CN107441557A - 一种功能性组织工程支架材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种功能性组织工程支架材料的制备方法，包括如下步骤：(1)将SIS置于改性剂中浸泡，得功能性薄膜组分；(2)功能性薄膜组分与去抗原SIS进行复合；所述改性剂选自聚赖氨酸、聚赖氨酸‑天冬氨酸共聚物或壳聚糖溶液中的一种或多种。本发明通过聚赖氨酸、聚赖氨酸‑天冬氨酸共聚物或壳聚糖表面带有的活性氨基或正电荷赋予材料双侧不同的功能性，得到毒性低，细胞相容性好、具有功能性的组织修复材料。该材料双侧功能性的不同作为神经修复、循环系统或泌尿系统的组织修复材料有特殊优势。

Description

一种功能性组织工程支架材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种功能性组织工程支架材料及其制备方法，属于组织支架材料制备技术领域。
背景技术
猪小肠粘膜下层(small intestinal submucosa，SIS)是一种富含活性因子的天然生物材料，在应用于多种组织缺损修复中，具体最突出的生物学优势，可获得结构和功能上的完整重建。
但由于SIS这类薄膜材料在力学上各向异性、单层材料力学和抗降解能力较差，通常通过压合真空冻干或热干的方式，将多层SIS结合在一起得到满足临床需求的组织修复材料。但是随着临床需求的发展，通过简单复合的SIS材料可能无法满足越来越多的损伤修复，一些组织损伤修复需求需要修复材料各层或各向不用的功能性。
目前已经有一些将生物补片类的膜性材料制备成双向异性的方法，各个方法的工艺、目的以及最终的应用领域都有所不同。一种是以结构异性为目的制备方法，所得材料在需要组织重塑不同的应用领域得到更好的治疗效果。如CN02118498.4公开了通过提取胶原重塑的办法制备双向异性的胶原膜材料，一面是较为致密的胶原层，另一面是较为疏松的胶原层，再粘膜再生领域得到很好的应用。CN102112162A公开了通过脱细胞外基质与脱细胞外基质微粒结合的方式制备双向结构不同的补片材料，制备的产品在生物活性方面较传统补片具有一定优势。另一种方法是通过各层材料预先复合活性成分再复层成型的模型得到产品各层生化性能不同的材料，通过各层材料添加的活性成分或活性成分的浓度不同得到各层异性的材料，在一些特殊的领域有很好的应用。如CN101970024A公开了通过各层添加不同的生长因子的方式先制备薄层材料再将各层复合在一起，制备的产品在皮肤修复方面预期有较好的效果。CN101970024B通过各层复合分阶段传递的方法制备多层材料，使材料不同生长因子或不同浓度的生长因子。但上述技术仍然存在如下缺陷：
1、单纯SIS复层不能满足产品各项异性的需求；
2、目前的多层处理方式多是结合生长因子的方式，其多层的功能性来源于生长因子的功能，而生长因子应用在体内可能由于局部浓度过高，产生一定风险；
3、目前没有针对神经修复、循环系统及泌尿系统修复的多层SIS处理方法。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种功能性组织工程支架材料及其制备方法。通过聚赖氨酸、聚赖氨酸-天冬氨酸共聚物或壳聚糖表面带有的活性氨基或正电荷赋予材料双侧不同的功能性，得到毒性低，细胞相容性好、具有功能性的组织修复材料。该材料双侧功能性的不同作为神经修复、循环系统或泌尿系统的组织修复材料有特殊优势。
本发明采用技术方案如下。
一种功能性组织工程支架材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)以脱细胞猪小肠粘膜下层(SIS)为支架结构，将SIS在改性剂中浸泡，使SIS表面带有活性氨基或聚阳离子，得到功能性薄膜组分，待用；
(2)再将去抗原SIS与功能性薄膜组分复合，得到功能性组织工程支架材料。
其中，步骤(1)中，所述改性剂选自聚赖氨酸、聚赖氨酸-天冬氨酸共聚物或壳聚糖中的一种或多种。所述改性剂的总浓度范围为0.001％-40％，由于改性剂的总浓度与分子量有关，如分子量低，则改性剂浓度相应提高，本领域技术人员可根据所掌握的专业常识选择合适的改性剂分子量和浓度，优选0.001％-32％；在此浓度范围内有效成分可按任意比例混合；所述浸泡时间为10min-24h，优选范围1h-4h；优选地，所述改性剂为聚赖氨酸溶液，其浓度为0.5％，浸泡2h；所述聚赖氨酸或聚赖氨酸-天冬氨酸共聚物分子量为1000-100000，所述壳聚糖分子量为3000-200000。
