EA041387B1

EA041387B1 - Молекулы, которые избирательно активируют регуляторные t-клетки для лечения аутоиммунных заболеваний

Info

Publication number: EA041387B1
Application number: EA201891656
Authority: EA
Inventors: Джеффри ГРИВ
Original assignee: Делиниа, Инк.
Priority date: 2016-01-20
Filing date: 2017-01-19
Publication date: 2022-10-19

Description

Перекрестная ссылка

По данной заявке испрашивают приоритет патентной заявки США № 15/002144, поданной 20 января 2016 г., которая включена в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме.

Ссылка на список последовательностей

Список последовательностей, записанный в файле Списки последовательностей^, созданном 2 июля 2018 г., 89156 байтов, машинный формат IBM-PC, операционная система MS-Windows, включен, таким образом, посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

Предпосылки изобретения

Иммунная система должна быть способна различать свое и не свое. Когда различать свое/не свое не удается, иммунная система разрушает клетки и ткани организма и, как результат, служит причиной аутоиммунных заболеваний. Регуляторные T-клетки активно подавляют активацию иммунной системы и предотвращают патологическую аутореактивность и последующее аутоиммунное заболевание. Разработка лекарственных средств и способов для избирательной активации регуляторных T-клеток для лечения аутоиммунного заболевания является целью интенсивных исследований и до разработки настоящего изобретения главным образом была безуспешной.

Регуляторные T-клетки (Treg) представляют собой класс CD4+CD25+ T-клеток, которые супрессируют активность других клеток иммунной системы. Treg являются ключевыми для гомеостаза иммунной системы и играют основную роль в поддержании толерантности к аутоантигенам и модуляции иммунного ответа на чужеродные антигены. Показано, что множество аутоиммунных и воспалительных заболеваний, в том числе диабет 1 типа (T1D), системная красная волчанка (SLE) и реакция трансплантат против хозяина (GVHD) имеют недостаточность числа клеток Treg или функции Treg. Следовательно, существует большой интерес к разработке терапии, которая увеличивает число и/или функцию клеток Treg.

Один подход к лечению аутоиммунных заболеваний, который исследовали, представляет собой трансплантацию аутологических, размноженных ex vivo клеток Treg (Tang, Q. et al., 2013, Cold Spring Harb. Perspect. Med., 3:1-15). Хотя для этого подхода продемонстрирована перспективность при лечении животных моделей заболевания и на ранних стадиях нескольких клинических исследований у человека, он требует персонализированного лечения с использованием собственных T-клеток пациента, является инвазивным и технически сложным. Другой подход представляет собой лечение с использованием низкой дозы интерлейкина-2 (IL-2). Клетки Treg характеристически экспрессируют высокие конститутивные уровни высоко аффинного рецептора IL-2, IL-2Raey, который состоит из субъединиц IL-2RA (CD25), IL2RB (CD122) и IL-2RG (CD132), и показано, что рост клеток Treg зависит от IL-2 (Malek, T.R. et al., 2010, Immunity, 33:153-65). В клинических исследованиях лечения низкими дозами IL-2 пациентов с хронической GVHD (Koreth, J. et al., 2011, N. Engl. J. Med., 365:2055-66) и HCV-ассоциированным аутоиммунным васкулитом (Saadoum, D. et al., 2011, N. Engl. J. Med., 365:2067-77) продемонстрированы повышенные уровни Treg и признаки клинического эффекта. Начаты новые клинические исследования, в которых изучают эффект IL-2 во многих других аутоиммунных и воспалительных заболеваниях.

Пролейкин (представленный на рынке Prometheus Laboratories, San Diego, CA), рекомбинантная форма IL-2, используемая в этих исследованиях, связан с высокой токсичностью. Пролейкин одобрен для лечения метастатической меланомы и метастатической злокачественной опухоли почки, но его побочные эффекты настолько тяжелы, что его использование рекомендовано только в больничных условиях с доступом к интенсивной терапии (http://www.proleukin.com/assets/pdf/proleukin.pdf). Пока совсем недавно не определили характеристики клеток Treg, IL-2 считали стимулятор иммунной системы, активирующим Tклетки и другие клетки иммунной системы для элиминации клеток злокачественной опухоли. В клинических исследованиях IL-2 при аутоиммунных заболеваниях использовали более низкие дозы IL-2 для того, чтобы направленно воздействовать на клетки Treg, поскольку клетку Treg отвечают на более низкие концентрации IL-2, чем клетки иммунной системы многих других типов, поскольку они экспрессируют IL-2Raey (Klatzmann D., 2015, Nat. Rev. Immunol., 15:283-94). Однако даже эти более низкие дозы вели к проблемам с безопасностью и переносимостью, и в применяемом лечении использовали ежедневные подкожные инъекции или хронически, или периодически курсами лечения по 5 суток. Следовательно, существует потребность в терапии аутоиммунных заболеваний, увеличивающей число и функцию клеток Treg, которая воздействует на клетки Treg более конкретно, чем IL-2, т.е. более безопасно и более переносимо, и которую вводят менее часто.

Один подход к усовершенствованию терапевтического индекса терапии на основе IL-2 состоит в использовании вариантов IL-2, которые избирательны к клеткам Treg относительно других клеток иммунной системы. Рецепторы IL-2 экспрессированы на клетках иммунной системы многих различных типов, в том числе T-клетках, NK клетках, эозинофилах и моноцитах, и этот широкий профиль экспрессии вероятно вносит вклад в их плейотропный эффект, оказываемый на иммунную систему, и высокую системную токсичность. Рецептор IL-2 существует в трех формах:

(1) низкоаффинных рецептор, IL-2RA, который не формирует сигнал;

(2) рецептор с промежуточной аффинностью (IL-2Rey), состоящий из IL-2RB и IL-2RG, который широко экспрессирован на стандартных T-клетках (Tcon), NK клетках, эозинофилах и моноцитах; и

- 1 041387 (3) высокоаффинный рецептор (IL-2Raey), состоящий из IL-2RA, IL-2RB и IL-2RG, который экспрессируется временно на активированных T-клетках и конститутивно на клетках Treg.

Разработаны варианты IL-2, которые избирательны к IL-2Raey относительно IL-2Rey (Shanafelt, A.B. et al., 2000, Nat. Biotechnol., 18:1197-202; Cassell, D.J. et al., 2002, Curr. Pharm. Des., 8:2171-83). Эти варианты имеют замены аминокислот, которые снижают их аффинность к IL-2RB. Поскольку IL-2 обладает не поддающейся обнаружению аффинностью к IL-2RG, эти варианты, следовательно, обладают сниженной аффинностью к комплексу рецептора IL-2Rey и сниженной способностью активировать IL2Rβy-экспрессирующие клетки, но сохраняют способность связывать IL-2RA и способность связывать и активировать комплекс рецептора IL-2Raey. Один из этих вариантов, IL-2/N88R (Bay 50-4798), клинически тестировали в виде низкотоксичной версии IL-2 в качестве стимулятора иммунной системы на основании гипотезы, что IL-2Rβy-экспрессирующие NK клетки вносят основной вклад в токсичность. Показано, что Bay 50-4798 избирательно стимулирует пролиферацию активированных T-клеток относительно NK клеток, и его оценивали в фазе I/II клинических исследований у пациентов со злокачественными опухолями (Margolin, K. et al., 2007, Clin. Cancer. Res., 13:3312-9) и пациентов с HIV (Davey, R.T. et al., 2008, J. Interferon Cytokine Res., 28:89-100). Некоторые исследования показывают, что Bay 50-4798 значительно безопаснее и более переносим, чем пролейкин, а также показывают, что он увеличивал уровни CD4+ T-клеток и CD4+CD25+ T-клеток у пациентов. Однако увеличение CD4+ Т-клеток и CD4+CD25+ Т-клеток не свидетельствовало об увеличении клеток Treg, поскольку идентификация Treg требует дополнительных маркеров в дополнение к CD4 и CD25 и поскольку клетки Treg являются минорной фракцией CD4+CD25+ клеток. После этих исследований в полевых испытаниях более полно устанавливали характеристики клеток Treg и демонстрировали, что клетки Treg избирательно экспрессируют IL-2Raey (рассмотрено в Malek, T.R. et al., 2010, Immunity, 33:153-65). На основании этого нового исследования теперь можно понять, что избирательные агонисты IL-2Raey избирательны к клеткам Treg.

Второй подход к усовершенствованию терапевтического индекса терапии на основе IL-2 состоит в том, чтобы оптимизировать фармакокинетику молекулы, чтобы максимально стимулировать клетки Treg. Первые исследования действия IL-2 показали, что IL-2 стимуляция пролиферации T-клеток человека in vitro требовала минимум 5-6 ч экспозиции для эффективных концентраций IL-2 (Cantrell, D.A. et al., 1984, Science, 224:1312-1316). При введении пациентам-людям IL-2 имеет очень короткое время полужизни в плазме: 85 мин при внутривенном введении и 3,3 ч при подкожном введении (Kirchner, G. I., et al., 1998, Br. J. Clin. Pharmacol., 46:5-10). В силу его короткого времени полужизни поддержание в циркуляции IL-2 на уровне, равном или превышающем необходимый для стимуляции T клеточной пролиферации в течение необходимого времени делает необходимыми высокие дозы, которые ведут к пиковым уровнями IL-2, значительно превышающим EC50 для клеток Treg, или требуют частого введения (фиг. 1). Эти высокие пиковые уровни IL-2 могут активировать рецепторы IL-2Rey и имеют другие непредусмотренные или нежелательные эффекты. Аналог IL-2 с более длительным временем полужизни в циркуляции, чем IL-2, может достигать целевой концентрации лекарственного средства в течение точно определенного периода времени при более низкой дозе, чем IL-2, и более низких пиковых уровнях. Следовательно, такой аналог IL-2 требует или более низких доз или менее частого введения, чем IL-2, чтобы эффективно стимулировать клетки Treg. В действительности у яванских макаков, которым дозировали слитый белок IgG-IL-2 с временем полужизни в циркуляции 14 ч, стимулировали значительно более устойчивое увеличение Treg по сравнению с эквимолярной дозой IL-2 (Bell et al., 2015, J. Autoimmun., 56:66-80). Менее частое подкожное введение лекарственного средства IL-2 также более переносимо для пациентов. Терапевтическое средство с этими характеристиками в клинике даст усовершенствованный фармакологический эффект, сниженную токсичность и усовершенствованную приверженность пациента терапии.

Один подход к увеличению времени полужизни терапевтических белков состоит в слиянии терапевтически активной части молекулы с другим белком, таким как Fc-область IgG, чтобы увеличивать время полужизни в циркуляции. Слияние терапевтических белков с Fc IgG позволяет достигать этого за счет увеличения гидродинамического радиуса белка, таким образом снижая почечный клиренс, и через опосредованных неонатальным Fc-рецептором (FcRn) рециклинг слитого белка, таким образом продлевая время полужизни в циркуляции. Слияние терапевтических белков с альбумином (Sleep, D. et al., 2013, Biochem. Biophys. Acta., 1830:5526-34) и неиммуногенными аминокислотными полимерными белками (Schlapschy, M. et al., 2007, Protein Eng. Des. Sel., 20:273-84; Schellenberger, V. et al., 2009, Nat. Biotechnol., 27:1186-90) также использовали для увеличения времени полужизни в циркуляции. Однако конструирование таких слитых белков таким образом, который обеспечивает устойчивую биологическую активность партнера слияния избирательного агониста IL-2, может быть непредсказуемым, в частности, в случае избирательного агониста IL-2, который представляет собой небольшой белок, который обладает дефектом связывания с одной из субъединиц рецептора и который должен собирать комплекс из трех рецепторных субъединиц, для того чтобы активировать рецептор (Wang, X. et al., 2005, Science, 310:1159-63).

Другие исследователи создавали различные IL-2 слитые белки, используя IL-2 дикого типа или IL-2 с заменой C125S, чтобы содействовать стабильности. Morrison и коллеги (Penichet, M.L. et al., 1997, Hum.

- 2 041387

Antibodies., 8:106-18) создавали слитый белок с IgG, слитым с IL-2 дикого типа, чтобы увеличивать время полужизни IL-2 в циркуляции и направлять IL-2 на конкретные антигены с целью потенциирования иммунного ответа на антиген. Этот слитый белок стоял из интактной молекулы антитела, состоящей из тяжелой (H) и легкой (L) цепей, где N-концевой фрагмент Н-цепи сливали с C-концевым фрагментом белка IL-2. Этот IgG-IL-2 слитый белок обладал Fc-эффекторными функциями. Ключевые эффекторные функции IgG-Fc белков представляют собой комплементзависимую цитотоксичность (CDC) и антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). Показано, что слитый IgG-IL-2 белок высоко активен в IL-2 биологическом анализе и обладал CDC активностью. Таким образом, Penichet et al. говорили об использовании слитых белков антитело-IL-2 для направления активности IL-2 на антигены, распознаваемые антителом, с целью потенциирования гуморального и клеточно-опосредованного иммунного ответа на антиген. Схожим образом Gillies и коллеги конструировали множество слитых IgG-IL-2 белков для иммунотерапии злокачественных опухолей, используя антительную часть слитого белка для направленного воздействия на опухолевые антигены, и IL-2-часть, для того чтобы стимулировать иммунный ответ на опухолевые клетки (рассмотрено в Sondel, P.M. et al., 2012, Antibodies, 1:149-71). Эти положения вполне отличны от данной патентоспособной технологии, в которой избирательный агонист IL-2, который способствует росту и активности иммуносупрессорных клеток Treg, сливают с белковым фрагментом Fc с недостаточностью эффекторной функции с целью увеличения системной экспозиции.

