PT2078073E

PT2078073E - Células derivadas do rim e métodos de utilização na reparação e regeneração de tecidos

Info

Publication number: PT2078073E
Application number: PT78526514T
Authority: PT
Inventors: Anna Gosiewska; David C Colter; Agnieszka Seyda; Charito S Buensuceso
Original assignee: Ethicon Inc
Priority date: 2006-10-12
Filing date: 2007-10-11
Publication date: 2013-11-11
Also published as: DK2078073T3; EP2078073B1; US10413571B2; US20080112939A1; EP2078073A1; CA2673521A1; US10500230B2; CN101595212A; JP2010506563A; ES2432395T3; AU2007308168B2; PL2078073T3; US20160375062A1; WO2008045498A1; SI2078073T1; AU2007308168A1; CA2673521C; CN101595212B; JP5450072B2

Description

DESCRIÇÃO

CÉLULAS DERIVADAS DO RIM E MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO NA REPARAÇÃO E REGENERAÇÃO DE TECIDOS

REFERÊNCIA PARA PEDIDO RELACIONADO

Este pedido reivindica o beneficio do Pedido Provisório US n° 60/829238, apresentado em 12 de Outubro de 2006.

CAMPO A invenção refere-se genericamente a populações de células derivadas de rim humano isoladas ou purificadas a partir de tecido renal de mamifero. A invenção relaciona-se, ainda, com métodos para o isolamento e purificação da população de células derivadas de rim humano. A população de células da presente invenção para utilização num método para o tratamento de doenças nos rins também é fornecida.

ANTECEDENTES

Insultos nefrotóxicOs e isquemia no rim levam à insuficiência renal aguda e que na maioria das vezes se manifesta como necrose tubular aguda. A recuperação da função renal após falha renal aguda está dependente da substituição das células tubulares necróticas, com epitélio tubular funcional. Além disso, uma resposta proliferativa pronunciada do endotélio capilar glomerular e peritubular é observada após a lesão isquémica. A ausência ou a redução da regeneração epitelial e endotelial pode predispor o paciente a cicatrizes tubulointersticiais e doença renal crónica. A origem das células renais recentemente geradas é principalmente indefinida, mas, por analogia com outros órgãos, células pluripotentes especificas de órgãos (isto 1 é, as células estaminais renais) têm sido sugeridas como precursoras de novas células. No entanto, está a faltar a identificação de células progenitoras renais adultas. Bussolati et al, American J. of Pathology, 166: 545-555, 2005. A evidência não é determinante para demonstrar o isolamento e cultura de células progenitoras renais. No entanto, alguns laboratórios têm feito algumas tentativas para identificar e isolar essas células. Por exemplo, um estudo em roedores mostrou que a papila renal é um nicho para células estaminais do rim adulto. Outras experiências demonstraram que as células renais papilares isoladas possuem um certo grau de diferenciação multipotencial quando injetadas diretamente no córtex renal, enxertam no parênquima renal. Estes resultados sugerem que a papila renal é um nicho para uma população de células progenitoras renais envolvidas na manutenção e reparação renal. No entanto, a existência deste nicho progenitor em rins humanos permanece para ser determinada. Oliver et al, J. of Clinicai Investigation, 114: 795-804, 2004. Pedido PCT W02005/021738.

As células progenitoras humanas putativas foram isoladas a partir de tecido renal de rins de cadáver. O isolamento destas células foi baseado na separação magnética de grânulos de células tendo como alvo a superfície do marcador CD133. Outras experiências mostraram que as células renais derivadas CD133+ têm a capacidade para se expandir em cultura e diferenciar in vitro em células epiteliais ou endoteliais. Após a implantação em ratinhos SCID, as células CD133+ formaram estruturas tubulares que expressavam marcadores epiteliais renais. Adicionalmente, a 2 injeção intravenosa em ratos com tubulonecrosis induzida por glicerol, as células CD133+ migraram e integraram-se no tecido renal lesado. Bussolati et al, American J. of Pathology, 166: 545-555, 2005. Estes dados indicam que as células progenitoras estão presentes no tecido do rim humano e que podem desempenhar um papel na reparação renal. No entanto, a população residente de células CD133+ no tecido renal adulto é muito baixa e, portanto, impraticável para a terapia alogénica baseada em células. Uma abordagem recente para identificar células estaminais especificas para órgãos utiliza métodos de isolamento de acordo com a capacidade das células progenitoras para o efluxo de corante Hoechst 33342. As células demonstrando essa capacidade têm sido denominadas células SP (lado-população) e mostraram diferentes graus de caracteristicas de células estaminais. Estudos têm mostrado que o interstício renal de rins de roedores contém células SP. Além disso, as células de rim SP foram infundidas em ratos com insuficiência renal aguda. Hishikawa et al, J. of Cell Biology, 169:921-928, 2005. Estas células pareciam migrar para o espaço intersticial e desempenhar um papel na reparação do tecido do rim danificado. No entanto, a existência de células SP no tecido do rim humano continua a estar por determinar. Existe uma necessidade na técnica para uma melhor fonte de células derivadas de rim de mamífero ou humano para utilização em terapia celular, que possam ser isoladas a partir de tecido normal de rim de mamífero ou humano e crescerem em cultura de células.

RESUMO A presente invenção proporciona uma população de células derivadas de rim humano isoladas ou purificadas a partir de tecido de rim humano. São fornecidos métodos para o isolamento e purificação da população derivada de células 3 de rim humano. Uma população única de células derivadas de rim humano é caracterizada por caracteristicas fenotipicas, por exemplo, morfologia, potencial de crescimento, fenótipo do marcador de superfície, desenvolvimento precoce da expressão do gene e expressão do gene do desenvolvimento renal. Ambos os marcadores de superfície e expressão fenotípica de genes são mantidos após múltiplas passagens da população de células derivadas de rim humano em cultura.

Num aspecto da invenção, é fornecida uma população de células derivadas de rim humano isoladas ou purificadas, sendo a referida população de células capaz de autorrenovação e expansão em cultura, em que a população de células é positiva para a expressão de marcadores de superfície celular HLAI e CD44 e em pelo menos um de Oct-4, Rex-1, Pax-2, caderina-11, FoxDl, WT1, EYA1, HNF3B CXC-R4, Sox-17 EpoR, BMP2, BMP7, ou GDF5 e negativa para a expressão de marcadores de superfície celular CDI33, E-caderina, e Wnt-4 e pelo menos um dos Sox2, FGF4, hTERT, S1X2 ou GATA-4. A população de células derivadas de rim humano isoladas ou purificadas, num outro aspecto, é positiva para, pelo menos, um dos marcadores de superfície celular CD24, CD29, CD49c, CD73, CD166, ou SSEA-4 e negativa para pelo menos um dos marcadores de superfície celular HLA-II, CD31, CD34, CD4 5, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD138 ou CD141. A população de células é preferivelmente não imunogénica para transplante alogénico num indivíduo humano. A população de células derivadas de rim humano pode segregar, pelo menos, um dos factores tróficos FGF2, HGF, TGFa, TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 ou VEGF. Preferivelmente, a população de 4 células não segrega, pelo menos, um dos factores tróficos PDGF-bb ou IL12p70 . A população de células derivadas de rim humano, pode ser derivada a partir da região renal subcapsular, a partir do córtex do rim ou da medula do rim. A população de células derivadas de rim humano pode compreender células progenitoras renais. A população de células da invenção pode ser utilizada para o tratamento da doença isquémica do rim de um indivíduo humano, em que o tratamento compreende a administração ao sujeito humano de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma população derivada de células de rim humano isoladas ou purificadas tal como descrito acima, reduzindo ou eliminando a doença renal isquémica no sujeito humano. A população de células da presente invenção para utilização num método para a substituição de tecidos renais, órgãos, componentes ou estruturas que estejam danificados devido a trauma, idade, lesão metabólica ou tóxica, doença ou perda idiopática num indivíduo humano é também fornecida. 0 método compreende a administração ao sujeito humano de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma população derivada de células de rim humano purificadas isoladas reduzindo ou eliminando os tecidos ou órgãos danificados, de modo a restabelecer a função renal no sujeito humano.

Um outro aspecto da invenção refere-se a um método para enriquecer seletivamente ou isolar uma população de células derivadas de rim humano. Este método compreende a obtenção 5 de tecido a partir da região subcapsular, córtex ou medula de um rim humano, a incubação do tecido na presença de uma metaloprotéase, uma protéase neutra, ou uma enzima mucolitica, o plaqueamento das células num recipiente de cultura de tecidos, a identificação da população celular que é positiva para a expressão de marcadores de superfície celular HLAI CD44 e pelo menos um dos 0ct4, Rex-1, Pax-2, caderina-11, FoxDl, WT1, EYA1, HNF3B CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7, ou GDF5 e negativa para a expressão de marcadores de superfície celular CDI33, E-coderina e Wnt-4, e pelo menos um de Sox2, FGF4, hTERT, SIX2 ou GATA-4 e o isolamento da população de células derivadas de rim humano. A população de células, num outro aspecto, é positiva para, pelo menos, um dos marcadores de superfície celular CD24, CD29, CD49c, CD73, CD166, ou SSEA-4, e negativa para pelo menos um dos marcadores de superfície celular HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD138 ou CD141. A população de células da presente invenção para utilização no tratamento de uma doença num mamífero com terapia genética é também fornecida, em que as referidas células são preparadas por fornecimento de uma população de células derivadas de rim isoladas de mamífero a partir de tecido do rim humano, como descrito acima, alterando geneticamente a população de células derivadas de rim humano isoladas ou purificadas para produzir um produto genético terapêutico, e expandir as células geneticamente modificadas em cultura. 0 referido tratamento consiste em administrar as células geneticamente modificadas para produzir o produto genético desejado no sujeito humano, para reduzir ou eliminar a doença no sujeito humano. 6

Num outro aspecto, é fornecido um método para o rastreio de um fármaco candidato potencial para o tratamento de uma desordem envolvendo células renais num sujeito humano, que compreende os passos de: (a) preparação de uma população de células derivadas de rim humano isoladas ou purificadas obtidas a partir de células de rim humano ou de tecido renal do paciente, sendo a referida célula capaz de autorrenovação e de expansão em cultura, em que a população de células é positiva para a expressão dos marcadores de superfície celular HLA I e CD44, e pelo menos um de Oct-4, Rex-1, Pax-2, caderina-11, FoxDl, WT1, EYA1, HNF3B CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7, ou GDF5 e neqativa para a expressão de marcadores de superfície celular CDI33, E-caderina, e Wnt-4, e pelo menos um de Sox2, FGF4, hTERT, SIX2 ou GATA-4; (b) cultivar a população de células derivadas de rim humano sob condições de proliferação para obter uma composição celular que compreende as células com potencial ou potencial aumentado para a autorrenovação e expansão in vitro; (c) expor as culturas de células em (a) ou (b) a um fármaco candidato potencial; e (d) detectar o presença ou ausência de um efeito do fármaco candidato potencial sobre a sobrevivência das células, numa característica morfológica, funcional ou fisiológica e/ou propriedade biológica molecular das referidas células, em que um efeito de alterar a sobrevivência de uma célula, uma característica morfológica funcional ou fisiológica e/ou uma propriedade biológica molecular das células indica a atividade do fármaco candidato potencial. A população celular, num outro aspecto, é positiva para, pelo menos, um dos marcadores de superfície celular CD24, CD29, CD49c, CD73, CD166, ou SSEA-4, e negativa para pelo menos um dos marcadores de 7 superfície celular HLA II, CD31 , CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD138 e CD141.

Um método para ensaiar a toxicidade de uma substância de teste para afectar a autorrenovação e a expansão em cultura de uma população de células derivadas isoladas ou purificadas de rim humano é também fornecido. Este método compreende os passos de: (a) cultivar a população de células derivadas de rim humano isoladas ou purificadas obtidas a partir de tecido de rim humano, sendo a referida célula capaz de autorrenovação e de expansão em cultura, em que a população de células é positiva para a expressão de marcadores da superfície celular HLA I e CD44 e pelo menos um de Oct-4, Rex-1, Pax-2, caderina-11, FoxDl, WT1, EYA1 HNF3B CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7, ou GDF5 e negativa para a expressão de marcadores de superfície celular CDI33, E-caderina e Wnt-4, e pelo menos um de Sox2, FGF4, hTERT, SIX2 ou GATA-4; (b) expor as células de cultura no passo (a) para testar uma substância; e (c) detectar a presença ou a ausência de um efeito da substância de teste sobre a sobrevivência das células ou numa característica morfológica, funcional ou fisiológica e/ou propriedade biológica molecular das células, através da qual um efeito de alteração da sobrevivência célula, uma característica morfológica, funcional ou fisiológica e/ou uma propriedade biológica molecular das células indica a atividade da substância de teste. A população de células pode ser positiva para pelo menos um dos marcadores de superfície celular CD24, CD2 9, CD4 9c, CD7 3, CD166, ou SSEA-4, e negativa para pelo menos um dos marcadores de superfície celular HLA II , CD31, CD34, CD45 CD56, CD80 , CD86, CD104, CD105, CD117, CD138 e CD141. 8 DESCRIÇÃO DETALHADA Visão global A presente invenção proporciona uma população de células derivadas de rim humano isoladas ou purificadas a partir de tecido de rim humano. São fornecidos métodos para isolar e purificar as células a partir de tecido de rim humano. Uma população única de células derivadas de rim humano é caracterizada por características fenotípicas, por exemplo, morfologia, potencial de crescimento, fenótipo do marcador de superfície, expressão do gene de desenvolvimento do rim, expressão do gene de desenvolvimento precoce ou a expressão do gene renoprotetor. Ambos os fenótipos de marcadores de superfície e de expressão de genes são retidos após múltiplas passagens da população de células derivadas de rim humano em cultura. É fornecida uma população de células derivadas de rim humano isoladas ou purificadas, sendo a referida população de células capaz de autorrenovação e de expansão em cultura, em que a população de células é positiva para a expressão de marcadores de superfície celular HLA I e CD44 e pelo menos um de Oct-4 , Rex-1, Pax-2, caderina-11, FoxD I, WT1, Eyal, HNF3B CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7, ou GDF5 e negativa para a expressão de marcadores de superfície celular CDI33, E -caderina, e Wnt-4, e pelo menos um dos Sox2, FGF4, hTERT, SIX2 ou GATA-4. A população de células de rim humano derivadas isoladas ou purificadas é estável e capaz de autorrenovação e de expansão em cultura de células. A população de células é não imunogénica para transplante alogénico num indivíduo humano, tal como evidenciado pela descoberta de que a população de células derivadas de rim humano isoladas ou purificadas é positiva para o marcador de superfície 9 celular HLA I e negativa para pelo menos um dos marcadores de superfície celular HLA II, CD80 ou CD86. A população de células derivadas de rim humano pode segregar, pelo menos, um dos factores tróficos FGF2, HGF, TGFa, TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 ou VEGF e não segregar, pelo menos, um dos factores tróficos PDGF-BB ou IL12p70. A população de células pode ser derivada da região subcapsular renal, córtex ou medula do rim, a partir de um ser humano. A população de células derivadas de rim humano pode incluir células progenitoras renais. As células progenitoras renais são capazes de se diferenciar em linhagens celulares distintas, por exemplo, adipócitos ou osteoblastos. A população de células derivadas de rim humano da presente invenção é útil em terapia celular para a regeneração na doença renal isquémica ou para tratamentos terapêuticos para substituir tecidos de rim, órgãos, componentes ou estruturas que estejam danificadas devido a trauma, idade, lesão metabólica ou tóxica, doença ou perda idiopática num sujeito humano. É para ser entendido que esta invenção não está limitada aos métodos específicos, reagentes, compostos, composições ou sistemas biológicos que podem, é claro, variar. É também para ser compreendido que a terminologia aqui utilizada é para o propósito de descrever apenas formas de realização particulares, e não se destina a ser limitativa. Tal como é usado nesta especificação e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o" incluem referentes plurais a menos que o conteúdo dite claramente o contrário. 10

