JP2000510701A - 生物学的に活性なペプチドのミルクからの精製 - Google Patents

生物学的に活性なペプチドのミルクからの精製

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Abstract

(57)【要約】 可溶性乳成分を(例えば、閉ループ式連続抽出システムにおいて)ミルクから分離する方法を開示する。この方法は、保持物と透過物を形成する膜を横切る接線流濾過の利用、この透過物を捕獲用デバイスにかけて可溶性乳成分を実質的に取り出し、この捕獲用デバイスからの流出液を元のミルク試料(保持物)と合わせ、そしてミルクが十分に精製されるまでこの手順を繰り返すことを含む。好ましくは、ミルクをEDTA等のキレート化剤と合わせて濾過効率を改善する。この手順は、有利には、外因性蛋白質例えば治療用蛋白質をミルク中に発現するように遺伝的に改変されたトランスジェニック動物からのミルクを用いる。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学的に活性なペプチドのミルクからの精製発明の背景 この発明は、一般に、関心ある成分をミルクから精製する改良された方法に関 係する。特に、それは、接線流濾過の利用により(好ましくは閉じたループの連 続抽出システムにより)、脂肪、脂質又は粒状物質を除去する前処理なしで、生 の全乳からペプチドを得る方法を提供する。 家畜のミルクは、多年にわたって、食品及び医薬産業のための蛋白質その他の 産物の源として用いられてきており、これらの産物を単離するための様々な技術 が知られている。ミルクは、主として水中の脂肪、ラクトース及び蛋白質よりな るコロイド状懸濁液である。反芻動物及び実験室用動物では、ミルクは、種に依 って、1リットル当り平均30〜140グラムの即ち約4〜17重量%の蛋白質 を含む。これらの蛋白質の大部分は、ミセルとして知られる超分子構造にてカル シウム及びホスフェートと複合体化しているカゼインである。乳蛋白質の他の主 要なクラスは、主としてベータ−ラクトグロブリン及びアルファ−ラクトグロブ リンよりなり、ラクトフェリン、免疫グロブリン及び血清アルブミンをも含むホ エー蛋白質である。 乳蛋白質は、通常、組み合わされた工程により単離される。生乳は、先ず、脂 肪を除去するために、例えば、スキミング、遠心分離、沈降(H.E.Swaisgood,D evelopments in Dairy Chemistry,I:Chemistry of Milk Protein,Applied Scien ce Publishers,ニュ-ヨ-ク、1982)、酸沈殿(米国特許第4,644,056)又は レンニン若しくはキモトリプシンを用いる酵素的凝固(Swaisgood,前出)によ り分画される。次に、主要な乳蛋白質を、澄んだ溶液又は大部分の沈殿に分画す ることができ、この沈殿から関心ある特定の蛋白質を容易に精製することができ る。 乳蛋白質の単離における最近の改良でさえも、脂肪及び脂質を除去するための 第1の工程及び、その後、濾過をして近いサイズの関心ある蛋白質の成分を回収 することを必要とする。例えば、フランス国特許第2487642号は、排除ク ロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーと組合せた膜限外濾過によ るスキムミルク又はホエーからの乳蛋白質の単離を記載している。ホエーは、先 ず、レンニン又は乳酸を用いる凝固によりカゼインを除去することにより生成さ れる。米国特許第4,485,040号は、2つの逐次的限外濾過ステップによ るホエーからのアルファ−ラクトグロブリン富化生成物(保持物中)の単離を記 載している。米国特許第4,644,056号は、pH4.0〜5.5での酸沈 殿、及び逐次的クロスフロー濾過(先ず、0.1〜1.2マイクロメートルの細 孔寸法を有する膜にて生成物プールを清澄化し、次いで、それを5〜80kdの 分離限界の膜にて濃縮する)によりミルク又は初乳から免疫グロブリンを精製す る方法を提供している。 同様に、米国特許第4,897,465号は、pHシフトを有する金属酸化物 膜上での逐次的限外濾過による、血清、卵黄又はホエーからの蛋白質例えば免疫 グロブリンの濃縮及び富化を教示している。濾過を、先ず、選択した蛋白質の等 電点(pI)より低いpHで行なって蛋白質保持物から多量の夾雑物を除去し、 次に、選択した蛋白質のpIより高いpHで行なって不純物を保持し且つ選択し た蛋白質を透過物へ通過させる。異なる濾過濃縮方法が、欧州特許EP4674 82B1号により教示されており、そこでは、脱脂したスキムミルクをその乳蛋 白質のpIより低いpH3〜4まで下げてカゼイン及びホエー蛋白質の両者を可 溶化する。次いで、連続する3ラウンドの限外濾過又は透析濾過(diafiltration )により蛋白質を濃縮して15〜20%の固形分(その90%は蛋白質)を含む 保持物を形成する。或は、英国特許出願第2179947号は、試料を濃縮する ための限外濾過及びその後のほぼ中性のpHにおける弱いカチオン交換クロマト グラフィーによるホエーからのラクトフェリンの単離を開示している。純度の測 定は、報告されていない。PCT公開WO95/22258において、蛋白質例 えばラクトフェリンは、濃縮された塩の添加とその後のカチオン交換クロマトグ ラフィーにより高イオン強度に調節されたミルクから回収される。 これらの方法のすべてにおいて、ミルク又はその画分は、先ず、濾過膜又は クロマトグラフィー媒質を詰まらせる脂肪、脂質及び他の特定の物質を除去する ために処理されている。こうして生成された初期の画分は、カゼイン、ホエー、 又は全乳蛋白質よりなってよく、これから、次いで、関心ある蛋白質が単離され る。しかしながら、これらの技術は、大きく且つ高価なバッチ及び/又は連続式 の遠心分離機を必要とすること、沈殿中の捕捉による蛋白質の損失による低収率 及び低いpHを必要とする沈殿方法による関心ある蛋白質の生物学的活性の損失 を含む重大な不都合を与える。これらの制限は、非常に多量に存在して食料品例 えばチーズの製造において商品として用いられる比較的安価な蛋白質については 許容され得る。しかしながら、それらは、もし蛋白質が全乳蛋白質の小画分に相 当し、高価な医薬品に相当し、又は生物学的活性を保持しなければならない酵素 その他の治療上活性な蛋白質よりなるならば、重大な経済的阻害となる。 これらの条件のすべては、例えば、トランスジェニック動物のミルクからの医 薬蛋白質の精製において得られるであろう。外因性蛋白質の発現レベルは、一般 に、その蛋白質及び種に依って1リットル当り1グラム未満から10グラム以上 に及ぶ。例えば1億ドルの年間市場取引額を有する製品においては、各々の製品 における1%の損失は、100万ドルに相当する。 外因性蛋白質を、商業的に採算性のあるレベルで、トランスジェニック動物の ミルクにおいて発現させる方法は、当分野で公知である。トランスジェニックの 家畜のミルク中の蛋白質の広範囲の商業的生産は、現在、開発中である(A.,J. Clark等、Trends in Biotechnology,5:20-24,1987,A.J.Clark,Journal of Cellular Biochemistry,49:121-127,1992;W.Bawden等、Biotechnology and Ge netic Engineering Reviews,12:89-137,1994;N.S.Rudolph,Genetic Enginee ring News,15:8-9,1995)。外因性ペプチド特にヒトのペプチドを、ミルク中 に比較的高濃度で大量に産生させることができ、それは、回復可能な源から容易 に収穫される正常のプロセッシングを受けたペプチドの連続的な高レベルのアウ トプットを与える。これらの高価な蛋白質の慣用の方法による精製は、上述の収 率及び活性損失に対する主題である。例えば、A.J.Clark等は、トランスジェニ ック雌ヒツジから得られたミルク由来のカゼインの酸沈殿による約2.0〜2. 5%の抗血友病因子IXの回収(約98%は、失われている)を 報告した(A.J.Clark等、Biotechnology 7:487-492,1989)。J.Denman等は、 組織プラスミノーゲンアクチベーターの長く作用する変異物の、トランスジェニ ックヤギ由来のミルクカゼインの酸沈殿による、約25%の(即ち、75%を失 う)回収を報告した(J.Denman等、Biotechnology 9:839-843,1991)。 PCT特許公開No.WO94/19935は、生物学的に活性な蛋白質を全 乳から、全乳蛋白質の可溶性を正に帯電した薬剤例えばアルギニン、イミダゾー ル又はビス−トリスにより安定化させることにより単離する方法を開示している 。この処理は、清澄化された溶液を形成し、それから、蛋白質を、例えば膜を通 しての濾過により単離することができるが、この処理をしなければ該膜は沈殿蛋 白質により詰まってしまう。この添加剤の濃度は、1〜3モルのオーダーで高い 。幾つかの場合には、特に高価な薬剤例えばアルギニンの大きな必要量を最小化 することが好ましい(該剤は、如何なる場合にも、後続の精製ステップにおいて 除去しなければならない)。この方法は又、乳脂肪を除去するための最初の遠心 分離のステップをも必要とする。ここに開示したものは、可溶性の乳成分を単離 するための当分野で公知の方法を超える改良である。本発明は、収率における損 失を、大規模生産に適した効率的で費用効果的な方法において生物学的活性を保 護する温和な条件を提供することにより減少させる。 