CN109337094A - 一种离子液体辅助酶解法制备水凝胶的方法 - Google Patents

一种离子液体辅助酶解法制备水凝胶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种离子液体辅助酶解法制备水凝胶的方法。该方法以胶原蛋白和1‑乙基‑3‑甲基咪唑乙酸为原料,采用物理交联法制得离子液体水相共溶体系即胶原蛋白/1‑乙基‑3‑甲基咪唑乙酸聚合物,然后在制备的溶液中加入氢氧化钠溶液和微生物转谷氨酰胺酶,在37℃反应完成后通过高温90℃灭火微生物转谷氨酰胺酶,最后通过溶剂交换、透析等步骤制得水凝胶材料,该材料具有30~100℃的温度敏感性、1~10KPa的压缩强度和4~6个月的降解时间,可作为一种新型的智能水凝胶材料。

Description

一种离子液体辅助酶解法制备水凝胶的方法
技术领域
本发明涉及一种用离子液体辅助酶解法制备的一种用作皮肤填充材料的水凝胶及其制备方法,属于生物化工领域。
背景技术
水凝胶是一种高分子网络体系,性质柔软,能保持一定的形状,能吸收大量的水。人体面部美容整形主要有修正皱纹、改善面部轮廓、填平凹陷瘢痕或唇部、修复受伤的组织等,适合人体组织结构,其要求水凝胶不吸收、不脱落、不碎裂,在弥散的环境下能很好地保持水分,有较好的粘度、弹性和柔软度。当水凝胶被移植到生物体后,由于组织损伤程度不同,很难满足修复的效果;当水凝胶注射到生物体后,如果水凝胶是环境敏感型的,比如温度敏感型,在室温下呈溶胶状,当温度达到人体温度后,水凝胶能形成凝胶,能维持形态且具有良好的生物相容性。因此,可注射式水凝胶作为组织填充材料,其研究、发展和应用具有不可估量的市场前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种用作皮肤填充材料的水凝胶及其制备方法,采用离子液体辅助酶解法制备更具生物相容性、安全性更高的皮肤填充材料。
本发明实现过程如下:
一种离子液体辅助酶解法制备水凝胶的方法,包括以下步骤:
(1)将胶原蛋白类物质溶于磷酸盐缓冲溶液中,然后加入1-乙基-3-甲基咪唑乙酸[EMIM] [AC]离子液体溶液,质量百分比浓度为15%~30%的胶原蛋白类物质溶液与1-乙基-3-甲基咪唑乙酸[EMIM] [AC]的质量比为(1~6):1,反应温度为0~25℃,反应时间为1~3h;
(2)加入氢氧化钠溶液调节溶液的pH为7.2~7.6,反应温度为20~30℃,反应时间为0.5~1h;
(3)加入交联剂,交联剂与胶原蛋白类物质的质量比是1:(6~10),反应温度为0~25℃,反应时间为0.5~1h,pH调节到8.0;
(4)将反应液放于37℃恒温水浴锅中6~12h,然后置于80~90℃灭活微生物转谷氨酰胺酶,采用蒸馏水或磷酸盐缓冲溶液进行溶剂交换或透析制得水凝胶。
步骤(1)中,所述胶原蛋白类物质为类人胶原蛋白,或从动物组织中提取的胶原蛋白。
步骤(2)中,加入氢氧化钠溶液调节溶液的pH为7.4,氢氧化钠溶液的浓度为0.1~0.5mol/L,优选为0.35mol/L。
步骤(3)中,交联剂为微生物转谷氨酰胺酶,交联剂溶液的质量分数为20%~30%,优选为25%。