Assim, por exemplo, a referência a "uma célula" inclui uma combinação de duas ou mais células, e outras semelhantes. 0 termo "cerca de" tal como é aqui utilizado para se referir a um valor mensurável, tal como, uma quantidade, uma duração temporal e semelhantes, destina-se a englobar as variações de ± 20% ou ± 10%, mais preferivelmente ± 5%, ainda mais preferencialmente ± 1%, e ainda mais preferivelmente ± 0,1% do valor especificado, como tais variações são adequadas para realizar os métodos descritos. A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado como vulgarmente entendido por um vulgar perito na técnica à qual pertence a invenção. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática para testar a presente invenção, os materiais e métodos preferidos são aqui descritos. Ao descrever e reivindicar a presente invenção, a seguinte terminologia será utilizada. "As células da invenção" referem-se a população de células derivadas de rim humano e as células derivadas delas incluindo células diferenciadas ou indiferenciadas. Uma população de células derivadas de rim humano pode ser positiva para a expressão de marcadores de superfície celular HLA I e CD44, e pelo menos um de Oct-4, Rex-1, Pax-2, caderina-11, FoxDl, WT1, EYA1, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7, ou GDF5 e negativa para a expressão de marcadores de superfície celular CDI33, E-caderina e Wnt-4 e pelo menos um dos Sox2, FGF4, hTERT, SIX2 ou GATA-4. 11 "Diferenciação" é o processo pelo qual uma célula não-especializada ("não confirmada") ou menos especializada adquire as caracteristicas de uma célula especializada, tal como uma célula do rim, por exemplo. A "célula diferenciada ou diferenciação celular induzida" é aquela que tem assumido uma posição mais especializada ("compromisso") dentro da linhagem de uma célula. 0 termo "compromisso", quando aplicado no processo de diferenciação, refere-se a uma célula que tenha procedido da via de diferenciação a um ponto em que, sob circunstâncias normais, irá continuar a diferenciar-se num tipo especifico de célula ou um subconjunto de tipos de células, e não pode, em circunstâncias normais, diferenciar-se num tipo de célula diferente ou reverter para um tipo de células menos diferenciadas. "De-diferenciação" refere-se ao processo pelo qual uma célula reverte para uma posição menos especializada (ou comprometida) dentro de uma linhagem celular. Tal como aqui utilizado, a "linhagem" de uma célula define a hereditariedade da célula, isto é, as células de que provém e as células a que pode dar origem. A linhagem de células coloca a célula dentro de um sistema hereditário de desenvolvimento e diferenciação. Um "marcador de linhagem especifica" refere-se a uma caracteristica especificamente associada com o fenótipo de células de uma linhagem de interesse e pode ser utilizado para avaliar a diferenciação de uma célula não comprometida com a linhagem de interesse.

Em sentido lato, "célula progenitora" é uma célula que tem a capacidade de gerar descendência que é mais diferenciada do que ela própria e mantêm, ainda, a capacidade de reconstituir o conjunto de células progenitoras. Por essa definição, as próprias células estaminais também são 12 células progenitoras, como são os precursores imediatos para mais células terminalmente diferenciadas. Ao referir-se as células da presente invenção, tal como descrito em maior detalhe abaixo, pode ser utilizada esta definição ampla de "células progenitoras". Num sentido mais restrito, uma célula progenitora é geralmente definida como uma célula que é intermediária da via de diferenciação, ou seja, que surge a partir de uma célula estaminal e é intermediária na produção de um tipo de células maduras ou um subconjunto de tipos de células. Este tipo de célula progenitora, geralmente, não é capaz de se autorrenovar. Assim, se este tipo de células é aqui referido, será referido como "células progenitoras não-renováveis" ou como um "progenitor intermediário" ou "célula precursora". Uma célula diferenciada pode ser derivada a partir de uma célula multipotente que é derivada de uma célula multipotente, e assim por diante. Embora cada uma destas células multipotentes possa ser consideradas como células estaminais, a gama de tipos de células de cada uma delas pode dar origem e pode variar consideravelmente. Algumas células diferenciadas também têm a capacidade de dar origem a células de maior potencial de desenvolvimento. Tal capacidade pode ser natural ou pode ser induzida artificialmente, por tratamento com vários factores. "Proliferação", indica um aumento no número de células. "Células progenitoras renais", tal como aqui utilizado são células derivadas de rim humano que podem dar origem a células, como os adipócitos, ou osteoblastos ou podem dar origem a um ou mais tipos de tecidos, por exemplo, tecido renal, além de produzir células filhas de potencial equivalente. Uma "célula progenitora de rim ou renal" é uma célula multipotente ou pluripotente que se origina 13 substancialmente a partir de tecido de rim adulto ou fetal. Estas células têm sido encontradas possuir caracteristicas de células estaminais pluripotentes, incluindo a rápida proliferação e o potencial para diferenciação em outras linhagens celulares. Células progenitoras renais "muitipotentes" podem dar origem a múltiplas linhagens de células, por exemplo, linhagens de células renais, linhagens de adipócitos, ou linhagens de osteoblastos. As células progenitoras renais demonstram um perfil de expressão de genes para marcadores de genes de desenvolvimento precoce, genes marcadores de desenvolvimento do rim, marcadores genéticos mesenquimais metanéfricos, e genes que promovem a sobrevivência do mesênquima metanéfrico. Por exemplo, as células progenitoras renais demonstrar um perfil de expressão do gene que é positivo para a expressão de genes, incluindo, mas não limitado a, Oct-4 e Rex-1 e negativo para a expressão de genes, incluindo, mas não limitado a, Sox2, FGF4, hTERT e Wnt-4. A população de células derivadas de rim humano isoladas ou purificadas são estáveis e capazes de autorrenovação e expansão em cultura de células. A população de células derivadas de rim humano foi identificada fenotipicamente como células que são positivas para a expressão de pelo menos um de Oct-4, Rex-1, Pax-2, caderina-11, FoxDl, WTl, EYA1, HNF3B CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7, ou GDF5 e negativas para a expressão de pelo menos um dos Sox2, FGF4, hTERT, Wnt-4, ou SIX2 GATA-4. Num aspecto adicional, a população de células derivadas de rim humano foi identificada como positivo para a expressão de pelo menos um dos EYA1, WTl, FoxDl, BMP7, BMP2, GDFS, EpoR ou Rex-1 e 14 negativa para a expressão de pelo menos um de Sox2, FGF4, hTERT ou Wnt-4. "Tecido" refere-se a um grupo ou a camada de células similarmente especializadas que, em conjunto, desempenham certas funções especiais. "Órgão" refere-se a duas ou mais camadas adjacentes de tecido, cujas camadas de tecido mantêm alguma forma de célula-célula e/ou a interação de células de matriz para formar uma microarquitectura. "Rim" refere-se a um de um par de órgãos do abdómen. Os rins removem os residuos do sangue (como a urina), produzem eritropoietina para estimular a produção de células vermelhas do sangue e desempenham um papel na regulação da pressão arterial. Os rins funcionam para manter a água e o equilíbrio eletrolitico, regulam a concentração de ácido-base, e filtram o sangue de residuos metabólicos, que são excretados como urina. "Cultura primária" refere-se a uma população de células que permite a interação de muitos tipos diferentes de células isoladas a partir de um tecido. A palavra "primária" tem o seu significado usual na técnica da cultura de tecidos. "Capaz de autorrenovação e expansão em cultura" refere-se a populações de células derivadas de rim de mamifero que crescem e se dividem em cultura de células e mantém substancialmente o mesmo fenótipo, tal como medido por meio de marcadores de células e secreção de factores tróficos de célula mãe para célula filha. Em algum ponto durante a replicação da população de células derivadas de rim de mamifero, o fenótipo pode mudar para um estado mais especializado ou diferenciado de células derivada de rim. 15 A população de células derivadas de rim humano da invenção também pode ser cultivada antes da administração a um paciente sob condições que promovam a proliferação e diferenciação celular. Estas condições incluem a cultura das células para permitir a proliferação e a confluência in vitro, altura em que as células podem ser feitas de modo a formar agregados ou aglomerados e secretos GDF5, BMP ou expressos de BMP ou receptores EPO. Vários termos são usados para descrever as células em cultura. "Cultura celular" refere-se genericamente as células retiradas de um organismo vivo, e cultivadas sob condições controladas, por exemplo, "na cultura". Uma "cultura de células primária" é uma cultura de células, tecidos ou órgãos tirada diretamente a partir de organismos e antes da primeira subcultura. As células são "expandidas", em cultura, quando são colocadas num meio de crescimento, sob condições que facilitam o crescimento celular e/ou a divisão, o que resulta numa maior população de células. Quando as células são expandidas em cultura, a taxa de proliferação de células é, por vezes, medida pela quantidade de tempo necessário para que as células dupliquem em número. Isto é referido como "tempo de duplicação". "Composição celular" refere-se a uma preparação de células, a qual pode incluir, para além das células, componentes não-celulares, tais como meios de cultura de células, por exemplo, proteinas, aminoácidos, ácidos nucleicos, nucleótidos, coenzimas, antioxidantes, metais e semelhantes. Além disso, a composição celular pode ter componentes que não afectem o crescimento ou a viabilidade do componente celular, mas que sejam utilizados para 16 proporcionar células num formato particular, por exemplo, como matriz polimérica para o encapsulamento ou preparação farmacêutica. "Meio de cultura" é reconhecido na técnica e é também conhecido como "meio de crescimento", geralmente refere-se a qualquer substância ou preparação utilizada para a cultura de células vivas. Assim, uma "cultura de tecido" refere-se à manutenção ou crescimento de tecido, por exemplo, os explantes do órgão de primordial, região subcapsular renal, córtex ou medula do rim, ou de um órgão adulto in vitro, de modo a preservar a sua estrutura e funcionamento. Uma "cultura de células" refere-se ao crescimento de células in vitro. Preparações de cultura de tecidos e de células da população de células derivadas de rim humano amplificadas podem assumir uma variedade de formatos. Por exemplo, uma "cultura em suspensão" refere-se a uma cultura em que as células se multiplicam, enquanto suspensas num meio adequado. Do mesmo modo, uma "cultura de fluxo continuo" refere-se à cultura de células ou explantes num fluxo continuo de meio fresco para manter o crescimento de células, por exemplo, viabilidade.

Uma "linha de células" é uma população de células formadas por uma ou mais subculturas de uma cultura de células primárias. Cada rodada de subcultura é referida como uma passagem. Quando as células foram subcultivadas, são referidas como tendo sido "passadas". Uma população de células especifica, ou uma linha celular, é referida ou caracterizada por o número de vezes que foi passada. Por exemplo, uma população de células cultivadas que foi passada dez vezes pode ser referida como uma cultura "PIO". A cultura primária, ou seja, a primeira cultura após o 17 isolamento de células de tecido, é designada PO. Após a primeira passagem, as células são descritas como uma cultura secundária (PI ou passagem 1) . Depois da segunda subcultura, as células tornam-se uma cultura terciária (P2 ou passagem 2), e assim por diante. Será entendido pelos especialistas na técnica que pode haver muitas duplicações da população durante o periodo de passagem, portanto, o número de duplicações da população de uma cultura é geralmente maior do que o número de passagens. A expansão das células (ou seja, o número de duplicações da população) no periodo compreendido entre passagens depende de muitos fatores, incluindo, mas não limitado à densidade da cultura, o substrato, meio e tempo entre passagens.

Um "meio condicionado" é um meio no qual uma célula ou uma população especifica de células foi cultivada e, em seguida removida. Enquanto as células foram cultivadas no meio, segregam factores celulares que podem fornecer suporte trófico para as outras células. Tais factores tróficos incluem, mas não estão limitados a hormonas, citoquinas, matriz extracelular (ECM), proteínas, anticorpos, e grânulos. 0 meio que contém os factores celulares é o meio condicionado.

Geralmente, um "factor trófico" é definido como uma substância que promove a sobrevivência, crescimento, proliferação, maturação, diferenciação e/ou manutenção de uma célula, ou estimula um aumento da atividade de uma célula. "Suporte trófico" é aqui utilizado para referir a capacidade de promover a sobrevivência, crescimento, proliferação, maturação, diferenciação e/ou manutenção de uma célula, ou para estimular o aumento da atividade de uma célula. A população de células derivadas de rim humano da 18 presente invenção produz factores tróficos, incluindo mas não se limitando a, factores de crescimento, citoquinas, e factores de diferenciação. Os factores tróficos incluem, mas não estão limitados a, FGF2, HGF, TGFa, TIMP-1, TIMP-2, VEGF, MMP-2, ou uma combinação destes. "Não-imunogénico" refere-se a células ou uma população de células que não provocam uma resposta imune prejudicial na maioria dos pacientes humanos tratados, isto é, uma resposta imune que comprometa a saúde do ser humano ou que interfira com a resposta terapêutica em sujeitos humanos tratados. "Gene" refere-se a uma sequência de ácido nucleico que codifica um produto genético. 0 gene compreende opcionalmente informação da sequência necessária para a expressão do gene (por exemplo, promotores, estimuladores, etc.). 0 termo "genoma" refere-se ao genoma de um organismo. "Expressão do gene" refere-se a transcrição de um gene para um produto de ARN, e, opcionalmente, para a tradução numa ou mais sequências polipeptidicas. "Dados de expressão de genes" refere-se a um ou mais conjuntos de dados que contêm informação sobre os diferentes aspectos da expressão do gene. 0 conjunto de dados inclui opcionalmente informação relativa: a presença de transcritos-alvo em amostras de células ou derivadas de células; níveis de abundância relativa e absoluta dos transcritos-alvo; a capacidade de vários tratamentos para 19 induzir a expressão de genes específicos; e a capacidade de vários tratamentos para alterar a expressão de genes específicos para diferentes níveis. "Perfil de expressão do gene" refere-se a uma representação do nível de uma pluralidade de genes, sem expressão (i.e. linha de base ou de controlo), ou em resposta a uma condição selecionada de expressão (por exemplo, a incubação da presença de um composto padrão ou composto de teste a um ou vários pontos de tempo). A expressão do gene pode ser expressa em termos de uma quantidade absoluta de mARN transcrito para cada gene, como uma proporção de ARNm transcrito numa célula de teste, em comparação com uma célula de controlo, e outros semelhantes. Refere-se também à expressão de um gene individual e de conjuntos de genes individuais num sujeito.