発明の要約 本発明は、可溶性の乳成分例えばペプチドを、その生物学的に活性な形態で、 全乳又はミルク画分から接線流濾過により単離する方法を提供する。以前の単離 方法と違って、この発明の方法は、脂肪及びカゼインミセルを除去するための最 初の全乳の分画を排除しており、それにより、この方法を単純にして回収率及び 生物活性の高価な損失を回避する。この方法は、更に、夾雑物を除去して関心あ る成分を精製する更なる精製ステップと組み合わせて用いることができる。 この発明により、全乳を接線流濾過に、好ましくは、可溶性の乳成分を含む透 過物(濾液)と、脂肪、他のコロイド状物質、粒状物、ウイルス、マイコプラズ マ、細菌及び体細胞を含む保持物を形成するのに十分な多孔度の限外濾過膜を横 切るようにかける。この透過物を、可溶性乳成分を実質的に取り出す捕獲手順(c apture procedure)にかけ、この捕獲手順(例えば、接線流濾過以外の捕獲手順 )からの溶出液を元のミルク試料(保持物)と合わせる。この手順を、可溶性乳 成分が実質的に回収されるまで反復し又は継続する。 この発明の別の具体例において、全乳を接線流濾過(好ましくは、限外濾過膜 を横切るもの)にかけて、可溶性乳成分を含む透過物及び脂肪、他のコロイド物 質、粒状物、ウイルス、マイコプラズマ、細菌及び体細胞を含む保持物を形成す る。透過物を集め、この透過物を取り出す際に十分量の溶液を保持物に加えて一 定容積を維持する。この手順を、可溶性乳成分が実質的に回収されるまで繰り返 す。 適宜、この透過物を更に1つ以上の捕獲手順(例えば、接線流濾過以外の捕獲 手順)により処理して、存在し得る任意の夾雑物を除去し、それにより、関心あ る成分の精製標品を与えることができる。これらの更なる手順には、限外濾過、 アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相 互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、又は他の型の捕獲用クロ マトグラフィー(これらは、当業者に周知である)が含まれ得る。 適宜、この手順を、透過物を直接捕獲用デバイスに導き且つ捕獲手順からの溶 出物を直接保持物に導き戻す閉ループ式の連続抽出システムとして操作する。 適宜、全乳を、先ず、驚く程ミルクの凝集を抑えて限外濾過フィルターを横切 る透過物流を改善するキレート化剤例えばエチレンジアミン四酢酸(EDTA) と合わせる。このミルクとキレート化剤との組合せを、上記のように、更なる工 程なしで直接接線流濾過にかける。 この発明の他の面において、この手順を、全乳を接線流濾過(好ましくは、十 分な多孔度の限外濾過膜を横切るもの)にかけて、可溶性乳成分を含む透過物( 濾液)と、脂肪、他のコロイド状物質、粒状物、ウイルス、マイコプラズマ、細 菌及び体細胞を含む保持物とを形成する閉ループ式の連続抽出システムとして操 作する。この透過物を、次いで、捕獲用デバイス(接線流濾過以外のもの)例え ば捕獲用クロマトグラフィー装置例えばイオン交換クロマトグラフィー装置又は アフィニティークロマトグラフィー装置例えばヘパリンアフィニティー カラム、プロテインAアフィニティーカラム若しくはプロテインGアフィニティ ーカラムに導き、そして、捕獲手順からの溶出物を元のミルク試料(保持物)に 導き戻す。この手順を、可溶性乳成分が実質的に回収されるまで繰り返す。 従って、可溶性乳成分を全乳又はその画分から限外濾過膜を横切る接線流濾過 によって単離するための効率的な方法を提供することは、本発明の目的である。 脂肪、カゼイン、ミセル、脂質及び粒状物を除去する(除去しないと微孔性フ ィルターを詰まらせる)ために濾過の前に全乳を最初に処理する必要性を排除す ることは、本発明の更なる目的である。可溶性乳成分の一部を捕らえてその収量 を減じる沈殿又は遠心分離等の工程によって全乳を最初に処理する必要性を特異 的に排除する方法を提供することは、本発明の更なる目的である。 穏和な条件を用いて、特に有機溶媒及び極端なpH及び温度を避け、それによ り、可溶性乳成分の生物学的活性を保護する方法を提供することは、本発明の更 なる目的である。 大規模精製のための方法を効率化し且つ費用効果を良くする希釈又は容積拡張 を伴わない一定の容積を維持する閉ループ式の連続抽出方法を提供することは、 本発明の更なる目的である。 更なる精製工程にかけて夾雑物を除去し(これらの工程の少なくとも1つは、 閉ループ式連続抽出システムに含まれ得る)、それにより、精製された可溶性乳 成分を生成することのできる接線流濾過透過物を提供することは、本発明の更な る目的である。 単一の逐次的工程において接線流濾過と可溶性乳成分分離のための捕獲手順と を組み合わせる方法を提供することは、本発明の更なる目的である。 キレート化剤例えばEDTAを加えて限外濾過膜を横切る透過物の通過を改善 して、濾過工程におけるミルクの凝集及び膜の目詰まりを減じるのを助ける方法 を提供することは、本発明の更なる目的である。 限外濾過及びクロマトグラフィー用媒質を、実質的に性能の変化なしで何回も 浄化して再利用することのできる媒質から選択する方法を提供することは、本発 明の更なる目的である。図面の簡単な説明 図1は、接線流濾過及びヘパリンアフィニティークロマトグラフィーを含む閉 ループ式連続抽出システムにおける生物学的に活性なペプチドのミルクからの精 製に用いられる典型的な装置の略図である。 図2は、接線流濾過による生物学的に活性なペプチドのミルクからの単離のた めに用いられる典型的な装置の略図である。 図3A及び3Bは、種々のpH値における全乳の濾過性に対するEDTAの効 果を描いている。 図4は、種々のキレート化剤のミルクから単離された抗トロンビンの純度に対 する効果を示す銀染色したSDS−ポリアクリルアミドゲルのエレクトロホログ ラムを描写している。 発明の詳細な説明 本発明は、ミルクから可溶性乳成分をその生物学的に活性な形態で単離するた めの方法を提供する。好ましくは、このミルクは、全乳である。可溶性乳成分は 、家畜のミルク中に通常存在する成分、免疫化によりミルク中の存在が減少する 特異的抗体等の成分、特定の食糧によりミルク中の存在が減じ若しくは増加する 成分、又はトランスジェニック若しくはトランソミック動物中への遺伝子トラン スファーにより導入された外因性成分の何れかであってよい。 この可溶性乳成分は、ペプチド特に蛋白質であってよい。この蛋白質は、例え ば、糖蛋白質、免疫グロブリン、酵素、ペプチド又はホルモンであってよい。そ れは、起源において、ヒトであってもなくてもよい。それは、潜在的治療剤又は 医薬例えばエリスロポエチン、アルファ−1プロテイナーゼインヒビターアルカ リホスファターゼ、アンギオゲニン、抗トロンビンIII、血液凝固因子の何れか( 因子VIII、因子IX及び因子Xを含む)、キチナーゼ、細胞外スーパーオキシドジ スムターゼ、フィブリノーゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタメートデカル ボキシラーゼ、ヒト血清アルブミン、免疫グロブリン、インシュリン、ミエリン 塩基性蛋白質、プロインシュリン、可溶性CD4又はその成分若しくは複合体、 ラクトフェリン、ラクトグロブリン、リゾチーム、ラクトアルブミン、組織プラ ス ミノーゲンアクチベーター又はこれらの変異物であってよいが、これらに限定さ れない。 或いは、この乳成分を食糧の成分として用いて、例えば、パン(米国特許第5 ,178,894号)若しくは乳幼児調合乳(PCT公開No.WO91/082 16)の栄養価を増大させ、又は酪農製品例えば凍らせた酪農デザートにこく、 きめ若しくは安定性を加えることができる(米国特許第5,175,013号)。 それは又、ある種の細胞例えば上皮細胞又は繊維芽細胞の無血清培養のための添 加剤としても用いることができる(K.S.Steimer等、J.Cell Phvsiol.109:223-2 34,1981;K.S.Steimer及びM.Klagsbrun,J.Cell Biol.88:294-300,1981)。更に 、それは、産業用酵素例えばプロテアーゼ、リパーゼ又はキチナーゼであってよ い(PCT公開No.93/25567)。 ミルクは、泌乳性哺乳動物例えば乳牛、ヤギ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット 又はヒツジから採取することができる。この哺乳動物は、普通の実験室用動物若 しくは家畜、又はトランスジェニック動物若しくはトランソミック動物の何れか であってよい。ここで用いる場合、トランスジェニック又はトランソミック動物 は、非ヒト動物をいう。トランスジェニック動物は、一般に、少なくとも1つの 外来遺伝子のゲノムへの安定な取り込みの結果として異なる種に由来するペプチ ド又は他の特徴を発現する動物として規定される。かかるペプチドは、外因性ペ プチドと呼ばれる。トランスジェニック哺乳動物のミルク中の外因性ペプチドの 分泌は、蛋白質コード配列にミルク特異的蛋白質(例えば、カゼイン、ホエー酸 性蛋白質又はラクトグロブリン)由来の調節配列を加えて含む融合又は組換え遺 伝子構築物を受精卵又は胚へ導入するために当分野で公知の方法を用いることに より達成される。これらの融合構築物は、外因性蛋白質の発現を、その単離を商 業的に可能にするだけ十分に高濃度で、主として又は専らミルクに向けることが できる。 ミルクは又、少なくとも1つの外来遺伝子の特定の体組織への導入の結果とし て、異なる種に由来する蛋白質又は特徴を発現する動物であるトランソミック動 物(トランソマチック動物とも呼ばれる)から採取することもできる。