JP4448552B1 - ゲル状集合体中への物質の混合方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ゲル状集合体を凍結すること、凍結した集合体を融解してゾルを得ること、得られたゾルと混合対象物とを混合すること、および混合対象物が混合されたゾルからゲル状集合体を再形成することを含む、ゲル状集合体中に混合対象物を混合する方法。
【選択図】なし
Description
ゲル状集合体を凍結すること、
凍結した集合体を融解してゾルを得ること、
得られたゾルと混合対象物とを混合すること、および
混合対象物が混合されたゾルからゲル状集合体を再形成することを含む。
好ましい実施形態においては、上記ゲル状集合体が、自己集合性分子が分子集合することによって形成されたゲルである。
好ましい実施形態においては、上記ゲル状集合体が、粘土鉱物が集合することによって形成されたゲルである。
好ましい実施形態においては、上記自己集合性分子が、自己集合性ペプチドである。
本発明の別の局面によれば、混合対象物が混合されたゲル状集合体の製造方法が提供される。該方法は、
ゲル状集合体を凍結すること、
凍結した集合体を融解してゾルを得ること、
得られたゾルと混合対象物とを混合すること、および
混合対象物が混合されたゾルからゲル状集合体を再形成することを含む。
(1)ゲル状集合体
「ゲル状集合体」とは、自己集合性分子または自己集合性を有する結晶が、媒質中において自発的に集合することによって形成されたゲルをいう。
(2)自己集合性分子
「自己集合性分子」とは、媒質中において、分子同士の相互作用を介して自発的に集合する分子をいう。このような分子は、分子間引力により自発的に凝集し、秩序正しく、安定に、共有結合によらずに分子集団を形成(いわゆる、分子集合)し得る。相互作用としては、特に限定されず、例えば、水素結合、イオン間相互作用、ファンデルワールス力等の静電的相互作用、疎水性相互作用が挙げられる。
(3)ゲル
「ゲル」とは、流動性を失ったコロイドである。ゲルは、粘性的な性質と弾性的な性質とを併せ持つ。具体的には、例えば、動的粘弾性測定を行なって、貯蔵弾性率G’及び損失弾性率G’’を測定したときに、「G’>G’’」となるものをいう。
(4)ゾル
「ゾル」とは、流動性を有するコロイドである。具体的には、例えば、動的粘弾性測定を行なって、貯蔵弾性率G’及び損失弾性率G’’を測定したときに、「G’<G’’」となるものをいう。
(5)ゾル‐ゲル転移
「ゾル‐ゲル転移」とは、貯蔵弾性率G’と損失弾性率G’’が「G’>G’’」である状態から「G’<G’’」である状態、または「G’<G’’」である状態から「G’>G’’」である状態へ転移する現象をいい、該現象が生じる温度をゾル‐ゲル転移点という。すなわち、ゾル‐ゲル転移点は「G’=G’’」となる点である。
本発明の混合方法は、ゲル状集合体中に混合対象物を混合する方法であって、
ゲル状集合体を凍結すること(凍結工程)、
凍結した集合体を融解してゾルを得ること(融解工程)、
得られたゾルと混合対象物とを混合すること(混合工程)、および
混合対象物が混合されたゾルからゲル状集合体を再形成すること(ゲル化工程)を含む。該方法は、必要に応じて、任意の工程をさらに含んでもよい。ゲル状集合体が、自己集合性分子が分子集合することによって形成されたゲルである場合、凍結融解することにより、分子間の結合が切断されてゲルを構成する三次元網目構造が崩壊するので、分子が均一に分散したゾルが得られ得る。また、ゲル状集合体が、自己集合性を有する結晶が集合することによって形成されたゲルである場合、凍結融解することにより、結晶間の結合が切断されて、結晶が均一に分散したゾルが得られ得る。本発明においては、このようにして得られた均一性の高いゾルと混合対象物とを混合するので、再形成されたゲル状集合体の内部においては、混合対象物が均一に分散された状態で存在し得る。凍結融解という極めて簡易な操作でゲル状集合体中に均一に混合対象物を混合し得ることは、本発明の大きな効果の1つである。
