JPH10509040A

JPH10509040A - 造血系多能性細胞のｅｘｖｉｖｏ増殖のための幹細胞因子および可溶性インターロイキン−６受容体の使用

Info

Publication number: JPH10509040A
Application number: JP8516352A
Authority: JP
Inventors: ナカハタ，タツトシ
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1994-11-16
Filing date: 1995-11-16
Publication date: 1998-09-08
Anticipated expiration: 2015-11-16
Also published as: ATE221118T1; AU4407396A; DK0793714T3; JP3600244B2; MX9701512A; WO1996015230A3; EP0793714B1; CN1224461A; PT793714E; DE69527540D1; ES2180665T3; CA2198603A1; DE69527540T2; CN1170926C; US5861315A; EP0793714A2; CA2198603C; WO1996015230A2; AU699479B2

Abstract

(57)【要約】ｇｐ１３０シグナル伝達のための、可溶性インターロイキン−６受容体、インターロイキン−６と組み合わせた幹細胞因子は、正常なヒト造血系多能性細胞からの血液細胞の増殖、分化および最終的成熟を助ける。

Description

【発明の詳細な説明】造血系多能性細胞のｅｘｖｉｖｏ増殖のための幹細胞因子および可溶性インターロイキン−６受容体の使用発明の背景本発明は、細胞増殖（cell expansion）におけるインターロイキン−６、可溶性インターロイキン−６受容体および幹細胞因子の組み合わせの使用に関する。特に、本発明は、造血系前駆／幹細胞のｅｘｖｉｖｏ増殖におけるこれらの因子の組み合わせの使用に関する。産業上の利用分野インターロイキン−６（ＩＬ−６）の受容体系は、２つの機能的に異なる鎖、すなわちリガンド結合鎖（ＩＬ−６Ｒ）および、リガンド非結合性のシグナル伝達鎖（ｇｐ１３０）から成る。ｇｐ１３０鎖はＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６複合体と結合して、高親和性ＩＬ−６結合部位の形成およびシグナル伝達に導く（１−４）。インターロイキン−６受容体の細胞外可溶性型（ｓＩＬ−６Ｒ）は、膜に固定されたｇｐ１３０を介してＩＬ−６シグナルを仲介することが示されている。ｓＩＬ−６ＲとＩＬ−６の複合体（ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６）は、ＩＬ−６Ｒ陰性細胞およびＩＬ−６Ｒ陽性細胞の両方で発現するｇｐ１３０と結合することができる。この結合により、ｇｐ１３０のホモ二量体化おびＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路の活性化を誘導し、細胞応答をもたらす（４−８）。ＩＬ−６はＩＬ−３および幹細胞因子（ＳＣＦ）と相乗的に作用して、ヒト造血系前駆細胞の増殖を増大させ、又は休眠中のマウス造血系前駆細胞からのコロニー形成を助けることが示された（９−１１）。しかしながら、ヒトの血液形成におけるｇｐ１３０のシグナル伝達経路の役割についてはほとんど分かっていない。最近、遺伝子治療、骨髄移植（ＢＭＴ）の増大およびＢＭＴの代用を含む種々の臨床応用のために造血前駆細胞のｅｘｖｉｖｏ増殖に多大の関心が寄せられている。種々の組み合わせのサイトカイン類または間質細胞を用いる細胞数の増大に関する既存の報告があるが、達成された前駆細胞、特に多能性前駆細胞、の増殖度は一般的に低い。このことは、原始細胞(primitive cells)の分化および枯渇化が増殖培養中に起こることを示唆している（１２−１５）。最近の研究により、ＩＬ−６およびｓＩＬ−６Ｒの組み合わせが、ｇｐ１３０シグナル伝達過程の活性化を介して分化可能な胚性幹（ＥＳ）細胞の自己再生を維持することが示された（１６）。ＩＬ−６の精製、クローニングおよび用途は公知である（１９８７年５月６日に公表されたＥＰ２２０５７４、Revelら；１９８８年１月１４日に公表されたＷＯ８８／００２０６、Clarkら）。ｓＩＬ−６Ｒの精製およびクローニング、また細菌感染、熱傷および損傷のような症状の治療におけるｓＩＬ−６ＲとＩＬ− ６の組み合わせ使用も報告されている（１９９１年２月２７日に公表されたＥＰ４１３９０８、Novick ら；ＪＰ８９２７１８６５；Yamasaki ら、Science、24 1:825-828、1988）。ＳＣＦは、初期に作用する造血因子である。ＳＣＦの精製、クローニングおよび用途が報告されている（゛幹細胞因子゛と題したＰＣＴＷＯ９１／０５７９５参照）。骨髄移植および骨髄回復の強化、並びに白血球減少症および血小板減少症の治療のためのＳＣＦの使用が記載されてきた。ＩＬ− ６と組み合わせたＳＣＦの使用が記載されてきたが、造血系前駆細胞の増殖のためのＳＣＦ、ＩＬ−６およびｓＩＬ−６Ｒの組み合わせ使用に関する既存の報告はない。発明の要約本発明は、可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）およびＩＬ−６と幹細胞因子（ＳＣＦ）との組み合わせが、ヒト造血系多能性細胞のｅｘｖｉｖｏ増殖を助けることができることを立証する。ｓＩＬ−６ＲまたはＩＬ−６のいずれも、単一でＳＣＦと組み合わせた場合、この効果を示さない。多能性細胞は、臍帯血、末梢血または骨髄から得ることができる。多能性造血細胞としては、ＣＤ３４選択により得られる前駆細胞および／または幹細胞、あるいは増殖している細胞の除去により機能的に選択された幹細胞、を挙げることができる。サイトカイン類は、別々のサイトカインを入れた個々の容器を含むキットとして提供することもできるし、または１種以上のサイトカインを単一の容器の中の混合物として提供することもできる。更に、本組み合わせのサイトカイン類は、エリトロボエチン（ＥＰＯ）の非存在下、精製したヒト造血系幹細胞からの赤血球系細胞の増殖、分化および最終的成熟を助けることができる。ｓＩＬ−６ＲまたはＩＬ−６のいずれも、単一でＳＣＦと組み合わせた場合、エリトロポエチンの非存在下ではこの効果を示さない。この研究により、ｓＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６およびＳＣＦの組み合わせによる造血系幹細胞（例えば、ＣＤ３４⁺細胞）からの赤血球系細胞の生成が立証された。サイトカイン類の有効性は、無血清培養でも確認された。多数の成熟赤血球細胞を含む、いくつかの赤血球系バースト（bursts）および混合赤血球系コロニーが、ｓＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６およびＳＣＦの組み合わせを含有するメチルセルロース培養中でＣＤ３４⁺細胞から発生した。抗ｇｐ１３０モノクローナル抗体を培養に添加すると、赤血球系細胞は全く産生されなかったが、一方、抗エリトロボエチン抗体の添加は、ＣＤ３４⁺細胞からの赤血球系細胞の生成に影響を及ぼさなかった。上記の結果から、成熟赤血球細胞は、エリトロポエチンの非存在下で造血系前駆細胞から産生可能であることが立証された。ヒト血清が検出可能なレベルのｓＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６およびＳＣＦを含有するという既知の報告（２６−２８）と合わせると、通常の赤血球形成は、２つの異なる経路、すなわちエリトロポエチンが仲介するシグナル伝達、およびＳＣＦシグナル伝達と組み合わさったｇｐ１３０の関与する新規な作用機序、によって生理学的に調節されていると考えられる。