JP2533595B2 - ラミニンレセプタ―をコ―ド化する組換えｄｎａクロ―ン - Google Patents

ラミニンレセプタ―をコ―ド化する組換えｄｎａクロ―ン

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 技術分野 本発明は一般的に組換えDNAに関する。より詳細に
は、本発明はラミニンの高親和性（約10-8〜10-10kd）
細胞表面レセプターをコード化する組換えCDNAクローン
に関する。
技術状況 ラミニンは表皮細胞及び新生細胞の両者の基底膜への
結合を媒介する基底膜の主たる糖タンパク質成分であ
る。基底膜は器官柔組織細胞を間質性コラーゲン様スト
ロマから分離する至る所に存在する特殊化されたタイプ
の外細胞マトリックスである。細胞とこのマトリックス
の相互作用は正常及び新生細胞過程の両者の重要な側面
である。正常な細胞は外細胞マトリックスを生存、増殖
及び分化のために必要とするように思われるのに対し、
移動性細胞は正常細胞及び新生細胞共に一つの組織から
他の組織に移動するに際して基底膜を横切らなければな
らない。特に扁平或いは小腺表皮細胞に生ずる転移癌細
胞は循環及びリンパ系に入るためには基底膜を横切らな
ければならず（血管内異物侵入）、又循環新生細胞は器
官の毛細管床に典型的に捕えられ、血管壁を冒し、及び
基底膜を侵入して血管外組織に至り（管外遊出）、そこ
で二次的新生物を次いで確立する。ラミニンレセプター
は表皮及び新生細胞の両者の基底膜への結合を媒介する
ことにより特に転移過程を制御することにおいて極めて
重要な役割をはたす。米国特許4,565,789号明細書はラ
ミニンレセプターの単離及びある種の側面の特性化を記
載している。しかしながら、ラミニンの細胞表面レセプ
ターをコード化するクローン化DNA配列はそれ迄知られ
ていない。
発明の概要 従って、本発明の目的はラミニンの高親和性（約10-8
〜10-10kd）細胞表面レセプターをコード化することの
できる組換えcDNAクローンを提供することである。
図面の簡単な説明 本発明のこれら及びその他の目的を付随する利点の多
くは添付図面に関連して考慮するとき以下の詳細な既述
を読んでよりよく理解されるであろう。
第１図は精製ラミニンレセプターの均質性を示す。TO
Pは大腸癌からの及び正常ヒト胎盤組織からの精製ラミ
ニンレセプターの比較を示す。ラミニン−Sepharoseア
フィニティカラムから1M NaClで溶出された物質をジチ
オスレイトールの存在下において NaDodSO4−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（７％）に
より分析し、銀染色により可視化した。パネルはラミニ
ンレセプターの調製物間の分子量の僅かな可変性を例示
する（68,000〜72,000）。レーンP1: ヒト胎盤組織か
ら単離されたラミニンレセプター（１μｇ）。レーンC
a: ヒト大腸癌から単離されたラミニンレセプター（３
μｇ）。レーンM: 分子量マーカー： ホスホリラーゼ
ｂ（94,000）、ウシ血清アルブミン（67,000）及びオバ
ルブミン（43,000）。
BOTTOMは精製ラミニンレセプターの等電集中及び二次
元ゲル電気泳動を示す。上記大腸癌ラミニレセプタータ
ンパク質試料（0.1μｇ）はI125で放射線標識され、等
電集中（pH範囲５〜７）及び10％ NaDodSO4−ポリアクリルアミドゲル上の二次元ゲル電気
泳動に付された。分子量マーカー： ホスホリラーゼｂ
（93,000）、ウシ血清アルブミン（66,000）、グリセラ
ルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（36,0
00）。
第２図は精製ラミニンレセプターのELISAを示す。各
マイクロタイターウェルを精製腫瘍ラミニンレセプター
で被覆し、LR1モノクローナル抗体2H5（□）、抗アルブ
ミン（○）或いは抗−α−アミラーゼモノクローナル抗
体（●）に対して２時間反応させた。抗体をペルオキシ
ダーゼ複合ヤギ抗マウスIgM或いはペルオキシダーゼ複
合ブタ抗ウサギIgGを用いて検出した。
第３図は抗ラミニンレセプターモノクローナル抗体の
λELR6に対する特異性を示す。約50〜100個の精製λELR
6プラークを含有するフィルターを抗ラミニンレセプタ
ーモノクローナル抗体、抗−α−アミラーゼモノクロー
ナル抗体、抗アルブミン抗体或いは抗ラミニン抗体のい
ずれかと反応された。抗体結合はペルオキシダーゼ複合
第二抗体を用いて検出した。
第４図はλELR1〜６の重畳ラミニンレセプターcDNAイ
ンサートを示す。頂部の線はcDNAインサートの左側への
２個のKpn I部位（Ｋ）を示す原型λELR組換えλgt11フ
ァージの図である。囲いはcDNAインサートを表わす。各
インサート内の左のEcoR I部位は存在しなかった。右の
EcoR I部位（Ｅ）を示す。λgt11のlacZ遺伝子からの転
写はファージの右腕からＥを介して左側に進む。Kpn I
部位（cDNAインサートに最も近接した）から最大のcDNA
インサート（λNLR4）のEcoR I部位に延在する領域は拡
大されて下に示される。cDNAインサート囲い内の斜線領
域はニックトランスレーションされハイブリダイゼーシ
ョンプローブとして用いられたλELR4のサブクローン
（第５図参照）から単離されたPst I−Sph I制限断片を
示す。明細書に説明される共通Sac I（Ｓ）及びHind II
I（Ｈ）部位が示される。ELR組換えファージの各々から
のファージDNAはKpn I及びEcoR Iで制限され、１％アガ
ロースゲルを通して電気泳動され、ニトロセルロースに
移され、及び上記Pst I−Sph I制限断片にストリンジェ
ントにハイブリダイズされる。プローブにハイブリダイ
ズした各λELR組換えファージからのKpn I−EcoR I制限
断片の長さをブロットのラジオオートグラフ上に図示
し、標準λ/Hind III消化物と対比して決定した。
第５図はλELR4のcDNAインサートの配列決定の術策を
図示する。λELR4のサブクローン化インサートの制限地
図をトップに示す。Ｅはインサートの５′EcoR I部位で
ある。H:Hinf I、S:Sph I、R:Rsa I、P:Pst I、＊：オ
ーカー集結コドン。矢印は５′末端において（γ−
P32）ATPによるキナーゼ化により（●）或いは３′末端
において（α−P32）ジデオキシATPによるデーリングに
より（○）或いはジデオキシ合成法（ｒ）のいずれかに
より標識化された断片の配列方向を示す。配列決定に用
いられたサブクローンはpLR4−１、pLR4−２、及びpLK4
−４であった。
第６図は下記に得られたタンパク質配列のλELRcDNA
インサートのヌクレオチド配列を提供する。各線の右側
には人工EcoR I部位からの塩基対の数が示される（塩基
１〜６）。
第７図は、合成ラミニンレセプターペプチドのELISA
決定を示す。合成ラミニンレセプターペプチドRTLR2は
