CN103284814A - 一种取向通道胶原支架制备方法及专用装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种取向通道胶原支架的制备方法及专用装置：采用取向通道胶原支架装置制作取向通道胶原支架，所述取向通道胶原支架装置由液氮保温盒、金属制冷条和模具组成；所述液氮保温盒由盒体和与盒体密封配合的盒盖构成，所述盒体一侧开有小孔；所述金属制冷条为梳形，由梳齿和梳柄构成，梳齿与液氮保温盒底部接触，所述梳柄可活动地与小孔密闭配合并伸出小孔；所述模具一端开有上方开口的凹槽，所述凹槽由制模端和制冷端构成，所述金属制冷条的梳柄与凹槽的制冷端可伸缩地紧密配合，所述小孔、凹槽的个数均与金属制冷条个数相匹配；本发明利用水平取向制作取向通道胶原支架，操作性更强，制作简单，取向通道胶原支架通道明显，取向良好。

Description

一种取向通道胶原支架制备方法及专用装置

（一）技术领域

本发明涉及一种水平取向通道胶原支架制作方法及专用装置。

（二）背景技术

交通事故、体育运动或者高强度工作造成的肌腱、软骨和神经损伤会给受伤者和家属造成沉重的心理和经济负担，影响和谐社会的发展。同时随着中国老龄化现象的加剧，因年龄增长所引起的骨关节炎也正给广大老年群体的晚年生活构成较大的影响。这些组织缺损疾病或者骨关节炎都需要利用组织工程来进行修复。

在生物医学工程领域内，利用取向通道胶原支架进行神经、肌腱和软骨等组织再生修复已逐渐发展成为一种成熟的再生医疗手段。取向胶原支架克服了原先无取向支架的各项均一性，使得生物支架在径向上的力学性能得以提升，加强了生物支架在实际使用中的可操作性。同时使得支架更加适应于生物体内的各向异性环境，更加有利于细胞在生物支架内的迁移和特异性分化，使再生的组织具有更好匹配原先组织生物功能的性能。

但传统取向通道胶原支架采用垂直晶体生长方式制作，装置成本高，模具制作复杂，实际操作要求严格。上述缺点限制了取向通道胶原支架在更广范围内的研究和应用。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种水平取向通道胶原支架制作方法及专用装置，本发明方法使胶原结晶在水平面上进行，不仅能够有效快速地制作取向通道胶原支架，而且操作过程简单，可行性强，专用装置具有制作多种形状的取向通道胶原支架的特点。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种取向通道胶原支架的制备方法，所述方法为：采用取向通道胶原支架装置制作取向通道胶原支架，所述取向通道胶原支架装置由液氮保温盒、金属制冷条和模具组成；所述液氮保温盒由盒体和与盒体密封配合的盒盖构成，所述盒体一侧开有小孔；所述金属制冷条为梳形，由梳齿和梳柄构成，梳齿与液氮保温盒底部接触，所述梳柄可活动地与小孔密闭配合并伸出小孔；所述模具一端开有上方开口的凹槽，所述凹槽由制模端和制冷端构成，所述金属制冷条的梳柄与凹槽的制冷端可伸缩地紧密配合，所述小孔、凹槽的个数均与金属制冷条个数相匹配；

所述取向通道胶原支架的制备方法为：将胶原水溶液分别加入取向通道胶原支架装置凹槽的制模端内，再向液氮保温盒内加入液氮（室温下迅速加入即可），液氮在保温盒内的高度低于小孔距离保温盒内底表面的高度，盖上液氮保温盒的盖子，金属制冷条将液氮释放的热量传递至胶原水溶液中，使胶原水溶液从金属制冷条一端向远离金属制冷条的另一端逐渐结晶，监测液氮保温盒内液氮深度，当液氮不能覆盖液氮保温盒整个底部时，再向液氮保温盒内加入液氮，当整个凹槽制模端内的胶原水溶液全部结晶完毕时，将取向通道胶原支架装置在-80℃放置至取向通道胶原支架温度降至-80℃，然后再真空干燥48～120小时，获得胶原支架。

