CN105536043B - 一种新型类人胶原蛋白止血敷料 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有良好生物相容性的可吸收的富集钙、锌、铜、铁的新型的类人胶原蛋白止血敷料及其制备方法。该制备方法是利用高密度发酵制备的人源型类人胶原蛋白分别螯合钙、锌、铜、铁四种离子的改性蛋白为原料，利用哺乳动物体内存在的赖氨酰氧化酶为交联剂，通过低温交联反应和冷冻干燥工艺过程，获得了可用于创伤和术后止血的新型胶原蛋白止血敷料。本发明制备方法原料易得，成本低，合成工艺简单易实现，工艺放大容易且重现性好；本发明制备的类人胶原蛋白止血敷料无动物源病毒隐患，止血效果显著，可用作各类创面止血和术后止血，以及生物医学组织工程等相关领域的基础研究与应用。

Description

一种新型类人胶原蛋白止血敷料

技术领域

本发明涉及一种新型富集钙、锌、铜、铁元素的类人胶原蛋白止血敷料及其制备方法。

背景技术

胶原蛋白是动物体内的一种纤维蛋白，富含于皮肤、筋腱、骨骼中，具有良好的生物相容性，常被用作重要的生物医用材料原料，可作为吸收性创面止血材料，常利用胶原蛋白被交联后的多孔结构吸收血液膨胀，形成凝血的网架，封闭血管裂口或者创面，并激活血小板，达到止血的目的。目前，对于可吸收性胶原蛋白类创面止血材料，因胶原蛋白来源于动物皮、筋腱等，对人体而言属于一种异源物，可引起过敏等不良反应，表现为发热、嗜酸粒细胞增多、引起伤口的感染；止血速度较慢，对血小板等止血成分的牵拉能力和创面修复能力均不好。此外，异源型动物胶原蛋白还存在一些潜在的动物携带病原的风险。

钙离子是人体内最重要的宏量元素之一，广泛分布于体内各组织器官之中，维系着所有细胞的正常生理功能。钙离子不仅参与了肌肉收缩、骨骼形成、神经传导，还有一个非常重要的作用就钙离子参与了血液凝固和能够促进创伤面的修复。凝血过程主要分为三个阶段：凝血酶原激活物的形成、凝血酶原的激活和纤维蛋白的形成。作为凝血因子IV的钙离子，参与了上述凝血过程的三个阶段。研究表明，钙离子能从血液中“捕获”并活化一种关键凝血蛋白质—凝血酶，必须在一定浓度的钙离子和纤维原蛋白存在时凝血过程才能很好地实现。

发明内容

本发明的目的在于提供一种富集钙、锌、铜、铁元素，并且无潜在病毒隐患和良好的生物相容性以及优异的创面止血修复效果的类人胶原蛋白止血敷料。

本发明另一目的是提供上述类人胶原蛋白止血敷料的制备方法。

本发明的具体过程如下：

一种类人胶原蛋白止血敷料，其采取以下制备方法得到：在以基因工程菌高密度发酵的人源型类人胶原蛋白分别螯合钙、锌、铁、铜离子制备的螯合型重组类人胶原蛋白的水溶液中，加入交联剂赖氨酰氧化酶进行酶法交联、陈化、冷冻和超低温冷冻处理后，进行真空冷冻干燥，Co60照射灭菌，获得最终的可吸收性类人胶原蛋白止血敷料。

所述螯合钙型、螯合锌型、螯合铁型、螯合铜型的重组类人胶原蛋白的质量比为：（500~600）:（10~15）:（10~20）:（1~5），总胶原蛋白溶液质量体积比浓度为5~20% 。

赖氨酰氧化酶质量体积比浓度为0.01~0.5%。

交联反应温度为20~45℃，具体可为20℃、25℃、37℃或45℃等；反应时间为5~48h，具体可为5h、10h、24h或48h等。

上述制备得到的类人胶原蛋白止血敷料的吸水率为3400%，凝血速率可达51s。

本发明所述的交联后样品需进行超低温冷冻和冷冻干燥处理，并通过Co60照射灭菌方可使用。

本发明的优点：

（1）本发明所涉及的胶原蛋白为基因工程菌高密度发酵的人源型胶原蛋白，具有优异的生物相容性、促细胞生长、无动物病毒隐患的特点，以这样蛋白改性的螯合钙、锌、铁、铜元素的胶原蛋白不仅同样保留了原胶原蛋白基质的优点，同时增加了离子辅助功效，大大提升了（术后）创伤面的高止血效果和促进创面愈合的功效；