第６図におけるcDNA配列から精製され、異った稀釈率の
ウサギ抗ラミニンレセプター抗血清或いは前免疫血清を
用いてELISAによりアッセイされた。
第８図はRNAゲルブロットハイブリダイゼーションを
示す。全細胞RNAを数個の乳癌細胞系から抽出し、メチ
ル水銀アガロースゲル上で分離し、及びジアゾベンジル
オキシメチルセルロース紙に移した。このフィルターを
pLR4−１からのニックトランスレーションされた
（32P）−標識化EcoR I−Pst Iインサートにハイブリダ
イズした。ハイブリダイズされたmRNA種の長さは知られ
た大きさのrRNA及びHind IIIで制限されたλDNAの大き
さと対比することにより求められた。レーン1:MCF−７
（親）；レーン2:MCF7−3E5;レーン3MCF7−5H7;レーン
4:ZR75。
第９図はラミニンレセプターmRNAレベルと６個のヒト
癌細胞系のラミニンに結合する能力との相関関係を示
す。第８図に示されるような異った時間のラジオオート
グラフの曝露を濃度測定により測定して線形応答範囲を
決定した。一連のハイブリダイズされたRNAの最低量に
数値1.0を与え、全てのその他の値はその値に対して計
算した。各細胞系に対する細胞当りのラミニンレセプタ
ーの数は対数成長期細胞に対する特異的結合（I125）ラ
ミニンのScat−chardプロットから計算した。線形回帰
分析は0.97の相関関係を示した。MCF−７親□、MCF−７
クローン5H7△、MCF−７クローン3E5■、ZR−75○、腎
癌Ａ−704●、Panc−１▲。
発明の具体的説明 本発明の上記及び各種のその他の目的及び利点は細胞
表面ラミニンレセプターをコード化するヌクレオチド配
列を全部或いは部分的に（第６図に示す如く）有する組
換えcDNAクローン及び合成ラミニンレセプター或いはそ
の断片の製造方法により達成される。
特に断りのない限り、本発明において用いる全ての技
術的或いは化学的用語は本発明の属する技術における当
業者により普通に理解されるものと同一意味を有する。
本発明の実施或いは試験において、本発明において説明
されるものと同様或いは等価の如何なる方法及び材料を
用いることもできるが、好ましい方法及び材料を以下に
説明する。以下に述べる全ての刊行物は本発明において
準用する。
本発明の組換えcDNAクローンを造築及び単離するため
の方法論は更に詳細に例IIにおいて説明されており、周
知の標準的技術を含む以下の一般的工程を含むものであ
る： ａ） ヒト臍帯静脈内皮細胞からのmRNA鋳型を用いてcD
NAを合成する。
ｂ） 内皮細胞cDNAをλgt11ベクター（ATCC 37194）
中に挿入する。
ｃ） この組換えλgt11をパッケージし、大腸菌（Esch
erichia coli）1090細胞（ATCC 37197）を感染するた
めに用いる。
ｄ） 得られるλgt11ヒト内皮細胞cDNA発現ライブラリ
ーをラミニンの結合に含まれるヒトラミニンレセプター
の領域を認識するモノクローナル抗体を用いてスクリー
ニングする。
ｅ） λELR1〜６と命名される６個のプラークがこのよ
うにして単離及び精製される（第３図）。これらのcDNA
インサートを制限エンドヌクレアーゼマッピングにより
分析し、共通領域を有することが判明し、それらがモノ
クローナル抗体により認識されるラミニンレセプターの
エピトープをコード化することを示す（第４図）。
ｆ） ６個の精製相の最も大きいcDNAインサートをプラ
スミドベクター中にサブクローン化して更に分析及びDN
A配列決定を容易にする。λgt11の左腕にcDNAインサー
トを連結するEcoR I部位は全ての六つのクローンに存在
しない。従ってPvu II部位11bp下流を利用して、最も大
きい組換えファージλELR4からcDNAインサートを精製す
る。
λELR4のEcoR I−Pvu II制限断片をpBR322のEcoR I−
Pvu II部位中にサブクローン化してpLR4−１を作成す
る。
本発明に従って得られた宿主E.コリ株C600r-m-（ATCC
33525）中に形質転換された組換えcDNAクローンpLR4
−１の寄託は受理番号67199号でアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション（American Type Culture Co
llection,（ATCC）、メリーランド州ロックビル）にな
された。要求によりPTOの長官はこの寄託物を入手で
き、特許発効時にはこの寄託物は最後の要求後少なくと
も５年間或いは少なくとも30年間、或いは特許の有効期
間生育可能に維持され、勿論、法律の規定に従って制限
なしに公衆に利用可能とされる。
本発明の確定的に同定する方法は組換えプラスミドの
cDNA配列（第６図）を精製胎盤ラミニンレセプターのシ
アノーゲンブロマイド−生成オクタペプチドのアミノ酸
配列との比較に基づく。オクタペプチドアミノ酸配列を
得るための方法論はより詳細に例Ｉに説明され、周知の
標準的技術を含む次の一般工程を包合する： ａ） ヒト胎盤組織からのミクロゾーム膜を調製し、可
溶化する。
ｂ） 可溶化されたミクロソーム膜含有調製物を精製ラ
ミニン−Sepharose4Bのアフィニティマトリックスを通
過させ、十分洗浄後高アフィニティラミニンレセプター
タンパク質を高濃度塩水（1M NaCl）によりリガンドか
ら溶出する。
ｃ） ヒト胎盤ラミニンレセプターの均質性を二次元ゲ
ル電気泳動（第１図）及び酵素結合免疫吸着剤アッセイ
（ELISA）（第２図）によりアッセイする。
ｄ） ヒト胎盤ラミニンレセプターをシアノーゲンブロ
マイドで切断し、得られたペプチド類を逆相高圧液体ク
ロマトグラフィ（HPLC）により分画する。
ｅ） 胎盤オリゴペプチドのミクロ配列分析は独特の配
列Met−Leu−Ala−Arg−Glu−Val−Leu−Argを有するオ
クタペプチドを露わす。
本発明の別の同定方法はヒト転移乳癌ラミニンレセプ
ターに向けられたウサギ抗血清のpLR4−１のcDNA配列か
ら生成した合成ペプチド（第７図）を同定（ELISAによ
り）する能力を求める。この抗ラミニンレセプター抗血
清を得る方法論は更に詳細に例IVにおいて説明されてお
り、周知の標準的技術を含む次の一般的工程を包合す
る： ａ） ラミニンレセプターを胎盤ラミニンレセプターに
対して上記に説明したようにヒト転移乳癌から精製す
る。
ｂ） 腫瘍ラミニンレセプターの均質性を胎盤ラミニン
レセプターに対して上記説明の如く評価する。
ｃ） NaDodSO4−ポリアクリルアミドゲルから切出した
腫瘍ラミニンレセプターの皮下注射によりウサギを免疫
化する。
ヒト癌細胞などのラミニンレセプターmRNAを含む細胞
の診断アッセイが癌の診断及び予知における有用な道具
として開発されてきた。ラミニンレセプターmRNA含量の
アッセイ方法は更に詳細に例Ｖにおいて説明され、周知
の標準的技術に従う次の一般的工程を包合する： ａ） 全細胞RNAを組織標本或いは細胞から単離する。