本发明所涉及的离子液体辅助酶解法制备水凝胶,是将离子液体(1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐离子液体([EMIM] [AC])),胶原蛋白和交联剂(微生物转谷氨酰胺酶)结合起来制成的皮肤填充材料,由于[EMIM] [AC]可以较好的封闭酶液而不被破坏,进而提高了酶液的活性。 MTGase 可以催化不同蛋白的聚合,其催化活性改变蛋白底物的空间结构。胶原蛋白在 MTGase 的作用下,部分蛋白链发生降解或聚合,然而未降解的分子链和聚合的分子链在适当的条件下可发生希夫碱式反应,形成复杂的嵌段聚合物。MTGase 在一定的温度和pH范围内表现为独特的敏感性。因此,为了研究胶原蛋白合成软材料,发明人在水体系中加入离子液体[EMIM] [AC],充分溶解胶原蛋白,形成离子液体水相共溶体系,改变胶原蛋白的螺旋结构。MTGase 在水凝胶体系中扮演辅助交联和酶解胶原胶原蛋白分子链的作用。因此,采用离子液体辅助酶解方法制成的水凝胶与非离子参与的水凝胶相比,具有稳定性良好、生物学效价高、降解时间较长和无毒副作用的优点,从而真正实现皮肤填充的优势,而且水凝胶随温度变化实现溶胶-凝胶的转变过程,最终达到增强皮肤弹性和美容的目的。
附图说明
图1为水凝胶的红外光谱图;图中,横轴为波数(cm-1),纵轴为透过率(%),1号线为微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)曲线,2号线为胶原蛋白(HLC)曲线,3号线为离子液体([EMIM] [AC])曲线,4号线为胶原蛋白/离子液体(HLC/[EMIM] [AC])曲线,5号线为微生物转谷氨酰胺酶/离子液体(MTGase/[EMIM] [AC])曲线,6号线为Gel3曲线,7号线为Gel1曲线,8号线为Gel2曲线,9号为鱼骨胶原蛋白/微生物转谷氨酰胺酶(FBC/MTGase)曲线,10号为鱼骨胶原蛋白/微生物转谷氨酰胺酶/离子液体(FBC/MTGase/[EMIM] [AC])曲线,11号为鱼骨胶原蛋白(Fish bone collagen(FBC))曲线;
图2为水凝胶的样品图。图中,图A中,Gel1和Gel2为离子液体辅助酶解法制备的水凝胶的照片图,Gel3为胶原蛋白与微生物转谷氨酰胺酶水凝胶的样品图,图B为鱼骨胶原蛋白/微生物转谷氨酰胺酶(Gel4)和鱼骨胶原蛋白/微生物转谷氨酰胺酶/离子液体(Gel5)制备水凝胶的照片图,图C为Gel1,Gel2和Gel3,Gel4和Gel5通过溶剂交换、透析等步骤制得水凝胶图,图D 为离子液体与微生物转谷氨酰胺酶反应后的样品,图E为离子液体和胶原胶原蛋白反应后的样品;
图3为水凝胶的扫描电镜图;图中,图1号为离子液体与微生物转谷氨酰胺酶反应后的扫描电镜图(左:放大250倍,右:放大100倍),2号为离子液体和胶原蛋白反应后的扫描电镜图(左:放大250倍,右:放大100倍),3号为胶原蛋白与微生物转谷氨酰胺酶水凝胶Gel3的扫描电镜图(左:放大250倍,右:放大100倍),4号和5号分别为胶原蛋白采用离子液体辅助酶解法制备的水凝胶(Gel1和Gel2)的扫描电镜图(左:放大250倍,右:放大100倍),6号为鱼骨胶原蛋白与与微生物转谷氨酰胺酶制备的水凝胶(Gel4)(左:放大250倍,右:放大100倍),7号为为鱼骨胶原蛋白采用离子液体辅助酶解法制备的水凝胶(Gel5)的扫描电镜图(左:放大250倍,右:放大100倍);