上述制备方法中，所述SIS可按照文献《脱细胞处理对小肠黏膜下层细胞残留及生长因子含量影响的实验研究》(陈薇,李次会,武术,解慧琪,罗静聪(2010)中国修复重建外科杂志v.24(01):94-99)记载的方法，通过取材，消毒，机械剥除，脱脂，脱细胞，去垢，制得SIS，将SIS沿肠管轴向剖开，并沿环向将SIS裁剪成任意尺寸的薄膜。
在步骤(1)之前，可先对脱细胞猪小肠粘膜下层进行预处理，以提高材料的力学强度和抗降解性；具体方法为：将SIS浸泡在交联剂中处理10min-30天，再用去离子水、生理盐水或PBS缓冲液充分冲洗，擦干表面水分，进行真空冷冻干燥，得到交联后的SIS。其中，所述交联剂选自甲醛、戊二醛、二苯基甲烷二异氰酸酯(MDI)、甲苯二异氰酸酯(TDI)、异佛尔酮二异氰酸酯(IPDI)、乙二醇缩水甘油醚、聚乙二醇缩水甘油醚或者它们各自的生理缓冲溶液中一种或多种；所述交联剂的总浓度为0.001M-1M。所述生理缓冲溶液是由NaCl、KCl、Na2HPO3、K2HPO3、Na2CO3、K2CO3中一种或多种配置的缓冲溶液，其pH范围为5-8。
在上述预处理过程中，所述真空冷冻干燥过程为：将上一步骤得到的SIS材料进行0.5-48小时的预冻，预冻温度为-10℃～-80℃,而后对产品进行真空低温干燥；干燥过程中温度在原有预冻温度上升到4℃-60℃。优选冷冻4小时，预冻温度为-30℃。
步骤(2)中，复合层数为2-10层，优选2-6层，进一步优选4层。作为本发明优选的实施方式之一，所述功能性组织工程支架材料由2层去抗原SIS和4层功能性薄膜组分组成。
本发明所述制备方法得到的功能性组织工程支架材料还可以进行真空冷冻干燥或保存在生理缓冲溶液中无菌封装，再通过Co60放射或环氧乙烷灭菌后包装保存。其中，所述真空冷冻干燥过程为：将所得材料进行0.5-48小时的预冻，预冻温度为-10℃～-80℃，而后对产品进行真空低温干燥；干燥过程中温度在原有预冻温度上升到4℃以上。优选冷冻4小时，预冻温度为-30℃。
本发明还提供上述制备方法获得的功能性组织工程支架材料。
本发明具有的有益效果如下：
1、保持了脱细胞外基质的天然三维结构，有利于细胞的生长、增殖和分化。
2、改性剂聚赖氨酸、聚赖氨酸-天冬氨酸共聚物或壳聚糖表面带有的活性氨基，由其处理后的SIS复合材料能够促使神经细胞的爬行和生长，可作为神经导管的修复材料或硬脊膜修复材料。
3、复合材料表面修饰的聚阳离子消耗了游离醛基等交联基团，配位了游离的羧基和磷酸基，延缓了SIS复合材料植入体内后的钙化过程，作为循环系统和泌尿系统中组织工程支架材料具有特殊优势。
附图说明
图1为MTT法荧光定量实施例1-3所得组织工程支架材料的细胞毒性。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 一种功能性组织工程支架材料的制备方法
步骤如下：
(1)制备功能性SIS：将其浸泡0.1M戊二醛的pH＝8.8的磷酸缓冲液(交联剂)中，放在37℃摇床中使其充分交联12小时，取出用去离子水充分冲洗；然后用滤纸擦干表面水分，放入液氮中迅速冷冻2小时，-80℃进行真空冷冻干燥8小时，得到交联处理后的猪小肠粘膜下层(SIS)。将所得交联后的SIS浸泡在质量浓度0.5％分子量为6000的聚赖氨酸溶液中，取出，得到功能性SIS，待用。
(2)制备复合材料：取去抗原后的SIS材料堆叠铺设2层，再将上述处理过的功能性SIS在此基础上继续铺设4层，得到总共6层的功能性组织工程支架材料，冷冻干燥。
实施例2 一种功能性组织工程支架材料的制备方法
步骤如下：
(1)制备功能性SIS：将其浸泡0.001M的TDI的交联溶液中，放在37℃摇床中使其充分交联10min，取出用去离子水充分冲洗；然后用滤纸擦干表面水分，放入深低温冰箱中，-60℃进行真空冷冻干燥16小时，得到交联处理后的SIS。将所得交联后的SIS浸泡在质量浓度30％分子量为3000的壳聚糖溶液中，取出，得到功能性SIS，待用。
(2)制备复合材料：取去抗原后的SIS材料堆叠铺设1层，再将上述处理过的功能性SIS在此基础上继续铺设9层，得到总共10层的功能性组织工程支架材料，冷冻干燥。
实施例3 一种功能性组织工程支架材料的制备方法
步骤如下：
(1)制备功能性SIS：将其浸泡1M的聚乙二醇缩水甘油醚的交联溶液中，放在37℃摇床中使其充分交联30天，取出用去离子水充分冲洗；然后用滤纸擦干表面水分，放入冻干机中-10℃，进行真空冷冻干燥48小时，得到交联处理后的SIS。将所得交联后的SIS浸泡在质量浓度0.001％分子量为100000的聚赖氨酸-天冬氨酸溶液中，取出，得到功能性SIS，待用。