ｂ） RNAを変性アガロースゲルを通して変性及び電気
泳動させ、瀘紙に移す。
ｃ） RNAを含む濾紙を放射線標識化ラミニンレセプタ
ーcDNAにハイブリダイズさせる。
ｄ） 洗浄後、フィルターを十分な時間Ｘ−線フィルム
に曝露し、放射線活性プローブのイメージを得る。
ｅ） フィルム上のバンドの相対的強度がラミニンレセ
プターmRNAの目安である（第８図）。
ｆ） 或いは又上記工程（ｂ）の代りに変性RNAの小ア
リコートを直接に濾紙に結合した後工程（ｃ）〜（ｅ）
を行う。
ｇ） 放射線標識化ラミニンレセプターcDNAは又in sit
uで組織断片及び細胞にハイブリダイズさせてラミニン
レセプターmRNAを発現する特定細胞集団を決定すること
もできる。
転移細胞におけるラミニンレセプターmRNAの増加した
含量は変化したラミニンレセプターDNAを含有する細胞
の診断アッセイの開発に役立つ。この方法論は各種遺伝
病に対して見出だされてきた制限断片長の多形性の可能
性のある存在に基づく。腫瘍のゲイム或いは転移細胞に
おけるラミニンレセプター遺伝子の増幅も又評価されて
よい。ラミニンレセプターゲイムDNAの分析方法は周知
の標準的技術に従って、次の一般的工程を包合する： ａ） 高分子量ゲイムDNAを例VIに説明するように組織
標本或いは細胞から単離する。
ｂ） DNAを各種制限エンドヌクレアーゼにより消化
し、アガロースゲルを通して電気泳動させ濾紙に移す。
ｃ） DNAを含有するフィルターを放射線標識化ラミニ
ンレセプターcDNAにハイブリダイズさせる。
ｄ） 洗浄後、フィルターをＸ−線フィルムに曝露し、
フィルム上のバンドのパターンを正常組織からのそれと
比較する。
pLR4−１のcDNA配列から生成した合成ペプチド類は転
移の形成を抑制する癌の治療において有用である。本発
明において説明される方法は基底膜は良性新生物におけ
る連続構造であり、又、良性細胞上のラミニンレセプタ
ーは基底膜への結合により占められているという観察に
基づくものである。これに対して、侵略腫瘍細胞に隣接
した基底膜は連続的ではない。侵略腫瘍細胞はこのよう
にリガンドに結合していない細胞表面上に発現された増
大した数のラミニンレセプターを有する。癌の管理及び
診断において重要な概念であるのは転移癌細胞上のラミ
ニンレセプター部位の利用可能性である。癌の腫瘍細胞
が一次腫瘍部位から隣接正常組織に移動する傾向及びそ
の体の遠方部位に広がり、転移クローンを開始する性向
と定義される癌の攻撃性は、次いで部分的により多くの
利用可能なラミニンレセプターを有する侵略性細胞の数
の一つの反映である。
pLR4−１のcDNA配列から生成する合成ペプチド類は放
射線標識化ラミニンに特異的に結合する。ラミニン結合
アッセイにおけるこの合成ペプチドの存在は細胞がラミ
ニンに結合する能力を阻害した。このように、合成ペプ
チドは細胞表面ラミニンレセプターがラミニンに結合す
る能力と拮抗及び妨害する。ペプチドが混合BL6メラノ
ーマ細胞であり、マウスに静脈内注射した場合にBL6細
胞からの転移の数は減少した。如何なる理論にも拘束さ
れるものではないが、合成ラミニンレセプター断片は基
底膜に対して直ちに結合することに対して細胞と拮抗し
て転移細胞のコロニー化を防止するものと思われる。
上記に基づき、本発明が各種方法で癌の診断及び治療
並びに細胞によるラミニンの異常な認識から生ずるその
他の病気に用いて有効な合成ペプチドとその断片を得る
ことができることは明らかである。
以下に、本発明を例示する具体例を説明する。
例Ｉ 独特なヒト胎盤ラミニンレセプターオクタペプチドの同
定 A.材料及び方法 1.組 織 ヒト乳癌及び大腸癌に由来する肝臓転移からの組織を
国立癌研究所病理学実験室（Laboratory of Pathology,
National Cancer Institut）及びグロストラップ病院病
理学部（Department of Pathology,Glostrup Hospita
l、コペンハーゲン）から得た。正常期間出産から得ら
れたヒト胎盤は国立海軍医療センター（National Naval
Medical Center,メリーランド州、ベセスダ）により提
供された。
2.ラミニンレセプターの精製 腫瘍組織（100〜300g）或いは胎盤組織（500g）を５
容（wt/vol）のリン酸緩衝化塩水（137mM NaCl/1.7mM
Kcl/8.1mM Na2HPO4/1.5mM KH2PO4、pH7.2）中にお
いて、Waringブレンダー内においてホモジナイズした。
この緩衝液及び以下の緩衝液に対して次のプロテアーゼ
阻害剤を添加した:50μg/mlフェニルメチルスルホニル
フルオライド、5mMベンズアミジン、10μg/mlアプロチ
ニン、50μg/ml大豆トリプシン阻害剤及び5mMベーター
ヒドロキシ水銀安息香酸。500×ｇで10分間遠心分離
後、ホモジネートを0.3Mスクロース/25mM Tris−HCl、
pH7.3中で1:1（vol/vol）に希釈し、氷上でブリンクマ
ンポリトロン（Brinkman Polytron）で超音波処理し、1
5,000×ｇで４℃において20分間遠心分離し、更に上澄
液を143000xgで４℃において90分間遠心分離した。得ら
れたペレット内のミクロゾーム膜を25mM Tris−HCl、p
H7.3/150mM NaCl/1mM CaCl2/3mM MgCl2中10mgタンパ
ク質/mlで再懸濁し、等容量の１％オクチルフェノリポ
リエトキシエタノール（Nonidet P−40,Sigma）/25mM
Tris−HCl、pH7.2/150mM NaCl/1mM CaCl2/3mM MgCl2
中に希釈し、４℃で６時間エンド−オーバー・エンド
（end−over−end）回転で抽出した。この調製物を200,
000×ｇで４℃において１時間超遠心分離し、次いで上
澄液を2mgのラミニン（ティンプル等Timpl,et al.,J.Bi
ol.Chem.,254:9933−9937（1979）に説明されたように
精製された）をmlのCBrN−活性化Sepharose4B（Pharmac
ia）にカップリングさせることにより調製された2mlのS
epharoseラミニンアフィニティマトリックと共に４℃で
10時間インキュベートした。Sepharose−ラミニンマト
リックスを次いで10回 25mM Tris−HCl、pH7.3/150mM
NaCl/1mM CaCl2/1mM MGCl2/0.05％ Nonidet P−40
中で洗浄し、及び１回400ml NaClを含有する緩衝液中
で洗浄した。このラミニン−Sepharoseマトリックスを
次いで2mlカラム中に充填した。タンパク質画分を室温
で1MNaCl/50mM Tris−HCl、pH7.3で溶出し、直ちに氷
上に置き、冷蒸留H2Oに対して透析し、凍結乾燥により
濃縮した。
3.シアノーゲンブロマイド消化及びマイクロ配列決定 精製ラミニンレセプターをシアノーゲンブロマイドで
オーゾールス等〔Ozols et al.,J.Biol,Chem.,252:5986