（2）本发明所涉及的交联剂是存在于哺乳动物中的铜依赖性氨基酸氧化酶，源于细胞分泌的赖氨酸氧化酶原在胞外被剪切加工而成的，能够催化细胞外基质蛋白（如胶原蛋白和弹性蛋白）中赖氨酸残基的ε-氨基氧化去氨基形成赖氨酸-乙醛，和相邻的分子的三螺旋区域（Hyl-Gly-His-Arg）中的一个高度保守的赖氨酰胺氧化酶结合位点上羟赖氨酸的反ε-氨基生成希夫碱（醛亚胺），从而实现胶原蛋白和弹性蛋白的可溶性单体转变为稳定性较强的不溶性纤维。该交联剂的使用不仅仅是对胶原蛋白分子的作用，还能够合成细胞外基质，影响细胞增殖和细胞趋化，促进创伤面的组织再生，故其单体在交联后的残存无需去除；

（3）本发明制备方法原料易得，成本低，合成工艺简单易实现，产品质量稳定，工艺放大容易且重现性能好。本发明所制备的新型止血敷料在医用生物材料与组织工程等相关领域有着良好的应用前景。

附图说明

图1为实施例1制备的新型止血敷料的样品图；

图2为实施例1制备的新型止血敷料的SEM图；

图3为实施例5中的新型止血敷料的细胞培养荧光图；

图4为实施例6中的新型止血敷料的止血效果图；

图5为实施例6中的新型止血敷料的止血4周后效果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1富含钙、锌、铁、铜型的类人胶原蛋白止血敷料的制备

按照质量比为100:2:2:1，分别称取适量的螯合钙、锌、铁、铜型的类人胶原蛋白适量，溶于适量的去离子水中，配制成浓度为10% (w/v)的胶原蛋白溶液100 ml；在搅拌下向上述蛋白溶液中加入0.05%(w/v)的交联剂赖氨酸氧化酶2mL，混匀后倒入模具，在25℃下保温24h，再转入超低温冰箱中冷冻2~4h；将超低温冷冻的样品迅速移入预冷的真空冷冻干燥机中，真空冷冻干燥24~48h，取出封装，Co60照射灭菌，获得可降解人源型胶原蛋白止血敷料。制备的新型止血敷料的外观照片如图1所示，其微观结构的SEM图见图2所示，该止血敷料的吸水率约为3400%。

实施例2富含钙、锌、铁、铜型的类人胶原蛋白止血敷料的制备

按照质量比为100:3:4:1，分别称取适量的螯合钙、锌、铁、铜型的类人胶原蛋白适量，溶于适量的去离子水中，配制成浓度为5%(w/v)的胶原蛋白溶液200 ml；在搅拌下向上述蛋白溶液中加入质量分数为0.5%的交联剂赖氨酸氧化酶0.4ml，混匀后倒入模具，在20℃下保温48h，再转入超低温冰箱中冷冻2~4h；将超低温冷冻的样品迅速移入预冷的真空冷冻干燥机中，真空冷冻干燥24~48h，取出封装，Co60照射灭菌，获得可降解人源型胶原蛋白止血敷料。

实施例3富含钙、锌、铁、铜型的类人胶原蛋白止血敷料的制备

按照质量比为400:10:10:1，分别称取适量的螯合钙、锌、铁、铜型的类人胶原蛋白适量，溶于适量的去离子水中，配制成浓度为15%(w/v)的胶原蛋白溶液200ml；在搅拌下向上述蛋白溶液中加入质量分数为0.05%(w/v)的交联剂赖氨酸氧化酶6mL，混匀后倒入模具，在45℃下保温5h，再转入超低温冰箱中冷冻2~4h；将超低温冷冻的样品迅速移入预冷的真空冷冻干燥机中，真空冷冻干燥24~48h，取出封装，Co60照射灭菌，获得可降解人源型胶原蛋白止血敷料。