Quando se refere a células de vertebrados em cultura, o termo "senescência" (também "senescência replicativa" ou "senescência celular") refere-se a uma propriedade atribuível às culturas celulares finitas, ou seja, a sua incapacidade para crescer para além de um número finito de duplicações da população (por vezes referido como "limite de Hayflick"). Embora a senescência celular tenha sido descrita pela primeira vez utilizando células do tipo fibroblasto, os tipos de células humanas mais normais podem ser cultivados em cultura com êxito e ser submetidas a senescência celular. 0 tempo de vida in vitro de diferentes tipos de células varia, mas o tempo de vida máximo é tipicamente menos de 100 duplicações da população (isto é, o número de duplicações para todas as células na cultura e, tornarem-se senescentes e, assim, tornar a cultura incapaz de se dividir). A senescência não depende do tempo 20 cronológico, mas sim é medida pelo número de divisões celulares, ou duplicações da população, a que a cultura foi sujeita. Assim, as células tornadas quiescentes por remoção de factores de crescimento essenciais são capazes de retomar o crescimento e divisão quando os factores de crescimento são reintroduzidos, e, posteriormente, executar o mesmo número de duplicações de células equivalentes cultivadas continuamente. Do mesmo modo, quando as células são congeladas em azoto liquido, após vários números de duplicações da população e, em seguida descongeladas e cultivadas, sofrem substancialmente o mesmo número de duplicações das células mantidas descongeladas em cultura. As células senescentes não estão mortas ou a morrer; são, na verdade, resistentes à morte celular programada (apoptose), e têm sido mantidas no seu estado não-dividido durante pelo menos três anos. Estas células estão muito vivas e metabolicamente ativas, mas não se dividem. 0 estado não-dividido de células senescentes ainda não foi encontrado ser reversível por qualquer agente biológico, químico ou virai. "As condições de crescimento padrão" refere-se a condições atmosféricas normais compreendendo cerca de 5% de CO2, a uma temperatura de cerca de 35-39°C, mais preferivelmente 37°C, e uma humidade relativa de cerca de 100%. "ED50" significa a dose de um fármaco que produz 50% da sua resposta máxima ou efeito. "Quantidade eficaz" refere-se às concentrações de componentes, tais como fatores de crescimento, citoquinas, células, preparações ou composições eficazes para a 21 produção de um resultado pretendido, incluindo a proliferação de células derivadas de rim humano, ou o tratamento de uma doença ou estado com células, preparações e composições da invenção, ou para efetuar um transplante de células num paciente a ser tratado. Uma quantidade eficaz de componentes, tais como fatores de crescimento, citoquinas, células, preparações ou composições provoca uma alteração na taxa de proliferação celular e/ou no estado de diferenciação de uma célula. "Administrar" ou "administração" refere-se ao processo pelo qual as células, preparações ou composições da invenção são entregues a um paciente, para fins de tratamento: As células, preparações ou composições podem ser administradas de várias maneiras, incluindo parentérica (por exemplo intravenosa e intra-arterial, bem como outras vias parentéricas apropriadas), por via oral, subcutânea, inalação, ou transdérmica. As células, preparações e composições da invenção são administrados de acordo com as boas práticas médicas, tendo em conta a condição clinica do paciente, o local e método de administração, dosagem, a idade do paciente, sexo, peso corporal e outros factores conhecidos dos médicos. "Animal" ou "sujeito mamífero" refere-se a mamíferos, de preferência mamíferos, tais como humanos, primatas, ratazanas, ou ratos. Do mesmo modo, um "paciente" ou "sujeito" a ser tratado pelo método da invenção pode significar um animal humano ou não humano, para os quais é fornecido o tratamento, incluindo o tratamento profiláctico, com as células, preparações e composições da presente invenção. Para o tratamento destas condições ou estados de doença que são específicos de um animal 22 específico, tal como um paciente humano, o termo refere-se a esse animal específico. Um "dador" refere-se a um indivíduo (animal, incluindo um ser humano) de quem ou a quem doa células renais ou células de rim para utilização num paciente. "Transplante", "implante", "transplantação", "enxertia" e "enxerto" são utilizados para descrever o processo pelo qual as células, preparações e composições da invenção são apresentadas para o local no interior do doente em que as células têm a intenção de exibir um efeito favorável, tal como a reparação de danos nos tecidos de um paciente, o tratamento de uma doença, uma lesão ou trauma ou dano genético ou insulto ambiental a um órgão ou tecido causada, causado, por exemplo, por um acidente ou outra atividade. As células, preparações, e composições também podem ser entregues numa área remota do corpo por qualquer modo de administração baseando-se na migração celular para a área adequada no corpo para efetuar o transplante. "Remoção" refere-se a uma porção ou um órgão retirado do corpo e cultivada num meio artificial. "Ex vivo" refere-se a células que foram tomadas a partir de um corpo, temporariamente cultivadas in vitro, e devolvidas a um corpo. "Essencialmente", "essencialmente eficaz", ou "essencialmente pura" refere-se a uma população de células ou a um método que é pelo menos 20 + %, 30 + %, 40 + %, 50 + %, 60+%, 70+%, 80+%, 85+%, 90+%, ou 95%+ efetiva, mais 23 preferencialmente pelo menos 98+% eficaz, ainda mais preferivelmente 99%+ eficaz. Por isso, um método que enriquece uma dada população de células, enriquece, pelo menos, cerca de 20+%, 30+%, 40+%, 50+%, 60+%, 70+%, 80%, 85%, 90%, ou 95% da população de células alvo, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 98% da população de células, mais preferencialmente cerca de 99% da população de células. Em certas concretizações as células numa população enriquecida de população de células derivadas de rim humano da invenção compreendendo, essencialmente, células derivadas de rim humano, por exemplo, as células, que são positivas para a expressão de marcadores de superficie celular HLA I e CD44 e pelo menos um de Oct-4, Rex-1, Pax-2, caderina-11, FoxDl, WT1, EYA1, HNF3B, Cxc-R4, Sox-17, GPO-R, BMP2, BMP7, ou GDF5 e neqativas para a expressão de marcadores de superficie celular CDI33, E-caderina, e Wnt-4, e pelo menos um dos Sox2, FGF4, hTERT, Six2 ou GATA-4. "Isolado" ou "purificado" refere-se alterado "pela mão do homem" a partir do estado natural, isto é, tudo o que ocorre na natureza é definido como isolado quando tiver sido removido do seu ambiente original, ou ambos. "Isolado" define também uma composição, por exemplo, uma população de células derivadas de rim humano, que está separada de contaminantes (isto é, substâncias que diferem das da célula). Num aspecto, uma população ou composição de células está substancialmente livre de células e materiais com os quais podem ser associadas na natureza. "Isolado" ou "purificado" ou "substancialmente puro", no que diz respeito a células derivadas de rim de humanos, refere-sem a uma população de células derivadas de rim humano que é pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de pelo menos mais 75%, de preferência pelo menos cerca 85%, preferivelmente pelo menos cerca de 90%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% pura, em relação às células derivadas de rim humano tornando-se uma população total de células. Reformulado, o termo "substancialmente puro" refere-se a uma população de células derivadas de rim humano da presente invenção, que contêm menos do que cerca de 50%, de preferência menos do que cerca de 30%, de preferência menos do que cerca de 20%, mais preferivelmente menos do que cerca de 10 %, mais preferencialmente menos do que cerca de 5%, de linhagem de células renais comprometidas na população original amplificada e isoladas antes da cultura e subsequente amplificação. A pureza de uma população de células ou composição pode ser avaliada por métodos adequados que são bem conhecidos na técnica. "Terapia génica" refere-se à transferência e inserção estável de nova informação genética nas células para o tratamento terapêutico de doenças ou distúrbios. Uma variedade de meios para a administração de terapia genética a um indivíduo humano, em vista da presente descrição, será evidente para os peritos na técnica. Técnicas de terapia genética são descritas nesta descrição. Um gene estranho é transferido para uma célula que prolifera para introduzir o gene transferido ao longo da população de células. Portanto, as células e as composições da invenção podem ser o alvo da transferência de genes, uma vez que irão produzir diversas linhagens, o que potencialmente expressa o gene estranho. A população de células derivadas de rim humano, ou precursores da mesma produzida em conformidade com um método da invenção, pode ser usada para tratar distúrbios 25 renais, por exemplo, a lesão isquémica renal, insuficiência renal, transplante de rim, ou carcinoma de células renais. As células, ou tecido ou um tecido renal funcionalmente regenerado, podem ser administradas a um paciente para tratar a diminuição aguda ou crónica na função renal. As células ou tecido renal funcional ou regenerado pode ser implantado no doador das células renais, ou noutro paciente. As células renais ou as suas precursoras podem também ser utilizadas para construir um sistema artificial do rim, por exemplo, Um sistema baseado num sistema de filtração de fibra oca.

As células, preparações de células e composições celulares da invenção podem ser utilizadAs como imunogénios que são administrados a um indivíduo mamífero. A administração de uma população de células derivadas de rim humano obtida em conformidade com a invenção pode ser conseguida por vários métodos. Métodos de administração células como imunogénios para um sujeito mamífero incluem, sem limitação, imunização, administração de uma membrana por contacto direto (por ex. por raspagem ou aparelho de raspar), administração a membranas mucosas (por ex. através de aerossol), e administração oral. A imunização pode ser ativa ou passiva e pode ocorrer por diferentes vias, incluindo a injeção intraperitoneal, injeção intradérmica e injeção local. 0 percurso e programa de imunização estão em conformidade com os métodos convencionais geralmente estabelecidos para estimulação e produção de anticorpos. Sujeitos mamíferos, em particular ratos, e as células produtoras de anticorpos dos mesmos podem ser manipulados para servir como base para produção de linhas celulares de hibridoma de mamífero. 26

As composições de população de células derivadas de rim humano da invenção podem ser usadas para preparar sistemas de modelos de doença. As composições celulares derivadas de rim humano da invenção também podem ser utilizadas para produzir compostos, incluindo, mas não se limitando a, factores de crescimento, hormonas, citoquinas e compostos imuno-estimulantes. A população de células derivadas de rim humano da presente invenção segrega factores incluindo, mas não limitado a, FGF2, HGF, TGFa, TIMP-1, TIMP-2, VEGF, ou MMP-2, ou uma combinação dos mesmos e não segrega pelo menos um dos factores tróficos PDGF-bb ou IL12p70 ou uma combinação destes.

Num aspecto, a invenção proporciona um sistema de cultura a partir do qual os genes, proteínas e outros metabolitos envolvidos na proliferação e diferenciação das populações de células derivadas de rim humano ou de células progenitoras renais humanas podem ser identificadas e isoladas. As células num sistema de cultura da invenção podem ser comparadas com outras células (por exemplo, células diferenciadas) para determinar os mecanismos e os compostos que estimulam a produção de células derivadas de rim humano ou de células progenitoras de rim humano.

As composições celulares da invenção podem ser utilizadas para rastrear os genes expressos em ou essenciais para a diferenciação de populações de células derivadas de rim humano. Métodos de rastreio que podem ser utilizados incluem a análise de diferença representacional (RDA) ou aprisionamento de genes, por exemplo SA-lacZ. DP Hill e Wurst, W., 1993, Methods in Enzymology, 225:664. 0 aprisionamento do gene pode ser utilizado para induzir mutações dominantes (por exemplo, por exclusão de domínios 27 específicos do produto do gene) que afectam a diferenciação ou a atividade de células derivadas de rim humano e permitem a identificação de genes expressos em ou essenciais para a diferenciação destas células.

As composições expandidas da invenção que compreendem o aumento do número de células derivadas de rim humano podem ser utilizadas para melhorar o sistema imunológico de um paciente. As preparações de células irá facilitar o reforço ou a reconstituição do sistema imunológico e/ou renal do paciente. Uma população de células derivadas de rim humano pode ser transfectada com um vector para expressar antigénios imunogénicos, por exemplo, antigénios virais, bacterianos, parasitários ou cancerosos. Esta população de células derivadas de rim humano transfectada pode ser usada para tratar um indivíduo humano que sofre de uma doença e, assim, reduzir ou eliminar a, doença virai, bacteriana, parasitária ou reduzir ou eliminar o cancro ou doença neoplásica.

Também aqui é revelado um método de tratamento que usa as populações de células derivadas de rim humano para caracterizar as respostas celulares para os agentes biológicos ou farmacológicos que envolvem o isolamento de células derivadas de rim humano a partir de uma população estatisticamente significativa de indivíduos, a cultura expande as células derivadas de rim humano da população de indivíduos estatisticamente significativa para estabelecer uma pluralidade de culturas de células de populações de células derivadas de rim humano, contactando as culturas de células derivadas de rim humano com um ou mais agentes farmacológicos ou biológicos, para identificar uma ou mais respostas celulares a um ou mais ou agentes biológicos ou 28 farmacológicos, e comparar uma ou mais respostas celulares das culturas de células derivadas de rim humano a partir de indivíduos na população estatisticamente significativa. É também aqui descrito um método de tratamento, que utiliza células derivadas de rim humano ou de populações de células derivadas de rim humano especificamente diferenciadas para terapia compreendendo a administração de células diferenciadas, especificamente a um paciente. Também é descrita a utilização de células derivadas de rim humano geneticamente modificadas para expressar seletivamente um gene endógeno ou um transgene. A invenção proporciona células derivadas de rim humanas cultivadas in vivo para transplante/administração num animal para tratar uma doença. Por exemplo, as células diferenciadas derivadas a partir de populações de células derivadas de rim humano podem ser utilizadas para tratar distúrbios que envolvem estruturas tubulares, vasculares, intersticiais, ou glomerulares do rim. Por exemplo, as células podem ser utilizadas para tratar doenças da membrana basal glomerular, tais como a síndrome de Alport; distúrbios de transporte tubulares, tais como a síndrome de Bartter, cistinuria ou diabetes insípidos nefrogénicos; doenças renais progressivas de etiologias diversas, tais como a nefropatia diabética ou a glomerulonefrite; doença de Fabry, hiperoxalúria, e para acelerar a recuperação da necrose tubular aguda.