进一步，所述模具由上层板和下层板构成，所述上层板与下层板胶粘连接，所述上层板一端开有与金属制冷条上的梳柄相配合的上方开口的凹槽，所述凹槽由制模端和制冷端构成，所述制冷端与梳柄可伸缩紧密配合。

进一步，所述胶原水溶液是从猪腿肌腱中制备的10mg/mL胶原水溶液。

进一步，所述胶原水溶液的加入量为凹槽体积的1～100%。

进一步，所述凹槽的制模端为长方形、Y形或弧形。

进一步，所述胶原水溶液的制备按如下步骤进行：剥取新鲜猪腿的肌腱，去除筋膜和脂肪制成预处理后的肌腱，然后剪成薄片，浸泡于三羟甲基氨基甲烷与乙二胺四乙酸和氯化钠的混合溶液a中，4℃过夜，取浸泡后的肌腱薄片用蒸馏水冲洗后溶于0.5mol/L乙酸水溶液中，调节pH值为1后加入胃蛋白酶，4℃放置3天，离心，弃去上层脂肪层，取下层胶原混合物a用0.5mol/L乙酸水溶液稀释3倍体积，纱布过滤，取滤液用等体积的0.9mol/L氯化钠水溶液配制成混合溶液b，4℃过夜，离心，取下层胶原混合物b加入1/4体积的0.5mol/L乙酸水溶液在4℃溶解过夜后用双蒸水透析，取截留液在-80℃冷冻干燥后用双蒸水配制成10mg/mL的胶原水溶液，4℃保存；所述混合溶液a中三羟甲基氨基甲烷终浓度为0.05mol/L，乙二胺四乙酸终浓度为0.02mol/L，氯化钠终浓度为0.5mol/L；所述胃蛋白酶的用量为100mg酶/1g预处理后的肌腱，胃蛋白酶的酶活是3000-3500NFU/mg。

本发明还提供一种用于制备所述取向通道胶原支架的专用装置，所述制备取向通道胶原支架的专用装置由液氮保温盒、金属制冷条和模具组成；所述液氮保温盒由盒体和与盒体密封配合的盒盖构成，所述盒体一侧开有小孔；所述金属制冷条为梳形，由梳齿和梳柄构成，梳齿与液氮保温盒底部接触，所述梳柄可活动地与小孔密闭配合并伸出小孔；所述模具一端开有上方开口的凹槽，所述凹槽由制模端和制冷端构成，所述金属制冷条的梳柄与凹槽的制冷端可伸缩地紧密配合，所述小孔、凹槽的个数均与金属制冷条个数相匹配。

进一步，所述制备取向通道胶原支架的专用装置中液氮保温盒上的小孔为1～10个，最优选5个。

进一步，所述制备取向通道胶原支架的专用装置中所述凹槽的制模端为长方形、Y形或弧形，所述凹槽的制冷端为正方形。优选所述凹槽制模端为长方形，制冷端为正方形时，制模端长为50mm，宽为20mm，制冷端宽为20mm；所述凹槽的制模端为Y形（即凹槽水平投影为倒“Y”形），制冷端为正方形时时，制模端包括上端两个分叉部分和下端长方形部分，制模端水平长度（即从凹槽长方形底端到分叉形顶端的距离）为50mm，下端长方形部分长度为20mm，宽度为10mm，两个分叉部分宽度均为10mm，分叉部分内侧间隔30mm，制冷端宽度为20mm；所述凹槽的制模端为弧形，制冷端为正方形时，弧面宽度为10mm，弧度为60度，制冷端宽度为20mm。

