JP2825780B2 - ラミニンレセプターをコードする組換えｄｎａクローン由来のプローブ - Google Patents
ラミニンレセプターをコードする組換えｄｎａクローン由来のプローブInfo
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】発明の分野
本発明は一般的に組換えＤＮＡに関する。より詳細に
は、本発明はラミニンの高親和性（約１０-8〜１０-10
ｋｄ）細胞表面レセプターをコード化する組換えＣＤＮ
Ａクローンに関する。 【０００２】背景技術 ラミニンは表皮細胞及び新生細胞の両者の基底膜への結
合を媒介する基底膜の主たる糖タンパク質成分である。
基底膜は器官柔組織細胞を間質性コラーゲン様ストロマ
から分離する至る所に存在する特殊化されたタイプの外
細胞マトリックスである。細胞とこのマトリックスの相
互作用は正常及び新生細胞過程の両者の重要な側面であ
る。正常な細胞は外細胞マトリックスを生存、増殖及び
分化のために必要とするように思われるのに対し、移動
性細胞は正常細胞及び新生細胞共に一つの組織から他の
組織に移動するに際して基底膜を横切らなければならな
い。特に扁平或いは小腺表皮細胞に生ずる転移癌細胞は
循環及びリンパ系に入るためには基底膜を横切らなけれ
ばならず（血管内異物侵入）、又循環新生細胞は器官の
毛細管床に典型的に捕えられ、血管壁を冒し、及び基底
膜を侵入して血管外組織に至り（管外遊出）、そこで二
次的新生物を次いで確立する。ラミニンレセプターは表
皮及び新生細胞の両者の基底膜への結合を媒介すること
により特に転移過程を制御することにおいて極めて重要
な役割をはたす。米国特許４，５６５，７８９号明細書
はラミニンレセプターの単離及びある種の側面の特性化
を記載している。しかしながら、ラミニンの細胞表面レ
セプターをコード化するクローン化ＤＮＡ配列はこれ迄
知られていない。 【０００３】 【発明の概要】従って、本発明の目的はラミニンの高親
和性（約１０-8〜１０-10 ｋｄ）細胞表面レセプターを
コード化することのできる組換えｃＤＮＡクローンを提
供することである。更に、本発明の目的は、転移を抑制
するラミニンレセプターの合成断片を提供することであ
る。更に本発明の目的は、多量の合成ラミニンレセプタ
ーの製造方法を提供することである。 【０００４】更に本発明の目的は膜張渡し領域及びリガ
ンド結合領域などの特定の領域をコード化するラミニン
レセプターの合成断片を提供することである。更に本発
明の目的は異った腫瘍細胞及び正常な組織細胞集合体に
おけるラミニンレセプターｍＲＮＡの含量を評価する診
断方法を提供するものである。更に本発明の目的は異っ
た組織及び腫瘍細胞集合体におけるラミニンレセプター
遺伝子のパターンを決定する診断方法を提供することで
ある。 【０００５】図面の説明 本発明のこれら及びその他の目的を付随する利点の多く
は添付図面に関連して考慮するとき以下の詳細な既述を
読んでよりよく理解されるであろう。 【０００６】図１は精製ラミニンレセプターの均質性を
示す。上段（ＴＯＰ）は大腸癌からの及び正常ヒト胎盤
組織からの精製ラミニンレセプターの比較を示す。ラミ
ニン-Sepharoseアフィニティカラムから１Ｍ ＮａＣｌ
で溶出された物質をジチオスレイトールの存在下におい
てＮａＤｏｄＳＯ４‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（７％）により分析し、銀染色により可視化した。パネ
ルはラミニンレセプターの調製物間の分子量の僅かな可
変性を例示する（６８，０００〜７２，０００）。レー
ンＰ１：ヒト胎盤組織から単離されたラミニンレセプタ
ー（１μｇ）。レーンＣａ：ヒト大腸癌から単離された
ラミニンレセプター（３μｇ）。レーンＭ：分子量マー
カー：ホスホリラーゼｂ（９４，０００）、ウシ血清ア
ルブミン（６７，０００）及びオバルブミン（４３，０
００）。 【０００７】図１下段（BOTTOM）は精製ラミニンレセプ
ターの等電集中及び二次元ゲル電気泳動を示す。上記大
腸癌ラミニンレセプタータンパク質試料（０．１μｇ）
はＩ125 で放射線標識され、等電集中（ｐＨ範囲５〜
７）及び１０％ ＮａＤｏｄＳＯ４‐ポリアクリルアミ
ドゲル上の二次元ゲル電気泳動に付された。分子量マー
カー：ホスホリラーゼｂ（９３，０００）、ウシ血清ア
ルブミン（６６，０００）、グリセラルアルデヒド３‐
ホスフェートデヒドロゲナーゼ（３６，０００）。 【０００８】図２は精製ラミニンレセプターのＥＬＩＳ
Ａを示す。各マイクロタイターウェルを精製腫瘍ラミニ
ンレセプターで被覆し、ＬＲ１モノクローナル抗体２Ｈ
５（□）、抗アルブミン（○）或いは抗‐α‐アミラー
ゼモノクローナル抗体（●）に対して２時間反応させ
た。抗体をペルオキシダーゼ複合ヤギ抗マウスＩｇＭ或
いはペルオキシダーゼ複合ブタ抗ウサギＩｇＧを用いて
検出した。 【０００９】図３および図４は抗ラミニンレセプターモ
ノクローナル抗体のλＥＬＲ６に対する特異性を示す。
約５０〜１００個の精製λＥＬＲ６プラークを含有する
フィルターを抗ラミニンレセプターモノクローナル抗
体、抗‐α‐アミラーゼモノクローナル抗体、抗アルブ
ミン抗体或いは抗ラミニン抗体のいずれかと反応され
た。抗体結合はペルオキシダーゼ複合第二抗体を用いて
検出した。 【００１０】図５はλＥＬＲ１〜６の重畳ラミニンレセ
プターｃＤＮＡインサートを示す。頂部の線はｃＤＮＡ
インサートの左側への２個のＫｐｎＩ部位（Ｋ）を示す
原型λＥＬＲ組換えλｇｔ１１ファージの図である。囲
いはｃＤＮＡインサートを表わす。各インサート内の左
のＥｃｏＲＩ部位は存在しなかった。右のＥｃｏＲＩ部
位（Ｅ）を示す。λｇｔ１１のｌａｃＺ遺伝子からの転
写はファージの右腕からＥを介して左側に進む。Ｋｐｎ
Ｉ部位（ｃＤＮＡインサートに最も近接した）から最大
のｃＤＮＡインサート（λＮＬＲ４）のＥｃｏＲＩ部位
に延在する領域は拡大されて下に示される。ｃＤＮＡイ
ンサート囲い内の斜線領域はニックトランスレーション
されハイブリダイゼーションプローブとして用いられた
λＥＬＲ４のサブクローン（図６参照）から単離された
ＰｓｔＩ‐ＳｐｈＩ制限断片を示す。明細書に説明され
る共通ＳａｃＩ（Ｓ）及びＨｉｎｄ III（Ｈ）部位が示
される。ＥＬＲ組換えファージの各々からのファージＤ
ＮＡはＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩで制限され、１％アガロ
ースゲルを通して電気泳動され、ニトロセルロースに移
され、及び上記ＰｓｔＩ‐ＳｐｈＩ制限断片にストリン
ジェントにハイブリダイズされる。プローブにハイブリ
ダイズした各λＥＬＲ組換えファージからのＫｐｎＩ‐
ＥｃｏＲＩ制限断片の長さをブロットのラジオオートグ
ラフ上に図示し、標準λ／Ｈｉｎｄ III消化物と対比し
て決定した。 【００１１】図６はλＥＬＲ４のｃＤＮＡインサートの
配列決定の術策を図示する。λＥＬＲ４のサブクローン
化インサートの制限地図を上段に示す。Ｅはインサート
の５′ＥｃｏＲＩ部位である。Ｈ：ＨｉｎｆＩ、Ｓ：Ｓ
ｐｈＩ、Ｒ：ＲｓａＩ、Ｐ：ＰｓｔＩ、＊：オーカー集
結コドン。矢印は５′末端において（γ‐Ｐ32）ＡＴＰ
によるキナーゼ化により（●）或いは３′末端において
（α‐Ｐ32）ジデオキシＡＴＰによるテーリングにより
（○）或いはジデオキシ合成法（ｒ）のいずれかにより
標識化された断片の配列方向を示す。配列決定に用いら
れたサブクローンはｐＬＲ４−１、ｐＬＲ４−２、及び
ｐＬＫ４−４であった。 【００１２】図７および図８は下記に得られたタンパク
質配列のλＥＬＲ ｃＤＮＡインサートのヌクレオチド
配列を提供する。各線の右側には人工ＥｃｏＲＩ部位か
らの塩基対の数が示される（塩基１〜６）。図７および
図８に記載されるヌクレオチド配列は連続したものであ
り、図７を左側とし、図８を右側とするものである。 【００１３】図９は、合成ラミニンレセプターペプチド
のＥＬＩＳＡ決定を示す。合成ラミニンレセプターペプ
チドＲＴＬＲ２は図７および図８におけるｃＤＮＡ配列
から生成され、異った稀釈率のウサギ抗ラミニンレセプ
ター抗血清或いは前免疫血清を用いてＥＬＩＳＡにより
アッセイされた。 【００１４】図１０はＲＮＡゲルブロットハイブリダイ
ゼーションを示す。全細胞ＲＮＡを数個の乳癌細胞系か
ら抽出し、メチル水銀アガロースゲル上で分離し、及び
ジアゾベンジルオキシメチルセルロース紙に移した。こ
のフィルターをｐＬＲ４−１からのニックトランスレー
ションされた（32Ｐ）‐標識化ＥｃｏＲＩ‐ＰｓｔＩイ
ンサートにハイブリダイズした。ハイブリダイズされた
ｍＲＮＡ種の長さは知られた大きさのｒＲＮＡ及びＨｉ
ｎｄ IIIで制限されたλＤＮＡの大きさと対比すること
により求められた。レーン１：ＭＣＦ‐７（親）；レー
ン２：ＭＣＦ７‐３Ｅ５；レーン３：ＭＣＦ７‐５Ｈ
７；レーン４：ＺＲ７５。 【００１５】図１１はラミニンレセプターｍＲＮＡレベ
ルと６個のヒト癌細胞系のラミニンに結合する能力との
相関関係を示す。図１０に示されるような異った時間の
ラジオオートグラフの曝露を濃度測定により測定して線
形応答範囲を決定した。一連のハイブリダイズされたＲ
ＮＡの最低量に数値１．０を与え、全てのその他の値は
その値に対して計算した。各細胞系に対する細胞当りの
ラミニンレセプターの数は対数成長期細胞に対する特異
的結合（Ｉ125 ）ラミニンのScat-chardプロットから計
算した。線形回帰分析は０．９７の相関係数を示した。
ＭＣＦ‐７親□、ＭＣＦ‐７クローン５Ｈ７△、ＭＣＦ
‐７クローン３Ｅ５（黒ぬり四角形）、ＺＲ‐７５○、
腎癌Ａ‐７０４●、Panc‐１（黒ぬり三角形）。 【００１６】図１２は合成ラミニンレセプターペプチド
が細胞へのラミニン結合を抑制することを示す。Ａ２０
５８ヒトメラノーマ細胞のラミニンに特異的に結合する
能力を、図７および図８のｃＤＮＡ配列から精製する各
種量のＲＴＬＲ２の□或いはＲＴＬＲ２‐コントロール
（黒ぬりひし形）の存在下において試験した。値は添加
断片の存在下において結合したラミニン量に対して表わ
されている。及び 【００１７】図１３はリガンド結合に含まれる合成ペプ
チドラミニンレセプターの同定を示す。予測された逆転
立体配置を有するｃＤＮＡ配列から精製されたペプチド
断片（ＲＴＬＲ２、ＲＴＬＲ３）並びにコントロールペ
プチドはグラスビーズに結合され（Ｉ125 ）ラミニンと
インキュベートした。示された数値は断片なしにビーズ
に結合されたｃｐｍを差引いた後のビーズに結合したｃ
ｐｍ×１０-3の数である。 【００１８】 【発明の具体的説明】本発明の上記及び各種のその他の
目的及び利点は細胞表面ラミニンレセプターをコード化
するヌクレオチド配列を全部或いは部分的に（図７およ
び図８に示す如く）有する組換えｃＤＮＡクローン及び
合成ラミニンレセプター或いはその断片の製造方法によ
り達成される。 【００１９】特に断りのない限り、本発明において用い
る全ての技術的或いは化学的用語は本発明の属する技術
における当業者により普通に理解されるものと同一意味
を有する。本発明の実施或いは試験において、本発明に
おいて説明されるものと同様或いは等価の如何なる方法
及び材料を用いることもできるが、好ましい方法及び材
料を以下に説明する。以下に述べる全ての刊行物は本発
明において準用する。 【００２０】本発明の組換えｃＤＮＡクローンを造築及
び単離するための方法論は更に詳細に例IIにおいて説明
されており、周知の標準的技術を含む以下の一般的工程
を含むものである： ａ） ヒト臍帯静脈内皮細胞からのｍＲＮＡ鋳型を用い
てｃＤＮＡを合成する。 ｂ） 内皮細胞ｃＤＮＡをλｇｔ１１ベクター（ＡＴＣ
Ｃ ３７１９４）中に挿入する。 ｃ） この組換えλｇｔ１１をパッケージし、大腸菌
（Escherichia coli）１０９０細胞（ＡＴＣＣ３７１９
７）を感染するために用いる。 ｄ） 得られるλｇｔ１１ヒト内皮細胞ｃＤＮＡ発現ラ
イブラリーをラミニンの結合に含まれるヒトラミニンレ
セプターの領域を認識するモノクローナル抗体を用いて
スクリーニングする。 ｅ） λＥＬＲ１〜６と命名される６個のプラークがこ
のようにして単離及び精製される（図３および図４）。
これらのｃＤＮＡインサートを制限エンドヌクレアーゼ
マッピングにより分析し、共通領域を有することが判明
し、それらがモノクローナル抗体により認識されるラミ
ニンレセプターのエピトープをコード化することを示す
（図５）。 ｆ） ６個の精製相の最も大きいｃＤＮＡインサートを
プラスミドベクター中にサブクローン化して更に分析及
びＤＮＡ配列決定を容易にする。λｇｔ１１の左腕にｃ
ＤＮＡインサートを連結するＥｃｏＲＩ部位は全ての六
つのクローンに存在しない。従ってＰｖｕII部位１１ｂ
ｐ下流を利用して、最も大きい組換えファージλＥＬＲ
４からｃＤＮＡインサートを精製する。λＥＬＲ４のＥ
ｃｏＲＩ‐ＰｖｕII制限断片をｐＢＲ ３２２のＥｃｏ
ＲＩ‐ＰｖｕII部位中にサブクローン化してｐＬＲ４−
１を作成する。 【００２１】本発明に従って得られた宿主Ｅ．コリ株Ｃ
６００ｒ- ｍ- （ＡＴＣＣ ３３５２５）中に形質転換
された組換えｃＤＮＡクローンｐＬＲ４−１の寄託は受
理番号６７１９９号でアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（American Type Culture Collection,
(ATCC)、メリーランド州ロックビル）になされた。要求
によりＰＴＯの長官はこの寄託物を入手でき、特許発効
時にはこの寄託物は最後の要求後少なくとも５年間或い
は少なくとも３０年間、或いは特許の有効期間生育可能
に維持され、勿論、法律の規定に従って制限なしに公衆
に利用可能とされる。 【００２２】本発明の確定的に同定する方法は組換えプ
ラスミドのｃＤＮＡ配列（図７および図８）を精製胎盤
ラミニンレセプターのシアノーゲンブロマイド‐生成オ
クタペプチドのアミノ酸配列との比較に基づく。オクタ
ペプチドアミノ酸配列を得るための方法論はより詳細に
例Ｉに説明され、周知の標準的技術を含む次の一般工程
を包合する： ａ） ヒト胎盤組織からのミクロゾーム膜を調製し、可
溶化する。 ｂ） 可溶化されたミクロソーム膜含有調製物を精製ラ
ミニン‐Sepharose ４Ｂのアフィニティマトリックスを
通過させ、十分洗浄後高アフィニティラミニンレセプタ
ータンパク質を高濃度塩水（１Ｍ ＮａＣｌ）によりリ
ガンドから溶出する。 ｃ） ヒト胎盤ラミニンレセプターの均質性を二次元ゲ
ル電気泳動（図１）及び酵素結合免疫吸着剤アッセイ
（ＥＬＩＳＡ）（図２）によりアッセイする。 ｄ） ヒト胎盤ラミニンレセプターをシアノーゲンブロ
マイドで切断し、得られたペプチド類を逆相高圧液体ク
ロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により分画する。 ｅ） 胎盤オリゴペプチドのミクロ配列分析は独特の配
列Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−
Ｌｅｕ−Ａｒｇを有するオクタペプチドを露わす。 【００２３】本発明の別の同定方法はヒト転移乳癌ラミ
ニンレセプターに向けられたウサギ抗血清のｐＬＲ４−
１のｃＤＮＡ配列から生成した合成ペプチド（図９）を
同定（ＥＬＩＳＡにより）する能力を求める。この抗ラ
ミニンレセプター抗血清を得る方法論は更に詳細に例IV
において説明されており、周知の標準的技術を含む次の
一般的工程を包合する： ａ） ラミニンレセプターを胎盤ラミニンレセプターに
対して上記に説明したようにヒト転移乳癌から精製す
る。 ｂ） 腫瘍ラミニンレセプターの均質性を胎盤ラミニン
レセプターに対して上記説明の如く評価する。 ｃ） ＮａＤｏｄＳＯ４‐ポリアクリルアミドゲルから
切出した腫瘍ラミニンレセプターの皮下注射によりウサ
ギを免疫化する。 【００２４】ヒト癌細胞などのラミニンレセプターｍＲ
ＮＡを含む細胞の診断アッセイが癌の診断及び予知にお
ける有用な道具として開発されてきた。ラミニンレセプ
ターｍＲＮＡ含量のアッセイ方法は更に詳細に例Ｖにお
いて説明され、周知の標準的技術に従う次の一般的工程
を包合する： ａ） 全細胞ＲＮＡを組織標本或いは細胞から単離す
る。 ｂ） ＲＮＡを変性アガロースゲルを通して変性及び電
気泳動させ、濾紙に移す。 ｃ） ＲＮＡを含む濾紙を放射線標識化ラミニンレセプ
ターｃＤＮＡにハイブリダイズさせる。 ｄ） 洗浄後、フィルターを十分な時間Ｘ‐線フィルム
に曝露し、放射線活性プローブのイメージを得る。 ｅ） フィルム上のバンドの相対的強度がラミニンレセ
プターｍＲＮＡの目安である（図１０）。 ｆ） 或いは又上記工程（ｂ）の代りに変性ＲＮＡの小
アリコートを直接に濾紙に結合した後工程（ｃ）〜
（ｅ）を行う。 ｇ） 放射線標識化ラミニンレセプターｃＤＮＡは又in
situ で組織断片及び細胞にハイブリダイズさせてラミ
ニンレセプターｍＲＮＡを発現する特定細胞集団を決定
することもできる。 【００２５】転移細胞におけるラミニンレセプターｍＲ
ＮＡの増加した含量は変化したラミニンレセプターＤＮ
Ａを含有する細胞の診断アッセイの開発に役立つ。この
方法論は各種遺伝病に対して見出だされてきた制限断片
長の多形性の可能性のある存在に基づく。腫瘍のゲノム
或いは転移細胞におけるラミニンレセプター遺伝子の増
幅も又評価されてよい。ラミニンレセプターゲノムＤＮ
Ａの分析方法は周知の標準的技術に従って、次の一般的
工程を包合する： ａ） 高分子量ゲノムＤＮＡを例VIに説明するように組
織標本或いは細胞から単離する。 ｂ） ＤＮＡを各種制限エンドヌクレアーゼにより消化
し、アガロースゲルを通して電気泳動させ濾紙に移す。 ｃ） ＤＮＡを含有するフィルターを放射線標識化ラミ
ニンレセプターｃＤＮＡにハイブリダイズさせる。 ｄ） 洗浄後、フィルターをＸ‐線フィルムに曝露し、
フィルム上のバンドのパターンを正常組織からのそれと