图4为水凝胶注射于小鼠皮下图;图中,A为Gel3注射于小鼠皮下1周后的图,B为Gel1注射于小鼠皮下1周后的图,C为Gel2注射于小鼠皮下1周后的图,D为Gel4注射于小鼠皮下1周后的图,E为Gel5注射于小鼠皮下1周后的图,F为Gel3注射于小鼠皮下6周后的图,G为Gel1注射于小鼠皮下6周后的图,H为Gel2注射于小鼠皮下6周后的图,I为Gel4注射于小鼠皮下6周后的图,J为Gel5注射于小鼠皮下6周后的图,K为Gel3注射于小鼠皮下16周后的图,L为Gel1注射于小鼠皮下16周后的图,M为Gel2注射于小鼠皮下16周后的图,N为Gel4注射于小鼠皮下16周后的图,O为Gel5注射于小鼠皮下16周后的图;
图5为水凝胶的单次抗压缩数据图;A图中,1号线为Gel3的压缩曲线,压缩应力为3KPa,2号线为Gel1的压缩曲线,压缩应力为4.8KPa,3号线为Gel2的压缩曲线,压缩应力为7.5KPa,B图中,1号线为Gel4的压缩曲线,压缩应力为2KPa,2号线为Gel5的压缩曲线,压缩应力为6.5KPa;
图6为本发明反应原理过程图;
图7为水凝胶注射于小鼠皮下后1(第一列),6(第二列)和16周(第三列)后,取皮下组织及材料的透射电镜图;图中数字1代表成纤维细胞,2代表巨噬细胞,3代表脂滴,gel代表皮下注射的水凝胶。第一行为注射生理盐水后的皮下组织和材料的透射电镜图,第二行为注射Gel1后的皮下组织和材料的透射电镜图,第三行为注射Gel2后的皮下组织和材料的透射电镜图,第四行为注射Gel3后的皮下组织和材料的透射电镜图,第五行为注射Gel4后的皮下组织和材料的透射电镜图,第六行为注射Gel5后的皮下组织和材料的透射电镜图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。
本发明所涉及的一种离子液体辅助酶解法用作皮肤填充材料的水凝胶,以胶原蛋白、离子液体1-乙基-3-甲基咪唑乙酸([EMIM] [AC])和微生物转谷氨酰胺酶为原料,采用离子液体辅助酶解法交联,反应结束后,将反应液放入37℃下静态放置12h,在90℃灭火酶后经过溶剂交换,透析制备得到水凝胶。
将离子液体作为原始材料的良好溶剂,改变原始材料的柔性结构特征,应用柔性分子与柔性分子对接中的一些新的思路和进展。离子液体[EMIM] [AC]具有低的粘度、低溶点、无毒和生物可降解性,广泛应用在工业领域。鉴于[EMIM] [AC]可以较好的封闭酶液而不被破坏,进而提高了酶液的活性以及MTGase催化不同蛋白的聚合效率是不同的,其催化活性对蛋白底物的空间结构有影响。胶原蛋白在MTGase的作用下,部分蛋白链发生降解或聚合,然而未降解的分子链和聚合的分子链在适当的条件下可发生希夫碱式反应,形成复杂的嵌段聚合物。MTGase在一定的温度和pH范围内表现为独特的敏感性。因此,为了研究胶原胶原蛋白合成软材料,我们在水体系中加入离子液体[EMIM] [AC],充分溶解胶原胶原蛋白,改变胶原胶原蛋白的螺旋结构。MTGase在水凝胶体系中扮演辅助交联和酶解胶原胶原蛋白分子链的作用。离子液体在水凝胶体系中扮演着保持胶原胶原蛋白完整结构的溶剂和催化酶液的活性的作用。
胶原蛋白本身具有良好的生物相容性和可降解性,其本身没有温度敏感的性质,通过化学/物理交联制备得到的水凝胶具有温度敏感性,在室温下呈溶胶状,即可以注射到要填充部位,当水凝胶在人体温度环境下自发形成凝胶,其稳定性高,不吸收,不脱落,不碎裂,有较好的粘度,弹性和柔软度,且有良好的生物相容性,适合用于组织填充。
具体制备方法如下:
步骤一:称取胶原蛋白溶于磷酸盐缓冲溶液中,然后向胶原蛋白溶液中加入1-乙基-3-甲基咪唑乙酸([EMIM] [AC])离子液体溶液,令胶原蛋白溶液的质量百分比浓度为15~30%,反应温度控制为0~25℃,在搅拌条件下反应1~3h;
步骤二:逐滴加入氢氧化钠溶液调节溶液的pH,氢氧化钠与1-乙基-3-甲基咪唑乙酸([EMIM] [AC])的体积比为1:1时,所得溶液的pH为7.4,反应温度控制为20~30℃,在搅拌条件下反应0.5~1h;
步骤三:加入交联剂,交联剂与胶原蛋白的质量比是1:(6~10),反应温度控制为0~25℃,在搅拌条件下反应0.5~1h;调节溶液pH为8.0。
步骤四:将反应液放于37℃恒温水浴锅中6~12h,然后置于80~90℃灭活微生物转谷氨酰胺酶5~15分钟,采用蒸馏水或磷酸盐缓冲溶液进行溶剂交换或透析8~12h制得水凝胶制得水凝胶。
其中,离子液体溶液为1-乙基-3-甲基咪唑乙酸( [EMIM] [AC]),质量体积分数为60~80mg/mL,优选80mg/mL。氢氧化钠的浓度为0.1~0.5mol/L,优选0.5mol/L。交联剂为微生物转谷氨酰胺酶,交联剂溶液的质量分数为20%~30%,优选20%。
实施例1:
步骤一:称取胶原蛋白溶于磷酸盐缓冲溶液中,然后向胶原蛋白溶液中加入1-乙基-3-甲基咪唑乙酸([EMIM] [AC])离子液体溶液,令胶原蛋白溶液的质量百分比浓度为15%,反应温度控制为25℃,在搅拌条件下反应3h;
步骤二:逐滴加入氢氧化钠溶液调节溶液的pH,氢氧化钠与1-乙基-3-甲基咪唑乙酸([EMIM] [AC])的体积比为1:1时,所得溶液的pH为7.4,反应温度控制为20℃,在搅拌条件下反应1h;
步骤三:加入微生物转谷氨酰胺酶,微生物转谷氨酰胺酶与胶原胶原蛋白的质量比是1:6,反应温度控制为20℃,在搅拌条件下反应0.50h;调节溶液pH为8.0。
步骤四:将反应液放于37℃恒温水浴锅中12h,然后置于90℃灭活微生物转谷氨酰胺酶5分钟,采用PBS进行溶剂交换12h制得水凝胶Gel1。
实施例2:
步骤一:称取胶原蛋白溶于磷酸盐缓冲溶液中,然后向胶原蛋白溶液中加入1-乙基-3-甲基咪唑乙酸([EMIM] [AC])离子液体溶液,令胶原蛋白溶液的质量百分比浓度为30%,反应温度控制为4℃,在搅拌条件下反应1h;
步骤二:逐滴加入氢氧化钠溶液调节溶液的pH,氢氧化钠与1-乙基-3-甲基咪唑乙酸([EMIM] [AC])的体积比为1:1时,所得溶液的pH为7.4,反应温度控制为30℃,在搅拌条件下反应1h;
步骤三:加入微生物转谷氨酰胺酶,微生物转谷氨酰胺酶与胶原胶原蛋白的质量比是1:10,反应温度控制为4℃,在搅拌条件下反应1h;调节溶液pH为8.0。
步骤四:将反应液放于37℃恒温水浴锅中6h,然后置于90℃灭活微生物转谷氨酰胺酶30分钟,采用蒸馏水透析12h制得水凝胶Gel2。
实施例3:
步骤一:称取胶原蛋白溶于磷酸盐缓冲溶液中,然后向胶原蛋白溶液中加入微生物转谷氨酰胺酶,微生物转谷氨酰胺酶与胶原蛋白的质量比是:1:6,反应温度控制为25℃,在搅拌条件下反应1h;
步骤二:将反应液放于37℃恒温水浴锅中12h,然后置于90℃灭活微生物转谷氨酰胺酶5分钟,采用蒸馏水进行溶剂交换12h制得水凝胶Gel3。
实施例4:
步骤一:称取鱼骨胶原蛋白溶于磷酸盐缓冲溶液中,然后向鱼骨胶原蛋白溶液中加入微生物转谷氨酰胺酶,微生物转谷氨酰胺酶与鱼骨胶原蛋白的质量比是:1:7,反应温度控制为4℃,在搅拌条件下反应1h;