进一步，所述制备取向通道胶原支架的专用装置中所述金属制冷条伸出液氮保温盒的长度为1～100mm，最优选20mm。

进一步，所述制备取向通道胶原支架的专用装置中所述凹槽的水平投影长度为1～200mm，最优选50mm。

进一步，所述制备取向通道胶原支架的专用装置中模具和液氮保温盒为聚苯乙烯或者聚四氟乙烯制成，所述金属制冷条由铝合金、不锈钢或铜制成。

进一步，所述制备取向通道胶原支架的专用装置中模具模具由上层板和下层板构成，所述上层板与下层板胶粘连接，所述上层板一端开有与金属制冷条上的梳柄相配合的上方开口的凹槽。所述制备取向通道胶原支架的专用装置中模具的下层板先用聚偏二氯乙烯透明胶带贴膜，然后再用双面胶与上层板胶粘。

进一步，优选金制冷条由长度为2～30厘米的长方体金属制成梳形，横截面的宽和高分别为：0.1～15厘米、0.05～5.0厘米，每条金属制冷条连有1-5个梳齿（梳齿优选为长方体），梳齿与液氮保温盒内部底面紧密接触。在液氮保温盒上的小孔到液氮保温盒内部底面的距离与梳齿的高度相同。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明利用水平取向制作取向通道胶原支架，操作性更强，制作简单，整个装置设计合理，体积小巧；本发明所制备的取向通道胶原支架通道明显，取向良好。

（四）附图说明

图1为取向通道胶原支架的专用装置的侧视图；

图2为取向通道胶原支架的专用装置的俯视图；

图3为取向通道胶原支架的专用装置凹槽示意图，A为长方形制模端、B为Y型制模端、C为弧形制模端，D为制冷端；

图4为制作取向通道胶原支架时，胶原水溶液开始在模型凹槽内水平方向结晶的示意图；

图5为制作取向通道胶原支架时，胶原水溶液在模型凹槽内完全结晶时的示意图；

图6为长方形取向通道胶原支架垂直面电镜扫描图；

图7为长方形取向通道胶原支架水平面电镜扫描图；

图8为Y形取向通道胶原支架垂直面电镜扫描图；

图9为Y形取向通道胶原支架水平面电镜扫描图；

图10为弧形取向通道胶原支架靠近金属制冷条端垂直面电镜扫描图；

图11为弧形取向胶原通道支架靠近金属制冷条端水平面电镜扫描图；

图12为弧形取向通道胶原支架中间段垂直面电镜扫描图；

图13为弧形取向通道胶原支架中间段水平面电镜扫描图；

图14为弧形取向通道胶原支架远离金属制冷条端垂直面电镜扫描图；

图15为弧形取向通道胶原支架远离金属制冷条端水平面电镜扫描图。

图16为骨髓来源的间充质干细胞在支架上的生长情况。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1胶原水溶液

剥取新鲜猪腿肌腱，去除筋膜和脂肪，称重为30g。剪成薄片，浸泡于100ml终浓度0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷、终浓度0.02mol/L乙二胺四乙酸和终浓度0.5mol/L氯化钠的混合溶液中，4℃过夜，制成浸泡后的肌腱薄片。将浸泡后的肌腱薄片用蒸馏水冲洗5遍后溶于100ml、0.5mol/L乙酸水溶液中，调节pH值为1后加入3g胃蛋白酶（酶活是3000-3500NFU/mg，厂家是生工生物工程（上海）股份有限公司），4℃放置3天，然后于4℃、4000转/每分钟水平离心25分钟，用枪吸弃上层脂肪层，收回下层胶原混合物于锥形瓶中，用0.5mol/L乙酸水溶液稀释3倍体积，在超净台中用4层纱布过滤，取250ml滤液用0.9mol/L氯化钠水溶液定容至500ml，4℃过夜，期间经常振荡；然后再于4℃、4000转/每分钟水平离心25分钟，弃上清液及悬浮物，取下层胶原混合物（即汲取I型胶原）汇集离心管中，加上1/4体积的0.5mol/L乙酸水溶液制成胶原混合溶液，4℃溶解过夜。检查透析袋（纤维素透析袋，截留分子量是3000道尔顿）闭端的扎线松紧度。用注射器将乙酸水溶液在4℃溶解过夜后的胶原混合溶液注入透析袋中，留有1/3-1/4的空间。用无菌线绑住透析袋的另一端。将其放入2L大烧杯中，灌以双蒸水透析。每天换水4-6次，透析3天。全过程在冰上操作，避免胶原变性。取直径为10cm的培养皿，编号称重。将透析袋放入50ml离心管，解开上端扎线，用10ml移液管将截留液移入直径为10cm的培养皿。-80℃过夜。于冻干机中抽干3天。称量胶原净质量。用双蒸水配制成10mg/mL胶原水溶液，振荡摇匀，至4℃冰箱保存。