Strom и его коллеги конструировали слитые белки с IL-2, слитым с N-концом Fc-белка с целью устранения активации T-клеток, экспрессирующих высокоаффинный рецептор IL-2 (Zheng, X.X. et al., 1999, J. Immunol., 1999, 163:4041-8). Показано, что этот слитый белок ингибирует развитие аутоиммунного диабета в модели T1D с переносом T-клеток на мышах. Показано, что IL-2-Fc слитый белок ингибирует функцию способствующих заболеванию T-клеток от подверженных T1D самок мышей NOD при трансплантации менее подверженным заболеванию самцам мышей NOD. Они также демонстрировали, что IL2-Fc слитый белок может убивать клетки, экспрессирующие высокоаффинный рецептор IL-2, in vitro. Эти исследовали дополнительно сравнивали IL-2-Fc слитые белки, сконструированные из Fc, полученного из Fc IgG2b с компетентной эффекторной функцией и мутантного Fc IgG2b с недостаточной эффекторной функцией. Только IL-2-Fc слитый белок, содержащий Fc с компетентной эффекторной функцией, эффективен для предотвращения начала заболевания. Таким образом, эти исследователи утверждают, что IL-2-Fc слитый белок с эффекторными функциями может элиминировать активированные Т-клетки, вызывающие заболевание, и что эффекторные функции Fc необходимы для его терапевтической активности. Эти положения вполне отличны от данной патентоспособной технологии, в которой избирательный агонист IL-2, который содействует росту и активности иммуносупрессорных клеток Treg, сливают с белковым фрагментом Fc с недостаточной эффекторной функцией для цели увеличения системной экспозиции и оптимизации размножения Treg. В другой работе Strom и коллеги говорят об использовании IL-2-Fc слитого белка для содействия толерантности к трансплантату (Zheng, X.X. et al., 2003, Immunity, 19:503-14). В этой работе IL-2-Fc слитый белок используют в тройной терапии, в которой его объединяют с антагонистом рецептора Fc-IL15 и рапамицином. Снова эти исследовали говорят, что IL-2-Fc слитый белок должен иметь эффекторные функции Fc, чтобы быть эффективным, и, кроме того, говорят, что этот IL-2-Fc слитый белок следует комбинировать с двумя другими молекулами, для того чтобы он был эффективен.

Данное изобретение предусматривает новое терапевтическое средство - слитый белок избирательного агониста IL-2-Fc с пептидным линкером из 6-30 аминокислот. Эта конфигурация объединяет высокую клеточную избирательность избирательного агониста IL-2 к клеткам Treg с длительным временем полужизни в циркуляции. В ходе разработки этой молекулы имели место удивительные и неожиданные находки, которые обнаруживали структурные элементы и конструктивные признаки белка, которые важны для биологической активности и которые ведут к обнаружению нескольких новых белков, которые отвечают желаемым терапевтическим характеристикам.

Краткое изложение сущности изобретения

Данное изобретение предусматривает слитый белок между белком избирательного агониста IL2αβγ (избирательным агонистом IL-2) и белком Fc IgG, где агонист IL-2 и Fc белок разделяет линкер от 17 А до 105 А, которые выполнены так, что агонист IL-2 находится на N-конце молекулы и белок Fc находится на C-конце. Фрагмент избирательного агониста IL-2 обеспечивает терапевтическую активность посредством избирательной активации формы ΓΕ-2αβγ рецептора, таким образом избирательно стимулируя Treg. Фрагмент Fc обеспечивает пролонгированное время полужизни в циркуляции по сравнению со временем полужизни в циркуляции для IL-2 или белка избирательного агониста IL-2. Фрагмент Fc увеличивает время полужизни в циркуляции за счет увеличения молекулярного размера слитого белка до больше чем 60000 Да, что составляет приблизительный порог для клубочковой фильтрации макромолекул в почке, и за счет рециклинга слитого белка через белок неонатального Fc-рецептора (FcRn), рецептора, который связывает и возвращает IgG, таким образом пролонгируя его время полужизни в циркуляции. Фрагмент Fc также должен иметь дефицит эффекторных функций Fc, таких как комплементзависимая цитотоксичность (CDC) и антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC), что позволяет

- 3 041387 слитому белку избирательно активировать Treg, чтобы потенцировать функцию Treg и увеличивать число Treg. Два белковых фрагмента сливают таким образом, который поддерживает устойчивую биологическую активность фрагмента избирательного агониста IL-2 и позволяет фрагменту Fc содействовать пролонгированному времени полужизни в циркуляции и, таким образом, эффективно увеличивать функцию и число Treg. Это потенциирование Treg должно супрессировать чрезмерные аутоиммунные или воспалительные реакции и приносить пользу при лечении аутоиммунных и воспалительных заболеваний. Белки по данному изобретению могут быть мономерными или димерными, образуя димеры через остатки цистеина в Fc фрагментах или доменах.

Более конкретно данное изобретение предусматривает слитый белок, который содержит N-концевой фрагмент белка варианта IL-2 человека и C-концевой фрагмент белка Fc IgG, где указанный IL-2 слитый белок обладает способностью избирательно активировать высокоаффинный рецептор IL-2 и, таким образом, избирательно активировать регуляторные T-клетки человека. Варианты IL-2 включают те, которые содержат замены, выбранные из группы, состоящей из N88R, N88G, D20H, Q126L и Q126F относительно белка IL-2 человека. SEQ ID NO: 1 представляет собой вариант IL-2/N88R, где нумерация соответствует wt IL-2. Кроме того, белок варианта IL-2 необязательно содержит IL-2 человека с заменой C125S. Предпочтительно белки по данному изобретению являются слитыми, где белок варианта IL-2 и белок Fc IgG имеют N-конец и C-конец и указанный белок варианта IL-2 человека сливают на его C-конце с N-концом белка Fc IgG. Кроме того, раскрыто, что активность домена варианта IL-2 значительно усиливают, когда линкерный пептид расположен между фрагментами белка варианта IL-2 и белка Fc IgG. Фрагмент или домен белка Fc IgG необязательно должен иметь недостаточность эффекторных функций Fc или содержать одну или несколько замен аминокислот, которые снижают эффекторные функции Fc части слитого белка.

Примером по данному изобретению является белок, который содержит белок варианта IL-2, имеющий замены аминокислот N88R и C125S относительно IL-2 человека (SEQ ID NO: 1 - N88R), линкерный пептид, как приведено в SEQ ID NO: 15, и белок Fc IgG1 человека, имеющий замену N297A, как приведено в SEQ ID NO: 2, где указанный слитый белок обладает способностью избирательно активировать высокоаффинный рецептор IL-2 и, таким образом, избирательно активировать регуляторные T-клетки человека. Альтернативные белки по данному изобретению включают белок варианта IL-2, имеющий замены аминокислот N88R и C125S относительно IL-2 человека (SEQ ID NO: 1 - N88R), линкерный пептид, как приведено в SEQ ID NO: 15, и белок Fc IgG2 человека, как приведено в SEQ ID NO: 3.

Более конкретным вариантом осуществления данного изобретения является димерный белок, который содержит две идентичные цепи, где каждая цепь содержит N-концевой фрагмент белка варианта IL-2 человека и C-концевой фрагмент белка Fc IgG, где N-концевой фрагмент белка варианта IL-2 человека имеет N-конец и C-конец отличается от IL-2 человека дикого типа, как в SEQ ID NO: 1, по меньшей мере одной из замен, выбранных из группы, состоящей из N88R, N88G, D20H, Q126L и Q126F, обладает по меньшей мере 90, или 95, или 97%-ной идентичностью последовательностей с SEQ ID NO: 1; и обладает способностью активировать клетки Treg посредством связывания с IL-2Raey на этих клетках; N-концевой белок варианта IL-2 человека соединяют его C-концом с N-концом аминокислотного линкера между 6 и 20 или 6 и 30 аминокислотными остатками, где указанный линкер также имеет C-конец; и C-конец аминокислотного линкера соединяют с N-концом фрагмента белка Fc IgG, обладающего 90, или 95, или 97%-ной идентичностью последовательностей, например с SEQ ID NO: 3 (IgG2) или SEQ ID NO: 2 (IgG1N297A), и содержащего остатки цистеина; и где две цепи связывают друг с другом через остатки цистеина, которые образуют межцепные дисульфидные связи фрагмента белка Fc IgG. Димеры по данному изобретению дополнительно можно замещать по C125S во фрагменте IL-2. Белки по данному изобретению предпочтительно содержат аминокислотные линкеры, содержащие группу остатков глицина, остатков серина и смесь остатков глицина и серина. Линкеры могут содержать смесь из 12-17 остатков серина и глицина предпочтительно с соотношением остатков глицина и остатков серина в диапазоне 3:1-5:1, например с соотношением 4:1.

Это изобретение дополнительно предусматривает вышеуказанные композиции в фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель.

Это изобретение дополнительно предусматривает нуклеиновые кислоты, кодирующие белки, описанные в настоящем описании. Нуклеиновые кислоты предпочтительно функционально связывают с экспрессирующими кассетами, которые можно или разрабатывать для рекомбинации с геномом клеткихозяина или вводить в независимо реплицирующуюся плазмиду или внехромосомную нуклеиновую кислоту.

Это изобретение дополнительно предусматривает способы избирательной активации регуляторных T-клеток человека у пациента, нуждающегося в этом, способ включает введение фармацевтической композиции, содержащей описанные композиции, вводимые в терапевтически эффективных дозах до достижения желаемых уровней концентраций регуляторных T-клеток человека.

Способ измерения числа клеток Treg в образце крови человека посредством приведения в контакт клеток крови человека со слитым белком по п.1 в концентрации между 1 и 0,01 нМ и последующего обнаружения клеток, которые связываются с белком, посредством проточной цитометрии.

- 4 041387

Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлена диаграммная иллюстрация зависимости между временем полужизни в циркуляции, пиковым уровнем лекарственного средства, эффективной концентрацией биологического средства и временем, необходимым, для того чтобы стимулировать пролиферацию клеток Treg после однократной дозы IL-2 или IL-2-Fc слитого белка с увеличенным временем полужизни. Штриховая линия представляет уровень в крови с течением времени для IL-2 после подкожной инъекции, а сплошная линия представляет уровень в крови с течением времени для IL-2-Fc слитого белка. Горизонтальные пунктирные линии показывают концентрации (значения EC50), необходимые, для того чтобы активировать клетки, экспрессирующие IL-2Raey и IL-2Rey соответственно). Двунаправленная стрелка показывает время экспозиции (5-6 ч) для IL-2 при EC50, необходимой, для того чтобы стимулировать клеточную пролиферацию.

На фиг. 2 представлены разработанные конфигурации для Fc слитых белков. Партнер слияния (X) можно сливать с N-концом (X-Fc) или C-концом (Fc-X) белка Fc. Линкерные пептиды можно вставлять между X и Fc.

На фиг. 3A-3C представлен эффект дозы для IL-2 и N88RL9AG1 стимулированного фосфорилирования STAT5 в CD4+ T-клетках, как измеряют посредством проточной цитометрии. Клетки обрабатывали с использованием IL-2 или N88RIL-2-Fc в концентрациях, указанных наверху, в течение 10 мин при 37°С, фиксировали, пермеабилизировали, окрашивали антителами и затем подвергали анализу проточной цитометрии, как описано в примере 3. Показаны клетки, отсортированные как CD4+, и клетки, дополнительно отсортированные по CD25 и pSTAT5, как показано в каждом из 4 квадрантов. Число в каждом квадранте показывает процентную долю CD4+ клеток в каждой субпопуляции. Клетки в верхних квадрантах представляют самые верхние 1-2% CD25-эксnрессирующих клеток популяции, обогащенной по клеткам Treg, и клетки в правых квадрантах представляют собой pSTAT5+ (фиг. 3A). N88RL9AG1 стимулирует только СО25^высок. клетки с высокой избирательностью, тогда как IL-2 массово стимулирует как CD25^/нu3k, так и С025^выс^ок клетки вплоть до пикомолярных концентраций (фиг. 3B). D20HL0G2 не обладает pSTAT5-стимулирующей активностью. В двух независимых экспериментах не наблюдали активацию pSTAT5 (фиг. 3C). Контроль, показывающий, что D20H/IL-2 стимулирует pSTAT5 в СО25^высок' клетках, тогда как D20HL0G2 - нет. Графики отображены в псевдоцветном режиме. Оба белка тестировали в концентрации 10’⁸М.

На фиг. 4 показано, что CD4+ T-клетки, которые обрабатывали N88RL9AG1, демонстрировали стимуляцию уровней pSTAT5 в клетках, экспрессирующих высокие уровни FOXP3. Клетки обрабатывали с использованием 4x10’9 M IL-2 или N88RL9AG1 и затем анализировали, как описано в примере 3. Большинство pSTAT5+ клеток, которые обрабатывали с использованием N88RL9AG1, также являлись FOXP3+, тогда как pSTAT5+ клетки, которые обрабатывали с использованием IL-2, были как FOXP3-, так и FOXP3+, причем большинство было FOXP3-.

На фиг. 5A, 5B показан выход белка для различных Fc слитых конструкций, продуцируемых в клетках HEK293. Белки экспрессировали параллельно в оптимизированной временной экспрессирующей системе и очищали, как описано в примере 1. Результаты представлены в виде финального выхода очищенного белка из 30 мл культур (фиг. 5A). Выход белка для N88R/IL-2-Fc слитых белков возрастает с увеличением длины пептидного линкера (фиг. 5B). Выход wt IL-2-Fc слитых белков только слегка увеличен при использовании пептидного линкера из 15 остатков. Более высокий выход D20H/IL-2-Fc слитых белков получали в конфигурации X-Fc, а не Fc-X.

На фиг. 6A, 6B представлена зависимость биологической активности IL-2 от длины пептидного линкера в N88R/IL-2-Fc слитых белках (фиг. 6A). Сигналы pSTAT5 в С025^выс^ок CD4+ T-клетках (Treg) возрастают с увеличением длины пептидного линкера (фиг. 6B). Наблюдали значимый сигнал pSTAT5 с использованием любого из N88R/IL-2-Fc белков в CD25’^низк клетках. Сигнал pSTAT5 для внутреннего контроля 10’⁸ М IL-2 показан на обоих диаграммах черным треугольником.

На фиг. 7 представлена биологическая активность D20H/IL-2-Fc слитых белков в Treg человека. Активность D20HL15AG1 по существу меньше, чем у N88RL15AG1, и D20HL15AG1 (конфигурация XFc) и AG1L15D20H (конфигурация Fc-X) обладает схожими активностями. Все 3 белка имеют пептидный линкер из 15 остатков.

На фиг. 8A, 8B показана биологическая активность для pSTAT5 активности wt IL-2-Fc с использованием и без использования пептидного линкера из 15 остатков. Биологическую активность IL-2 только умеренно усиливали с помощью пептидного линкера из 15 остатков как в Treg (фиг. 8A), так и в Со25’^/низк. клетках (фиг. 8B).

На фиг. 9 показана избирательность IL-2 и белков избирательных агонистов IL-2 в отношении клеток иммунной системы 7 различных типов в PBMC человека. N88RL15AG1 обладает высокой избирательностью к Treg по сравнению с wt IL-2 и WTL15AG1 и демонстрирует более высокую избирательность в нескольких типах клеток, чем N88R/IL-2.

- 5 041387

Подробное описание изобретения

Введение.

Это изобретение представляет собой новый терапевтический слитый белок, который содержит три ключевых белковых элемента:

(1) сконструированный цитокин IL-2, который модифицировали, чтобы он обладал высокой избирательностью к клеткам Treg;

(2) белок Fc с недостаточной эффекторной функцией, который увеличивает время полужизни белка в циркуляции; и (3) пептидный линкер между двумя фрагментами, который необходим для высокой биологической активности слитого белка.