As células diferenciadas derivadas de uma população de células derivadas de rim humano, também podem ser usadas para tratar perturbações tais como a insuficiência renal aguda, síndroma nefrótica aguda, nefropatia analgésica, doença renal ateroembólica, insuficiência renal crónica, 29 nefrite crónica, síndrome nefrótica congénita, doença renal em estado final, sindrome de Goodpasture, IgM mesangial glomerulonefrite proliferativa, nefrite intersticial, cancro de rim, cancro renal, hipernefroma; adenocarcinoma de células renais, danos nos rins, infecção nos rins, lesões nos rins, pedras nos rins, nefrite lúpica, GN membranoproliferativa I, GN membranoproliferative II, nefropatia membranosa, doença de lesões minimas, glomerulonefrite necrosante, nefroblastoma, nefrocalcinose, diabetes insipidus nefrogénica, nefropatia - IgA, nefrose (sindrome nefrótica), doença renal policistica, GN pós-estreptocócica, nefropatia de refluxo, embolia da artéria renal, estenose da artéria renal, doenças renais, necrose papilar renal, acidose tubular renal tipo I, acidose tubular renal tipo II, subperfusão renal ou trombose da veia renal. A população de células derivadas de rim humano pode ser usada para enxertar uma célula num humano, compreendendo a administração células autólogas, alogénicas ou xenogénicas, para restaurar ou corrigir a função especifica metabólica, enzimática, estrutural ou outra do tecido, para o ser humano. As células podem ser usadas para enxertar uma célula num ser humano, causando a diferenciação in vivo de tipos de células, e administrando as células derivadas de rim humano no mamifero. As células, ou a sua progenitura diferenciada in vitro ou in vivo, podem ser usadas para corrigir uma doença genética, doença degenerativa ou o processo da doença do cancro. A população de células derivadas de rim humano pode ser usada como um agente terapêutico, por exemplo, para ajudar na recuperação de um paciente de quimioterapia ou 30 radioterapia no tratamento do cancro, no tratamento de doença autoimune, ou para induzir tolerância no receptor. A presente divulgação proporciona ainda um método de caracterização genética de uma população de células derivadas de rim humano, e a utilização deste gene nos perfis de um banco de dados. Também proporciona a utilização de perfis de genes de células derivadas de rim humano em bases de dados para auxiliar na descoberta de medicamentos. A presente descrição proporciona adicionalmente utilizando populações de células derivadas de rim humano ou células que foram diferenciadas a partir de células derivadas de rim humano, em conjugação com um dispositivo de transporte ou estrutura para formar um rim artificial. Dispositivos de transporte adequados são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, o dispositivo de transporte pode ser um dispositivo oco, à base de fibras em uso com a população de células diferenciadas derivadas de rim humano. 0 humano proporciona ainda um método para a remoção de toxinas a partir do sangue de um sujeito, contactando o sangue ex vivo com populações de células derivadas de rim humano isoladas de qual parte um dispositivo oco, à base de fibras.

Além disso, nos métodos descritos acima, as células podem ser administradas em conjunto com uma matriz aceitável, por ex. uma matriz farmaceuticamente aceitável. A matriz pode ser biodegradável. A matriz também pode fornecer material genético adicional, citoquinas, factores de crescimento, ou outros factores de promoção do crescimento e diferenciação 31 das células. As células também podem ser encapsuladas antes da administração. As células encapsuladas podem ser contidas dentro de uma cápsula polimérica.

Os polimeros utilizados para preparar dispositivos de transporte, estruturas ou matrizes aqui descritos são biodegradáveis e biocompatíveis. Os polimeros biodegradáveis facilmente quebram em pequenos segmentos quando expostos ao tecido húmido do corpo. Os segmentos, em seguida, ou são absorvidos pelo corpo, ou passados pelo corpo. Mais particularmente, os segmentos biodegradados não provocam reação crónica de corpo estranho permanente, porque são absorvidos pelo corpo ou passados a partir do corpo, de tal modo que nenhum vestigio permanente ou residual do segmento é retido pelo corpo.

Exemplos de polímeros bio compatíveis, bio absorvíveis adequados que podem ser utilizados incluem polímeros selecionados do grupo que consiste em poliésteres alifáticos, poli (aminoácidos), copoli (éter-ésteres), oxalatos de polialcileno, poliamidas, poli (iminocarbonatos), poliortoésteres, polyoxasteres, epoliamidoésteres, polioxaésteres contendo grupos amina, poli (anidridos), polifosfazenos, biomoléculas e suas misturas. Para a finalidade da presente invenção poliésteres alifáticos incluem, mas não se limitam a homopolímeros e copolímeros de lactido (que inclui ácido láctico, d-, 1- e meso láctido), glicólido (incluindo ácido glicólico), epsilon-caprolactona, p-dioxanona (1,4— dioxano-2-ona), carbonato de trimetileno (1,3-dioxano-2-ona), derivados alquilo de carbonato de trimetileno, delta-valerolactona, beta-butirolactona, gama-butirolactona, epsilon-decalactona, hidroxibutirato (unidades de 32 repetição), hidroxivalerato (unidades de repetição), 1,4-dioxepan-2-ona (incluindo o seu dimero 1,5,8,12-tetraoxaciclotetradecano-7,14-diona), 1,5-dioxepan-2-ona, 6,6-dimetil-l,4-dioxano-2-ona2,5-diquetomorfolina, pivalolactone, alfa, alfa-dietilpropiolactona, carbonato de etileno, oxalato de etileno, 3-metil-l,4-dioxano-2,5-diona, 3,3-dietil-l,4-dioxano-2,5-diona, 6,8-dioxabicicloctano-7-ona e misturas destes polímeros.

Numa forma de realização, os polímeros que são úteis para os fins da presente invenção são poliésteres alifáticos que incluem, mas não estão limitados a, homopolímeros e copolímeros de lactido (que inclui ácido láctico, D-, L- e meso lactido), glicólido (incluindo ácido glicólico), epsilon-caprolactona, p-dioxanona (1,4-dioxano-2-ona) , carbonato de trimetileno (1,3-dioxano-2-ona) , derivados alquilo de carbonato de trimetileno, delta-valerolactona, beta-butirolactona, gama-butirolactona, epsilon-decalactona, hidroxibutirato (unidades de repetição), hidroxivalerato (unidades de repetição), 1,4-dioxepan-2-ona (incluindo o seu dimero 1,5,8,12- tetraoxaciclotetradecano-7,14-diona), 1,5-dioxepan-2-ona, 6,6-dimetil-l,4-dioxano-2-ona e misturas destes polímeros. Numa outra forma de realização, os polímeros naturais, incluindo, mas não limitado a, colagénio, gelatina, quitina, ácido hialurónico, elastina, fibronectina e semelhantes, também são adequados para os fins da presente invenção. Uma combinação de polímeros sintéticos e naturais podem também ser utilizados.

Outra aplicação da terapia genética permite a utilização de um fármaco numa concentração elevada, que é normalmente considerada perigosa, fornecendo resistência a fármacos em 33 células de rim derivadas de mamíferos normais por transferência de um gene resistente ao fármaco nas células. Em particular, é possível realizar o tratamento com um fármaco anticancerígeno em concentração elevada através da transferência de um gene com resistência a fármacos contra o fármaco anticancerígeno, por exemplo, transferindo um gene de resistência a múltiplos fármacos numa preparação de células expandida compreendendo células derivadas de rim de mamífero.

Outras doenças que não as relacionadas com o sistema renal podem ser tratadas usando as preparações de células expandidas compreendendo populações de células derivadas de rim humano, por exemplo em doenças relacionadas com a deficiência de secreção de proteínas, tais como hormonas, enzimas, citoquinas, factores de crescimento e semelhantes. Uma proteina deficiente pode ser induzida e expressa através da transferência de um gene que codifica uma proteína alvo para a população de células derivadas de rim humano sob o controlo de um promotor adequado. A expressão da proteína pode ser controlada para se obter a mesma atividade que a obtida por expressão natural in vivo.

Também é possível inserir um gene que codifica uma ribozima, um ácido nucleico antessentido, ou semelhantes, ou um outro gene adequado para a população de células derivadas de rim humano para controlar a expressão de um produto genético específico nas células ou para inibir a susceptibilidade a doenças. Por exemplo, a população de células derivadas de rim humano pode ser submetida a modificação de genes para expressar um ácido nucleico antessentido ou uma ribozima, o que pode impedir o 34 crescimento de organismos patogénicos no rim, incluindo, mas não limitado a, HIV, HTLV-I e HTLV -II.

As preparações de células compreendendo população de células derivadas de rim humano podem ser introduzidas num sujeito humano, que é um receptor de células transplantadas, por exemplo, por administração intravenosa convencional. A divulgação apresenta um método para identificar agentes que influenciam a proliferação, a diferenciação ou a sobrevivência das células que têm o potencial para formar as células derivadas de rim humano. Exemplos de tais agentes são pequenas moléculas, anticorpos e proteínas extracelulares. Os agentes podem ser identificados e avaliados perfilado para a segurança e eficácia em animais. Num outro aspecto, a invenção contempla métodos para influenciar a proliferação, diferenciação e sobrevivência das células que têm o potencial para formar uma população de células derivadas de rim humano por contacto das células com um agente ou agentes identificados pelo método anterior. Os agentes identificados podem ser formulados como uma preparação farmacêutica.

Manipulação genética de uma população de células derivadas de rim humano A população de células derivadas de rim humano da invenção pode ser manipulada usando qualquer um de uma variedade de vectores, incluindo, mas não limitado a, vectores virais integrados, por exemplo, vector retroviral ou vectores virais adeno-associados; vectores replicantes não-integrados, por exemplo, vectores do papiloma vírus, 35 vectores SV40, vectores adenovirais; ou vectores virais de replicação defeituosa. Outros métodos de introdução de ADN em células incluem a utilização de lipossomas, electroporação, arma de partículas, ou por injeção direta de ADN.

As células hospedeiras são preferivelmente transformadas ou transfectadas com ADN controlado por, ou em associação operativa com um ou mais elementos de controlo de expressão apropriados, tais como promotores ou sequências potenciadoras, terminadores de transcrição, sitios de poliadenilação, entre outros, e um marcador selecionável.

No seguimento da introdução do ADN estranho, as células manipuladas podem ser deixadas crescer em meio enriquecido e depois mudadas para meio seletivo. 0 marcador selecionável no ADN estranho confere resistência à seleção e permite às células integrarem estavelmente o ADN estranho, como, por exemplo, num plasmídeo nos seus cromossomas e crescer para formar focos que, por sua vez, podem ser clonados e expandidos em linhas celulares. Este método pode ser vantajosamente utilizado para conceber linhagens de células que expressam o produto genético.

Qualquer promotor pode ser usado para conduzir a expressão do gene inserido. Por exemplo, os promotores virais incluem, mas não estão limitados a, promotor de CMV/potenciador, SV40, virus do papiloma, virus de Epstein-Barr ou promotor do gene da elastina. De preferência, os elementos de controlo utilizados para controlar a expressão do gene de interesse devem permitir a expressão regulada do gene de modo que o produto seja sintetizado apenas quando 36 necessário in vivo. Se a expressão transiente for desejada, os promotores constitutivos são utilizadas preferencialmente num vector não-integrado e/ou de replicação defeituosa. Alternativamente, os promotores indutiveis poderão ser utilizados para conduzir a expressão do gene inserido quando necessário.

Os promotores indutiveis incluem, mas não estão limitados a, aqueles associados com a metalotioneina e proteínas de choque térmico. Têm sido descritos exemplos de regiões de controlo da transcrição que exibem especificidade do tecido. Por exemplo, o promotor da eritropoietina é especifico aos tecidos renais; 0 gene co-transportador de NaVglucose (SGLT2) de alta capacidade (tipo 2), um gene que é expresso apenas nos túbulos iniciais proximais do rim; e transportador anião orgânico humano 3 (hOAT3/SLC22A8) é predominantemente expressO nos túbulos proximais do rim.

As células da invenção podem ser geneticamente modificadas para expressão "knock out" de factores que promovem a inflamação ou rejeição no local do implante. Técnicas de modulação negativa para a redução dos niveis de expressão de genes alvo ou niveis de atividade do produto do gene alvo são discutidos abaixo. "Modulação negativa", tal como é aqui utilizado, refere-se a uma redução no nivel e/ou atividade do produto do gene alvo em relação ao nivel e/ou atividade do produto do gene alvo na ausência do tratamento modulador. A expressão de um gene nativo de uma célula de rim derivada de mamíferos pode ser reduzida ou eliminada utilizando uma série de técnicas, incluindo, por exemplo, a inibição da expressão através da inativação do gene completo (vulgarmente designado por "knockout") utilizando 37 a técnica de recombinação homóloga. Normalmente, um exão que codifica para uma região importante da proteina é interrompido por um marcador de seleção positivo, por exemplo, o neo, impedindo a produção de mARN normal a partir do gene alvo, resultando na inativação do gene. Um gene pode também ser inativado através da criação de uma deleção em parte de um gene, ou por exclusão de todo o gene. Ao utilizar uma construção com duas regiões de homologia com o gene-alvo que estão distantes no genoma, as sequências intervenientes nas duas regiões podem ser eliminadas (Mombaerts et al., 1991, Proc. Nat. Acad.

Sei. USA 88:3084-3087). ADNzimas, ribozimas e moléculas antessentido, que inibem a expressão do gene alvo, podem também ser utilizados de acordo com a invenção para reduzir o nivel de atividade do gene alvo. Por exemplo, as moléculas antessentido de ARN que inibem a expressão de genes complexos principais de histocompatibilidade (HLA), têm demonstrado ser mais versáteis no que diz respeito às respostas imunitárias. Moléculas de ARN antessentido incluem, mas não estão limitadas a, oligonucleótidos siRNA ou cDNA que produz oligonucleótidos siRNA. Ainda outras moléculas de hélice tripla, pode ser utilizadas na redução do nivel de atividade do gene alvo.

Estas técnicas são descritas em detalhe por L.G. Davis et al. (Eds), 1994, Basic Methods in Molecular Biology, 2a ed., Appleton & Lange, Norwalk, Conn.

Uma vez que geneticamente as células modificadas, da invenção tenham sido podem ser implantadas 38 diretamente no paciente para permitir a melhoria dos sintomas da doença renal através da produção de um produto genético anti-inflamatório, tal como, por exemplo, péptidos ou polipeptideos que correspondem ao idiotipo de anticorpos neutralizantes para o GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2 ou outras citoquinas inflamatórias.

Alternativamente, as células geneticamente modificadas podem ser usadas para produzir o novo tecido in vitro, que é então implantado no sujeito, tal como descrito supra.

Utilização de uma população de células derivadas do rim humano para transplante

Os métodos de tratamento objecto da divulgação envolvem a implantação de uma população de células derivadas de células de rim, ou trans-diferenciadas em indivíduos. A população de células derivadas de rim da presente invenção pode ser alogénica ou autóloga, como evidenciado pela descoberta de que a população de células é positiva para o marcador de superfície celular HLA I e negativa para, pelo menos, um dos marcadores de superfície celular HLA II, CD80 ou CD8 6, e pode ser entregue ao sítio de necessidade terapêutica ou "casa" para o sítio. As células da presente invenção podem diferenciar-se in situ ou fornecer suporte trófico para células endógenas. 0 implante de células de dosagem apropriada em humanos pode ser determinado a partir de dados existentes relativos quer à atividade das células, por exemplo, produção de GDF5, ou à densidade de células para o tratamento de doença renal ou isquemia. Da cultura in vitro e experiências in vivo com animais, a quantidade de hormonas produzidas pode ser quantificada e utilizada para calcular uma dose adequada de material implantado. Adicionalmente, o paciente pode ser monitorizado para 39 determinar se pode ser feito um implante adicional ou material implantado ser reduzido em conformidade.