図面の簡単な説明図１は、指示した因子の組み合わせの存在下で培養した多能性細胞からのコロニー形成の結果を示す。図２は、ＩＬ−６の存在下（○）または非存在下（●）における種々の濃度のｓＩＬ−６Ｒでの前駆細胞の増殖、並びにｓＩＬ−６Ｒの存在下（○）または非存在下（●）における種々の濃度のＩＬ−６での前駆細胞の増殖を示す。図３は、７日目（白い棒）、１４日目（斜線棒）および２１日目（黒塗りの棒）における、図に記載された因子またはそれらの組み合わせ体を補充した際の前駆細胞の増殖を示す。図４は、７日目（白い棒）、１４日目（斜線棒）および２１日目（黒塗りの棒）における、ＳＣＦの存在下、種々の因子の組み合わせを補充した血清含有培養又は無血清培養での前駆細胞の増殖を示す。図５は、総前駆細胞（○）およびＣＦＵ−Ｍｉｘ（●）の増大に対する種々の濃度の抗ヒトｇｐ１３０モノクローナル抗体（Ａ）および抗ヒトＩＬ−６Ｒモノクローナル抗体（Ｂ）の影響を示す。図６は、ＩＬ−６およびＳＣＦの存在下での種々の濃度のｓＩＬ−６Ｒの作用を示す。図７は、ｓＩＬ−６ＲおよびＳＣＦの存在下での種々の濃度のＩＬ−６の作用を示す。図８は、無血清および血清含有培養に対するＳＣＦ、ＩＬ−６／ＳＣＦおよびｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６／ＳＣＦの作用を示す。図９は、生成した赤血球系細胞の性質を示す。図１０は、培養の７、１４および２１日目における異なる組み合わせのサイトカイン類により産生した総細胞数、Ｅ−芽球（E-blasts）および赤血球を示す。ＩＬ−３はインターロイキン−３であり、Ｇ−ＣＳＦは顆粒球コロニー刺激因子であり、ＧＭ−ＣＳＦは顆粒球マクロフアージコロニー刺激因子である。図１１は、ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６／ＳＣＦまたはＥＰＯ／ＳＣＦの組み合わせを体を添加した懸濁培養に対する抗ｇｐ１３０ＭＡｂ（μｇ／ｍｌ）の作用を示す。図１２は、ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６／ＳＣＦまたはＥＰＯ／ＳＣＦの組み合わせ体を添加した懸濁培養に対する抗ＩＬ−６ＲＭＡｂ（μｇ／ｍｌ）の作用を示す。図１３は、ＥＰＯ、ＥＰＯ／ＳＣＦまたはｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６／ＳＣＦの組み合わせ体を添加した懸濁培養に対する抗ＥＰＯ抗体（μｇ／ｍｌ）の作用を示す。発明の詳細な説明本発明は、ヒト造血系幹／前駆細胞に対するｓＩＬ−６ＲおよびＩＬ−６の複合体の活性により開始することのできるｇｐ１３０シグナル伝達の潜在的役割の研究に基づく。本明細書中に示された結果は、ＳＣＦの存在下、ｓＩＬ−６ＲおよびＩＬ−６が関わるｇｐ１３０シグナル伝達が、ヒト原始造血系前駆細胞のｅｘｖｉｖｏ増殖を劇的に刺激することを示す。ＩＬ−６のシグナル伝達受容体成分であるｇｐ１３０は、ＩＬ−６リガンドとＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）との複合体と結合しシグナルを伝達する。ヒト造血系前駆細胞の増殖におけるｇｐ１３０シグナル伝達の役割を調べるために、種々のサイトカイン類と組み合わせた組み換え可溶性ヒトＩＬ−６受容体（ｓＩＬ −６Ｒ）および／またはＩＬ−６の、ＣＤ３４⁺細胞に対する作用を試験した。ｓＩＬ−６ＲおよびＩＬ−６の組み合わせ（ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６）が、幹細胞因子（ＳＣＦ）の存在下、造血系前駆／幹細胞およびＣＤ３４⁺細胞の増殖を劇的に刺激することを見い出した。しかし、ｓＩＬ−６ＲおよびＳＣＦの組み合わせまたはＩＬ−６およびＳＣＦの組み合わせのいずれも同様の結果を与えなかった。ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６／ＳＣＦを添加した懸濁培養中で３週間にわたり多能性造血系前駆細胞の顕著な生成が起こった。コロニー、特に多系統および芽細胞コロニーの効率的形成が、組み合わせたサイトカイン類を補充した血清含有培養および無血清培養の両方で観察された。初めの造血系前駆／幹細胞は、胎児、胎盤、臍帯血、末梢血、または骨髄を含むいずれかの適切な細胞源から得ることができる。これらの多能性造血細胞としては、ＣＤ３４選択により得られる前駆細胞および／または幹細胞を含むことができる。任意に、多能性造血細胞は、増殖している細胞の除去により機能的に選択または単離される幹細胞（Berardiら，Science，267:104-108，1995）であってもよい。本発明により、それぞれｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６およびＳＣＦにより開始される２つのシグナル経路、すなわちｇｐ１３０シグナル伝達およびｃ−Ｋｉｔシグナル伝達、がヒト造血系前駆細胞のｅｘｖｉｖｏ増殖を相乗的に促進することが立証された。ｓＩＬ−６Ｒは、ＢＡＦ−ｍ１３０細胞、ｇｐ１３０ｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞、およびマウスの破骨細胞、のようなある種の細胞系に対してＩＬ−６の存在下で作働的効果を高めることが報告されている（６−８、２５）。しかしながら、本知見は、ＳＣＦの存在下でのｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６が、ヒト原始造血系前駆細胞の増殖にとって非常に強力な刺激剤であることを示した。ｅｘｖｉｖｏ増殖に関する既知の報告は、ヒト原始造血系細胞の刺激のためにｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６／ＳＣＦの組み合わせを用いて見出されたような顕著な相乗作用を示すことはできなかった。造血系前駆細胞のｉｎｖｉｔｒｏ増殖は、遺伝子治療および細胞置換を含む可能な臨床応用に適した造血細胞を調製する魅力的な手段である。種々の組み合わせのサイトカイン類が、前駆細胞の増殖に有用であることが報告されてきた（１２−１５）。ＳＣＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−６は、原始造血細胞に対し最も大きく作用するサイトカイン類として一般に認められており、これらの因子の組み合わせは、造血系前駆細胞の増殖のための基本的かつ最も効力あるサイトカインの組み合わせとして広く用いられてきた。しかしながら、本発明は、ｓＩＬ− ６ＲとＩＬ−６およびＳＣＦとの組み合わせ（ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６／ＳＣＦ）が、ＣＦＵ−ＭｉｘまたはＣＦＵ−Ｂｌａｓｔを含む原始前駆細胞の増殖率に関して優れていることを示している。既存の研究は、ＩＬ−３、ＩＬ−６およびＳＣＦと、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１またはＥＰＯのようなある種の他のサイトカインとの組み合わせの存在下でのヒト末梢血由来のＣＤ３４⁺細胞の培養に基づいていた。このような研究は、これらの組み合わせが、血清含有懸濁液培養における前駆細胞の生成に有用であることを示している（１２、１３）。ＣＦＵ−ＧＭの約６０倍の増加は、ＩＬ−３の組み合わせを用いて既に達成されたが、しかしながら、ＣＦＵ−Ｍｉｘは増大しておらず、ＣＦＵ−ＭｉｘまたはＢＦＵ−Ｅは、培養の１４日目に全く検出されなかった。このような知見は、比較的後期の前駆細胞が、これらの培養で主として増大したことを示唆する。