Слитые белки выполняют так, что домен IL-2 прикрепляют к N-концу линкерного пептида через Cконец домена IL-2. Домен Fc прикрепляют через его N-конец к C-концу линкера. В предшествующих исследованиях с использованием и без использования коротких пептидных линкеров сообщали, что слитые белки N-IL-2:c-Fc не обладают значимой биологической активностью. Это вело к сосредоточению на обратных конфигурациях n-Fc:c-IL-2, где Fc-области прикрепляли N-конец линкера и домены IL-2 формировали карбоксиконец слитого белка.

Fc слитый белок с доменом биологически активного партнера слияния на N-конце в Fc является предпочтительной конфигурацией, поскольку биологически активный домен заменяет Fab часть из IgG. Fc слитый белок с доменом биологически активного партнера слияния на C-конце в Fc является менее предпочтительной конфигурацией, поскольку потенциально снижают способность C-конца в Fc IgG связываться с другими молекулами, такими как Fc-рецептор FcRn, что необходимо для длительного времени полужизни Fc белков в циркуляции. Сообщалось, что IL-2 слитые белки, которые слиты с C-концом Fc, имеют значительно более короткое время полужизни в циркуляции, что можно ожидать для Fc слитого белка, что подсказывает, что функцию или стабильность Fc ослабляют. Соответственно это изобретение с его длинным пептидным линкером, который необходим для биологической активности IL-2, представляет значимое непредвиденное достижение, которое шло в разрез с положениями в известном уровне техники IL-2 слитых белков. Молекулы, определяемые этим изобретением, делают возможным безопасное и эффективное лечение аутоиммунных заболеваний с помощью нового механизма стимуляции образования небольшой субпопуляции Т-клеток, которая супрессирует аутоиммунную и воспалительную патологию. Ожидают, что это терапевтическое средство, разрушающее парадигму, лечит множество различных аутоиммунных заболеваний.

Определения.

По меньшей мере определенный процент (например, 90 или 95 или 97%) идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 1, как используют в настоящем описании, относится к степени, в которой последовательность из двух или больше нуклеиновых кислот или полипептидов является одинаковой. Процент идентичности между последовательностью, представляющей интерес, и второй последовательностью в окне оценки, например, на протяжении длины последовательности, представляющей интерес, можно вычислять посредством выравнивания последовательностей, определения числа остатков (нуклеотидов или аминокислот) в окне оценки, которые находятся напротив идентичного остатка с допущением введения пропусков для того, чтобы максимизировать идентичность, деления на общее число остатков последовательности, представляющей интерес, или второй последовательности (в зависимости от того, какая больше), которые попадают в окно, и умножения на 100. При вычислении числа идентичных остатков, необходимых для достижения конкретного процента идентичность дроби следует округлять до ближайшего целого числа. Процент идентичности можно вычислять с использованием различных компьютерных программ. Например, компьютерные программы, такие как BLAST2, BLASTN, BLASTP, Gapped BLAST и т.д., генерируют выравнивания и предоставляют процент идентичности между последовательностями, представляющими интерес. Алгоритм Karlin и Altschul (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. ScL, USA, 87:22264-2268, 1990), модифицированный как в Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. ScL, USA, 90:5873-5877, 1993, встроен в программы NBLAST и XBLAST из Altschul et al. (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990). Для получения выравниваний с пропусками для целей сравнения используют Gapped BLAST, как описано в Altschul et al. (Altschul et al., Nucleic. Acids. Res., 25:3389-3402, 1997). При использовании программ BLAST и Gapped BLAST, можно использовать параметры соответствующих программ по умолчанию. Можно использовать матрицу PAM250 или BLOSUM62. Программное обеспечение для осуществления анализа BLAST общедоступно в National Center for Biotechnology Information (NCBI). См. эти программы на веб-сайте с URL адресом во всемирной сети: ncbi.nlm.nih.gov. В конкретном варианте осуществления процент идентичности вычисляют с использованием BLAST2 с параметрами по умолчанию, как предоставлено в NCBI.

N-конец относится к концу пептида или полипептида, который несет аминогруппу, в отличие от карбоксильного конца, несущего карбоксильную кислотную группу.

С-конец относится к концу пептида или полипептида, который несет карбоксильную кислотную группу, в отличие от аминоконца, несущего аминогруппу.

С-концевой фрагмент белка Fc IgG относится к части слитого белка, которая происходит из двух

- 6 041387 идентичных белковых фрагментов, каждый имеет шарнирную область, второй константный домен и третьи константные домены двух тяжелых цепей молекулы IgG и содержит карбоксиконцевые тяжелые цепи, связанные дисульфидными связями друг с другом через шарнирную область. Это функционально определяют как ту часть молекулы IgG, которая взаимодействует с белком C1q комплемента и IgG-Fcрецепторами (FcyR), опосредуя эффекторные функции комплементзависимой цитотоксичности (CDC) и антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). Последовательность можно модифицировать для снижения эффекторных функций, для увеличения времени полужизни в циркуляции и для элиминации сайтов гликозилирования.

Варианты IL-2.

Белки вариантов IL-2 по данному изобретению представляют собой избирательные агонисты IL-2-Raey. Функционально они избирательно активируют комплекс рецептора IL-2Raey относительно комплекса рецептора IL-2Rey. Их получают из белка IL-2 дикого типа, структурно определяемого как имеющего по меньшей мере 95% идентичность последовательностей с IL-2 дикого типа из SEQ ID NO: 1 и функционально определяемого по способности предпочтительно активировать клетки Treg. Белок также можно функционально определять по его способности избирательно активировать передачу сигналов рецептора IL-2 в Treg, как измеряют по уровням фосфорилированного белка STAT5 в клетках Treg по сравнению с CD4+ CD25^/нu3k. T-клетками или NK клетками, или по избирательной активации стимулированных фитогемагглютинином T-клеток в сравнении с NK клетками.

N-концевой фрагмент белка варианта IL-2 человека относится к N-концевому домену слитого белка, который получают из белка IL-2 дикого типа, структурно и функционально определенного выше.

Treg.

Treg или клетки Treg относятся к регуляторным T-клеткам. Регуляторные T-клетки представляют собой класс T-клеток, которые супрессируют активность других клеток иммунной системы и которые определяют с использованием проточной цитометрии по фенотипу клеточных маркеров CD4+CD25+FOXP3+. Поскольку FOXP3 является внутриклеточным белком и требует фиксации и пермеабилизации клеток для окрашивания, фенотип клеточной поверхности CD4+CD25+CD127- можно использовать для определения живых Treg. Treg также включают различные подклассы Treg, такие как tTreg (тимусного происхождения) и pTreg (из периферии, дифференцированные из наивных T-клеток на периферии). Все Treg экспрессируют рецептор IL-2Raey, не продуцируют свой собственный IL-2 и зависят от IL-2 для роста, и специалист в данной области примет во внимание, что оба класса избирательно активирует избирательный агонист IL-2Raey.

Пептидные линкеры.

Пептидный линкер определяют как аминокислотную последовательность, расположенную между двумя белками, содержащими слитый белок, т.е. линкерную пептидную последовательность не получают из какого-либо белка-партнера. Пептидные линкеры встраивают в слитые белки в качестве разделителей для того, чтобы содействовать надлежащей укладке белка и стабильности составляющих белок фрагментов, чтобы усовершенствовать экспрессию белка или сделать возможной более хорошую биологическую активность двух партнеров слияния (Chen et al., 2013, Adv. Drug. Deliv. Rev., 65(10):1357-69). Пептидные линкеры можно делить на категории не структурированных гибких пептидов или жестких структурных пептидов.

Fc слитые белки.

Fc слитый белок представляет собой белок, полученный с помощью технологии рекомбинантных ДНК, где трансляционную рамку считывания домена Fc белка IgG млекопитающего сливают с таковым другого белка (Fc партнер слияния) для получения нового единого рекомбинантного полипептида. Fc слитые белки обычно получают в виде димеров с дисульфидными связями, которые соединены вместе посредством дисульфидными связями, расположенными в шарнирной области.

Функциональная активация.

Биологическая активность относится к измерению биологической активности в количественном анализе на основе клеток in vitro.

Функциональную активацию клеток Treg определяют как IL-2-опосредованный ответ в Treg. Считывание анализа для функциональной активации клеток Treg включает стимуляцию pSTAT5, пролиферации клеток Treg и стимуляцию уровней эффекторных белков Treg.

Разработка и конструирование.

Существует множество возможностей для разработки и конструирования Fc слитого белка, и выбор среди этих возможностей разработки приведен далее, чтобы сделать возможным создание молекулы с желаемой биологической активностью и фармацевтическими характеристиками. Ключевые возможности разработки включают (1) свойства избирательного агониста IL-2;

(2) выбор белка фрагмент Fc;

- 7 041387 (3) конфигурацию партнеров слияния в слитом белке; и (4) аминокислотную последовательность в сочленении между Fc и белком партнера слияния.

Основные способы.

В целом получение слитых белков по изобретению можно выполнять с помощью процедур, раскрытых в настоящем описании, и с помощью общепризнанных способов рекомбинантной ДНК, включая, например, амплификацию полимеразной цепной реакцией (ПЦР), получение плазмидной ДНК, расщепление ДНК рестрикционными ферментами, получение олигонуклеотидов, лигирование ДНК, выделение мРНК, введение ДНК в подходящую клетку, трансформацию или трансфекцию организма-хозяина, культивирование организма-хозяина. Дополнительно слитые молекулы можно выделять и очищать с использованием хаотропных средств и хорошо известных электрофоретических, хроматографических способов и центрифугирования. Раскрытие, относящееся к этим способам, см. в целом в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-е изд. (1989); и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989).

Гены, кодирующие слитые белки по данному изобретению, подразумевают расщепление рестрикционными ферментами и лигирование в качестве основных стадий, используемых для получения ДНК, кодирующей желаемые слитые конструкции. Концы фрагмента ДНК могут требовать модификации перед лигированием, и это можно выполнять посредством заполнения липких концов, удаления концевых частей фрагмента(ов) с использованием нуклеаз (например, ExoIII), сайт-специфического мутагенеза или посредством добавления новых пар оснований с помощью ПЦР. Полилинкеры и адаптеры можно использовать для того, чтобы содействовать соединению выбранных фрагментов.

Экспрессионную конструкцию обычно собирают поэтапно, используя раунды рестрикции, лигирования и трансформации E.coli. Многие клонирующие векторы, подходящие для конструирования экспрессионной конструкции, известны в данной области (lambda.ZAP и pBLUESCRIPT SK-1, Stratagene, LaJolla, Calif., pET, Novagen Inc., Madison, Wis. цитированы в Ausubel et al., 1999), и конкретный выбор не является критическим для изобретения. На выбор клонирующего вектора влияет посредством система переноса генов, выбранная для введения экспрессионной конструкции в клетку-хозяина. В конце каждого этап получаемую конструкцию можно анализировать с помощью анализа рестрикции, последовательности ДНК, гибридизации и ПЦР.

Сайт-специфический мутагенез обычно используют для введения конкретных мутаций в гены, кодирующие слитые белки по данному изобретению, известными в данной области способами. См., например, публикацию патентной заявки США 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnology, 19:773-776; Kren et al., 1998, Nat. Med., 4:285-290; и Calissano and Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett., 43:15-16. В настоящем изобретении можно использовать любую процедуру сайт-специфического мутагенеза. Доступны многие коммерческие наборы, которые можно использовать, для того чтобы получать варианты по данному изобретению.

Различные промоторы (регуляторная область инициации транскрипции) можно использовать в соответствии с изобретением. Выбор подходящего промотора зависит от предложенного экспрессирующего организма-хозяина. Промоторы из гетерологичных источников можно использовать до тех пор, пока они функциональны в выбранном организме-хозяине.

Различные сигнальные последовательности можно использовать, для того чтобы содействовать экспрессии белков, описанных в настоящем описании. Также можно использовать сигнальную последовательность, которую выбирают или разрабатывают для эффективной секреции и процессинга в экспрессирующем организме-хозяине. Сигнальную последовательность, которая гомологична кодирующей последовательности TCR или кодирующей последовательности IL-2 мыши, можно использовать для клеток млекопитающих. Другие подходящие пары сигнальной последовательности/клетки-хозяина включают сигнальную последовательность sacB из B. subtilis для секреции в B. subtilis, и сигнальные последовательности α-фактора спаривания Saccharomyces cerevisiae или кислой фосфатазы phoI из P. pastoris для секреции у P. pastoris. Сигнальную последовательность можно соединять напрямую через последовательность, кодирующую сайт расщепления сигнальной пептидазы, с кодирующей последовательностью белка или через короткий нуклеотидный мостик.

Идентифицированы элементы для усиления транскрипции и трансляции для эукариотических систем экспрессии белка. Например, расположение промотора 1000 п. о. вируса мозаики цветной капусты (CaMV) по любую сторону от гетерологичного промотора может повышать уровни транскрипции в 10-400 раз в клетках растения. Экспрессионная конструкция также должна содержать подходящие последовательности инициации трансляции. Модификация экспрессионной конструкции, чтобы включать консенсусную последовательность Козак для надлежащей инициации трансляции может повышать уровень трансляции в 10 раз.

Экспрессирующие кассеты соединяют с подходящими векторами, совместимыми с организмомхозяином, который подлежит использованию. Вектор должен быть способен вмещать ДНК последовательность, кодирующую слитые белки, подлежащие экспрессии. Подходящие клетки-хозяева включают эукариотические и прокариотические клетки, предпочтительно те клетки, которые можно легко трансформировать и которые демонстрируют быстрый рост в культуральной среде. В частности, предпочти- 8 041387 тельные клетки-хозяева включают прокариоты, такие как E.coli, Bacillus subtillus и т.д., и эукариоты, такие как клетки животного и штаммы дрожжей, например S. cerevisiae. Клетки млекопитающих в целом предпочтительны, в частности HEK, J558, NSO, SP2-0 или CHO. Другие подходящие хозяева включают, например, клетки насекомого, такие как Sf9. Используют стандартные условия культивирования. См. Sambrook, выше. Затем можно отбирать стабильные трансформированные или трансфицированные клеточные линии. В качестве экспрессирующей системы также можно использовать системы транскрипции-трансляции in vitro.

Нуклеиновую кислоту, кодирующую желаемый слитый белок, можно вводить в клетку-хозяина стандартными способами трансфекции клеток. Термин трансфицирование или трансфекция предназначен для того, чтобы охватывать все общепринятые способы введения нуклеиновой кислоты в клеткихозяева, в том числе копреципитацию с фосфатом кальция, опосредованную DEAE-декстраном трансфекцию, липофекцию, электропорацию, микроинъекцию, вирусную трансдукцию и/или встраивание. Подходящие способы трансфекции клеток-хозяев можно найти в Sambrook et al., выше, и других лабораторных руководствах.

