CN105664234B

CN105664234B - 一种抗菌性类人胶原蛋白创面医护膜敷料

Info

Publication number: CN105664234B
Application number: CN201610073663.5A
Authority: CN
Inventors: 范代娣; 马沛; 郑晓燕; 米钰; 惠俊峰
Original assignee: Northwest University
Current assignee: Northwest University
Priority date: 2016-02-03
Filing date: 2016-02-03
Publication date: 2019-01-25
Anticipated expiration: 2036-02-03
Also published as: CN105664234A

Abstract

本发明公开了一种具有良好生物相容性的可吸收的富集钙、锌、铜、银元素的新型的类人胶原蛋白创面医护敷料及其制备方法。该制备方法是利用高密度发酵制备的人源型类人胶原蛋白分别螯合钙、锌、铜三种离子的改性蛋白为原料，利用哺乳动物体内存在的赖氨酰氧化酶为交联剂，并通过高吸附特性负载上自由银离子，通过低温交联反应和冷冻干燥工艺过程，获得了可用于烧烫伤和皮肤创伤的新型类人胶原蛋白创面医护膜敷料。本发明无动物源病毒隐患，止血效果显著；富含的银离子能够阻止创面免受细菌侵犯。该种医护敷料可用作各类创面的治疗，有着广阔的应用前景。

Description

一种抗菌性类人胶原蛋白创面医护膜敷料

技术领域

本发明涉及一种新型富集钙、锌、铜、银元素的类人胶原蛋白的创面医护膜敷料及其制备方法。

背景技术

治疗各种烧伤、烫伤、溃疡、褥疮、创伤创面，需要着重解决的是创伤表面的透气性，防止组织液及体液的流失，防止病患表面感染，促组织修复等。然而，传统的伤口敷料虽单次换药费用低廉，取材方便，但是在治愈创面过程中，存在着明显的缺陷：频繁换药增加了伤口细菌感染的几率，敷料膜与分泌物黏连，在换敷料时常常使新形成的组织再次受损，敷料材质的非降解可营养性吸收不利于创伤面的自修复。近年来，市场上出现了一些新型膜敷料，包括重点防护创面感染型敷料和可营养吸收性膜敷料，但这些膜敷料还存在着许多值得性能改进和提升方面。如银离子抗菌敷料虽能很好的防止细菌的感染，但是结构复杂（内外多达5层），膜敷料材质不可被营养吸收无疑愈合缓慢，且需多次换药处理而给患者经济上和时间上带来负担；胶原蛋白类膜敷料虽因胶原蛋白是动物体内的一种纤维蛋白，具有良好的生物相容性和可降解营养性吸收而利于创面修复，使得创面修复效果改善，但是目前现流行的胶原蛋白类膜敷料的胶原蛋白来源于动物提取物，存在不可预测的潜在的病毒隐患，胶原蛋白类敷料价格相对也较贵。目前，还没有一种创面医护敷料能同时具有强止血性、吸收伤口分泌液、良好通透气性、防杀菌性、可降解被营养性吸收、无动物源病毒隐患、造价低廉等特点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗菌性、无潜在病毒隐患、有良好的生物相容性、可降解被营养性吸收和优异的创面修复效果的富集钙、锌、铜、银元素的类人胶原蛋白的创面医护膜敷料。

本发明另一目的在于提供上述类人胶原蛋白的创面医护膜敷料的制备方法。

本发明的具体过程如下：

一种类人胶原蛋白创面医护膜敷料，其采取以下制备方法得到：以基因工程菌高密度发酵的人源型类人胶原蛋白分别螯合钙、锌、铜离子制备的螯合型重组类人胶原蛋白的水溶液中，加入赖氨酰氧化酶进行酶法交联、陈化、冷冻和超低温冷冻处理后，进行真空冷冻干燥；将冷冻干燥后的膜敷料浸入硝酸银去离子水溶液吸附饱和后再放入超低温冰箱冷冻后，移入真空冷冻干燥机中进行真空冷冻干燥，封装，Co60照射灭菌，获得类人胶原蛋白创面医护膜敷料。

本发明所述的螯合钙型、螯合锌型、螯合铜型的重组类人胶原蛋白的质量比以人体平均每天对钙、锌、铜的平均需求量为参考确定为：（500~600）:（10~15）:（1~5），所配置的总胶原蛋白溶液浓度为5~20% (w/v)。