实施例2制备取向通道胶原支架的专用装置

参见图1和图2。

所述制备取向通道胶原支架的专用装置由液氮保温盒1、金属制冷条2和模具3组成；所述液氮保温盒1由盒体和与盒体密封配合的盒盖构成，所述盒体一侧开有小孔；所述金属制冷条为梳形，由梳齿6和梳柄7构成，梳齿与液氮保温盒底部接触，所述梳柄可活动地与小孔密闭配合并伸出小孔；所述模具由上层板和下层板构成，所述上层板与下层板胶粘连接，所述上层板一端开有上方开口的凹槽4，所述凹槽由制模端和制冷端构成，所述梳柄与凹槽的制冷端可伸缩地紧密配合，所述小孔、凹槽的个数均与金属制冷条个数相匹配。在模具下面放置一块垫板使模具的凹槽与金属制冷条配合插入。液氮保温盒底部装有液氮5。

所述金属制冷条由铝合金制成，伸出液氮保温盒的金属制冷条长度为20cm，横截面宽为2cm，横截面高为1cm的梳形，梳齿为2个。

所述液氮保温盒和模具均由聚苯乙烯或者聚四氟乙烯制作。

实施例3制作长方形取向通道胶原支架

参见图3中长方形凹槽（A）的示意图。

根据实施例2所制备的制备取向通道胶原支架的专用装置，所述液氮保温盒和模具均由聚苯乙烯制作，凹槽的制模端为长方形，长度为70mm，宽为20mm，凹槽的制冷端为正方形，宽度为20mm，伸出液氮保温盒的金属制冷条长度为20mm，金属制冷条横截面宽为20mm，横截面高为10mm，梳齿为2个。在下层板的上表面贴一次聚偏二氯乙烯透明胶带，然后利用双面胶带将上层板和下层板胶粘起来。

向模具的凹槽内加入14mL实施例1方法制备的10mg/mL的胶原水溶液。向液氮保温盒里加入100mL液氮，盖上液氮保温盒的盖子，让胶原水溶液里的冰晶从制冷金属条一端开始向远离金属条一端逐渐生长。同时观察液氮保温盒里的液氮体积，当液氮不能覆盖液氮保温盒整个底部时，再向液氮保温盒内加入100mL液氮，使制冷金属条能够持续的从液氮内释放热量。

当整个模具凹槽制模端内的胶原水溶液全都取向结晶完毕时，将取向通道胶原支架装置放入-80℃冰箱8小时至取向通道胶原支架温度降至-80℃。然后用真空冻干机将取向通道胶原支架装置真空干燥72小时，取下模具内的支架，即获得长方形取向通道胶原支架，长为70mm、宽为20mm、厚度为10mm。模具的凹槽内胶原水溶液冰晶生长方向参见图4，冰晶生长完成示意图见图5所示，长方形取向通道胶原支架崔直面电镜扫描图见图6所示，水平面电镜扫描图见图7所示。结果表明：长方形取向通道胶原支架的取向良好，各孔分布均匀，孔径大小合适。

实施例4制作Y形取向通道胶原支架

参见图3中凹槽（B）示意图制作Y形取向通道胶原支架。

凹槽的制模端为Y形，包括上端两个分叉部分和下端长方形部分，制模端水平长度（即从凹槽长方形底端到分叉形顶端的距离）为50mm，下端长方形部分长度为20mm，宽度为10mm，两个分叉部分宽度均为10mm，分叉部分内侧间隔30mm，制冷端为正方形，宽为20mm。

