CN103502262B - 基于双头两亲性肽的自组装水凝胶 - Google Patents

基于双头两亲性肽的自组装水凝胶 Download PDF

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Abstract

我们公开了具有作为头部基团的肽序列的双头两亲物。我们还公开了由所述双头两亲性肽制备的自组装水凝胶。这些水凝胶可用于包封生物活性物质并递送至患者体内。

Description

基于双头两亲性肽的自组装水凝胶
技术领域
本发明涉及双头两亲性肽。本发明还涉及由双头两亲性肽制备的自组装水凝胶。
背景技术
蛋白质和细胞例如干细胞的治疗性递送目前通过或者内吸性给药或者在损伤部位弹丸式注射而实现。在两种情况下，只有相对较小百分比的活性物质保留在损伤部位，而大部分活性物质最终留在其它器官，如肝脏和肺。其中活性物质保留在损伤部位的方法允许较低的剂量、较少的副作用以及潜在的高活性。
细胞和蛋白质递送的目前方法包括微球、物理吸附到基质如泡沫以及共价连接到此类基质。通常这些方法与精细组织如大脑和心脏所需的由小号针递送相容。水凝胶具有的有益效果是它们可变形并且在一些情况下可以原位形成。然而，水凝胶形成的主要机制是通过光交联或自由基交联，它们二者都对会对蛋白质和细胞造成损伤。已报道了一些与细胞和蛋白质相容的方法。已报道了酶促交联凝胶和通过迈克尔加成而交联形成的凝胶，然而形成速率使得这些凝胶需要异位预成形，然后引入原位。
自组装肽体系具有的有益效果是在适当设计时，它们在异位可处于液体状态，并且在原位与体液接触时迅速转变为凝胶状态。由于胶凝机制基于非共价相互作用，因此预期对蛋白质和细胞无害。已报道了基于具有交替疏水性和带电残基的肽的体系由于肽之间的β折叠型氢键相互作用而自组装。这些体系的潜在缺点是依赖于电荷的微妙平衡，其限制了可接近的序列的范围。基于芴甲氧羰基保护的二苯基丙氨酸的水凝胶通过注射溶于六氟异丙醇(不期望的溶剂)的肽溶液制备，可能还令人担忧的是肽降解时芴甲氧羰基保护基团的毒性。已报道了一种变体，其中芴甲氧羰基保护的苯基丙氨酸通过酶连接到苯基丙氨酸。潜在缺点是对酶的潜在免疫应答和反应速率降低。已报道了基于β发夹肽的体系通过剪切稀释引入并穿过插管，随后再形成。最后，也已报道了基于形成β-折叠的肽序列的水凝胶和基于α-螺旋肽的卷曲螺旋的水凝胶。最后，已对线性两亲性肽开展广泛研究，该线性两亲性肽为C-或N-端用烷基尾部官能化的肽。这些体系的优点是尾部疏水折拢的附加能量增益稳定了体系。肽头部基团可支化的线性分子(单头部、单C6-C22尾部)和双亲水基两亲物(头部-尾部-头部排列)已有所描述。该体系的缺点是通常需要二价离子的超生理浓度或大幅pH变化来诱导胶凝。此外，这些凝胶未显示出剪切稀释行为。
有四种主要两亲物：线性两亲物(单头部、单尾部)、双亲水基两亲物(头部-尾部-头部)、双子两亲物(两个头部基团、两个尾部)和双头两亲物(两个头部基团、一个尾部)。已有研究表明这些种类彼此相比表现出不同的聚集行为。双子和双头两亲物的优点是它们是“预聚合的”，因此在低临界聚集浓度下形成稳定的聚集体。已报道了基于多个带正电的肽的双子两亲物用作基因转染试剂。三种双头两亲物体系在下文中有所描述。报道的第一种体系包含具有二磷酸头部基团的两亲物，其形成矩形胶束聚集体。两种其它体系具有铵或糖头部基团，并且形成胶束。
鉴于上述水凝胶的缺点，仍然需要用于生物活性物质递送的替代水凝胶。具体地，需要易于小号针递送的、在生理条件下递送后胶凝的、并且对生物活性物质没有不利影响的原位胶凝自组装水凝胶。
发明内容
本文中我们描述了具有作为头部基团的肽序列的双头两亲物。这些双头两亲性肽用于制备自组装水凝胶。肽头部基团诱导胶凝，并且增加两亲物在水溶液中的溶解度，而疏水性尾部用于稳定水凝胶。此外，这些水凝胶可用于包封生物活性物质并递送至患者体内。
附图说明
图1：示例性双头两亲性肽的化学绘图。
图2：双头尾部合成的示意图。
图3：2重量％溶于DMEM的Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gln-Gln-SerDPA的自承凝胶。
图4：示出Val-Ala-Val-Ala-Val-Ala-Glu-Glu-GluDPA的可能结合钙基团的化学结构。
图5：增溶区和包含β-折叠型氢键单元或π-π堆叠单元的自组装诱导区中具有Glu-Gly-Glu序列的水凝胶的G’的比较。
图6：溶于PBS的增溶区中具有不同极性、不带电氨基酸的凝胶的时间扫描比较。
图7：溶于DMEM的增溶区中不同极性、不带电氨基酸的时间扫描比较。
图8：溶于DMEM的增溶区中不同极性、不带电氨基酸的应变扫描比较。
图9：Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Glu-Gly-GluDPA凝胶中hUTC的细胞活力。
图10：培养3周后Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gln-Gln-SerDPA凝胶中hUTC细胞的细胞活力。插图示出了“死亡”图像，主图示出了活细胞。
图11：培养3周后Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gln-Gln-SerDPA凝胶中hKDC细胞的细胞活力。
图12：培养3周后Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-SerDPA凝胶中IMAC细胞的细胞活力。