ゲル状集合体としては、凍結融解によってゾルを形成し、可逆的なゾル−ゲル転移特性を有する限り、任意の適切な集合体が採用され得る。凍結融解によってゾルを形成した後のゲルへの転移は、時間応答性、温度応答性、圧力応答性のいずれによるものであってもよく、また上記応答性のうち2つ以上の要因によるものであってもよい。ゲル状集合体は、該集合体を形成する分子または結晶と、媒質と、必要に応じて任意の添加物を含む。
アミノ酸配列:a1b1c1b2a2b3db4a3b5c2b6a4
(該アミノ酸配列中、a1〜a4は、塩基性アミノ酸残基であり;b1〜b6は、非電荷極性アミノ酸残基および/または疎水性アミノ酸残基であり、ただし、そのうちの少なくとも5個は、疎水性アミノ酸残基であり;c1およびc2は、酸性アミノ酸残基であり;dは、疎水性アミノ酸残基である。)
n−RLDLRLALRLDLR−c(配列番号1)
n−RLDLRLLLRLDLR−c(配列番号2)
n−RLDLRLALRLDLRL−c(配列番号3)
融解温度は、上記凍結した集合体が融解してゾルを形成する温度であれば、任意の適切な温度に設定され得る。一定の温度で融解してもよく、異なる温度で段階的に融解してもよい。融解速度および時間に制限はなく、徐々に融解してもよく、急速に融解してもよい。例えば、自己集合性ペプチドのゾルを得る場合は、好ましくは5〜70℃、さらに好ましくは15〜45℃の温度条件下に凍結した自己集合性ペプチドを置くことで好適に融解を行い得る。
混合対象物は、目的等に応じて、任意の適切な物質が選択され得る。混合対象物の具体例としては、ビタミン類;単糖;二糖;オリゴ糖;ヒアルロン酸、キトサン、親水化セルロース等の多糖類;アルコール;グリセリン、プロピレングリコール等のポリオール;ジルコニア、酸化チタン等の金属酸化物;色素;ホルモン、サイトカイン、造血因子、増殖因子等の生理活性物質;ペプチド;酵素;抗体;DNA;RNA;触媒;架橋剤;培養液;その他一般的な低分子化合物が挙げられる。また、混合対象物は、細胞、細胞群、組織、微生物、ウイルス等の生物試料であってもよい。細胞は、動物細胞であっても、植物細胞であってもよい。微生物としては、例えば、細菌、酵母、原生動物が挙げられる。混合対象物は1種のみを用いてもよく、2種以上用いてもよい。
ゲルの再形成条件(温度、時間等)は、ゲル状集合体が再形成される限り制限はなく、分子または結晶の種類および濃度、媒質の種類等に応じて適切に設定され得る。ゾル中に含まれる分子が自己集合性分子である場合、適切な条件に設定することにより、分子集合によってゲルが自発的に再形成され得る。
本発明の別の局面によれば、混合対象物が混合されたゲル状集合体の製造方法が提供され得る。該製造方法は、ゲル状集合体を凍結すること、凍結した集合体を融解してゾルを得ること、得られたゾルと混合対象物とを混合すること、および混合対象物が混合されたゾルからゲル状集合体を再形成することを含む。各工程については、上記B項で記載したとおりである。該製造方法によれば、混合対象物が均一に混合されたゲル状集合体が得られ得る。
常法により、N末端をアセチル化し、C末端をアミド化した自己集合性ペプチド1([CH3CO]−RLDLRLALRLDLR−[NH2])を得た。該自己集合性ペプチド1を水に溶解し、NaHCO3水溶液を終濃度が1.2mMとなるように加えた。得られたペプチド溶液中のペプチド濃度は1w/v%であった。該ペプチド溶液を室温で10分静置し、自己集合性ペプチドゲルを得た。
自己集合性ペプチドゲルとして、商品名「BDTM PuraMatrixTM ペプチド ハイドロゲル」(BD Biosciences社、ペプチド濃度:1w/v%、pH3)を用いた。
試験例1と同様にして得た自己集合性ペプチドゲルに超音波処理(製品名「超音波洗浄機 US−4R」(アズワン社製、槽内体積9.5L)、160W、30分間)を施すことにより、ゾルを得た。得られたゾル300μlを、3.25×105cells/mlの濃度でNIH3T3細胞を含むDMEM培地200μlが入った容器に加え、ピペッティングを3回行って混合することにより、細胞が混合されたゾルを得た。