−5989（1977）〕により説明されるように消化し、400
μｌの0.1％トリフルオロ酢酸／アセトニトリルに溶解
し、逆相25cm×4.1mm PRP−１カラム（Hamilton）上で
200μｌの二つの注入として2ml/分の流速で運転した。
シアノーゲンブロマイド−発生断片のアミノ酸配列決定
を製造者のプログラム03 RPTHを用いる付属モデル120A
PTH−アナライザーを有するモデル470A気相タンパク
質シークエンサー（Applied Bio Systems、フォスター
シテー、カリフォルニア州）を用いて行った。
4.酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ELISA） ELISAはエングバル（Engvall、Methods Enzymol.,70:
419−439（1980））に従って行った。アッセイされた抗
体はリオッタ等（Liotta,et al.,Exp.Cell Res.,156:11
7−126（1985））により説明されたようなヒトラミニン
レセプターに対するIgMマウスモノクローナル抗体2H5
（LR−１）、ウサギ抗−ヒトアルブミン（Miles）及び
−アミラーゼに対するIgMマウスモノクロナール抗体
（国立歯科研究所 National Institute of Dental Rese
archのR.シラガニアン R.Siraganianから得られた）を
包含した。結合抗体はペルオキシダーゼ−複合ウサギ−
抗マウスIgM（キエルケガード・アンド・ペリー・ラボ
ラトリーズ Kierkegaard and Pery Laboratories,メリ
ーランド州、ガイザースバーグ）或いはペルオキシダー
ゼ−複合ヤギ抗−ウサギIgG（Kierkegaard and Perry L
aboratories）を用いて検出した。
5.ゲル電気泳動 タンパク質資料はレムリ（Laemmli,Nature（ロンド
ン）、227:680−685（1970））の方法によりジチオスレ
イトールの存在下においてNaDodSO4−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分析した。等電集中及び二次元Na
DodSO4−ポリアクリルアミドゲル電気泳動はオファレス
（O'Farrell,J.Biol.Chem.,250:4007−4021（1975））
及びビルス等（Wirth et al.,Cancer Res.,46:400〜413
（1986））により説明されたように行われた。免疫ブロ
ッティングはリオッタ等（Liotta,et al.（1985）、前
掲）により説明されたように抗ラミニンレセプターモノ
クローナル抗体を用いて行われた。
B.結果 1.ヒトラミニンレセプターの精製 調製量の精製ラミニンレセプターの単離はヒト転移乳
癌及び大腸癌及びヒト胎盤組織からの可溶化ミクロゾー
ム膜含有調製物をラミニン−Sepharose4Bのアフィニテ
ィマトリックスにかけ、次いでアフィニティマトリック
スの十分な洗浄及び高濃度塩水（1M NaCl）によるリガ
ンドからのレセプタータンパク質の溶出により達成され
た。NaDodSO4−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（第1A
図）により分析すると、乳癌及び大腸癌からの精製タン
パク質はより厳密性の少ない条件下に単離されたヒト乳
癌ラミニンレセプターについて、先に報告されたよう
に、約みかけMr＝68,000〜72,000を有した。この精製操
作の結果薬20μg/100gの腫瘍組織及び２μg/100gの胎盤
組織のレセプタータンパク質収率が得られた（可溶化ミ
クロゾーム膜調製物中約0.02％のタンパク質）。
これらの乳癌、大腸癌及び胎盤からの精製ラミニンレ
セプター調製物を標準的操作に従ってヨード化し、二次
元ゲル電気泳動により分析して調製物の均質性を評価し
た。代表的な腫瘍ラミニンレセプターのオートラジオグ
ラフを第1B図に示す。ラミニンレセプターのみかけpIは
6.4±0.2である。第1B図は延伸スポットを示すが、異っ
たpH範囲及び免疫ブロッティング（前記Liotta等（198
5）らにより説明されるような）におけるその他のゲル
は単一ポリペプチド鎖と一致する。
これらの三つの源泉からの精製ラミニンレセプター調
製物をマイクロタイターウエル内で固定し、一群の抗体
と反応させて更に調製物の純度及びアミニン或いはアル
ブミンによる汚染の欠乏を示した。全ての場合におい
て、ヒトラミニンレセプターLR−１（2H5）に対するIgM
マウスモノクローナル抗体は陽性に反応したのに対し、
ウサギ抗−ヒトアルブミン及びα−アミラーゼに向けら
れたクラス適合IgMマウスモノクローナル抗体は反応し
なかった。代表的ELISAを第２図に示す。
2.胎盤ラミニンレセプターのシアノーゲンブロマイドペ
プチドのマイクロ配列分析 そのままのラミニンレセプター分子を直接に配列決定
するための繰返された試みは、おそらくアミノ末端の保
護により成功しなかった。従って、レセプタータンパク
質をシアノーゲンブロマイドで切断し、得られたペプチ
ドを逆相HPLCにより分画した。胎盤オリゴペプチドのマ
イクロ配列分析は、配列Met−Leu−Ala−Arg−Glu−Val
−Leu−Argを有するペプチドを現わした。同族体に対す
るコンピュータの助けを借りた探索（ウィルバー及びリ
ップマン、Wilber and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.80:
726−730（1983））はこのオクタペプチドが独特のもの
であることを示した。
例II ヒトラミニンレセプターcDNAクローンの単離 A.材料及び方法 1.細胞培養 ヒト臍帯静脈内皮細胞の単層培養物をジェイ等（Jay
e,et al.Science 228:882−885（1985））により説明さ
れるように生育した。
2.RNAの調製 全細胞RNAをチルギン等（Chirgwin,et al.,Bio−chem
istry,18:5294−5299（1979））により説明されるグア
ニジニウムイソチオシアネート−セシウムクロライド密
度法により培養物中の細胞層から抽出した。ポリ（Ａ）
−含有RNAをオリゴ（dT）セルロース（タイプ３、コラ
ボラティブ・リサーチ Collaborative Research）上の
クロマトグラフィによりアヴィブ及びレーダー（Aviv a
nd Leder,Proc.Natl.Acad.Sci.,69:1408−1412（197
2））の方法に従って単離した。
3.cDNAの合成 オリゴ（dT）−選択ヒト内皮RNAをブェル等（Buell,e
t al.,J.Biol Chem.253:2471−2482（1978））の方法に
よりcDNAの合成のための鋳型として用い、２本鎖cDNAを
ウィッケンス等（Wickens,et al.,J.Biol.Chem.253:248