これに対して、本発明を用いた、懸濁培養中の多能性造血系前駆細胞の効率的な増大およびメチルセルロース培養中のＭｉｘおよびＢｌａｓｔコロニーの劇的形成は、ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６が、より初期の原始造血細胞または分化可能な幹細胞さえも刺激することを示す。抗ｇｐ１３０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）または抗ＩＬ−６ＲｍＡｂの上記培養への添加は、懸濁培養中の前駆細胞の増殖を用量依存的に阻害することが判明した。また、これらの抗体は、メチルセルロース培養中の多系統コロニーの形成も完全に遮断した。この知見は、ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の観察された作用が、標的細胞上の膜固定されたｇｐ１３０と、ＩＬ−６が結合したｓＩＬ−６Ｒ分子との相互作用を介して提供されたことを明示した。最近の研究は、ｇｐ１３０が細胞上で遍在的に発現したこと、またＥＳ細胞の自己再生がｉｎｖｉｔｒｏでＬＩＦなしにｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６複合体により維持することができることを示した（６、１６、１８）。しかしながら、ヒトＣＤ３４⁺造血系幹／前駆細胞上でどのサイトカイン受容体が正常に発現するかという情報は、依然として不完全である。ＳＣＦのｃ−Ｋｉｔ受容体は確かに存在しており、本研究において、ｇｐ１３０は、全てのＣＤ３４⁺細胞中に存在しているようであるが、ＩＬ−６Ｒは、免疫染色により測定したようにＣＤ３４⁺ 細胞の小集団中にしか存在していないように思われる。ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６複合体は、ＩＬ−６Ｒ陽性細胞においてＩＬ−６シグナルを増強することができ、更に重要なことには、通常ＩＬ−６に反応しないＩＬ−６Ｒ陰性ＣＤ３４⁺細胞中のｇｐ１３０を介してシグナルを仲介することかできる。ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６は、本研究で明らかにされたようにＳＣＦの存在下でのみ機能することから、前駆細胞上のｇｐ１３０およびｃ−Ｋｉｔの同時発現およびこれらのシグナル経路の同時活性化は、潜在的な臨床応用のためのヒト造血系前駆細胞の劇的増殖をもたらす。実施例実施例１メチルセルロース培養におけるＣＤ３４⁺細胞からのコロニー形成に対するｓＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６およびＳＣＦの作用材料および方法細胞調製ヒト臍帯血を、正常な満期分娩中に得、医療機関の指導により集めた。Ｓｉｌｉｃａ（IBL,Fujioka,Japan）を用いた食細胞の枯渇後、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離により単核細胞（ＭＮＣ）を分離した。ＣＤ３４⁺細胞を結合させるための抗ＣＤ３４抗体を有する磁気ビーズ (Dynabeads M-450 CD34; Dynal，Oslo，Norway)、ＭＮＣからＣＤ３４⁺細胞を分離するための Dynal Magnetic Particle concentrator、および選択したＣＤ３４⁺細胞をビーズから分離するための DETACHaBead CD34(Dynal)を用いてＭＮＣからＣＤ３４⁺細胞を精製した。製造元の指示書に従って選択および分離操作を行った。分離した細胞の８５〜９５パーセントはＣＤ３４陽性であることか、ＦＡＣＳ分析(Ortho Diagnostics Systems，Westwood，MA)により確認された。受容体およびサイトカイン類組換えヒトＩＬ−６およびＳＩＬ−６Ｒのクローニング、発現および精製は、従来の開示の通りに十分特徴付けられる（１７、１８）。ヒトＳＣＦ（Amgen; Thousand Oaks,CA）、ヒトＩＬ−３、顆粒球マクロフアージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびエリトロポエチン（ＥＰＯ）(Kirin Brewery Co．Ltd.; Tokyo，Japan)、およびヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）(ChugaiPharmaceutical Co.; Tokyo，Japan)を用いて細胞に対する種々のサイトカインの組み合わせの作用を評価した。サイトカイン類のすべてが、純粋な組換え分子であり、ヒト造血細胞のメチルセルロース培養に最適の応答を誘導する濃度で用いた。これらの濃度は、１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、２００Ｕ／ｍｌのＩＬ−３、２Ｕ／ｍｌのＥＰＯ、並びに１０ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦである。懸濁培養精製したＣＤ３４⁺細胞を、公知の技術（２１、２２）を用いて懸濁培養中でインキュベートした。培養混合物は、２０００個のＣＤ３４⁺細胞、 α−培地（ICN Flow; ICN BIOMEDICALS,Inc.,CostaMesa,CA）、２０％牛胎児血清（FBS; HyClone,UT）、１％結晶化および脱イオン化画分Ｖ牛血清アルブミン（BSA，Sigma社）、および異なる組み合わせのサイトカイン類を含有した。２４ウェルの組織プレート(Nunc,Kamstrup,Denmark)の各ウェル内の１ｍｌの培養混合物を、５％ＣＯ₂、５％Ｏ₂および９０％Ｎ₂で満たした湿潤雰囲気下、３７℃ でインキュベートした。無血清懸濁培養は、２％の純粋なＢＳＡ（Sigma 社）、１０μｇ／ｍｌのインスリン、２００μｇ／ｍｌのトランスフェリン（Sigma社）、１０^-5Ｍのメルカプトエタノール（Eastman 社）、並びにＦＢＳおよびＢＳＡの代わりの４０μｇ／ｍｌの低濃度リポ蛋白（Sigma 社）から構成された（２２）。１週間おきに、培養容量の半分を取り出すことにより培養物を減少させ、次いで、その分の容量を、同じ組み合わせのサイトカイン類を含有する新しく調製した培地で置き換えた。集めた培地中の細胞を洗浄し計数した（１２−１５）。培養の各時点で生成した造血系前駆細胞の総数を、クローナルメチルセルロースアッセイで、増殖した細胞の画分を更に培養することにより評価した。実施例３の遮断（blocking）実験のために、抗ｇｐ１３０ｍＡｂまたは抗ＩＬ−６ＲｍＡｂを培養の開始時に加えた。クローン培養懸濁培養中に接種したＣＤ３４⁺細胞およびその子孫を、メチルセルロース培養中でＣＤ３４⁺細胞は５００細胞／ｍｌ、培養した細胞は２× １０³〜１０×１０³細胞／ｍｌの濃度で３つ組でインキュベートした（２３）。培養混合物は、細胞、α−培地、０．９％メチルセルロース（Shinetsu Chemica l Co.，Tokyo，Japan）、３０％ＦＢＳ、１％ＢＳＡ、５×１０^-5Ｍのメルカプトエタノール、およびｓＩＬ−６Ｒ含有または非含有の種々の組み合わせのサイトカイン類を含有した。１ｍｌの細胞含有培養混合物を、各３５ｍｍのＬｕｘ標準非組織培養皿にプレーティングし、５％ＣＯ₂を含む空気で満たした湿潤雰囲気下で３７℃でインキュベートした。無血清メチルセルロース培養は、１％の純粋なＢＳＡ、３００μｇ／ｍｌのヒトトランスフェリン、１６０μｇ／ｍｌの大豆レシチン（Sigma 社）、並びにＢＳＡおよびＦＢＳの代わりの９６μｇ／ｍｌのコレステロール(Nacalai Tesque Inc.，Ky oto，Japan)を除いては血清含有培養中のものと同じ成分を含有した（１１）。ＳＣＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦの組み合わせを用いて各時点における懸濁培養中で生成した種々の前駆細胞を測定した。全ての培養は、３つ組で行い、公知の基準（１０、１１、２３）により１４日目に計数した。結果図１は、指示した因子の組み合わせの存在下で培養した多能性細胞から得た結果を示す。コロニーは、１４日目に計数した。コロニー数は、３つ組の培養の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。（コロニー型を示すのに用いた略号は、以下の通りである。ＧＭ、顆粒球−マクロフアージコロニー；Ｍｅｇ、巨核球コロニー；Ｂ、赤血球系バースト；Ｂｌａｓｔ、芽細胞コロニー；Ｍｉｘ、混合造血系コロニー；およびＧＥＭＭ、顆粒球−赤血球−マクロフアージ−巨核球コロニー）。種々のサイトカイン類の各々を、１２８０ｎｇ／ｍｌのｓＩＬ−６Ｒ、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６および／または１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦと組み合わせて用いた。血清含有培養においては、ｓＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６、ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６またはＳＣＦ単独では、わずかな数のコロニーしか誘導しなかった。ＩＬ−６およびＳＣＦの組み合わせは、ＩＬ−６またはＳＣＦ単独の補充と比較して、ＧＭおよびＢｌａｓｔコロニーの形成を増強した。最も顕著なコロニー生成は、ｓＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６およびＳＣＦを補充した培養中で５０％を超える高いプレーティング効率として観察された。ｓＩＬ−６ＲをＩＬ−６およびＳＣＦの組み合わせ体に添加すると、総コロニー数が４．２倍増加した。ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ− ６／ＳＣＦにより誘導されたコロニー数は、ＩＬ−３を用いた場合の１１．３倍、ＧＭ−ＣＳＦを用いた場合の５．２倍、Ｇ−ＣＳＦを用いた場合の５．４倍であった。ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６／ＳＣＦを補充した培養中で、いくつかのＭｅｇコロニーおよび赤血球系バーストの他に大きなサイズのかなりの数のＢｌａｓｔコロニーおよびＭｉｘコロニー、その大部分はＧＥＭＭである、が発生した。ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６／ＳＣＦにより誘導されたコロニーの６０％以上がＧＥＭＭおよびＢｌａｓｔコロニーであり、一方、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦにより誘導されたコロニーの大部分がＧＭコロニーであった。ＦＢＳ中の末知の因子の影響の可能性を排除するために、無血清培養も実施した。最も顕著なコロニー形成が、再度、ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６／ＳＣＦを補充した培養中で観察された。ｓＩＬ−６ＲのＩＬ−６およびＳＣＦの組み合わせへの添加は、総コロニー数を１７．５倍増加させた。また、この組み合わせは、Ｍｅｇコロニーおよび赤血球系バーストの他に、多数のＭｉｘおよびＢｌａｓｔコロニーの形成を刺激した。他の因子の組み合わせでは、コロニーが全く発生しないか又はわずかなＧＭコロニーしか発生しなかった。図１に示すようにｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６を他の因子と組み合わせて試験した場合、ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６とＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦのいずれかとの間の僅かな相乗作用が、血清含有培養で観察された。しかしながら、無血清培養では、ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６と前記因子との間になんら相乗作用が見られなかった。この結果は、ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ− ６がＣＤ３４⁺前駆細胞の増殖に特にＳＣＦと相乗作用することを示している。実施例２懸濁培養における造血系多能性細胞の増大に対するｓＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６およびＳＣＦの作用ＳＣＦ単独またはＩＬ−６／ＳＣＦ組み合わせ体と組み合わせた種々の濃度のｓＩＬ−６Ｒの存在下で、ＣＤ３４⁺細胞の血清含有懸濁培養を用いて実験を行った。培養により誘導された前駆細胞を、１４日のインキュベーション後にアッセイした。図２は、８４０個の前駆細胞を含有する２０００個のヒトＣＤ３４⁺ 細胞に対するｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６／ＳＣＦの組み合わせ（ＳＣＦ１００ｎｇ／ｍｌ）を用いた血清含有懸濁培養における１４日後の前駆細胞増殖の結果を示している。図２Ａは、ＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下（○）または非存在下（●）、種々の濃度のｓＩＬ−６Ｒにおける前駆細胞の増加を示す。図２Ｂは、ｓＩＬ−６Ｒ（１２８０ｎｇ／ｍｌ）の存在下（○）または非存在下（●）、種々の濃度のＩＬ−６における前駆細胞の増加を示す。図１Ａに示すように、総前駆細胞は、ｓＩＬ−６Ｒの濃度に従って劇的に増加した。この増加は、８０ｎｇ／ｍｌの低濃度でｓＩＬ−６Ｒを用いても検出可能である。増加は、１２８０ｎｇ／ｍｌの濃度のｓＩＬ−６Ｒを用いると、前駆細胞は約７０倍に増加したところでプラトーになる。しかしながら、ＩＬ−６の非存在下では、ｓＩＬ−６Ｒは、総前駆細胞を増大できなかった。また、前駆細胞の最適増大は、ＩＬ−６の濃度に依存すると考えられる。ｓＩＬ−６Ｒの存在下、５０ｎｇ／ｍｌを超えるＩＬ−６濃度を用いて前駆細胞の最大増加（６３倍の増加）を得た（図２Ｂ）。対照的に、ｓＩＬ−６Ｒの非存在下では、５０ｎｇ／ｍｌを超える濃度のＩＬ−６を用いた場合でさえ、ＩＬ−６とＳＣＦの組み合わせを用いても前駆細胞は約１０倍の増加しか観察されなかった。これらの結果は、ｓＩＬ−６Ｒが、機能的であり、ＩＬ−６との組み合わせでのみＣＤ３４⁺細胞において増殖シグナルを伝達することができることを示した。また、これらの結果は、１２８０μｇ／ｍｌのｓＩＬ−６Ｒおよび５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６が、ＳＣＦを含有する懸濁培養中での前駆細胞の増大の最適濃度であることを示している。造血系前駆細胞の増大に対するｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の作用を更に詳細に検討調査するために、（他の因子と組み合わせてｓＩＬ−６ＲおよびＩＬ−６を補充した）血清含有および無血清懸濁培養の両方を、３週間にわたって実施し、毎週、前駆細胞の増大を分析した。図３は、単一の因子または因子の組み合わせを補充した血清含有懸濁培養での７日目（白い棒）、１４日目（斜線棒）および２１日目（黒塗りの棒）における、６８４個の前駆細胞を含有する２０００個のＣＤ３４⁺細胞からの総前駆細胞の生成結果を示す。データは、１回の実験から得ている。同様のデータが、更に４回の実験で得られた。