CN115518207A - 一种异构双层胶原基屏障膜及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种异构双层胶原基屏障膜及其制备方法和应用,采用生物相容性良好的天然高分子胶原作为基材,以无生物毒性的双醛多糖作为交联剂,通过双醛多糖的醛基与胶原的氨基之间的席夫碱反应进行交联,采用溶剂挥发与冷冻干燥相结合的方式制备双层胶原基屏障膜。本发明的优点是:双醛多糖交联的异构双层胶原基屏障膜,具有较高的机械强度、可控的降解速率、良好的生物相容性、组织贴合性和引导骨再生能力,溶剂挥发与冷冻干燥相结合的方式制备孔径不同的双层,对孔径实现稳定调控,解决了现有胶原基屏障膜所存在的技术缺陷。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域,具体而言涉及一种异构双层胶原基屏障膜及其制备方法和应用,为一种具有异构双层结构、可控生物降解速率、较强机械性能以及引导成骨分化能力的双层胶原基骨缺损修复屏障膜。
背景技术
引导骨再生术(Guided bone regeneration,GBR)是目前国内外治疗骨组织的缺损的“金标准”。GBR技术主要根据骨修复过程中各种细胞迁移速度和所需生长环境不同,在骨缺损区域放置一层屏障膜,该屏障膜可以阻挡生长较快的结缔组织细胞向骨缺损取迁移,为生长较慢的成骨细胞提供优势的附着位点和生长空间。
屏障膜是GBR技术得以取得良好治疗效果的关键因素。理想的屏障膜需要具有良好的生物相容性、较高的机械强度维持骨再生空间以及在能够阻止结缔组织细胞向下生长的同时允许营养物质的交换。市面上的屏障膜主要分为合成高分子材料、金属材料、天然材料以及复合材料。胶原基材料因为其良好的生物相容性、体内可降解性以及促骨再生性能收到了广泛关注,目前临床所使用的屏障膜有75%均为胶原基材料。
为满足GBR的要求,胶原基屏障膜大多被设计为异构双层的结构。致密层有利于阻隔结缔组织细胞,多孔层可为成骨细胞提供生长空间。而目前由于较高的技术壁垒,仅有欧美少数几家企业能够制备异构双层的胶原基屏障膜,因此其价格昂贵,给患者带来极大的经济负担。且所制备的屏障膜依旧存在机械强度低、降解速度快等缺点,无法贴合骨再生的过程。研究人员常采用化学交联的方式,通过添加化学交联剂提高胶原基屏障膜的机械性能。常使用的交联剂包括戊二醛、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC),它们虽对机械性能的提升有一定的效果,但极强的细胞毒性以及对胶原膜诱导骨再生能力的破坏限制了其广泛应用。近年来,双醛多糖作为无生物毒性的良好大分子蛋白质交联剂引起了广泛的关注,它可以在提升胶原膜机械性能的同时,保持胶原基材料原有的生物活性。然而,双醛多糖与胶原两种大分子之间发生化学反应的复杂和不稳定性,让孔径调控变得异常困难,无法获得符合孔径要求的异构双层结构。
因此,探明双醛多糖与胶原之间的反应机理,找寻合理稳定的胶原基屏障膜的孔径调控策略,开发一种具有我国自主知识产权,具有异构双层结构、可控生物降解速率、较强机械性能以及引导成骨分化能力的胶原基屏障膜具有重大的意义。
发明内容
本发明针对现有技术的缺陷,提供了一种异构双层胶原基屏障膜及其制备方法和应用。本发明以胶原为基材,采用双醛多糖作为交联剂,采用溶剂蒸发和冷冻干燥相结合的方式制备异构双层胶原基屏障膜。在保留胶原生物相容性的同时,通过交联剂增强胶原膜的机械性能,创新的制备工艺可以稳定调控屏障膜的孔径,有利于大规模的工业化应用,解决了现有的技术难题,获得了具有有异构双层结构、可控生物降解速率、较强机械性能以及引导成骨分化能力的胶原基屏障膜。
为了实现以上发明目的,本发明采取的技术方案如下:
(1)胶原基溶液的制备:
将胶原溶于醋酸溶液中得到胶原溶液,调节胶原溶液pH至5~8;在冰浴下将双醛多糖溶液缓慢加入到胶原溶液中,混合均匀得到胶原基屏障膜溶液,转速下离心去除气泡备用;
(2)双层胶原基屏障膜的制备:
将无气泡的胶原基屏障膜溶液倒入模具中,蒸发溶剂,然后向模具中再加入无气泡的胶原基屏障膜溶液,在液氮中冷冻后冷冻干燥得到双层胶原基屏障膜。
本发明优选的技术方案为:
(1)胶原基溶液的制备:将胶原溶于0.1~1M的醋酸溶液中得到质量分数为0.1%~2%的胶原溶液,使用0.25~3M的氢氧化钠溶液调节载药胶原溶液pH至5~8。将醛基含量为0.5~5mmol/g的双醛多糖溶于去离子水中,得到质量浓度为0.05%~1%的双醛多糖溶液。在冰浴下将1体积份双醛多糖溶液缓慢加入到10~50体积份的胶原溶液中,混合均匀得到胶原基屏障膜溶液,在500~10000rpm的转速下离心1~10min去除气泡备用。
(2)双层胶原基屏障膜的制备:将上述1体积份无气泡的胶原基屏障膜溶液倒入模具中,在30~50℃下蒸发溶剂4~48h,然后向模具中再加入0.1~2体积份无气泡的胶原基屏障膜溶液,在液氮中冷冻30~240S后冷冻干燥得到双层胶原基屏障膜。
进一步的,所述胶原为Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅲ型胶原、Ⅳ型胶原中的任意一种。
作为优选,所述双醛多糖为双醛黄原胶、双醛纤维素、双醛淀粉、双醛环糊精、双醛羧甲基纤维素、双醛壳聚糖、双醛卡拉胶中的任意一种。
与现有技术相比,本发明的优点在于:
(1)本发明以生物相容性良好的天然高分子胶原为基材,使所制备的屏障膜避免了生物毒性,具有良好的组织的贴合性,同时胶原降解产生的氨基酸具有促骨生长的作用;
(2)本发明采用大分子交联剂双醛多糖用于提高胶原基屏障膜的机械性能,在保留胶原原有的优势的同时,提升其物化性能,避免小分子醛类交联剂的生物毒性。
(3)本发明采用溶剂蒸发和冷冻干燥相结合的方式制备异构双层胶原基屏障膜,避免胶原与双醛多糖两种大分子反应的不稳定性,可以稳定调控屏障膜的孔径,有利于工业放大生产。
附图说明
图1为实施例双层屏障膜实物图;
图2为实施例双层屏障膜SEM图片;
图3为实施例屏障膜的不同表面在不同时间点的水接触角;
图4(A1)为实施例屏障膜的多孔层AFM形貌表征之一;
图4(A2)为实施例屏障膜的多孔层AFM形貌表征之二;
图4(B1)为实施例屏障膜的致密层AFM形貌表征之一;
图4(B2)为实施例屏障膜的致密层AFM形貌表征之二。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下列举实施例,对本发明做进一步详细说明。
实施例1
(1)胶原基溶液的制备:将Ⅰ型胶原溶于0.5M的醋酸溶液中得到质量分数为0.8%的胶原溶液,使用0.25M的氢氧化钠溶液调节载药胶原溶液pH至5。将醛基含量为2mmol/g的双醛壳聚糖溶于去离子水中,得到质量浓度为0.3%的双醛壳聚糖溶液。在冰浴下将1体积份双醛壳聚糖溶液缓慢加入到10体积份的Ⅰ型胶原溶液中,混合均匀得到胶原基屏障膜溶液,在500rpm的转速下离心5min去除气泡备用。
(2)双层胶原基屏障膜的制备:将上述1体积份无气泡的胶原基屏障膜溶液倒入模具中,在37℃下蒸发溶剂12h,然后向模具中再加入0.2体积份无气泡的胶原基屏障膜溶液,在液氮中冷冻60S后冷冻干燥得到双层胶原基屏障膜。
实施例2
(1)胶原基溶液的制备:将Ⅱ型胶原溶于0.1M的醋酸溶液中得到质量分数为0.5%的胶原溶液,使用1M的氢氧化钠溶液调节载药胶原溶液pH至6。将醛基含量为4mmol/g的双醛环糊精溶于去离子水中,得到质量浓度为0.5%的双醛环糊精溶液。在冰浴下将1体积份双醛环糊精溶液缓慢加入到50体积份的Ⅱ型胶原溶液中,混合均匀得到胶原基屏障膜溶液,在2000rpm的转速下离心4min去除气泡备用。
(2)双层胶原基屏障膜的制备:将上述1体积份无气泡的胶原基屏障膜溶液倒入模具中,在40℃下蒸发溶剂24h,然后向模具中再加入0.5体积份无气泡的胶原基屏障膜溶液,在液氮中冷冻100S后冷冻干燥得到双层胶原基屏障膜。
实施例3
(1)胶原基溶液的制备:将Ⅲ型胶原溶于0.5M的醋酸溶液中得到质量分数为1%的胶原溶液,使用2M的氢氧化钠溶液调节载药胶原溶液pH至7。将醛基含量为5mmol/g的双醛羧甲基纤维素溶于去离子水中,得到质量浓度为1%的双醛羧甲基纤维素溶液。在冰浴下将1体积份双醛羧甲基纤维素溶液缓慢加入到40体积份的Ⅲ型胶原溶液中,混合均匀得到胶原基屏障膜溶液,在5000rpm的转速下离心6min去除气泡备用。