Альтернативно можно использовать синтетическую генную конструкцию для всей конструкции белков, описанных в настоящем описании, или ее части. Это влечет за собой синтез разработанной полинуклеотидной молекулы in vitro, чтобы кодировать полипептидную молекулу, представляющую интерес. Можно осуществлять синтез генов с использованием многих способов, таких как мультиплексная технология на основе микрочипов, описанная в Tian et al. (Tian et al., Nature, 432:1050-1054), и схожие технологии, в которых олигонуклеотиды синтезируют и собирают на фотопрограммируемыми микрожидкостных чипах.

Слитые белки по данному изобретению выделяют из собранных клеток-хозяев или из среды для культивирования. Используют стандартные способы очистки белков для выделения белков, представляющих интерес, из среды или из собранных клеток. В частности, способы очистки можно использовать, для того чтобы экспрессировать и очищать желаемый слитый белок в крупном масштабе (т.е. по меньшей мере в миллиграммовых количествах) в различных подходах, включая вращающиеся флаконы, вращающиеся колбы, тканевые культуральные планшеты, биореактор или ферментатор.

Фрагмент избирательного агониста IL-2.

IL-2 с заменой N88R представляет собой образцовый случай избирательного агониста IL-2 для рецептора IL-2Raey (Shanafelt, A.B. et al., 2000, Nat. Biotechnol., 18:1197-202). IL-2/N88R имеет недостаточное связывание с субъединицей рецептора IL-2Re и комплексом рецептора IL-2Rey, но способен связываться с комплексом рецептора IL-2Raey и стимулировать пролиферацию IL-2Rαβy-экспрессирующих PHA-активированных T-клеток так же эффективно, как wt IL-2, при этом демонстрируя в 3000 раз сниженную способность стимулировать пролиферацию IL-2Rβy-экспрессирующих NK клеток. Другие избирательные агонисты IL-2Raey со схожими профилями активности включают IL-2 с заменами N88G и D20H, а также другие варианты IL-2 с заменами Q126L и Q126F (контактные остатки для субъединицы IL-2RG) обладают IL-2Rαβy-избирательной агонистической активностью (Cassell, D.J. et al., 2002, Curr. Pharm. Des., 8:2171-83). Квалифицированный практик в данной области примет во внимание, что любой из этих молекул избирательных агонистов IL-2 можно заменять фрагмент IL-2/N88R, ожидая, что Fc слитый белок будет обладать схожей активностью. Все указанные выше мутации можно выполнять на фоне wt IL-2 или wt IL-2 с заменой C125S, которая представляет собой замену, которая содействует стабильности IL-2 посредством элиминации не спаренного остатка цистеина. Это изобретение также можно использовать с другими мутациями или усечениями, которые усовершенствуют продуцирование или стабильность, не оказывая значительного влияния на активность, активирующую рецептор IL-2.

Варианты по данному изобретению необязательно включают варианты с консервативными заменами, что применимо к последовательностям как аминокислот, так и нуклеиновых кислот. В отношении конкретной последовательности нуклеиновой кислоты, консервативно модифицированные варианты относятся к тем нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или по существу идентичные аминокислотные последовательности, или где нуклеиновая кислота не кодирует аминокислотную последовательность к по существу идентичным последовательностям. В частности, вырожденные замены кодонов можно получать посредством создания последовательностей, в которых третье положение в одном или нескольких выбранных (или всех) кодонах заменяют на перемешанное основание и/или остатки дезоксиинозина (Batzer et al., Nucleic. Acid. Res., 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes., 8:91-98 (1994)). По причине вырожденности генетического кода большое число функционально идентичных нуклеиновых кислот кодируют любой заданный белок. Например, все кодоны GCA, GCC, GCG и GCU кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждом положении, где аланин определен с помощью кодона, кодон можно изменять на любой из описанных соответствующих кодонов, не изменяя кодируемый полипептид. Такие вариации нуклеиновых кислот представляют собой молчащие вариации, которые представляют собой один вид консервативно модифицированных вариаций. Каждая последовательность нуклеиновой кислоты в настоящем описании, которая кодирует полипептид, также описывает каждую возможную молчащую вариацию нуклеиновой ки- 9 041387 слоты. Специалист примет во внимание, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением

AUG, который как правило является единственным кодоном для метионина, и TGG, который как правило является единственным кодоном для триптофана) можно модифицировать для получения функционально идентичной молекулы. Соответственно в каждой описанной последовательности подразумевают каждую молчащую вариацию нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид.

В отношении консервативной замены в аминокислотных последовательностях специалист примет во внимание, что индивидуальные замены, делеции или добавления в последовательность нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида или белка, которые изменяют, добавляют или удаляют одну аминокислоту или небольшую процентную долю аминокислот в кодируемой последовательности, представляет собой консервативно модифицированный вариант, где изменение ведет к замене аминокислоты с использованием химически схожей аминокислоты. Таблицы консервативных замен, в которых приведены функционально схожие аминокислоты, хорошо известны в данной области. Такие консервативно модифицированные варианты дополняют и не исключают полиморфные варианты, межвидовые гомологи и аллели по изобретению.

Каждая из следующих групп содержит аминокислоты, которые представляют собой консервативные замены друг для друга:

1) аланин (A), глицин (G);

2) серин (S), треонин (T);

3) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (E);

4) аспарагин (N), глутамин (Q);

5) цистеин (C), метионин (M);

6) аргинин (R), лизин (K), гистидин (H);

7) изолейцин (I), лейцин (L), валин (V); и

8) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W).

Фрагмент белка Fc.

Ключевой выбор при разработке относится к свойствам фрагмента белка Fc. Основные терапевтические применения Fc слитых белков представляют собой (1) наделение белка партнера слияния эффекторными функциями Fc иммуноглобулина; или (2) увеличение времени полужизни белка партнера слияния в циркуляции (Czajkowsky et al., 2012, EMBO Mol. Med., 4:1015-28).

Основные эффекторные функции белков IgG представляют собой комплементзависимую цитотоксичность (CDC) и антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), функции, опосредованные связыванием Fc с белком C1q комплемента и с IgG-Fc-рецепторами (FcyR) соответственно. Эти эффекторные функции важны, когда терапевтический белок используют, для того чтобы направлять или усиливать иммунный ответ на конкретную антигенную мишень или клетку. Слитый белок по данному изобретению разрабатывают только для того, чтобы увеличивать время полужизни фрагмента избирательного агониста IL-2 в циркуляции, а эффекторные функции не нужны и даже могут быть токсичными и, таким образом, в явной форме не желательны. Например, слитый белок избирательного агониста IL-2-Fc с Fc с компетентной эффекторной функцией потенциально может убивать клетки Treg, которые слитый белок по данному изобретению стремится активировать и размножать, что точно противоположно терапевтической цели при аутоиммунных заболеваниях. Существует четыре подкласса IgG человека, которые различаются эффекторными функциями (CDC, ADCC), временем полужизни в циркуляции и стабильностью (Salfeld, J.G., 2007, Nature Biotechnology, 25:1369-72). IgG1 обладает эффекторными функциями Fc, является наиболее обильным подклассом IgG и является наиболее широко используемым подклассом в терапевтических белках, одобренных US FDA. IgG2 имеет недостаточность эффекторных функций Fc, но подвержен димеризации с другими молекулами IgG2 и также подвержен нестабильности из-за запутанности дисульфидных связей в шарнирной области. IgG3 обладает эффекторными функциями Fc и имеет чрезвычайно длинную жесткую шарнирную область. IgG4 имеет недостаточность эффекторных функций Fc, более короткое время полужизни в циркуляции, чем другие подклассы, а димер IgG4 биохимически нестабилен по причине только одной дисульфидной связи в шарнирной области, что ведет к обмену Н-цепями между различными молекулами IgG4. Специалист в данной области примет во внимание, что фрагменты белка Fc из IgG2 и IgG4 не обладают эффекторными функциями и их можно использовать в этом изобретении. Специалист в данной области также примет во внимание, что модификации последовательностей Fc описаны в данной области так, что эту шарнирную область в IgG2 Fc можно модифицировать, для того чтобы предотвращать агрегирование, или эту шарнирную область в Fc IgG4 можно модифицировать, для того чтобы стабилизировать димеры. Альтернативно созданы варианты IgG1 с недостаточностью эффекторной функции. Один такой вариант имеет замену аминокислоты в положении N297, местоположении участка N-связанного гликозилирования. Замена этого остатка аспарагина устраняет участок гликозилирования и значительно снижает ADCC и CDC активность (Tao, M.H. et al., 1989, J. Immunol., 143:2595-2601). В настоящем описании этот вариант используют в качестве образцового случая в изобретении. Другой вариант IgG1 с недостаточностью эффекторной функции представляет собой IgG1 (L234f/L235E/P331S/) (Oganesyan et al., 2008, Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr., 64:700-4),

- 10 041387 в котором мутированы аминокислоты в сайтах связывания C1q и FcyR, и специалист в данной области должен рассматривать использование этих или схожих вариантов Fc, для того чтобы создавать стабильные IL-2SA-Fc слитые белки с недостаточностью эффекторных функций. Специалист в данной области также примет во внимание, что формы фрагментов белка Fc, сконструированные для того, чтобы представлять собой стабильные мономеры вместо димеров (Dumont, J.A. et al., 2006, BioDrugs, 20:151-60; Liu Z. et al., J. Biol. Chem., 2015, 20, 290:7535-62), также можно комбинировать с избирательным агонистом IL-2 по данному изобретению. Кроме того, специалист в данной области примет во внимание, что функционально мономерный гетеродимер, состоящий из IL-2-полипептида H-цепи Fc в комбинации с полипептидом H-цепи Fc и собранный с использованием технологии биспецифических антител (Zhu Z. et al., 1997, Protein Sci., 6:781-8), также можно комбинировать с избирательным агонистом IL-2 по данному изобретению. Некоторые IL-2 Fc слитые белки выполнены с использованием интактных молекул антител IgG, или с использованием (Penichet, M.L. et al., 1997, Hum. Antibodies., 8:106-18), или без использования (Bell et al., 2015, J. Autoimmun., 56:66-80) антигенной специфичности во фрагменте IgG. Кроме того, специалист в данной области примет во внимание, что варианты Fc, у которых частично или полностью отсутствует шарнирная область, можно использовать в этом изобретении.

Fc слитые белки можно выполнять в двух конфигурациях, обозначаемых здесь как X-Fc и Fc-X, где X, белок партнера слияния, находится на N-конце и Fc находится на C-конце, и Fc-X, где Fc находится на N-конце и белок партнера слияния находится на C-конце (фиг. 2). В литературе представлены примеры, которые показывают, что различные партнеры слияния могут иметь различные предпочтения к N- или C-концевым Fc слитым конструкциям. Например, показано, что FGF21 имеет сильное предпочтение к конфигурации Fc-X. Fc-FGF21 обладает по существу той же активирующей рецептор биологической активностью, что и сам FGF21, при этом FGF21-Fc обладает 1000-кратно сниженной биологической активностью (Hecht et al., 2012, PLoS One., 7(11):e49345). Создано множество IL-2 Fc слитых белков для различных применений и сообщалось, что они обладают хорошей биологической активностью IL-2, когда слиты непосредственно с Fc как в Fc-X (Gillies et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., 89:1428-32; Bell et al., 2015, J. Autoimmun., 56:66-80), так и в X-Fc (Zheng, X.X. et al., 1999, J. Immunol., 163:4041-8) конфигурациях. Gavin et al. (US 20140286898 Al) описывают Fc слитые белки, содержащие IL-2 и определенные варианты IL-2 в конфигурации Fc-X, которые обладают биологической активностью, схожей с таковой у свободного цитокина IL-2, но в отличие от результатов Zheng et al. (Zheng, X.X. et al., 1999, J. Immunol., 1999, 163:4041-8), обнаружили, что слитые белки вариантов IL-2 в конфигурации X-Fc имеют сниженную или нулевую биологическую активность. Таким образом, Gavin, et al. в целом отталкиваются от N-концевых IL-2 Fc слитых белков. Другой фактор, который влияет на выбор конфигурации слитого белка заключается во влиянии на время полужизни в циркуляции. В литературе снова обнаружено, что IL-2 слитые белки в конфигурации Fc-X имеют относительно низкое время полужизни в циркуляции, много меньше чем время полужизни IgG1 человек 21 сутки у человека или время полужизни у существующих одобренных FDA Fc слитых белков (табл. I). Сообщалось, что IgG-IL-2 слитые белки в конфигурации Fc-X имеют относительно короткое время полужизни в циркуляции порядка 1 ч у мышей (Gillies S.D., 2002, Clin. Cancer. Res., 8:210-6; Gillies, S.D., US 2007/0036752 A2; Bell, C.J., 2015, J. Autoimmun., 56:66-80) и порядка 3,3 ч (Ribas A.J., 2009, Transl. Med., 7:68) и 3,7 ч (King D.M., 2004, J. Clin. Oncol., 22:4463-73) у человека, а также сообщалось, что Fc-IL-2 слитые белки обладают временем полужизни в циркуляции 12,5 ч у мышей (Zhu E.F., Cancer Cell., 2015, 13;27(4):489-501). Протеолиз между C-концом фрагмента Fc и фрагментом IL-2 способствует короткому времени полужизни в циркуляции (Gillies S.D., 2002, Clin. Cancer. Res., 8:210-6; Zhu E.F., 2015, Cancer Cell., 27:489-501). По причине этих относительно коротких времен полужизни авторы изобретения сосредоточились на слитых белках избирательного агониста IL-2 Fc в конфигурации X-Fc. Находки в этой работе показывают, что IL-2-Fc слитый белок, содержащий замену IgG1 (N297A), имеет высокую биологическую активность и является особенно предпочтительной частицей по данному изобретению. Вариант IgG1 Fc слитого белка, который устраняет O-связанный углевод, также является особенно предпочтительной частицей, поскольку он обладает высокой биологической активностью и обеспечивает преимущества для изготовления чистого и гомогенного лекарственного продукта. Находки в этом патенте дополнительно указывают, что IL-2-Fc слитые белки варианта IgG1 с недостаточностью эффекторной функции и Fc IgG4, хотя и слегка менее активны, также являются предпочтительными частицами. Слитые конструкции с IgG2 и сывороточным альбумином (HSA) имеют более низкую биологическую активность и являются менее предпочтительными частицами, несмотря на то что они могут подходить для терапевтического использования, если они обладают другими положительными свойствами.

Линкер.