例えば、外 因性蛋白質を、適当な遺伝子及び調節エレメントの乳上皮細胞への直接的な導入 により、例えば乳腺で急速に分裂しているミオオピセリアル(myoopithelial)細 胞を標的とするレトロウイルスベクターにより、ミルク中に生成することができ る。継続する世代を通して子孫にトランスジーンを伝えるトランスジェニック動 物と異なり、トランソミック動物は、外因性蛋白質をミルク中に生成する能力を 伝えず、個体ごとに造らなければならない。それにもかかわらず、それらは、関 心ある蛋白質その他の成分の起源たり得る。 通常は哺乳動物により生成されない外因性ペプチドは、異種性ペプチドとして 知られている。家畜のミルク中に見出され得る異種性ペプチドの例には、ヒトの 乳蛋白質例えばラクトフェリン、ヒト血清蛋白質例えば血液凝固因子及び産業用 酵素例えばキチナーゼが含まれる。通常特定の哺乳動物により生成されるペプチ ドは、内因性ペプチドとして知られる。内因性の例は、内因性乳蛋白質をその濃 度を増すことを目的として発現させ、又は通常血清中にのみ見出される蛋白質を ミルク中に発現させるようにトランスジェニックとすることができる。例えばウ シトランスフェリンは、通常、ミルク中に極微量で存在するが、発現を、ラクト フェリン遺伝子をアルファ−S1カゼイン遺伝子の制御下に有するトランスジェ ニック動物を生成することにより有意に増大させることができる(PCT公開N o.WO93/25567)。 異種性ぺプチドは、トランスジェニック動物により通常作られる同じペプチド 又は蛋白質の内因性型と共存することができる。異種及び同種型のペプチドは、 通常、アミノ酸配列、三次若しくは四次構造、グリコシル化その他の翻訳後修飾 の少なくとも1つにより異なっている。例えば、トランスジェニックヒツジにお ける抗トロンビンIIIは、アミノ酸配列の違いにより区別することのできるヒト 型及びヒツジ型の両方で存在し、この違いは、蛋白質の表面電荷、疎水性、金属 結合親和性又はその他の親和性における差異を生じ得る。医薬又は治療薬等の用 途のために、ヒトのペプチドは、意図したヒトレシピエントにより外来蛋白質と して認識されにくいので好適である。非ヒト型ペプチドが哺乳動物のミルク中に 存在すると、精製工程の一部として、それらを、外因性ヒト蛋白質から分離する ことが必要となり得る。 本発明は、自然に存在するものであっても誘導されたものであっても、内因性 であっても外因性であっても、同種のものであっても異種のものであっても、ミ ルク中に存在し得る任意の関心ある成分を包含する。 ミルクは、本発明の方法により、生乳、低温殺菌乳又は凍結全乳の何れかの形 態にて処理することができる。これは、ミルク中に存在し得て微孔性濾過膜又は クロマトグラフィー媒質を詰まらせ得る脂肪、カゼインミセル、脂質、体細胞及 び他の粒状物を除去する最初の工程の必要性を排除する。典型的には、この最初 の工程は、蛋白質画分の酸又はレンネットによる沈殿により行われ、又は脂肪及 び脂質の遠心分離及びスキミングにより行われてスキムミルクを生成する。これ らの方法のすべては、蛋白質を捕捉してそれらの回収を減じることが知られてい る。更に、沈殿法は、更なる処理のために沈殿した蛋白質を再溶解可能にして清 透化する追加の工程を必要とする。大量の遠心分離は、大型の高価な装置を必要 とし、この処理工程は、存在する遠心分離機を一層大きいものと置き換えるか、 もっと多くの遠心分離機を追加してそれらの幾つかを同時運転するか、又は存在 する遠心分離機によって逐次的に多数のバッチを処理し、それにより、全処理時 間を延長することによってのみスケールアップすることができる。 更に、蛋白質沈殿に必要な低pHは、幾らかの関心ある成分の生物学的活性を 減じ又は破壊し得る。例えば、トロンビンインヒビターの抗トロンビンIIIは、 約6.0未満のpH値で不安定であり、3〜5のpH値で完全に不活性化され、 それは、カゼイン蛋白質の酸沈殿のために典型的に用いられる。 本発明において、捕捉及び酸不安定性による損失を、全乳の前分画を必要とし ない方法により排除する。この方法により、ミルクを、直接、微孔性膜を横切る 濾過にかける。濾過の例には、デッドエンド濾過及び接線流濾過が含まれる。デ ッドエンド濾過において、濾過すべき溶液は、フィルター表面に対して垂直に流 れる。接線流濾過において、濾過すべき溶液は、フィルターに平行に流れ、透過 物は、それを横切って拡散する。この発明の方法において、濾過は、接線流濾過 によるものである。 接線流濾過に使用するフィルターは、好ましくは、関心あるミルク成分を含む 透過物及び脂肪、細胞、カゼインミセル及び粒状物を含む保持物を形成するのに 十分なだけの多孔度を有する。一般に、乳脂肪球は、約1〜10ミクロメートル 未満の細孔寸法、体細胞は、約0.450ミクロメートルの細孔寸法、細菌は、 約0.200ミクロメートルの細孔寸法、カゼインミセルは、約0.08〜0. 20ミクロメートルの細孔寸法、ウイルスは、約0.050.1ミクロメートル の細孔寸法、マイコプラズマは、0.1ミクロメートルの細孔寸法、そしてプリ オンは、約0.35ミクロメートルの細孔寸法を有する膜により保持され得る。 ウイルスを除去するのに十分な膜は、脂肪球、体細胞、細菌及びカゼインミセル をも除去すると考えられる。約0.05ミクロメートルの細孔寸法は、一般に、 約500kDの分子量カットオフに対応する。 通常、限外濾過膜を横切る接線流濾過において、関心ある成分は、保持物中に 濃縮される。例えば、EPO公開No.467,482は、酸性化スキムミルク の限外濾過とその後の透析濾過及び第2の限外濾過による合わせた乳蛋白質の精 製を開示している(それぞれの場合に、蛋白質を保持物中に保持する)。しかしな がら、本発明に関して新規なものは、可溶性乳成分の透過物中への分離のための 限外濾過膜の利用である。こうして形成された透過物は、関心ある成分を単離精 製するための適宜の更なる処理に適した澄んだ溶液である。保持物は、乳状の外 観を保持している。 適宜、ミルクを、最初に、穏和な条件下で、生乳が凝集すること及び濾過膜を 詰まらせることを阻止するのに十分なそして膜を横切る透過物の通過を改善する のに十分な量にてキレート化剤と合わせる。ここで用いる場合、キレート化剤は 、有機又は無機のカルシウム塩を可溶化することのできる任意の薬剤として定義 される。好ましくは、このキレート化剤は、カルシウムをキレート化することが できる。効果的にカルシウムをキレート化するキレート化剤の例は、エチレンジ アミン四酢酸(EDTA)、エチレングリコール−ビス(ベータ−アミノエチル エーテル)N,N,N’,N’四酢酸(EGTA)又はシトレートである。好ま しくは、キレート化剤を加えて1〜500mMの終濃度とする。好ましくは、キ レート化剤の終濃度は、約20〜50mMのEDTA又は50〜200mMのシ トレートである。最も好ましくは、キレート化剤の終濃度は、約25mMのED TAである。 幾つかの状況において、シトレートは、捨てられる総量に依存して、EDTA の処分が環境調節に対する問題であり得、それ故、一層高くつき得るので、一層 強力なキレート化剤であるEDTAより好適である。EGTAは、EDTAより 一層高いカルシウムに対する親和性定数を有し(R.M.C.Dawson,D.C.Elliott,W. H.Elliott及びK.M.Jones,Data for Biochemical Research,第三版、Clarendo n Press,Oxford,1986)、この発明の方法において同等かそれ以上に有効であろ う。 本発明の更なる利点は、凝結により詰まることのない膜が一層容易に浄化され て再利用されることである。例えば、それらは、適当な溶媒例えば酸、塩基及び /又はアルコールでその場で洗うことを繰り返すことにより同じ場所で浄化され 得る。再利用の前に、これらの膜を適当な緩衝液で平衡化して極微量の溶媒をす べて除去する。大規模な精製に要する量では何万ドルもの費用がかかる濾過膜の リサイクルに従順な方法を提供することにより、この発明は、実質的に、処理コ ストを減じる。 この発明の好適具体例において、限外濾過膜を横切る接線流濾過を、単一の逐 次的工程において、捕獲工程と組み合わせて、可溶性乳成分を透過物から除去す る。最も好ましくは、接線流濾過を、閉ループ式の連続抽出システムにて実施す る。ここで用いる場合、語句「閉ループ式の連続抽出システム」は、捕獲手順か らの溶出物を元のミルク試料(保持物)と合わせるシステムをいう。好適具体例 において、これは、元のミルク試料において一定の容積を維持し、そうして、新 たな溶液をシステムに加える必要性を回避する。この透過物を捕獲用デバイスに 導いて可溶性乳成分を単離する。ここで用いる場合、用語「捕獲用デバイス」は 、関心ある可溶性乳成分を捕獲することのできる接線流フィルター以外のデバイ スをいう。これらのデバイスには、アフィニティークロマトグラフィー、イオン 交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグ ラフィー、又はその他の当業者に公知の捕獲用クロマトグラフィーが含まれるが 、これらに限定されない。好ましくは、この捕獲用デバイスは、クロマトグラフ ィーデバイス例えばアフィニティークロマトグラフィーデバイスである。アフィ ニティークロマトグラフィーデバイスの例には、ヘパリンアフィニティーカラム 、プロテインAアフィニティーカラム又はプロテインGアフィニティーカラムが 含まれるが、これらに限定されない。捕獲手順からの溶出物を、元のミルク 試料(保持物)に導き戻す。好適具体例において、この処理は、可溶性乳成分が 実質的に回収されるまで行う(又は、この工程を繰り返し又は継続する)。この 発明の方法を用いての回収率は、関心ある可溶性乳成分の少なくとも約75%、 80%、90%、又は95%である。