ＩＬ−６またはｓＩＬ−６Ｒを単独に補充した培養で見られた前駆細胞の数は、徐々に減少し、１４日又は２１日目では観察される前駆細胞は、ほとんど残存していなかった。ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６またはＳＣＦ単独のいずれも前駆細胞の増大に対し顕著な効果がなかった。ＳＣＦおよびＩＬ−６を補充した細胞は、７、１４および２１日目までにそれそれ８．５倍、１４倍および２１倍まで総前駆細胞数が増加した。対照的に、ｓＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６およびＳＣＦの組み合わせは、前駆細胞の増殖を劇的に増加させた。経時的観察は、１４日目まで総前駆細胞の継続的増加、その後２１日目まで下降を示した。増殖前の値と比較すると、前駆細胞の全体の増加は、７、１４および２１日目でそれぞれ４４倍、６１倍および３３倍であった。培養１４日目で総ＣＤ３４⁺細胞が約８０倍に増加したことがＦＡＣＳ分析により観察された。増殖した前駆細胞の種々のサブタイプを毎週メチルセルロースアッセイで分析すると、Ｍｉｘコロニーが、他の因子の組み合わせにおいてはかろうじて検出可能であるが、ＧＭコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤血球系バースト形成単位（ＢＦＵ−Ｅ）、ＣＦＵ−ＢｌａｓｔおよびＣＦＵ−Ｍｉｘを含む全タイプの前駆細胞が、ｓＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６およびＳＣＦの存在下、３週間の培養を通じて生成し続けたことが判明した。ＣＦＵ−Ｍｉｘの数は、７および１４日目までにそれぞれ約６０倍および８０倍増加した。また、無血清懸濁培養を用いて同様の結果が得られた。興味深いことには、ｓＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６およびＳＣＦの存在下、２１日目の無血清懸濁培養でさえも、４０倍の増加でかなりの数のＣＦＵ−Ｍｉｘが得られた。これらの結果は、造血系前駆細胞の増殖においてｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６がＳＣＦと相乗的に作用することを示した。その後の実験で、ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ− ６を、ＳＣＦの存在下、ＩＬ−３およびＧ−ＣＳＦを含む初期に作用するサイトカイン類と組み合わせて試験した。また、この研究では、ｓＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６およびＳＣＦの組み合わせと、増大実験に用いた前述の標準であるＩＬ−３、ＩＬ−６およびＳＣＦの組み合わせとを比較した。ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６／ＳＣＦを用いた総前駆細胞の増大は、ＩＬ−３、ＩＬ−６およびＳＣＦの組み合わせを用いて得られたものの１．５倍であった。血清含有および無血清培養の両方において異なるサイトカインの組み合わせを用いたＣＦＵＭｉｘの生成を図４に示す。初めの培養混合物は、７８６個の前駆細胞および１８８個のＣＦＵ−Ｍｉｘを含む２０００個のＣＤ３４⁺細胞を含有した。７日目（白い棒）、１４日目（斜線棒）および２１日目（黒塗りの棒）にＳＣＦの存在下で種々の因子の組み合わせ体を培養に補充した。データは、１回の実験から提供されている。同様のデータが、更に２回の実験で得られた。ｓＩＬ−６、ＩＬ−６およびＳＣＦの組み合わせは、血清含有培養において７および１４日目にそれぞれ約６０倍および８０倍、無血清培養において７および１４日目にそれぞれ約４９倍および６８倍、ＣＦＵ−Ｍｉｘを増大させた。ＩＬ −３、ＩＬ−６およびＳＣＦの組み合わせにより生成した前駆細胞は、主として顆粒球および／またはマクロファージ系統であり、ＣＦＵ−Ｍｉｘは、培養１４日目までに血清含有で約３０倍および無血清培養で１０倍増大したにすぎなかった。ｓＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６およびＳＣＦの組み合わせへのＩＬ−３の添加は、ＣＦＵ −Ｍｉｘの増殖を増加させなかった。興味深いことには、この組み合わせへのＧ −ＣＳＦの添加は、増殖に対しマイナスの影響がありそうであった。これらの結果は、ｓＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６およびＳＣＦの組み合わせが、特に原始前駆細胞の増殖にとってより効力ある組み合わせであることを示した。実施例３多能性細胞の増殖に対する抗ｇｐ１３０ｍＡｂおよび抗ＩＬ−６ＲｍＡｂの影響ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６複合体が仲介する造血系前駆細胞増殖におけるｇｐ１３０の関与を証明するために、前駆細胞の増殖に対するマウス抗ヒトｇｐ１３０ｍＡｂおよび抗ヒトＩＬ−６ＲｍＡｂの影響を評価した。抗体の調製抗−ヒトｇｐ１３０モノクローナル抗体（例えば、ＧＰＸ７、ＧＰＸ２２およびＧＰＺ３５）の調製は、公知である（２、１９）。これらの３種のｍＡｂは、ｇｐ１３０受容体上の異なるエピトープを認識し、ＩＬ−６が誘導するｇｐ１３０およびＩＬ−６受容体結合の阻害を介してＩＬ−６が仲介する生物学的反応を阻害することが知られている。抗ヒトＩＬ−６ＲｍＡｂ（ＰＭ１）も調製した（２０）。ＰＭ１は、ＩＬ−６ＲのＩＬ−６への結合の阻害を通じてＩＬ−６が仲介する生物学的反応を阻害することが知られている。抗ｇｐ１３０ｍＡｂの添加は、血清含有懸濁培養における総前駆細胞の増大を用量依存的に阻害することが分かった。図５は、種々の濃度の抗ヒトｇｐ１３０ｍＡｂ（Ａ）および抗ヒトＩＬ−６ＲｍＡｂ（Ｂ）を培養に加えたときの、ｓＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６およびＳＣＦの組み合わせを含有する培養中の総前駆細胞（○）およびＣＦＵ−Ｍｉｘ（●）、並びにＩＬ−３およびＳＣＦの組み合わせを含有する培養中の総前駆細胞（△）の各増大を示す。ｍＡｂを含まない培養を対照実験として評価した。データは、ｍＡｂで処理した各培養中で生成した前駆細胞と、対照を用いて得られた前駆細胞との比率を対照のパーセント（％）として表す。ＣＦＵ−Ｍｉｘの増殖は、１μｇ／ｍｌの抗ｇｐ１３０ｍＡｂ濃度で完全に遮断されたが、一方、ｍＡｂは、ＩＬ−３およびＳＣＦの組み合わせにより誘導される増殖にほとんど又は全く影響しないようであった。抗ＩＬ−６ＲｍＡｂの培養への添加は、効率がわずかに低いことを除いては類似の阻害を示し、１０μｇ／ｍｌの濃度でＣＦＵ−Ｍｉｘが完全に増殖しなくなることが観察された（図５Ｂ）。また、抗ＩＬ−６Ｒ抗体もＩＬ−３およびＳＣＦの組み合わせにより刺激される増殖に影響を与えなかった。これに対して、抗ＥＰＯ抗体は、ＳＣＦおよびＥＰＯにより誘導される増殖を阻害したが、ｓＩＬ− ６Ｒ、ＩＬ−６およびＳＣＦにより誘導される増殖には全く影響を与えなかった（データは示さず）。同じ結果が、無血清懸濁培養およびメチルセルロース培養の両方において得られた。赤血球系細胞産生ヒト造血系前駆細胞からの赤血球系細胞の生成に対するｇｐ１３０シグナル伝達の影響を更に調べるために、さらに実験を行った。正常なヒト造血系前駆／幹細胞を、臍帯血単核細胞から単離し、種々の濃度のｓＩＬ−６Ｒと共にＩＬ−６およびＳＣＦの存在下で培養した。総細胞数は、用量依存的に増加することが分かった。この増加は、８０ｎｇ／ｍｌの低い濃度でもｓＩＬ−６Ｒで検出可能であり、１２８０ｎｇ／ｍｌでプラトーになるようであった。