Аминокислотная последовательность в сочленении между Fc и белком партнера слияния может представлять собой или (1) непосредственное слияние двух белковых последовательностей; или (2) слияние с промежуточным линкерным пептидом.

Из 10 Fc слитых белков, которые в настоящее время одобрены US FDA для клинического использования (табл. I), 8 представляют собой непосредственные слияния белка партнера слияния и Fc, тогда как

- 11 041387 содержат линкерные пептиды, так что многие Fc слитые белки могут быть функциональны без линкерных пептидов. Линкерные пептиды включают в виде разделителей между двумя белковыми фрагментами. Линкерные пептиды могут содействовать надлежащей укладке белка и стабильности составляющих белковых фрагментов, усовершенствовать экспрессию белка и делать возможной более хорошую биологическую активность составляющих белковых фрагментов (Chen et al., 2013, Adv. Drug. Deliv. Rev., 65:1357-69). Пептидные линкеры, используемые во многих слитых белках, разрабатывают в виде бесструктурных гибких пептидов. Исследование длины, последовательности и конформации линкерных пептидов между независимыми структурными доменами в природных белках дало теоретическую основу для разработки гибких пептидных линкеров (Argos, 1990, J. Mol. Biol., 211:943-58). У Argos предоставлено руководство о том, что длинные гибкие линкерные пептиды должны состоять из небольших неполярных остатков, таких как глицин, и небольших полярных остатков, таких как серин и треонин, причем множество остатков глицина обеспечивает очень гибкую конформацию, а серин или треонин обеспечивают полярную площадь поверхности, чтобы ограничивать гидрофобное взаимодействие в пептиде или с составляющими фрагментами слитого белка. Многие пептидные линкеры, описанные в литературе, богаты глицином и серином, например повторами последовательности GGGGS, хотя специалист в данной области примет во внимание, что также можно использовать другие последовательности, придерживаясь общих рекомендаций Argos (Argos, 1990, J. Mol. Biol., 20, 211(4):943-58). Например, один из белков, описанных в настоящем описании содержит линкерный пептид, состоящий из глицина и аланина (SEQ ID NO: 15). Гибкий линкерный пептид с полностью растянутой конформацией β-тяжа будет иметь от длину конца до конца приблизительно 3,5 А на остаток. Таким образом, линкерный пептид из 5, 10, 15, 20, 25 или 30 остатков будет иметь максимальную полностью растянутую длину 17,5 А, 35 А, 52,5 А, 70 А, 87,5 А или 105 А соответственно. Максимальная длина от конца до конца для пептидного линкера также может быть ориентиром для определения характеристик пептидного линкера в этом изобретении.

Специалисты в данной области также примут во внимание, что непептидные гибкие химические линкеры также могут заменять полипептидный линкер указанной выше длины, например 17,5 А, 35 А, 52,5 А, 70 А, 87,5 А или 105 А. Цель линкерного пептида в данном изобретении состоит в том, чтобы сделать возможным приобретение подходящей конформации и ориентации индивидуальных фрагментов слитого белка для того, чтобы сделать возможным контакт фрагмента избирательного агониста IL-2 с его когнатным рецептором и сделать возможным связывание фрагмента Fc с FcRn, чтобы сделать возможным рециклинг слитого белка и пролонгированное время полужизни в циркуляции. Многим Fc слитым белкам не требуются линкерные пептиды, о чем свидетельствуют 8 из 10 одобренных US FDA Fc слитых белков, не содержащих такие пептиды, как перечислено в табл. I. В отличие от этого дулаглутид, слияние GLP-1 и Fc, содержит пептидный линкер из 15 остатков, который оказывает сильное влияние на биологическую активность (Glaesner, патент США 7452966 B2). Предшествующая в данной области работа на IL-2-Fc слитых белках указывает на то, что линкерные пептиды не необходимы для биологической активности. Сообщалось, что IL-2 слитые белки, содержащие wt IL-2 или IL-2 с заменой C125S в ориентации Fc-X, обладают биологической активностью IL-2, схожей с таковой у свободного цитокина IL-2 без пептидных линкеров (Gillies et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., 89:1428-32; Gavin et al., патентная заявка США 20140286898 Al) или с ними (Bell et al., 2015, J. Autoimmun., 56:66-80). В ориентации X-Fc, Zheng et al. сообщали о биологической активности IL-2 у IL-2 слитого белка в конфигурации X-Fc, которая по существу неотличима от таковой у самого IL-2 (Zheng, X.X. et al., 1999, J. Immunol., 1999, 163:4041-8). Такой всесторонний известный уровень техники говорит о том, что слияние белка IL-2 с Fc не требует линкерного пептида, для того чтобы иметь высокую биологическую активность IL-2. Однако Gavin et al. сообщали о том, что Fc слитые белки в конфигурации X-Fc, содержащие определенные варианты IL-2 с измененной рецепторной избирательностью, имели сниженную или нулевую биологическую активность или без пептидного линкера или с пептидным линкером из 5 остатков (Gavin et al., патентная заявка США 20140286898 A1). Работа, приведенная в этом патенте, демонстрирует, что пептидный линкер из по меньшей мере 6 и предпочтительно по меньшей мере 9 аминокислот необходим для устойчивой биологической активности IL-2 на Treg и, кроме того, показывает, что усовершенствование биологической активности достигает плато при 15 аминокислотах и сохраняется при линкерах вплоть до 30 аминокислот в длину.

Биологические анализы.

Надежные и количественные биологические анализы необходимы для определения характеристик биологической активности белков-кандидатов. Эти анализы должны измерять активацию рецептора IL-2, измерять нисходящие функциональные последствия активации в Treg и измерять терапевтическирелевантные исходы и функции активированных Treg. Эти анализы можно использовать для измерения терапевтической активности и силы молекул избирательного агониста IL-2, а также можно использовать для измерения фармакодинамики избирательного агониста IL-2 у животных или человека. В одном анализе измеряют фосфорилирование белка сигнальной трансдукции STAT5, которое измеряют проточной цитометрией с использованием антитела со специфичностью к фосфорилированному белку (pSTAT5). Фосфорилирование STAT5 представляет собой обязательную стадию в пути сигнальной трансдукции IL-2. STAT5 важен для развития Treg и конститутивно активированной формы STAT5, экспрессируемой

- 12 041387 в CD4+CD25+ клетках, достаточно для получения клеток Treg в отсутствие IL-2 (Mahmud, S.A. et al., 2013, JAKSTAT, 2:e23154). Следовательно, измерение фосфорилированного STAT5 (pSTAT5) в клетках Treg будет признано специалистом в данной области в качестве признака IL-2 активации в этих клетках и будет предсказывать другие биологические исходы лечения IL-2, принимая во внимание подходящие время экспозиции и условия. В другом анализе функциональной активации измеряют IL-2-стимулированную пролиферацию клеток Treg. Специалист в данной области примет во внимание, что пролиферацию Treg можно измерять по встраиванию тритированного тимидина в очищенные клетки Treg, по увеличению числа клеток Treg в смешанной популяции клеток, измеряемого посредством проточной цитометрии, и частотам фенотипов маркеров CD4+CD25+FOXP3+ или CD4+CD25+CD127-, по увеличенной экспрессии белков клеточного цикла, ассоциированных с пролиферацией, в клетках Treg, таких как Ki-67, или по измерению разведения витального флуоресцентного красителя, ассоциированного с клеточным делением, такого как карбоксифлуоресцеинсукцинимидиловый эфир (CFSE), с помощью проточной цитометрии в клетках Treg. Другой анализ функциональной активации Treg с использованием IL-2 заключается в увеличенной стабильности Treg. Некоторые считают клетки pTreg нестабильными и обладающими потенциалом к дифференциации в Th1 и Th17 эффекторные T-клетки. IL-2 активация Treg может стабилизировать Treg и предотвращать эту дифференцировку (Chen, Q. et al., 2011, J. Immunol., 186:6329-37). Другой исход IL-2 стимуляции Treg представляет собой стимуляцию уровня функциональных эффекторных молекул Treg, таких как CTLA4, GITR, LAG3, TIGIT, IL-10, CD39 и CD73, которые вносят вклад в иммуносупрессорную активность Treg.

Для разработки Fc белка избирательного агониста IL-2 авторы изобретения изначально сосредоточились на белках в конфигурации X-Fc, поскольку сообщалось о коротком времени полужизни в циркуляции для IL-2 слитых белков в конфигурации Fc-X. Первые два белка, которые получали и тестировали, один с линкерным пептидом и один без него, неожиданно демонстрировали, что белок с пептидным линкером обладал биологической активностью IL-2 и что белок без пептидного линкера не имел поддающейся обнаружению биологической активности. Оба белка демонстрировали высокую аффинность связывания с IL-2RA, указывая на то, что оба белка были должным образом уложены. Эти результаты подсказывали, что линкерный пептид необходим для активации рецептора IL-2 и биологической активности. Затем получали серию дополнительных аналогов для устранения других переменных и для того, чтобы тестировать эту гипотезу. Результаты этих исследований привели к открытию ключевых взаимосвязей между структурой и активностью для этого терапевтического белка и созданию новых молекул с желаемой активностью и фармацевтических свойствами.

В следующей таблице приведен список предпочтительных частиц._________________

Название	Линкер	Партнер слияния
N88RL10AG1	10 аминокислот	IgGl(N297A) Fc
N88RL15AG1	15 аминокислот	IgGl(N297A) Fc
N88RL20AG1	20 аминокислот	IgGl(N297A) Fc
N88RL25AG1	25 аминокислот	IgGl(N297A) Fc
N88RL30AG1	30 аминокислот	IgGl(N297A) Fc
N88RL15G1ED	15 аминокислот	IgGl(E233P/L234A/L235A/ G236del)
N88RL15G2	15 аминокислот	IgG2 Fc
N88RL15G4(S228P)	15 аминокислот	IgG4 Fc
N88RT3AL15AG1	15 аминокислот	IgGl(N297A) Fc
N88RL15HSA	15 аминокислот	HSA (С-конец)
HSAL15N88R	15 аминокислот	HSA (N-конец)
N88GL15AG1	15 аминокислот	IgGl(N297A) Fc
D20HL15AG1	15 аминокислот	IgGl(N297A) Fc
Q126LL15AG1	15 аминокислот	IgGl(N297A) Fc
Q126FL15AG1	15 аминокислот	IgGl(N297A) Fc

Состав.

Фармацевтические композиции слитых белков по настоящему изобретению определяют как сформулированные для парентеральной (в частности, внутривенной или подкожной) доставки в соответствии со стандартными способами. В целом фармацевтические составы включают слитые белки по настоящему изобретению в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, таким как физиологический раствор, буферный физиологический раствор, 5% декстроза в воде или т.п. Составы дополнительно могут содержать один или несколько эксципиентов, консервантов, солюбилизаторов, буферных средств, аль- 13 041387 бумин для предотвращения потерь белка на поверхностях флаконов и т.д. Способы формулирования хорошо известны в данной области и раскрыты, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ред., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 19-e изд., 1995.

В качестве иллюстрации фармацевтические составы можно поставлять в виде набора, содержащего контейнер, который содержит слитые белки по настоящему изобретению. Терапевтические белки можно предоставлять в форме инъецируемого раствора для однократных или многократных доз в виде стерильного порошка, который следует восстанавливать перед инъекцией, или в виде предварительно заполненного шприца. Такой набор дополнительно может содержать письменную информацию о показаниях и использовании фармацевтической композиции. Кроме того, такая информация может включать утверждение том, что слитые белки по настоящему изобретению противопоказаны пациентам с известной гиперчувствительностью к слитым белкам по настоящему изобретению.

Слитые белки избирательных агонистов IL-2 по данному изобретению можно встраивать в композиции, в том числе фармацевтические композиции. Такие композиции обычно содержат белок и фармацевтически приемлемый носитель. Как используют в настоящем описании, термин фармацевтически приемлемый носитель включает, но не ограничиваясь этим, физиологический раствор, растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические и задерживающие абсорбцию средства и т.п., совместимые с фармацевтическим введением. Дополнительные активные соединения (например, антибиотики) также можно включать в композиции.

Фармацевтическую композицию формулируют, чтобы она была совместимой с предполагаемым для нее путем введения. Слитые белки избирательных агонистов IL-2 по изобретению вероятно представляют собой те, которые подлежат введению через парентеральный путь. Примеры парентеральных путей введения включают, например, внутривенный, внутрикожный и подкожный. Растворы или суспензии, используемые для парентерального применения, могут содержать следующие компоненты: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций, физиологический раствор, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные средства, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфат натрия; хелатирующие средства, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и средства для корректировки тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. рН можно корректировать с использованием кислот или оснований, таких как одно- и/или двухосновный фосфат натрия, соляная кислота или гидроксид натрия (например, до рН приблизительно 7,27,8, например 7,5). Парентеральный препарат можно заключать в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы с несколькими дозами, выполненные из стекла или пластмассы.

Фармацевтические композиции, подходящие для инъекционного использования, включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального получения стерильных инъецируемых растворов или дисперсий. Носители, подходящие для внутривенного введения, включают физиологический раствор, бактериостатическую воду или фосфатно-солевой буфер (PBS). Во всех случаях композиция должна быть стерильной и текучей до такой степени, чтобы имела место возможность легкого введения через шприц. Она должна быть стабильной при условиях изготовления и хранения и должна быть предохранена от контаминирующего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащие, например воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), и их подходящие смеси. Сохранению требуемого размера частицы в случае дисперсии можно содействовать с помощью поверхностно-активных средств, например полисорбата или Tween. Предотвращение действия микроорганизмов можно достичь с помощью различных антибактериальных и противогрибковых средств, например парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты тимеросала и т.п. Во многих случаях в композицию предпочтительно включать изотонические средства, например сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит, хлорид натрия.

Стерильные инъецируемые растворы можно получать посредством внедрения активного соединения в требуемом количестве в подходящий растворитель с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости, после чего следует стерилизация фильтрованием. В целом дисперсии получают посредством внедрения активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из тех, что перечислены выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъецируемых растворов, предпочтительные способы получения представляют собой вакуумную сушку и лиофилизацию, которая дает порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из его раствора, предварительно стерилизованного фильтрацией.

В одном из вариантов осуществления слитый белок избирательного агониста IL-2 получают с использованием носителей, которые должны защищать слитый белок избирательного агониста IL-2 от быстрой элиминации из организма, например состав с контролируемым высвобождением, в том числе импланты и микроинкапсулированные системы доставки. Можно использовать биоразрушаемые биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимолочная кислота. Такие составы можно получать с использованием

- 14 041387 стандартных способов.

Фармацевтические композиции можно заключать в контейнер, упаковку или дозатор вместе с инструкциями для введения.

Введение.