步骤二:将反应液放于37℃恒温水浴锅中12h,然后置于90℃灭活微生物转谷氨酰胺酶30分钟,采用蒸馏水透析12h制得水凝胶Gel4。
实施例5:
步骤一:称取鱼骨胶原蛋白溶于磷酸盐缓冲溶液中,然后向鱼骨胶原蛋白溶液中加入1-乙基-3-甲基咪唑乙酸([EMIM] [AC])离子液体溶液,令鱼骨胶原蛋白溶液的质量百分比浓度为30%,反应温度控制为4℃,在搅拌条件下反应3h;
步骤二:逐滴加入氢氧化钠溶液调节溶液的pH,氢氧化钠与1-乙基-3-甲基咪唑乙酸([EMIM] [AC])的体积比为1:1时,所得溶液的pH为7.4,反应温度控制为20℃,在搅拌条件下反应0.5h;
步骤三:加入微生物转谷氨酰胺酶,微生物转谷氨酰胺酶与鱼骨胶原蛋白的质量比是1:8,反应温度控制为25℃,在搅拌条件下反应1h;调节溶液pH为8.0。
步骤四:将反应液放于37℃恒温水浴锅中12h,然后置于90℃灭活微生物转谷氨酰胺酶5分钟,采用PBS进行溶剂交换12h制得水凝胶Gel5。
对以上实施例的产物进行红外光谱分析、扫描电镜分析、样品观察、压缩实验、动物皮下注射填充,细胞毒性检验,其分析结果如下:
1、实施例1,2,3,4和5中水凝胶填充材料的红外光谱分析如图1所示,在图4号线中,胶原蛋白在离子液体水相共溶体系中,部分官能团发生变化,可能改变了胶原胶原蛋白的螺旋结构。在图5号线中,离子液体与微生物转谷氨酰胺酶的反应可以看出,3号线中单纯的MTGase 1170cm-1和1450cm-1处的吸收峰与5号线相比,吸收强度明显减弱,可能由于[EMIM] [AC]可以较好的封闭酶液而不被破坏,进而提高了酶液的活性。与纯的胶原胶原蛋白、微生物转谷氨酰胺酶的C=O吸收峰(1644 cm-1,1644 cm-1,1646 cm-1)相比,实施例1,2和5中的水凝胶的C=O(1619cm-1)吸收峰发生蓝移,且在1413 cm-1处有新的吸收峰,是酰胺键(-RCONHR’)的C-N伸缩振动的吸收峰。实施例1,2和5中的水凝胶光谱图中,1619 cm-1和2625cm-1处吸收峰是新生成的铵盐(-RNH2 +)的吸收峰。因此,离子液体参与的水凝胶如实施例1,2,5中,水凝胶中部分蛋白链发生降解或聚合,然而未降解的分子链和聚合的分子链在适当的条件下可发生希夫碱式反应,形成复杂的嵌段聚合物。
2、实施例1,2,3,4和5中水凝胶填充材料的样品如图2所示,表面形貌结果显示:离子液体1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐与微生物转谷氨酰胺酶聚合物([EMIM][AC]/MTGase)发生反应后,离子液体包裹酶液,增加了酶的活性;离子液体1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐与胶原胶原蛋白聚合物([EMIM][AC]/HLC)发生反应后,胶原胶原蛋白溶液的粘度增加,并有形成凝胶的趋势;实施例1和2中,当用离子液体辅助酶修饰胶原胶原蛋白溶液后,形成聚合物(HLC/[EMIM][AC] / MTGase),表面光滑,有弹性,而且水凝胶柔性适中,趋向透明的类似果冻状水凝胶。在HLC/[EMIM][AC]/MTGase配比比较,可以看出不同配比对水凝胶的表面形貌、表面粗糙和可塑性能有影响。实施例3中,胶原胶原蛋白溶液与微生物转谷氨酰胺酶(HLC/MTGase)发生反应后,可形成类似于果冻状乳白色水凝胶,表面比较粗糙,容易破碎;实施例4中,水凝胶表面比较粗糙,颜色呈乳白色;实施例5中,水凝胶表面比较粗糙,颜色呈乳黄色,有弹性。