図６は、ＩＬ−６およびＳＣＦの存在下、種々量のｓＩＬ−６Ｒを用いた１回の実験の結果を示す。総細胞数の分析は、１２８０ｎｇ／ｍｌを超えるｓＩＬ−６Ｒ濃度で、インキュベーションの７、１４および２１日目にそれぞれ３０倍以上、６５０倍以上および９００倍以上の培養中の総細胞の増大を示した。しかしながら、ＩＬ−６の非存在下では、ｓＩＬ−６Ｒは、総細胞数を増加させなかった。これらの結果は、ｓＩＬ−６Ｒが機能的であり、ＩＬ−６と組み合わせてのみＣＤ３４⁺細胞における増殖シグナルを伝達することができることを明白に示している。また、ＩＬ−６の用量−応答実験は、総細胞数の用量依存的な増加を示した。１２８０ｎｇ／ｍｌのｓＩＬ−６Ｒの存在下、５０〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ−６を用いて最大細胞数が得られた（図７）。ｓＩＬ−６Ｒの非存在下では、しかしながら、ＩＬ−６は、５０ｎｇ／ｍｌを超える量を用いた場合でさえ、総細胞数のわずかな増加しか得られなかった。これらの結果は、１２８０ｎｇ／ｍｌのｓＩＬ−６Ｒおよび５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６が、ＳＣＦを含む血清含有培養中での精製幹細胞からの総細胞の増大に有効な組み合わせでありうることを示している。ｓＩＬ− ６Ｒ、ＩＬ−６およびＳＣＦの組み合わせによる総細胞の増大は、ヒト骨髄から精製したＣＤ３４⁺細胞を用いた場合にも観察された（データは示さず）。血清含有培養中の組み合わせたｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の観察された効果は、ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６／ＳＣＦの組み合わせ単独によるよりむしろ牛胎児血清（ＦＢＳ）に混入する未知の因子と連関した上記因子の作用による可能性があった。この可能性を排除するために、ＣＤ３４⁺臍帯血細胞の無血清懸濁培養を検討した。驚くべきことに、血清含有培養と比較したところ、無血清培養でｓＩＬ −６Ｒ、ＩＬ−６およびＳＣＦ間により大きい相乗作用が観察された（図８）。ｓＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６およびＳＣＦの組み合わせを用いた細胞の無血清培養は、培養の７、１４および２１日目に総細胞数の増大をそれぞれ３８倍、５３０倍および２２００倍促進した。ＳＣＦ単独またはＩＬ−６と組み合わせて培養した細胞は、２１日目でさえわずかに２．２または７．５倍の増大しか示さなかった。これらの結果は、未知の因子の影響の可能性を明白に排除し、ＳＣＦの存在下でｓＩＬ−６Ｒが造血系幹細胞の増大を誘導することを示した。増大した細胞の細胞遠心分離調製物を、種々の細胞化学的および免疫学的染色で染色した。これらの細胞の示差的細胞数は、ＣＤ３４⁺臍帯血細胞培養の７日目に存在したもののような主として芽細胞の存在を示した（図９ａ）。興味あることには、ｓＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６およびＳＣＦの組み合わせを用いた場合、血清含有および無血清懸濁培養の両方で培養の１４日目に多数の赤芽球が観察された。赤血球系細胞の性質を、グリコホリンＡ（図９ｂ）およびヘモグロビン−ａ（図９ｃ）に対するモノクローナル抗体を用いベンジジン染色および免疫染色により確認した。いくつかの赤血球系細胞は、正赤芽球および除核した赤血球期に分化した（図９ｄ）。培養の２１日目に、ほとんどの赤血球系細胞が正赤芽球期に分化し、多数の除核赤血球が観察された。赤血球系細胞の絶対数は、総細胞数およびサイトスピンスライド上のグリコホリンＡ陽性細胞の発生により算定した。サイトカイン類およびｓＩＬ−６Ｒの種々の組み合わせを添加した無血清培養中の赤血球系細胞の絶対数を毎週分析した結果を図１０に示す。ｓＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６およびＳＣＦの組み合わせは、他の組み合わせと比較し総細胞数のみならず総赤血球系細胞の生成もより顕著に刺激した。培養の２週間目に、この組み合わせにより生成した細胞の約７９％は赤血球系細胞（即ち、Ｅ−芽球および赤血球）であった。培養の３週間目に、この組み合わせにより生成した細胞の約６９％は赤血球系細胞であった。また、ＩＬ−３またはＧＭ−ＣＳＦのいずれかと組み合わせてｓＩＬ−６ＲおよびＩＬ−６を含有する培養中に少数の赤血球系細胞が観察されたが、これは、ｉｎｖｉｔｒｏでの赤血球系細胞の生成にｇｐ１３０シグナル伝達が役割を果たすことを示唆している。エリトロポエチンを含む組み合わせを除いては、他のサイトカインの組み合わせ体を添加した培養中に赤血球系細胞は検出できなかった。エリトロポエチン単独との比較では、ｓＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６およびＳＣＦの組み合わせにより産生した赤血球系細胞の総数は、培養１４日目で約５倍、培養２１日目で約１１５倍であった（図１０）。エリトロポエチン、ｓＩＬ−６ＲおよびＩＬ−６の組み合わせとの比較では、ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６／ＳＣＦの組み合わせにより産生した赤血球系細胞の総数は、培養１４日目で約４．１倍、培養２１日目で約３８．３倍であった。赤血球系細胞の生成に対するｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６／ＳＣＦの組み合わせの効果は、ＣＤ３４⁺骨髄細胞の血清含有および無血清培養の両方で観察された（データは示さず）。ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６／ＳＣＦの組み合わせ体を添加した懸濁培養において、多数の赤血球系細胞の生成は、ＣＤ３４⁺細胞集団中での未成熟な赤血球系前駆細胞の増殖、分化および成熟によるものと考えられた。この可能性を確認するために、ＣＤ３４⁺細胞のメチルセルロースクローン培養を検討した。培養には、エリトロポエチン単独、組み合わせたエリトロポエチン／ＩＬ−６、またはエリトロポエチン／ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の組み合わせ体のいずれかが添加された。表１は、１４日間培養した５００個のＣＤ３４⁺臍帯血細胞から得た結果を示す。ｓＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６およびＳＣＦの組み合わせは、エリトロポエチンの非存在下で、赤血球系バーストを刺激するのみならず多数の大きい混合赤血球系コロニーも生成させた。全ての混合赤血球系コロニーは、赤血球を含む多数の成熟赤血球系細胞を含有した（図９ｆおよび図９ｇ）。ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６／ＳＣＦの組み合わせは、５００個のＣＤ３４⁺臍帯血細胞から２７．２±５．８個の赤血球系バーストおよび１２２．３±２１．８個の混合赤血球系コロニーを産生した。対照的に、ＳＣＦ単独またはＩＬ−６と組み合わせたＳＣＦを添加した培養中には、赤血球系バーストおよび混合赤血球系コロニーのいずれも観察されなかった。また、ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６／ＳＣＦを用い臍帯血および骨髄幹細胞のいずれからも、赤血球系バーストおよび混合赤血球系コロニーの生成が無血清培養で確認された（データは示さず）。成熟赤血球系前駆細胞（即ち、コロニー形成単位−赤血球系）を含む骨髄単核細胞をｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６／ＳＣＦの組み合わせを用いて培養した場合、多数の赤血球系コロニーを観察した。