赖氨酰氧化酶质量体积比浓度为0.01~0.5%。

交联反应温度为20~45℃，具体可为20℃、25℃、37℃或45℃等；反应时间为5~48h，具体可为5h、10h、24h或48h等。

硝酸银水溶液的质量体积比浓度为1~15%。

本发明所述的交联后样品需进行低温、超低温冷冻和冷冻干燥处理，并通过Co60照射灭菌方可使用。

钙离子是人体内最重要的宏量元素之一，广泛分布于体内各组织器官之中，维系着所有细胞的正常生理功能。钙离子不仅参与了肌肉收缩、骨骼形成、神经传导，还有一个非常重要的作用就钙离子参与了血液凝固和能够促进创伤面的修复。作为凝血因子IV的钙离子，能从血液中“捕获”并活化一种关键凝血蛋白质—凝血酶，启动凝血机制，进行止血；外来抗原激活T细胞受体，启动了钙离子介导的信号通路，促使免疫细胞分化和生长等。银离子的抗菌性主要通过破坏细菌细胞壁，与细胞内的酶和蛋白质等重要物质相互作用，导致细菌缺乏能量，并与细菌细胞内DNA相互作用，影响细菌细胞分裂，最终导致细菌死亡。伤口局部锌、铜离子浓度增加，也能加快伤口的愈合过程。锌是脱氢酶类，DNA聚合酶，碳酸酐酶的辅因子；铜以金属酶的形式存在于体内，位于酶的活性部位。铜被吸收后，合成血浆铜蓝蛋白和各种铜酶，参与血红素和细胞色素的合成。

本发明既能将上述膜敷料的优点保持，又弥补相应的缺陷，获得具有良好生物相容性、可被营养吸收性的、无动物源病毒隐患的创面膜敷料，同时还能合理利用人体必需元素钙、锌、铜、银等的特殊生理生化作用，充分提高膜敷料的止血、防感染效果和促进创面愈合。

本发明所涉及的胶原蛋白为基因工程菌高密度发酵的人源型胶原蛋白，具有优异的生物相容性、促细胞生长、无动物病毒隐患的特点，以这样蛋白改性的螯合钙、锌、铜元素的胶原蛋白不仅同样保留了原胶原蛋白基质的优点，同时释放出来的钙、锌、铜离子对创伤面具有积极的止血、组织修复功效，大大提升了对创伤面的高止血效果和促进创面愈合的功效。此外，本发明中胶原蛋白膜敷料负载微量银离子，可对创伤面形成无菌保护，防止创面感染；

本发明所涉及的交联剂是存在于哺乳动物中的铜依赖性氨基酸氧化酶，源于细胞分泌的赖氨酸氧化酶原在胞外被剪切加工而成的，能够催化细胞外基质蛋白（如胶原蛋白和弹性蛋白）中赖氨酸残基的ε-氨基氧化去氨基形成赖氨酸-乙醛，和相邻的分子的三螺旋区域（Hyl-Gly-His-Arg）中的一个高度保守的赖氨酰胺氧化酶结合位点上羟赖氨酸的反ε-氨基生成希夫碱（醛亚胺），从而实现胶原蛋白和弹性蛋白的可溶性单体转变为稳定性较强的不溶性纤维。该交联剂的使用能够合成细胞外基质，影响细胞增殖和细胞趋化，促进创伤面的组织再生。故其单体在交联后的残存无需去除。

基因工程菌高密度发酵的人源型胶原蛋白，具有优异的生物相容性、促细胞生长、无动物病毒隐患的特点，是一种性能优异的最理想的可降解的营养型生物医用材料。

本发明制备方法原料易得，成本低，合成工艺简单易实现，产品质量稳定，工艺放大容易且重现性能好。本发明所制备的新型创伤面膜敷料在医用生物材料与组织工程等相关领域有着良好的应用前景。

附图说明

图1为实施例1制备的类人胶原蛋白创面医护膜敷料的样品图；

图2为实施例1制备的类人胶原蛋白创面医护膜敷料的SEM图；

图3为实施例5中的类人胶原蛋白创面医护膜敷料的细胞培养荧光图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

按照质量比为100:2:1，分别称取适量的螯合钙、锌、铜型的类人胶原蛋白适量，溶于适量的去离子水中，配制成浓度为10% (w/v)的胶原蛋白溶液100 ml；在搅拌下向上述蛋白溶液中加入0.05%(w/v)的交联剂赖氨酸氧化酶2mL，混匀后倒入模具，在25℃下保温24h，再转入超低温冰箱中冷冻2~4h；将超低温冷冻的样品迅速移入预冷的真空冷冻干燥机中，真空冷冻干燥24~48h。