試験例2と同様の自己集合性ペプチドゲルに超音波処理(製品名「超音波洗浄機 US−4R」(アズワン社製、槽内体積9.5L)、160W、30分間)を施すことにより、ゾルを得た。得られたゾル300μlを、5.38×105cells/mlの濃度でNIH3T3細胞を含むDMEM培地200μlが入った容器に加え、ピペッティングを3回行って混合することにより、細胞が混合されたゾルを得た。
上記自己集合性ペプチド1を水に溶解し、NaHCO3水溶液を終濃度が1.2mMとなるように加えた。得られたペプチド溶液中のペプチド濃度は0.8w/v%であった。該ペプチド溶液を室温で10分静置し、自己集合性ペプチドゲルを得た。
自己集合性ペプチドゲルとして、商品名「BDTM PuraMatrixTM ペプチド ハイドロゲル」(BD Biosciences社、ペプチド濃度:1w/v%、pH3)を用いた。
フェノールレッドを含むDMEM培地の代わりに50μM FITC標識インスリン水溶液を混合したこと以外は実施例1と同様にして、自己集合性ペプチドゲルを再形成した。再形成されたゲルの写真を図3に示す。
エオシン水溶液の代わりに50μM FITC標識インスリン水溶液を混合したこと以外は実施例2と同様にして、自己集合性ペプチドゲルを再形成した。再形成されたゲルの写真を図4に示す。
凍結融解する代わりに超音波処理(製品名「超音波洗浄機 US−4R」(アズワン社製、槽内体積9.5L)、160W、30分間)をしてゾルを得たこと以外は実施例1と同様にして、自己集合性ペプチドゲルを再形成した。再形成されたゲルの写真を図1に示す。
凍結融解する代わりに超音波処理(製品名「超音波洗浄機 US−4R」(アズワン社製、槽内体積9.5L)、160W、30分間)をしてゾルを得たこと以外は実施例2と同様にして、自己集合性ペプチドゲルを再形成した。再形成されたゲルの写真を図2に示す。
凍結融解する代わりに超音波処理(製品名「超音波洗浄機 US−4R」(アズワン社製、槽内体積9.5L)、160W、30分間)をしてゾルを得たこと以外は実施例3と同様にして、自己集合性ペプチドゲルを再形成した。再形成されたゲルの写真を図3に示す。
凍結融解する代わりに超音波処理(製品名「超音波洗浄機 US−4R」(アズワン社製、槽内体積9.5L)、160W、30分間)をしてゾルを得たこと以外は実施例4と同様にして、自己集合性ペプチドゲルを再形成した。再形成されたゲルの写真を図4に示す。
商品名「ラポナイトXLG」(ラポート社製)を6w/v%の濃度で含むゲル状集合体(媒質:水)を液体窒素で凍結した。次いで、凍結した集合体を37℃の温水で一部融解し、その後室温で静置して融解することにより、ゾルを得た。得られたゾルを25℃で5時間静置することにより、ゲル状集合体を再形成した。
商品名「ラポナイトXLG」(ラポート社製)を2w/v%の濃度で含むゲル状集合体(媒質:0.75重量%界面活性剤(商品名「OS−14」、日光ケミカルズ社製)および1.0重量%EDTA−2Na含有水溶液)液体窒素で凍結した。次いで、凍結した集合体を37℃の温水で一部融解し、その後室温静置して融解することにより、ゾルを得た。得られたゾルを25℃で15分静置することにより、ゲル状集合体を再形成した。
配列番号2は、本発明に使用され得る自己集合性ペプチドである。
配列番号3は、本発明に使用され得る自己集合性ペプチドである。
Claims (5)
- ゲル状集合体を凍結すること、
凍結した集合体を融解してゾルを得ること、
得られたゾルと混合対象物とを混合すること、および
混合対象物が混合されたゾルからゲル状集合体を再形成することを含む、ゲル状集合体中に混合対象物を混合する方法。 - 前記ゲル状集合体が、自己集合性分子が分子集合することによって形成されたゲルである、請求項1に記載の方法。
- 前記ゲル状集合体が、粘土鉱物が集合することによって形成されたゲルである、請求項1に記載の方法。
- 前記自己集合性分子が、自己集合性ペプチドである、請求項2に記載の方法。
- ゲル状集合体を凍結すること、
凍結した集合体を融解してゾルを得ること、
得られたゾルと混合対象物とを混合すること、および
混合対象物が混合されたゾルからゲル状集合体を再形成することを含む、混合対象物が混合されたゲル状集合体の製造方法。
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