比較する。 【００２６】ｐＬＲ４−１のｃＤＮＡ配列から生成した
合成ペプチド類は転移の形成を抑制する癌の治療におい
て有用である。本発明において説明される方法は基底膜
は良性新生物における連続構造であり、又、良性細胞上
のラミニンレセプターは基底膜への結合により占められ
ているという観察に基づくものである。これに対して、
侵略腫瘍細胞に隣接した基底膜は連続的ではない。侵略
腫瘍細胞はこのようにリガンドに結合していない細胞表
面上に発現された増大した数のラミニンレセプターを有
する。癌の管理及び診断において重要な概念であるのは
転移癌細胞上のラミニンレセプター部位の利用可能性で
ある。癌の腫瘍細胞が一次腫瘍部位から隣接正常組織に
移動する傾向及びその体の遠方部位に広がり、転移クロ
ーンを開始する性向と定義される癌の攻撃性は、次いで
部分的により多くの利用可能なラミニンレセプターを有
する侵略性細胞の数の一つの反映である。 【００２７】ｐＬＲ４−１のｃＤＮＡ配列から生成する
合成ペプチド類は放射線標識化ラミニンに特異的に結合
する（図１３）。ラミニン結合アッセイにおけるこの合
成ペプチドの存在は細胞がラミニンに結合する能力を阻
害した（図１２）。このように、合成ペプチドは細胞表
面ラミニンレセプターがラミニンに結合する能力と拮抗
及び妨害する。ペプチドが混合ＢＬ６メラノーマ細胞で
あり、マウスに静脈内注射した場合にＢＬ６細胞からの
転移の数は減少した（表１）。如何なる理論にも拘束さ
れるものではないが、合成ラミニンレセプター断片は基
底膜に対して直ちに結合することに対して細胞と拮抗し
て転移細胞のコロニー化を防止するものと思われる。 【００２８】上記に基づき、本発明を用いて、各種方法
で癌並びに細胞によるラミニンの異常な認識から生ずる
その他の病気の診断及び治療における有効な合成ペプチ
ドとその断片を得ることができることは明らかである。 【００２９】 【実施例】以下に、本発明を例示する具体例を説明す
る。 例Ｉ：独特なヒト胎盤ラミニンレセプターオクタペプチ
ドの同定 Ａ．材料及び方法 １．組 織 ヒト乳癌及び大腸癌に由来する肝臓転移からの組織を国
立癌研究所病理学実験室（Laboratory of Pathology,Na
tional Cancer Institut）及びグロストラップ病院病理
学部（Department of Pathology, Glostrup Hospital、
コペンハーゲン）から得た。正常期間出産から得られた
ヒト胎盤は国立海軍医療センター（National Naval Med
ical Center,メリーランド州、ベセスダ）により提供さ
れた。 【００３０】２．ラミニンレセプターの精製 腫瘍組織（１００〜３００ｇ）或いは胎盤組織（５００
ｇ）を５容（wt/vol）のリン酸緩衝化塩水（１３７ｍＭ
ＮａＣｌ／１．７ｍＭ Ｋｃｌ／８．１ｍＭＮａ２Ｈ
ＰＯ４／１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２）中に
おいて、Waringブレンダー内においてホモジナイズし
た。この緩衝液及び以下の緩衝液に対して次のプロテア
ーゼ阻害剤を添加した：５０μｇ／mlフェニルメチルス
ルホニルフルオライド、５ｍＭベンズアミジン、１０μ
ｇ／mlアプロチニン、５０μｇ／ml大豆トリプシン阻害
剤及び５ｍＭベーターヒドロキシ水銀安息香酸。５００
×ｇで１０分間遠心分離後、ホモジネートを０．３Ｍス
クロース／２５ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．３中
で１：１（vol ／vol ）に希釈し、氷上でブリンクマン
ポリトロン（Brinkman Polytron)で超音波処理し、１
５，０００×ｇで４℃において２０分間遠心分離し、更
に上澄液を１４３０００ｘｇで４℃において９０分間超
遠心分離した。得られたペレット内のミクロゾーム膜を
２５ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．３／１５０ｍＭ
ＮａＣｌ／１ｍＭ ＣａＣｌ２／３ｍＭ ＭｇＣｌ２
中１０mgタンパク質／mlで再懸濁し、等容量の１％オク
チルフェノリポリエトキシエタノール（Nonidet P-40,
Sigma)／２５ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．２／１
５０ｍＭ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＣａＣｌ２／３ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２中に希釈し、４℃で６時間エンド‐オーバー・
エンド(end-over-end)回転で抽出した。この調製物を２
００，０００×ｇで４℃において１時間超遠心分離し、
次いで上澄液を２mgのラミニン（ティンプル等Timpl, e
t al., J.Biol. Chem., 254: 9933-9937(1979)に説明さ
れたように精製された）をmlのＣＢｒＮ‐活性化Sephar
ose ４Ｂ（Pharmacia ）にカップリングさせることによ
り調製された２mlのSepharose ラミニンアフィニティマ
トリックスと共に４℃で１０時間インキュベートした。
Sepharose ‐ラミニンマトリックスを次いで１０回２５
ｍＭＴｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．３／１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ／１ｍＭ ＣａＣｌ２／１ｍＭＭＧＣｌ２／０．０
５％ Nonidet Ｐ‐４０中で洗浄し、及び１回４００ml
ＮａＣｌを含有する緩衝液中で洗浄した。このラミニ
ン‐Sepharose マトリックスを次いで２mlカラム中に充
填した。タンパク質画分を室温で１ＭＮａＣｌ／５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．３で溶出し、直ちに氷
上に置き、冷蒸留Ｈ２Ｏに対して透析し、凍結乾燥によ
り濃縮した。 【００３１】３．シアノーゲンブロマイド消化及びマイ
クロ配列決定 精製ラミニンレセプターをシアノーゲンブロマイドでオ
ーゾールス等〔Ozolset al., J. Biol, Chem., 252:598
6-5989 (1977)〕により説明されるように消化し、４０
０μｌの０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリルに
溶解し、逆相２５cm×４．１mm ＰＲＰ‐１カラム（Ha
milton）上で２００μｌの二つの注入として２ml／分の
流速で運転した。シアノーゲンブロマイド‐発生断片の
アミノ酸配列決定を製造者のプログラム０３ ＲＰＴＨ
を用いる付属モデル１２０Ａ ＰＴＨ‐アナライザーを
有するモデル４７０Ａ気相タンパク質シークエンサー
（Applied Bio Systems 、フォスターシテー、カリフォ
ルニア州）を用いて行った。 【００３２】４．酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩ
ＳＡ） ＥＬＩＳＡはエングバル(Engvall、Methods Enzymol.，
70: 419-439 (1980)）に従って行った。アッセイされた
抗体はリオッタ等（Liotta, et al., Exp. Cell Res.,
156: 117-126 (1985) ）により説明されたようなヒトラ
ミニンレセプターに対するＩｇＭマウスモノクローナル
抗体２Ｈ５（ＬＲ‐１）、ウサギ抗‐ヒトアルブミン
（Miles ）及び‐アミラーゼに対するＩｇＭマウスモノ
クロナール抗体（国立歯科研究所 National Institute
of Dental ResearchのＲ．シラガニアン R. Siraganian
から得られた）を包含した。結合抗体はペルオキシダー
ゼ‐複合ウサギ‐抗マウスＩｇＭ（キエルケガード・ア
ンド・ペリー・ラボラトリーズ Kierkegaard and Pery
Laboratories, メリーランド州、ガイザースバーグ）或
いはペルオキシダーゼ‐複合ヤギ抗‐ウサギＩｇＧ（Ki
erkegaard and PerryLaboratories）を用いて検出し
た。 【００３３】５．ゲル電気泳動 タンパク質試料はレムリ（Laemmli, Nature （ロンド
ン）、227: 680-685 (1970) ）の方法によりジチオスレ
イトールの存在下においてＮａＤｏｄＳＯ４‐ポリアク
リルアミドゲル電気泳動により分析した。等電集中及び
二次元ＮａＤｏｄＳＯ４‐ポリアクリルアミドゲル電気
泳動はオファレス（O'Farrell, J. Biol.Chem., 250: 4
007-4021 (1975)）及びビルス等（Wirth et al.,Cancer
Res., 46: 400 〜413 (1986)）により説明されたよう
に行われた。免疫ブロッティングはリオッタ等（Liott
a, et al. (1985) 、前掲）により説明されたように抗
ラミニンレセプターモノクローナル抗体を用いて行われ
た。 【００３４】Ｂ．結 果 １．ヒトラミニンレセプターの精製 調製量の精製ラミニンレセプターの単離はヒト転移乳癌
及び大腸癌及びヒト胎盤組織からの可溶化ミクロゾーム
膜含有調製物をラミニン‐Sepharose ４Ｂのアフィニテ
ィマトリックスにかけ、次いでアフィニティマトリック
スの十分な洗浄及び高濃度塩水（１Ｍ ＮａＣｌ）によ
るリガンドからのレセプタータンパク質の溶出により達
成された。ＮａＤｏｄＳＯ４‐ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（図１上段）により分析すると、乳癌及び大腸
癌からの精製タンパク質はより厳密性の少ない条件下で
単離されたヒト乳癌ラミニンレセプターについて、先に
報告されたように、約みかけＭｒ＝６８，０００〜７
２，０００を有した。この精製操作の結果薬２０μｇ／
１００ｇの腫瘍組織及び２μｇ／１００ｇの胎盤組織の
レセプタータンパク質収率が得られた（可溶化ミクロゾ
ーム膜調製物中約０．０２％のタンパク質）。これらの
乳癌、大腸癌及び胎盤からの精製ラミニンレセプター調
製物を標準的操作に従ってヨード化し、二次元ゲル電気
泳動により分析して調製物の均質性を評価した。代表的
な腫瘍ラミニンレセプターのオートラジオグラフを図１
下段に示す。ラミニンレセプターのみかけｐＩは６．４
±０．２である。図１下段は延伸スポットを示すが、異
ったｐＨ範囲及び免疫ブロッティング（前記Liotta等
（1985）らにより説明されるような）におけるその他の
ゲルは単一ポリペプチド鎖と一致する。 【００３５】これらの三つの源泉からの精製ラミニンレ
セプター調製物をマイクロタイターウエル内で固定し、
一群の抗体と反応させて更に調製物の純度及びアミニン
或いはアルブミンによる汚染の欠乏を示した。全ての場
合において、ヒトラミニンレセプターＬＲ‐１（２Ｈ
５）に対するＩｇＭマウスモノクローナル抗体は陽性に
反応したのに対し、ウサギ抗‐ヒトアルブミン及びα‐
アミラーゼに向けられたクラス適合ＩｇＭマウスモノク
ローナル抗体は反応しなかった。代表的ＥＬＩＳＡを図
２に示す。 【００３６】２．胎盤ラミニンレセプターのシアノーゲ
ンブロマイドペプチドのマイクロ配列分析 そのままのラミニンレセプター分子を直接に配列決定す
るための繰返された試みは、おそらくアミノ末端の保護
により成功しなかった。従って、レセプタータンパク質
をシアノーゲンブロマイドで切断し、得られたペプチド
を逆相ＨＰＬＣにより分画した。胎盤オリゴペプチドの
マイクロ配列分析は、配列Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａ
ｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇを有するペプチ
ドを現わした。同族体に対するコンピュータの助けを借
りた探索（ウィルバー及びリップマン、Wilber and Lip
man,Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 726-730 (1983) ）は
このオクタペプチドが独特のものであることを示した。 【００３７】例II：ヒトラミニンレセプターｃＤＮＡク
ローンの単離 Ａ．材料及び方法 １．細胞培養 ヒト臍帯静脈内皮細胞の単層培養物をジェイ等（Jaye,
et al. Science 228:882-885 (1985)）により説明され
るように生育した。 【００３８】２．ＲＮＡの調製 全細胞ＲＮＡをチルギン等（Chirgwin, et al., Bio-ch
emistry, 18: 5294-5299 (1979) ）により説明されるグ
アニジニウムイソチオシアネート‐セシウムクロライド
密度法により培養物中の細胞層から抽出した。ポリ
（Ａ）‐含有ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロース（タイ
プ３、コラボラティブ・リサーチ Collaborative Resea
rch ）上のクロマトグラフィによりアヴィブ及びレーダ
ー（Aviv andLeder, Proc. Natl. Acad. Sci., 69:1408
-1412 (1972) ）の方法に従って単離した。 【００３９】３．ｃＤＮＡの合成 オリゴ（ｄＴ）‐選択ヒト内皮ＲＮＡをブェル等（Buel
l, et al., J. Biol Chem. 253:2471-2482 (1978) ）の
方法によりｃＤＮＡの合成のための鋳型として用い、２
本鎖ｃＤＮＡをウィッケンス等（Wickens, et al., J．
Biol. Chem. 253: 2483-2495 (1978) ）により説明され
るようにして調製した。このｃＤＮＡをウルリッチ等
（Ullrich, et al., Science, 196: 1313-1319 (1977)
）により説明されるようにしてＳ１ヌクレアーゼで平
滑末端にし、引続くＥ．コリ ＤＮＡポリメラーゼＩの
クレノウ断片による処理をウォーテル及びレニコフ（Wa
rtelland Resnikoff, Gene, 9: 309-319 (1980)）によ
り説明されるようにして行った。このｃＤＮＡを次いで
ＥｃｏＲＩメチラーゼで修飾し、ＥｃｏＲＩリンカーに
連結し、及びヒュイン等（Huynh, et al., DNA Cloning
Volume 1: a practicalapproach, D.M.Glover 編、IRL
Press Ltd., 英国オックスフォード４９−７８頁（１
９８５））により説明されるようにしてＥｃｏＲＩで徹
底的に消化した。 【００４０】４．ヒト内皮λｇｔ１１ ｃＤＮＡライブ
ラリーの造築及びスクリーニング ＥｃｏＲＩ‐連結ｃＤＮＡを上記ヒュイン（Huynh ）
（１９８５）により説明されるようにしてＥｃｏＲＩ消
化及びホスファターゼ処理λｇｔ１１に連結した。この
組換え相をエンキスト及びスターンバーグ（Enquist an
d Sternberg 、Methods Enzymol., 68: 281-298(1979)
）により説明されるようにしてパッケージし、上記ヒ
ュイン（Huynh)（１９８５）により説明されているよう
にしてＥ．コリ Ｙ１０８８（ＡＴＣＣ ３７１９５）
中で増幅した。Ｅ．コリ Ｙ１０９０（ＡＴＣＣ ３／
１９）細胞を内皮細胞λｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリ
ーで感染させ、抗‐ラミニンレセプターモノクローナル
抗体２Ｈ５（リオッタ等 Liotta et al., Exp. Cell Re
s., 156: 117-126 (1985) ）を用いてヤング及びデービ
ス（Young and Davis 、Science, 222: 778-782 (198
3)）により説明されるようにしてラミニンレセプターβ
‐ガラクトシダーゼ融合タンパク質の抗体認識により１
５０万個のプラークをスクリーニングした。この抗体は
ラミニンレセプターのリガンド結合を認識するか或いは
妨害する（上記リオッタ等 Liotta et al.,(1985)）及
びトーゴー等 Togo et al, Basement Membrans, S. Shi
bata編、ニューヨーク州、エルセヴィア、３２５〜３３
３頁（１９８５））。抗体結合は上記例１ Ａ４で説明
したように、ペルオキシダーゼ‐複合アフィニティ精製
ウサギ抗‐マウスＩｇＭを用いて検出した。陽性プラー
クをベントン及びデービス（Benton and Davis, Scienc
e, 196：180-182 ）により説明されるようにして同定、
増幅及び再スクリーニングして精製した。プラークを含
有するフィルターを抗‐ヒトα‐アミラーゼ及び抗‐ヒ
トアルブミン（上記例１４Ａに説明された通りのもの）
並びに抗‐ラットラミニン（アルブレクトセン等 Albre
chtsen, et al.,Cancer Res., 41: 5076-5081 (1981)
）を包合するコントロール抗体に対して反応させた。 【００４１】５．サザーンブロットハイブリダイゼーシ
ョン ファージＤＮＡはマニアチス等（Maniatis, et al., Mo
lecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold SpringHa
rbor Laboratory 、ニューヨーク州、コールドスプリン
グハーバー、７７−８５頁（１９８２））により説明さ
れたようにして単離された。制限エンドヌクレアーゼ‐
消化ＤＮＡをアガロースゲルを通して電気泳動させ、ニ
トロセルロース紙に移し、及びサザーンの方法（Southe
rn, Methods Enzymol., 68: 152-176 (1979)）によりハ