Слитые белки по настоящему изобретению предпочтительно вводят через парентеральный путь. Подкожный путь является предпочтительным путем, но также можно использовать внутривенное, внутримышечное и субдермальное введение. Для подкожного или внутримышечного путей можно использовать депо и составы депо. Для определенных заболеваний можно использовать специальные пути введения. Например, для воспалительных заболеваний глаза можно использовать внутриглазную инъекцию. Слитые белки можно использовать в концентрации приблизительно от 0,1 до 10 мкг/мл общего объема, хотя можно использовать концентрации в диапазоне от 0,01 до 100 мкг/мл.

Определение дозы входит в навыки среднего специалиста в данной области. Дозирование происходит ежедневно или еженедельно в течение периода лечения или может происходить с другой прерывающейся частотой. Внутривенное введение происходит посредством болюсной инъекции или инфузии в течение типичного периода от одного до нескольких часов. Также можно использовать составы с замедленным высвобождением. В целом терапевтически эффективное количество слитых белков по настоящему изобретению представляет собой количество, достаточное для получения клинически значимого изменения состояния, которое лечат, такого как клинически значимое изменение в циркулирующих клетках Treg, клинически значимое изменение в клетках Treg, присутствующих в пораженной ткани, или клинически значимое изменение в симптоме заболевания.

Данные, полученные из анализа клеточных культур и исследований на животных, можно использовать при формулировании диапазона доз для использования у человека. Доза таких соединений предпочтительно находится в диапазоне концентраций в циркуляции, который включает полумаксимальную эффективную концентрацию (EC50; т.е. концентрацию тестируемого соединения, которая достигает полумаксимальной стимуляции клеток Treg) при небольшой или нулевой токсичности. Доза может варьировать в этом диапазоне в зависимости от используемой дозированной формы и применяемого пути введения. Для любого соединения, используемого в способе по изобретению терапевтически эффективную дозу можно оценивать изначально по анализу клеточных культур. Дозу можно формулировать в животных моделях для достижения диапазона циркулирующих концентраций в плазме, который включает EC50, как определяют в клеточной культуре. Такую информацию можно использовать для более точного определения эффективных доз у человека. Уровни в плазме можно измерять, например, посредством твердофазного иммуносорбентного анализа.

Как определено в настоящем описании, терапевтически эффективное количество слитого белка избирательного агониста IL-2 (т.е. эффективная доза) зависит от выбранного полипептида и частоты дозирования. Например, в однократной дозе можно вводить количество в диапазоне приблизительно от 0,001 до 0,1 мг/кг массы организма пациента; в некоторых вариантах осуществления можно вводить приблизительно 0,005, 0,01, 005 мг/кг. Композиции можно вводить от одного раза в сутки до одного или нескольких раз в неделю, или один или несколько раз в месяц; в том числе один раз через день. Специалист в данной области примет во внимание, что определенные факторы могут влиять на дозу и время, необходимые для эффективного лечения субъекта, включая в качестве неограничивающих примеров тяжесть заболевания или нарушения, предыдущее лечение, общее состояние здоровья и/или возраст субъекта, уровень клеток Treg, присутствующий у пациента, и другие присутствующие заболевания. Кроме того, лечение субъекта терапевтически эффективным количеством слитого белка избирательного агониста IL-2 по изобретению вероятно представляет собой серию лечений.

Аутоиммунные заболевания.

Отмечены некоторые из заболеваний, для которых может быть полезна терапия по данному изобретению. Однако роль клеток Treg в аутоиммунных заболевания является очень активной областью исследований, и дополнительные заболевания вероятно будут идентифицированы как поддающиеся лечению с помощью этого изобретения. Аутоиммунные заболевания определяют как заболевания человека, в которых иммунная система атакует свои собственные белки, клетки и ткани. Исчерпывающий список и обзор аутоиммунных заболеваний можно найти в The Autoimmune Diseases (Rose and Mackay, 2014, Academic Press). Заболевания, для которых существуют свидетельства эффекта от увеличения Treg, включают реакция трансплантат против хозяина, обыкновенную пузырчатку, системную красную волчанку, склеродермию, язвенный колит, болезнь Крона, псориаз, диабет 1 типа, рассеянный склероз, амиотрофический боковой склероз, очаговую алопецию, увеит, оптикомиелит и мышечную дистрофию Дюшенна.

Другие слитые белки.

Поскольку цель фрагмента белка Fc в этом изобретении состоит лишь в увеличении времени полужизни в циркуляции, специалист в данной области примет во внимание, что фрагмент избирательного агониста IL-2 можно сливать с N-концом других белков, для того чтобы достигать той же цели увеличения молекулярного размера и снижения скорости почечного клиренса, используя взаимосвязи структураактивность, обнаруженные в этом изобретении. Избирательный агонист IL-2 можно сливать с N-концом сывороточного альбумина (Sleep, D. et al., 2013, Biochim. Biophys. Acta, 1830:5526-34 ), который увели- 15 041387 чивает гидродинамический радиус слитого белка относительно фрагмента IL-2 и также подвержен рециклингу с помощью FcRN. Специалист в данной области также примет во внимание, что фрагмент избирательного агониста IL-2 по данному изобретению также можно сливать с N-концом рекомбинантных неиммуногенных аминокислотных полимеров. Два примера неиммуногенных аминокислотных полимеров, разработанных с этой целью, представляют собой полимеры XTEN, цепи аминокислот A, E, G, P, S и T (Schellenberger, V. et al., 2009, Nat. Biotechnol., 27:1186-90)), и полимеры PAS, цепи аминокислотных остатков P, A и S (Schlapschy, M. et al., 2007, Protein. Eng. Des. Sel., 20:273-84).

Все публикации и патентные заявки, цитированные в этом описании, включены в настоящее описание посредством ссылки, как если бы каждую индивидуальную публикацию или патентную заявку конкретно и индивидуально указывали для включения посредством ссылки.

Несмотря на то что вышеуказанное изобретение описано в некоторых деталях в качестве иллюстрации и примера для целей прозрачности понимания, специалистам в данной области будет легко увидеть в свете положений данного изобретения, что в нем можно создавать определенные изменения и модификации, не отступая от сущности или объема приложенной формулы изобретения.

Примеры

Следующие примеры представлены только в качестве иллюстрации только и не в качестве ограничения. Специалисты без труда узнают различные некритические параметры, которые можно изменять или модифицировать, чтобы получать по существу схожие результаты.

Пример 1. Клонирование, экспрессия и очистка слитых белков избирательного агониста IL-2-Fc IgG.

кДНК, кодирующую N88RL9AG1 (SEQ ID NO: 4), конструировали посредством синтеза ДНК и ПЦР сборки. Конструкция N88RL9AG1 состояла из сигнальной последовательности IgG1 мыши, последовательности зрелого IL-2 человека (SEQ ID NO: 1) с заменами N88R и C125S, 9-аминокислотной линкерной пептидной последовательности (SEQ ID NO: 15) и Fc-области IgG1 человека, содержащей замену N297A (SEQ ID NO: 2). N88R/IL-2 представляет собой избирательный агонист IL-2 со сниженным связыванием с IL-2RB и избирательной агонистической активностью на экспрессирующих рецептор IL-2Raey клетках (Shanafelt, A.B. et al., 2000, Nat. Biotechnol., 18:1197-202). Элиминация участка N-связанного гликозилирования в N297 на Fc IgG1 снижает эффекторные функции Fc (Tao, M.H. et al., 1989, J. Immunol., 143:2595-2601). D20HL0G2 состоял из сигнальной последовательности IgG1 мыши, IL-2 (SEQ ID NO: 1) с заменами D20H и C125S и фрагмента белка Fc, полученного из IgG2 человека (SEQ ID NO: 3). Сообщали, что D20H вариант IL-2 обладает избирательной агонистической активностью, схожей с N88R (Cassell, D.J. et al., 2002, Curr. Pharm. Des., 8:2171-83).

Эти кДНК клонировали в pcDNA3.1(+) (Life Technologies, Carlsbad, CA), используя участки рестрикции HindIII и NotI. Очищенную экспрессирующую векторную плазмиду, содержащую конструкцию, временно трансфицировали в клетки HEK293. Клетки HEK293 высевали во встряхиваемую колбу за 24 ч до трансфекции и выращивали с использованием бессывороточных сред с определенным химическим составом. Экспрессионные ДНК конструкции временно трансфицировали в 0,1 л суспензии клеток HEK293. После 24 ч клетки считали для получения жизнеспособности и числа жизнеспособных клеток. Культуры собирали в сутки 5 и кондиционированные супернатанты сред осветляли посредством центрифугирования на 3000xg в течение 15 мин. Белок очищали посредством пропускания супернатанта через колонку с белком A (GE Healthcare), элюирования 0,25% уксусной кислотой (рН 3,5), нейтрализации элюированного белка с использованием 1М Tris (рН 8,0) и диализа против 30 мМ HEPES, рН 7, 150 мМ NaCl. Затем образцы подвергали стерильному фильтрованию через 0,2 мкм мембранный фильтр и анализировали с помощью SDS PAGE при восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Белки мигрировали в виде димера с дисульфидной связью. Концентрацию белка определяли по поглощению с использованием вычисленного коэффициента экстинкции 1,11 мг/мл-см’¹ и аликвоты хранили при -80°C.

Цитокины N88R/IL-2 и D20H/IL-2 представляют собой варианты SEQ ID NO: 1, которые получали E.coli, по существу как описано в патенте США 6955807 B1, за исключением добавления дополнительной мутации C125S для усовершенствованной стабильности.

Пример 2. Определение рецепторсвязывающей активности N88RL9AG1 и D20HL0G2.

Для того чтобы определять, были ли N88RL9AG1 и D20HL0G2 уложены должным образом, их аффинность к субъединицам IL-2RA и IL-2RB рецептора IL-2 определяли посредством поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием прибора Biacore T-200 (GE Healthcare). Белки внеклеточных доменов IL-2RA и IL-2RB и белок IL-2 (R&D Systems, Minneapolis, MN) иммобилизовали на чипах CM-5 Biacore с помощью NHS/EDC сочетания до конечных значений RU (резонансные единицы) 30 и 484 соответственно. Кинетику связывания с IL-2RA измеряли в пяти концентрациях IL-2 и N88RL9AG1 в диапазоне от 0,6 до 45 нМ при скорости потока 50 мкл/мин. Кинетику связывания с IL2RB измеряли в пяти концентрациях в диапазоне от 16,7 до 450 нМ для IL-2 и от 14 до 372 нМ для Fc слитых белков при скорости потока 10 мкл/мин. Константы диссоциации (Kd) вычисляли по кинетическим константам с использованием программного обеспечения для оценки Biacore версии 2.0, принимая модель 1:1 для IL-2 и двухвалентную модель для N88RL9AG1 и D20HL0G2. Значения равновесной Kd

- 16 041387 вычисляли с помощью программного обеспечения для оценки Biacore, используя значения равновесного связывания.

Связывание с IL-2RA обнаруживали как для IL-2, так и для N88RL9AG1. Значение Rmax для N88RL9AG1, 14,43, было в 5,5 раза выше, чем таковое для IL-2, 2,62, в соответствии с тем фактом, что N88RL9AG1 (82 916 г/М) имеет более высокую молекулярную массу, чем IL-2 (15444 г/М). Значения k_on, k_off и Kd для IL-2 находились в диапазоне, ожидаемом исходя из опубликованных значений SPR (табл. II). Аффинность N88RL9AG1 был приблизительно в 2 раза больше, чем таковая у IL-2, как определяли с помощью кинетических и равновесных способов. Связывание IL-2 с IL-2RB обнаруживали при Rmax 6,19. Значения, которые определяли для kon, koff и Kd, находятся в диапазоне, приведенном в литературе. Приведенные значения составляют 3,1x10’8 М (IL-2RA) и 5,0х10’⁷ М (IL-2RB) (Myszka, D.G. et al., 1996, Protein Sci., 5:2468-78); 5,4x10’8 M (IL-2RA) и 4,5x10’⁷ (IL-2RB) (Shanafelt, A.B. et al., 2000, Nat. Biotechnol., 18:1197-202); и 6,6x10’9 M (IL-2RA) и 2,8x10’⁷ M (IL-2RB) (Ring, A.M. et al., 2012, Nat. Immunol., 13:118795). По существу не обнаруживали связывание N88RL9AG1 CIL-2RB, причем легкое связывание обнаруживали при наивысшей тестируемой концентрации (Rmax=0,06), значительно ниже ожидаемого на основании разности молекулярных масс между IL-2 и N88RL9AG1 и на основании результатов связывания IL-2RA. D20HL0G2 белок также тестировали на связывание с IL-2RA и обнаруживали Kd 8,3x10’9 M, схожую с таковой для N88RL9AG1. Таким образом, исследования связывания SPR показывали, что оба белка N88RL9AG1 и D20HL0G2 связываются с IL-2RA, что указывает на то, что белки уложены должным образом.

Пример 3. Биологическая активность N88RL9AG1 и D20HL0G2 на T-клетках.

Биологическую активность N88RL9AG1 и D20HL0G2 на T-клетках определяли посредством измерения уровней фосфорилированного STAT5 (pSTAT5) в конкретных субпопуляциях T-клетка. Уровни pSTAT5 измеряли посредством проточной цитометрии в фиксированных и пермеабилизированных клетках с использованием антитела к пептиду фосфорилированного STAT5. Клетки Treg конститутивно экспрессируют CD25 и клетки, которые входят в верхний 1% уровней экспрессии CD25, высоко обогащены клетками Treg (Jailwala, P. et al., 2009, PLoS One., 2009, 4:e6527; Long, S.A. et al., 2010, Diabetes 59:407-15). Следовательно, данные проточной цитометрии делили на группы CD25^высок. (верхние 1-2% экспрессирующих CD25 клеток) и CD25’^/низк' для Treg и субпопуляций CD4 эффекторных T-клеток соответственно.

Криосохранненные CD4+ T-клетки (Astarte Biologies, Seattle, WA) размораживали, промывали в средах X-VIVO 15 (Lonza, Allendale, NJ), содержащих 1% AB сыворотку человека (Mediatech, Manassas, VA), и оставляли восстанавливаться в течение 2 ч при 37°C. Затем клетки распределяли в 0,1 мл в пробирках 15x75 мм в концентрации 5x106 клеток/мл. Клетки обрабатывали различными концентрациями IL-2 или Fc слитых белков в течение 10 мин при 37°C. Затем клетки фиксировали с использованием Cytofix Fixation Buffer при 37°C в течение 10 мин, пермеабилизировали с использованием Perm Buffer III (BD Biosciences, Santa Clara, CA) в течение 30 мин на льду и затем промывали. Затем клетки окрашивали смесью антител anti-CD4-Pacific Blue (BD Biosciences, Santa Clara, CA), anti-CD25-AF488 (eBioscience, San Diego, CA) и anti-pSTAT5-AF547 (BD Biosciences) в концентрациях, рекомендованных производителем, в течение 30 мин при 20°C, промывали и получали данные проточной цитометрии на приборе LSRII (BD Biosciences). Данные анализировали с использованием аналитического программного обеспечения Flowjo (Flowjo, Ashland, OR).