好ましくは、回収率は、約75〜90%の 範囲に、一層好ましくは約75〜95%の範囲にある。この発明の方法を用いて の関心ある可溶性乳成分の純度は、約80%、85%、90%又は95%である 。好ましくは、この純度は、約95%より高い。この方法を実施するために用い られる典型的な装置の略図を、図1に示す。 一定容積及び一定生成物通過を維持する条件下で、この回収プロセスは、指数 関数的崩壊方程式によりモデル化することができ、この方程式を、以後、方程式 1と呼ぶ: Cr=Co×e-(Vp ×d/Vo) 式中、Crは、保持物中の所望の成分の濃度であり、 Coは、所望の成分の出発濃度であり、 Voは、出発容積であり、 Vpは、全透過物容積であり、 d=は、通過係数(即ち、任意所定時間におけるCr/Co比)である。 例えば、この発明の方法を用いて、抗トロンビンIIIをトランスジェニックヤ ギ由来の全乳から単離することができる。この場合、ミルクを500kDのフィ ルターを横切る接線流濾過及びその後のヘパリンアフィニティークロマトグラフ ィーカラム上への捕獲ステップにより処理する。一定の流れを維持する条件下で 、保持物中の抗トロンビンIIIの約40%が、任意所定時間にこの膜を通過する :即ち、方程式1においてdで示される通過係数は、0.4に等しい。方程式1 は、7容の希釈されたミルクが透過物に及びヘパリンアフィニティーカラム上に 通過した後には、元のミルク試料中の抗トロンビンIIIの94%が回収され得る ということを予言する。実際には、7試料通過後の回収率は、75〜90%であ る。 最も好ましくは、この捕獲用デバイスからの流出物を、インラインで、保持物 を含有する元のミルク試料貯蔵器に導き戻す。実質的にすべての関心ある化合物 を捕獲し、液体流からの液体を元のミルク試料貯蔵器に戻す。保持物中に残って いる残留量の関心ある化合物を濾過/クロマトグラフィープロセスを続けること により単離することができる。 別の具体例においては、透過物を貯蔵器に取り出し、十分量の緩衝溶液と置き 換えてミルク試料貯蔵器中の一定容積を維持する。この別法を実施するのに用い られる典型的な装置の略図を、図2に示す。 通常、連続流濾過工程例えば限外濾過及び透析濾過は、透過物が除去されるの と同じ比率で水又は緩衝液を同時に加えることにより実施する。これは、試料及 び廃溶液の全容積の並びにそれらを処理し保持するのに必要な容器の寸法の有意 の増加を生じる。しかしながら、この発明の方法は、一定容積を維持する。好ま しくは、ミルク溶液を、膜を詰まらせることなく効率的な濾過を与えることが可 能な程度に濃縮して維持する。更に、種々の乳成分は、関心ある成分の選択的除 去を除いて、平衡を保つ。有利には、ここに記載のプロセスは、出発試料、保持 物及び透過物の容積、必要な緩衝液の容積、及び精製設備に配置すべき人員数を 最小にする。従って、この発明は、従来の精製方法を超えるかなりの潜在的な費 用の倹約を意味する。この発明の方法による接線流濾過により生成される透過物 は、関心ある成分の部分精製された標品を含む。 本発明の更なる適用において、この透過物を、適宜、関心ある成分の精製標品 を与えるために存在し得る1つ以上の更なるプロセスにより処理して、キレート 化剤を他の汚染物質と共に除去することができる。第一の透過物は、関心ある成 分と類似の、一層大きい又は一層小さい分子量の更なるペプチドを含んでよい。 これらは、例えば、他の内因性乳蛋白質であっても、外因性蛋白質の同族型であ ってもよい。更なる精製のために適当な更なるプロセスの例には、アフィニティ ークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマ トグラフィー、チオフィリッククロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラ フィー、逆相クロマトグラフィー又は濾過プロセス例えば限外濾過が含まれる。 アフィニティークロマトグラフィーは、関心ある成分に特異的に又は優先的に結 合するリガンド例えば抗体、プロテインA又はプロテインG、又は抗トロンビン IIIの場合にはヘパリンを用いて行うことができる。 実施例1:生物学的に活性な抗トロンビンIIIのミルクからの単離 抗トロンビンIIIを発現しているトランスジェニックヤギからミルクを集めて 、−35℃にて凍結した。この凍結したミルクを8±3℃の冷蔵室で一晩かけて 又は40℃以下の水浴中で解凍が完了するまで断続的に手で渦を起こすして解凍 した。約23kgの解凍したミルク試料を、同重量の50mM EDTA及び1 80mM塩化ナトリウム(pH9.1)を含む8±3℃の溶液と合わせた。 希釈したミルクを供給タンク内に入れ、図1に図式表示した連続式抽出システ ムにおいて、接線流濾過により8±6℃で清澄化した。500(kD)分子量カッ トオフの中空繊維膜カートリッジ(UFP−500−E;A/G Technology Corp.,マサチュ -セッツ、Needham在)を、10mM EDTA及び180mM塩化ナトリウム( pH6.8)を含む溶液で平衡化した。ミルクを、2つの3平行スタック中に配 置した6つの0.7m2カートリッジを通して、遠心ポンプにより確立された4 5L/分以下の流量で循環させた。入口圧を、隔膜バルブにより、15±2ポン ド/平方インチ(psi)に調節した。透過物流量を、計量型ポンプにより調節して 透過物の膜貫通圧力を0〜5psiに維持した。熱交換器(図1には示してない)を 、管路中に、濾過カートリッジの直前に入れて溶液の温度を8℃近くに維持した 。 抗トロンビンIIIを含む透過物を、誘導体化したヘパリンをリガンドとして含 む平衡化されたアフィニティークロマトグラフィーカラムにインラインで直接ポ ンプで送った。ヘパリンハイパーD樹脂(BioSepra Inc.,マサチュ-セッツ、Marlboroug h在)をクロマトグラフィーカラムに詰めて総ベッドボリューム6.1±0.7L とし、10mM EDTA(180mM塩化ナトリウム中)、pH6.8、8±3 ℃で平衡化した。ヘパリンカラムからの流出物を直接供給タンクに戻した。今や 濾過保持物及びヘパリンカラム溶出物と合わされたミルク試料を、希釈されたミ ルクの7容すべてが濾過カートリッジを通過するまで再循環させた。次いで、ヘ パリンカラムを接線流濾過ユニットから分離して、20mMリン酸ナトリウム及 び400mM塩化ナトリウムを含む緩衝液(pH7.0)で洗った。抗トロンビン IIIは、20mMリン酸ナトリウム及び2.5M塩化ナトリウムを含む緩衝液(p H7.0)で溶出された。カラム溶出液中の蛋白質を、280ナノメートル フィルターを取り付けたUV吸光度検出器を用いて検出した。 接線流濾過及びヘパリンクロマトグラフィーの全プロセスは、約6〜8時間を 要した。我々は、以前に、ここに記載した条件下で、この型の500kDの限外 濾過用中空繊維カートリッジを横切る流れが4時間にわたって一定のままである ことを示した。以前の実験は又、他の型の膜例えば0.1ミクロメートル、0. 2ミクロメートル及び0.45ミクロメートルのデュラポアメンブレンが、30 分間の試験濾過期間中に流れが有意に減じるので、ここに規定した条件下での接 線流濾過に一層適さないことをも確立した。 定量的逆相クロマトグラフィーを用いて、出発ミルク試料中及び最終的ヘパリ ンカラム溶出物中の全抗トロンビンIII蛋白質を測定した。POROS R2/ Hカラム(PerSeptive BioSystems,マサチュ-セッツ、Cambridge在、製品番号1−11 14−12)を、製造者の指示に従って用いた。水中の0.1%トリフルオロ酢 酸(TFA)〜99.9%アセトニトリル中の0.1%TFAのカラム勾配を、2 .0mL/分の流量で確立し、抗トロンビンIIIの標準溶液を用いて較正した。 抗トロンビンIII含量を、直線的標準曲線から補間した。 抗トロンビンIIIの生物学的活性を、トロンビンの標準量により試料中の抗ト ロンビンIIIがKabi基質S2238(H−D−フェニルアラニル−L−ピペコ リル−L−アルギニン−p−ニトロアニリンジヒドロクロリド)の開裂を阻止す る程度を測定するトロンビン阻害アッセイにより測定した。トロンビン及び抗ト ロンビンIIIに結合するヘパリンを各アッセイ試料に加えて抗トロンビンIII阻害 活性を増大させた。ヘパリン及びトロンビンを、ミクロウェルプレート中で、プ ロセス試料のアリコート又は標準抗トロンビンIII溶液の希釈物の何れかとイン キュベートした。15分間37℃でのインキュベーションの後に、水酢酸で反応 を停止して405ナノメートルで吸光度を測定した。抗トロンビンIII活性を直 線的標準曲線から補間した。 この接線流濾過とヘパリンアフィニティークロマトグラフイーの組合せは、一 貫して、75〜90%の回収率及び95%より高い純度を生じた。ロットAT5 01の典型的な精製の実行の結果を標1に示す。24Lの出発ミルク試料は、5 5gの抗トロンビンIII(その42g(75%)がヘパリンアフィニティーカラムか ら 回収された)を含んだ。最終生成物プールは、7.8単位/mgの比活性を有し た(これは、血漿由来の抗トロンビンIIIの比活性に匹敵する)。 接線流濾過を単独で行って、インラインでヘパリンアフィニティークロマトグ ラフィーと組み合わせなかったならば、透過物は、収集タンクに取り出され、一 定容積を維持するために透過物の容積に等しい容積の緩衝液をミルク/保持物貯 蔵器に加えたであろう。典型的装置を図2に示す。ロットAT501の典型的な 精製の実行のために、例えば、331Lの全透過物が集められ、等容積の緩衝液 を系に加え戻す。 