イブリダイズさせた。32Ｐ‐標識化プローブをマニアチ
ス等（Maniatis, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.、7
2:1184-1188 (1975)）に説明されるようにしてニックト
ラスレーションにより調製した。 【００４２】６．プラスミド及びｃＤＮＡインサートの
サブクローニング及び調製 ｃＤＮＡインサートをλｇｔ１１の左腕に結合するＥｃ
ｏＲＩ部位は全ての６個のクローン中に存在しない。従
って、ＰｖｕII部位１１ｂｐ下流を利用して最大の組換
えファージＥＬＲ４からｃＤＮＡインサートを精製し
た。λＥＬＲ４のＥｃｏＲＩ−ＰｖｕII制限断片をｐＢ
Ｒ３２２のＥｃｏＲＩ‐ＰｖｕII部位にサブクローニン
グしてｐＬＲ４−１を作成し、及びｐＵＣ８のＥｃｏＲ
Ｉ‐ＨｉｎｄIIポリリンカー部位にサグクローニングし
てｐＬＲ４−２を作成した。引続き、長いポリ（Ａ）尾
部からｃＤＮＡ配列決定を容易にするためにｐＬＲ４−
１のＥｃｏＲＩ‐ＰｓｔＩ制限断片をｐＢＲ３２２のＥ
ｃｏＲＩ‐ＰｓｔＩ部位にサブクローニングしてｐＬＲ
４−４を作成した。ｐＢＲ３２２の組換え体をＥ．コリ
Ｃ６００ｒｍ（ＡＴＣＣ ３３５２５）中に形質転換
し、及びｐＵＣ組換え体をＥ．コリ ＪＭ １０３中に
形質転換した（メッシング等、Messing, et al., Nucle
ic Acids Res., 9: 309-321 、マンデル及びヒガ（Mand
el and Higa, J. Mol. Biol., 53: 159-162 (1970)）の
塩化カルシウム法による）。スーパーコイル化プラスミ
ドＤＮＡをビルンボイン及びドリー（Birnboin and Dol
y, Nucleic Acids Res., 7: 1513- 1523 (1979) ）によ
る方法に従ったエチジウブロマイド‐セシウムクロライ
ド中の平衡遠心分離後にフルカリ溶解により回収した。
ｃＤＮＡインサートを制限ＤＮＡから単離し、アクリロ
アミドゲルからソーベル等（Sobel,et al., Proc. Sc
i., 75: 5846-5850 (1978)）により説明されるようにし
て溶出した。 【００４３】Ｂ．結 果 １．抗体認識によるラミニンレセプターｃＤＮＡの選択 ヒト内皮細胞λｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリーを抗‐
ラミニンレセプターモノクローナル抗体２Ｈ５を用いて
スクリーニングした。上記材料及び方法において説明さ
れるように、この抗体は（ａ）免疫ブロット上のラミニ
ンレセプターを特異的に認識し、（ｂ）ＥＬＩＳＡによ
り精製ラミニンレセプターを認識し（図２）、（ｃ）血
漿膜或いは細胞のいづれかへのラミニンの結合を妨害
し、及び（ｄ）細胞の羊膜基底膜への結合を阻害する。
これらの性質は明らかに、このモノクローナル抗体がラ
ミニンレセプターのラミニン結合領域を認識するか或い
は妨害することを示す。６個のプラークを先ず選択し
た。プラーク精製後、λＥＬＲ１−６と命名された全て
の６個のファージは抗‐ラミニンレセプターモノクロー
ナル抗体と激しい反応を示したが、しかし、ヒトα‐ア
ミラーゼに向けられたクラス適合（ＩｇＭ）モノクロー
ナル抗体或いはラミニンに対して向けられた或いはアル
ブミンなどのラミニンレセプターと大きさの同様なタン
パク質に向けられた抗体のいずれにも何等の反応性も示
さなかった（図３および図４）。 【００４４】２．λＥＬＲ１〜６の共通領域 ６個のファージ、λＥＬＲ１〜６の制限エンドヌクレア
ーゼ消化はｃＤＮＡインサートの３′末端をλｇｔ１１
の左腕に結合するＥｃｏＲＩ部位は全ての６個のファー
ジにはないことを示した。ＳａｃＩ、ＫｐＩ、Ｈｉｎｄ
III及びＥｃｏＲＩを用いる単一、二重及び三重エンド
ヌクレアーゼ消化を行って、λＥＬＲ１〜６のマッピン
グを行った。図４にまとめて示されるこれらの実験は、
（ａ）ｃＤＮＡインサートの大きさは約４５０〜９７５
ｂｐの範囲であり、（ｂ）全てのクローンはクローンの
３′末端から約４５０〜５００ｂｐの内部ＳａｃＩ部位
を共有し、（ｃ）λＥＬＲ６のインサートは内部Ｓａｃ
Ｉ部位に僅かに約２０ｂｐ５′延びるにすぎず、及び
（ｄ）λＥＬＲ１及びλＥＬＲ４のインサートは５′Ｅ
ｃｏＲＩ部位からそれぞれ約３０及び４０ｂｐのＨｉｎ
ｄ III部位を共有することを示した。これらの６個の組
換えファージはこのようにＳａｃＩ部位への丁度５′か
ら各ｃＤＮＡインサートの３′末端までに延圧する共通
の４５０〜５００ｂｐ領域を有し、この領域がモノクロ
ーナル抗体２Ｈ５により認識される領域をコード化する
ことを示唆する。この観察は６個の組換えファージの各
々からＤＮＡのＫｐｎＩ‐ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩ‐Ｓ
ａｃＩ二重消化物がλＥＬＲ４から単離されたＰｓｔＩ
‐ＳｐｈＩ制限断片にストリンジェントにハイブリダイ
ズされたサザーンブロット実験により試験された。図４
に示される代表的ハイブリダイゼーション実験は全ての
６個の組換えファージの共通４５０〜５００ｂｐ領域が
モノクローナル抗体２Ｈ５により認識される抗原領域を
コード化することを示す。 【００４５】例III ：ｃＤＮＡ配列決定 Ａ．材料及び方法 １．ＤＮＡ配列決定 λＥＬＲ４からのｃＤＮＡは図６に示される術策に従っ
て配列決定された。ギルバート及びマクサム（Gilbert
and Maxam, Proc. Natl. Acad. Sci., 70:3581-3584 (1
973)）の両方の化学的修正方法が用いられた。前者の場
合において、上記例IIＡ６に説明されるサブクローンｐ
ＬＲ４−１、ｐＬＲ４−２及びｐＬＲ４−４のｃＤＮＡ
制限断片は５′末端を、上記ギルバート及びマクサム
（１９７３）により説明されるようにＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（Boehringer-Mannheim ）及び（γ‐
Ｐ32）ＡＴＰにより処理するか、或いは３′テーリィン
グキット（Amersham）を用いて（α‐Ｐ32）ジデオキシ
ＡＴＰで３′末端をテーリングすることにより標識化し
た。ジデオキシ合成法の場合には、ＥＬＲ４のＥｃｏＲ
Ｉ‐ＳａｃＩ制限断片をＭ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ
１９中にサブクローン化した（ヤニッシュ‐ペラン等 Y
anisch-Perran, et al., Gene, 33: 103-119(1981)）。 【００４６】Ｂ．結 果 １．λＥＬＲ４のｃＤＮＡインサートのヌクレオチド及
び演繹アミノ酸配列 λＥＬＲ４のｃＤＮＡインサートの配列はλｇｔ１１ベ
クターの右腕のＥｃｏＲＩ挿入部位と一致する２５３個
のアミノ酸開放読取り枠を示す。２Ｈ５エピトープ（上
記例II Ｂ２参照）により認識される「共通領域」の配
列は図７および図８のヌクレオチド３６１からヌクレオ
チド７６５まで延びる。それは上記例Ｉｂ２に説明され
る胎盤ラミニンレセプターの精製シアノーゲンブロマイ
ド‐発生オリゴペプチドのそれと同一のオクタペプチド
コード化配列（ヌクレオチド４０９〜４３２）を包合す
る。この配列内にはラミニンレセプターのカルボキシ末
端に向かう３個のアミノ酸により分離された６個のアミ
ノ酸繰返しがみられる。このアミノ酸繰返しをコード化
するｃＤＮＡ配列は同一ではない（ヌクレオチド６７０
〜６８７及び６９７−７１４）。オーカー停止コドンに
引続き、λＥＬＲ４ ｃＤＮＡインサートは長いポリ
（Ａ）伸長から上流の標準的なポリアデニル化シグナル
ＡＡＴＡＡＡ １７ｂｐを含む６６ｂｐの３′未翻訳領
域を含む。３′未翻訳領域及びポリ（Ａ）尾部の長さを
差し引いた後、λＥＬＲ１〜６の共通ｃＤＮＡ領域によ
り規定されるような２Ｈ５エピトープの最大の可能性の
ある程度は３９３ｂｐ即１３１個のアミノ酸まで狭めら
れうる。ウィルバン及びリップマン(Wirbun and Lipma
n，Proc. Natl. Acad. Sci., 80: 726-730 (1983)）の
方法によるコンピュータ分析は公知のタンパク質配列へ
の有意な同族性を示さない。 【００４７】ラミニンレセプターの潜在的膜張渡し領域
は図７および図８の５２〜８４のヌクレオチドによりコ
ード化される１１個のアミノ酸疎水性ポリペプチドを含
み得ることが認められる。 【００４８】例IV：ｃＤＮＡ‐由来合成ラミニンレセプ
ターペプチドの抗体認識 Ａ．材料及び方法 １．抗血清の調製 ラミニンレセプターはヒト転移乳癌から上記例Ｉ Ａ１
と同様にして精製した。２０μｇの精製ラミニンレセプ
ターを上記例Ｉ Ａ５と同様にしてＮａＤｏｄＳＯ４‐
ポリアクリルアミドゲルを通して電気泳動し、ゲルから
切出した。ウサギをアルブレックセン等（Albrecktsen,
et al., Cancer Res. 41: 5076-5081 (1981)）により説
明されるようにしてタンパク質で免疫化した。血清を抗
原注射開始前（前免疫血清）及び各ブースター注射後１
０日目に集めた。 【００４９】２．ＩＬＩＳＡ ＩＬＩＳＡは上記例IV Ａ１で説明したようにして得ら
れた前免疫及び免疫血清を用いて、上記例ＩＡ４と同様
に行った。 【００５０】３．合成ペプチドＲＴＬＲ２ 配列： Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ −Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ −Ｔｈｒ−Ａｌａ を含有するＲＴＬＲ２と命名される合成ペプチドは周知
の標準的方法に従ってペニンスラ・ラボラトリーズ社
（Penninsula Laboratories, Inc. カリフォルニア州ベ
ルモント）により提供された。この配列は図７および図
８におけるヌクレオチド６６７−７２６から選ばれた。 【００５１】Ｂ．結 果 １．抗‐ラミニンレセプター抗血清による合成ペプチド
の認識 λＥＬＲ４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列６６７−７２
６（図７および図８）を用いてペプチド配列を予測し
た。合成ペプチドＲＴＬＲ２（例IVＡ３）は腫瘍ラミニ
ンレセプターに対して向けられたウサギ抗血清によるＥ
ＬＩＳＡにおいては認識されたが、しかし前免疫血清に
よっては認識されなかった（図９）。このペプチドは例
III Ｂ２において説明された二つの６個のアミノ酸繰返
しを含み、予測された反転立体配置を有する。 【００５２】例Ｖ：ラミニンレセプターｃＤＮＡのＲＮ
Ａへのハイブリダイゼーション Ａ．材料及び方法 １．細胞系 ＭＣＦ‐７ヒト乳癌細胞系（親）はミシガン癌財団（Mi
chigan Cancer Foundation）により提供された。二つの
クローン化ＭＣＦ‐７細胞系ＭＣＦ７‐５Ｈ＆及びＭＣ
Ｆ７‐３Ｅ５はＰ．ホランハンド（P. Horan Hand ，Na
tional CancerInstitute ）から得られ、グライナー等
（Greiner, et al., Int. J. Cancer, 36: 159-166 (19
85) ）により説明されている。ＺＲ‐７５ヒト乳癌系は
エンゲル及びヤング（Engel and Young, Cancer Res.，
38: 4327-4339 (1978)）により説明され、Ｌ．エンゲル
（L. Engel, National Cancer Institute ）から得ら
れ、及びヒト腎癌系Ａ‐７０４はＳ．アーロンソン（S.
Aaronson, National CancerInstitute ）から得られ、
ギャード等（Giard, et al., J. Natl. Cancer Inst.,
51: 1417-1423 (1973)）により説明されている。ヒトＰ
ａｎｃ‐１細胞系はアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（American Type Culture Collection）か
ら得られた。ネズミＮＩＨ‐３Ｔ３細胞及びそのキルス
テン（Kirsten）ウイルス‐形質転換誘導体（ＫＮＩ
Ｈ）は、Ｍ．ゴッテスマン（M. Gottesman, National C
ancerInstitute）から得られ、それらの生育はゴッテス
マン（Gottesman, Proc. Natl. Acad. Sci., 75:27657-
2771(1978)）により説明されている。ネズミＦ９奇形癌
細胞及びそれらのジフチリル環状ＡＭＰプラスレチン酸
分化誘導体（ストリックランド等 Strickland, et al.,
Cell ，21: 347 〜355 (1980)）は、Ｗ．アンダーソン
（W.Anderson, National Cancer Institute ）から得ら
れた。ラットＬ２細胞系はユーワー（Wewer, Dev. Bio
l., 93:416-421 (1982)）により説明されている。 【００５３】２．ＲＮＡの調製 ＲＮＡは上記例IIＡ２と同様にして細胞培養物から或い
はストローマン等（Strohman, et al., Cell, 10:265-2
73 (1977) ）により説明されているグアニジン‐塩酸塩
法により調製された。 【００５４】３．ノーザンハイブリダイゼーション ５μｇの全細胞ＲＮＡをメチル水銀／アガロースゲル上
で分離し、ソーベル等（Sobel, et al., Biochemistry
，20: 2678-2684 (1981)）により説明されているアル
ウィン等（Alwine, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,
74: 5350-5354 (1977)）の方法によりジアゾベンジルオ
キシメチルセルロース紙（シュライヒャー及びシューエ
ルSchleicher and Schuell）に移した。フィルターを上
記例II Ａ５と同様にしてニックトランスレーションさ
れたｃＤＮＡインサートにハイブリダイズした。ラジオ
オートグラフの各種時間曝露を濃度測定法により測定し
て線形応答範囲を求めた。ブロットをアクチンｃＤＮＡ
プローブ（クリーブランド等Cleveland, et al., Cell,
20：95-105 (1980) により説明された）を用いて、及
び熱衝撃ｃＤＮＡプローブ（ヒッケイ等Hickey, et a
l., Gene，43: 147-154(1986)により説明された）を用
いて逆スクリーニングして等量のＲＮＡが移されたこと
を確認した。 【００５５】４．ラミニン結合アッセイ 各細胞系の細胞当りのラミニンレセプターの数をリオッ
タ等（Liotta, et al., Exp. Cell Res. 156: 117-126
(1985) ）により説明されたように対数生育期細胞に対
する特異的結合（ 125Ｉ）‐標識化ラミニンのScatchar
d プロットから計算した。 【００５６】Ｂ．結 果 １．ヒトラミニンレセプターｍＲＮＡの発現 ラミニンレセプターの量及び表面分布は各種癌性ヒト組
織において異ることが従来報告された（ホランハンド等
Horan Hand et al., Cancer Res., 45: 2713-2719 (19
85) ）。一般的に、悪性組織はそれらの細胞表面上によ
り多くの未占有ラミニンレセプターを有し、それらのよ
り良性の対照物よりもより多くのラミニンに結合する。
ラミニンレセプターｍＲＮＡレベルがリガンド結合に利
用可能な細胞表面ラミニンレセプターの量の決定に役割
を果たすか否かを決定するためにノーザンブロット実験
が行われた（図１０）。ラミニンレセプターｃＤＮＡイ
ンサートは推定された大きさのラミニンレセプターを有
するタンパク質をコード化するのに十分な長さの約１７
００ベースのｍＲＮＡを認識する。各種ヒト表皮細胞系
からのハイブリダイズされたＲＮＡのレベルは異った。
特に、転移乳癌細胞系ＭＣＦ‐７からのＲＮＡに対して
は、非転移乳癌細胞系ＺＲ‐７５からのＲＮＡに対する
よりも大きなハイブリダイゼーションがあった。一般的
にハイブリダイズしたＲＮＡのレベルは直接ラミニン結
合アッセイと相関関係があり（図１１）、レセプターの
生合成に利用可能なラミニンレセプターｍＲＮＡの量は
ラミニン基底膜への細胞結合の調節における律速制御工
程であることを示唆する。よって、ヒト腫瘍組織におけ
るラミニンレセプターｍＲＮＡレベルの決定を診断的に
用いてラミニンレセプター含量に基づき腫瘍の相対的攻
撃性或いは治療処法に対する感受性を予測することがで
きる。上記の如く、これは、ラミニンレセプターｃＤＮ
Ａをプローブとして用いる切断された腫瘍物質のノーザ
ンブロットハイブリダイゼーション或いはin situ ハイ
ブリダイゼーションにより達成することができる。ラミ
ニンレセプターｃＤＮＡは周知の次の標準的技術に従う
各種手段により上記操作のためのプローブとして調製さ
れる。例IIＡ５において説明したニックトランスレーシ
ョン操作を用いて（32Ｐ）、（35Ｓ）、或いは（ 3Ｈ）
のいずれかでｃＤＮＡインサートを放射線認識すること
ができる。或いは又、ラミニンレセプターｃＤＮＡイン
サートをプラスミドにサブクローン化してメルトン等
（Melton, et al., Nucleic Acids Res., 12: 7035-705
6 (1984)）により説明される方法により放射線認識ＲＮ
Ａの転写を行うことが可能である。発色検出計を組合わ
されたビオチニル化ＲＮＡ及びＤＮＡハイブリダイゼー
ションプローブも又例えばランガー等（Langer，et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. 78:6633-6637(1981)）及
びレアリー等（Leary, et al., Proc. Natl. Acad.Sci.