Результаты для N88RL9AG1 в этом анализе показывали, что по сравнению с IL-2, N88RL9AG1 имел выдающуюся избирательность к популяции Treg (фиг. 3A). N88RL9AG1 активировал меньше чем 1% CD4+ клеток с очень сильной избирательностью к CD25^высок. клеткам. В отличие от этого IL-2 активировал более 80% CD4+ T-клеток в концентрации 40 нМ с высокой долей pSTAT5+ клеток, экспрессирующих низкие или нулевые уровни CD25. Даже при 4 пМ, наименьшей тестируемой концентрации, IL-2 все еще стимулировал значимые уровни pSTAT5 как в CD25’^/низк' клетках, так и в CD25^высок. клетках.

Затем D20HL0G2 тестировали на активность в pSTAT5 анализе CD4+ T-клеток. Неожиданно D20HL0G2 не обладал активностью в этом анализе (фиг. 3B). Дополнительный контроль с 10’⁸ М цитокина D20H/IL-2 (вариант цитокина IL-2, не слитый с Fc) демонстрировал устойчивую и избирательную pSTAT5 активацию CD25^высок. клеток (фиг. 3C). Отсутствие активности при использовании D20HL0G2 особенно удивительно, учитывая то, что D20HL0G2 связывался с IL-2RA с Kd, схожей с таковой у IL-2 и N88RL9AG1, что указывает на то, что он уложен должным образом.

Для того чтобы подтверждать, что CD25^высок. клетки, избирательно активированные с помощью N88RL9AG1, представляют собой Treg, активированные клетки совместно окрашивали на pSTAT5 и FOXP3, другой молекулярный маркер для клеток Treg. CD4+ клетки обрабатывали с использованием 4 нМ IL-2 или N88RL9AG1, фиксировали и пермеабилизировали, как описано выше, для окрашивания pSTAT5, и впоследствии обрабатывали с использованием 1 мл FOXP3 Perm Buffer (BioLegend, San Diego, CA) в течение 30 мин при комнатной температуре и затем промывали и ресуспендировали в FOXP3 Perm Buffer. Пермеабилизированные клетки окрашивали смесью антител anti-FOXP3-eFluor450, anti-CD25-AF488 (eBioscience, San Diego, CA) и anti-pSTAT5-AF547 (BD Biosciences) в течение 30 мин при 20°C, промывали и анализировали посредством проточной цитометрии. Результаты этого эксперимента показывали, что вы- 17 041387 сокая доля обработанных N88RL9AG1 клеток с активированным STAT5 (pSTAT5+ клетки), также экспрессировала высокие уровни FOXP3. Этот результат предоставляет дополнительное свидетельство того, что активированные клетки высоко обогащены клетками Treg. В отличие от этого обработанные IL-2 pSTAT5+ клетки представляли собой FOXP3+ и FOXP3-, причем большинство составляют FOXP3- клетки.

Пример 4. Определение взаимосвязей структура-активность, важных для биологической активности.

Неожиданные результаты, описанные в примере 3, подсказывали, что биологическая активность IL2, которую обнаруживали с использованием N88RL9AG1, но не с использованием D20HL0G2, обусловлена присутствием линкерного пептида. Для того чтобы верифицировать эту находку и устранить вклад других переменных, таких как изотип фрагмента Fc и мутации избирательности во фрагменте IL-2, разрабатывали и получали панель аналогов, все с использованием Fc N297A IgG1 (табл. III).

Конструировали кДНК и экспрессировали и очищали белки, как описано в примере 1, за исключением того, что C-концевой остаток лизина из Fc удаляли во всех конструкциях и что получение клеточных культур проходило в объеме 30 мл вместо 100 мл. Все белки извлекали с хорошим выходом. Фактически сравнение выхода для серии молекул N88R/IL-2 показывало явную тенденцию к увеличению выхода белка с увеличением длины пептидного линкера, причем выход N88RL20AG1 (с самым длинным пептидным линкером) в 6,8 раза выше, чем у N88RL0AG1 (без пептидного линкера) (фиг. 5A). Основание для увеличенного выхода содержащих линкерный пептид белков еще не ясна, но может быть обусловлена увеличенным уровнем экспрессии, увеличенным уровнем секреции, увеличенной стабильностью белка или увеличенной эффективностью очистки. Что интересно, выход WTL15AG1 только незначительно выше (в 1,8 раза) такового у WTL0AG1 по сравнению с 4,5-кратно более высоким выходом для N88RL15AG1 по сравнению с N88RL0AG1. Выход D20HL15AG1 схож с выходом N88RL15AG1, что указывает на то, что мутация избирательности IL-2 не оказывает достоверного эффекта на выход и оба эти белка имели значительно более высокие выходы (в 4,3 раза и 3,4 раза соответственно), чем AG1L15D20H (фиг. 5B). В совокупности эти результаты показывали, что увеличение длины пептидного линкера связано с более высоким выходом белка у содержащих N88R/IL-2 Fc слитых белков, что выход Fc слитых белков, содержащих wt IL-2, значительно менее чувствителен к присутствию линкерного пептида и IL-2-Fc слитые белки в конфигурации X-Fc получали.

Эти очищенные белки тестировали в биологическом анализе pSTAT5 T-клеток человека, по существу как описано в примере 3, за исключением того, что CD3+ T-клетки человека (отрицательно отобранные) использовали вместо CD4+ клеток и клетки инкубировали с тестовыми белками в течение 20 мин вместо 10 мин.

Результаты для серии молекул N88R/IL-2 показывали, что на биологическую активность в Tregобогащенной популяции значительно влияла длина пептидного линкера (фиг. 6A). Сигнал pSTAT5 (% pSTAT5+ клеток) в популяции Treg поступательно возрастал вместе с увеличением длины пептидного линкера. Эта увеличенная биологическая активность отражена как в максимальном сигнале pSTAT5 при 10^-8 М тестового белка, так и в значениях EC50 (табл. IV). N88RL20AG1, белок с самым длинным пептидным линкером, демонстрировал 4,2-кратное увеличение максимального сигнала pSTAT5 относительно N88RL0AG1. Поскольку сигнал pSTAT5 N88RL0AG1 не достигал 50% от IL-2 активации в этой наивысшей концентрации (10^-8 М), не было возможно определять кратность усовершенствования в EC50 белков, содержащих линкерных пептиды, относительно N88RL0AG1. Однако на основании EC50 N88RL20AG1 и наивысшей тестированной концентрации N88RL0AG1 можно оценивать, что N88RL20AG1 будет проявлять более чем 100-кратно более низкую EC50, чем N88RL0AG1.

Как ожидали, по существу отсутствовала поддающаяся обнаружению активность любых из молекул N88R/IL-2 в CD25^/нu3k популяции, хотя 10^-8 М IL-2 стимулировал активность pSTAT5 в 54,2% CD25^/нu3k клеток (фиг. 6B).

Сравнение WTL0AG1 и WTL15AG1 показывало, что линкерные пептиды оказывают значительно менее достоверный эффект на wt IL-2-Fc слитые белки, чем N88R/IL-2-Fc слитые белки (фиг. 7). В субпопуляции Treg как WTL0AG1, так и WTL15AG1 имели значимую биологическую активность и фактически стимулировали приблизительно 2-кратно более высокий максимальный уровень фосфорилирования pSTAT5, чем IL-2. Однако WTL0AG1 и WTL15AG1 также стимулировали большие сигналы pSTAT5 в CD25^/нu3k клетках в приблизительно 10-кратно более высокой концентрации. WTL15AG1 и WTL0AG1 демонстрировали приблизительно 10-кратную разницу в значениях EC50 в обеих популяциях Treg и CD25-/h^u3k. клеток.

Максимальный сигнал pSTAT5 D20HL15AG1 в Treg значительно меньше такового у N88RL15AG1 (фиг. 8). Это подсказывает, что отсутствие любой поддающейся обнаружению активности в примере 3 с использованием D20HL0G2 отчасти обусловлено более низкой активностью фрагмента D20H/IL-2 в контексте Fc слитого белка по сравнению с фрагментом N88R/IL-2. Активность AG1L15D20H слегка выше таковой у D20HL15AG1, что указывает на то, что конфигурация фрагмента IL-2 в Fc слитом белке (т.е. X-Fc против Fc-X) не оказывает основного эффекта на биологическую активность в Treg.

В совокупности эти результаты определяют ключевые признаки N88R/IL-2-Fc слитых белков, необ- 18 041387 ходимые для оптимальной биологической активности. N88R/IL-2-Fc белкам необходим линкерный пептид для оптимальной биологической активности в Treg с тенденцией к увеличению биологической активности с увеличением длины линкерного пептида. Кроме того, наряду с другими работами линкерные пептиды оказывают более умеренный эффект на биологическую активность Fc слитых белков, содержащих wt IL-2. Эти различающиеся требования к линкерному пептиду могут быть следствием того факта, что N88R/IL-2 имеет недостаточность связывания с IL-2RB, что возможно может вести к более строгим требованиям к контакту с рецептором и увеличению чувствительности к стерическим помехам от партнера Fc слитого белка. Эти результаты также определяют наиболее активные слитые белки избирательного агониста IL-2-Fc.

Пример 5. Избирательность слитых белков избирательного агониста IL-2-Fc в PBMC человека.

Для того чтобы определять избирательность N88R/IL-2-Fc слитых белков в более широком биологическом контексте, разрабатывали анализ для измерения активации STAT5 в клетках иммунной системы всех ключевых типов в неочищенных не фракционированных PBMC человека. PBMC человека выделяли посредством центрифугирования с Ficoll-Hypaque от нормального добровольца. 10⁶ PBMC суспендировали в средах X-VIVO15 с глюкозой (Lonza) и 10% FBS (Omega) и обрабатывали с использованием 10^-8 М тестовых белков в течение 20 мин при 37°C. Затем клетки обрабатывали с использованием Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (EBIO) по инструкциям производителя. Затем клетки фиксировали с использованием Cytofix Buffer и пермеабилизировали с использованием Perm Buffer III, как описано в примере 3. Затем фиксированные и пермеабилизированные клетки промывали в 1% FBS/PBS и окрашивали смесью антител в течение 60 мин при комнатной температуре в темноте. Затем окрашенные клетки промывали в 1% FBS/PBS, ресуспендировали в PBS и анализировали на проточном цитометре Fortessa (BD Biosciences). Смесь антител состояла из anti-CD4-PerCP-Cy5.5 (BD, № 560650), anti-pSTAT5AF-488 (BD, № 612598), anti-CD25-PE (BD, № 560989), anti-CD56-PE-CF594 (BD, № 562328), antiFOXP3-AF647 (BD, № 560889), anti-CD3-V450 (BD, № 560366) и anti-CD8-BV650 (Biolegend, № 301041). Эта процедура окрашивания делала возможным мониторинг уровней pSTAT5 в клетках иммунной системы 7 ключевых типов.

Фенотипы клеток представляли собой следующее: клетки Treg: CD3+, CD4 + , Foxp3+, CD25^b“^cok., CD8-, CD56-; активированные клетки CD4 Teff: CD3+, CD4 + , Foxp3-, CD25^b“^cok., CD8-, CD56-; клетки CD4 Teff: CD3+, CD4 + , Foxp3-, CD25^hu3k; CD8-, CD56-; NKT-клетки: CD3+, CD4-, Foxp3-, CD25^hu3k; CD8-, CD56+; NK клетки: CD3-, CD4-, Foxp3-, CD25^hu3k., CD8-, CD56+; В-клетки: CD3-, CD4-, Foxp3-, CD25^нUЗk., CD8-, CD56-.

Белки тестировали в этом анализе в концентрации 10^-8 М. Результаты, представленные на фиг. 9 и сведенные в табл. V, показывают, что N88RL15AG1 демонстрировал выдающуюся избирательность по сравнению с wt IL-2 и WTL15AG1, оба они активировали pSTAT5 в больших фракциях от всех популяций клеток. N88RL15AG1 стимулировал сигнал pSTAT5 в популяции Treg близко к уровню wt IL-2 при незначительной активации клеток других типов за исключением NK клеток. Дополнительный анализ (не показано) показывал, что pSTAT5+ NK клетки были CD25^βыс^оk, что является характеристикой клеток NK-CD56^bright, субпопуляции NK клеток, которая также обладает иммунорегуляторной активностью (Poli, A. et al., 2009, Immunology, 126(4):458-65). Клетки нескольких типов, которые имели низкие уровни сигнала pSTAT5 при использовании N88R/IL-2 (активированные клетки CD4 Teff, клетки CD4 Teff, NK T-клетки и NK клетки), демонстрировали нулевые или низкие сигналы pSTAT5 при использовании N88RL15AG1. Эти результаты демонстрируют активность и высокую избирательность N88RL15AG1 к Treg в комплексном биологическом окружении.

Пример 6. Исследование дополнительных взаимосвязей структура-функция, важных для биологической активности.

Результаты, представленные в примере 5, указывали на строгие требования к линкерному пептиду между 6 и 20 аминокислотами в длину для устойчивой биологической активности N88R/IL-2-Fc слитых белков, где увеличение длины линкерного пептида связано с увеличением биологической активности. Для того чтобы определять, если даже более длинные линкерные пептиды содействуют увеличенной биологической активности, дополнительные белковые конструкции с длинами пептидных линкеров 25 и 30 аминокислот получали как описано в примере 1 и тестировали в анализе биологической активности pSTAT5 в T-клетках, как описано в примере 3, наряду с независимыми препаратами N88RL15AG1 и N88RL20AG1. Результаты этого эксперимента показывали, что увеличение пептидного линкера до 25 (N88RL25AG1) или 30 (N88RL30AG1) аминокислот не ведет к более высокой биологической активности в CD25hi клетках, чем белок с 20-аминокислотным линкером (табл. VII). Эти результаты, наряду с результатами, представленными в примере 4, показывают, что способность пептидных линкеров содействовать биологической активности IL-2 выходит на плато при длине 15-20 аминокислот и что более длинные линкерные пептиды не содействуют дальнейшему увеличению биологической активности.