実施例2:全乳の濾過性に対するEDTAの効果 実施例1に記載したように凍結して解凍したヤギの全乳の20mLのアリコー トを20mLの50mM EDTA又は20mLの蒸留した脱イオン水と合わせ 、濃HCl又はNaOHを用いて6〜10の範囲に及ぶ種々のpHに調節した。 各溶液を、蒸留した脱イオン水で2回より多く希釈して、1/16及び1/32 (vol/vol)の最終的なミルク希釈物とした。個々の試料を、3mL/分の 流量で、無菌の0.22ミクロメートルのMillex-GVフィルター(Millipore Co rp.,マサチュ-セッツ、Bedford在)を通して、20PSIGの圧力が達成されるまでポ ンプで送った。透過物を予め重量を測定した小さい管に集めた。各濾過を二連で 行った。管を重量測定して、全透過物をグラムで計算し、これを容積に変換した 。対照を正確に同じ方法で処理した、但し、EDTAを加えなかった。幾つかの 場合には、透過物を、抗トロンビンIII活性について、実施例1に記載したよう にトロンビン阻害アッセイによりアッセイした。 以下のpHで水のみでに希釈したミルクは、1/32の最終的希釈にてフィル ターを容易に通過した(図3)。しかしながら、EDTAの添加は、試験したすべ てのpH及び濃度において濾過性を増加させた。EDTAは、試験した一層低い 希釈において特に効果的であったが、これは、フルスケールの精製操作で一層小 さい全処理容積に相当する。別々の実験において、pH8におけるEDTA濃度 の2倍増は、少なくとも、6.25〜25mM EDTAの範囲で濾過されたミ ルクの全重量の2倍増を生じた(データは示してない)。 実施例3:種々のキレート化剤の可溶性蛋白質のミルクからの単離に対する効果 トランスジェニックヤギ155−10(抗トロンビンIIIを発現する)からのミ ルクを、実施例1に記載したように集め、凍結して解凍した。解凍したミルクの 160mLの試料を、EDTA又はシトレートをキレート化剤として含む同重量 の緩衝液と合わせた。 シトレート緩衝液は、166mMクエン酸ナトリウム及び10mMクエン酸( pH7.0)を含んだ。希釈されたミルクを、8±6℃で、図1に記載したごと き連続式抽出システムにおける接線流濾過により清澄化した(但し、一層小さい 規模で)。500kDの分子量カットオフを有する中空繊維膜カートリッジ(UFP- 500-E-4;A/G Technology Corp.,マサチュ-セッツ、Needham在)を、118mMクエン酸 ナトリウム及び7mMクエン酸を含む溶液(pH7.0)で平衡化した。このミル クを0.032m2のカートリッジを通して、2.5L/分で、蠕動ポンプによ り再循環させた。入口圧を、管クランプにより15±2psiに調節した。第2 の蠕動ポンプを用いて流量を18mL/分に、圧力を2〜6psiに維持した。 抗トロンビンIIIを含む透過物をインラインで、直接、平衡化したヘパリンハ イパーD(BioSepra Inc.,マサチュ-セッツ、Marlborough在)アフィニティーカラムにポ ンプで送った。このカラムは76mLであり、118mMクエン酸ナトリウム及 び7mMクエン酸(pH7.0)で、8±6℃で平衡化した。 この透過物を直接ヘパリンカラム上に通して、ヘパリンカラム溶出物を、閉ル ープ式連続抽出システム中の保持物貯蔵器に戻した。 13容の希釈したミルクを濾過カートリッジを通過させた後に、ヘパリンカラ ムを接線流濾過ユニットから分離した。このヘパリンカラムを、20mMリン酸 ナトリウム及び400mM塩化ナトリウム(pH7.0)を含む緩衝液で洗った。 抗トロンビンIIIは、20mMリン酸ナトリウム及び2.5M塩化ナトリウムを 含む緩衝液(pH7.0)でヘパリンカラムから溶出された。カラム溶出中の蛋白 質を、280ナノメートルフィルターを取り付けたUV吸光度検出器を用いて検 出した。接線流濾過及びヘパリンクロマトグラフィーの全プロセスは、約6時間 を要した。 キレート化剤としてのEDTAと合わせた全乳を、このスケールで、実施例1 に記載した緩衝液及びカラム洗浄溶液を用いて同様に処理した。 精製した抗トロンビンIIIのアリコートを、10〜20%の勾配を有するSD Sポリアクリルアミドゲル(Owl Scieentific,マサチュ-セッツ、Woburn在)上での電気 泳動により分離して、蛋白質純度の定性的評価のための標準的方法に従って銀で 染色した。図4は、EDTA及びシトレート試料からのヘパリンカラム溶出物( それぞれ、レーン3及び5)並びにEDTA及びシトレートプロセスからの溶出 蛋白質(それぞれ、レーン7及び9)を示している。分子量標準は、カリフォルニ ア、Hercules在、BioRad社より入手した(製品番号161−0304)。類似の精 製レベルを、EDTA及びシトレートプロセスの両方から得た。定量的逆相クロ マトグラフィーにより測定して、抗トロンビンIII活性の回収率は、EDTAを 用いて81%、シトレートを用いて90%であった。 実施例4:生物学的に活性なモノクローナル抗体のミルクからの単離 IgGモノクローナル抗体を発現するトランスジェニックヤギ395−94か ら集めたミルクを、本質的に実施例1に記載したように、凍結し、解凍し、ED TAと合わせて処理した。この試料を、500キロダルトン(kD)の分子量カッ トオフの中空繊維(UFP-500-E-3A;A/G Technology Corp.,マサチュ-セッツ、Needham在) 又は0.1ミクロンの中空繊維フィルター(モデルCFP-1-E-3A;A/G Technology C orp.,マサチュ-セッツ、Needham在)の何れかによる接線流濾過にかけた。両方の場合に おいて、透過物を、直接、プロテインGアフィニティークロマトグラフィーカラ ム(Pharmacia,ニュ-ジャ-ジ-、Piscataway在)に導く。これらのカラムを、0.1Mリ ン酸ナトリウム(pH7.0)で平衡化し、接線流濾過工程を完了した後に0.1 Mリン酸ナトリウム(pH7.0)で洗って、0.1Mクエン酸(pH2.2)で溶 出した。元のミルク試料中のIgGの純度は、定量的逆相クロマトグラフィーに より測定して、約21%であった。接線流濾過及びプロテインGクロマトグラフ ィーの後に、IgGの純度は、0.1ミクロン濾過した物質については82%で あり、500kD濾過した物質については99%あった。 実施例5:アルファ−1プロテイナーゼインヒビターのミルクからの単離 ヒトのアルファ−1プロテイナーセインヒビター(AIPI)を発現するトラン スジェニックヤギ(398−94)から集めたミルクを、本質的に実施例1に記載 したように、凍結し、解凍し、等容の20mMアルギニン(pH7.2)と合わせ てQ−セファロースFFクロマトグラフィーカラム(Pharmacia,ニュ-ジャ-ジ-、Pisc ataway在)と連結した接線流濾過により処理した。希釈したミルクを、750キ ロダルトンの分子量カットオフの中空繊維フィルター(モデルUFP-750-E-3X2;A/G Technology Corp.,マサチュ-セッツ、Needham在)により、接線流濾過にかけた。その 透過物を、直接、Q−セファロースFFカラム(1.1cm×24cm)上に導い た。このカラムを、20mMリン酸ナトリウム、1.25mM NaCl(pH 7.0)で平衡化した。接線流濾過/捕獲ステップが完了した後(2時間)、カラ ムを20mMリン酸ナトリウム、5mM NaCl(pH7.0)で洗い、次いで 、AIPIをカラムから20mMリン酸ナトリウム、75mM NaCl(pH 7.0)で溶出させた。ミルク中のAIPIの純度は、定量的逆相クロマトグラ フィーにより測定して約4%であった。清澄化及びQ−セファロースFFクロマ トグラフィーのステップ(閉ループ式連続抽出モードにて実施)の後に、このトラ ンスジェニッタAIPIの純度は、91%であり、回収率は89%であった。 実施例6:生物学的標品からのウイルスの除去 ウイルス除去の研究を、契約研究団体により、標準的試験手順に従って、この 発明のプロセスにおいて行った。抗トロンビンIIIの全乳からの単離を、実施例 1に記載したように行った。但し、このプロセスは、製造プロセススケールと同 じベッド高さで一層狭い直径のカラムを用いることによりスケールダウンした。 ヘパリンアフィニティーカラムにおける抗トロンビンIII蛋白質のカラムベッド ボリュームに対する比率、線流量、緩衝液容積のカラム容積に対する比率、緩衝 液の組成及び温度等の他のキーパラメーターは、変えなかった。 北米のヤギが感染し易いであろう4種類のウイルスを病原性ウイルスの範囲の 代表として選択した。2種類のエンベロープを有するウイルス:レトロウイルス 科の一本鎖(ss)RNA含有ウイルスである異種栄養性のマウスレトロウイルス (ミンクS+L−標的細胞にて試験);及びヘルペスウイルス科の二本鎖(ds)D NAウイルスである仮性狂犬病ウイルス(PK−13細胞(ATCC CRL64 89)にて試験)を試験した。2種類のエンベロープを有しないウイルス:ピコル ナウイルス科のssRNAウイルスであるポリオウイルスセービン1型(ベロ細 胞(ATCC CCL81)にて試験);及びアデノウイルス科のdsDNAウイ ルスであるマウスアデノウイルス(BALB/c3T3細胞にて試験)を試験した 。 これらのミルク試料に、各ウイルスの公知の接種物を別々に加えて、接線流濾 過及びヘパリンアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより処理した。ヘパ リンカラムに載せる溶液にも又、別々に加えた。両カラムからの溶出液を、各標 的細胞培養上で個々に試験した。接線流濾過カラムは、4種類すべてのウイルス について、一貫して、優れたウイルス減少を与え、一層大きい仮性狂犬病ウイル ス及び異種栄養性マウスレトロウイルスは、完全に除去された。このヘパリンア フィニティーカラムは、2〜4のログウイルス減少を与えた。結果は、表2にま とめてある。 表1.ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーと組み合わせた接線流濾過を 用いる抗トロンビンIIIのトランスジェニックヤギのミルクからのこの発明の方 法による単離。結果を、実施例1に記載したように、ロットAT501の典型的 単離について示す。抗トロンビンIII(ATIII)活性を、トロンビン阻害アッセイ により測定し、キリユニット(KU)で表した;全ATIII蛋白質を定量的逆相ク ロマトグラフィーにより測定した。表2.抗トロンビンIII単離プロセスによるウイルスの減少(各カラムに、別々に ウイルス接種物を加えて、カラム溶出物を適当な標的培養細胞にて培養すること により測定)。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヘイズ,マイケル エル. アメリカ合衆国 01720 マサチューセッ ツ,アクトン,オーチャード ドライブ 5 (72)発明者 シャーマン,リー ティー. アメリカ合衆国 01532 マサチューセッ ツ,ノースバラ,グリーン ストリート 39