3−2495（1978））により説明されるようにして調製し
た。このcDNAをウルリッチ等（Ullrich,et al.,Scienc
e,196:1313−1319（1977））により説明されるようにし
てS1ヌクレアーゼで平滑末端にし、引続くE.コリ DNA
ポリメラーゼＩのクレノウ断片による処理をウォーテル
及びレニコフ（Wartell and Resnikoff,Gene,9:309−31
9（1980））により説明されるようにして行った。このc
DNAを次いでEcoR Iメチラーゼで修飾し、EcoR Iリンカ
ーに連結し、及びヒュイン等（Huynh,et al.,DNA Cloni
ng Volume 1:a practical approach,D.M.Glover編、IRL
Press Ltd.,英国オックスフォード49−78頁（1985））
により説明されるようにしてEcoRIで徹底的に消化し
た。
4.ヒト内皮λgt11 cDNAライブラリーの造築及びスクリ
ーニング EcoR I−連結cDNAを上記ヒュイン（Huynh）（1985）
により説明されるようにしてEcoR I消化及びホスファタ
ーゼ処理λgt11に連結した。この組換え相をエンキスト
及びスターンバーグ（Enquist and Sternberg、Methods
Enzymol.,68:281−298（1979）により説明されるよう
にしてパッケージし、上記ヒュイン（Huynh）（1985）
により説明されているようにしてE.コリ Y1088（ATCC
37195）中で増幅した。E.コリ Y1090（ATCC 3/19）
細胞を内皮細胞λgt11 cDNAライブラリーで感染させ、
抗−ラミニンレセプターモノクローナル抗体2H5（リオ
ッタ等 Liotta et al.,Exp.Cell Res.,156:177−126（1
985））を用いてヤング及びデービス（Young and Davi
s、Science,222:778−782（1983））により説明される
ようにしてラミニンレセプターβ−ガラクトシダーゼ融
合タンパク質の抗体認識により150万個のプラークをス
クリーニングした。この抗体はラミニンレセプターのリ
ガンド結合を認識するか或いは妨害する（上記リオッタ
等 Liotta et al.,（1985））及びトーゴー等Togo et a
l,Basement Membrans,S.Shibata編、ニューヨーク州、
エルセヴィア、325〜333頁（1985））。抗体結合は上記
例1A4で説明したように、ペルオキシダーゼ−複合アフ
ィニティ精製ウサギ抗−マウスIgMを用いて検出した。
陽性プラークをベントン及びデービス（Benton and Dav
is,Science,196:180−182）により説明されるようにし
て同定、増幅及び再スクリーニングして精製した。プラ
ークを含有するフィルターを抗−ヒトα−アミラーゼ及
び抗−ヒトアルブミン（上記例14Aに説明された通りの
もの）並びに抗−ラットラミニン（アルブレクトセン等
Albrechtsen,et al.,Cancer Res.,41:5076−5081（198
1））を包合するコントロール抗体に対して反応させ
た。
5.サザーンブロットハイブリダイゼーション ファージDNAはマニアチス等（Maniatis,et al.,Molec
ular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbo
r Laboratory、ニューヨーク州、コールドスプリングハ
ーバー、77−85頁（1982））により説明されたようにし
て単離された。制限エンドヌクレアーゼ−消化DNAをア
ガロースゲルを通して電気泳動させ、ニトロセルロース
紙に移し、及びサザーンの方法（Southern,Methods Enz
ymol.,68:152−176（1979））によりハイブリダイズさ
せた。32P−標識化プローブをマニアチス等（Maniatis,
et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.、72:1184−1188（197
5））に説明されるようにしてニックトラスレーション
により調製した。
6.プラスミド及びcDNAインサートのサブクローニング及
び調製 cDNAインサートをλgt11の左腕に結合するEcoR I部位
は全ての６個のクローン中に存在しない。従って、Pvu
II部位11bp下流を利用して最大の組換えファージELR4か
らcDNAインサートを精製した。λELR4のEcoR I−Pvu II
制限断片をpBR322のEcoR I−Pvu II部位にサブクローニ
ングしてpLR4−１を作成し、及びpUC8のEcoR I−Hind I
Iポリリンカー部位にサグクローニングしてPLR4−２を
作成した。引続き、長いポリ（Ａ）尾部からcDNA配列決
定を容易にするためにpLR4−１のEcoR I−Pst I制限断
片をpBR322のEcoR I−Pst I部位にサブクローニングし
てpLR4−４を作成した。pBR322の組換え体をE.コリ C6
00rm（ATCC 33525）中に形質転換し、及びpUC組換え体
をE.コリ JM103中に形質転換した（メッシング等、Mes
sing,et al.,Nucleic Acids Res.,9:309−321、マンデ
ル及びヒガ（Mandel and Higa,J.Mol.Biol.,53:159−16
2（1970））の塩化カルシウム法による）。スーパーコ
イル化プラスミドDNAをビルンボイン及びドリー（Birnb
oin and Doly,Nucleic Acids Res.,7:1513−1523（197
9））による方法に従ったエチジウブロマイド−セシウ
ムクロライド中の平衡遠心分離後にフルカリ溶解により
回収した。cDNAインサートを制限DNAから単離し、アク
リロアミドからソーベル等（Sobel,et al.,Proc.Sci.,7
5:5846−5850（1978））により説明されるようにして溶
出した。
B.結果 1.抗体認識によるラミニンレセプターcDNAの選択 ヒト内皮細胞λgt11 cDNAライブラリーを抗−ラミニ
ンレセプターモノクローナル抗体2H5を用いてスクリー
ニングした。上記材料及び方法において説明されるよう
に、この抗体は（ａ）免疫ブロット上のラミニンレセプ
ターを特異的に認識し、（ｂ）ELISAにより精製ラミニ
ンレセプターを認識し（第２図）、（ｃ）血漿膜或いは
細胞のいずれかへのラミニンの結合を妨害し、及び
（ｄ）細胞の羊膜基底膜への結合を阻害する。これらの
性質は明らかに、このモノクローナル抗体がラミニンレ
セプターのラミニン結合領域を認識するか或いは妨害す
ることを示す。６個のプラークを先ず選択した。プラー
ク精製後、λELR1−６を命名された全ての６個のファー
ジは抗−ラミニンレセプターモノクローナル抗体と激し
い反応を示したが、しかし、ヒトα−アミラーゼに向け
られたクラス適合（IgM）モノクローナル抗体或いはラ