80: 4045-4049 (1983) ）により説明されている。 【００５７】２．ラミニンレセプターｍＲＮＡの他の種
における検出 ラットＬ２細胞及びＮＩＨ ３Ｔ３及びＦ９奇形癌など
のネズミ細胞からのＲＮＡ及びそれらの誘導体を含有す
るノーザンブロットも又約１７００塩基のｍＲＮＡを検
出した。このように、ヒトラミニンレセプターｃＤＮＡ
インサートは他の脊椎動物種からのＲＮＡに交差ハイブ
リダイズすることができる（データは示さず）。 【００５８】例VI：ラミニンレセプターの多形性 Ａ．材料及び方法 １．交差ハイブリダイジングラミニンレセプターｃＤＮ
Ａの同定 例II Ａ４において説明したヒト内皮細胞λｇｔ１１
ｃＤＮＡライブリーを用いてＥ．コリ Ｙ１０８８細胞
（ＡＴＣＣ ３７１９５）を感染させ、ベントン及びデ
ービス（Benton and Davis, Science, 196: 180-182 (1
977)）のプラークハイブリダイゼーション操作によりλ
ＥＬＲ４からの32Ｐ‐標識化ｃＤＮＡインサートを用い
てスクリーニングした。陽性プラークを上記ベントン及
びデービスに説明されるように、同定及び増幅及び再ス
クリーニングして生成した。 【００５９】２．ＤＮＡ配列決定 陽性ファージのｃＤＮＡインサートを例II Ａ６と同様
にしてｐＵＣベクターのＥｃｏＲＩ部位中にサブクロー
ン化し、ｃＤＮＡ配列をギルバート及びマクサム（Gilb
ert and Maxam, Proc. Natl. Acad. Sci., 70:3581-358
4 (1973)）の方法により決定した。 【００６０】３．ヒトゲノムＤＮＡの単離 ゲノムＤＮＡをブリン等（Blin, et al., Nucleic Acid
s Res., 3: 2303-2308(1976) ）により説明されるよう
にしてドデシル硫酸ナトリウム及びプロティナーゼＫに
よるおだやかな消化により上記例Ｖ Ａ１において説明
されたヒト細胞系から単離した。 【００６１】４．サザーンハイブリダイゼーション 上記細胞系並びにヒト肝臓（Ｍ．ヤング M. Young, Na
tional Institute ofDental Research から取得）から
のゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｔ III、ＢａｍＨ
Ｉ或いはＸｂａＩで徹底的に消化し、アガロースゲル上
で電気泳動させニトロセルロース上に移し、上記例II
Ａ５と同様にλＥＬＲ４ ｃＤＮＡにハイブリダイズさ
せた。 【００６２】Ｂ．結 果 １．ｃＤＮＡ配列比較 部分的ｃＤＮＡ配列を組換えファージλＥＬＲ１０、λ
ＥＬＲ１４、λＥＬＲ１０６、λＥＬＲ１１２に対して
決定した。５′ＥｃｏＲｉ部位からλＥＬＲ１４の内部
ＳａｃＩ部位までの配列は図７および図８のヌクレオチ
ド７‐３８１に完全に対応し、λＥＬＲ４からの上流の
９６個の追加の塩基を含む。他の分析されたクローンは
λＥＬＲ４配列に対する高い同族性を示すが、しかし、
多数の点突然変異を含有する。他のクローンのそれぞれ
に対しては開放翻訳読取り枠はなく、それらが擬ラミニ
ンレセプター遺伝子のｃＤＮＡであることを示唆する。 【００６３】２．ゲノムＤＮＡ分析 ヒト肝臓及び各種ヒト細胞系からの高分子量ゲノムＤＮ
Ａのサザーンブロット分析は多数のハイブリダイズ化Ｄ
ＮＡバンドを示す。これはヒトゲノム中にその全てが交
差ハイブリダイズする多数のラミニンレセプター遺伝子
があることを示唆する。加えて、各々独特のＤＮＡを含
有する多数のプラークが部分的にＡｌｕＩ／Ｈａｅ III
で消化されたヒトゲノムＤＮＡのλシャロン４Ａライブ
ラリー（Ｔ．マニアチス、T. Maniatis ，ハーバード大
学から取得）から上記プラークハイブリダイゼーション
法により単離された。これらの知見は多数の交差ハイブ
リダイズ化ラミニンレセプター遺伝子が同一でないこと
を示唆する。一つの可能性はヒトゲノムが一つの活性ラ
ミニンレセプター遺伝子及び数個の擬遺伝子を含有する
ことである。擬遺伝子から転写されたｍＲＮＡは細胞質
に到達するのに十分安定であり、又、in vitroで転写さ
れてｃＤＮＡを作り、及びそれらの対応するｃＤＮＡは
λＥＬＲ１〜６などの真正ラミニンレセプターｃＤＮＡ
と交差ハイブリダイズし、ノーザンブロットにおける代
替的ハイブリダイゼーションプローブとして用いること
ができる。しかしながら、擬遺伝子の５′末端における
多数の翻訳停止コドンにより、ラミニンレセプタータン
パク質はそれから合成されない。全ての単離ラミニンレ
セプターｃＤＮＡ（開放読取り枠中）が真正のラミニン
レセプターｃＤＮＡとしての資格を有するためにはλＥ
ＬＲ４ ｃＤＮＡ配列により予測されるアミノ酸をコー
ド化する必要がある。 【００６４】例VII ：合成ラミニンレセプターペプチド
類 Ａ．材料及び方法 １．合成ラミニンレセプターペプチド類 合成ペプチドＲＴＬＲ２‐２０は図７および図８のヌク
レオチド６６７−７２６から得られ、上記系IV Ａ３に
おいて説明されている。第一のプロリンが欠失し、スレ
オニン及びグルタメート残基がそれぞれリジン及びロイ
シンにより置換されているコントロールペプチドはＲＴ
ＬＲ２‐コントロールと命名される。合成ペプチドＲＴ
ＬＲ３は配列Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈｉｓ
−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−
Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖ
ａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇを含有し、図７および図８におけ
るヌクレオチド３７３−４３２から得られた。予測され
た逆転を含まないコントロールペプチドも又合成され
た。コントロールペプチドＲＴＣ１は配列Ｓｅｒ−Ｓｅ
ｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ
−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇ
ｌｙを含有する。コントロールペプチドＲＴＣ２は配列
Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを含有する。コントロールペプチ
ドＲＴＣ３は配列Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｍ
ｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇを含有する（図７および
図８のヌクレオチド３９７〜４２０から得られる）。全
ての合成ペプチド類は例Ｉ Ａ３と同様にして逆相ＨＰ
ＬＣにおいて精製され、周知の標準的方法に従ってペニ
ンシュラ・ラボラトリーズ社（Penninsula Laboratorie
s, Inc.,カリフォルニア州、ベルモント）より提供され
た。勿論、本発明のクローンを用いて周知の標準的技術
に従ってペプチドを合成すすることができる。λＥＬＲ
１〜６クローンはそれらのハイブリッドβ‐ガラクトシ
ダーゼラミニンレセプターペプチド類を発現する能力に
より選ばれた。このｃＤＮＡインサート或いはその断片
は例えばマニアティス等（ Maniatis, et al., Molecul
ar Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbo
r Loboratory, ニューヨーク州、コールドスプリングハ
ーバー、４０４〜４３０頁（１９８２））により総括さ
れているように、その他のベクターにサブクローン化し
て他の融合タンパク質或いは非融合タンパク質を製造す
ることができる。 【００６５】２．結合アッセイ Ｇ．トダロ（G. Todaro, National Cancer Institute）
により供給されるＡ２０５８ヒトメラノーマ細胞の、合
成ラミニンレセプターレセプターペプチドの存在下で
の、ラミニンに特異的に結合する能力を例IVＡ４と同様
にして試験した。合成ペプチドＲＴＬＲ２及びＲＴＬＲ
３並びにコントロールペプチドをブラウン等（Brown, e
t al., Bio-chemistry, 18:4901 〜4906 (1979) ）によ
るｐ‐ニトロフェニルエステルガラスビーズを用いて、
インキュベーションにより固体支持体に結合した。この
ビーズはＡ．デイ（A. Day, Medical College of Virgi
nea ）から得られた。ペプチドを次いで（Ｉ125 ）ラミ
ニンとインキュベートし、結合（Ｉ125 ）ラミニンの量
を求めた。 【００６６】３．転移アッセイ 転移ＢＬ６ネズミメラノーマ細胞はＩ．ハート博士（D
r. I. Hart, FrederickCancer Research Center,メリー
ランド州、フレデリック）から得た。新たにトリプシン
化した細胞を各種濃度の合成ペプチドＲＴＬＲ２（前
記）と混合し、約５×１０4 個の細胞をリオッタ等（Li
otta et al., Nature, 284: 682-688 (1980)の方法によ
りヌードマウス当り０．１の容量で静脈内（i.v.）注射
した。マウスは各群１０匹であった。動物を３1/2 週に
おいて殺し、転移の数を求めた。同様な疎水性変化のＲ
ＴＣ１などのコントロール合成ペプチドは転移の数に何
等の影響を及ぼさなかった。 【００６７】Ｂ．結 果 １．結合研究 合成ペプチド類をｃＤＮＡ配列に基づいて製造し（図７
および図８）、ラミニンレセプター‐リガンド結合機構
を研究するために用いた。合成ペプチドＲＴＬＲ２の存
在はヒトＡ２０５８メラノーマ細胞のラミニンに結合す
る能力を抑制したが、そのコントロール対照物（ＲＴＬ
Ｒ２‐コントロール）は抑制しなかった（図１２）。こ
れはそのリガンドに対するレセプターの少なくとも一つ
の結合領域がＲＴＬＲ２配列内に含有されていることを
示唆する。更に、各種合成ペプチドを（Ｉ125 ）のラミ
ニンとインキュベートし、結合することのできる標識化
リガンドの量を測定したところ、ＲＴＬＲ２‐ペプチド
はＲＴＬＲ３或いは３個のその他のコントロールペプチ
ドよりもより多い結合活性を有した（図１３）。そのよ
うな研究はｃＤＮＡ‐由来ラミニンレセプターペプチド
を用いて各種生物学的機能に含まれるラミニンレセプタ
ーの特異的領域を求めることができることを示唆する。 【００６８】２．転 移 ｃＤＮＡ配列から発生した合成ペプチド類を用いて癌転
移を抑制することができる。ＢＬ６メラノーマ細胞から
の転移の数は合成ＲＴＬ２断片を細胞と共にマウス中に
共注射した際に減少した（表１）。如何なる理論にも拘
束されるものではないが、合成ラミニンレセプター断片
は転移のコロニー化を防止するものと想定される。その
ような結果は、ｃＤＮＡ発生合成ラミニンレセプター断
片が癌治療における転移の抑制に有用であることを示唆
する。 【００６９】 【００７０】５×１０4 のＢＬ６メラノーマ細胞を各種
濃度の合成ラミニンレセプターＲＴＬＲ２と混合し、各
ヌードマウス（群当り１０匹）に０．１mlの容量で静脈
内注射した。動物を３1/2 週間後に殺し、肺における転
移の数を求めた。 【００７１】ここに説明した具体例及び実施態様は例示
を目的とするのみであり、それに照した各種修正或いは
変化が当業者に示唆され、本願の精神及び趣旨及び冒頭
に掲げた特許請求の範囲に含まれるべきことが了解され
る。
は、本発明はラミニンの高親和性（約１０-8〜１０-10
ｋｄ）細胞表面レセプターをコード化する組換えＣＤＮ
Ａクローンに関する。 【０００２】背景技術 ラミニンは表皮細胞及び新生細胞の両者の基底膜への結
合を媒介する基底膜の主たる糖タンパク質成分である。
基底膜は器官柔組織細胞を間質性コラーゲン様ストロマ
から分離する至る所に存在する特殊化されたタイプの外
細胞マトリックスである。細胞とこのマトリックスの相
互作用は正常及び新生細胞過程の両者の重要な側面であ
る。正常な細胞は外細胞マトリックスを生存、増殖及び
分化のために必要とするように思われるのに対し、移動
性細胞は正常細胞及び新生細胞共に一つの組織から他の
組織に移動するに際して基底膜を横切らなければならな
い。特に扁平或いは小腺表皮細胞に生ずる転移癌細胞は
循環及びリンパ系に入るためには基底膜を横切らなけれ
ばならず（血管内異物侵入）、又循環新生細胞は器官の
毛細管床に典型的に捕えられ、血管壁を冒し、及び基底
膜を侵入して血管外組織に至り（管外遊出）、そこで二
次的新生物を次いで確立する。ラミニンレセプターは表
皮及び新生細胞の両者の基底膜への結合を媒介すること
により特に転移過程を制御することにおいて極めて重要
な役割をはたす。米国特許４，５６５，７８９号明細書
はラミニンレセプターの単離及びある種の側面の特性化
を記載している。しかしながら、ラミニンの細胞表面レ
セプターをコード化するクローン化ＤＮＡ配列はこれ迄
知られていない。 【０００３】 【発明の概要】従って、本発明の目的はラミニンの高親
和性（約１０-8〜１０-10 ｋｄ）細胞表面レセプターを
コード化することのできる組換えｃＤＮＡクローンを提
供することである。更に、本発明の目的は、転移を抑制
するラミニンレセプターの合成断片を提供することであ
る。更に本発明の目的は、多量の合成ラミニンレセプタ
ーの製造方法を提供することである。 【０００４】更に本発明の目的は膜張渡し領域及びリガ
ンド結合領域などの特定の領域をコード化するラミニン
レセプターの合成断片を提供することである。更に本発
明の目的は異った腫瘍細胞及び正常な組織細胞集合体に
おけるラミニンレセプターｍＲＮＡの含量を評価する診
断方法を提供するものである。更に本発明の目的は異っ
た組織及び腫瘍細胞集合体におけるラミニンレセプター
遺伝子のパターンを決定する診断方法を提供することで
ある。 【０００５】図面の説明 本発明のこれら及びその他の目的を付随する利点の多く
は添付図面に関連して考慮するとき以下の詳細な既述を
読んでよりよく理解されるであろう。 【０００６】図１は精製ラミニンレセプターの均質性を
示す。上段（ＴＯＰ）は大腸癌からの及び正常ヒト胎盤
組織からの精製ラミニンレセプターの比較を示す。ラミ
ニン-Sepharoseアフィニティカラムから１Ｍ ＮａＣｌ
で溶出された物質をジチオスレイトールの存在下におい
てＮａＤｏｄＳＯ４‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（７％）により分析し、銀染色により可視化した。パネ
ルはラミニンレセプターの調製物間の分子量の僅かな可
変性を例示する（６８，０００〜７２，０００）。レー
ンＰ１：ヒト胎盤組織から単離されたラミニンレセプタ
ー（１μｇ）。レーンＣａ：ヒト大腸癌から単離された
ラミニンレセプター（３μｇ）。レーンＭ：分子量マー
カー：ホスホリラーゼｂ（９４，０００）、ウシ血清ア
ルブミン（６７，０００）及びオバルブミン（４３，０
００）。 【０００７】図１下段（BOTTOM）は精製ラミニンレセプ
ターの等電集中及び二次元ゲル電気泳動を示す。上記大
腸癌ラミニンレセプタータンパク質試料（０．１μｇ）
はＩ125 で放射線標識され、等電集中（ｐＨ範囲５〜
７）及び１０％ ＮａＤｏｄＳＯ４‐ポリアクリルアミ
ドゲル上の二次元ゲル電気泳動に付された。分子量マー
カー：ホスホリラーゼｂ（９３，０００）、ウシ血清ア
ルブミン（６６，０００）、グリセラルアルデヒド３‐
ホスフェートデヒドロゲナーゼ（３６，０００）。 【０００８】図２は精製ラミニンレセプターのＥＬＩＳ
Ａを示す。各マイクロタイターウェルを精製腫瘍ラミニ
ンレセプターで被覆し、ＬＲ１モノクローナル抗体２Ｈ
５（□）、抗アルブミン（○）或いは抗‐α‐アミラー
ゼモノクローナル抗体（●）に対して２時間反応させ
た。抗体をペルオキシダーゼ複合ヤギ抗マウスＩｇＭ或
いはペルオキシダーゼ複合ブタ抗ウサギＩｇＧを用いて
検出した。 【０００９】図３および図４は抗ラミニンレセプターモ
ノクローナル抗体のλＥＬＲ６に対する特異性を示す。
約５０〜１００個の精製λＥＬＲ６プラークを含有する
フィルターを抗ラミニンレセプターモノクローナル抗