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.可溶性乳成分をミルク又はミルク画分から分離する方法であって、下記を含 む当該方法: a) ミルク又はミルク画分を、保持物と可溶性乳成分を含む透過物とを形成 するのに十分な多孔度の膜を横切る接線流濾過にかけ; b) この透過物を捕獲用デバイスにかけて、実質的にその可溶性乳成分を取 り出し; c) ステップb)におけるこの捕獲用デバイスからの流出物を元のミルク試 料と合わせ;そして d) ステップa)からc)を、可溶性乳成分が実質的に回収されるまで繰り 返す。 2.ミルク又はミルク画分を、ミルクの凝集を減じて、濾過膜の通過を改善する のに十分な量のキレート化剤と合わせる、請求項1に記載の方法。 3.成分がペプチド又は蛋白質である、請求項1に記載の方法。 4.蛋白質を、糖蛋白質、免疫グロブリン、ペプチド、ホルモン、酵素、血清蛋 白質、乳蛋白質、細胞性蛋白質、可溶性レセプター及び産業用酵素よりなる群か ら選択する、請求項3に記載の方法。 5.蛋白質を、エリスロポエチン、アルファ−1プロテイナーゼインヒビター、 アルカリホスファターゼ、アンギオゲニン、抗トロンビンIII、キチナーゼ、細 胞外スーパーオキシドジスムターゼ、因子VIII、因子IX、因子X、フィブリノー ゲン、グルコセレブロシダーゼ、グルタメートデカルボキシラーゼ、ヒト血清ア ルブミン、インシュリン、ミエリン塩基性蛋白質、ラクトフェリン、ラクトグロ ブリン、リゾチーム、ラクタルブミン、プロインシュリン、可溶性CD4、可溶 性CD4の成分及び複合体、組織プラスミノーゲンアクチベーター並びにこれら の変化物よりなる群から選択する、請求項4に記載の方法。 6.接線流フィルターが、実質的にすべての脂肪、カゼインミセル、体細胞及び 粒状物を保持物中に保持するのに十分な多孔度を有する、請求項1に記載の方法 。 7.接線流フィルターが0.1〜1,000ナノメートルの範囲の細孔寸法を有 する、請求項1に記載の方法。 8.生乳中に存在する細菌、マイコプラズマ、ウイルス、プリオン粒子及び他の 汚染微生物が実質的に除去される、請求項1に記載の方法。 9.キレート化剤を、EDTA、EGTA及びシトレートよりなる群から選択す る、請求項2に記載の方法。 10.キレート化剤を、1〜500ミリモルの終濃度範囲で加える、請求項9に 記載の方法。 11.キレート化剤がEDTAである、請求項9に記載の方法。 12.EDTAを、約25ミリモルの終濃度で加える、請求項11に記載の方法 。 13.捕獲用デバイスがクロマトグラフィー捕獲用デバイスである、請求項1に 記載の方法。 14.クロマトグラフィー捕獲用デバイスがアフィニティークロマトグラフィー 捕獲用デバイスである、請求項13に記載の方法。 15.アフィニティークロマトグラフィー捕獲用デバイスを、ヘパリンカラム、 プロテインAカラム又はプロテインGカラムよりなる群から選択する、請求項1 4に記載の方法。 16.クロマトグラフィー捕獲用デバイスが、イオン交換クロマトグラフィー捕 獲用デバイスである、請求項13に記載の方法。 17.ミルクを、トランスジェニック哺乳動物及びトランソミック哺乳動物より なる群から選択する泌乳性非ヒト哺乳動物から得る、請求項1に記載の方法。 18.ミルクを、トランスジェニックウシ、ヤギ、ブタ、ウサギ、マウス、ラッ ト又はヒツジから得る、請求項17に記載の方法。 19.可溶性乳成分を、閉ループ式連続抽出システムにおいてミルク又はミルク 画分から分離する方法であって、下記を含む当該方法: a) ミルク又はミルク画分を、保持物と可溶性乳成分を含む透過物とを形成 するのに十分な多孔度の膜を横切る接線流濾過にかけ; b) この透過物をクロマトグラフィー捕獲用デバイスにかけて、実質的に、 可溶性乳成分を取り出し; c) ステップb)における捕獲手順からの流出液を元のミルク試料と合わせ ;そして d) ステップa)からc)を、可溶性乳成分が、実質的に、回収される間で 繰り返す。 20.クロマトグラフィー捕獲用デバイスがアフィニティークロマトグラフィー 捕獲用デバイスである、請求項19に記載の方法。 21.クロマトグラフィー捕獲用デバイスがイオン交換クロマトグラフィー捕獲 用デバイスである、請求項19に記載の方法。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010514746A (ja) * 2006-12-29 2010-05-06 エルエフビー バイオテクノロジーズ ミルクからのタンパク質の抽出方法
JP2011519962A (ja) * 2008-05-14 2011-07-14 アグリカルチャー ヴィクトリア サービス ピーティーワイ エルティーディー アンギオゲニン濃縮ミルク分画
JP2013524786A (ja) * 2010-04-09 2013-06-20 バイオプロテイン テクノロジーズ エスエー トランスジェニック動物の乳からの組換えヒト血漿リン脂質転送タンパク質(pltp)の製造
JP2013538588A (ja) * 2010-10-05 2013-10-17 ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー タンパク質を生産するための方法
JP2014520820A (ja) * 2011-07-07 2014-08-25 エルエフビー ユーエスエー インコーポレイテッド タンパク質を安定化する製剤
JP2017520531A (ja) * 2014-06-02 2017-07-27 ラボラトワール フランセ デュ フラクショヌマン エ デ ビオテクノロジーLaboratoire Francais du Fractionnement et des Biotechnologies Fc断片の産生
JP2018513008A (ja) * 2015-04-17 2018-05-24 イー・エム・デイー・ミリポア・コーポレイシヨン 接線流濾過モードで作動するナノファイバー限外濾過膜を用いた、試料中の目的の生物学的物質を精製する方法

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE122007000007I1 (de) 1986-04-09 2007-05-16 Genzyme Corp Genetisch transformierte Tiere, die ein gewünschtes Protein in Milch absondern
EP1555319A3 (en) 1997-10-20 2006-03-15 GTC Biotherapeutics, Inc. Modified nucleic acid sequences and method to increasing mRNA levels and protein expression in cell systems
SE9802213D0 (sv) * 1998-06-18 1998-06-18 Amersham Pharm Biotech Ab A method for the removal/purification of serum albumins and means for use in the method
US20030005468A1 (en) * 1998-06-19 2003-01-02 Meade Harry M. Methods and vectors for improving nucleic acid expression
ES2267289T3 (es) * 1998-09-24 2007-03-01 Pharming Intellectual Property Bv Purificacion de fibrinogeno a partir de fluidos mediante precipitacion y cromatografia de interaccion hidrofoba.
DE60037397T2 (de) * 1999-01-06 2008-06-05 Merrimack Pharmaceuticals, Inc., Cambridge Expression von ausgeschiedenem, menschlichem alpha-fetoprotein in transgenen tieren