图13：第7周测试品的组织结构。
具体实施方式
本文中我们描述了形成自组装水凝胶的双头两亲性肽(DPA)。双头两亲性肽的通式结构以下式1示出：
烃链的长度以n表示，为至少6，并且X为肽序列，例如表1中示出的SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：8、SEQIDNO：10、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16和SEQIDNO：17。在一个实施例中，n在约6至约22的范围内。在另一个实施例中，n在约12至约18的范围内。
双头两亲性肽具有疏水性尾部和两个肽头部基团。疏水性尾部在自组装后为水凝胶提供了稳定化作用，并且两个头部基团(上式1的X)具有肽序列。肽序列具有自组装诱导区和增溶区(图1)，其中尾部连接到自组装诱导区的N-端。自组装诱导区提供了定向次级相互作用，以诱导纤维形成和胶凝，该区域具有至少4个氨基酸。在一个实施例中，自组装诱导区具有约6个至约9个氨基酸。在另一个实施例中，自组装诱导区为肽序列，例如SEQIDNO：18、SEQIDNO：19、SEQIDNO：20、SEQIDNO：21、SEQIDNO：22和SEQIDNO：24。
自组装诱导区提供的定向次级相互作用包括但不限于β-折叠型氢键和π-π堆叠相互作用。具有β-折叠型氢键相互作用的自组装诱导区的一个例子为Val-Ala-Val-Ala-Val-Ala。具有π-π堆叠型相互作用的芳族序列包括Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly、Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly、Gly-Tyr-Gly-Tyr-Gly-Tyr-Gly、Gly-Trp-Gly-Trp-Gly-Trp-Gly等等。最后一个序列不产生凝胶，但形成了大型聚集体。基于β-折叠型氢键相互作用和π-π堆叠相互作用的两种两亲物引起水凝胶形成，然而，与相同浓度的两亲物下β-折叠氢键相互作用驱使DPA制得的水凝胶相比，π-π堆叠相互作用驱使DPA制得的水凝胶显示出流变性大一个数量级。在一个实施例中，自组装诱导区提供了π-π堆叠相互作用，并且具有肽序列Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe。
增溶区能够使双头两亲性肽溶解，并且在水凝胶形成的动力学中发挥作用。增溶区具有至少1个氨基酸，并且在一个实施例中，具有至少3个氨基酸。在另一个实施例中，增溶区具有3个氨基酸。增溶区具有富含可提高DPA在溶液中，例如在水、磷酸盐缓冲盐水、DMEM等等中的溶解度的极性残基的肽序列。增溶区的合适肽序列包括但不限于Glu-Gly-Glu、Glu-Glu-Glu、Gln-Gln-Ser、Asn-Asn-Ser、Gln-Gly-Ser、Gly-Gln-Ser、Asn-Gly-Ser、Gly-Asn-Ser、Glu-Gly-Ser和Lys-Gly-Ser。Lys-Ala肽序列带有测试的自组装诱导区被证明不溶，因此只寻找具有3个或更多个极性氨基酸的肽序列。所有基于Glu和Lys的排列需要超生理二价离子浓度来诱导胶凝。然而，所有基于极性、不带电氨基酸的序列(如基于Asn、Gln和Ser的序列)在二价离子的生理浓度下形成凝胶。在一个实施例中，增溶区是肽序列，例如SEQIDNO：26、SEQIDNO：27、SEQIDNO：28、SEQIDNO：29、SEQIDNO：30、SEQIDNO：31、SEQIDNO：32、SEQIDNO：33、SEQIDNO：34和SEQIDNO：35。
本领域的技术人员可认识到，增溶区可用显示生物活性的肽序列延长。
双头两亲性肽用三步法制备。首先，通过脂肪酰氯(具有对应于式1中的n的烃链长度)与2-氨基-丙二酸二甲酯反应，然后酯水解生成游离酸而制备双头尾部。在第二步中，使用固态肽合成技术，通过人工或自动合成制备肽序列。在第三步中，使用1∶2的尾部∶肽摩尔比，将双头尾部连接到仍然在树脂上的肽。引人注目的是，尝试制备每个尾部只有一个肽的变体未成功，可能是因为双头型是熵驱动的。最后，将双头两亲性肽从树脂切下，并在单个步骤中通过用三氟乙酸(TFA)处理，移除肽侧链上的保护基团。然后将分子溶解于水中，并且在pH6-8下冻干以除去残余的酸。
双头两亲性肽形成的水凝胶在异位表现出流体样特性，而在原位转变为包封生物活性物质的水凝胶，而不会变性或换句话讲对生物活性物质的活性造成负面影响。这些水凝胶可用于通过小号插管治疗性递送生物活性物质。然后，凝胶会使生物活性物质保持在损伤部位，使生物活性物质能够发挥它们的治疗作用。
在一个实施例中，通过如下方式制备水凝胶：将双头两亲性肽以所需最终水凝胶浓度的两倍溶解于pH为约5至约9的水溶液(水、磷酸盐缓冲盐水等)中，然后与生理盐溶液(例如磷酸盐缓冲盐水、汉克斯平衡盐溶液、达尔伯克氏改良伊格尔培养基)、细胞培养基(前述生理盐溶液和血清的混合物)或生理体液(例如滑液、脊髓液)混合。在另一个实施例中，通过将双头两亲性肽溶解于生理盐溶液中直接制备显示出剪切稀释行为的水凝胶。最终双头两亲性肽浓度可在约1重量％直到溶解度极限的范围内。离子的浓度应使得其足以中和增溶区中的电荷。在一个实施例中，使用4重量％双头两亲性肽水溶液以及与生理盐溶液的1∶1比率混合液，但是其它比率也可使用，只要离子的浓度足以中和肽的增溶区的电荷。在水中，末端酸基团之间的静电排斥对自组装起到部分反作用，从而形成小组装体。在混合时发生胶凝，因为离子屏蔽表面电荷，导致纤维伸长，然后胶凝。流变学比较显示盐浓度影响形成的动力学。