实施例4富含钙、锌、铁、铜型的类人胶原蛋白止血敷料的制备

按照质量比为100:2:4:1，分别称取适量的螯合钙、锌、铁、铜型的类人胶原蛋白适量，溶于适量的去离子水中，配制成浓度为20%(w/v)的胶原蛋白溶液100ml；在搅拌下向上述蛋白溶液中加入质量分数为0.01%的交联剂赖氨酸氧化酶10mL，混匀后倒入模具，在37℃下保温10h，再转入超低温冰箱中冷冻2~4h；将超低温冷冻的样品迅速移入预冷的真空冷冻干燥机中，真空冷冻干燥24~48h，取出封装，Co60照射灭菌，获得可降解人源型胶原蛋白止血敷料。

实施例5富集钙、锌、铁、铜型的类人胶原蛋白止血敷料的细胞学实验

以实施例1中获得的类人胶原蛋白止血敷料为材料进行细胞学实验。

（1）细胞毒性实验

浸提液的制备方法：必须保证无菌操作，本实验的所有操作均在生物安全柜内完成。按照类人胶原蛋白止血敷料厚度大于3mm，试样表面积/浸提介质=3cm²/ml的要求进行浸提液的制备。选取实施例1中制备的类人胶原蛋白止血敷料为原材料，取15cm²敷料使用5ml的RPMI 1640培养基（含10%的小牛血清），在37℃的生化培养箱中恒温浸泡72h±2h制备敷料的浸提液。以1：1的比例将制得的浸提液与原RPMI 1640培养基进行混合，制得50%浓度浸提液。

5mg/ml MTT溶液的配制：准确称取100mg的MTT溶于20ml的PBS中,完全溶解以后用0.22μm的滤膜过滤除菌，分装以后用锡箔纸包住置于-20℃冰箱避光保存备用。

在37℃，CO₂浓度为5.0%的条件下培养BHK-21细胞。细胞传代后把BHK-21细胞以0.25%的胰蛋白酶（用孔径为0.22μm的膜过滤）溶液进行消化，以3×10⁴ cells/ml的细胞密度接种于96孔细胞培养板中，每孔接种100μL。将接有细胞的细胞培养板放入培养箱培养24h后，吸去培养液，并以每8个孔为一组平行样，分别向每孔加入50%和100%浓度的蛋白敷料的浸提液100μl。

当培养到2d、4d和7d时，每孔分别加入浓度为5 mg/ml 的MTT溶液20μl，孵育4h后吸去上层培养液，迅速加入150μl DMSO，快速振荡5min以570nm作为检测波长，同时以630nm为参考检测波长，利用酶标仪测定每个孔的吸光度值。实验中使用完全培养基作为空白对照。以细胞的相对增殖率=实验组吸光度值/空白组吸光度值×100%，计算出不同浓度的材料浸提液中BHK-21细胞的相对增殖率。

检测结果表明富集钙、锌、铁、铜型的类人胶原蛋白止血敷料的细胞毒性评价为1级。

（2）细胞形貌的分析

类人胶原蛋白止血敷料对细胞形态的影响可以通过荧光染色来观察。首先是将生长较好的BHK-21细胞制备成细胞悬浮液，其浓度为9×10³个/mL，于48孔板中加1mL的细胞悬浮液，待24h后，加入样品溶液进行，培养48h后，加入CDFA荧光染料，使其在培养液中的最终浓度为10μg/mL，CO₂培养箱中孵育30min中，吸取上清，在荧光显微镜下观察细胞形貌，图3为新型止血敷料浸提液培养BHK-21细胞24h的细胞形貌荧光图。

实施例6富集钙、锌、铁、铜型的类人胶原蛋白止血敷料的术后止血应用

以实验兔为动物模型，以实施例1中获得的类人胶原蛋白止血敷料为材料，采用2.5%戊巴比妥钠溶液2ml耳缘静脉注射麻醉，逐层开腹，暴露肝脏，在肝叶上用手术刀片做1.0cm×1.0cm的创面，在创面形成过程中渗血用纱布吸取，然后迅速用准备好的面积为1.5cm×1.5cm类人胶原蛋白止血敷料膜敷压创面，记录完全止血时间为51秒，观察止血敷料在创面的粘附情况并对肝脏表面进行拍照，如图4所示。对实验兔进行伤口缝合包扎，饲养4周后处死，解剖观察原肝脏创伤部位，发现止血敷料已经完全降解，肝脏表面无明显炎症迹象和增生物出现，如图5照片所示。