体、抗‐α‐アミラーゼモノクローナル抗体、抗アルブ
ミン抗体或いは抗ラミニン抗体のいずれかと反応され
た。抗体結合はペルオキシダーゼ複合第二抗体を用いて
検出した。 【００１０】図５はλＥＬＲ１〜６の重畳ラミニンレセ
プターｃＤＮＡインサートを示す。頂部の線はｃＤＮＡ
インサートの左側への２個のＫｐｎＩ部位（Ｋ）を示す
原型λＥＬＲ組換えλｇｔ１１ファージの図である。囲
いはｃＤＮＡインサートを表わす。各インサート内の左
のＥｃｏＲＩ部位は存在しなかった。右のＥｃｏＲＩ部
位（Ｅ）を示す。λｇｔ１１のｌａｃＺ遺伝子からの転
写はファージの右腕からＥを介して左側に進む。Ｋｐｎ
Ｉ部位（ｃＤＮＡインサートに最も近接した）から最大
のｃＤＮＡインサート（λＮＬＲ４）のＥｃｏＲＩ部位
に延在する領域は拡大されて下に示される。ｃＤＮＡイ
ンサート囲い内の斜線領域はニックトランスレーション
されハイブリダイゼーションプローブとして用いられた
λＥＬＲ４のサブクローン（図６参照）から単離された
ＰｓｔＩ‐ＳｐｈＩ制限断片を示す。明細書に説明され
る共通ＳａｃＩ（Ｓ）及びＨｉｎｄ III（Ｈ）部位が示
される。ＥＬＲ組換えファージの各々からのファージＤ
ＮＡはＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩで制限され、１％アガロ
ースゲルを通して電気泳動され、ニトロセルロースに移
され、及び上記ＰｓｔＩ‐ＳｐｈＩ制限断片にストリン
ジェントにハイブリダイズされる。プローブにハイブリ
ダイズした各λＥＬＲ組換えファージからのＫｐｎＩ‐
ＥｃｏＲＩ制限断片の長さをブロットのラジオオートグ
ラフ上に図示し、標準λ／Ｈｉｎｄ III消化物と対比し
て決定した。 【００１１】図６はλＥＬＲ４のｃＤＮＡインサートの
配列決定の術策を図示する。λＥＬＲ４のサブクローン
化インサートの制限地図を上段に示す。Ｅはインサート
の５′ＥｃｏＲＩ部位である。Ｈ：ＨｉｎｆＩ、Ｓ：Ｓ
ｐｈＩ、Ｒ：ＲｓａＩ、Ｐ：ＰｓｔＩ、＊：オーカー集
結コドン。矢印は５′末端において（γ‐Ｐ32）ＡＴＰ
によるキナーゼ化により（●）或いは３′末端において
（α‐Ｐ32）ジデオキシＡＴＰによるテーリングにより
（○）或いはジデオキシ合成法（ｒ）のいずれかにより
標識化された断片の配列方向を示す。配列決定に用いら
れたサブクローンはｐＬＲ４−１、ｐＬＲ４−２、及び
ｐＬＫ４−４であった。 【００１２】図７および図８は下記に得られたタンパク
質配列のλＥＬＲ ｃＤＮＡインサートのヌクレオチド
配列を提供する。各線の右側には人工ＥｃｏＲＩ部位か
らの塩基対の数が示される（塩基１〜６）。図７および
図８に記載されるヌクレオチド配列は連続したものであ
り、図７を左側とし、図８を右側とするものである。 【００１３】図９は、合成ラミニンレセプターペプチド
のＥＬＩＳＡ決定を示す。合成ラミニンレセプターペプ
チドＲＴＬＲ２は図７および図８におけるｃＤＮＡ配列
から生成され、異った稀釈率のウサギ抗ラミニンレセプ
ター抗血清或いは前免疫血清を用いてＥＬＩＳＡにより
アッセイされた。 【００１４】図１０はＲＮＡゲルブロットハイブリダイ
ゼーションを示す。全細胞ＲＮＡを数個の乳癌細胞系か
ら抽出し、メチル水銀アガロースゲル上で分離し、及び
ジアゾベンジルオキシメチルセルロース紙に移した。こ
のフィルターをｐＬＲ４−１からのニックトランスレー
ションされた（32Ｐ）‐標識化ＥｃｏＲＩ‐ＰｓｔＩイ
ンサートにハイブリダイズした。ハイブリダイズされた
ｍＲＮＡ種の長さは知られた大きさのｒＲＮＡ及びＨｉ
ｎｄ IIIで制限されたλＤＮＡの大きさと対比すること
により求められた。レーン１：ＭＣＦ‐７（親）；レー
ン２：ＭＣＦ７‐３Ｅ５；レーン３：ＭＣＦ７‐５Ｈ
７；レーン４：ＺＲ７５。 【００１５】図１１はラミニンレセプターｍＲＮＡレベ
ルと６個のヒト癌細胞系のラミニンに結合する能力との
相関関係を示す。図１０に示されるような異った時間の
ラジオオートグラフの曝露を濃度測定により測定して線
形応答範囲を決定した。一連のハイブリダイズされたＲ
ＮＡの最低量に数値１．０を与え、全てのその他の値は
その値に対して計算した。各細胞系に対する細胞当りの
ラミニンレセプターの数は対数成長期細胞に対する特異
的結合（Ｉ125 ）ラミニンのScat-chardプロットから計
算した。線形回帰分析は０．９７の相関係数を示した。
ＭＣＦ‐７親□、ＭＣＦ‐７クローン５Ｈ７△、ＭＣＦ
‐７クローン３Ｅ５（黒ぬり四角形）、ＺＲ‐７５○、
腎癌Ａ‐７０４●、Panc‐１（黒ぬり三角形）。 【００１６】図１２は合成ラミニンレセプターペプチド
が細胞へのラミニン結合を抑制することを示す。Ａ２０
５８ヒトメラノーマ細胞のラミニンに特異的に結合する
能力を、図７および図８のｃＤＮＡ配列から精製する各
種量のＲＴＬＲ２の□或いはＲＴＬＲ２‐コントロール
（黒ぬりひし形）の存在下において試験した。値は添加
断片の存在下において結合したラミニン量に対して表わ
されている。及び 【００１７】図１３はリガンド結合に含まれる合成ペプ
チドラミニンレセプターの同定を示す。予測された逆転
立体配置を有するｃＤＮＡ配列から精製されたペプチド
断片（ＲＴＬＲ２、ＲＴＬＲ３）並びにコントロールペ
プチドはグラスビーズに結合され（Ｉ125 ）ラミニンと
インキュベートした。示された数値は断片なしにビーズ
に結合されたｃｐｍを差引いた後のビーズに結合したｃ
ｐｍ×１０-3の数である。 【００１８】 【発明の具体的説明】本発明の上記及び各種のその他の
目的及び利点は細胞表面ラミニンレセプターをコード化
するヌクレオチド配列を全部或いは部分的に（図７およ
び図８に示す如く）有する組換えｃＤＮＡクローン及び
合成ラミニンレセプター或いはその断片の製造方法によ
り達成される。 【００１９】特に断りのない限り、本発明において用い
る全ての技術的或いは化学的用語は本発明の属する技術
における当業者により普通に理解されるものと同一意味
を有する。本発明の実施或いは試験において、本発明に
おいて説明されるものと同様或いは等価の如何なる方法
及び材料を用いることもできるが、好ましい方法及び材
料を以下に説明する。以下に述べる全ての刊行物は本発
明において準用する。 【００２０】本発明の組換えｃＤＮＡクローンを造築及
び単離するための方法論は更に詳細に例IIにおいて説明
されており、周知の標準的技術を含む以下の一般的工程
を含むものである： ａ） ヒト臍帯静脈内皮細胞からのｍＲＮＡ鋳型を用い
てｃＤＮＡを合成する。 ｂ） 内皮細胞ｃＤＮＡをλｇｔ１１ベクター（ＡＴＣ
Ｃ ３７１９４）中に挿入する。 ｃ） この組換えλｇｔ１１をパッケージし、大腸菌
（Escherichia coli）１０９０細胞（ＡＴＣＣ３７１９
７）を感染するために用いる。 ｄ） 得られるλｇｔ１１ヒト内皮細胞ｃＤＮＡ発現ラ
イブラリーをラミニンの結合に含まれるヒトラミニンレ
セプターの領域を認識するモノクローナル抗体を用いて
スクリーニングする。 ｅ） λＥＬＲ１〜６と命名される６個のプラークがこ
のようにして単離及び精製される（図３および図４）。
これらのｃＤＮＡインサートを制限エンドヌクレアーゼ
マッピングにより分析し、共通領域を有することが判明
し、それらがモノクローナル抗体により認識されるラミ
ニンレセプターのエピトープをコード化することを示す
（図５）。 ｆ） ６個の精製相の最も大きいｃＤＮＡインサートを
プラスミドベクター中にサブクローン化して更に分析及
びＤＮＡ配列決定を容易にする。λｇｔ１１の左腕にｃ
ＤＮＡインサートを連結するＥｃｏＲＩ部位は全ての六
つのクローンに存在しない。従ってＰｖｕII部位１１ｂ
ｐ下流を利用して、最も大きい組換えファージλＥＬＲ
４からｃＤＮＡインサートを精製する。λＥＬＲ４のＥ
ｃｏＲＩ‐ＰｖｕII制限断片をｐＢＲ ３２２のＥｃｏ
ＲＩ‐ＰｖｕII部位中にサブクローン化してｐＬＲ４−
１を作成する。 【００２１】本発明に従って得られた宿主Ｅ．コリ株Ｃ
６００ｒ- ｍ- （ＡＴＣＣ ３３５２５）中に形質転換
された組換えｃＤＮＡクローンｐＬＲ４−１の寄託は受
理番号６７１９９号でアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（American Type Culture Collection,
(ATCC)、メリーランド州ロックビル）になされた。要求
によりＰＴＯの長官はこの寄託物を入手でき、特許発効
時にはこの寄託物は最後の要求後少なくとも５年間或い
は少なくとも３０年間、或いは特許の有効期間生育可能
に維持され、勿論、法律の規定に従って制限なしに公衆
に利用可能とされる。 【００２２】本発明の確定的に同定する方法は組換えプ
ラスミドのｃＤＮＡ配列（図７および図８）を精製胎盤
ラミニンレセプターのシアノーゲンブロマイド‐生成オ
クタペプチドのアミノ酸配列との比較に基づく。オクタ
ペプチドアミノ酸配列を得るための方法論はより詳細に
例Ｉに説明され、周知の標準的技術を含む次の一般工程
を包合する： ａ） ヒト胎盤組織からのミクロゾーム膜を調製し、可
溶化する。 ｂ） 可溶化されたミクロソーム膜含有調製物を精製ラ
ミニン‐Sepharose ４Ｂのアフィニティマトリックスを
通過させ、十分洗浄後高アフィニティラミニンレセプタ
ータンパク質を高濃度塩水（１Ｍ ＮａＣｌ）によりリ
ガンドから溶出する。 ｃ） ヒト胎盤ラミニンレセプターの均質性を二次元ゲ
ル電気泳動（図１）及び酵素結合免疫吸着剤アッセイ
（ＥＬＩＳＡ）（図２）によりアッセイする。 ｄ） ヒト胎盤ラミニンレセプターをシアノーゲンブロ
マイドで切断し、得られたペプチド類を逆相高圧液体ク
ロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により分画する。 ｅ） 胎盤オリゴペプチドのミクロ配列分析は独特の配
列Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−
Ｌｅｕ−Ａｒｇを有するオクタペプチドを露わす。 【００２３】本発明の別の同定方法はヒト転移乳癌ラミ
ニンレセプターに向けられたウサギ抗血清のｐＬＲ４−
１のｃＤＮＡ配列から生成した合成ペプチド（図９）を
同定（ＥＬＩＳＡにより）する能力を求める。この抗ラ
ミニンレセプター抗血清を得る方法論は更に詳細に例IV
において説明されており、周知の標準的技術を含む次の
一般的工程を包合する： ａ） ラミニンレセプターを胎盤ラミニンレセプターに
対して上記に説明したようにヒト転移乳癌から精製す
る。 ｂ） 腫瘍ラミニンレセプターの均質性を胎盤ラミニン
レセプターに対して上記説明の如く評価する。 ｃ） ＮａＤｏｄＳＯ４‐ポリアクリルアミドゲルから
切出した腫瘍ラミニンレセプターの皮下注射によりウサ
ギを免疫化する。 【００２４】ヒト癌細胞などのラミニンレセプターｍＲ
ＮＡを含む細胞の診断アッセイが癌の診断及び予知にお
ける有用な道具として開発されてきた。ラミニンレセプ
ターｍＲＮＡ含量のアッセイ方法は更に詳細に例Ｖにお
いて説明され、周知の標準的技術に従う次の一般的工程
を包合する： ａ） 全細胞ＲＮＡを組織標本或いは細胞から単離す
る。 ｂ） ＲＮＡを変性アガロースゲルを通して変性及び電
気泳動させ、濾紙に移す。 ｃ） ＲＮＡを含む濾紙を放射線標識化ラミニンレセプ
ターｃＤＮＡにハイブリダイズさせる。 ｄ） 洗浄後、フィルターを十分な時間Ｘ‐線フィルム
に曝露し、放射線活性プローブのイメージを得る。 ｅ） フィルム上のバンドの相対的強度がラミニンレセ
プターｍＲＮＡの目安である（図１０）。 ｆ） 或いは又上記工程（ｂ）の代りに変性ＲＮＡの小
アリコートを直接に濾紙に結合した後工程（ｃ）〜
（ｅ）を行う。 ｇ） 放射線標識化ラミニンレセプターｃＤＮＡは又in
situ で組織断片及び細胞にハイブリダイズさせてラミ
ニンレセプターｍＲＮＡを発現する特定細胞集団を決定
することもできる。 【００２５】転移細胞におけるラミニンレセプターｍＲ
ＮＡの増加した含量は変化したラミニンレセプターＤＮ
Ａを含有する細胞の診断アッセイの開発に役立つ。この
方法論は各種遺伝病に対して見出だされてきた制限断片
長の多形性の可能性のある存在に基づく。腫瘍のゲノム
或いは転移細胞におけるラミニンレセプター遺伝子の増
幅も又評価されてよい。ラミニンレセプターゲノムＤＮ
Ａの分析方法は周知の標準的技術に従って、次の一般的
工程を包合する： ａ） 高分子量ゲノムＤＮＡを例VIに説明するように組
織標本或いは細胞から単離する。 ｂ） ＤＮＡを各種制限エンドヌクレアーゼにより消化
し、アガロースゲルを通して電気泳動させ濾紙に移す。 ｃ） ＤＮＡを含有するフィルターを放射線標識化ラミ
ニンレセプターｃＤＮＡにハイブリダイズさせる。 ｄ） 洗浄後、フィルターをＸ‐線フィルムに曝露し、
フィルム上のバンドのパターンを正常組織からのそれと
比較する。 【００２６】ｐＬＲ４−１のｃＤＮＡ配列から生成した
合成ペプチド類は転移の形成を抑制する癌の治療におい
て有用である。本発明において説明される方法は基底膜
は良性新生物における連続構造であり、又、良性細胞上
のラミニンレセプターは基底膜への結合により占められ
ているという観察に基づくものである。これに対して、
侵略腫瘍細胞に隣接した基底膜は連続的ではない。侵略
腫瘍細胞はこのようにリガンドに結合していない細胞表
面上に発現された増大した数のラミニンレセプターを有
する。癌の管理及び診断において重要な概念であるのは
転移癌細胞上のラミニンレセプター部位の利用可能性で
ある。癌の腫瘍細胞が一次腫瘍部位から隣接正常組織に
移動する傾向及びその体の遠方部位に広がり、転移クロ
ーンを開始する性向と定義される癌の攻撃性は、次いで
部分的により多くの利用可能なラミニンレセプターを有
する侵略性細胞の数の一つの反映である。 【００２７】ｐＬＲ４−１のｃＤＮＡ配列から生成する
合成ペプチド類は放射線標識化ラミニンに特異的に結合
する（図１３）。ラミニン結合アッセイにおけるこの合
成ペプチドの存在は細胞がラミニンに結合する能力を阻
害した（図１２）。このように、合成ペプチドは細胞表
面ラミニンレセプターがラミニンに結合する能力と拮抗
及び妨害する。ペプチドが混合ＢＬ６メラノーマ細胞で
あり、マウスに静脈内注射した場合にＢＬ６細胞からの
転移の数は減少した（表１）。如何なる理論にも拘束さ
れるものではないが、合成ラミニンレセプター断片は基
底膜に対して直ちに結合することに対して細胞と拮抗し
て転移細胞のコロニー化を防止するものと思われる。 【００２８】上記に基づき、本発明を用いて、各種方法
で癌並びに細胞によるラミニンの異常な認識から生ずる
その他の病気の診断及び治療における有効な合成ペプチ
ドとその断片を得ることができることは明らかである。 【００２９】 【実施例】以下に、本発明を例示する具体例を説明す
る。 例Ｉ：独特なヒト胎盤ラミニンレセプターオクタペプチ
ドの同定 Ａ．材料及び方法 １．組 織 ヒト乳癌及び大腸癌に由来する肝臓転移からの組織を国
立癌研究所病理学実験室（Laboratory of Pathology,Na
tional Cancer Institut）及びグロストラップ病院病理
学部（Department of Pathology, Glostrup Hospital、
コペンハーゲン）から得た。正常期間出産から得られた
ヒト胎盤は国立海軍医療センター（National Naval Med
ical Center,メリーランド州、ベセスダ）により提供さ
れた。 【００３０】２．ラミニンレセプターの精製 腫瘍組織（１００〜３００ｇ）或いは胎盤組織（５００
ｇ）を５容（wt/vol）のリン酸緩衝化塩水（１３７ｍＭ
ＮａＣｌ／１．７ｍＭ Ｋｃｌ／８．１ｍＭＮａ２Ｈ
ＰＯ４／１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２）中に
おいて、Waringブレンダー内においてホモジナイズし
た。この緩衝液及び以下の緩衝液に対して次のプロテア
ーゼ阻害剤を添加した：５０μｇ／mlフェニルメチルス
ルホニルフルオライド、５ｍＭベンズアミジン、１０μ
ｇ／mlアプロチニン、５０μｇ／ml大豆トリプシン阻害
剤及び５ｍＭベーターヒドロキシ水銀安息香酸。５００
×ｇで１０分間遠心分離後、ホモジネートを０．３Ｍス