(2)制备复合材料：取去抗原后的SIS材料堆叠铺设1层，再将上述处理过的功能性SIS在此基础上继续铺设1层，得到总共2层的功能性组织工程支架材料，冷冻干燥。
对比例：传统方法制备的组织修复材料
步骤如下：
(1)制备去抗原后猪小肠粘膜下层将其浸泡0.1M甲醛的PH＝6.9的磷酸缓冲液中，放在37℃摇床中使其充分交联1小时取，取出用去离子水充分冲洗；然后用滤纸擦干表面水分，放入液氮中迅速冷冻2小时，-80℃进行真空冷冻干燥8小时，得到交联处理后的ECM；
(2)再将材料浸泡在0.5％透明质酸钠溶液中4h，并通过4层复合，最后冷冻干燥后得到一种传统方法制备的组织修复材料。
效果验证
1、钙含量测定
钙含量测定方法参照：Rupak M.Rajachar,Elyse Tung,Anh Q.Truong,etal.Role of carbonic anhydrase II in ectopic calcification.CardiovascularPathology,2009,18:77-82。文献方法测定。
将实施例1-3及对比例制得的组织工程支架材料植入小鼠体内35天后，测定其钙含量，结果如下表1所示。
表1
实施例 平均干基含量
实施例1 86.0±9.7
实施例2 8.3±6.2
实施例3 98.6±23.5
对比例 769±70.5
由表1可知，本发明实施例1-3所得组织工程支架材料较对比例在钙含量方面显著提高。
2、材料细胞毒性测试
材料对于神经胶质瘤细胞的作用测试方法参照龚海鹏,钟映晖,公衍道等,多基赖氨酸改性壳聚糖对于神经细胞的作用,生物物理学报,2000,16:553-559方法。
将实施例1-3所得组织工程支架材料的功能面向上，敷设在96孔板上，用神经胶质瘤细胞(9L)制成细胞悬浊液，37℃培养24小时，MTT法荧光定量测试材料细胞毒性，结果如图1所示。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种功能性组织工程支架材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将SIS置于改性剂中浸泡，得功能性薄膜组分；(2)功能性薄膜组分与去抗原SIS进行复合；
所述改性剂选自聚赖氨酸、聚赖氨酸-天冬氨酸共聚物或壳聚糖溶液中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的功能性组织工程支架材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述改性剂的总浓度为0.001％-40％；优选所述改性剂为聚赖氨酸溶液，浓度为0.5％。
3.根据权利要求1或2所述的功能性组织工程支架材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述聚赖氨酸或聚赖氨酸-天冬氨酸共聚物分子量为1000-100000，所述壳聚糖分子量为3000-200000。
4.根据权利要求1-3任一所述的功能性组织工程支架材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述浸泡时间为0.5-48h。
5.根据权利要求1-4任一所述的功能性组织工程支架材料的制备方法，其特征在于，在制备前，先对SIS进行预处理：将SIS在交联剂中浸泡，再真空冷冻干燥。
6.根据权利要求5所述的功能性组织工程支架材料的制备方法，其特征在于，所述交联剂选自甲醛、戊二醛、二苯基甲烷二异氰酸酯、甲苯二异氰酸酯、异佛尔酮二异氰酸酯、乙二醇缩水甘油醚、聚乙二醇缩水甘油醚或者它们各自的生理缓冲溶液中一种或多种。
7.根据权利要求5所述的功能性组织工程支架材料的制备方法，其特征在于，所述真空冷冻干燥过程为：将所得SIS材料于-10℃～-80℃预冻，再升温至4-60℃进行真空低温干燥；优选预冻4小时，预冻温度为-30℃。
8.根据权利要求1-7任一所述的功能性组织工程支架材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，复合层数为2-10层，优选2-6层。
9.权利要求1-8任一所述制备方法得到的功能性组织工程支架材料。
10.根据权利要求9所述的功能性组织工程支架材料，其特征在于，由2层去抗原SIS和4层功能性薄膜组分组成。
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