Para melhorar a diferenciação, sobrevivência ou a atividade das células implantadas, factores adicionais podem ser adicionados, incluindo factores de crescimento, tais como as proteinas morfogenéticas ou corticosteróides, antioxidantes ou agentes anti-inflamatórios, tais como ciclosporina, estatinas, rapamicina e os inibidores da quinase p38.

Para aumentar a vascularização e a sobrevivência das células transplantadas, factores angiogénicos, tais como VEGF, PDGF ou FGF2 podem ser adicionados isoladamente ou em combinação com células endoteliais e os seus precursores, incluindo células CD34+, CD34+/CD117+, células derivadas do tecido umbilical humano, meio condicionado, matriz extracelular produzida pelas células ou lisados celulares.

Populações de células derivadas de rim humanas podem ser usadas para tratar doenças ou patologias crónicas que resultam em morbilidade e esperança reduzida de vida. Estas doenças e condições incluem, mas não estão limitadas a, insuficiência renal aguda, sindrome nefrótico agudo, nefropatia analgésica, doença renal ateroembólica, doença renal crónica, nefrite crónica, sindrome nefrótico congénito, doença renal em fase terminal, sindrome de Goodpasture, IgM glomerulonefrite proliferativa mesangial, nefrite intersticial, cancro do rim, cancro renal, hipernefroma; adenocarcinoma de células renais, danos nos rins, infecção nos rins, lesões renais, pedras nos rins, nefrite lúpica, GN membranoproliferativa I, GN 40 membranoproliferativa II, nefropatia membranosa, doença de lesões mínimas, glomerulonefrite necrotizante, nefroblastoma, nefrocalcinose, diabetes insípidos nefrogénico, retinopatia diabética, nefropatia-IgA, nefrose (síndrome nefrótico), doença renal policística, GN pós-estreptocócica, nefropatia de refluxo, embolia da artéria renal, estenose da artéria renal, doenças renais, necrose papilar renal, acidose tubular renal tipo I, acidose tubular renal tipo II, subperfusão renal ou trombose da veia renal. Estratégias de gestão clínica concentram-se frequentemente na prevenção de novos danos ou lesões ao invés da substituição ou reparação do tecido danificado (por ex. túbulos renais, glomérulos, neurónios, células gliais, músculo cardíaco). As estratégias de gestão clínica incluem o tratamento com esteroides exógenos e medicamentos farmacêuticos sintéticos, não celulares, e têm variados graus de sucesso, o que pode depender da administração continuada do fármaco esteroide ou sintético.

Um ou mais outros componentes podem ser adicionados a células transplantadas, incluindo componentes selecionados da matriz extracelular, tais como um ou mais tipos de colagénio conhecido na técnica e/ou factores de crescimento, plasma rico em plaquetas e medicamentos. Os factores de crescimento que podem ser utilmente incorporados na formulação celular incluem um ou mais factores de crescimento de tecidos conhecidos na técnica ou a ser identificado no futuro, incluindo, mas não limitado a, BMPs GDFS, IGF-I e-II, ou hormona do crescimento. Alternativamente, as células da invenção podem ser geneticamente modificadas para expressar e produzir factores tróficos. Os detalhes de manipulação genética das células da invenção são fornecidas na descrição e como é 41 conhecido dos peritos na técnica. Os fármacos que podem ser utilmente incorporados na formulação celular incluem compostos anti-inflamatórios, compostos pró-angiogénicos, compostos anti-apoptóticos, bem como anestésicos locais.

Encapsulamento de uma população de células derivadas de rim humano para transplante

Uma população de células derivadas de rim humano pode ser alogénica ou autóloga, como evidenciado pela descoberta de que a população de células é positiva para o marcador de superfície celular HLA I e negativa, pelo menos, um dos marcadores de superfície celular HLA II, CD80 ou CD86, e não pode ser reconhecida pelo sistema imune ou pode reduzir a resposta imune, como observado na reação mista de linfócitos. É preferido que as células diferenciadas sejam derivadas a partir do paciente que está a ser tratado de modo a evitar a rejeição pelo sistema imunológico. No entanto, quando as células autólogas não estão disponíveis, pode ser útil para encapsular as células diferenciadas numa cápsula que é permeável ao oxigénio e nutrientes requeridos pela célula e os factores terapêuticos que as células segregam como hormonas ou BMP-7, GDF5, sendo contudo impermeável a factores humorais e células imunitárias. Preferivelmente, o encapsulante é hipoalergénico, está facilmente e de forma estável situado num tecido alvo, e proporciona uma proteção adicional à estrutura implantada. A proteção contra a rejeição pelo sistema imunológico, também pode ser fornecida através da modificação genética das células diferenciadas, de acordo com qualquer método 42 conhecido na técnica. Auto-anticorpos e células resistentes CTL podem ser produzidos utilizando métodos tais como aqueles divulgados nas Patentes US 5286632, 5320962, 5342761 e em WO 90/11354,WO 92/03917, WO 93/04169 e WO 95/17911. Em alternativa, a seleção de células trans-diferenciadas resistentes é realizada através da cultura destas células na presença de auto-anticorpos ou DDI associados com CTLs ou CTLs ativados com auto-antigénios específicos de IDD. Como resultado destas técnicas, são geradas células tendo resistência aumentada à destruição por anticorpos ou mecanismos dependentes de linfócitos T. Tais células podem ser implantadas num hospedeiro apropriado num tecido apropriado, tal como aqui descrito e têm um aumento da resistência à destruição por processos autoimunes.

Da mesma forma, o perfil de histocompatibilidade humana (HLA) da célula diferenciada pode ser modificado, opcionalmente por um processo iterativo, no qual a célula diferenciada é exposta a linfócitos normais, alogénicos, e selecionadas as células sobreviventes. Alternativamente, uma abordagem de mutagénese dirigida ao local é usada para eliminar os marcadores HLA a partir da superfície das células diferenciadas, gerando, assim, células diferenciadas e modificadas, que são implantadas num mamífero receptor com necessidade de tal implante.

Num exemplo específico, o sistema de vector de vírus adeno-associado (AAV), portador do gene de resistência à neomicina, neo, é usado. O AAV pode ser usado para transfectar células eucarióticas (LaFace et al. (1988) Virology 162:483). Além disso, é usado o sistema de vector de transporte pBabe-Bleo que transporta o gene de 43 resistência à fleomicina (Morgenstern et ai. (1990) Nucleic Acids Res. 18:3587). Este vector de transporte pode ser usado para transformar células humanas com genes úteis tal como é aqui descrito.

Criopreservação e depósito de rama população de células derivadas de rim humano

Uma população de células derivadas de rim humano da invenção pode ser criopreservada e mantida ou armazenada num "banco de células". A criopreservação das células da invenção pode ser efectuada de acordo com métodos conhecidos. Por exemplo, mas não como forma de limitação, as células podem ser suspensas num "meio de congelamento", tal como, meio de cultura compreendendo ainda 0 a 95 por cento de FBS, e 0 a 10 por cento de dimetilsulfóxido (DMSO) , um crioprotector, com ou sem 5 a 10 por cento de glicerol, a uma densidade de, por exemplo, de cerca de 0,5 a 10 x 106 células por mililitro. Alternativamente, outros agentes crioprotectores podem ser utilizados, tais como, hidratos de carbono, incluindo, mas não limitados a glucose, sacarose, maltose e trealose. As células são dispensadas em ampolas de vidro ou de plástico ou outros recipientes, que são então selados e transferidos para a câmara de congelação de um congelador de taxa controlada. A taxa óptima de congelação pode ser determinada empiricamente. Uma taxa de congelação programável, por exemplo, pode ser usada uma mudança na temperatura de -1 até -100 C por minuto através do calor de fusão. Uma vez que as ampolas tenham atingido 180°C, são transferidas para uma área de armazenamento de azoto liquido. As células criopreservadas podem ser armazenadas por um periodo de anos, no entanto, devem ser controlados pelo menos de 5em 5 anos para a manutenção da viabilidade. 44

As células criopreservadas da invenção constituem um banco de células, porções do qual podem ser "retirados" por descongelação e, em seguida, utilizadas como necessário. 0 descongelamento deve geralmente ser realizada rapidamente, por exemplo, através da transferência de uma ampola de azoto liquido para um banho de água a 37°C. Os conteúdos descongelados da ampola deve ser imediatamente transferidos em condições estéreis, para um vaso de cultura contendo um meio apropriado, tal como DMEM condicionado com FBS a 10 por cento.

Utilização de uma população de células derivadas de rim humano para rastreio in vitro da eficácia do fármaco ou a toxicidade A população de células derivadas de rim humano da invenção pode ser utilizada in vitro para pesquisar uma ampla variedade de compostos para a eficácia e toxicidade de agentes farmacêuticos, crescimento/factores de regulação e agentes anti-inflamatórios. Para este efeito, as células da invenção, ou culturas de tecidos descritas acima, são mantidas in vitro e expostas ao composto a ser testado. A atividade de um composto citotóxico pode ser medida pela sua capacidade para danificar ou matar as células em cultura. Isto pode ser prontamente avaliado por meio de técnicas de coloração vitais. O efeito do crescimento/ factores reguladores pode ser avaliado através da análise do número de células vivas in vitro, por exemplo, por contagem de células totais e contagem de células diferenciais. Isto pode ser conseguido utilizando técnicas citológicas e/ou histológicas padrão, incluindo a utilização de técnicas de imunocitoquimica utilizando anticorpos que definem antigénios celulares de tipo especifico. 0 efeito de vários fármacos em células da 45 invenção, quer em cultura em suspensão ou no sistema tridimensional descrita acima pode ser avaliado.

As células e os tecidos da presente invenção podem ser utilizadas como sistemas modelo para o estudo de condições fisiológicas ou patológicas. Por exemplo, a população de células derivadas de rim humano da presente invenção pode ser usada para estudar os estados de doença, por exemplo, insuficiência renal aguda, insuficiência renal crónica, cancro do rim, cancro renal, hipernefroma, adenocarcinoma de células renais, dano renal, infecção do rim, lesão renal, pedras nos rins, nefrite lúpica, doença renal policistica ou trombose da veia renal.

As células e tecidos da invenção podem também ser usados para estudar o mecanismo de ação de citoquinas, factores de crescimento, por exemplo, EPO, e mediadores inflamatórios, por ex. IL-1, TNF e prostaglandinas. Além disso, os agentes citotóxicos e/ou farmacêuticos, podem ser rastreados para aqueles que são mais eficaz para um paciente em particular, tais como aqueles que revertem, reduzem ou previnem a doença renal ou isquemia do rim, ou de outro modo melhoram o crescimento equilibrado do tecido renal. Agentes que provarem ser eficazes in vitro podem então ser usados para tratar terapeuticamente o paciente.

Utilização de uma população de células derivadas de rim humano para produzir moléculas biológicas

Numa outra forma de realização, a população de células derivadas de rim humano da invenção pode ser cultivada in vitro, para produzir produtos biológicos, com elevado rendimento. Por exemplo, tais células, quer as que produzem 46 naturalmente um produto biológico particular de interesse (p. ex. um factor de crescimento, um factor de regulação, ou hormona peptidica), ou aquelas que foram geneticamente modificadas para produzir um produto biológico, podem ser clonalmente expandidas utilizando, por exemplo, um sistema de cultura de células tridimensional. Se as células excretam o produto biológico no meio nutriente, o produto pode ser facilmente isolado a partir do meio consumido ou condicionado usando técnicas de separação padrão tais como, por exemplo, a precipitação diferencial de proteinas, cromatografia de troca iónica, cromatografia de filtração em gel, electroforese, e HPLC, para citar apenas algumas. Um "bioreator" pode ser usado para tirar vantagem do método de fluxo para alimentar, por exemplo, uma cultura tridimensional in vitro.

Essencialmente, como o meio fresco é passado através da cultura tridimensional, o produto biológico é lavado para fora da cultura e pode então ser isolado a partir da saída, como descrito acima.

Alternativamente, um produto biológico de interesse pode permanecer no interior da célula e, deste modo, a sua recolha pode requerer que as células sejam lisadas. 0 produto biológico pode então ser purificado utilizando uma ou mais das técnicas anteriormente enumeradas. Métodos de Administração

Nos métodos aqui descritos, a quantidade terapeuticamente eficaz da população de células derivadas de rim humano pode variar desde o número máximo de células que é recebido de forma segura pelo sujeito para o número mínimo de células 47 necessárias para a indução da formação de qualquer novo vaso sanquineo no tecido do rim isquémico, ou para aumentar o fluxo sanguíneo para o tecido do rim isquémico ou para reparar ou regenerar a região renal subcapsular, córtex renal, ou tecido da medula do rim. Geralmente, a quantidade terapeuticamente eficaz de uma população de células derivada de rim humano é pelo menos 1 x 104 por kg de peso corporal do paciente e, mais em geral, não necessita de ser superior a 1 x 107 de cada tipo de célula por kg. Embora seja preferível que a população de células derivadas de rim humano seja autóloga ou HLA-compatível com o sujeito, a população de células derivadas de rim humano pode ser isolada a partir de outros indivíduos ou de espécies ou a partir de estirpes de doadores geneticamente modificadas puras, ou a partir de culturas de células in vitro. A população de células derivadas de rim humano isoladas ou purificadas é positiva para os marcadores da superfície celular, HLA I, e negativa para os marcadores da superfície celular, HLA II, CD80 ou CD86. A população de células é não imunogénica para transplante alogénico num indivíduo mamífero. A quantidade terapeuticamente eficaz da população de células derivadas de rim humano pode ser suspensa num transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Tal veículo inclui, mas não está limitado a meio de cultura de base e 1% de albumina do soro, soro fisiológico, soro fisiológico tamponado, dextrose, água, colagénio, alginato, ácido hialurónico, cola de fibrina, polietilenoglicol, álcool polivinílico, carboximetilcelulose e suas combinações. A formulação deve ser adequada ao modo de administração. Por conseguinte, a invenção proporciona a utilização de tecido de rim humano produzido pela população 48 de células derivadas de rim humano da invenção para o fabrico de um medicamento para tratar um tecido renal isquémico num sujeito. Em algumas formas de realização, o medicamento compreende ainda polipeptideos recombinantes, tais como factores de crescimento, quimiocinas ou citoquinas. Em outras formas de realização, os medicamentos compreendem uma população de células derivadas de rim humano. As células utilizadas para o fabrico dos medicamentos podem ser isoladas, derivadas ou enriquecidas usando qualquer das variantes previstas para os métodos aqui descritos. A preparação de células derivadas de rim humano ou composição é formulada de acordo com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa a seres humanos. Tipicamente, as composições para administração intravenosa, administração intra-arterial ou administração dentro da cápsula do rim, são soluções em tampão aquoso isotónico estéril. Sempre que necessário, a composição pode também incluir um anestésico local para aliviar qualquer dor no local da injeção. Geralmente, os ingredientes são fornecidos quer separadamente ou misturados em conjunto na forma de dosagem unitária, por exemplo, como um concentrado criopreservado num recipiente hermeticamente selado tal como uma ampola, indicando a quantidade de agente ativo. Quando a composição é para ser administrada por infusão, pode ser dispensada com uma garrafa de infusão contendo água estéril de grau farmacêutico ou soro fisiológico. Quando a composição é administrada por injeção, pode ser fornecida uma ampola de água estéril para injeção ou solução salina de modo que os ingredientes possam ser misturados antes da administração. 49 aceitáveis são

Transportadores farmaceuticamente determinados em parte pela composição particular a ser administrada, bem como pelo método particular utilizado para administrar a composição. Por conseguinte, há uma grande variedade de formulações adequadas de composições farmacêuticas (ver, por exemplo, Alfonso R Gennaro (ed) , Remington: The Science and Practice of Pharmacy, anteriormente Remington's Pharmaceutical Sciences, 20 ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2003) . As composições farmacêuticas são geralmente formuladas como estéreis, substancialmente isotónicas e em plena conformidade com a regulamentação de Good Manufacturing Practices (GMP) do U.S. Food and Drug Administration.