これらの結果は、ｓＩＬ −６Ｒ／ＩＬ−６／ＳＣＦの組み合わせが、ＣＤ３４⁺細胞集団中での未成熟赤血球系前駆細胞、および骨髄単核細胞中での成熟赤血球系前駆細胞、の増殖、分化および最終的成熟を助けることができることを強く示した。赤血球形成の調節のための代替経路の可能性を更に調べるために、細胞の発生に対する種々の抗体の作用を調査した。次の抗体の作用を調べた：ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６複合体と細胞表面のｇｐ１３０との間の相互作用を遮断する抗ｇｐ１３０ＭＡｂ（ＧＰＸ７、ＧＰＸ２２およびＧＰＺ３５）（１９、２９）；ＩＬ− ６およびＩＬ−６Ｒ間の相互作用を遮断する抗ＩＬ−６ＲＭＡｂ（２０）；およびＣＤ３４⁺細胞からの赤血球系細胞の発生を遮断する抗エリトロポエチン中和抗体。ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６／ＳＣＦの組み合わせ体を添加した懸濁培養への抗ｇｐ１３０ＭＡｂの添加は、赤血球系細胞の産生を完全に阻害した（図１１）。抗ｇｐ１３０抗体は、しかしながら、エリトロポエチンに依存する赤血球系細胞の産生に対しては何ら影響しなかった。ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６／ＳＣＦの組み合わせ体を添加した培養への１０μｇ／ｍｌの濃度の抗ＩＬ−６ＲＭＡｂの添加は、赤血球系細胞の産生をほぼ完全に阻害した（図１２）。抗ＩＬ−６ＲＭＡｂのより低い効率は、ＩＬ−６および細胞表面ＩＬ−６Ｒ間の相互作用の抗体中和を妨げることのできる過剰のｓＩＬ−６Ｒにより説明することができる。対照的に、抗エリトロポエチン抗体は、赤血球系細胞のエリトロポエチンに依存する産生をほぼ完全に阻害するが、ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６／ＳＣＦの組み合わせによる赤血球系細胞の生成には影響を与えなかった（図１３）。さらに、造血系幹細胞のメチルセルロースクローン培養も、抗エリトロポエチン抗体ではなく抗ｇｐ１３０ＭＡｂが、さもなければｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６／ＳＣＦの組み合わせにより誘導される赤血球系バーストおよび混合赤血球系コロニー形成の両方の発生を完全に遮断することを示した。これらの結果は、インターロイキン−６リガンドおよび可溶性受容体の観察された作用が、ＩＬ−６およびｓＩＬ−６Ｒの相互作用並びにその結果生じたＩＬ− ６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体と標的前駆細胞上の膜固定ｇｐ１３０との結合に起因することを明白に示している。また、これらの結果は、ＳＣＦと組み合わせたｇｐ１３０シグナル伝達による未成熟赤血球系前駆細胞からの赤血球系細胞の生成が、エリトロポエチンの存在と独立して起こることを示した。赤血球系細胞の増殖および最終的成熟は、エリトロポエチン受容体シグナル伝達により生理学的に調節されると考えられてきた。本発明は、ＳＣＦと組み合わせたｇｐ１３０シグナル伝達が、エリトロポエチンの非存在下で赤芽球および赤血球のもとになる末成熟赤血球系前駆細胞を刺激することを示している。これは、そして、エリトロポエチン受容体シグナル伝達が、正常なヒト赤血球系細胞の増殖、分化および最終的成熟に必須ではないことを示唆する。ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６／ＳＣＦの組み合わせによる赤血球系細胞の顕著な産生および、ｓＩＬ− ６Ｒの添加を受けていない幹細胞によるこのような産生の欠如は、ｓＩＬ−６Ｒが、膜貫通ＩＬ−６Ｒを欠いてはいるがｇｐ１３０を発現する細胞にＩＬ−６反応性を付与するという従来の報告を思い出させる。この理論は、全ＣＤ３４⁺細胞および増殖細胞がｇｐ１３０を発現したか、ｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６／ＳＣＦの組み合わせ体の添加を受けたＣＤ３４⁺細胞の約９０％がＩＬ−６Ｒ染色に陰性であったことを示す免疫細胞学的染色実験により支持された。ｓＩＬ−６Ｒの生理学的有意性が、ヒト血清におけるその検出により示されることが報告されてきた（２６）。血清中に存在するｓＩＬ−６Ｒは、ＩＬ−６に結合し終局的にｇｐ１３０を刺激するその能力の点で生物学的に活性である（３０）。ｉｎｖｉｔｒｏでＣＤ３４⁺細胞からの赤血球系細胞の生成に対するｓＩＬ−６ＲおよびＩＬ−６の組み合わせの半最大効果が、３２０ｎｇ／ｍｌのｓＩＬ−６Ｒおよび２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６の濃度で観察された。これは、生理的濃度範囲内に入いりそうだと考えられる。ＩＬ−６およびＳＣＦもヒト血清中で検出可能である。ＩＬ−６と同様に、可溶性および膜結合の両方の型のＳＣＦは、造血系幹細胞および末成熟前駆細胞を固定し骨髄中で増殖を助けることのできる骨髄間質細胞により産生される（２７、２８、３１、３２）。合わせて考えると、今回の結果は、ｇｐ１３０シグナル伝達と組み合わせたＳＣＦが、ｉｎｖｉｖｏでの正常な赤血球形成に重要な役割を果たすことを示している。実施例４ヒト造血系幹細胞に対するｓＩＬ−６ＲおよびＩＬ−６の増殖活性方法医療機関のガイドラインにより得たヒト臍帯血を、正常な満期分娩中に集めた。Silica(IBL，Fujioka，Japan)を用いた食細胞の枯渇後、Ficoll-Hypaqu e密度勾配遠心分離により単核細胞を分離した。洗浄後、単核細胞を、抗ＣＤ３４抗体を有する磁気粒子（Dynabeads M-450 CD34; Dynal，Oslo，Norway）と、ビーズ対細胞比１：１で混合した。細胞−ビーズ懸濁液を懸濁し４℃で３０分間インキュベートして細胞をビーズに結合させた。得られたビーズ／ロゼット形成細胞を Dynal Magnetic Particle Concentrator内に集めた。製造元の指示書に従って、DETACHaBead CD34(Dynal)により陽性選択された細胞からビーズを脱着し、選択したＣＤ３４⁺細胞を回収した。分離したＣＤ３４⁺細胞の純度は、ＦＡＣＳ分析(Ortho，USA)により８５〜９５％であった。ＳＣＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、エリトロポエチンおよびＧ− ＣＳＦを補充したメチルセルロース培養におけるコロニー形成は、４５〜５５％であった。精製ＣＤ３４⁺細胞を、以下の改変を加えた従来法（２１、２２）を用いて懸濁培養液中で培養した。培養培地は、２０００個のＣＤ３４⁺細胞、α −培地、２０％牛胎児血清（FBS; HyClone，UT）、１％結晶化脱イオン化牛血清アルブミン（BSA，Sigma）を含有した。５％ＣＯ₂および５％Ｏ₂を用い３７℃で２４−ウェルの組織プレート（Nunc，Kamstrup，Denmark）中で１ｍｌの培養混合物並びに組換えヒトｓＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６、およびＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）の種々の組み合わせ体をインキュベートした。組換えｓＩＬ−６Ｒ、ＩＬ− ６、およびＳＣＦは、従来の通りに作製して用いた。無血清懸濁培養は、２％の純粋なＢＳＡ（Sigma）、１０μｇ／ｍｌのインスリン、２００ｍｇ／ｍｌのトランスフェリン、１０^-5Ｍのメルカプトエタノール（Eastman）、およびＦＢＳの代わりの４０μｇ／ｍｌの低濃度リポ蛋白(NakaraiTesque Inc.