3、实施例1,2,3,4和5中水凝胶填充材料的扫描电镜分析如图3所示,离子液体1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐与微生物转谷氨酰胺酶转移酶([EMIM][AC]/MTGase)聚合物在pH为8.0,37℃下反应聚合物的组成结构,发生部分酶液聚集的物质;离子液体1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐与胶原胶原蛋白聚合物([EMIM][AC]/HLC)断面结构可以看出是由椭球形状的纤维样组成,与胶原胶原蛋白的结构发生明显的改变,推测胶原胶原蛋白的空间构象已改变;实施例1和2中聚合物(HLC/[EMIM][AC]/MTGase)断面结构呈均匀分布的多孔结构,孔的连续性较好。实施例3中胶原胶原蛋白溶液与微生物转谷氨酰胺酶(HLC/MTGase)断面结构呈不均匀的多孔结构,孔的连续性较差;实施例4中,孔径小,表面分布不均匀;实施例5中,孔径较大,表面分布均匀,但孔的连续性差。
4、实施例1,2,3,4和5中水凝胶填充材料注射于小鼠皮下分析如图4所示,相同之处在于在第一周水凝胶存在于小鼠皮下;第六周水凝胶存在于小鼠皮下,略微有些降解;不同之处在于实施例1,2和5中第十六周水凝胶残留大部分,小部分已经降解完;实施例3和4中水凝胶大部分已经降解完。实施例1,2,3,4和5中水凝胶填充材料注射于小鼠皮下16周后观察,都成乳白色的类似于果冻状的水凝胶。
5、图5为实施例1,2,3,4和5中水凝胶的抗压缩数据图。分为单次压缩。实施例1中水凝胶的压缩应力为4.8KPa,实施例2中水凝胶的压缩应力为7.5KPa,实施例3中水凝胶的压缩应力为3KPa,实施例4中水凝胶的压缩应力为2KPa,实施例5中水凝胶的压缩应力为6.5KPa。结果说明离子液体参与的水凝胶的抗压缩强度要明显高于非离子液体参与的水凝胶。
6、辅助酶参与的离子液体/胶原胶原蛋白水凝胶的合成原理,胶原蛋白类物质在离子液体水相共溶体系中,改变了蛋白的空间结构,其溶液的pH为7.4。然后在溶液pH为8.0条件下,MTGase交联剂加入体系中,离子液体可以间接封闭酶而提高酶的活性,然而使蛋白分子链独特的结构与MTGase进行对接,使整个水凝胶体系柔性结构突出,在控制工艺参数的条件下合成理想的软材料,并成功制备多功能敏感性水凝胶,如图6所示。
7、图7为实施例1,2,3,4和5中水凝胶注射于小鼠皮下后1(第一列),6(第二列)和16周(第三列)后,取皮下组织及材料的透射电镜图。图中数字1代表成纤维细胞,2代表巨噬细胞,3代表脂滴,gel代表皮下注射的水凝胶。第一行为注射生理盐水后的皮下组织和材料的透射电镜图,第二行为注射实施例3后的皮下组织和材料的透射电镜图,第三行为注射实施例1后的皮下组织和材料的透射电镜图,第四行为注射实施例2后的皮下组织和材料的透射电镜图,第五行为注射实施例4后的皮下组织和材料的透射电镜图,第六行为注射实施例5后的皮下组织和材料的透射电镜图。实施例1,2,3,4和5图中第一周,水凝胶材料对小鼠皮下有轻微的炎症反应,在第6周的时候,炎症细胞数量达到最大值,在16周,水凝胶已经完全适应皮下组织,具有良好的生物相容性。其中与非离子液体参与的水凝胶比较,离子液体参与的水凝胶的降解时间较长,炎症反应减弱,能够更好的适应皮下组织。