在可供选择的实施例中，可通过选择pH使得末端氨基酸带电来溶解双头两亲性肽。然后，可通过调整pH使得增溶区中末端氨基酸的电荷被中和来诱导胶凝。
在又一个实施例中，使用任何所述方法混合具有不同肽序列的两个或更多个双头两亲性肽，并且诱导成凝胶。可在DPA中混合，其自身不形成凝胶，只要它们是少数组分(＜50％总DPA)。
以1∶1的比率在二价离子的生理浓度下混合可使凝胶在40-60秒内形成。当使用PBS时，在＞4重量％的浓度下在2-3分钟内发生胶凝，而在超生理二价离子浓度下，立即发生胶凝。最后，当涡旋凝胶时，制剂液化，并且在3-5分钟内再形成凝胶。使DPA的最终浓度从1增加至2至4重量％可使每个步骤中的流变性呈数量级增加。因此，增溶区中极性氨基酸和离子浓度之间的匹配主要控制形成的动力学，而自组装区域(仅氢键相对于π-π堆叠)的性质和分子浓度控制最终流变性。凝胶的流变性随时间的推移持续提高，反映了凝胶的动态性质：初始动力学被困结构以热力学更稳定的形式重组。在30-60分钟后，似乎获得接近最佳的结构。
在形成动力学实验中，增溶区中各种极性、不带电氨基酸的比较显示，Asn-Asn-Ser序列达到最高流变性，然后是Gln-Gly-Ser，最后是Gln-Gln-Ser。然而，在应变扫描实验中，Asn-Asn-Ser凝胶在40％应变时开始破碎，而另外两个凝胶可应对几乎100％应变。
如上所述制备的双头水凝胶可用于以微创方式递送生物活性剂，包括但不限于细胞、蛋白质和寡核苷酸。交联的良性机制不影响合并的活性物质的生物学功能，而凝胶前体溶液的低粘度允许以微创方式引入。用生物活性物质序列延长的双头两亲性肽水凝胶也可用于捕获循环的生物活性物质、执行信号传递事件、调节细胞行为例如因子分泌等。
可被包封的合适细胞类型包括但不限于干细胞、祖细胞、原代细胞、转染细胞和无限增殖化细胞。在一个实施例中，包封人脐带组织来源细胞。在另一个实施例中，包封人肾脏来源细胞。在又一个实施例中，包封人乳动脉细胞。此外，可包封组织片段或组织糜。合适的蛋白质包括但不限于抗体和生长因子。合适的寡核苷酸包括但不限于siRNA和微RNA。
例如，细胞的递送可通过将最终浓度的两倍溶解的双头两亲性肽以1∶1的比率与细胞适宜培养基中的细胞悬浮液混合而实现。在一个实施例中，将100微升4重量％双头两亲性肽溶液与100微升包含100,000个细胞的细胞悬浮液混合。细胞浓度受到细胞悬浮液中的最大细胞密度的限制。在一个实施例中，凝胶中包封的细胞的数量在约10,000个细胞至约1,000,000个细胞的范围内。对于多种细胞类型，在三周的过程中细胞活力无显著减少。
含细胞制剂的体内递送可以多种方式实现。不限制可能性，可使用双筒注射器，其中一个室包含溶于水的双头两亲性肽溶液，另一个室包含细胞悬浮液。然后可使用单腔或双腔插管，具体取决于希望混合在何处进行。或者，可利用剪切稀释特性并且在单筒注射器中预形成凝胶。在注射时，凝胶将剪切稀释并且通过插管，然后在体内再形成。
在一个实施例中，三种不同制剂Val-Ala-Val-Ala-Val-Ala-Glu-Gly-Glu、Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Glu-Gly-Glu知Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gln-Gly-Gln的生物相容性通过将100微升凝胶注入臀肌内制作的囊袋来评估。在28天后，任何组中均未检测到凝胶。在实验过程中，Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gln-Gly-Gln制剂未显示出组织响应。然而，需要超生理钙浓度才胶凝的另外两个制剂显示出下层肌肉组织坏死。
实例
请注意除非另外指明，本文所述所有重量百分比均为重量比(w/w)。
实例1：双头尾部的合成
尾部的合成以克级规模(约5g原料)进行，并且从2-氨基-丙二酸的甲酯和棕榈酰氯起始(图2)。棕榈酰氯与2-氨基-丙二酸在氯仿中偶联，得到92％的产率。通过后续用盐酸、10％碳酸氢钠和水萃取来纯化产物。随后，通过在存在过量氢氧化钾的情况下回流2小时进行乙醇中的酯水解。通过用盐酸、饱和氯化钠溶液和水的一系列萃取进行纯化。用硫酸镁干燥有机层，但这会导致形成凝胶样混合物，而不是标准硫酸镁水合物沉淀。尝试过滤硫酸镁水合物未成功。因此，用水吹打混合物以除去硫酸镁水合物，然后过滤沉淀，并用乙醚洗涤沉淀以除去痕量的水。双头尾部的最终收率为56％。
实例2：人工固相肽合成
从0.25mmol预装的王氏树脂(100-200目)起始，在肽合成容器中使树脂在二氯甲烷中溶胀1小时。随后，重复脱保护和氨基酸偶联步骤的循环，直到所有氨基酸残基已偶联。通过加入5cc20％溶于二甲基甲酰胺(DMF)的哌啶，振荡5分钟，然后排出脱保护混合物来实现脱保护。对总共三个脱保护步骤重复两次。在N-甲基吡咯烷酮(NMP)洗涤后，通过如下方式偶联：使1mmol(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐)(HBTU)溶解于5ccNMP中，随后将其加入到1mmol氨基酸。将混合物在室温下温育5分钟，然后加入0.3cc二异丙基乙胺。然后将混合物加入树脂，振荡1小时。在NMP洗涤后，进行下一个循环。