ミニンに対して向けられた或いはアルブミンなどのラミ
ニンレセプターと大きさの同様なタンパク質に向けられ
た抗体のいずれにも何等の反応性も示さなかった（第３
図）。
2.λELR1〜６の共通領域 ６個のファージ、λELR1〜６の制限エンドヌクレアー
ゼ消化はcDNAインサートの３′端末をλgt11の左腕に結
合するEcoR I部位は全ての６個のファージにはないこと
を示した。Sac I、Kp I、Hind III及びEcoR Iを用いる
単一、二重及び三重エンドヌクレアーゼ消化を行って、
λELR1〜６のマッピングを行った。第４図にまとめて示
されるこれらの実験は、（ａ）cDNAインサートの大きさ
は約450〜975bpの範囲であり、（ｂ）全てのクローンは
クローンの３′末端から約450〜500bpの内部Sac I部位
を共有し、（ｃ）λELR6のインサートは内部Sac I部位
に僅かに約50bp5′延びるにすぎず、及び（ｄ）λELR1
及びλELR4のインサートは５′EcoR I部位からそれぞれ
約30及び40bpのHind III部位を共有することを示した。
これらの６個の組換えファージはこのようにSac I部位
への丁度５′から角cDNAインサート３′末端までに延圧
する共通の450〜500bp領域を有し、この領域がモノクロ
ーナル抗体2H5により認識される領域をコード化するこ
とを示唆する。この観察は６個の組換えファージの各々
からDNAのKpn I−EcoR I及びKpn I−Sac I二重消化物が
λELR4から単離されたPst I−Sph I制限断片にストリン
ジェントにハイブリダイズされたサザーンブロット実験
により試験された。第４図に示される代表的ハイブリダ
イゼーション実験は全ての６個の組換えファージの共通
450〜500bp領域がモノクローナル抗体2H5により認識さ
れる抗原領域をコード化することを示す。
例III cDNA配列決定 A.材料及び方法 1.DNA配列決定 λELR4からのcDNAは第５図に示される術策に従って配
列決定された。ギルバート及びマクサム（Gilbert and
Maxam,Proc.Natl.Acad.Sci.,70:3581−3584（1973））
の両方の化学的修正方法が用いられた。前者の場合にお
いて、上記例II A6に説明されるサブクローンpLR4−
１、pLR4−２及びpJR4−４のcDNA制限断片は５′端末
を、上記ギルバート及びマクサム（1973）により説明さ
れるようにT4ポリヌクレオチドキナーゼ（Boehringer−
Mannheim）及び（γ−P32）ATPにより処理するか、或い
は３′テーリィングキット（Amersham）を用いて（α−
P32）ジデオキシATPで３′端末をテーリングすることに
より標識化した。ジデオキシ合成法の場合には、ELR4の
EcoR I−Sac I制限断片をM13mp18及びM13mp19中にサブ
クローン化した（ヤニッシュ−ペラン等 Yanisch−Perr
an,et al.,Gene,38:103−119（1981））。
B.結果 1.λELR4のcDNAインサートのヌクレオチド及び演繹アミ
ノ酸配列 λELR4のcDNAインサートの配列はλgt11ベクターの右
腕のEcoR I挿入部位と一致する253個のアミノ酸開放読
取り枠を示す。2H5エピトープ（上記例II B2参照）によ
り認識される「共通領域」の配列は第６図のヌクレオチ
ド361からヌクレオチド765まで延びる。それは上記例I
b2に説明される胎盤ラミニンレセプターの精製シアノー
ゲンブロマイド−発生オリゴペプチドのそれと同一のオ
クタペプチドコード化配列（ヌクレオチド409〜432）を
包合する。この配列内にはラミニンレセプターのカルボ
キシ端末に向かう３個のアミノ酸により分離された６個
のアミノ酸繰返しがみられる。このアミノ酸繰返しをコ
ード化するcDNA配列は同一ではない（ヌクレオチド670
〜687及び697〜714）。オーカー停止コドンに引続き、
λELR4 cDNAインサートは長いポリ（Ａ）伸長から上流
の標準的なポリアデニル化シグナル AATAAA 17bpを含
む66bpの３′未翻訳領域を含む。３′未翻訳領域及びポ
リ（Ａ）尾部の長さを差し引いた後、λELR1〜６の共通
cDNA領域により規定されるような2H5エピトープの最大
の可能性のある程度は393bp即131個のアミノ酸まで狭め
られうる。ウィルバン及びリップマン（Wirbun and Lip
man,Proc.Natl.Acad.Sci.,80:726−730（1983））の方
法によるコンピュータ分析は公知のタンパク質配列への
有意な同族性を示さない。
ラミニンレセプターの潜在的膜張渡し領域は第６図の
52〜84のヌクレオチドによりコード化される11個のアミ
ノ酸疎水性ポリペプチドを含み得ることが認められる。
例IV cDNA−由来合成ラミニンレセプターペプチドの抗体認識 A.材料及び方法 1.抗血清の調製 ラミニンレセプターはヒト転移乳癌から上記例I A1の
同様にして精製した。20μｇの精製ラミニンレセプター
を上記例I A5と同様にしてNaDodSO4−ポリアクリルアミ
ドゲルを通して電気泳動し、ゲルから切出した。ウサギ
をアルブレックセン等（Albrecktsen,et al.,Cancer Re
s.41:5076−5081（1981））により説明されるようにし
てタンパク質で免疫化した。血清を抗原注射開始前（前
免疫血清）及び各ブースター注射後10日目に集めた。
2.ILISA ILISAは上記例IV A1で説明したようにして得られた前
免疫及び免疫血清を用いて、上記例I A4と同様に行っ
た。
3.合成ペプチドRTLR2 配列： Pro−Thr−Glu−Asp−Trp−Ser−Ala−Gln−Pro−Ala
−Thr−Glu−Asp−Trp−Ser−Ala−Ala−Pro−Thr−Ala を含有するRTLR2と命名される合成ペプチドは周知の標
準的方法に従ってペニンスラ・ラボラトリーズ社（Penn
insula Laboratories,Inc.カリフォルニア州ベルモン
ト）により提供された。この配列は第６図におけるヌク
レオチド667−726から選ばれた。
B.結果 1.抗−ラミニンレセプター抗血清による合成ペプチドの
認識 λELR4 cDNAのヌクレオチド配列677−726（第６図）
を用いてペプチド配列を予測した。合成ペプチドRTLR2
（例IV A3）は腫瘍ラミニンレセプターに対して向けら
れたウサギ抗血清による ELISAにおいては認識されたが、しかし前免疫血清によ
っては認識されなかった（第７図）。このペプチドは例
III B2において説明された二つの６個のアミノ酸繰返し
を含み、予測された反転立体配置を有する。
例Ｖ ラミニンレセプターcDNAのRNAへのハイブリダイゼーシ
ョン A.材料及び方法 1.細胞系 MCF−７ヒト乳癌細胞系（親）はミシガン癌財団（Mic
higan Cancer Foundation）により提供された。二つの
クローン化MCF−７細胞系MCF7−5H＆及びMCF7−3E5はP.