向模具的凹槽的制模端内加入实施例1方法制备的10mg/ml胶原水溶液7.25ml，其他操作同实施例3，获得Y形取向通道胶原支架，厚度为10mm，胶原支架垂直面和水平面电镜扫描图分别见图8和图9所示。结果表明：Y型取向通道胶原支架的通道取向良好，各孔分布均匀，孔径大小合适。在两条分叉支架的交界处连接完整，过度自然。

实施例5制作弧形取向通道胶原支架

参见图3中凹槽（C）示意图制作弧形取向通道胶原支架。

凹槽的制模端为弧形，制冷端为正方形，制冷端的宽为20mm，制模端的弧形面宽度为10mm，弧度为60度。

向模具的凹槽制模端内加入实施例1方法制备的10mg/ml胶原水溶液14ml，其他操作同实施例3，获得弧形取向通道胶原支架，厚度为10mm。弧形取向通道胶原支架靠近金属制冷条段垂直面和水平面电镜扫描图分别见图10和图11所示，中间段垂直面和水平面电镜扫描图分别见图12和图13所示，靠近模具端（即远离金属制冷条一段）垂直面和水平面电镜扫描图分别见图14和图15所示。结果表明弧形取向通道胶原支架的通道取向良好，各孔分布均匀，孔径大小合适。取向通道的方向在弧形支架的各段都按照弯曲的角度得到了体现。

实施例6胶原支架细胞生物相容性测试

参见图16骨髓来源的间充质干细胞在支架上的生长情况。

将实施例3中的长方形取向通道胶原支架切割成边长为5mm的立方块，在真空干燥箱里进行热交联，热交联的时间和温度依次为25度12小时，110度72小时，65度48小时。将交联后的胶原支架浸没在3mL含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液（所述DMEM高糖培养液购自浙江星月生物科技股份有限公司）中24小时。将浸没后的支架放置于96孔板中，并在孔内接种骨髓来源的间充质干细胞（骨髓间充质干细胞采用直接培养法（全骨髓培养法）从大鼠中获得：取大鼠的股骨和胫骨，直接用培养基冲出骨髓，冲洗后不离心直接接种在培养瓶里，24-48h后去悬浮，再接下来的每3-4天换液一次，直到需要传代。所用骨髓间充质干细胞为第4代细胞。），接种数量为1000细胞每孔。96孔板在细胞培养箱内培养3天，培养环境为37摄氏度，二氧化碳浓度为5%。3天后，细胞生长情况，采用CCK-8在450nm紫外光下评估细胞在胶原支架上的粘附情况。结果见图16所示，表明从荧光照片中可以看出，骨髓间充质细胞的细胞骨架铺展很开，在材料上的粘附良好。证明了该材料细胞毒性低，有很好的细胞亲和能力，同时在细胞粘附性上有很大的优势，适合于组织再生领域的使用。

Claims (10)

1.一种取向通道胶原支架的制备方法，其特征在于所述方法为：采用取向通道胶原支架装置制作取向通道胶原支架，所述取向通道胶原支架装置由液氮保温盒、金属制冷条和模具组成；所述液氮保温盒由盒体和与盒体密封配合的盒盖构成，所述盒体一侧开有小孔；所述金属制冷条为梳形，由梳齿和梳柄构成，梳齿与液氮保温盒底部接触，所述梳柄可活动地与小孔密闭配合并伸出小孔；所述模具一端开有上方开口的凹槽，所述凹槽由制模端和制冷端构成，所述金属制冷条的梳柄与凹槽的制冷端可伸缩地紧密配合，所述小孔、凹槽的个数均与金属制冷条个数相匹配；