在所有氨基酸加入后，通过如下步骤加入尾部。将70mgHBTU溶解于5ccNMP中，并且加入到40mg尾部(如实例1所述制备)中。短暂超声处理混合物，以促进尾部的溶解。然后，加入0.1cc二异丙基乙胺，将混合物加入肽合成容器中的含肽树脂中。振荡18小时后，排出偶联混合物，加入新鲜混合物，然后再振荡18小时。排出偶联混合物后，用NMP洗涤树脂，然后用二氯甲烷洗涤两次。使树脂干燥过夜。
用10cc95％三氟乙酸(TFA)/2.5％三异丙基硅烷/2.5％水振荡3小时使侧链脱保护并从树脂上切下。然后，将TFA混合物从肽合成容器排出，收集到圆底烧瓶中。用1ccTFA洗涤树脂两次，合并级分。蒸发TFA直到只留下最小体积后，用10倍过量冷乙醚沉淀双头两亲性肽。通过过滤收集双头两亲性肽。随后通过pH调节将肽溶解于10-20cc水中。一旦双头两亲性肽完全溶解，即将pH调节至6-8，然后冻干双头两亲性肽。
实例3：自动化固相肽合成
从预装的王氏树脂(100-200目)开始，以0.25mmol规模在FocusXC合成仪(AAPPTEC，Louisville，KY)上进行自动化合成。将树脂在NMP中溶胀15分钟。脱保护通过两步进行，首先用20％溶于DMF的哌啶温育三分钟，然后用20％溶于DMF的哌啶温育10分钟。用NMP洗涤6次后，通过如下方式进行偶联：预混合3.7cc0.2M氨基酸溶液和0.2M溶于NMP的HBTU，然后加入2.4cc二异丙基乙胺。然后将混合物加入树脂，振荡30分钟。在6次NMP洗涤后，进行下一个循环。
在所有氨基酸加入后，通过如下步骤加入尾部。将70mgHBTU溶解于5ccNMP中，并且加入到40mg尾部(如实例1所述制备)中。短暂超声处理混合物，以促进尾部的溶解。然后，加入0.1cc二异丙基乙胺，将混合物加入肽合成容器中的含肽树脂中。振荡18小时后，排出偶联混合物，加入新鲜混合物，然后再振荡18小时。排出偶联混合物后，用NMP洗涤树脂，然后用二氯甲烷洗涤两次。使树脂干燥过夜。
用10cc95％三氟乙酸(TFA)/2.5％三异丙基硅烷/2.5％水振荡3-4小时使侧链脱保护并从树脂上切下。然后，将TFA混合物从肽合成容器排出，收集到圆底烧瓶中。用1ccTFA洗涤树脂两次，合并级分。蒸发TFA直到只留下最小体积后，用10倍过量冷乙醚沉淀肽。或者，完全移除TFA，用50cc二乙醚吹打剩余的双头两亲性肽30分钟。通过过滤收集双头两亲性肽。随后通过pH调节将双头两亲性肽溶解于10-20cc水中。一旦双头两亲性肽完全溶解，即将pH调节至6-8，然后冻干双头两亲性肽。
使用以上实例1-3中描述的方法合成具有表1中所示肽序列的双头两亲性肽(DPA)。
表1：
SEQ ID NO： 肽序列(式1中的X) 人工合成 自动化合成
1 Val-Ala-Val-Ala-Val-Ala-Lys-Ala 是 否
2 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Lys-Ala 是 否
3 Val-Ala-Val-Ala-Val-Ala-Glu-Glu-Glu 是 否
4 Gly-Val-Ala-Val-Ala-Val-Ala-Glu-Gly-Glu 是 否
5 Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Glu-Gly-Glu 是 是
6 Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Glu-Gly-Glu 否 是
7 Gly-Trp-Gly-Trp-Gly-Trp-Gly-Glu-Gly-Glu 否 是
8 Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gln-Gln-Ser 否 是
9 Gly-Trp-Gly-Trp-Gly-Trp-Gly-Gln-Gln-Ser 否 是
10 Gly-Tyr-Gly-Tyr-Gly-Tyr-Gly-Gln-Gln-Ser 否 是
11 Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Asn-Asn-Ser 否 是
12 Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gln-Gly-Ser 否 是
13 Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gly-Gln-Ser 否 是
14 Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Asn-Gly-Ser 否 是
15 Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gly-Asn-Ser 否 是
16 Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Glu-Gly-Ser 否 是
17 Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Lys-Gly-Ser 否 是
表2中示出的肽序列用于自组装诱导区。
表2：
SEQ ID NO： 肽序列(自组装诱导区)
18 Val-Ala-Val-Ala-Val-Ala
19 Gly-Val-Ala-Val-Ala-Val-Ala
20 Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly
21 Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly
22 Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Glu-Gly