クロース／２５ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．３中
で１：１（vol ／vol ）に希釈し、氷上でブリンクマン
ポリトロン（Brinkman Polytron)で超音波処理し、１
５，０００×ｇで４℃において２０分間遠心分離し、更
に上澄液を１４３０００ｘｇで４℃において９０分間超
遠心分離した。得られたペレット内のミクロゾーム膜を
２５ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．３／１５０ｍＭ
ＮａＣｌ／１ｍＭ ＣａＣｌ２／３ｍＭ ＭｇＣｌ２
中１０mgタンパク質／mlで再懸濁し、等容量の１％オク
チルフェノリポリエトキシエタノール（Nonidet P-40,
Sigma)／２５ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．２／１
５０ｍＭ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＣａＣｌ２／３ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２中に希釈し、４℃で６時間エンド‐オーバー・
エンド(end-over-end)回転で抽出した。この調製物を２
００，０００×ｇで４℃において１時間超遠心分離し、
次いで上澄液を２mgのラミニン（ティンプル等Timpl, e
t al., J.Biol. Chem., 254: 9933-9937(1979)に説明さ
れたように精製された）をmlのＣＢｒＮ‐活性化Sephar
ose ４Ｂ（Pharmacia ）にカップリングさせることによ
り調製された２mlのSepharose ラミニンアフィニティマ
トリックスと共に４℃で１０時間インキュベートした。
Sepharose ‐ラミニンマトリックスを次いで１０回２５
ｍＭＴｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．３／１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ／１ｍＭ ＣａＣｌ２／１ｍＭＭＧＣｌ２／０．０
５％ Nonidet Ｐ‐４０中で洗浄し、及び１回４００ml
ＮａＣｌを含有する緩衝液中で洗浄した。このラミニ
ン‐Sepharose マトリックスを次いで２mlカラム中に充
填した。タンパク質画分を室温で１ＭＮａＣｌ／５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．３で溶出し、直ちに氷
上に置き、冷蒸留Ｈ２Ｏに対して透析し、凍結乾燥によ
り濃縮した。 【００３１】３．シアノーゲンブロマイド消化及びマイ
クロ配列決定 精製ラミニンレセプターをシアノーゲンブロマイドでオ
ーゾールス等〔Ozolset al., J. Biol, Chem., 252:598
6-5989 (1977)〕により説明されるように消化し、４０
０μｌの０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリルに
溶解し、逆相２５cm×４．１mm ＰＲＰ‐１カラム（Ha
milton）上で２００μｌの二つの注入として２ml／分の
流速で運転した。シアノーゲンブロマイド‐発生断片の
アミノ酸配列決定を製造者のプログラム０３ ＲＰＴＨ
を用いる付属モデル１２０Ａ ＰＴＨ‐アナライザーを
有するモデル４７０Ａ気相タンパク質シークエンサー
（Applied Bio Systems 、フォスターシテー、カリフォ
ルニア州）を用いて行った。 【００３２】４．酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩ
ＳＡ） ＥＬＩＳＡはエングバル(Engvall、Methods Enzymol.，
70: 419-439 (1980)）に従って行った。アッセイされた
抗体はリオッタ等（Liotta, et al., Exp. Cell Res.,
156: 117-126 (1985) ）により説明されたようなヒトラ
ミニンレセプターに対するＩｇＭマウスモノクローナル
抗体２Ｈ５（ＬＲ‐１）、ウサギ抗‐ヒトアルブミン
（Miles ）及び‐アミラーゼに対するＩｇＭマウスモノ
クロナール抗体（国立歯科研究所 National Institute
of Dental ResearchのＲ．シラガニアン R. Siraganian
から得られた）を包含した。結合抗体はペルオキシダー
ゼ‐複合ウサギ‐抗マウスＩｇＭ（キエルケガード・ア
ンド・ペリー・ラボラトリーズ Kierkegaard and Pery
Laboratories, メリーランド州、ガイザースバーグ）或
いはペルオキシダーゼ‐複合ヤギ抗‐ウサギＩｇＧ（Ki
erkegaard and PerryLaboratories）を用いて検出し
た。 【００３３】５．ゲル電気泳動 タンパク質試料はレムリ（Laemmli, Nature （ロンド
ン）、227: 680-685 (1970) ）の方法によりジチオスレ
イトールの存在下においてＮａＤｏｄＳＯ４‐ポリアク
リルアミドゲル電気泳動により分析した。等電集中及び
二次元ＮａＤｏｄＳＯ４‐ポリアクリルアミドゲル電気
泳動はオファレス（O'Farrell, J. Biol.Chem., 250: 4
007-4021 (1975)）及びビルス等（Wirth et al.,Cancer
Res., 46: 400 〜413 (1986)）により説明されたよう
に行われた。免疫ブロッティングはリオッタ等（Liott
a, et al. (1985) 、前掲）により説明されたように抗
ラミニンレセプターモノクローナル抗体を用いて行われ
た。 【００３４】Ｂ．結 果 １．ヒトラミニンレセプターの精製 調製量の精製ラミニンレセプターの単離はヒト転移乳癌
及び大腸癌及びヒト胎盤組織からの可溶化ミクロゾーム
膜含有調製物をラミニン‐Sepharose ４Ｂのアフィニテ
ィマトリックスにかけ、次いでアフィニティマトリック
スの十分な洗浄及び高濃度塩水（１Ｍ ＮａＣｌ）によ
るリガンドからのレセプタータンパク質の溶出により達
成された。ＮａＤｏｄＳＯ４‐ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（図１上段）により分析すると、乳癌及び大腸
癌からの精製タンパク質はより厳密性の少ない条件下で
単離されたヒト乳癌ラミニンレセプターについて、先に
報告されたように、約みかけＭｒ＝６８，０００〜７
２，０００を有した。この精製操作の結果薬２０μｇ／
１００ｇの腫瘍組織及び２μｇ／１００ｇの胎盤組織の
レセプタータンパク質収率が得られた（可溶化ミクロゾ
ーム膜調製物中約０．０２％のタンパク質）。これらの
乳癌、大腸癌及び胎盤からの精製ラミニンレセプター調
製物を標準的操作に従ってヨード化し、二次元ゲル電気
泳動により分析して調製物の均質性を評価した。代表的
な腫瘍ラミニンレセプターのオートラジオグラフを図１
下段に示す。ラミニンレセプターのみかけｐＩは６．４
±０．２である。図１下段は延伸スポットを示すが、異
ったｐＨ範囲及び免疫ブロッティング（前記Liotta等
（1985）らにより説明されるような）におけるその他の
ゲルは単一ポリペプチド鎖と一致する。 【００３５】これらの三つの源泉からの精製ラミニンレ
セプター調製物をマイクロタイターウエル内で固定し、
一群の抗体と反応させて更に調製物の純度及びアミニン
或いはアルブミンによる汚染の欠乏を示した。全ての場
合において、ヒトラミニンレセプターＬＲ‐１（２Ｈ
５）に対するＩｇＭマウスモノクローナル抗体は陽性に
反応したのに対し、ウサギ抗‐ヒトアルブミン及びα‐
アミラーゼに向けられたクラス適合ＩｇＭマウスモノク
ローナル抗体は反応しなかった。代表的ＥＬＩＳＡを図
２に示す。 【００３６】２．胎盤ラミニンレセプターのシアノーゲ
ンブロマイドペプチドのマイクロ配列分析 そのままのラミニンレセプター分子を直接に配列決定す
るための繰返された試みは、おそらくアミノ末端の保護
により成功しなかった。従って、レセプタータンパク質
をシアノーゲンブロマイドで切断し、得られたペプチド
を逆相ＨＰＬＣにより分画した。胎盤オリゴペプチドの
マイクロ配列分析は、配列Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａ
ｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇを有するペプチ
ドを現わした。同族体に対するコンピュータの助けを借
りた探索（ウィルバー及びリップマン、Wilber and Lip
man,Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 726-730 (1983) ）は
このオクタペプチドが独特のものであることを示した。 【００３７】例II：ヒトラミニンレセプターｃＤＮＡク
ローンの単離 Ａ．材料及び方法 １．細胞培養 ヒト臍帯静脈内皮細胞の単層培養物をジェイ等（Jaye,
et al. Science 228:882-885 (1985)）により説明され
るように生育した。 【００３８】２．ＲＮＡの調製 全細胞ＲＮＡをチルギン等（Chirgwin, et al., Bio-ch
emistry, 18: 5294-5299 (1979) ）により説明されるグ
アニジニウムイソチオシアネート‐セシウムクロライド
密度法により培養物中の細胞層から抽出した。ポリ
（Ａ）‐含有ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロース（タイ
プ３、コラボラティブ・リサーチ Collaborative Resea
rch ）上のクロマトグラフィによりアヴィブ及びレーダ
ー（Aviv andLeder, Proc. Natl. Acad. Sci., 69:1408
-1412 (1972) ）の方法に従って単離した。 【００３９】３．ｃＤＮＡの合成 オリゴ（ｄＴ）‐選択ヒト内皮ＲＮＡをブェル等（Buel
l, et al., J. Biol Chem. 253:2471-2482 (1978) ）の
方法によりｃＤＮＡの合成のための鋳型として用い、２
本鎖ｃＤＮＡをウィッケンス等（Wickens, et al., J．
Biol. Chem. 253: 2483-2495 (1978) ）により説明され
るようにして調製した。このｃＤＮＡをウルリッチ等
（Ullrich, et al., Science, 196: 1313-1319 (1977)
）により説明されるようにしてＳ１ヌクレアーゼで平
滑末端にし、引続くＥ．コリ ＤＮＡポリメラーゼＩの
クレノウ断片による処理をウォーテル及びレニコフ（Wa
rtelland Resnikoff, Gene, 9: 309-319 (1980)）によ
り説明されるようにして行った。このｃＤＮＡを次いで
ＥｃｏＲＩメチラーゼで修飾し、ＥｃｏＲＩリンカーに
連結し、及びヒュイン等（Huynh, et al., DNA Cloning
Volume 1: a practicalapproach, D.M.Glover 編、IRL
Press Ltd., 英国オックスフォード４９−７８頁（１
９８５））により説明されるようにしてＥｃｏＲＩで徹
底的に消化した。 【００４０】４．ヒト内皮λｇｔ１１ ｃＤＮＡライブ
ラリーの造築及びスクリーニング ＥｃｏＲＩ‐連結ｃＤＮＡを上記ヒュイン（Huynh ）
（１９８５）により説明されるようにしてＥｃｏＲＩ消
化及びホスファターゼ処理λｇｔ１１に連結した。この
組換え相をエンキスト及びスターンバーグ（Enquist an
d Sternberg 、Methods Enzymol., 68: 281-298(1979)
）により説明されるようにしてパッケージし、上記ヒ
ュイン（Huynh)（１９８５）により説明されているよう
にしてＥ．コリ Ｙ１０８８（ＡＴＣＣ ３７１９５）
中で増幅した。Ｅ．コリ Ｙ１０９０（ＡＴＣＣ ３／
１９）細胞を内皮細胞λｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリ
ーで感染させ、抗‐ラミニンレセプターモノクローナル
抗体２Ｈ５（リオッタ等 Liotta et al., Exp. Cell Re
s., 156: 117-126 (1985) ）を用いてヤング及びデービ
ス（Young and Davis 、Science, 222: 778-782 (198
3)）により説明されるようにしてラミニンレセプターβ
‐ガラクトシダーゼ融合タンパク質の抗体認識により１
５０万個のプラークをスクリーニングした。この抗体は
ラミニンレセプターのリガンド結合を認識するか或いは
妨害する（上記リオッタ等 Liotta et al.,(1985)）及
びトーゴー等 Togo et al, Basement Membrans, S. Shi
bata編、ニューヨーク州、エルセヴィア、３２５〜３３
３頁（１９８５））。抗体結合は上記例１ Ａ４で説明
したように、ペルオキシダーゼ‐複合アフィニティ精製
ウサギ抗‐マウスＩｇＭを用いて検出した。陽性プラー
クをベントン及びデービス（Benton and Davis, Scienc
e, 196：180-182 ）により説明されるようにして同定、
増幅及び再スクリーニングして精製した。プラークを含
有するフィルターを抗‐ヒトα‐アミラーゼ及び抗‐ヒ
トアルブミン（上記例１４Ａに説明された通りのもの）
並びに抗‐ラットラミニン（アルブレクトセン等 Albre
chtsen, et al.,Cancer Res., 41: 5076-5081 (1981)
）を包合するコントロール抗体に対して反応させた。 【００４１】５．サザーンブロットハイブリダイゼーシ
ョン ファージＤＮＡはマニアチス等（Maniatis, et al., Mo
lecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold SpringHa
rbor Laboratory 、ニューヨーク州、コールドスプリン
グハーバー、７７−８５頁（１９８２））により説明さ
れたようにして単離された。制限エンドヌクレアーゼ‐
消化ＤＮＡをアガロースゲルを通して電気泳動させ、ニ
トロセルロース紙に移し、及びサザーンの方法（Southe
rn, Methods Enzymol., 68: 152-176 (1979)）によりハ
イブリダイズさせた。32Ｐ‐標識化プローブをマニアチ
ス等（Maniatis, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.、7
2:1184-1188 (1975)）に説明されるようにしてニックト
ラスレーションにより調製した。 【００４２】６．プラスミド及びｃＤＮＡインサートの
サブクローニング及び調製 ｃＤＮＡインサートをλｇｔ１１の左腕に結合するＥｃ
ｏＲＩ部位は全ての６個のクローン中に存在しない。従
って、ＰｖｕII部位１１ｂｐ下流を利用して最大の組換
えファージＥＬＲ４からｃＤＮＡインサートを精製し
た。λＥＬＲ４のＥｃｏＲＩ−ＰｖｕII制限断片をｐＢ
Ｒ３２２のＥｃｏＲＩ‐ＰｖｕII部位にサブクローニン
グしてｐＬＲ４−１を作成し、及びｐＵＣ８のＥｃｏＲ
Ｉ‐ＨｉｎｄIIポリリンカー部位にサグクローニングし
てｐＬＲ４−２を作成した。引続き、長いポリ（Ａ）尾
部からｃＤＮＡ配列決定を容易にするためにｐＬＲ４−
１のＥｃｏＲＩ‐ＰｓｔＩ制限断片をｐＢＲ３２２のＥ
ｃｏＲＩ‐ＰｓｔＩ部位にサブクローニングしてｐＬＲ
４−４を作成した。ｐＢＲ３２２の組換え体をＥ．コリ
Ｃ６００ｒｍ（ＡＴＣＣ ３３５２５）中に形質転換
し、及びｐＵＣ組換え体をＥ．コリ ＪＭ １０３中に
形質転換した（メッシング等、Messing, et al., Nucle
ic Acids Res., 9: 309-321 、マンデル及びヒガ（Mand
el and Higa, J. Mol. Biol., 53: 159-162 (1970)）の
塩化カルシウム法による）。スーパーコイル化プラスミ