Оценивали альтернативные партнеры слияния Fc, которые могут увеличивать время полужизни в циркуляции и которые имеют недостаточность эффекторных функций Fc. Аналогичным образом получали и тестировали Fc gG1 с мутациями E233P/L234A/L235A/G236del (SEQ ID NO: 22), Fc IgG2 (SEQ ID NO: 23) и IgG4 Fc с шарнирной мутацией S228P, которая стабилизирует димер Fc (SEQ ID NO: 24). Кроме того,

- 19 041387 получали и тестировали слитые белки, в которых IL-2/N88R сливали с альбумином человека, или с

N-концом (N88RL15HSA, SEQ ID NO: 25) или с C-концом (HSAL15N88R, SEQ ID NO: 26) альбумина человека. Несмотря на то что все белки биологически активны на CD25hi клетках ни один из этих слитых белков не проявлял биологическую активность больше чем та, которую наблюдали для

N88RL15AG1 (табл. VIII).

Эффект различных мутаций избирательности IL-2 исследовали на остове слияния Fc N297A IgG1 (табл. IX). Белки с мутациями избирательности N88G и Q126F имели меньшую биологическую активность в CD25hi клетках, чем N88R, при 10^-8 М, наивысшей тестируемой концентрации, при этом не проявляя биологической активности в CD25^-/ни3k. клетках (данные не представлены). Белок с заменой N88I не имел активности в клетках какого-либо типа. Это может указывать, что исходное сообщение об избирательной агонистической активности для этого варианта было ошибочным, или альтернативно это может указывать на то, что он не активен в рамках контекста Fc слитого белка. Белки с заменой Q126L имели более высокую биологическую активность, чем N88R, что отражено в более высоком ответе pSTAT5 в тестах с наивысшей концентрацией на CD25hi клетках, несмотря на то что этому сопутствовало посредством умеренное увеличение активации экспрессирующих CD25^-/ни3k клеток при 10^-8 М (данные не представлены). Эти результаты подсказывают, что Q126L/IL-2 является более мощным избирательным агонистом с более высокой биологической активностью как в CD25hi, так и в CD25^-/ни3k клетках.

Наконец, влияние устранения участка О-связанного гликозилирования на треонине 3 из фрагмента IL-2/N88R оценивали посредством получения варианта N88RT3AL15AG1. Участок O-связанного гликозилирования в IL-2 не требуется для биологической активности (Robb, R.J. et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:6486-90), и устранение этого участка гликозилирования должно вести к полностью агликозилированному белку, который будет обладать меньшими посттрансляционными модификациями, вносящими вклад в гетерогенность продукта. Вариант N88RT3AL15AG1 получали и тестировали, а также показали, что он обладает биологической активностью в CD25hi клетках, схожей с таковой для N88RL15AG1 (табл. IX).

Таблицы

Таблица I

Одобренные US FDA Fc слитые белки и их характеристики

ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО	Изотип Ес	Партнер слияния	N или С слияние	Линкерный пептид	Время полужизни (сутки)
Ромиплостим	G1	Пептид TPO-R	С	Υ	3,5
Этанерцепт	G1	Р75 TNFa-R	Ν	Ν	4,3
Алефацепт	G1	LFA3	Ν	Ν	10, 1
Рилонацепт	G1	IL1-R	Ν	Ν	8, 6
Абатацепт	G1	CTLA4	Ν	Ν	16, 7
Белатацепт	G1	CTLA4 (мут.)	Ν	Ν	9, 8
Афлиберцепт	G1	VEGF R1+R2	Ν	Ν	п/а
Дулаглутид	G4 (мут.)	GLP1	Ν	Υ	3,7
Элоктат	G1	FVIII	Ν	Ν	0, 8
Алпроликс	G1	FIX	Ν	Ν	3, 6

Таблица II

Аффинность IL-2 Fc слитых белков к субъединицам IL-2RA и IL-2RB

					9
IL2RB	IL-2	Кинетический	5, ЮхЮ⁵	3, ОхЮ-¹	5,87x10“ 7
	N88RL9AG1	Кинетический	nd	nd	-
	IL-2	Равновесие			2,53x10- 7
	N88RL9AG1	Равновесие	—	—	7,60x10- 2

- 20 041387 nd: связывание не обнаруживали.

Таблица III

Белок	IL2	Пептидный линкер	Конфигурация	SEQ ID NO:
N88RL0AG1	N88R	0	Х-Ес	6
N88RL5AG1	N88R	5	Х-Ес	7
N88RL10AG1	N88R	10	Х-Ес	8
N88RL15AG1	N88R	15	X-Fc	9
N88RL20AG1	N88R	20	X-Fc	10
WTL0AG1	wt	0	X-Fc	11
WTL15AG1	wt	15	X-Fc	12
D20HL15AG1	D20H	15	X-Fc	13
AG1L15D20H	D20H	15	Fc-X	14

Таблица IV

Белок	EC50	Максимальный	Кратность увеличения максимального ответа pSTAT5
ответ при 10-⁸	pSTAT5 Μ
N88RL0AG1	>10~⁸	0,33		1,0
N88RL5AG1	>10~⁸	0,52		1, 6
N88RL9AG1	7xlO~¹⁰	0, 96	2,9
N88RL10AG1	9xlO~¹⁰	0, 90	2,7
N88RL15AG1	4xlO~¹⁰	1,22	3,7
N88RL20AG1	lxlO~¹⁰	1,40	4,2

Таблица V

	Контроль	IL-2	WTL15AG1	N88R/IL2	N88RL15AG
					1
Клетки Treg	0, 8	99, 9	99, 8	99, 9	75, 1
Активированные	0, 1	70,5	65, 2	3, 7	0, 1
клетки CD4
Teff
Клетки CD4	0,2	60, 9	40, 0	2,4	0, 5
Teff
Клетки CD8	0, 1	90,2	35, 4	2,3	0, 1
Teff
NKT-клетки	0, 5	74,9	60,5	20,5	5, 2
NK клетки	0, 3	96, 8	96, 1	49, 9	19, 3
В-клетки	0, 1	20,9	10, 6	0,2	0, 1

Процентная доля pSTAT5+ клеток среди клеток иммунной системы 7 типов в PBMC человека. Клетки обрабатывали белком, указанным в заголовках колонок, и анализировали как описано в примере 6.

- 21 041387

Таблица VI

Белок	IL2	Пептидный линкер (а. к. )	Партнер слияния	SEQ ID NO:
N88RL25AG1	N88R	0	IgGl Fc N297A	20
N88RL30AG1	N88R	5	IgGl Fc N297A	21
N88RL15G1ED	N88R	10	IgGl Fc	22
N88RL15G2	N88R	15	IgG2 Fc	23
N88RL15G4(S228P)	N88R	20	IgG4 Fc	24
N88RL15HSA	wt	0	HSA	25
HSAL15N88R	wt	15	HSA	26
N88IL15AG1	N88I	15	IgGl Fc N297A	27
N88GL15AG1	N88G	15	IgGl Fc N297A	28
Q126FL15AG1	Q126F	15	IgGl Fc	29
			N297A
Q126LL15AG1	Q126L	15	IgGl Fc N297A	30
N88RT3AK15AG1	N88R, ТЗА	15	IgGl Fc N297A	31

Таблица VII

Белок	EC50	Максимальный ответ pSTAT5 при 10-⁸ Μ (%клеток pSTAT5+)	Ответ pSTAT5 при 10^⁸ М (% ответа на wt IL-2)
N88RL15AG1	13, OxlO~¹⁰	1, 12	73
N88RL20AG1	9, 5xlO~¹⁰	1, 18	77
N88RL25AG1	29, 7xlO~¹⁰	1, 10	71
N88RL30AG1	8,5xlO~¹⁰	1, 18	77

Таблица VIII

Белок	ЕС50	Максимальный ответ pSTAT5 при 10~⁸ М (% клеток PSTAT5+)	Ответ pSTAT5 при 10~⁸ М (% ответа на wt IL-2)
N88RL15G1ED	5, 2х10-⁹	0, 90	58
N88RL15G2	-	0,71	46
N88RL15G4(S228P)	6, 9х10-⁹	0,77	50
N88RL15HSA	-	0,32	21
HSAL15N88R	-	0, 68	44

-22041387

Таблица IX

Белок N88IL15AG1 N88GL15AG1	EC50 8, IxlQ-¹⁰	Максимальный ответ pSTAT5 при IGF⁸ M (% клеток pSTAT5+) 0, 00 0, 81	Ответ при 10~ ответа IL-2) 0 53	pSTAT5 -⁸ M (% на wt
Q126FL15AG1	9, IxlQ-¹⁰	0,75	49
Q126LL15AG1	9, 5xlO~¹⁰	1, 66	108
N88RT3AK15AG1	1,9xl0~⁹	0, 97	63

Списки последовательностей

SEQ ID NO: 1 >IL-2 человека(N88R)

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCL EEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISRINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT FCQSIISTLT

SEQ ID NO: 2 >IgGl человека(N297A) Fc

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 3 >IgG2 человека Fc

VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQ VYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*

SEQ ID NO: 4 >N88RL9AG1

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCL EEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISRINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT FSQSIISTLTGGGGAGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWD VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*

SEQ ID NO: 5 >D20HL0G2

APTSSSTKKTQLQLEHLLLHLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCL EEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT FSQSIISTLTVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWY

- 23 041387

VDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQ PREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*

SEQ ID NO: 6 >N88RLOAG1

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCL EEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISRINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT FSQSIISTLTDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*

SEQ ID NO: 7 >N88RL5AG1

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCL EEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISRINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT FSQSIISTLTGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*

SEQ ID NO: 8 >N88RL1OAG1

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCL EEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISRINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT FSQSIISTLTGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*

SEQ ID NO: 9 >N88RL15AG1

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCL EEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISRINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT FSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*

SEQ ID NO: 10

- 24 041387 >N88RL2OAG1

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCL EEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISRINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT FSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

SEQ ID NO: 11 >WTLOAG1

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCL EEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT FSQSIISTLTDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*

SEQ ID NO: 12 >WTL15AG1

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCL EEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT FSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*

SEQ ID NO: 13 >D2OHL15AG1

APTSSSTKKTQLQLEHLLLHLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCL EEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT FSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*

SEQ ID NO: 14 >AG1L15D2OH

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP

- 25 041387

REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSAPTSSSTKKT QLQLEHLLLHLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQ SKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT*

SEQ ID NO: 15 >L9

GGGGAGGGG

SEQ ID NO: 16 >L5

GGGGS

SEQ ID NO: 17 >L10

GGGGSGGGGS

SEQ ID NO: 18 >L15

GGGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID NO: 19 >L2 0

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID NO: 20 >N88RL25AG1

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCL EEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISRINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT FSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPG*

SEQ ID NO: 21 >N88RL3OAG1

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCL EEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISRINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT FSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY

- 26 041387

TQKSLSLSPG*

SEQ ID NO: 22 >N88RL3G1ED(E233P/L234A/L235A/G236del)

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCL EEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISRINVIVLELKGSETTEMCEYADETATIVEFLNRWIT FSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVWDV

SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*

SEQ ID NO: 23 >N88RL3G2

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCL eeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisrinvivlelkgsettfuceyadetativeflnrwit FSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCW vdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrwsvltwhqdwlngkeykckvsnkg LPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNY kttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg*

SEQ ID NO: 24 >N88RL3G4(S228P)

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCL EEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISRINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT FSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG*

SEQ ID NO: 25 >N88RL15HSA

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCL EEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISRINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT FSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDH VKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFL QHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTE CCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEV SKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVEN DEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEK

- 27 041387

CCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTL VEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDY

LSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHA DICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKL VAASQAALGL*

SEQ ID NO: 26 >HSAL15N88R

DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESA ENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVM CTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRD EGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLL ECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDV CKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKP LVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEA KRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETF TFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEE GKKLVAASQAALGLGGGGSGGGGSGGGGS

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCL EEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISRINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT FSQSIISTLT*

SEQ ID NO: 27 >N88IL15AG1

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCL EEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISIINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT FSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*

SEQ ID NO: 28 >N88GL15AG1

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCL EEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISGINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT FSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*

- 28 041387

SEQ ID NO: 29 >Q126FL15AG1

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCL EEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT FSFSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*

SEQ ID NO: 30 >Q126LL15AG1

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCL EEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT FSLSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*

SEQ ID NO: 31 >N88RT3AL15AG1

APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCL EEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISRINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT FSQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ лечения аутоиммунного заболевания у субъекта, нуждающегося в этом, где способ включает введение фармацевтической композиции, содержащей

i) слитый белок, содержащий (a) домен белка варианта IL-2 человека, содержащий замену, выбранную из группы, состоящей из N88R, N88G, Q126L и Q126F;

(b) домен пептидного линкера между 6 и 35 аминокислотами; и (c) домен Fc IgG, где каждый домен имеет аминоконец (N-конец) и карбоксиконец (C-конец), где слитый белок выполнен с возможностью слияния C-конца домена белка варианта IL-2 человека через пептидную связь с N-концом пептидного линкера и N-конец фрагмента белка Fc IgG сливают через пептидную связь с C-концом пептидного линкера; и ii) фармацевтически приемлемый носитель, где аутоиммунное заболевание выбирают из группы, состоящей из псориаза, реакции трансплантат против хозяина, амиотрофического бокового склероза, обыкновенной пузырчатки, системной красной волчанки, склеродермии, язвенного колита, болезни Крона, диабета 1 типа, рассеянного склероза, очаговой аллопеции, увеита, оптикомиелита и мышечной дистрофии Дюшенна.
2. Способ по п.1, где слитый белок содержится в димерном белке, который содержит две идентичные цепи, где каждая цепь содержит слитый белок.
3. Способ по п.1 или 2, в котором домен белка варианта IL-2 человека содержит замену C125S.
4. Способ по любому из пп.1-3, в котором домен белка варианта IL-2 человека содержит замену N88R.
5. Способ по любому из пп.1-4, где домен пептидного линкера составляет от 10 до 30 аминокислот.
6. Способ по любому из пп.1-5, в котором домен пептидного линкера состоит из смеси остатков глицина и серина.
7. Способ по любому из пп.1-5, в котором домен пептидного линкера содержит смесь из 12-17 остатков серина и глицина.
8. Способ по любому из пп.1-5, в котором домен пептидного линкера содержит остатки глицина и остатки серина в соотношении 4:1.
9. Способ по любому из пп.1-8, в котором домен белка Fc IgG содержит одну или несколько замен аминокислот, которые снижают эффекторные функции Fc-части слитого белка.

- 29 041387
10. Способ по п.1 или 2, где

а) домен белка варианта IL-2 человека содержит замены аминокислот N88R и C125S;

b) домен линкерного пептида содержит аминокислотную последовательность, как приведено в

SEQ ID NO: 18; и

c) домен Fc IgG1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
11. Способ по п. 1 или 2, где слитый белок содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 31.