23 Gly-Trp-Gly-Trp-Gly-Trp-Gly
24 Gly-Tyr-Gly-Tyr-Gly-Tyr-Gly
用于增溶区的肽序列在表3中示出。
表3：
SEQ ID NO： 肽序列(增溶区)
25 Lys-Ala
26 Glu-Glu-Glu
27 Glu-Gly-Glu
28 Gln-Gln-Ser
29 Asn-Asn-Ser
30 Gln-Gly-Ser
31 Gly-Gln-Ser
32 Asn-Gly-Ser
33 Gly-Asn-Ser
34 Glu-Gly-Ser
35 Lys-Gly-Ser
出于比较目的，类似于本领域中报道的那些的具有SEQIDNO：8的DPA的线性两亲性肽类似物，通过实例2中所述的自动化合成路线生成，改进之处是棕榈酸用作尾部，与树脂上的肽成1∶1的摩尔比，代替了双头尾部。此外，Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gln-Gln-Ser肽通过自动化肽合成制备。
实例4：胶凝实验
进行倒置测试，以定性确定在何种条件下多种DPA形成自承水凝胶。通过将多种类型的DPA以所需最终浓度的两倍溶解于超纯水(电阻率＞18MΩ)中，然后以1∶1的比率与不同的液体介质混合来测试所述多种类型的DPA。如果在倒置小瓶时凝胶支承其自身重量，则视为已发生胶凝(图3)。以1、2和4重量％的最终浓度测试胶凝。我们测试了用作液体介质的磷酸盐缓冲盐水(PBS)和达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)。典型的规模为100μl每种DPA水溶液和混合介质，但其它规模也已测试。最后，如果不发生自发的胶凝，则加入10μl100mg/cc氯化钙溶液，以诱导胶凝。具有肽序列Val-Ala-Val-Ala-Val-Ala-Lys-Ala和Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Lys-Ala的DPA不溶于超纯水，因此不测试。
氢键序列和π-π堆叠序列的比较
Val-Ala-Val-Ala-Val-Ala-Glu-Glu-Glu和Gly-Val-Ala-Val-Ala-Val-Al-Glu-Gly-GluDPA以在加钙的DMEM中2重量％的最低浓度形成凝胶，而Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Glu-Gly-GluDPA以1重量％的最低浓度形成凝胶(表4)。当通过倒置进行混合时，凝胶是自承性的，光学透明的，并且两个月后既不会碎裂也不会排出水分。该发现之后，受流变特性(见上)支持，专门使用基于芳族氨基酸的自组装诱导剂。
表4：
双头两亲性肽 水 DMEM 加钙
Gly-Val-Ala-Val-Ala-Val-Ala-Glu-Glu-Glu 否 否 是，2重量％
Gly-Val-Ala-Val-Ala-Val-Ala-Glu-Gly-Glu 否 否 是，2重量％
Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Glu-Gly-Glu 否 否 是，1重量％
极性、不带电增溶区的使用
在大约5分钟后，Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gln-Gln-SerDPA形成自承凝胶，在水中的浓度为4重量％。可以通过涡旋使这些凝胶破裂，然后静置时，它们会再形成。相似地，可以通过将它们溶解于PBS中而不是水中，制备质量更好的凝胶。当与DMEM混合时，在不添加补充钙离子的情况下，这些DPA在2重量％形成凝胶(表5)。可以推测，在增溶区中使用极性、不带电氨基酸，就不必使用额外的钙并允许以生理盐浓度进行胶凝。
表5：
双头两亲性肽 水 PBS DMEM
Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gln-Gln-Ser 是，4重量％ 是，4重量％ 是，2重量％
自组装诱导区中芳族氨基酸的变化。
制备Gly-Trp-Gly-Trp-Gly-Trp-Gly-Gln-Gln-SerDPA，因为预期较大的芳族部分会提供更强的π-π堆叠相互作用。然而，就Gly-Trp-Gly-Trp-Gly-Trp-Gly-Gln-Gln-Ser和Gly-Trp-Gly-Trp-Gly-Trp-Gly-Gln-Gln-SerDPA而言，在测试条件(2-4重量％，水，PBS，DMEM和DMEM加钙)下均未观察到胶凝。当Gly-Tyr-Gly-Tyr-Gly-Tyr-Gly-Gln-Gln-SerDPA与DMEM和钙混合时形成凝胶，但在水、PBS或DMEM中不会胶凝(表6)。因此，得出的结论是，就芳族堆叠效率而言，苯基丙氨酸是优选的残基。色氨酸和酪氨酸仍可以芳族氨基酸之间的不同间距发挥作用。
表6：
双头两亲性肽 水 PBS DMEM 加钙
Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gln-Gln-Ser 是，4％ 是，4％ 是，2％
Gly-Trp-Gly-Trp-Gly-Trp-Gly-Gln-Gln-Ser 否 否 否 否
Gly-Tyr-Gly-Tyr-Gly-Tyr-Gly-Gln-Gln-Ser 否 否 否 是，2％
增溶区中氨基酸序列的变化。