ドＤＮＡをビルンボイン及びドリー（Birnboin and Dol
y, Nucleic Acids Res., 7: 1513- 1523 (1979) ）によ
る方法に従ったエチジウブロマイド‐セシウムクロライ
ド中の平衡遠心分離後にフルカリ溶解により回収した。
ｃＤＮＡインサートを制限ＤＮＡから単離し、アクリロ
アミドゲルからソーベル等（Sobel,et al., Proc. Sc
i., 75: 5846-5850 (1978)）により説明されるようにし
て溶出した。 【００４３】Ｂ．結 果 １．抗体認識によるラミニンレセプターｃＤＮＡの選択 ヒト内皮細胞λｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリーを抗‐
ラミニンレセプターモノクローナル抗体２Ｈ５を用いて
スクリーニングした。上記材料及び方法において説明さ
れるように、この抗体は（ａ）免疫ブロット上のラミニ
ンレセプターを特異的に認識し、（ｂ）ＥＬＩＳＡによ
り精製ラミニンレセプターを認識し（図２）、（ｃ）血
漿膜或いは細胞のいづれかへのラミニンの結合を妨害
し、及び（ｄ）細胞の羊膜基底膜への結合を阻害する。
これらの性質は明らかに、このモノクローナル抗体がラ
ミニンレセプターのラミニン結合領域を認識するか或い
は妨害することを示す。６個のプラークを先ず選択し
た。プラーク精製後、λＥＬＲ１−６と命名された全て
の６個のファージは抗‐ラミニンレセプターモノクロー
ナル抗体と激しい反応を示したが、しかし、ヒトα‐ア
ミラーゼに向けられたクラス適合（ＩｇＭ）モノクロー
ナル抗体或いはラミニンに対して向けられた或いはアル
ブミンなどのラミニンレセプターと大きさの同様なタン
パク質に向けられた抗体のいずれにも何等の反応性も示
さなかった（図３および図４）。 【００４４】２．λＥＬＲ１〜６の共通領域 ６個のファージ、λＥＬＲ１〜６の制限エンドヌクレア
ーゼ消化はｃＤＮＡインサートの３′末端をλｇｔ１１
の左腕に結合するＥｃｏＲＩ部位は全ての６個のファー
ジにはないことを示した。ＳａｃＩ、ＫｐＩ、Ｈｉｎｄ
III及びＥｃｏＲＩを用いる単一、二重及び三重エンド
ヌクレアーゼ消化を行って、λＥＬＲ１〜６のマッピン
グを行った。図４にまとめて示されるこれらの実験は、
（ａ）ｃＤＮＡインサートの大きさは約４５０〜９７５
ｂｐの範囲であり、（ｂ）全てのクローンはクローンの
３′末端から約４５０〜５００ｂｐの内部ＳａｃＩ部位
を共有し、（ｃ）λＥＬＲ６のインサートは内部Ｓａｃ
Ｉ部位に僅かに約２０ｂｐ５′延びるにすぎず、及び
（ｄ）λＥＬＲ１及びλＥＬＲ４のインサートは５′Ｅ
ｃｏＲＩ部位からそれぞれ約３０及び４０ｂｐのＨｉｎ
ｄ III部位を共有することを示した。これらの６個の組
換えファージはこのようにＳａｃＩ部位への丁度５′か
ら各ｃＤＮＡインサートの３′末端までに延圧する共通
の４５０〜５００ｂｐ領域を有し、この領域がモノクロ
ーナル抗体２Ｈ５により認識される領域をコード化する
ことを示唆する。この観察は６個の組換えファージの各
々からＤＮＡのＫｐｎＩ‐ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩ‐Ｓ
ａｃＩ二重消化物がλＥＬＲ４から単離されたＰｓｔＩ
‐ＳｐｈＩ制限断片にストリンジェントにハイブリダイ
ズされたサザーンブロット実験により試験された。図４
に示される代表的ハイブリダイゼーション実験は全ての
６個の組換えファージの共通４５０〜５００ｂｐ領域が
モノクローナル抗体２Ｈ５により認識される抗原領域を
コード化することを示す。 【００４５】例III ：ｃＤＮＡ配列決定 Ａ．材料及び方法 １．ＤＮＡ配列決定 λＥＬＲ４からのｃＤＮＡは図６に示される術策に従っ
て配列決定された。ギルバート及びマクサム（Gilbert
and Maxam, Proc. Natl. Acad. Sci., 70:3581-3584 (1
973)）の両方の化学的修正方法が用いられた。前者の場
合において、上記例IIＡ６に説明されるサブクローンｐ
ＬＲ４−１、ｐＬＲ４−２及びｐＬＲ４−４のｃＤＮＡ
制限断片は５′末端を、上記ギルバート及びマクサム
（１９７３）により説明されるようにＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（Boehringer-Mannheim ）及び（γ‐
Ｐ32）ＡＴＰにより処理するか、或いは３′テーリィン
グキット（Amersham）を用いて（α‐Ｐ32）ジデオキシ
ＡＴＰで３′末端をテーリングすることにより標識化し
た。ジデオキシ合成法の場合には、ＥＬＲ４のＥｃｏＲ
Ｉ‐ＳａｃＩ制限断片をＭ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ
１９中にサブクローン化した（ヤニッシュ‐ペラン等 Y
anisch-Perran, et al., Gene, 33: 103-119(1981)）。 【００４６】Ｂ．結 果 １．λＥＬＲ４のｃＤＮＡインサートのヌクレオチド及
び演繹アミノ酸配列 λＥＬＲ４のｃＤＮＡインサートの配列はλｇｔ１１ベ
クターの右腕のＥｃｏＲＩ挿入部位と一致する２５３個
のアミノ酸開放読取り枠を示す。２Ｈ５エピトープ（上
記例II Ｂ２参照）により認識される「共通領域」の配
列は図７および図８のヌクレオチド３６１からヌクレオ
チド７６５まで延びる。それは上記例Ｉｂ２に説明され
る胎盤ラミニンレセプターの精製シアノーゲンブロマイ
ド‐発生オリゴペプチドのそれと同一のオクタペプチド
コード化配列（ヌクレオチド４０９〜４３２）を包合す
る。この配列内にはラミニンレセプターのカルボキシ末
端に向かう３個のアミノ酸により分離された６個のアミ
ノ酸繰返しがみられる。このアミノ酸繰返しをコード化
するｃＤＮＡ配列は同一ではない（ヌクレオチド６７０
〜６８７及び６９７−７１４）。オーカー停止コドンに
引続き、λＥＬＲ４ ｃＤＮＡインサートは長いポリ
（Ａ）伸長から上流の標準的なポリアデニル化シグナル
ＡＡＴＡＡＡ １７ｂｐを含む６６ｂｐの３′未翻訳領
域を含む。３′未翻訳領域及びポリ（Ａ）尾部の長さを
差し引いた後、λＥＬＲ１〜６の共通ｃＤＮＡ領域によ
り規定されるような２Ｈ５エピトープの最大の可能性の
ある程度は３９３ｂｐ即１３１個のアミノ酸まで狭めら
れうる。ウィルバン及びリップマン(Wirbun and Lipma
n，Proc. Natl. Acad. Sci., 80: 726-730 (1983)）の
方法によるコンピュータ分析は公知のタンパク質配列へ
の有意な同族性を示さない。 【００４７】ラミニンレセプターの潜在的膜張渡し領域
は図７および図８の５２〜８４のヌクレオチドによりコ
ード化される１１個のアミノ酸疎水性ポリペプチドを含
み得ることが認められる。 【００４８】例IV：ｃＤＮＡ‐由来合成ラミニンレセプ
ターペプチドの抗体認識 Ａ．材料及び方法 １．抗血清の調製 ラミニンレセプターはヒト転移乳癌から上記例Ｉ Ａ１
と同様にして精製した。２０μｇの精製ラミニンレセプ
ターを上記例Ｉ Ａ５と同様にしてＮａＤｏｄＳＯ４‐
ポリアクリルアミドゲルを通して電気泳動し、ゲルから
切出した。ウサギをアルブレックセン等（Albrecktsen,
et al., Cancer Res. 41: 5076-5081 (1981)）により説
明されるようにしてタンパク質で免疫化した。血清を抗
原注射開始前（前免疫血清）及び各ブースター注射後１
０日目に集めた。 【００４９】２．ＩＬＩＳＡ ＩＬＩＳＡは上記例IV Ａ１で説明したようにして得ら
れた前免疫及び免疫血清を用いて、上記例ＩＡ４と同様
に行った。 【００５０】３．合成ペプチドＲＴＬＲ２ 配列： Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ −Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ −Ｔｈｒ−Ａｌａ を含有するＲＴＬＲ２と命名される合成ペプチドは周知
の標準的方法に従ってペニンスラ・ラボラトリーズ社
（Penninsula Laboratories, Inc. カリフォルニア州ベ
ルモント）により提供された。この配列は図７および図
８におけるヌクレオチド６６７−７２６から選ばれた。 【００５１】Ｂ．結 果 １．抗‐ラミニンレセプター抗血清による合成ペプチド
の認識 λＥＬＲ４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列６６７−７２
６（図７および図８）を用いてペプチド配列を予測し
た。合成ペプチドＲＴＬＲ２（例IVＡ３）は腫瘍ラミニ
ンレセプターに対して向けられたウサギ抗血清によるＥ
ＬＩＳＡにおいては認識されたが、しかし前免疫血清に
よっては認識されなかった（図９）。このペプチドは例
III Ｂ２において説明された二つの６個のアミノ酸繰返
しを含み、予測された反転立体配置を有する。 【００５２】例Ｖ：ラミニンレセプターｃＤＮＡのＲＮ
Ａへのハイブリダイゼーション Ａ．材料及び方法 １．細胞系 ＭＣＦ‐７ヒト乳癌細胞系（親）はミシガン癌財団（Mi
chigan Cancer Foundation）により提供された。二つの
クローン化ＭＣＦ‐７細胞系ＭＣＦ７‐５Ｈ＆及びＭＣ
Ｆ７‐３Ｅ５はＰ．ホランハンド（P. Horan Hand ，Na
tional CancerInstitute ）から得られ、グライナー等
（Greiner, et al., Int. J. Cancer, 36: 159-166 (19
85) ）により説明されている。ＺＲ‐７５ヒト乳癌系は
エンゲル及びヤング（Engel and Young, Cancer Res.，
38: 4327-4339 (1978)）により説明され、Ｌ．エンゲル
（L. Engel, National Cancer Institute ）から得ら
れ、及びヒト腎癌系Ａ‐７０４はＳ．アーロンソン（S.
Aaronson, National CancerInstitute ）から得られ、
ギャード等（Giard, et al., J. Natl. Cancer Inst.,
51: 1417-1423 (1973)）により説明されている。ヒトＰ
ａｎｃ‐１細胞系はアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（American Type Culture Collection）か
ら得られた。ネズミＮＩＨ‐３Ｔ３細胞及びそのキルス
テン（Kirsten）ウイルス‐形質転換誘導体（ＫＮＩ
Ｈ）は、Ｍ．ゴッテスマン（M. Gottesman, National C
ancerInstitute）から得られ、それらの生育はゴッテス
マン（Gottesman, Proc. Natl. Acad. Sci., 75:27657-
2771(1978)）により説明されている。ネズミＦ９奇形癌
細胞及びそれらのジフチリル環状ＡＭＰプラスレチン酸
分化誘導体（ストリックランド等 Strickland, et al.,
Cell ，21: 347 〜355 (1980)）は、Ｗ．アンダーソン
（W.Anderson, National Cancer Institute ）から得ら
れた。ラットＬ２細胞系はユーワー（Wewer, Dev. Bio
l., 93:416-421 (1982)）により説明されている。 【００５３】２．ＲＮＡの調製 ＲＮＡは上記例IIＡ２と同様にして細胞培養物から或い
はストローマン等（Strohman, et al., Cell, 10:265-2
73 (1977) ）により説明されているグアニジン‐塩酸塩
法により調製された。 【００５４】３．ノーザンハイブリダイゼーション ５μｇの全細胞ＲＮＡをメチル水銀／アガロースゲル上
で分離し、ソーベル等（Sobel, et al., Biochemistry
，20: 2678-2684 (1981)）により説明されているアル
ウィン等（Alwine, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,
74: 5350-5354 (1977)）の方法によりジアゾベンジルオ
キシメチルセルロース紙（シュライヒャー及びシューエ
ルSchleicher and Schuell）に移した。フィルターを上
記例II Ａ５と同様にしてニックトランスレーションさ
れたｃＤＮＡインサートにハイブリダイズした。ラジオ
オートグラフの各種時間曝露を濃度測定法により測定し
て線形応答範囲を求めた。ブロットをアクチンｃＤＮＡ
プローブ（クリーブランド等Cleveland, et al., Cell,
20：95-105 (1980) により説明された）を用いて、及
び熱衝撃ｃＤＮＡプローブ（ヒッケイ等Hickey, et a
l., Gene，43: 147-154(1986)により説明された）を用
いて逆スクリーニングして等量のＲＮＡが移されたこと
を確認した。 【００５５】４．ラミニン結合アッセイ 各細胞系の細胞当りのラミニンレセプターの数をリオッ
タ等（Liotta, et al., Exp. Cell Res. 156: 117-126
(1985) ）により説明されたように対数生育期細胞に対
する特異的結合（ 125Ｉ）‐標識化ラミニンのScatchar
d プロットから計算した。 【００５６】Ｂ．結 果 １．ヒトラミニンレセプターｍＲＮＡの発現 ラミニンレセプターの量及び表面分布は各種癌性ヒト組
織において異ることが従来報告された（ホランハンド等
Horan Hand et al., Cancer Res., 45: 2713-2719 (19
85) ）。一般的に、悪性組織はそれらの細胞表面上によ
り多くの未占有ラミニンレセプターを有し、それらのよ
り良性の対照物よりもより多くのラミニンに結合する。
ラミニンレセプターｍＲＮＡレベルがリガンド結合に利
用可能な細胞表面ラミニンレセプターの量の決定に役割
を果たすか否かを決定するためにノーザンブロット実験
が行われた（図１０）。ラミニンレセプターｃＤＮＡイ
ンサートは推定された大きさのラミニンレセプターを有
するタンパク質をコード化するのに十分な長さの約１７
００ベースのｍＲＮＡを認識する。各種ヒト表皮細胞系
からのハイブリダイズされたＲＮＡのレベルは異った。
特に、転移乳癌細胞系ＭＣＦ‐７からのＲＮＡに対して
は、非転移乳癌細胞系ＺＲ‐７５からのＲＮＡに対する
よりも大きなハイブリダイゼーションがあった。一般的
にハイブリダイズしたＲＮＡのレベルは直接ラミニン結
合アッセイと相関関係があり（図１１）、レセプターの
生合成に利用可能なラミニンレセプターｍＲＮＡの量は
ラミニン基底膜への細胞結合の調節における律速制御工
程であることを示唆する。よって、ヒト腫瘍組織におけ
るラミニンレセプターｍＲＮＡレベルの決定を診断的に
用いてラミニンレセプター含量に基づき腫瘍の相対的攻
撃性或いは治療処法に対する感受性を予測することがで
きる。上記の如く、これは、ラミニンレセプターｃＤＮ
Ａをプローブとして用いる切断された腫瘍物質のノーザ
ンブロットハイブリダイゼーション或いはin situ ハイ
ブリダイゼーションにより達成することができる。ラミ
ニンレセプターｃＤＮＡは周知の次の標準的技術に従う
各種手段により上記操作のためのプローブとして調製さ
れる。例IIＡ５において説明したニックトランスレーシ
ョン操作を用いて（32Ｐ）、（35Ｓ）、或いは（ 3Ｈ）
のいずれかでｃＤＮＡインサートを放射線認識すること
ができる。或いは又、ラミニンレセプターｃＤＮＡイン
サートをプラスミドにサブクローン化してメルトン等
（Melton, et al., Nucleic Acids Res., 12: 7035-705
6 (1984)）により説明される方法により放射線認識ＲＮ
Ａの転写を行うことが可能である。発色検出計を組合わ
されたビオチニル化ＲＮＡ及びＤＮＡハイブリダイゼー
ションプローブも又例えばランガー等（Langer，et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. 78:6633-6637(1981)）及
びレアリー等（Leary, et al., Proc. Natl. Acad.Sci.