实施例1,2,3,4和5水凝胶的细胞毒性检测数据结果显示,HLC为胶原胶原蛋白,FBC为鱼骨胶原蛋白,MTGaSe为微生物转谷酰胺转移酶,[EMIM] [AC]为离子液体1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐。从细胞生存率可以了解与非离子液体参与的水凝胶(实施例3)比较,离子液体参与的水凝胶(实施例1,2)的细胞毒性减弱,没有显著性差异。与单纯的HLC和MTGaSe比较,非离子液体参与的水凝胶(实施例3)的细胞毒性减小,具有显著性差异(P<0.05)。与单纯的HLC、MTGaSe和[EMIM] [AC]比较,离子液体参与的水凝胶(实施例1,2)的细胞毒性减小,具有显著性差异(P<0.05)。然而鱼胶原蛋白参与的水凝胶(实施例4,5)没有显著性差异。根据国标ISO10993.12-2005,离子液体参与的水凝胶浸提液中细胞增殖速率最后都达到100%以上,其细胞毒性等级可被划分为0级。
本发明制得的离子液体参与的水凝胶和非离子液体参与的水凝胶填充材料用于成年雌性ICR小鼠的动物实验表明:用离子液体辅助酶解法制备出的水凝胶如实施例1,2和5中,具有较好的生物相容性和组织相容性,无细胞毒性,且降解慢,适合用于组织填充。
本发明内容不限于实施例所列举,本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换,均为本发明的权利要求所涵盖。

Claims (9)

1.一种离子液体辅助酶解法制备水凝胶的方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)将胶原蛋白类物质溶于磷酸盐缓冲溶液中,然后加入1-乙基-3-甲基咪唑乙酸[EMIM] [AC]离子液体溶液,质量百分比浓度为15%~30%的胶原蛋白类物质溶液与1-乙基-3-甲基咪唑乙酸[EMIM] [AC]的质量比为(1~6):1,反应温度为0~25℃,反应时间为1~3h;
(2)加入氢氧化钠溶液调节溶液的pH为7.2~7.6,反应温度为20~30℃,反应时间为0.5~1h;
(3)加入交联剂,交联剂与胶原蛋白类物质的质量比是1:(6~10),反应温度为0~25℃,反应时间为0.5~1h,调节pH到8.0;
(4)将反应液放于37℃恒温水浴锅中6~12h,然后置于80~90℃灭活微生物转谷氨酰胺酶,采用蒸馏水或磷酸盐缓冲溶液进行溶剂交换或透析制得水凝胶。
2.根据权利要求1所述制备水凝胶的方法,其特征在于:步骤(1)中,所述胶原蛋白类物质为类人胶原蛋白,或从动物组织中提取的胶原蛋白。
3.根据权利要求1所述制备水凝胶的方法,其特征在于:步骤(2)中,氢氧化钠溶液的浓度为0.1~0.5mol/L。
4.根据权利要求3所述制备水凝胶的方法,其特征在于:氢氧化钠溶液的浓度为0.35mol/L。
5.根据权利要求1所述制备水凝胶的方法,其特征在于:加入氢氧化钠溶液调节溶液的pH为7.4。
6.根据权利要求1所述制备水凝胶的方法,其特征在于:步骤(3)中,交联剂为微生物转谷氨酰胺酶,交联剂溶液的质量分数为20%~30%。
7.根据权利要求6所述制备水凝胶的方法,其特征在于:交联剂的质量分数为25%。
8.使用权利要求1所述制备水凝胶的方法获得的水凝胶。
9.权利要求8所述水凝胶在制备皮肤填充材料中的应用。
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