制备Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Asn-Asn-SerDPA，观察较短的侧链是否有利。该DPA显示出与Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gln-Gln-SerDPA相比类似的胶凝特性。此外，制备Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gln-Gly-SerDPA，测试降低分子内空间位阻是否有利。凝胶形成得更快并且看起来更坚实。进行进一步排列，包括Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gly-Gln-Ser、Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Asn-Gly-Ser和Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gly-Asn-Ser(表7)。所有这些凝胶均显示出类似的胶凝特性，证明Gln、Asn和Gly的任何排列均导致在与DMEM混合时可形成凝胶。
表7：
双头两亲性肽 水 PBS DMEM
Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gln-Gln-Ser 是，4％ 是，4％ 是，2％
Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Asn-Asn-Ser 是，2％ 是，4％ 是，2％
Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gln-Gly-Ser 否 是，2％ 是，2％
Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gly-Gln-Ser 否 否 是，2％
Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Asn-Gly-Ser 否 否 是，2％
Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gly-Asn-Ser 否 否 是，2％
双头两亲物与线性两亲物和肽的比较。
将肽和线性两亲性肽类似物与双头两亲性肽分子进行比较(表8)。在所有的测试条件下，肽未形成任何凝胶。线性两亲性肽类似物在水、PBS中或与DMEM混合时未形成凝胶，但当提供超生理浓度的钙时可发生胶凝。该结果证明了双头结构在获得上述特性方面的有益效果，并可能反映出双头两亲物的较低的临界聚集浓度。
表8：
分子 水 PBS DMEM 加钙
Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gln-Gln-Ser(肽) 否 否 否 否
Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gln-Gln-Ser(线性) 否 否 否 是，2％
Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gln-Gln-Ser(DPA) 是，4％ 是，4％ 是，2％
实例5用钙离子对双头两亲性肽酸基团进行滴定
用钙离子对Val-Ala-Val-Ala-Val-Ala-Glu-Glu-GluDPA进行滴定，以确定需要通过离子络合发生胶凝的酸基团数量。理论上，有8个酸基团(每个头部基团4个)可以参与胶凝过程(图4)。通过将钙量减半而进行的16至1当量的滴定显示，稳定凝胶形成与没有凝胶或弱凝胶形成之间的转变点发生在2和1当量的钙之间。
实例6：用流变特性评价DPA水凝胶的机械性能。
用平行板法(半径＝25mmn)对400μl凝胶进行振荡流变测试，以评价凝胶的机械强度。进行时间扫描，以评价1％的恒定应变速率和1rad/s的频率下的形成动力学。在1rad/s的恒定频率下以2％的增量进行1-100％应变范围内的应变扫描。用G’和G”的交叉确定凝胶点和破碎点。在将导致DPA水凝胶形成的溶液混合之后立即开始时间扫描。在应变扫描时，在开始测量之前使凝胶在板上形成30分钟。
芳族与非芳族自组装诱导区的比较
对1重量％和2重量％的Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Glu-Gly-GluDPA以及2重量％的Gly-Val-Ala-Val-Ala-Val-Ala-Glu-Gly-GluDPA进行时间扫描。在25℃下通过将10μl的100mg/ml氯化钙溶液加入溶于DMEM的DPA溶液中，在板上开始胶凝过程。在所有三种情况下，定义凝胶点的G’与G”之间的交叉点出现后，才开始测量。通过曲线的外推获得凝胶点的估计值为45-50秒。1分钟后，G”曲线保持平坦，但G’保持增加至少1小时，显示出凝胶的动态特性，这允许从初始动力学结构重新排列成热力学有利的结构(图5)。2重量％的Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Glu-Gly-GluDPA凝胶的G’(10分钟后4,000Pa)比1重量％的Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Glu-Gly-GluDPA(300Pa)和2重量％的Gly-Val-Ala-Val-Ala-Val-Ala-Glu-Gly-GluDPA(140Pa)大一个数量级。1小时后，2重量％的Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Glu-Gly-Glu凝胶达到7,200Pa的强度，对曲线进行进一步外推获得估计的最终强度为约10,000Pa。1小时后，温度升至37℃，由于流动性增大而导致G’下降至5,000Pa，但凝胶立即开始恢复强度。该实验证明，利用自组装诱导区中的π-π堆叠相互作用可产生更强的凝胶。此外，使最终双头两亲性肽浓度加倍，导致机械性能提高大约10倍。