，Tokyo)から構成された（１０）。１週間おきに、培地の半分を、同じサイトカインセットを含有する新鮮な培地と交換した。細胞の画分を、次いで、回収し、洗浄し、血球計数器で計数し、細胞遠心分離し、染色した。結果本実験の結果を、上記したように図１０〜図１２に示す。図１０は、インキュベーション１４日目のＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下（○）または非存在下（●）でＳＣＦと共に種々の濃度のｓＩＬ−６Ｒを用いた血清含有懸濁培養中の幹細胞の成長を示す。図１１は、インキュベーション１４日目のｓＩＬ −６Ｒ（１２８０ｎｇ／ｍｌ）の存在下（○）または非存在下（●）でＳＣＦと共に種々の濃度のＩＬ−６を用いた血清含有懸濁培養中の幹細胞の成長を示す。図１２は、７日目（白い棒）、１４日目（斜線棒）および２１日目（黒塗りの棒）におけるＳＣＦ単独、ＳＣＦおよびＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍｌ）の組み合わせ体、またはＳＣＦ／ＩＬ−６およびｓＩＬ−６Ｒ（１２８０ｎｇ／ｍｌ）の組み合わせ体のいずれかを含有する血清含有および無血清培養中での幹細胞の成長を示す。結果は、３回の別々の実験から得たものである。標準偏差を誤差棒で表す。実施例５組み合わせたサイトカイン類を有する培養中での造血系幹細胞からの赤血球系細胞の発生方法懸濁培養の細胞遠心分離調製物を、従来法により７日目および１４日目にＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａで染色した。また１４日目に、調製物を、従来方法（２３）により抗グリコホリンＡに対するＭＡｂ(Immunotech Co，Marseilles,France)および抗ヘモグロビンα鎖(COSMO Bio C o.，Tokyo，Japan）を用いアルカリホスファターゼ抗アルカリホスファターゼ（ＡＰＡＡＰ）法で免疫染色した。陽性の細胞を赤みがかった粒子で染色した。既に報告された（２３、２４）通りにメチルセルロース培養を行った。培養混合物は、５００個のＣＤ３４⁺臍帯血細胞、α−培地、０．９％、３０％ＦＢＳ、１％ＢＳＡ、５ｘ１０^-5Ｍのメルカプトエタノール、１２８０ｎｇ／ｍｌのｓＩＬ −６Ｒ、８０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６および１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦを含有した。１ｍｌの培養混合物を、各３５ｍｍＬｕｘ標準非組織培養皿にプレーティングした。細胞を、５％ＣＯ₂含有空気の湿潤雰囲気下で３７℃でインキュべートした。結果本実験の結果を図９に示す。７日目（図９ａ）および１４日目（図８ｄ）にＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａで染色した懸濁培養の細胞遠心分離調製物を示す。１４日目に抗グリコホリン−ＡＭＡｂまたは抗ヘモグロビン −α ＭＡｂで免疫染色した培養の細胞遠心分離調製物を、それぞれ図９ｂおよび９ｃに示す。１４日目におけるｓＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６およびＳＣＦ含有メチルセルロース培養物中の赤血球系前駆細胞から生成した代表的赤血球系バーストおよび混合赤血球系コロニーを、それぞれ図９ｅおよび９ｆに示す。実施例６赤血球系細胞の産生に対する抗体の影響方法以下の実験は、赤血球系細胞の生成に対する抗ヒトｇｐ１３０ＭＡｂ、ヒトＩＬ−６ＲＭＡｂおよび抗ヒトエリトロポエチン抗体の影響を調べた。抗ヒトｇｐ１３０ＭＡｂ（ＧＰＸ７、ＧＰＸ２２およびＧＰＺ３５）の調製法は、既に記載されている（２）。要するに、マウスを組換えヒト可溶性ｇｐ１３０で免疫し、抗ヒトｇｐ１３０ＭＡｂＧＰＸ７、ＧＰＸ２２およびＧＰＺ３５を産生するハイブリドーマを作製した。３種の抗体は、ｇｐ１３０上の異なるエピトープを認識し、ｇｐ１３０とＩＬ−６受容体とのＩＬ−６が誘導する結合の阻害を介してＩＬ−６が仲介する生物学的反応を阻害する（２、１９）。抗ヒトＩＬ−６Ｒ（ＰＭ１）ＭＡｂを調製した（２０）。ＰＭ１は、ＩＬ−６のＩＬ −６受容体への結合の阻害を介してＩＬ−６が仲介する生物学的反応を阻害する。ウサギ抗ヒトエリトロポエチン抗体（ＩｇＧＫ−５）は、ＫｉｒｉｎＣｏ．，Ｊａｐａｎにより提供された。抗エリトロポエチン抗体（２４ｍｇ／ｍｌ）は、２Ｕ／ｍｌのエリトロポエチンを中和する（３４）。図１１に示されるように、ヒト臍帯血幹細胞（２０００個のＣＤ３４⁺細胞）には、予め決定した最適濃度のｓＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６／ＳＣＦ（○）、またはエリトロポエチン（２Ｕ／ｍｌ）およびＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）の組み合わせ体（●）のいずれかを添加した。実施例４で述べた通りに調製した血清含有懸濁培養中にマウス抗ヒトｇｐ１３０ＭＡｂ（図１１）、マウス抗ヒトＩＬ− ６ＲＭＡｂ（ＰＭ１）（図１２）またはウサギ抗ヒトエリトロポエチン抗体（図１３）を添加した又は添加しない培養を観察した。培養の初めに濃度を変えた抗体を加えた。抗体を全く加えないウェルを対照として用いた。１４日間培養後、細胞を回収し、計数し、細胞遠心分離した。総赤血球系細胞（赤芽球、正赤芽球および赤血球を含む）は、総細胞数およびサイトスピンスライド上で測定した赤血球系細胞の割合に基づいて算定した。その結果得たデータを、各対照のウェル内の赤血球系細胞に対する、抗体で処理した各ウェル内の赤血球系細胞の比率で表し、対照のパーセント（％）として表した。以下に、本明細書で引用した参考文献を記す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．多能性造血細胞をｅｘｖｉｖｏ増殖するための方法であって、可溶性インターロイキン−６受容体、インターロイキン−６および幹細胞因子を含むサイトカイン類の組み合わせ体を用いて前記細胞を培養することを包含する方法。２．増殖させる細胞を、臍帯血、末梢血または骨髄から得る、請求項１に記載の方法。３．多能性造血細胞が、ＣＤ３４選択により得た前駆細胞および／または幹細胞である、請求項３に記載の方法。４．多能性造血細胞が、増殖細胞の除去により機能的に選択された幹細胞である、請求項３に記載の方法。５．前記可溶性インターロイキン−６受容体を、少なくとも８０ｎｇ／ｍｌ〜１２８０ｎｇ／ｍｌの濃度で用いる、請求項１に記載の方法。６．前記インターロイキン−６を、少なくとも５０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度で用いる、請求項５に記載の方法。７．請求項１に記載の多能性造血細胞の増殖に用いるための、可溶性インターロイキン−６受容体、インターロイキン−６および幹細胞因子を含む物品。８．可溶性インターロイキン−６受容体、インターロイキン−６および幹細胞因子を含むサイトカイン類の組み合わせ体を用いて多能性造血細胞を培養することにより産生した、顆粒球−マクロフアージコロニー、巨核球コロニー、赤血球系バースト、芽細胞コロニー、混合造血系コロニーおよび顆粒球−赤血球−マクロフアージ−巨核球コロニーを含有する細胞集団。９．分化した血球コロニーを生成するための方法であって、第一のサイトカイン、前記第一のサイトカインの可溶性受容体および第二のサイトカインを含むサイトカイン類の組み合わせ体を多能性造血細胞と組み合わせるｅｘｖｉｖｏ法から成り、前記第一および第二のサイトカインが異なるシグナル伝達経路により細胞応答を刺激する、前記方法。