WO2001000855A1 (en) 1999-06-23 2001-01-04 Ppl Therapeutics (Scotland) Ltd. Fusion proteins incorporating lysozyme
NZ522971A (en) * 2000-05-05 2005-02-25 Gtc Biotherapeutics Inc Transgenically produced decorin in the mammary gland of a transgenic animal
US20020077775A1 (en) * 2000-05-25 2002-06-20 Schork Nicholas J. Methods of DNA marker-based genetic analysis using estimated haplotype frequencies and uses thereof
US20030195707A1 (en) * 2000-05-25 2003-10-16 Schork Nicholas J Methods of dna marker-based genetic analysis using estimated haplotype frequencies and uses thereof
US20040226052A1 (en) * 2000-10-13 2004-11-11 Meade Harry M. Methods of producing a target molecule in a transgenic animal and purification of the target molecule
EP1401857A4 (en) * 2001-06-13 2004-07-21 Taurus Hsa Llc PURIFICATION OF HUMAN SERUM ALBUMIN
JP2005511012A (ja) * 2001-08-10 2005-04-28 セローノ ジェネティクス インスティテュート ソシエテ アノニム ヒトcDNAおよびタンパク質およびその使用
US6875459B2 (en) * 2001-09-10 2005-04-05 Henry B. Kopf Method and apparatus for separation of milk, colostrum, and whey
US20060253913A1 (en) * 2001-12-21 2006-11-09 Yue-Jin Huang Production of hSA-linked butyrylcholinesterases in transgenic mammals
AU2003247354A1 (en) * 2002-04-24 2003-11-10 Intermediate ingredient for dairy product manufacturing and method of making the same
ATE402955T1 (de) * 2002-05-27 2008-08-15 Nestec Sa Säurelösliche proteine aus casein-micellen
GB0216001D0 (en) * 2002-07-10 2002-08-21 Nat Blood Authority Process and composition
WO2004026427A2 (en) * 2002-09-17 2004-04-01 Gtc Biotherapeutics, Inc. Isolation of immunoglobulin molecules that lack inter-heavy chain disulfide bonds
WO2004050847A2 (en) * 2002-11-27 2004-06-17 Gtc Biotherapeutics, Inc. Modified antibodies stably produced in milk and methods of producing same
US20040231010A1 (en) * 2003-01-09 2004-11-18 Murray James D. Lysozyme transgenic ungulates
US20040210953A1 (en) * 2003-01-09 2004-10-21 Murray James D. Lysozyme transgenic ungulates
ATE521701T1 (de) 2003-01-22 2011-09-15 Univ Duke Verbesserte konstrukte zur expression lysosomaler polypeptide
JP2006515227A (ja) * 2003-02-24 2006-05-25 ジーティーシー バイオセラピューティックス インコーポレイテッド 十字流濾過の方法およびそのための装置
WO2005085287A1 (en) * 2004-03-03 2005-09-15 En-N-Tech, Inc. Treatments for contaminant reduction in lactoferrin preparations and lactoferrin-containing compositions
US20050197496A1 (en) * 2004-03-04 2005-09-08 Gtc Biotherapeutics, Inc. Methods of protein fractionation using high performance tangential flow filtration
US20050245444A1 (en) * 2004-04-30 2005-11-03 Yann Echelard Method of using recombinant human antithrombin for neurocognitive disorders
US20060121004A1 (en) * 2004-12-07 2006-06-08 Yann Echelard Methods of reducing the incidence of rejection in tissue transplantation through the use of recombinant human antithrombin
US20060130159A1 (en) * 2004-12-09 2006-06-15 Nick Masiello Method of purifying recombinant MSP 1-42 derived from Plasmodium falciparum
US20080019905A9 (en) * 2005-02-18 2008-01-24 Strome Scott E Method of using an anti-CD137 antibody as an agent for radioimmunotherapy or radioimmunodetection
WO2006138647A2 (en) * 2005-06-16 2006-12-28 Gtc Biotherapeutics, Inc. Method of making recombinant human antibodies for use in biosensor technology
WO2007014244A2 (en) * 2005-07-25 2007-02-01 Gtc Biotherapeutics, Inc. Method of purifying recombinant human antithrombin to enhance the viral and prion safety profile
ES2417147T3 (es) * 2005-10-21 2013-08-06 Revo Biologics, Inc. Anticuerpos con actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos mejorada, métodos para su producción y uso
US7531632B2 (en) * 2006-02-16 2009-05-12 Gtc Biotherapeutics, Inc. Clarification of transgenic milk using depth filtration
FR2901707B1 (fr) 2006-05-31 2017-09-29 Lab Francais Du Fractionnement Composition de facteur vii recombinant ou transgenique, chaque molecule de facteur vii possedant deux sites de n-glycosylation a motifs glycanniques definis
AU2007281998B2 (en) * 2006-08-04 2014-02-20 Pharmathene Inc. Long half-life recombinant butyrylcholinesterase
JP5208428B2 (ja) * 2007-01-30 2013-06-12 雪印メグミルク株式会社 美肌剤
FR2912310B1 (fr) 2007-02-13 2009-08-07 Kasan Sarl Nouvelles compositions cosmetiques et/ou pharmaceutiques et leurs applications.