溶于PBS的增溶区中具有极性不带电氨基酸的凝胶的时间扫描比较
对溶于DMEM的4重量％Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gln-Gln-Ser、Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gln-Gly-Ser和Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Asn-Asn-Ser凝胶进行时间扫描。在测量开始之前所有样品都具有转变点。如图6所示，凝胶的特性保持逐渐提高。凝胶强度的顺序似乎是增溶区中具有Asn-Asn-Ser序列的DPA＞增溶区中具有Gln-Gly-Ser序列的DPA＞增溶区中具有Gln-Gln-Ser序列的DPA。
溶于DMEM的增溶区中具有极性不带电氨基酸的凝胶的时间扫描比较
对溶于DMEM的2重量％Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gln-Gln-Ser、Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gln-Gly-Ser和Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Asn-Asn-Ser凝胶进行时间扫描(图7)。在这些样品中，具有Gln-Gly-Ser和Asn-Asn-Ser序列的DPA瞬时出现凝胶点，具有Gln-Gln-Ser序列的DPA在混合后74秒出现凝胶点。凝胶的特性持续提高，就增溶区中的DPA序列而言，强度顺序为Asn-Asn-Ser＞Gln-Gly-Ser＞Gln-Gln-Ser。
溶于DMEM的增溶区中具有极性不带电氨基酸的凝胶的应变扫描比较
对溶于DMEM的2重量％Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gln-Gln-Ser、Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gln-Gly-Ser和Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Asn-Asn-Ser凝胶进行应变扫描(图8)。实验开始之前使凝胶形成30分钟。如图8所示，增溶区中具有Asn-Asn-Ser序列的DPA凝胶具有最高的初始强度，但显示特性更快速地下降(在15％应变处开始下降，而不是33和50％处)并在其它应变(42％应变，而不是99％应变)之前再次穿过转变点。
实例5：细胞活力和增殖实验
用DPA凝胶中的hUTC细胞进行细胞活力和增殖实验
通过将人脐带细胞(hUTC)包封到凝胶中评价细胞在凝胶中的活力和增殖。如美国专利7,510,873中所述分离hUTC。从储存室取出细胞，将细胞解冻，并在Haynick培养基中培养4天。4天之后，用胰蛋白酶处理细胞，并用GuavaViaCount方法(Millipore，Billerica，MA)计数。以1,000,000细胞/毫升的密度，将细胞重悬于Hayflick培养基中。通过将100μl细胞悬浮液加入置于24孔板中的超纯水中的100μl4重量％DPA溶液中，获得2％的最终DPA浓度，从而将细胞包封到凝胶中。在37℃和5％CO2条件下将凝胶温育1小时，然后将1000μl培养基添加到凝胶顶部。在37℃和5％CO2条件下培养细胞。培养期间，每3-4天更换500μl培养基。
用Gly-Val-Ala-Val-Ala-Val-Ala-Glu-Gly-Glu和Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe- Gly-Glu-Gly-GluDPA凝胶进行细胞实验
通过上下吸取将细胞悬浮液与4％DPA溶液混合之后，通过加入使胶凝发生的10μl100mg/ml氯化钙溶液修改上文所述的方案。在DPA中的最终浓度为2％，100,000个细胞。使用纯培养基制备没有细胞的对照凝胶，制备另外的单独细胞和具有氯化钙的细胞的对照作为标准2D培养物。培养7天之后，用Live/Dead测定法测定凝胶的细胞活力，用(Invitrogen)CyQuantGR测定法测定凝胶的细胞增殖(Invitrogen，Carlsbad，CA)。如所提供的方案中所述进行Live/Dead测定，但溴化乙锭浓度减半，以减少由于染料吸收而产生的非特异性荧光。细胞对照显示主要是活细胞，只有少量死细胞。凝胶中的细胞包含大量活细胞(图9)。凝胶中未观察到死细胞。因此，这些细胞在凝胶中的活力非常高(＞95％)。
用Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gln-Gln-SerDPA凝胶进行细胞实验
在第二个实验中，将100,000hUTC细胞包封到2重量％Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gln-Gln-SerDPA凝胶中。将细胞培养3周，并在1、2和3周后用Live/Dead对细胞进行评价。在所有时间点，检测到数量非常有限的死细胞，显示在整个时间段内活力保持良好(图10)。
