拟图见图4。
三、Ultra-T/B免疫融合蛋白的瞬时表达及初步功能测定
293F(购自Invitrogen公司,Cat No.11625-019)细胞培养于10%胎牛血清的CD 293培养液(购自Invitrogen公司,Cat No.11913-019)中。转染前一天铺6孔板,细胞浓度为5×105细胞/孔。24小时后,分别将1μg DNA(Ultra-T/B免疫融合蛋白表达载体)和LipofectamineTM 2000(购自Invitrogen公司,CatNo.11668-019)与250μl IMDM(购自Hyclone公司,Cat No.SH30243.01B)混匀,静置5min。将DNA混悬液逐滴加入LipofectamineTM 2000混悬液中,混匀,室温放置20min后,将DNA-LipofectamineTM 2000混悬液逐滴加入经2次洗涤过的293F细胞中,置于5%CO2、37℃培养。
转染96小时后,收集上清ELISA检测蛋白的表达以及与可溶性CD80和Blys的结合。CD80和Blys(均购自北京义翘神州生物技术有限公司,产品号10698-HCCH和10056-H01H)5μg/ml和4μg/ml分别包被EIA 96孔板。将不同稀释倍数的转染上清50μl加入包被的96孔板中,37℃孵育2小时。洗涤3次后,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人二抗(北京中衫金桥公司产品,产品号:ZDR-5301),37℃孵育1h。洗涤3次后,加入TMB底物显色液(北京康为世纪生物科技有限公司,产品号:CW0050)50μl/孔。10分钟后,加入2N的H2SO4终止显色。
结果:瞬时表达的Ultra-T/B免疫融合蛋白的对可溶性CD80和Blys均有较好的结合活性,尤其与Blys的结合能力高强,样品稀释100倍后仍然可检测到二者的结合,见图5和6。
将来应用时,Ultra-T/B免疫融合蛋白与T淋巴细胞表面CD80(B7)的结合,可以竞争性CD80(B7)与CD28的结合,阻碍T淋巴细胞活化的第二刺激信号,达到抑制T淋巴细胞的活化目的;Ultra-T/B免疫融合蛋白与Blys的结合,中和体内Blys的功能,达到抑制B淋巴细胞活化的目的。如上所述,自身免疫性疾病往往是由于T淋巴细胞和B淋巴细胞免疫功能亢进而导致的一类疾病,所以,Ultra-T/B免疫融合蛋白具有潜在的治疗类风湿关节炎(RA)、银屑病、系统性红斑狼疮(SLE)、硬皮病、I型糖尿病(Type I diabetes)等自身免疫性疾病。
四、Ultra-T/B免疫融合蛋白的工程细胞的建立及初步纯化
DG44细胞(购自Invitrogen,cat:A11000-01)培养于10%胎牛血清的DMEM培养基(购自Invitrogen,cat:12491-023)中。按LipofectamineTM 2000(购自Invitrogen公司,Cat No.11668-019)说明书的要求将Ultra-T/B免疫融合蛋白转染至DG44细胞。转染48小时后,培养基换为10%透析血清不含谷氨酰胺DMEM培养基并加入25μM蛋氨酸亚氨基代砜(购自Sigma,cat:M5379)加压筛选。大约10天后未转染入表达载体的DG44细胞死亡,转染入表达载体的细胞形成细胞克隆,ELISA方法检测培养上清中融合蛋白的的表达水平,选出高表达克隆,转入24孔板扩大培养,并逐步训化至无血清无蛋白的CD optiCHO培养基中(购自Invitrogen,cat:12681-011)悬浮培养,建立稳定工程细胞株。
稳定工程细胞株在500ml摇瓶中悬浮培养,7-10天后收集培养上清。培养上清离心过滤后采用ProteinA亲和层析的方法纯化Ultra-T/B免疫融合蛋白。用pH 7.4的PBS溶液平衡HiTrap MabSelect SuRe 1ml柱(GEHealthcare Life Sciences产品,Cat.No:11-0034-93)10个床体积,流速为0.5ml/min;培养上清液用0.45μm滤膜过滤上样,流速为1.5ml/min。用pH 7.4的PBS溶液再洗5-10个床体积,流速为1.0ml/min;用100mM柠檬酸缓冲液(pH 3.5)洗脱,流速为0.5ml/min,收集洗脱峰。
结果:见图7,免疫融合蛋白纯度达到95%以上,免疫融合蛋白的分子量大约160kDa左右,其中TACI/Cκ分子量约为25kDa,CTLA-4/IgG4约为55kDa,与理论预期基本一致。
Organization Applicant
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<110> OrganizationName : 江苏健德生物药业有限公司
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<120> Title : 一种可同时抑制T、B淋巴细胞功能的免疫融合蛋白、其制备方法及其应用
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ttccctgagc ctgtgaccgt gtcctggaac tccggcgccc tgacctccgg cgtgcacacc 600
ttccctgccg tgctgcagtc ctccggcctg tactccctgt cctccgtggt gaccgtgcct 660
tcctcctccc tgggcaccaa gacctacacc tgcaacgtgg accacaagcc ttccaacacc 720
aaggtggaca agcgcgtgga gtccaagtac ggccctcctt gccctccttg ccctgcccct 780
gagttcgagg gcggcccttc cgtgttcctg ttccctccta agcctaagga caccctgatg 840
atctcccgca cccctgaggt gacctgcgtg gtggtggacg tgtcccagga ggaccctgag 900
gtgcagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcaca acgccaagac caagcctcgc 960
gaggagcagt tcaactccac ctaccgcgtg gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggac 1020
tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag gtgtccaaca agggcctgcc ttcctccatc 1080
gagaagacca tctccaaggc caagggccag cctcgcgagc ctcaggtgta caccctgcct 1140
ccttcccagg aggagatgac caagaaccag gtgtccctga cctgcctggt gaagggcttc 1200
tacccttccg acatcgccgt ggagtgggag tccaacggcc agcctgagaa caactacaag 1260
accacccctc ctgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tgtactcccg cctgaccgtg 1320
gacaagtccc gctggcagga gggcaacgtg ttctcctgct ccgtgatgca cgaggccctg 1380
cacaaccact acacccagaa gtccctgtcc ctgtccctgg gcaagtaaga attc 1434
<212> Type : DNA
<211> Length : 1434
SequenceName : 4
SequenceDescription :
Sequence
--------
<213> OrganismName :
<400> PreSequenceString :
atggagaccg acaccctgct gctctgggtg ctgctgctct gggtgcccgg ctccaccgga 60
gctatgagat cctgccccga agagcagtac tgggatcctc tgctgggtac ctgcatgtcc 120
tgcaaaacca tttgcaacca tcagagccag cgcacctgtg cagccttctg caggtcactc 180
agctgccgca aggagcaagg caagttctat gaccatctcc tgagggactg catcagctgt 240
gcctccatct gtggacagca ccctaagcaa tgtgcatact tctgtgagaa caagctcagg 300
agc 303
<212> Type : DNA
<211> Length : 303
SequenceName : 5
SequenceDescription :
Sequence
--------
<213> OrganismName :
<400> PreSequenceString :
atggagaccg acaccctgct gctctgggtg ctgctgctct gggtgcccgg ctccaccgga 60
atgcacgtgg ctcagcctgc tgtggtgctg gcttcctccc gcggaatcgc ttccttcgtg 120
tgcgagtacg cttcccctgg aaaggctacc gaggtgcgcg tgaccgtgct gcgccaggct 180
gactcccagg tgaccgaggt gtgcgctgct acctacatga tgggaaacga gctgaccttc 240
ctggacgact ccatctgcac cggaacctcc tccggaaacc aggtgaacct gaccatccag 300
ggactgcgcg ctatggacac cggactgtac atctgcaagg tggagctgat gtaccctcct 360
ccttactacc tgggaatcgg aaacggaacc cagatctacg tgatcgaccc tgagcct 417
<212> Type : DNA
<211> Length : 417
SequenceName : 6
SequenceDescription :
Claims (4)
1.一种可同时抑制T、B淋巴细胞功能的免疫融合蛋白,其特征在于,所述的免疫融合蛋白具有同抗体类似的4肽链结构,包括两部分:一部分为序列如SEQ ID.1 所示的氨基酸序列组成的多肽链;另一部分为序列如SEQ ID.2所示的氨基酸序列组成的多肽链。
2.如权利要求1中所述的可同时抑制T、B淋巴细胞功能的免疫融合蛋白的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)将TACI和Cκ编码基因连接,得到核苷酸序列如SEQ ID.3 所示的TACI/Cκ编码基因;
2)将CTLA-4和IgG4Fc恒定区的编码基因连接,得到核苷酸序列如SEQ ID.4所示的CTLA-4/IgG4 Fc编码基因;其中IgG4 Fc恒定区有两个氨基酸突变,第228位的S突变为P,第235位的L突变为E;
3)将克隆得到的扩增产物经限制性内切酶酶切后克隆至真核细胞表达载体;
4)真核细胞表达载体转染至工程细胞中,在上述细胞中组装成同抗体类似的4肽链结构,得到可同时抑制T、B淋巴细胞功能的免疫融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的构建方法,其特征在于,所说的工程细胞选自CHO、293或NS0细胞。
4.如权利要求1所述的可同时抑制T、B淋巴细胞功能的免疫融合蛋白,具有用于制备治疗由于T淋巴细胞和B淋巴细胞免疫功能亢进而导致自身免疫性疾病的药物的用途。
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