所述取向通道胶原支架的制备方法为：将胶原水溶液分别加入取向通道胶原支架装置凹槽的制模端内，再向液氮保温盒内加入液氮，液氮在保温盒内的高度低于小孔距离保温盒内底表面的高度，盖上液氮保温盒的盖子，金属制冷条将液氮释放的热量传递至胶原水溶液中，使胶原水溶液从金属制冷条一端向远离金属制冷条的另一端逐渐结晶，监测液氮保温盒内液氮深度，当液氮不能覆盖液氮保温盒整个底部时，再向液氮保温盒内加入液氮，当整个凹槽制模端内的胶原水溶液全部结晶完毕时，将取向通道胶原支架装置在-80℃放置至取向通道胶原支架温度降至-80℃，然后再真空干燥48～120小时，获得胶原支架。

2.如权利要求1所述取向通道胶原支架的制备方法，其特征在于所述模具由上层板和下层板构成，所述上层板与下层板胶粘连接，所述上层板一端开有与金属制冷条上的梳柄相配合的上方开口的凹槽。

3.如权利要求1所述取向通道胶原支架的制备方法，其特征在于所述胶原水溶液的加入量为凹槽体积的1～100%。

4.如权利要求1所述取向通道胶原支架的制备方法，其特征在于所述凹槽的制模端为长方形、Y形或弧形。

5.如权利要求1所述取向通道胶原支架的制备方法，其特征在于所述胶原水溶液的制备按如下步骤进行：剥取新鲜猪腿的肌腱，去除筋膜和脂肪后制成预处理后的肌腱，然后剪成薄片，浸泡于三羟甲基氨基甲烷与乙二胺四乙酸和氯化钠的混合溶液a中，4℃过夜，取浸泡后的肌腱薄片用蒸馏水冲洗后溶于0.5mol/L乙酸水溶液中，调节pH值为1后加入胃蛋白酶，4℃放置3天，离心，弃去上层脂肪层，取下层胶原混合物a用0.5mol/L乙酸水溶液稀释3倍体积，纱布过滤，取滤液用等体积的0.9mol/L氯化钠水溶液配制成混合溶液b，4℃过夜，离心，取下层胶原混合物b加入1/4体积的0.5mol/L乙酸水溶液在4℃溶解过夜后用双蒸水透析，取截留液在-80℃冷冻干燥后用双蒸水配制成10mg/mL的胶原水溶液，4℃保存；所述混合溶液a中三羟甲基氨基甲烷终浓度为0.05mol/L，乙二胺四乙酸终浓度为0.02mol/L，氯化钠终浓度为0.5mol/L；所述胃蛋白酶的用量为100mg酶/1g预处理后的肌腱。

6.一种用于制备权利要求1所述取向通道胶原支架的专用装置，其特征在于所述制备取向通道胶原支架的专用装置由液氮保温盒、金属制冷条和模具组成；所述液氮保温盒由盒体和与盒体密封配合的盒盖构成，所述盒体一侧开有小孔；所述金属制冷条为梳形，由梳齿和梳柄构成，梳齿与液氮保温盒底部接触，所述梳柄可活动地与小孔密闭配合并伸出小孔；所述模一端开有上方开口的凹槽，所述凹槽由制模端和制冷端构成，所述金属制冷条的梳柄与凹槽的制冷端可伸缩地紧密配合，所述小孔、凹槽的个数均与金属制冷条个数相匹配。

7.如权利要求6所述制备取向通道胶原支架的专用装置，其特征在于所述液氮保温盒上的小孔为1～10个。

8.如权利要求6所述制备取向通道胶原支架的专用装置，其特征在于所述凹槽的制模端为长方形、Y形或弧形。

9.如权利要求6所述制备取向通道胶原支架的专用装置，其特征在于所述金属制冷条伸出液氮保温盒的长度为1～100mm。

10.如权利要求6所述制备取向通道胶原支架的专用装置，其特征在于所述所述模具由上层板和下层板构成，所述上层板与下层板胶粘连接，所述上层板一端开有与金属制冷条上的梳柄相配合的上方开口的凹槽。

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