将冷冻干燥后的膜敷料浸没于5% (w/v)的硝酸银去离子水溶液中，待敷料吸附饱和后，放入超低温冰箱冷冻2~4h后，迅速移入真空冷冻干燥机中进行真空冷冻干燥24~48h。取出二次冷冻好的膜敷料封装，Co60照射灭菌，获得富集钙、锌、铜、银元素的类人胶原蛋白的创面医护膜敷料。图1为制备的新型膜敷料的实物照片，图2为其微观结构的SEM图。

实施例2

按照质量比为100:3: 1，分别称取适量的螯合钙、锌、铁、铜型的类人胶原蛋白适量，溶于适量的去离子水中，配制成浓度为5%(w/v)的胶原蛋白溶液200 ml；在搅拌下向上述蛋白溶液中加入质量分数为0.5%的交联剂赖氨酸氧化酶0.4ml，混匀后倒入模具，在20℃下保温48h，再转入超低温冰箱中冷冻2~4h；将超低温冷冻的样品迅速移入预冷的真空冷冻干燥机中，真空冷冻干燥24~48h。

将冷冻干燥后的膜敷料10% (w/v)的硝酸银去离子水溶液中，待敷料吸附饱和后，放入超低温冰箱冷冻2~4h后，迅速移入真空冷冻干燥机中进行真空冷冻干燥24~48h。取出二次冷冻好的膜敷料封装，Co60照射灭菌，获得获得富集钙、锌、铜、银元素的类人胶原蛋白的创面医护膜敷料。

实施例3

按照质量比为400:10:1，分别称取适量的螯合钙、锌、铁、铜型的类人胶原蛋白适量，溶于适量的去离子水中，配制成浓度为15%(w/v)的胶原蛋白溶液200ml；在搅拌下向上述蛋白溶液中加入质量分数为0.05%(w/v)的交联剂赖氨酸氧化酶6mL，混匀后倒入模具，在45℃下保温5h，再转入超低温冰箱中冷冻2~4h；将超低温冷冻的样品迅速移入预冷的真空冷冻干燥机中，真空冷冻干燥24~48h。

将冷冻干燥后的膜敷料1% (w/v)的硝酸银去离子水溶液中，待敷料吸附饱和后，放入超低温冰箱冷冻2~4h后，迅速移入真空冷冻干燥机中进行真空冷冻干燥24~48h。取出二次冷冻好的膜敷料封装，Co60照射灭菌，获得获得富集钙、锌、铜、银元素的类人胶原蛋白的创面医护膜敷料。

实施例4

按照质量比为100:2:1，分别称取适量的螯合钙、锌、铁、铜型的类人胶原蛋白适量，溶于适量的去离子水中，配制成浓度为20%(w/v)的胶原蛋白溶液100ml；在搅拌下向上述蛋白溶液中加入质量分数为0.01%的交联剂赖氨酸氧化酶10mL，混匀后倒入模具，在37℃下保温10h，再转入超低温冰箱中冷冻2~4h；将超低温冷冻的样品迅速移入预冷的真空冷冻干燥机中，真空冷冻干燥24~48h。

将冷冻干燥后的膜敷料15% (w/v)的硝酸银去离子水溶液中，待敷料吸附饱和后，放入超低温冰箱冷冻2~4h后，迅速移入真空冷冻干燥机中进行真空冷冻干燥24~48h。取出二次冷冻好的膜敷料封装，Co60照射灭菌，获得获得富集钙、锌、铜、银元素的类人胶原蛋白的创面医护膜敷料。

实施例5类人胶原蛋白创面医护膜敷料为为材料进行细胞学实验。

（1）细胞毒性实验

浸提液的制备方法：必须保证无菌操作，本实验的所有操作均在生物安全柜内完成。按照类人胶原蛋白止血敷料厚度大于3mm，试样表面积/浸提介质=3cm²/ml的要求进行浸提液的制备。选取实施例1中制备的类人胶原蛋白止血敷料为原材料，取15cm²敷料使用5ml的RPMI 1640培养基（含10%的小牛血清），在37℃的生化培养箱中恒温浸泡72h±2h制备敷料的浸提液。以1：1的比例将制得的浸提液与原RPMI 1640培养基进行混合，制得50%浓度浸提液。

5mg/ml MTT溶液的配制：准确称取100mg的MTT溶于20ml的PBS中,完全溶解以后用0.22μm的滤膜过滤除菌，分装以后用锡箔纸包住置于-20℃冰箱避光保存备用。