PL2650302T3 (pl) 2007-07-10 2015-01-30 Glanbia Nutritionals Ireland Ltd Sposób usuwania endotoksyny z białek
EP2077273B1 (en) 2007-12-31 2011-09-14 Animal Technology Institute Taiwan Methods for separating casein from soluble proteins in a composition
TWI346666B (en) * 2007-12-31 2011-08-11 Animal Technology Inst Taiwan Method for seperating casein from casein-contained solution
US8304005B2 (en) * 2008-04-21 2012-11-06 Fuji Oil Company, Limited Method for production of defatted soymilk peptide
US20110229460A1 (en) * 2008-05-01 2011-09-22 Gtc Biotherapeutics, Inc. anti-cd137 antibody as an agent in the treatment of inflammatory conditions
ES2968448T3 (es) * 2009-12-18 2024-05-09 Csl Ltd Procedimiento de purificación de polipéptidos
AU2010340358B2 (en) 2009-12-21 2014-07-24 Pharmathene, Inc. Recombinant butyrylcholinesterases and truncates thereof
US8861162B2 (en) * 2010-03-09 2014-10-14 Honeywell International Inc. High power solid state power controller (SSPC) solution for primary power distribution applications
WO2011127456A2 (en) 2010-04-09 2011-10-13 Pacira Pharmaceuticals, Inc. Method for formulating large diameter synthetic membrane vesicles
SG191781A1 (en) 2010-12-30 2013-08-30 Lab Francais Du Fractionnement Glycols as pathogen inactivating agents
EP2694196B1 (en) 2011-04-01 2021-07-21 EMD Millipore Corporation Nanofiber containing composite structures
TW201400499A (zh) 2012-03-12 2014-01-01 Revo Biolog Inc 抗凝血酶用於治療妊娠毒血症之用途
EP2687595B1 (en) 2012-07-19 2018-05-30 Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies Method for purifying transgenic factor VII
WO2014022748A1 (en) 2012-08-03 2014-02-06 Revo Biologics, Inc. The use of antithrombin in extracorporeal membrane oxygenation
JP2016508515A (ja) 2013-02-13 2016-03-22 ラボラトワール フランセ デュ フラクショヌマン エ デ ビオテクノロジーLaboratoire Francais du Fractionnement et des Biotechnologies 高ガラクトシル化抗TNF−α抗体およびその使用
CN105263319A (zh) 2013-02-13 2016-01-20 法国化学与生物科技实验室 具有经修饰的糖基化的蛋白及其生产方法
AU2014285971A1 (en) 2013-07-05 2016-02-04 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Affinity chromatography matrix
US9661868B2 (en) * 2013-07-16 2017-05-30 Mead Johnson Nutrition Company Expanded bed adsorption methods for isolation of basic milk proteins including lactoferrin
FR3034419B1 (fr) 2015-04-02 2017-12-15 Lab Francais Du Fractionnement Procede de purification d'une proteine recombinante therapeutique a partir d'un lait transgenique
CA3100869A1 (en) * 2018-05-24 2019-11-28 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Method for preparing precursor of recombinant human insulin or analogue thereof
FR3082427B1 (fr) 2018-06-14 2020-09-25 Lab Francais Du Fractionnement Combinaison de facteur vii et d'un anticorps bispecifique anti-facteurs ix et x
WO2022024828A1 (ja) 2020-07-29 2022-02-03 和弘 原 成分調整物生産装置及び成分調整物生産方法
CN113101737B (zh) * 2021-03-04 2023-09-15 京美生命科技(杭州)有限公司 一种亲和切向流过滤系统及其构建方法和外泌体提取方法及应用

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2459619B1 (fr) 1979-06-26 1983-07-29 Agronomique Inst Nat Rech Procede pour l'obtention a partir de lactoserum, d'un produit enrichi en alpha-lactalbumine et applications dudit procede
FR2487642B2 (fr) 1980-07-31 1985-10-18 Bel Fromageries Procede de preparation de fractions proteiques par ultrafiltration et chromatographie d'exclusion et d'echange d'ions
DE3432718C1 (de) 1984-09-06 1986-05-22 Biotest Pharma GmbH, 6000 Frankfurt Verfahren zur Herstellung einer Loesung von Milch- und/oder Kolostralimmunglobulinen
FR2584727B1 (fr) 1985-07-11 1988-06-17 Roussel Uclaf Procede d'extraction de proteines du lait, produits, application du procede, et compositions pharmaceutiques
JPS62298536A (ja) 1986-06-17 1987-12-25 Green Cross Corp:The 生理活性物質の自動精製方法および自動精製装置
DE3743440A1 (de) * 1987-12-21 1989-06-29 Gauri Kailash Kumar Verfahren zum trennen der geloesten und ungeloesten bestandteile von milch
US4897465A (en) 1988-10-12 1990-01-30 Abbott Laboratories Enrichment and concentration of proteins by ultrafiltration
RU2095414C1 (ru) 1989-12-01 1997-11-10 Джен Фарминг Ойроп БВ Трансген для получения рекомбинантного полипептида в молоке трансгенных коров, способ получения трансгенной коровы (варианты), молоко от трансгенной коровы, пищевой состав
NL9001650A (nl) 1990-07-19 1992-02-17 Ver Coop Melkind Werkwijze voor de bereiding van een melkeiwit-isolaat.
US5256294A (en) 1990-09-17 1993-10-26 Genentech, Inc. Tangential flow filtration process and apparatus
US5175013A (en) 1990-12-31 1992-12-29 The Pillsbury Company Frozen dessert compositions and products
US5178894A (en) 1991-09-26 1993-01-12 Silvia P. Rudel High non-fat milk content bread products having improved keeping qualities
JP3670003B2 (ja) 1992-06-15 2005-07-13 ファーミング ビー.ブイ. ウシ種による組み換えポリペプチドの製造及びトランスジェニック法
US5256437A (en) * 1992-06-19 1993-10-26 Pall Corporation Product and process of making sterile milk through dynamic microfiltration
PT804070E (pt) 1993-03-09 2000-11-30 Genzyme Corp Isolamento de componentes de interesse a partir do leite.
CA2183459A1 (en) 1994-02-16 1995-08-24 Jan H. Nuijens Isolation of lactoferrin from milk
US5597486A (en) * 1995-05-01 1997-01-28 Millipore Investment Holdings Limited Membrane filtration with optimized addition of second liquid to maximize flux

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010514746A (ja) * 2006-12-29 2010-05-06 エルエフビー バイオテクノロジーズ ミルクからのタンパク質の抽出方法
JP2011519962A (ja) * 2008-05-14 2011-07-14 アグリカルチャー ヴィクトリア サービス ピーティーワイ エルティーディー アンギオゲニン濃縮ミルク分画
JP2013524786A (ja) * 2010-04-09 2013-06-20 バイオプロテイン テクノロジーズ エスエー トランスジェニック動物の乳からの組換えヒト血漿リン脂質転送タンパク質(pltp)の製造
JP2013538588A (ja) * 2010-10-05 2013-10-17 ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー タンパク質を生産するための方法
US10138290B2 (en) 2010-10-05 2018-11-27 Novo Nordisk Healthcare Ag Process for protein production
JP2014520820A (ja) * 2011-07-07 2014-08-25 エルエフビー ユーエスエー インコーポレイテッド タンパク質を安定化する製剤
JP2017520531A (ja) * 2014-06-02 2017-07-27 ラボラトワール フランセ デュ フラクショヌマン エ デ ビオテクノロジーLaboratoire Francais du Fractionnement et des Biotechnologies Fc断片の産生
JP2018513008A (ja) * 2015-04-17 2018-05-24 イー・エム・デイー・ミリポア・コーポレイシヨン 接線流濾過モードで作動するナノファイバー限外濾過膜を用いた、試料中の目的の生物学的物質を精製する方法

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Publication number Publication date
ATE224145T1 (de) 2002-10-15
DE122007000008I2 (de) 2011-01-13
NZ332916A (en) 2000-05-26
DE122007000008I1 (de) 2009-05-20
ES2182074T3 (es) 2003-03-01
DE69715641D1 (de) 2002-10-24
PT923308E (pt) 2002-11-29
CA2254871C (en) 2008-03-25
EP0923308A4 (ja) 1999-06-30
EP0923308A1 (en) 1999-06-23
US6268487B1 (en) 2001-07-31
LU91305I2 (fr) 2007-03-12
WO1997042835A1 (en) 1997-11-20
JP4476362B2 (ja) 2010-06-09
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