(2)双层胶原基屏障膜的制备:将上述1体积份无气泡的胶原基屏障膜溶液倒入模具中,在50℃下蒸发溶剂48h,然后向模具中再加入1体积份无气泡的胶原基屏障膜溶液,在液氮中冷冻180S后冷冻干燥得到双层胶原基屏障膜。
本发明提供以下实验数据:
如图1所示,双层屏障膜实物图可以看出其具有良好的柔韧性,可应用于患部。
如图2所示,微观SEM图可以看出屏障膜呈现明显的双层结构,表层孔径较小有利于阻隔结缔组织细胞,底层孔径较大为成骨细胞生长提供位点。
如图3所示,水接触角可以表征表面的亲疏水性,致密层接触角大于90°表现出疏水性,多孔层接触角小于90°表现出亲水性,亲水性能好更有利于细胞的浸润生长。
如图4(A1)、图4(A2)、图4(B1)、图4(B2)所示,AFM可以表征表面的粗糙度,多孔层的表面粗糙度更高,更高的表面粗糙度,可以为细胞提供更多的粘附位点,促进细胞生长。
本领域的普通技术人员将会意识到,这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的实施方法,应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合,这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种异构双层胶原基屏障膜的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
采用生物相容性良好的天然高分子胶原作为基材,以无生物毒性的双醛多糖作为交联剂,通过双醛多糖的醛基与胶原的氨基之间的席夫碱反应进行交联,采用溶剂挥发与冷冻干燥相结合的方式制备双层胶原基屏障膜,对孔径实现稳定调控。
2.根据权利要求1所述的一种异构双层胶原基屏障膜的制备方法,其特征在于,具体包括如下步骤:
(1)胶原基溶液的制备:
将胶原溶于醋酸溶液中得到胶原溶液,调节胶原溶液pH至5~8;在冰浴下将双醛多糖溶液缓慢加入到胶原溶液中,混合均匀得到胶原基屏障膜溶液,转速下离心去除气泡备用;
(2)双层胶原基屏障膜的制备:
将无气泡的胶原基屏障膜溶液倒入模具中,蒸发溶剂,然后向模具中再加入无气泡的胶原基屏障膜溶液,在液氮中冷冻后冷冻干燥得到双层胶原基屏障膜。
3.根据权利要求2所述的一种异构双层胶原基屏障膜的制备方法,其特征在于:所述胶原为Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅲ型胶原、Ⅳ型胶原中的任意一种。
4.根据权利要求2所述的一种异构双层胶原基屏障膜的制备方法,其特征在于:所述双醛多糖为双醛黄原胶、双醛纤维素、双醛淀粉、双醛环糊精、双醛羧甲基纤维素、双醛壳聚糖、双醛卡拉胶中的任意一种。
5.根据权利要求2所述的一种异构双层胶原基屏障膜的制备方法,其特征在于:步骤(1)中各物质的用量按照以下比例:
采用0.1~1M的醋酸溶液溶解胶原,得到质量分数为0.1%~2%的胶原溶液;
将醛基含量为0.5~5mmol/g的双醛多糖溶于去离子水中,得到质量浓度为0.05%~1%的双醛多糖溶液;
在冰浴下将1体积份双醛多糖溶液缓慢加入到10~50体积份的胶原溶液中。
6.根据权利要求2所述的一种异构双层胶原基屏障膜的制备方法,其特征在于:步骤(1)中使用0.25~3M的氢氧化钠溶液调节胶原溶液pH;
在500~10000rpm的转速下离心1~10min去除气泡。
7.根据权利要求2所述的一种异构双层胶原基屏障膜的制备方法,其特征在于:步骤(2)中,物质的量按照以下配比:将1体积份无气泡的胶原基屏障膜溶液倒入模具中,蒸发溶剂后向模具中再加入0.1~2体积份无气泡的胶原基屏障膜溶液。
8.根据权利要求2所述的一种异构双层胶原基屏障膜的制备方法,其特征在于:步骤(2)中,在30~50℃下蒸发溶剂4~48h,在液氮中冷冻30~240S后冷冻干燥。
9.根据权利要求1到8任一项所述的制备方法获得的一种异构双层胶原基屏障膜。
10.根据权利要求9所述的一种异构双层胶原基屏障膜的应用,其特征在于:作为骨缺损修复的材料。
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