在37℃，CO₂浓度为5.0%的条件下培养BHK-21细胞。细胞传代后把BHK-21细胞以0.25%的胰蛋白酶（用孔径为0.22μm的膜过滤）溶液进行消化，以3×10⁴ cells/ml的细胞密度接种于96孔细胞培养板中，每孔接种100μL。将接有细胞的细胞培养板放入培养箱培养24h后，吸去培养液，并以每8个孔为一组平行样，分别向每孔加入50%和100%浓度的蛋白敷料的浸提液100μl。

当培养到2d、4d和7d时，每孔分别加入浓度为5 mg/ml 的MTT溶液20μl，孵育4h后吸去上层培养液，迅速加入150μl DMSO，快速振荡5min以570nm作为检测波长，同时以630nm为参考检测波长，利用酶标仪测定每个孔的吸光度值。实验中使用完全培养基作为空白对照。以细胞的相对增殖率=实验组吸光度值/空白组吸光度值×100%，计算出不同浓度的材料浸提液中BHK-21细胞的相对增殖率。

检测结果表明富集钙、锌、铁、铜型的类人胶原蛋白止血敷料的细胞毒性评价为1级。

（2）细胞形貌的分析

类人胶原蛋白止血敷料对细胞形态的影响可以通过荧光染色来观察。首先是将生长较好的BHK-21细胞制备成细胞悬浮液，其浓度为9×10³个/mL，于48孔板中加1mL的细胞悬浮液，待24h后，加入样品溶液进行，培养48h后，加入CDFA荧光染料，使其在培养液中的最终浓度为10μg/mL，CO₂培养箱中孵育30min中，吸取上清，在荧光显微镜下观察细胞形貌，图3为新型止血敷料浸提液培养BHK-21细胞24h的细胞形貌荧光图。

Claims

1.一种类人胶原蛋白创面医护膜敷料，其特征在于采取以下制备方法得到：以基因工程菌高密度发酵的人源型类人胶原蛋白分别螯合钙、锌、铜离子制备的螯合型重组类人胶原蛋白的水溶液中，加入赖氨酰氧化酶进行酶法交联、陈化、冷冻和超低温冷冻处理后，进行真空冷冻干燥；将冷冻干燥后的膜敷料浸入硝酸银去离子水溶液吸附饱和后再放入超低温冰箱冷冻后，移入真空冷冻干燥机中进行真空冷冻干燥，封装，Co60照射灭菌，获得类人胶原蛋白创面医护膜敷料。

2.根据权利要求1所述的类人胶原蛋白创面医护膜敷料，其特征在于：所述螯合钙型、螯合锌型、螯合铜型的重组类人胶原蛋白的质量比为：（500~600）:（10~15）:（1~5），总胶原蛋白溶液质量体积比浓度为5~20%。

3.根据权利要求1所述的类人胶原蛋白创面医护膜敷料，其特征在于：赖氨酰氧化酶质量体积比浓度为0.01~0.5%。

4.根据权利要求1所述的类人胶原蛋白创面医护膜敷料，其特征在于：交联反应温度为20~45℃，反应时间为5~48h。

5.根据权利要求1所述的类人胶原蛋白创面医护膜敷料，其特征在于：硝酸银水溶液的质量体积比浓度为1~15%。

6.权利要求1所述类人胶原蛋白创面医护膜敷料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：以基因工程菌高密度发酵的人源型类人胶原蛋白分别螯合钙、锌、铜离子制备的螯合型重组类人胶原蛋白的水溶液中，加入赖氨酰氧化酶进行酶法交联、陈化、冷冻和超低温冷冻处理后，进行真空冷冻干燥；将冷冻干燥后的膜敷料浸入硝酸银去离子水溶液吸附饱和后再放入超低温冰箱冷冻后，移入真空冷冻干燥机中进行真空冷冻干燥，封装，Co60照射灭菌，获得类人胶原蛋白创面医护膜敷料。

7.根据权利要求6所述的类人胶原蛋白创面医护膜敷料的制备方法，其特征在于：所述螯合钙型、螯合锌型、螯合铜型的重组类人胶原蛋白的质量比为：（500~600）:（10~15）:（1~5），总胶原蛋白溶液质量体积比浓度为5~20%。

8.根据权利要求6所述的类人胶原蛋白创面医护膜敷料的制备方法，其特征在于：赖氨酰氧化酶质量体积比浓度为0.01~0.5%。

9.根据权利要求6所述的类人胶原蛋白创面医护膜敷料的制备方法，其特征在于：交联反应温度为20~45℃，交联反应时间为5~48h。

10.根据权利要求6所述的类人胶原蛋白创面医护膜敷料的制备方法，其特征在于：硝酸银水溶液的质量体积比浓度为1~15%。