80: 4045-4049 (1983) ）により説明されている。 【００５７】２．ラミニンレセプターｍＲＮＡの他の種
における検出 ラットＬ２細胞及びＮＩＨ ３Ｔ３及びＦ９奇形癌など
のネズミ細胞からのＲＮＡ及びそれらの誘導体を含有す
るノーザンブロットも又約１７００塩基のｍＲＮＡを検
出した。このように、ヒトラミニンレセプターｃＤＮＡ
インサートは他の脊椎動物種からのＲＮＡに交差ハイブ
リダイズすることができる（データは示さず）。 【００５８】例VI：ラミニンレセプターの多形性 Ａ．材料及び方法 １．交差ハイブリダイジングラミニンレセプターｃＤＮ
Ａの同定 例II Ａ４において説明したヒト内皮細胞λｇｔ１１
ｃＤＮＡライブリーを用いてＥ．コリ Ｙ１０８８細胞
（ＡＴＣＣ ３７１９５）を感染させ、ベントン及びデ
ービス（Benton and Davis, Science, 196: 180-182 (1
977)）のプラークハイブリダイゼーション操作によりλ
ＥＬＲ４からの32Ｐ‐標識化ｃＤＮＡインサートを用い
てスクリーニングした。陽性プラークを上記ベントン及
びデービスに説明されるように、同定及び増幅及び再ス
クリーニングして生成した。 【００５９】２．ＤＮＡ配列決定 陽性ファージのｃＤＮＡインサートを例II Ａ６と同様
にしてｐＵＣベクターのＥｃｏＲＩ部位中にサブクロー
ン化し、ｃＤＮＡ配列をギルバート及びマクサム（Gilb
ert and Maxam, Proc. Natl. Acad. Sci., 70:3581-358
4 (1973)）の方法により決定した。 【００６０】３．ヒトゲノムＤＮＡの単離 ゲノムＤＮＡをブリン等（Blin, et al., Nucleic Acid
s Res., 3: 2303-2308(1976) ）により説明されるよう
にしてドデシル硫酸ナトリウム及びプロティナーゼＫに
よるおだやかな消化により上記例Ｖ Ａ１において説明
されたヒト細胞系から単離した。 【００６１】４．サザーンハイブリダイゼーション 上記細胞系並びにヒト肝臓（Ｍ．ヤング M. Young, Na
tional Institute ofDental Research から取得）から
のゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｔ III、ＢａｍＨ
Ｉ或いはＸｂａＩで徹底的に消化し、アガロースゲル上
で電気泳動させニトロセルロース上に移し、上記例II
Ａ５と同様にλＥＬＲ４ ｃＤＮＡにハイブリダイズさ
せた。 【００６２】Ｂ．結 果 １．ｃＤＮＡ配列比較 部分的ｃＤＮＡ配列を組換えファージλＥＬＲ１０、λ
ＥＬＲ１４、λＥＬＲ１０６、λＥＬＲ１１２に対して
決定した。５′ＥｃｏＲｉ部位からλＥＬＲ１４の内部
ＳａｃＩ部位までの配列は図７および図８のヌクレオチ
ド７‐３８１に完全に対応し、λＥＬＲ４からの上流の
９６個の追加の塩基を含む。他の分析されたクローンは
λＥＬＲ４配列に対する高い同族性を示すが、しかし、
多数の点突然変異を含有する。他のクローンのそれぞれ
に対しては開放翻訳読取り枠はなく、それらが擬ラミニ
ンレセプター遺伝子のｃＤＮＡであることを示唆する。 【００６３】２．ゲノムＤＮＡ分析 ヒト肝臓及び各種ヒト細胞系からの高分子量ゲノムＤＮ
Ａのサザーンブロット分析は多数のハイブリダイズ化Ｄ
ＮＡバンドを示す。これはヒトゲノム中にその全てが交
差ハイブリダイズする多数のラミニンレセプター遺伝子
があることを示唆する。加えて、各々独特のＤＮＡを含
有する多数のプラークが部分的にＡｌｕＩ／Ｈａｅ III
で消化されたヒトゲノムＤＮＡのλシャロン４Ａライブ
ラリー（Ｔ．マニアチス、T. Maniatis ，ハーバード大
学から取得）から上記プラークハイブリダイゼーション
法により単離された。これらの知見は多数の交差ハイブ
リダイズ化ラミニンレセプター遺伝子が同一でないこと
を示唆する。一つの可能性はヒトゲノムが一つの活性ラ
ミニンレセプター遺伝子及び数個の擬遺伝子を含有する
ことである。擬遺伝子から転写されたｍＲＮＡは細胞質
に到達するのに十分安定であり、又、in vitroで転写さ
れてｃＤＮＡを作り、及びそれらの対応するｃＤＮＡは
λＥＬＲ１〜６などの真正ラミニンレセプターｃＤＮＡ
と交差ハイブリダイズし、ノーザンブロットにおける代
替的ハイブリダイゼーションプローブとして用いること
ができる。しかしながら、擬遺伝子の５′末端における
多数の翻訳停止コドンにより、ラミニンレセプタータン
パク質はそれから合成されない。全ての単離ラミニンレ
セプターｃＤＮＡ（開放読取り枠中）が真正のラミニン
レセプターｃＤＮＡとしての資格を有するためにはλＥ
ＬＲ４ ｃＤＮＡ配列により予測されるアミノ酸をコー
ド化する必要がある。 【００６４】例VII ：合成ラミニンレセプターペプチド
類 Ａ．材料及び方法 １．合成ラミニンレセプターペプチド類 合成ペプチドＲＴＬＲ２‐２０は図７および図８のヌク
レオチド６６７−７２６から得られ、上記系IV Ａ３に
おいて説明されている。第一のプロリンが欠失し、スレ
オニン及びグルタメート残基がそれぞれリジン及びロイ
シンにより置換されているコントロールペプチドはＲＴ
ＬＲ２‐コントロールと命名される。合成ペプチドＲＴ
ＬＲ３は配列Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈｉｓ
−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−
Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖ
ａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇを含有し、図７および図８におけ
るヌクレオチド３７３−４３２から得られた。予測され
た逆転を含まないコントロールペプチドも又合成され
た。コントロールペプチドＲＴＣ１は配列Ｓｅｒ−Ｓｅ
ｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ
−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇ
ｌｙを含有する。コントロールペプチドＲＴＣ２は配列
Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを含有する。コントロールペプチ
ドＲＴＣ３は配列Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｍ
ｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇを含有する（図７および
図８のヌクレオチド３９７〜４２０から得られる）。全
ての合成ペプチド類は例Ｉ Ａ３と同様にして逆相ＨＰ
ＬＣにおいて精製され、周知の標準的方法に従ってペニ
ンシュラ・ラボラトリーズ社（Penninsula Laboratorie
s, Inc.,カリフォルニア州、ベルモント）より提供され
た。勿論、本発明のクローンを用いて周知の標準的技術
に従ってペプチドを合成すすることができる。λＥＬＲ
１〜６クローンはそれらのハイブリッドβ‐ガラクトシ
ダーゼラミニンレセプターペプチド類を発現する能力に
より選ばれた。このｃＤＮＡインサート或いはその断片
は例えばマニアティス等（ Maniatis, et al., Molecul
ar Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbo
r Loboratory, ニューヨーク州、コールドスプリングハ
ーバー、４０４〜４３０頁（１９８２））により総括さ
れているように、その他のベクターにサブクローン化し
て他の融合タンパク質或いは非融合タンパク質を製造す
ることができる。 【００６５】２．結合アッセイ Ｇ．トダロ（G. Todaro, National Cancer Institute）
により供給されるＡ２０５８ヒトメラノーマ細胞の、合
成ラミニンレセプターレセプターペプチドの存在下で
の、ラミニンに特異的に結合する能力を例IVＡ４と同様
にして試験した。合成ペプチドＲＴＬＲ２及びＲＴＬＲ
３並びにコントロールペプチドをブラウン等（Brown, e
t al., Bio-chemistry, 18:4901 〜4906 (1979) ）によ
るｐ‐ニトロフェニルエステルガラスビーズを用いて、
インキュベーションにより固体支持体に結合した。この
ビーズはＡ．デイ（A. Day, Medical College of Virgi
nea ）から得られた。ペプチドを次いで（Ｉ125 ）ラミ
ニンとインキュベートし、結合（Ｉ125 ）ラミニンの量
を求めた。 【００６６】３．転移アッセイ 転移ＢＬ６ネズミメラノーマ細胞はＩ．ハート博士（D
r. I. Hart, FrederickCancer Research Center,メリー
ランド州、フレデリック）から得た。新たにトリプシン
化した細胞を各種濃度の合成ペプチドＲＴＬＲ２（前
記）と混合し、約５×１０4 個の細胞をリオッタ等（Li
otta et al., Nature, 284: 682-688 (1980)の方法によ
りヌードマウス当り０．１の容量で静脈内（i.v.）注射
した。マウスは各群１０匹であった。動物を３1/2 週に
おいて殺し、転移の数を求めた。同様な疎水性変化のＲ
ＴＣ１などのコントロール合成ペプチドは転移の数に何
等の影響を及ぼさなかった。 【００６７】Ｂ．結 果 １．結合研究 合成ペプチド類をｃＤＮＡ配列に基づいて製造し（図７
および図８）、ラミニンレセプター‐リガンド結合機構
を研究するために用いた。合成ペプチドＲＴＬＲ２の存
在はヒトＡ２０５８メラノーマ細胞のラミニンに結合す
る能力を抑制したが、そのコントロール対照物（ＲＴＬ
Ｒ２‐コントロール）は抑制しなかった（図１２）。こ
れはそのリガンドに対するレセプターの少なくとも一つ
の結合領域がＲＴＬＲ２配列内に含有されていることを
示唆する。更に、各種合成ペプチドを（Ｉ125 ）のラミ
ニンとインキュベートし、結合することのできる標識化
リガンドの量を測定したところ、ＲＴＬＲ２‐ペプチド
はＲＴＬＲ３或いは３個のその他のコントロールペプチ
ドよりもより多い結合活性を有した（図１３）。そのよ
うな研究はｃＤＮＡ‐由来ラミニンレセプターペプチド
を用いて各種生物学的機能に含まれるラミニンレセプタ
ーの特異的領域を求めることができることを示唆する。 【００６８】２．転 移 ｃＤＮＡ配列から発生した合成ペプチド類を用いて癌転
移を抑制することができる。ＢＬ６メラノーマ細胞から
の転移の数は合成ＲＴＬ２断片を細胞と共にマウス中に
共注射した際に減少した（表１）。如何なる理論にも拘
束されるものではないが、合成ラミニンレセプター断片
は転移のコロニー化を防止するものと想定される。その
ような結果は、ｃＤＮＡ発生合成ラミニンレセプター断
片が癌治療における転移の抑制に有用であることを示唆
する。 【００６９】 【００７０】５×１０4 のＢＬ６メラノーマ細胞を各種
濃度の合成ラミニンレセプターＲＴＬＲ２と混合し、各
ヌードマウス（群当り１０匹）に０．１mlの容量で静脈
内注射した。動物を３1/2 週間後に殺し、肺における転
移の数を求めた。 【００７１】ここに説明した具体例及び実施態様は例示
を目的とするのみであり、それに照した各種修正或いは
変化が当業者に示唆され、本願の精神及び趣旨及び冒頭
に掲げた特許請求の範囲に含まれるべきことが了解され
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】精製ラミニンレセプターの均質性を示した図で
ある。上段は大腸癌からの及び正常ヒト胎盤組織からの
精製ラミニンレセプターの比較を示す。レーンＰ１：ヒ
ト胎盤組織から単離されたラミニンレセプター（１μ
ｇ）、レーンＣａ：ヒト大腸癌から単離されたラミニン
レセプター（３μｇ）、レーンＭ：分子量マーカー：ホ
スホリラーゼｂ（９４，０００）、ウシ血清アルブミン
（６７，０００）及びオバルブミン（４３，０００）。
下段は精製ラミニンレセプターの等電集中及び二次元ゲ
ル電気泳動を示す。 【図２】精製ラミニンレセプターのＥＬＩＳＡを示した
図である。□：ＬＲ１モノクローナル抗体２Ｈ５、○：
抗アルブミン、●：抗‐α‐アミラーゼモノクローナル
抗体。 【図３】抗ラミニンレセプターモノクローナル抗体のλ
ＥＬＲ６に対する特異性を示した図である。 【図４】抗ラミニンレセプターモノクローナル抗体のλ
ＥＬＲ６に対する特異性を示した図である。 【図５】λＥＬＲ１〜６の重畳ラミニンレセプターｃＤ
ＮＡインサートを示した図である。 【図６】λＥＬＲ４のｃＤＮＡインサートの配列決定の
術策を示した図である。λＥＬＲ４のサブクローン化イ
ンサートの制限地図を上段に示す。Ｅ：ＥｃｏＲＩ、
Ｈ：ＨｉｎｆＩ、Ｓ：ＳｐｈＩ、Ｒ：ＲｓａＩ、Ｐ：Ｐ
ｓｔＩ、＊：オーカー集結コドン、●：５′末端におけ
る（γ‐Ｐ32）ＡＴＰによるキナーゼ化、○：３′末端
における（α‐Ｐ32）ジデオキシＡＴＰによるテーリン
グにより、ｒ：ジデオキシ合成法。 【図７】λＥＬＲ ｃＤＮＡインサートのヌクレオチド
配列を示した図である。 【図８】λＥＬＲ ｃＤＮＡインサートのヌクレオチド
配列を示した図である。 【図９】合成ラミニンレセプターペプチドのＥＬＩＳＡ
決定を示した図である。 【図１０】ＲＮＡゲルブロットハイブリダイゼーション
を示した図である。レーン１：ＭＣＦ‐７（親）、レー
ン２：ＭＣＦ７‐３Ｅ５、レーン３：ＭＣＦ７‐５Ｈ
７、レーン４：ＺＲ７５。 【図１１】ラミニンレセプターｍＲＮＡレベルと６個の
ヒト癌細胞系のラミニンに結合する能力との相関関係を
示した図である。□：ＭＣＦ‐７親、△：ＭＣＦ‐７ク
ローン５Ｈ７、黒ぬり四角形：ＭＣＦ‐７クローン３Ｅ
５、○：ＺＲ‐７５、●：腎癌Ａ‐７０４、黒ぬり三角
形：Panc‐１。 【図１２】合成ラミニンレセプターペプチドが細胞への
ラミニン結合を抑制することを示した図である。□：Ｒ
ＴＬＲ２、黒ぬりひし形：ＲＴＬＲ２‐コントロール 【図１３】リガンド結合に含まれる合成ペプチドラミニ
ンレセプターの同定を示した図である。
ある。上段は大腸癌からの及び正常ヒト胎盤組織からの
精製ラミニンレセプターの比較を示す。レーンＰ１：ヒ
ト胎盤組織から単離されたラミニンレセプター（１μ
ｇ）、レーンＣａ：ヒト大腸癌から単離されたラミニン
レセプター（３μｇ）、レーンＭ：分子量マーカー：ホ
スホリラーゼｂ（９４，０００）、ウシ血清アルブミン
（６７，０００）及びオバルブミン（４３，０００）。
下段は精製ラミニンレセプターの等電集中及び二次元ゲ
ル電気泳動を示す。 【図２】精製ラミニンレセプターのＥＬＩＳＡを示した
図である。□：ＬＲ１モノクローナル抗体２Ｈ５、○：
抗アルブミン、●：抗‐α‐アミラーゼモノクローナル
抗体。 【図３】抗ラミニンレセプターモノクローナル抗体のλ
ＥＬＲ６に対する特異性を示した図である。 【図４】抗ラミニンレセプターモノクローナル抗体のλ
ＥＬＲ６に対する特異性を示した図である。 【図５】λＥＬＲ１〜６の重畳ラミニンレセプターｃＤ
ＮＡインサートを示した図である。 【図６】λＥＬＲ４のｃＤＮＡインサートの配列決定の
術策を示した図である。λＥＬＲ４のサブクローン化イ
ンサートの制限地図を上段に示す。Ｅ：ＥｃｏＲＩ、
Ｈ：ＨｉｎｆＩ、Ｓ：ＳｐｈＩ、Ｒ：ＲｓａＩ、Ｐ：Ｐ
ｓｔＩ、＊：オーカー集結コドン、●：５′末端におけ
る（γ‐Ｐ32）ＡＴＰによるキナーゼ化、○：３′末端
における（α‐Ｐ32）ジデオキシＡＴＰによるテーリン
グにより、ｒ：ジデオキシ合成法。 【図７】λＥＬＲ ｃＤＮＡインサートのヌクレオチド
配列を示した図である。 【図８】λＥＬＲ ｃＤＮＡインサートのヌクレオチド
配列を示した図である。 【図９】合成ラミニンレセプターペプチドのＥＬＩＳＡ
決定を示した図である。 【図１０】ＲＮＡゲルブロットハイブリダイゼーション
を示した図である。レーン１：ＭＣＦ‐７（親）、レー
ン２：ＭＣＦ７‐３Ｅ５、レーン３：ＭＣＦ７‐５Ｈ
７、レーン４：ＺＲ７５。 【図１１】ラミニンレセプターｍＲＮＡレベルと６個の
ヒト癌細胞系のラミニンに結合する能力との相関関係を
示した図である。□：ＭＣＦ‐７親、△：ＭＣＦ‐７ク
ローン５Ｈ７、黒ぬり四角形：ＭＣＦ‐７クローン３Ｅ
５、○：ＺＲ‐７５、●：腎癌Ａ‐７０４、黒ぬり三角
形：Panc‐１。 【図１２】合成ラミニンレセプターペプチドが細胞への
ラミニン結合を抑制することを示した図である。□：Ｒ
ＴＬＲ２、黒ぬりひし形：ＲＴＬＲ２‐コントロール 【図１３】リガンド結合に含まれる合成ペプチドラミニ
ンレセプターの同定を示した図である。
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フロントページの続き
(73)特許権者 593094257
ロアラー、インターナショナル（ホール
ディングズ）インコーポレーテッド
ＲＯＲＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡ
Ｌ （ＨＯＬＤＩＮＧＳ）ＩＮＣ.
アメリカ合衆国デラウエアー州、ルイ
ス、ケープ ヘンローペン ドライブ、
40
(72)発明者 ソベル，マーク イー.
アメリカ合衆国メリーランド州、ベセス
ダ、ブルス、ラン、パークウェイ、9401
(72)発明者 リオッタ，ランス エー.
アメリカ合衆国メリーランド州、ポトマ
ック、ミストウッド、ドライブ、9027
(72)発明者 ウイワー，ウルラ エム.
アメリカ合衆国メリーランド州、ロック
ビル、グロブナー、プレイス、ナンバ
ー、1404、1201
(72)発明者 ジェイ，マイケル シー.
アメリカ合衆国バージニア州、アーリン
トン、エス、セカンド、ストリート、
3017
(72)発明者 ドロハン，ウイリアム エヌ.
アメリカ合衆国バージニア州、スプリン
グフィールド、オークフォード、ドライ
ブ、8417
(58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名)
C12N 15/00
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＣＡ（ＳＴＮ)
ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ
ＥＮＥＴＹＸ)
ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．下記配列から得られる連続した３００〜８２８ヌク
レオチドのヌクレオチド配列からなるラミニンレセプタ
ーｍＲＮＡ用プローブ。 【化１】２．下記配列から得られる連続した３００〜８２８ヌク
レオチドのヌクレオチド配列からなるラミニンレセプタ
ー遺伝子用プローブ。 【化２】３．癌の攻撃性または癌細胞治療剤の有効性を決定する
方法であって、単離された組織試料を、下記配列から得
られる連続した３００〜８２８ヌクレオチドのヌクレオ
チド配列からなるラミニンレセプターｍＲＮＡ用プロー
ブと反応させ、それらの間のハイブリダイゼーションの
程度を決定し、及びハイブリダイゼーションの程度を標
準と比較することを特徴とする方法。 【化３】４．癌の攻撃性または癌細胞治療剤の有効性を決定する
方法であって、単離された組織試料を、下記配列から得
られる連続した３００〜８２８ヌクレオチドのヌクレオ
チド配列からなるラミニンレセプター遺伝子用プローブ
と反応させ、それらの間のハイブリダイゼーションの程
度を決定し、及びハイブリダイゼーションの程度を標準
と比較することを特徴とする方法。 【化４】５．癌の攻撃性の決定方法であって、精製ＲＮＡ試料
を、下記配列から得られる連続した３００〜８２８ヌク
レオチドのヌクレオチド配列からなるラミニンレセプタ
ーｍＲＮＡ用プローブと反応させ、それらの間のハイブ
リダイゼーションの程度を決定し、及びハイブリダイゼ
ーションの程度を標準と比較することを特徴とする方
法。 【化５】
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/911,863 US4861710A (en) | 1986-09-26 | 1986-09-26 | Recombinant DNA clone encoding laminin receptor |
| US911863 | 1986-09-26 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62506395A Division JP2533595B2 (ja) | 1986-09-26 | 1987-09-23 | ラミニンレセプタ―をコ―ド化する組換えｄｎａクロ―ン |
Publications (2)
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|---|---|
| JPH0880200A JPH0880200A (ja) | 1996-03-26 |
| JP2825780B2 true JP2825780B2 (ja) | 1998-11-18 |
Family
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Family Applications (3)
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|---|---|---|---|
| JP62506395A Expired - Lifetime JP2533595B2 (ja) | 1986-09-26 | 1987-09-23 | ラミニンレセプタ―をコ―ド化する組換えｄｎａクロ―ン |
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