Uma variedade de meios para a administração de células aos sujeitos será, em vista da presente memória descritiva, evidente para os peritos na técnica. Tais métodos incluem injeção das células num sitio alvo num indivíduo. As células podem ser inseridas num dispositivo de entrega, o que facilita a introdução, por injeção ou implantação em todos os indivíduos. Tais dispositivos de administração podem incluir tubos, por exemplo, cateteres, para injeção de células e fluidos dentro do corpo de um indivíduo receptor. Numa forma de realização preferida, os tubos têm adicionalmente uma agulha, por exemplo, uma seringa, através da qual as células da invenção podem ser introduzidas no sujeito num local desejado. Numa concretização preferida, as populações de células derivadas de rim de humanos são formuladas para administração num vaso sanguíneo através de um cateter (onde o termo "cateter" destina-se a incluir qualquer um dos vários sistemas de tubo para o fornecimento de substâncias a um vaso sanguíneo). Alternativamente, as células podem ser 50 inseridas numa ou sobre uma estrutura, incluindo, mas não limitado a têxteis, tais como tecidos, malhas, tranças, mechas e não tecidos, películas perfuradas, esponjas e espumas, e grânulos, tais como grânulos como sólidos ou porosos, micropartículas, nanopartículas, e semelhantes. As células podem ser preparadas para a entrega numa variedade de formas diferentes. Por exemplo, as células podem ser suspensas numa solução ou gel. As células podem ser misturadas com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, em que as células da invenção permanecem viáveis. Transportadores e diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem solução salina, soluções de tampão aquosas, solventes e/ou meios de dispersão. A utilização de tais veículos e diluentes são bem conhecidos na técnica. A solução é, de preferência estéril e fluida, e muitas vezes será isotónica. De preferência, a solução é estável sob as condições de fabrico e armazenagem e preservada contra a ação contaminante de microrganismos tais como bactérias e fungos através da utilização de, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, e afins.

Os modos de administração da população de células derivadas de rim humano da invenção incluem, mas não estão limitados a injeção sistémica, intra-renal, intravenosa ou intra-arterial e injeção direta no tecido no local pretendido da atividade. A preparação pode ser administrada por qualquer via conveniente, por exemplo, por infusão ou injeção de bolus e pode ser administrada em conjunto com outros agentes biologicamente ativos. A administração é preferivelmente sistémica. Mais preferencialmente, o local de administração é muito próximo ou mais próxima do local pretendido da atividade. Nos casos em que um indivíduo 51 sofre de isquemia global, uma administração sistémica, tal como administração intravenosa, é a preferida. Sem pretender ficar restringido por um mecanismo, a composição compreendendo uma população de células derivadas de rim humano, quando administrada, migra para casa ou para o tecido isquémico, por exemplo, no rim, em resposta a factores quimiotácticos produzidos devido à lesão. 0 tecido isquémico que pode ser tratado pelos métodos da invenção inclui, mas não está limitado a, isquemia renal.

Os métodos aqui descritos proporcionam um polipeptídeo recombinante ou um fármaco que é administrado ao individuo em combinação com a administração de células. 0 polipeptídeo ou fármaco pode ser administrado ao sujeito antes, concorrentemente ou após a administração das células. Numa concretização preferida, o medicamento ou polipeptídeo recombinante promove a angiogénese, a vasculogénese, ou ambas. Numa outra forma de realização, o polipeptídeo recombinante ou fármaco promove a proliferação ou a diferenciação da população de células derivadas de rim humano. Numa concretização, o polipeptídeo recombinante é o VEGF, FGF2, SDF, CXCR-4 ou CXCR-5, ou um seu fragmento, o qual retém uma atividade terapêutica para o tecido isquémico.

Em particular, os métodos da invenção são úteis para a vasculogénese terapêutica para o tratamento da isquemia renal em seres humanos. A administração de uma população de células derivadas de rim humano, de acordo com os métodos da invenção pode ser utilizada como um tratamento único ou como um adjuvante de modalidades de tratamento cirúrgico e/ou médico. Por exemplo, os métodos aqui descritos para o tratamento da isquemia renal, podem ser utilizados em 52 conjunto com o tratamento para o cancro renal, infecção nos rins, dano renal, transplante de rim, ou pedras nos rins. Os métodos aqui descritos são particularmente úteis para individuos que possuem uma revascularização incompleta da área isquémica após tratamentos cirúrgicos e, por conseguinte, têm áreas de tecido isquémico nos rins, mas viáveis. Motivos que podem beneficiar significativamente da vasculogénese terapêutica de acordo com os métodos descritos aqui são aqueles que têm grandes áreas de tecido viável nos rins comprometidos pela perfusão fornecidos pelos vasos que são alvos pobres para técnicas de revascularização. A quantidade terapeuticamente eficaz da população de células derivadas de rim humano da invenção é um número máximo de células que são recebidos de forma segura pelo sujeito. Como a via preferida é a injeção intra-renal, a dose máxima deve levar em consideração o tamanho dos vasos em que as células são infundidas, de modo que os vasos não se tornem congestionados ou obstruidos. 0 número minimo de células necessárias para a indução da formação de novos vasos sanguineos no tecido renal isquémico pode ser determinado empiricamente, sem experimentação excessiva, através de estudos de escalonamento de dose. Por exemplo, um tal aumento da dose poderia começar com cerca de 104 de células derivadas de rim de mamiferos por kg de peso corporal.

Um aspecto da invenção proporciona ainda uma formulação farmacêutica, compreendendo: (a) a população de células derivadas de rim humano da invenção e um veiculo farmaceuticamente aceitável. Em algumas formas de realização, a formulação compreende de 104 - 109 células 53 derivadas de rim de mamifero. Numa outra forma de realização, a formulação é preparada para administração através de um cateter. A prática da presente invenção irá empregar, sempre que adequado e salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de biologia celular, cultura celular, biologia molecular, biologia transgénica, microbiologia, virologia, ADN recombinante e imunologia, que estão dentro da pericia na técnica. Tais técnicas são descritas na literatura. Ver, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed. por Sambrook e Russell (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 2001); no tratado Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., NY.); Using Antibodies, Segunda Edição por Harlow e Lane, Cold Spring Harbor Press, Nova Iorque, 1999; Current Protocols in Molecular Biology, ed. por Bonifacino, Dasso, Lippincott-Schwartz, Harford, e Yamada, John Wiley and Sons, Inc., Nova Iorque, 1999.

Outras concretizações e utilizações serão evidentes para um perito na técnica à luz da presente divulgação. REALIZAÇÕES EXEMPLARES EXEMPLO 1

Isolamento de células derivadas de rim

Rins humanos normais foram obtidos a partir do National Disease Research Interchange (NDRI, Filadélfia, PA). Cada rim foi lavado em meio Eagles modificado por Dulbecco (DMEM de baixa glicose, Invitrogen, Carlsbad, CA) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS, Invitrogen), a fim de remover o sangue e detritos. Os tecidos foram dissecados a 54 partir da região cortical exterior, região medular interior e região subcapsular do rim. Os tecidos foram então dissociado mecanicamente em placas de cultura de tecidos até que o tecido foi picado numa polpa fina. 0 tecido foi, então, transferido para um tubo cónico de 50 mililitros. O tecido foi então digerido em quaisquer misturas de enzimas de acordo com as boas práticas de fabricação (GMP) contendo 0,25 unidades de PZ de atividade/mililitro de colagenase (NB6, N0002779, Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemanha), 2,5 unidades/mililitro de dispase (Dispase II 165 859, Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN), 1 unidade/ml de hialuronidase (Vitrase, ISTA Pharmaceuticals, Irvine, CA) ou misturas de enzimas de grau não-GMP, contendo 500 unidades/ml de colagenase (Sigma, St. Louis, MO) , 50 unidades/ml de dispase (Invitrogen) e 5 unidades/ml de hialuronidase (Sigma). Células de rim derivadas foram também isoladas, com 50 unidades/ml de dispase. A mistura de enzimas foi combinada com qualquer meio de crescimento epitelial renal (REGM) (Cambrex, Walkersville, MD) ou meio de crescimento de células mesenquimais estaminais (MSCGM) (Cambrex). Os tubos cónicos contendo as enzimas de tecido, de meio e de digestão foram incubadas a 37 °C num agitador orbital a 225 rpm durante 1 hora. A digestão foi centrifugada a 150 x g durante 5 minutos e o sobrenadante foi aspirado. O sedimento de células resultante foi ressuspendido em 20 mililitros de REGM ou MSCGM. A suspensão celular foi filtrada através de um coador de células de nylon de 40 micron BD FALCON (BD Biosciences, San Jose, CA). O filtrado foi ressuspenso em meio (volume total de 50 ml) e centrifugado a 150 x g durante 5 minutos. O sobrenadante foi aspirado e o 55 sedimento de células foi ressuspenso em 50 ml de meio de cultura fresco. Este processo foi repetido mais duas vezes.

Após a centrifugação final, o sobrenadante foi aspirado e o sedimento celular foi ressuspenso em 5 ml de meio de cultura fresco. 0 número de células viáveis foi determinado utilizando um instrumento Guava (Guava Technologies, Hayward, CA). As células foram então colocadas em placas a uma densidade de cultura de 5000 células/cm2 em frascos de cultura de tecidos revestidos com 2% gelatina ou laminina e cultivadas quer num baixo teor de oxigénio (hipoxia) ou atmosfera normal (normoxia). A Tabela 1 apresenta a informação do doador e as condições de crescimento usadas para isolar populações de células derivadas de rim. Para obter clones derivados de uma única célula de células de rim, foram realizadas técnicas de diluição limitantes. No total, as células foram isoladas utilizando vinte e quatro condições diferentes, a partir de quatro diferentes doadores cadáveres com idades entre 39, 46, 21 e 10 anos de idade. EXEMPLO 2

Morfologia celular do derivado de rim

Sete dias após o isolamento, as populações de células derivadas de rim foram avaliadas por microscopia de luz e foram observadas caracteristicas morfológicas das células. Consistentemente, todas as condições de isolamento deram origem a células com uma morfologia epitelial. (Tabela 1). 56

Tabela 1: Condições utilizadas para estabelecer culturas de células derivadas de rim. Enzimas de grau não-GMP (A). Enzimas de grau GMP (B). Dispase (C). Idade do doador em anos (idade). Atmosfera em que as culturas foram cultivadas (ATM). Normoxia (N). Hipoxia (H)

Isolamento Idade Género do doador Fonte do tecido Enzimas Meio Substrato Atm Morfologia 1 39 Masculino Córtex A REGM Gelatina N Epitelial 2 39 Masculino Medula A REGM Gelatina N Epitelial 3 39 Masculino Córtex A MSCGM Gelatina N Epitelial 4 39 Masculino Medula A MSCGM Gelatina N Epitelial 5 39 Masculino Córtex A REGM Gelatina H Epitelial 6 39 Masculino Medula A REGM Gelatina H Epitelial 7 39 Masculino Córtex A MSCGM Gelatina H Epitelial 8 39 Masculino Medula A MSCGM Gelatina H Epitelial 9 39 Masculino Córtex A REGM Laminina N Epitelial 10 39 Masculino Medula A REGM Laminina N Epitelial 11 39 Masculino Córtex A MSCGM Laminina N Epitelial 12 39 Masculino Medula A MSCGM Laminina N Epitelial 13 39 Masculino Córtex A REGM Laminina H Epitelial 14 39 Masculino Medula A REGM Laminina H Epitelial 15 39 Masculino Córtex A MSCGM Laminina H Epitelial 16 39 Masculino Medula A MSCGM Laminina H Epitelial 57

Isolamento Idade Género do doador Fonte do tecido Enzimas Meio Substrato Atm Morfologia 17 46 Masculino Subcapsular B REGM Gelatina N Epitelial 18 46 Masculino Córtex A REGM Gelatina N Epitelial 19 46 Masculino Córtex A REGM Gelatina N Epitelial 20 46 Masculino Medula B REGM Gelatina N Epitelial 21 46 Masculino Medula A REGM Gelatina N Epitelial 22 21 Masculino Subcapsular A REGM Gelatina N Epitelial 23 21 Masculino Córtex A REGM Gelatina N Epitelial 24 10 Feminino Córtex C REGM Gelatina N Epitelial

Estes dados ilustram que as células derivadas de rim podem ser isoladas a partir de um dador de qualquer idade ou género, bem como isoladas utilizando várias formulações de meios de crescimento e condições de cultura. A facilidade e consistência do procedimento de isolamento mostram que as células derivadas de rim são uma valiosa fonte de células para uso em terapias baseadas em células. EXEMPLO 3

Potencial de crescimento em células derivadas de rim Células derivadas de rim podem ser amplamente propagadas em cultura e são capazes de gerar um número significativo de células num curto espaço de tempo. Este é um critério para o desenvolvimento de terapias com células alogénicas. 58

As células derivadas de rim foram plaqueadas a 5000 células/cm2 em frascos T75 em REGM ou MSCGM e cultivadas a 37°C em 5% de dióxido de carbono. As células foram passadas a cada 2-5 dias. Em cada passagem, as células foram contadas e a viabilidade foi medida utilizando um instrumento Guave (Guave Technologies, Hayward, CA) . As populações de células foram continuamente passadas durante várias semanas até ser atingida a senescência. A senescência foi determinada quando as células não conseguiram alcançar uma duplicação maior da população durante o intervalo de tempo de estudo. Foram calculadas as duplicações da população [In (rendimento celular final/número inicial de células plaqueadas)/In2].