总之，除过钙元素外，还有许多微量元素如铁、锌、铜、锰、铬、硒、钼、钴、氟等，它们也与人的生存和健康息息相关，对人的生命起至关重要的作用，如果它们的摄入过量、不足、不平衡或缺乏都会不同程度地引起人体生理的异常或发生疾病。其中与创伤愈合有关的微量元素主要有锌、铁、铜。锌极易与血浆中一些低分子量化合物结合，由肾滤过而排出，当蛋白从尿中丢失时，锌也可随之丢失。因此，在创伤或手术后，或多或少有一段时间处于低锌状态，补锌是十分必要的。铁和抗坏血酸在一起，对伤口愈合也是必需的。铁的丢失主要原因是创伤失血，血红蛋白分解及组织溶解渗出。铁是人体造血的重要原料，但必须依靠铜元素的帮忙。铜在人体内的含量仅次于铁和锌，以金属酶的形式存在于体内，位于酶的活性部位。铜被吸收后，合成血浆铜蓝蛋白和各种铜酶，参与血红素和细胞色素的合成。铜蓝蛋白可以维护正常的造血机能，促进铁的吸收和运输，促进血红素和血红蛋白的合成。本专利发明人合理利用人体必需元素钙、锌、铜、铁等的特殊生理作用，制备得到的类人胶原蛋白止血敷料可充分提高止血效果和促进创面愈合。

Claims (10)

1.一种类人胶原蛋白止血敷料，其特征在于采取以下制备方法得到：在以基因工程菌高密度发酵的人源型类人胶原蛋白分别螯合钙、锌、铁、铜离子制备的螯合型重组类人胶原蛋白的水溶液中，加入交联剂赖氨酰氧化酶进行酶法交联、陈化、冷冻和超低温冷冻处理后，进行真空冷冻干燥，Co60照射灭菌，获得最终的可吸收性类人胶原蛋白止血敷料。

2.根据权利要求1所述的类人胶原蛋白止血敷料，其特征在于：所述螯合钙型、螯合锌型、螯合铁型、螯合铜型的重组类人胶原蛋白的质量比为：（500~600）:（10~15）:（10~20）:（1~5），总胶原蛋白溶液质量体积比浓度为5~20%。

3.根据权利要求1所述的类人胶原蛋白止血敷料，其特征在于：赖氨酰氧化酶质量体积比浓度为0.01~0.5%。

4.根据权利要求1所述的类人胶原蛋白止血敷料，其特征在于：交联反应温度为20~45℃。

5.根据权利要求1所述的类人胶原蛋白止血敷料，其特征在于：交联反应时间为5~48h。

6.根据权利要求1所述的类人胶原蛋白止血敷料，其特征在于：所述类人胶原蛋白止血敷料的吸水率为3400%，凝血速率可达51s。

7.权利要求1所述类人胶原蛋白止血敷料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：在以基因工程菌高密度发酵的人源型类人胶原蛋白分别螯合钙、锌、铁、铜离子制备的螯合型重组类人胶原蛋白的水溶液中，加入交联剂赖氨酰氧化酶进行酶法交联、陈化、冷冻和超低温冷冻处理后，进行真空冷冻干燥，Co60照射灭菌，获得最终的可吸收性类人胶原蛋白止血敷料。

8.根据权利要求7所述的类人胶原蛋白止血敷料的制备方法，其特征在于：所述螯合钙型、螯合锌型、螯合铁型、螯合铜型的重组类人胶原蛋白的质量比为：（500~600）:（10~15）:（10~20）:（1~5），总胶原蛋白溶液质量体积比浓度为5~20%。

9.根据权利要求7所述的类人胶原蛋白止血敷料的制备方法，其特征在于：赖氨酰氧化酶质量体积比浓度为0.01~0.5%。

10.根据权利要求7所述的类人胶原蛋白止血敷料的制备方法，其特征在于：交联反应温度为20~45℃，反应时间为5~48h。