ホランハンド（P.Horan Hand,National Cancer Institu
te）から得られ、グライナー等（Greiner,et al.,Int.C
ancer,36:159−166（1985））により説明されている。Z
R−75ヒト乳癌系はエンゲル及びヤング（Engel and You
ng,Cancer Res.,38:4327−4339（1978））により説明さ
れ、L.エンゲル（L.Engel,National Cancer Institut
e）から得られ、及びヒト腎癌系Ａ−704はS.アーロンソ
ン（S.Aaronson,National Cancer Institute）から得ら
れ、ギャード等（Giard,et al.,J.Natl.Cancer Inst.,5
1:1417−1423（1973））により説明されている。ヒトPa
nc−１細胞系はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（American Type Culture Collection）から得
られた。ネズミNIH−3T3細胞及びそのキルステン（Kirs
ten）ウイルス−形質転換誘導体（KNIH）は、M.ゴッテ
スマン（M.Gottesman,National Cancer Institute）か
ら得られ、それらの生育はゴッテスマン（Gottesman,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.,75:27657−2771（1978））により説
明されている。ネズミF9奇形癌細胞及びそれらのジフチ
リル環状AMPプラスレチン酸分化誘導体（ストリックラ
ンド等Strickland,et al.,Cell,21:347〜355（1980））
は、W.アンダーソン（W.Anderson.National Cancer Ins
titute）から得られた。ラットL2細胞系はユーワー（We
wer,Dev.Biol.,93:416−421（1982））により説明され
ている。
2.RNAの調製 RNAは上記例II A2と同様にして細胞培養物から或いは
ストローマン等（Strohman,et al.,Cell,10:265−273
（1977））により説明されているグアニジン−塩酸塩法
により調製された。
3.ノーザンハイブリダイゼーション ５μｇの全細胞RNAをメチル水銀／アガロースゲル上
で分離し、ソーベル等（Sobel,et al.,Biochemistry,2
0:2678−2684（1981））により説明されているアリウィ
ン等（Alwine,et al.Proc.Natl.Acad.,74:5350−5354
（1977））の方法によりジアゾベンジルオキシメチルセ
ルロース紙（シュライヒャー及びシューエル Schleich
er and Schuell）に移した。フィルターを上記例II A5
と同様にしてニックトランスレーションされたcDNAイン
サートにハイブリダイズした。ラジオオートグラフの各
種時間曝露を濃度測定法により測定して線形応答範囲を
求めた。ブロットをアクチンcDNAプローブ（クリーブラ
ンド等 Cleveland,et al.,Cell,20:95−105（1980）に
より説明された）を用いて、及び熱衝撃cDNAプローブ
（ヒッケイ等Hickey,et al.,Gene,43:147−154（1986）
により説明された）を用いて逆スクリーニングして等量
のRNAが移されたことを確認した。
4.ラミニン結合アッセイ 各細胞系の細胞当りのラミニンレセプターの数をリオ
ッタ等（Liotta,et al.,Exp.Cell Res.156:117−126（1
985））により説明されたように対数生育期細胞に対す
る特異的結合（125I）−標識化ラミニンのScatchardプ
ロットから計算した。
B.結果 1.ヒトラミニンレセプターmRNAの発現 ラミニンレセプターの量及び表面分布は各種癌性ヒト
組織において異ることが従来報告された（ホランハンド
等 Horan Hand et al.,Cancer Res.,45:2713−2719（19
85））。一般的に、悪性組織はそれらの細胞評面上によ
り多くの未占有ラミニンレセプターを有し、それらのよ
り良性の対照物よりもより多くのラミニンに結合する。
ラミニンレセプターmRNAレベルがリガンド結合に利用可
能な細胞表面ラミニンレセプターの量の決定に役割を果
たすか否かを決定するためにノーザンブロット実験が行
われた（第８図）。ラミニンレセプターcDNAインサート
は推定された大きさのラミニンレセプターを有するタン
パク質をコード化するのに十分な長さの約1700ベースmR
NAを認識する。各種ヒト表皮細胞系からのハイブリダイ
ズされたRNAのレベルは異った。特に、転移乳癌細胞系M
CF−７からのRNAに対しては、非転移乳癌細胞系ZR−75
からのRNAに対するよりも大きなハイブリダイゼーショ
ンがあった。一般的にハイブリダイズしたRNAのレベル
は直接ラミニン結合アッセイと相関関係があり（第９
図）、レセプターの生合成に利用可能なラミニンレセプ
ターmRNAの量はラミニン基底膜への細胞結合の調節にお
ける律速制御工程であることを示唆する。よって、ヒト
腫瘍組織におけるラミニンレセプターmRNAレベルの決定
を診断的に用いてラミニンレセプター含量に基づき腫瘍
の相対的攻撃性或いは治療処法に対する感受性を予測す
ることができる。上記の如く、これは、ラミニンレセプ
ターcDNAをプロープとして用いる切断された腫瘍物質の
ノーザンブロットハイブリダイゼーション或いはin sit
uハイブリダイゼーションにより達成することができ
る。ラミニンレセプターcDNAは周知の次の標準的技術に
従う各種手段により上記操作のためのプロープとして調
製される。例II A5において説明したニックトランスレ
ーション操作を用いて（32P）（35S）、或いは（3H）の
いずれかでcDNAインサートを放射線認識することができ
る。或いは又、ラミニンレセプター cDNAインサートを
プラスミドにサブクローン化してメルトン等（Melton,e
t al.,Nucleic Acids Res.,12:7035−7056（1984））に
より説明される方法により放射線認識RNAの転写を行う
ことが可能である。発色検出計を組合わされたビオチニ
ル化RNA及びDNAハイブリダイゼーションプローブも又例
えばランガー等（Langer,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.7
8:6633−6637（1981））及びレアリー等（Leary,et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.80:4045−4049（1983））によ