Para a análise de cariótipo, a passagem 4 e a passagem 10 células renais derivadas, de isolamentos 22 e 23, foram cultivadas em frascos T25 e permitidas anexar durante a noite. Os frascos foram então cheios com REGM e foi realizada a análise de cariótipo. A tabela 2 é um resumo dos dados de crescimento para isolamentos testados. Não houve nenhum efeito significativo sobre as caracteristicas de crescimento das células em relação à idade do doador, a fonte de tecido, ou enzimas utilizadas para isolar as células. A análise do cariótipo foi realizada em isolamentos 22 e 23, em ambas as passagens 4 e 10. Ambos demonstraram um cariótipo normal na passagem 4 e passagem 10. 59

Tabela 2: Resumo dos dados de potencial de crescimento. Duplicações da população (PD), Consulte a Tabela 1 para a referência cruzada do número de isolamentos

Isolamento Dias até à senescência Passagem PD Viabilidade (%) 1 54 12 31,2 98 2 54 12 26, 8 98 17 51 11 30,2 98 18 48 10 26, 8 97 19 42 9 24, 9 97 20 48 10 31,0 98 21 48 10 29, 0 98 22 47 16 28,7 97 23 47 16 27, 9 97

Em média, as duplicações da população (DP) em senescência foi de 28,5, enquanto a viabilidade média foi de 97,6%.

Em resumo, as células derivadas de rim têm um potencial de crescimento robusto em cultura. Estes dados podem ser usados para estimar o número total de células geradas a partir de um conjunto de rim humano. Se todo o tecido do rim for processado, e as células resultantes forem cultivadas durante 31 duplicações da população, todo um rim humano produziria cerca de 1,89 x 1016 células totais. Portanto, considerando que uma dose terapêutica de células é 1 x 108 células por pessoa, as células derivadas de rim, isolado a partir de um único rim seriam suficientes para tratar a 189 milhões de doentes. Por fim, estas células são 60 uma fonte altamente expansível de células para utilização em terapias baseadas em células alogénicas. EXEMPLO 4

Marcador do fenótipo de superfície celular derivada do rim A análise por citometria de fluxo foi realizada sobre as células derivadas de rim para determinar o marcador de fenótipo superficial. Células de 9 dos isolamentos no Exemplo 1, foram expandidas para passagem 4 e a passagem 10 em REGM em frascos T75 a 37°C e 5% de dióxido de carbono. As células aderentes foram lavadas com PBS e isoladas com TrypLE Select (Gibco, Grand Island, NY) . As células foram recolhidas, centrifugadas e ressuspensas em 3% (v/v) de FBS em PBS a uma concentração de 2 x 105 células/mililitro. O anticorpo específico foi adicionado a 100 microlitros de suspensão de células e a mistura foi incubada no escuro durante 30-45 minutos a 4°C. Após a incubação, as células foram lavadas com PBS e centrifugada para remover o excesso de anticorpos. As células foram ressuspensas em 500 microlitros de PBS e analisadas por citometria de fluxo. A análise de citometria de fluxo foi realizada com um instrumento Guave (Guave Technologies, Hayward, CA) . Os anticorpos usados para caracterizar o marcador do fenótipo de superfície estão apresentados na Tabela 3. 61

Tabela 3: Anticorpos usados para a caracterização da células do marcador do fenófcipo de superfície celular /3 ísav*^ ''írssαϊά Ha ν'ί w UC4. Jr viCLua uu χ,ι,ιιιι

Anticorpo Manufactura N° de catálogo CD34 Bd Pharmingen 555821 CD44 Bd Pharmingen 555478 CD45R Bd Pharmingen 555489 CD117 Bd Pharmingen 340529 CD141 Bd Pharmingen 559781 CD31 Bd Pharmingen 555446 CD4 9c Bd Pharmingen 556025 CD7 3 Bd Pharmingen 550257 CD90 Bd Pharmingen 555596 HLA-I Bd Pharmingen 555553 HLA-II Bd Pharmingen 555558 CD133 Miltenyi Biotech 120-001-243 SSEA4 R & D Systems FAB14 3 5 P CD105 SantaCruz Biotech SC-21787 CD104 Bd Pharmingen 555720 CD166 Bd Pharmingen 559263 CD2 9 Bd Pharmingen 555442 CD24 Bd Pharmingen 555428 CD5 6 AbCAM MEM188 CD138 Bd Pharmingen 550805 CD8 0 Bd Pharmingen 557226 62

Anticorpo Manufactura N° de catálogo CD8 6 Bd Pharmingen 555659 E-caderina Bd Pharmingen 612130 IgG-FITC Bd Pharmingen 555748 IgG-PE Bd Pharmingen 555749 A Tabela 4 apresenta um resumo de todos os dados do marcador do fenótipo de superfície. Todos os isolamentos testados apresentaram marcação positiva para CD24, CD29, CD44, CD49c, CD73, CD90, CD166, SSEA-4 e HLA I e marcação negativa para CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD133, CD138, CD141, E-caderina e HLA II. Além disso, todos os isolamentos analisados foram expandidos por várias gerações (passagem 10) e ainda mantinham o seu marcador do fenótipo de superfície.

Estas células expressam HLA I, mas não expressam HLA II, CD80 e CD86. Estas características de expressão de células refletem a capacidade da célula para escapar ao sistema imune do hospedeiro. Estes dados demonstram que as células derivadas de rim são não imunogénicas e podem ser administradas a um paciente, sem a necessidade de imunossupressão ou a tipagem de tecidos.

Em resumo, estes dados demonstram que as células derivadas de rim a partir de doadores múltiplos podem ser isoladas sob várias condições (Tabela 1) , e ainda mantêm o seu marcador de fenótipo de superfícieo. Além disso, expressam marcadores progenitores putativos, tais como CD24 e SSEA-4, mas não expressam marcadores comprometidos de linhagens 63 maduras, tais como a E-caderina. Finalmente, as células derivadas de rim são não imunogénicas e, portanto, constituem uma fonte atrativa de células para utilização em terapias de células alogénicas.

Tabela 4: Sumário da análise d© marcadores de superfície. Hão determinado (ND). Marcação positiva (t), Marcação

Marcadores de Nome superfície alternativo Isolamento 1 2 17 18 19 20 21 22 23 24 CD2 9 Bl-Integrina + + + + + + + + + + CD44 HCAM + + + + + + + + + + CD49C A3-integrina ND ND + + + + + + + + CD166 ALCAM + + + + + + + + + + CD24 Antigénio-1 de choque térmico ND ND + + + + + + + + CD73 SH3 ND ND + + + + + + + + CD90 Thy-1 ND ND + + + + + + + + SSEA4 Nenhum + + + + + + + + + + CD31 PECAM-1 — — — — — — — CD34 Qpl05 ‘ " " — ‘ — — CD45 Ly5 — — — — — — — CD56 NCAM ND ND " — ‘ — — 64

Marcadores de Nome superfície alternativo Isolamento 1 2 17 18 19 20 21 22 23 24 CD104 B4-Integrina — ‘ " " " " " CD138 Syndecan-1 ND ND " " ' ' " — CD141 Trombomodulina ND ND ‘ " " " ‘ — E-CADERINA Nenhum — — " — CD105 Endoglin — — " — CD117 Kit-C — ‘ " " " ‘ — CD133 AC133 — — — — CD8 0 B7-1 ND ND ND ND ND ND ND — — CD8 6 B7-2 ND ND ND ND ND ND ND — HLA I MHC-a,b,c ND ND ND ND ND ND ND + + + HLA II MHC-DP, DQ, DR ND ND ND ND ND ND ND + + + EXEMPLO 5

Expessão genética de células derivadas de rim 0 ARN foi extraído a partir de células a partir dos isolamentos 1, 2 e 17-23, utilizando um kit de extração de ARN (RNeasy Mini Kit, Qiagen, Valência, CA) . 0 ARN foi eluído com 50 microlitros de água tratada com DEPC e armazenado a -80°C. O ARN foi transcrito reversamente usando hexâmeros aleatórios com os reagentes de transcrição reversa TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA) a 25°C durante 10 minutos, 37°C durante 60 minutos e 95°C durante 10 minutos. As amostras foram armazenadas a -20°C. Com os iniciadores descritos na Tabela 5, os genes selecionados 65 foram investigados por PCR convencional (reação em cadeia da polimerase) . A PCR foi realizada em amostras de cADN, utilizando conjuntos de iniciadores de PCR RT2 (SuperArray Biosciences Corp, Frederick MD).

Tabela 5: Iniciadores utilizados no estudo

Gene N° do catálogo SuperArray Oct-4 PPH02394A Rex 1 PPH02395A Sox2 PPH02471A TERT Humano (hTERT) PPH00995A FGF4 PPH00356A Pax2 PPH06881A Caderina-11 PPH0667A WT1 PPH00254A F0XD1 PPH01990A WNT4 PPH02445a Epo PPH01338A EpoR PPH02642A Eyal PPH10542A HNF3B PPH00976A Soxl7 PPH02451A Gata4 PPH010860A Six2 PPH10860A CXCR4 PPH00621A 66

Gene N° do catálogo SuperArray BMP-2 PPH00549A BMP-7 PPH00527A GDF5 PPH01912A

Os iniciadores foram misturados com 1 microlitro de cADN e 2X ReactronReady SYBR Green PCR Master Mrx (SuperArray Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante e a PCR foi realizada utilizando um sistema ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA) . As condições de ciclos térmicos foram, inicialmente, de 50°C durante 2 min e 95°C durante 10 min seguidos por 34 ciclos de 95°C durante 15 seg e 60°C durante 1 min. Para a GAPDH, a PCR foi realizada utilizando os iniciadores GAPDH da Applied Biosystems (cat #: 402869) 1 microlitro de solução de cADN e 1 x tampão de mistura de reação de PCR universal AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, Foster City, CA) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração dos iniciadores na reação de PCR final foi de 0,5 micromolar, tanto para o iniciador direto e inverso e a sonda TaqMan não foi adicionada. As amostras foram corridas em 2% (p/v) de gel de agarose e coradas com brometo de etidio (Sigma, St. Louis, MO) . As imagens foram capturadas usando um filme Twinpack Universal 667 (VWR International, South

Plainfield, NJ) e uma câmara de distância focal Polaroid™ (VWR International, South Plainfield, NJ). Para cada um dos genes analisados, o produto final de PCR foi excisado do gel e a sequência alvo foi confirmado por sequenciação de ADN. 67

Análise de RT-PCR

Todos os isolados de células analisadas apresentaram um perfil de expressão gênica constante e estável. A análise de RT-PCR foi realizada nos isolamentos 1, 2, e 17-23, a fim de detectar a expressão do gene marcador de desenvolvimento precoce (Oct-4, Rex-1, Sox2, FGF4, hTERT), genes marcadores de desenvolvimento do rim (Pax- 2, WT-1, Eya-1, Wnt-4, BMP-7, caderina-11, FoxDl), marcadores genéticos mesenquimais metanéfricos (Pax-2, Eya-1, TP-1, Six2 e FoxDl), e genes que promovem a sobrevivência do mesênquima metanéfrico (BMP-7). Além disso, foram analisados a expressão de outros genes de desenvolvimento, tais como genes da endoderme (HNF3B CXC-R4, Sox-17, GATA-4), bem como marcadores de genes que promovem a reparação renal ou têm valor terapêutico no tratamento da doença renal (Epo, EpoR, BMP-7, BMP-2, GDF5).

Como mostrado na Tabela 6, todos os isolamentos mostraram expressão positiva para Oct-4 e Rex-1 e expressão negativa para Sox2, FGF4, hTERT e Wnt-4. Os isolamentos 17-23 apresentaram expressão positiva para o Pax-2, WT1, caderina-11 e FoxDl. Os isolamentos 22 e 23 apresentaram expressão positiva para Eya-1, Sox-17 e CXCR-4 e expressão negativa para GATA-4. Os isolamentos 17-23 expressaram

EpoR, mas não expressaram Epo. Os isolamentos 17-22 expressaram BMP-2, BMP-7 e GDF5. Além disso, todos os isolamentos podem ser expandidos em múltiplas gerações (passagem 10), e ainda manter a sua expressão fenotipica de genes. 68

Tabela 6: Resumo da análise de expressão génica. Expressão positiva {-t-) . Expressão negativa {-) . Não determinado (ND) , Genes que funcionam durante o desenvolvimento precoce (desenvolvimento precoce). Os genes que funcionam durante o desenvolvimento renal (desenvolvimento do rim). Marcadores mesenquimais metanéfricos (MET). Marcadores de linhagem endodermal (endoderma), Os genes envolvidos na sobrevivência do rim (renoprotetores). Genes envolvidos na sobrevivência do mesenquima metanéfrico (Sobrevivência)

Isolamento 1 2 17 18 19 20 21 22 23 Nome do gene Função 0ct4/pfu Desenvolvimento precoce + + + + + + + + + Rex-1 Desenvolvimento precoce + + + + + + + + + Sox2 Desenvolvimento precoce FGF4 Desenvolvimento precoce hTert Desenvolvimento precoce Pak2 Desenvolvimento do rim, Met ND ND + + + + + + + Caderina-11 Desenvolvimento do rim ND ND + + + + + + + FoxDl Desenvolvimento do rim, Met ND ND + + + + + + + 69

Isolamento 1 2 17 18 19 20 21 22 23 Nome do gene Função WT-1 Desenvolvimento do rim, Met ND ND + + + + + + + Eyal Desenvolvimento do rim ND ND ND ND ND ND ND + + Wnt-4 Desenvolvimento do rim ND ND ND ND ND ND ND SIX2 Met ND ND ND ND ND ND ND GATA-4 Endodermo ND ND ND ND ND ND ND HNF3N Endodermo ND ND ND ND ND ND ND + + CXC-R4 Endodermo ND ND ND ND ND ND ND + + Sox-17 Endodermo ND ND ND ND ND ND ND + + EpoR Renoprotector ND ND ‘ " ‘ BMP2 Renoprotector ND ND + + + + + ND ND GDF5 Renoprotector ND ND + + + + + ND ND BMP7 Desenvolvimento do rim, sobrevivência ND ND + + + + + ND ND

Em resumo, as células derivadas de rim expressam genes envolvidos no desenvolvimento precoce e desenvolvimento do rim. Expressam marcadores para o mesenquima metanéfrico e marcadores de células progenitoras renais. Expressam marcadores endoderme, bem como fatores envolvidos na reparação renal e tubulogenesis. 70

No total, estes dados demonstram que as células derivadas de rim são uma fonte de células progenitoras renais putativas que podem ser utilizadas para terapias baseadas em células para proteger ou reparar tecido de rim danificado. EXEMPLO 6

Análise de secreção do factor trófico Células derivadas de rim foram mostradas produzir consistentemente fatores tróficos que protegem e reparam os rins. Assim, estas células podem servir como um agente terapêutico para o tratamento da doença renal.

As células da passagem 3, a partir dos isolamentos 17-21 foram cultivadas a 5000 células/cm2 num frasco T75/isolamento, cada uma contendo 15 mililitros de REGM. As células foram cultivadas a 37 °C em 5% de dióxido de carbono. Após cultura durante a noite, o meio foi mudado para um meio isento de soro (DMEM de baixa glicose (Gibco), 0,1% (p/v) de albumina de soro bovino (Sigma), penicilina (50 unidades/mililitro) e estreptomicina (50 microgramas/ mililitro) (Gibco)) e cultivadas durante mais 8 horas. O meio condicionado, isento de soro, foi recolhido no fim da incubação por centrifugação a 14000 x g durante 5 min e armazenado a -20°C.