人肾脏来源(hKDC)细胞在Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gln-Gln-Ser DPA凝胶中的细胞活力
通过将人肾脏来源细胞(hKDC)包封在凝胶中评价细胞在凝胶中的活力和增殖。如美国专利公布2008/0112939中所述分离hKDC。从储存室取出细胞，将细胞解冻，并在肾上皮细胞生长培养基(REGM)中培养4天。4天之后，用胰蛋白酶处理细胞，并用GuavaViaCount(Millipore，Billerica，MA)方法计数。以1,000,000细胞/毫升的密度，将细胞重悬于REGM培养基中。通过将100μl细胞悬浮液加入置于24孔板中的超纯水中的100μl4重量％DPA溶液中，获得2％的最终DPA浓度，从而将细胞包封到凝胶中。在37℃和5％CO2条件下将凝胶温育1小时，然后将1000μl培养基添加到凝胶顶部。在37℃和5％CO2条件下培养细胞。培养期间，每3-4天更换500μl培养基。将细胞培养3周，并在1、2和3周后用Live/Dead对细胞进行评价。在所有时间点，检测到数量非常有限的死细胞，显示在整个时间段内活力保持良好(图11)。
内乳动脉(IMAC)细胞在Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gln-Gln-SerDPA 凝胶中的细胞活力
通过将人内乳动脉来源细胞(IMAC)包封在凝胶中评价细胞在凝胶中的活力和增殖。如共同未决的美国专利申请12/885855中所述分离IMAC。从储存室取出细胞，将细胞解冻，并在改进的DMEM/F12培养基中培养4天。4天之后，用胰蛋白酶处理细胞，并用GuavaViaCount(Millipore，Billerica，MA)方法计数。以1,000,000细胞/毫升的密度，将细胞重悬于改进的DMEM/F12培养基中。通过将100μl细胞悬浮液加入置于24孔板中的超纯水中的100μl4重量％DPA溶液中，获得2％的最终DPA浓度，从而将细胞包封到凝胶中。在37℃和5％CO2条件下将凝胶温育1小时，然后将1000μl培养基添加到凝胶顶部。在37℃和5％CO2条件下培养细胞。培养期间，每3-4天更换500μl培养基。将细胞培养3周，并在1、2和3周后用Live/Dead对细胞进行评价。在所有时间点，检测到数量非常有限的死细胞，显示在整个时间段内活力保持良好。IMAC细胞看起来在这些凝胶中具有高运动性，如IMAC细胞在凝胶中形成的通道所证明。在三周实验的过程中，通道的数量显著增加，表明它们持续在凝胶中移动(图12)。
生物相容性研究
对Gly-Val-Ala-Val-Ala-Val-Ala-Glu-Gly-Glu、Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Glu-Gly-Glu和Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-Gln-Gln-SerDPA进行生物相容性研究。在1.5cc的聚丙烯冷冻管中以15KGy对冻干的DPA粉末进行电子束灭菌。通过将用于注射的4重量％DPA水溶液以1∶1的比率与DMEM混合，然后立即吸入1cc注射器中，从而在注射器中预形成凝胶。就增溶区中具有Glu-Gly-Glu序列的制剂而言，在吸入注射器之前混入10μl无菌的100mg/cc氯化钙溶液。在斯普拉-道来大鼠的臀肌内制作囊袋，然后用装配到注射器上的导管注射100μl凝胶。随后，用以商品名VICRYL(Ethicon，Somerville，NJ)销售的羟基乳酸聚合物910缝合线缝合囊袋。在植入后第3、7和28天收获组织。大体观察显示，第3天有一些流体积累，但在其它时间点未再观察到此现象。28天之后，未再检测到支架。在增溶区中具有Glu-Gly-Glu序列的样品中，观察到下面的组织层有一些坏死。具有Gln-Gln-Ser序列的材料显示在组织学中具有最小的免疫应答(图13)。这证明，胶凝在生理盐浓度下而非在超生理盐浓度下具有有益效果。
结果和结论总结
当将Gln-Gln-Ser双头两亲性肽与线性两亲性肽类似物和肽类似物比较时，线性两亲性肽类似物需要超生理离子浓度，而肽类似物根本不会胶凝。因此，与同一种肽的其它结构类似物相比，双头结构看起来是有利的。此外，因为在生物相容性研究中观察到具有超生理盐浓度的测试品造成组织坏死，而在生理盐浓度下形成的双头两亲性肽凝胶没有此类坏死，所以证明这些体系具有有益效果。使用极性、不带电氨基酸能获得在此类条件下形成凝胶的双头两亲性肽体系。利用自组装诱导区中的π-π堆叠相互作用能获得机械性能有所提高的凝胶。凝胶的剪切稀释行为和凝胶在剪切稀释后的再形成是有利的，可便于施加到体内。最后，已证明的是，可以包封多种密度的多种细胞类型并且它们在至少三周的时间内仍然存活。

Claims (4)

1.一种具有下式的双头两亲性肽：
其中n等于至少6，并且X为选自以下的肽序列：SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16。
2.根据权利要求1所述的双头两亲性肽，其中n在6至22的范围内。
3.根据权利要求2所述的双头两亲性肽，其中n在12至18的范围内。
4.一种水凝胶，包含权利要求1所述的双头两亲性肽。
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