り説明されている。
2.ラミニンレセプターmRNAの他の種における検出 ラットL2細胞及びNIH 3T3及びF9奇形癌などのネズミ
細胞からのRNA及びそれらの誘導体を含有するノーザン
ブロットも又約1700塩基のmRNAを検出した。このよう
に、ヒトラミニンレセプター cDANインサートは他の脊
椎動物種からのRNAに交差ハイブリダイズすることがで
きる（データは示さず）。
例VI ラミニンレセプターの多形性 A.材料及び方法 1.交差ハイブリダイジングラミニンレセプターcDNAの同
定 例II A4において説明したヒト内皮細胞λgt11 cDNA
ライブラリーを用いてE.コリ Y1088細胞（ATCC 3719
5）を感染させ、ベントン及びデービス（Benton and Da
vis,Science,195:180−182（1977））のプラークハイブ
リダイゼーション操作によりλELR4からの32P−標識化c
DNAインサート用いてスクリーニングした。陽性プラー
クを上記ベントン及びデービスに説明されるように、同
定及び増幅及び再スクリーニングして生成した。
2.DNA配列決定 陽性ファージのcDNAインサートを例II A6と同様にし
てpUCベクターのEcoR I部位中にサブクローン化し、cDN
A配列をギルバート及びマクサム（Gilbert and Maxam,P
roc.Natl.Acad.Sci.,70:3581−3584（1973））の方法に
より決定した。
3.ヒトゲノムDNAの単離 ゲノムDNAをブリン等（Blin,et al.,Nucleic Acids R
es.,3:2303−2308（1976））により説明されるようにし
てドデシル硫酸ナトリウム及びブロティナーゼＫによる
おだやかな消化により上記例V A1において説明されたヒ
ト細胞系から単離した。
4.サザーンハイブリダイゼーション 上記細胞系並びにヒト肝臓（M.ヤング M.Young,Naat
ional Institute of Dental Researchから取得）からの
ゲノムDNAをEcoR I、Hint III、BamHI或いはXba Iで徹
底的に消化し、アガロースゲル上で電気泳動させニトロ
セルロース上に移し、上記例II A5と同様にλELR4 cDN
Aにハイブリダイズさせた。
B.結果 1.cDNA配列比較 部分的cDNA配列を組換えファージλELR10、λELR14、
λELR106、λELR112に対して決定した。５′EcoRi部位
からλELR14の内部Sac I部位までの配列は第６図のヌク
レオチド７−381に完全に対応し、λELR4からの上流の9
6個の追加の塩基を含む。他の分析されたクローンはλE
LR4配列に対する高い同族性を示すが、しかし、多数の
点突然変異を含有する。他のクローンのそれぞれに対し
ては開放翻訳読取り枠はなく、それらが擬ラミニンレセ
プター遺伝子のcDNAであることを示唆する。
2.ゲノムDNA分析 ヒト肝臓及び各種ヒト細胞系からの高分子量ゲノムDN
Aのサザーンブロット分析は多数のハイブリダイズ化DNA
バンドを示す。これはヒトゲノム中にその全てが交差ハ
イブリダイズする多数のラミニンレセプター遺伝子があ
ることを示唆する。加えて、各々独特のDNAを含有する
多数のプラークが部分的にAlu I/Hae IIIで消化された
ヒトゲノムDNAのλシャロン4Aライブラリー（T.マニア
チス、T.Maniatis,ハーバード大学から取得）から上記
プラークハイブリダイゼーション法により単離された。
これらの知見は多数の交差ハイブリダイズ化ラミニンレ
セプター遺伝子が同一でないことを示唆する。一つの可
能性はヒトゲノムが一つの活性ラミニンレセプター遺伝
子及び数個の擬遺伝子を含有することである。擬遺伝子
から転写されたmRNAは細胞質に到達するのに十分安定で
あり、又、in vitroで転写されてcDNAを作り、及びそれ
らの対応するcDNAはλELR1〜６などの真正ラミニンレセ
プター cDNAと交差ハイブリダイズし、ノーザンブロッ
トにおける代替的ハイブリダイゼーションプローブとし
て用いることができる。しかしながら、擬遺伝子の５′
末端における多数の翻訳停止コドンにより、ラミニンレ
セプタータンパク質はそれから合成されない。全ての単
離ラミニンレセプターcDNA（開放読取り枠中）が真正の
ラミニンレセプターcDNAとしての資格を有するためには
λELR4 cDNA配列により予測されるアミノ酸をコード化
する必要がある。
ここに説明した具体例及び実施態様は例示を目的とす
るのみであり、それに照した各種修正或いは変化が当業
者に示唆され、本願の精神及び趣旨及び冒頭に掲げた特
許請求の範囲に含まれるべきことが了解される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/50 (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ (72)発明者 ソベル，マーク イー. アメリカ合衆国メリーランド州、ベセス ダ、ブルス、ラン、パークウェイ、9401 (72)発明者 リオッタ，ランス エー. アメリカ合衆国メリーランド州、ポトマ ック、ミストウッド、ドライブ、9027 (72)発明者 ウイワー，ウルラ エム. アメリカ合衆国メリーランド州、ロック ビル、グロブナー、プレイス、ナンバ ー、1404、1201 (72)発明者 ジェイ，マイケル シー. アメリカ合衆国バージニア州、アーリン トン、エス、セカンド ストリート、 3017 (72)発明者 ドロハン，ウイリアム エヌ. アメリカ合衆国バージニア州、スプリン グフィールド、オークフォード、ドライ ブ、8417 (56)参考文献 特開 昭60−500974（ＪＰ，Ａ) Ｃｏｕｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 45 （1985），Ｐ．2713−2719

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記ヌクレオチド配列を有するラミニンの
    細胞表面レセプターをコードする組換えcDNAクローン：
  2. 【請求項２】下記ヌクレオチド配列を有するラミニンの
    細胞表面レセプターをコードする組換えcDNAクローンを
    含んでなる、形質転換微生物：
  3. 【請求項３】寄託番号ATCC 67199により寄託された微
    生物である、請求の範囲第２項に記載の形質転換微生
    物。
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