As células foram lavadas com PBS, individualizadas utilizando 4 mililitros de TrypLE Select (Gibco) e contadas com um instrumento Guava (Guava Technologies, Hayward, CA) para estimar o número de células em cada frasco. Utilizando matrizes Proteome Searchlight (Pierce Biotechnology Inc.), as amostras foram então analisadas por 71 inibidor ELISA para os seguintes factores tróficos: tecidual da metaloproteinase-1 (TIMP-1), inibidor de tecido da metaloproteinase-2 (TIMP-2), factor de crescimento epitelial derivado de plaquetas (PDGF-bb), factor de crescimento de queratinócitos (KGF), factor de crescimento de hepatócitos (HGF), factor de crescimento de fibroblastos básicos (FGF2), factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), factor de crescimento epidérmico de ligação à heparina (HB-EGF), proteina quimiotática de monócitos-1 (MCP-1), interleucina-6 (IL— 6), interleucina-8 (IL-8), factor de transformação de crescimento alfa (TGFa), factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator derivado estromal lb (SDFIb), factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor básico de crescimento dos nervos (b-NGF), neurotrofina-3 (NT-3), crescimento relacionado com alfa-oncogene (GRO-oí), interleucina-lb (IL-lb), interleucina-12p40 (IL-12p40), interleucina-12p70 (IL-12p70), interleucina-11 (IL-11), interleucina-15 (1-15), matriz de metaloproteinase-2 (MMP-2), matriz de metaloproteinase-9 (MMP-9), angiopoietina-2 (ANG-2) e hormona de crescimento humano (HGH).

Análise da produção de fator trófico. A secreção de vinte e sete diferentes factores de crescimento e citoquinas foi analisada nos isolamentos 17-21. Os resultados estão resumidos na Tabela 7. Todos os isolamentos segregaram TIMP-1, TIMP-2, VEGF, e MMP-2 em mais de 300 picograms/mililitro/lxlO6 células/8 horas. Segregaram 50-300 picograms/mililitro/lxlO6 células/8 horas de FGF2 e de HGF e 1-50 picograms/mililitro/lxlO6 células/ 8 horas de KGF, PDGF-BB, NGF-b, IL-12p40 e IL-11. SDF-1, ANG-2, HGH e IL-12p70, não foram detectados. 72

Em resumo, estes dados mostram que as células derivadas de rim segregam vários factores tróficos para a proteção e reparação de tecido de rim danificado. Por exemplo, FGF2, HGF, TGFa têm sido implicados na reparação renal. Células derivadas de rim segregam estes factores em niveis elevados e consistentes. Assim, estas células são uma fonte valiosa de células para utilização em terapias que visem doenças renais.

Tabela 7: Análise de ensaio ELISA Searchlight multiplexado da produção de factor trófico a partir de células derivadas de rim. Isolamento "apenas meio" é uma amostra de controlo de meio livre isolado sem condicionamento. As unidades mostradas são em picogramas/mililitro/lxlO6 células/8 horas. Os resultados mostrados são a média das medições em duplicado ISOLATIONf TÍMP1 ANG2 KGF FGF2 PDGF- bb HGF I VEGF Jhb-egf TGFa Media oniy <9.8 <9.8 <2.0 <10.8 <2 <6.2 1 <9.8 <3.7 <2.3 17 5699.4 <9.8 20 148.4 <2 91.9 416.3 461 67.7 18 6054,8 <9.8 11.1 62:4 5.7 91 329.7 35.1 59.1 19 6710.6 <9.8 35.1 160.1 <2 320.9 580.5 70.2 119 20 9483.7 <9.8 14.1 86.6 5 80.3 294.3 24.6 37.4 21 2705 <9.8 13.8 91.5 <2 162 298.4 I 32,4 34.6 jlSOtATION HGH SDF1b 8NGF MMP9 iL1b MMP2 GROa MCP1 IL6 | Media only <9.8 <50.0 1.2 <39.1 <0.4 <62.5 <0.8 2.1 <0.8 17 <9.8 <50.0 3 <39.1 <0.4 3240 36,8 29.8 38.7 18 <9.8 <50,0 6.5 145 1.6 3487.6 95 32.7 40.5 19 <9.8 <50.0 20.8 <39.1 3.3 3565.9 37.1 48.8 44.9 20 <9.8 <50.0 62 108 1.4 3191.3 499.8 340.9 80 I 21 <9.8 <50.0 5.8 <39.1 2.2 2814.1 14.2 30.2 19.5 tSOLATION 8DNF NT3 IL15 I TIMP2 IL8 IL11 JL12p48 JL12p70 CNTF Media only <6.2 <1.6 <0.8 10 <0.8 <2 <1.2 <1.2 9 17 <6.2 <16 3.4 2266.2 31.6 20.5 14.9 <1.2 30.1 18 <8.2 5-4 2.7 1841.4 115.8 20.8 6.2 <1.2 <7,8 19 <6.2 13 5.2 1376.7 36.4 29.3 21.5 <1.2 93 20 16.2 12.3 2.3 1785 622.2 20.5 8.7 <1.2 21.7 21 <6.2 <1.6 <0.8 ! 1193 12 19.1 9,3 <1.2 <7.8 73 EXEMPLO 7

Crescimento das células derivadas de rim em estruturas de poliéster

Existe uma necessidade significativa de materiais básicos que possam ser utilizados para reconstruir o tecido do órgão. Células derivadas de rim foram cultivadas em estruturas de poliéster sintético para produzir estruturas semelhantes a tecido que servem como materiais de blocos de construção básicos para aplicações em manipulação de tecidos renais.

As células derivadas de rim foram cultivadas em várias peliculas fundidas solventes de poliéster. Foram preparadas peliculas de 35/65 poli (e-caprolactona-co-glicolido) (PCL/ PGA) de 100 milímetros de diâmetro. Uma solução de 5% de polímero foi preparada por dissolução de 20 g de 35/65 PCL/PGA (Ethicon, Somerville, NJ) (viscosidade inerente = 1,45 decilitros/grama), em 380 g de 1,4-dioxano anidro (Aldrich, Milwaukee, WI) a 70°C. As películas foram expressas por vazamento de 3,5 mililitros de solução de polímero para 100 x 15 mm de pratos de Petri de polimetilpenteno Nalgene (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) .

Foram preparadas películas de 45/55 poli (e-caprolactona-co-glicolido) (PCL/ PGA) de 100 milímetros de diâmetro. Uma solução de 5% de polímero foi preparada por dissolução de 20 g de 45/55 PCL/PGA (Ethicon, Somerville, NJ) (viscosidade inerente = 1,88 decilitros/grama), em 380 g de 1,4-dioxano anidro (Aldrich, Milwaukee, WI) a 70°C. As películas foram expressas por vazamento de 3,5 mililitros de solução de polímero para 100 x 15 mm de pratos de Petri de polimetilpenteno Nalgene (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) .

Foram preparadas películas de 45/55 poli (e-caprolactona-co-glicolido) (PCL/ PGA) de 55 milímetros de diâmetro. Uma solução de 5% de polímero foi preparada por dissolução de 20 g de 45/55 PCL/PGA (Ethicon, Somerville, NJ) (viscosidade inerente = 1,88 decilitros/grama), em 380 g de 1.4- dioxano anidro (Aldrich, Milwaukee, WI) a 70°C. As películas foram expressas por vazamento de 2,5 mililitros de solução de polímero para 55 x 15 mm de pratos de Petri de polimetilpenteno Nalgene (Ted Pella Inc., Redding, CA).

Foram preparadas películas de 40/60 poli (e-caprolactona-co-glicolido) (PCL/ PGA) de 55 milímetros de diâmetro. Uma solução de 10% de polímero foi preparada por dissolução de 40 g de 40/60 PCL/PGA (Ethicon, Somerville, NJ) (viscosidade inerente = 1,20 decilitros/grama), em 360 g de 1.4- dioxano anidro (Aldrich, Milwaukee, WI) a 70°C. As películas foram expressas por vazamento de 5,0 mililitros de solução de polímero para 55 x 15 mm de pratos de Petri de polimetilpenteno Nalgene (Ted Pella Inc., Redding, CA).

Todas as películas fundidas foram frouxamente tapadas e colocadas dentro de um fumeiro de funcionamento com uma velocidade de fluxo de 100 pés/min durante 4 dias. O solvente residual foi removido das películas por posterior secagem em estufa de vácuo (0,1-0,2 mm Hg) a 70°C durante um período de 4 dias. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, as películas foram esterilizadas por incubação em etanol a 100% durante a noite à temperatura ambiente. As películas foram então secas ao ar, lavadas com PBS e as 75 células dos isolamentos 17 ou 18 foram cultivadas sobre as películas a 5000 células/cm2 em REGM e cultivados a 37°C durante 4-9 dias.

Análise do crescimento de células derivadas de rim em estruturas de poliéster.

Os isolamentos 17 ou 18 foram cultivados em REGM em várias películas de poliéster com solvente fundido, tal como está resumido na Tabela 8. Em cada caso, as estruturas baseadas em PCL/PGA suportaram o crescimento de uma monocamada de células intactas. Além disso, as combinações células/películas foram levantadas a partir do prato de fundição, mantendo ao mesmo tempo uma estrutura de monocamada de células. Estas construções de células/películas derivadas de rim podem ser utilizadas como uma folha de células de materiais em aplicações de manipulação de tecidos.

Tabela 8: Resumo de células derivadas de rim testadas em diferentes películas

ISOLAMENTO ESTRUTURA Isolamento 17 35/65 PCL/PGA Isolamento 18 45/55 PCL/PGA Isolamento 18 60/40 PCL/PGA Isolamento 18 45/55 PCL/PGA Isolamento 18 35/65 PCL/PGA 76 EXEMPLO 8

Tubulogenesis celular derivada de rim in vitro Células derivadas de rim pode ser descongeladas na passagem 4 e passagem 10 e em seguida trituradas numa suspensão de uma única célula em 4 x 104 células/mililitro de uma solução de colágeno tipo I, contendo 66% de Vitrogen 100 (3 miligramas/mililitro (Cohesion Technologies, Paio Alto, CA) . As células em suspensão podem ser plaquedas numa membrana de omento de-celularizado. A mistura de colagénio/ célula pode então ser incubada durante 30 minutos a 37°C, 5% de C02, 95% de ar para permitir que o colagénio gel e, em seguida, é adicionado meio de cultura. As células são alimentadas a cada 3 dias durante 7 dias. No dia 7, as culturas são tratadas com várias concentrações de factor de crescimento de hepatócitos e ainda cultivadas até ser observada a tubulogenesis.

Estas observações demonstram que as células derivadas de rim podem auto-organizar-se em estruturas tubulares in vitro. Estas estruturas têm valor como blocos de construção para aplicações de reconstrução de rins, bem como para o desenvolvimento do rastreio de fármacos e ensaios de toxicologia. EXEMPLO 9 Células derivadas de rim para o rastreio de fármacos e ensaio toxicológico

As células derivadas renais humanas oferecem novas oportunidades para a descoberta e avaliação da segurança de moléculas terapêuticas in vitro. Túbulos derivados de células derivadas de rim possibilitam o desenvolvimento de um nefrotóxico, bem como sistema de modelo nefrogénico para a descoberta de novos fármacos renais regenerativos ou 77 renoprotetores. Esta descoberta de fármacos de células derivadas de rim e do sistema de plataforma de ensaio toxicológico vai reforçar a investigação e desenvolvimento de novos compostos para o tratamento da doença renal.

As células derivadas de rim podem ser colocadas em placas a 5000 células/cm2 em poços de uma placa de 96 poços utilizando os métodos descritos no Exemplo 8. Estas placas servem como sistema de ensaio para testar vários compostos e pequenas moléculas quanto à sua capacidade para melhorar ou prevenir a formação de túbulos. Para determinar os efeitos dos vários compostos, os poços individuais são analisados através de microscopia de luz para tubulogenesis e a formação de redes de ramificação de túbulos. Além disso, a RT-PCR pode ser realizada sobre células em cada poço individual utilizando os métodos descritos no Exemplo 5.

As células derivadas de rim podem ser cultivadas num formato de 96 poços e tubulogenesis pode ser modulada por meio da adição de vários compostos e medicamentos de moléculas pequenas. Diferentes factores de crescimento e medicamentos podem induzir a tubulogenesis em células derivadas de rim e a ramificação, bem como aumentar a expressão do gene BMP-7, BMP-2, GDF5, receptor de BMP-1 e receptor de BMP-2. Um aumento da regulação destes genes está correlacionado com o aumento da formação de túbulos. Um aumento de BMP-7 também sugere que o fármaco de teste irá promover a reparação renal pelo aumento de BMP-7 no rim danificado. Do mesmo modo, uma sub-regulação ou ausência de expressão de genes está correlacionada com a inibição da tubulogenesis ou a citotoxicidade, bem como uma diminuição 78 da capacidade para o fármaco de teste estimular a reparação de rim.

Em resumo, a exploração da capacidade de células derivadas de rim para formar os túbulos assim como a expressão de moléculas de BMP e seus receptores, oferece a oportunidade de se desenvolver um novo sistema de descoberta de fármacos e da plataforma de ensaio toxicológico. Este sistema de ensaio irá melhorar a pesquisa e desenvolvimento de novos compostos para o tratamento da doença renal. EXEMPLO 10

Multipotencialidade das células derivadas de rim

As células derivadas de rim são uma fonte potencial de células progenitoras capazes de diferenciação em adipócitos e osteoblastos. Estes dados demonstram a natureza multipotencial de células derivadas de rim e ilustra ainda mais as suas características de célula progenitora.

Para ensaios de diferenciação, as células derivadas de rim podem ser cultivadas em meio REGM em 5% de C02 a 37°C por uma semana antes de serem alteradas para adipogénicas (DMEM/F12, 3% de FCS, 33 de biotina micromolar, 17 micromolar de pantotenato, 100 nanomolar de insulina, 1 micromolar de dexametasona, 0,25 micrograma/ml de anfotericina Be 0,25 milimolar de IBMX) ou osteogénicas em meio de diferenciação (DMEM, FCS a 10%, 0,2 milimolar de ácido ascórbico, 25 milimolar de β-glicerofosfato, 500 nanomolar de dexametasona, 20 nanomolar de glutamina). As células podem ser cultivadas durante um adicional de 3 semanas, com troca de meio a cada segundo dia, depois fixadas durante 10 minutos em 4% de paraformadeido. 0 adipocitesare identificado por coloração com Vermelho do 79

Nilo (Sondas moleculares, 1:2000 em PBS) durante 15 min. Os osteoblastos são identificados pelo ensaio da fosfatase alcalina utilizando 0,1 miligramas/mililitro de sal Fast Blue BB (Sigma), 0,1 miligramas/mililitro de fosfato Naftol AS-MX (Sigma), e 2 milimolar de MgCl2 em 0,1 molar de Tris-HC1 (pH 8,5) . As imagens são capturadas com uma câmara digital Nikon conectada a um microscópio invertido Nikon TS 100 ECLIPSE. Foram usadas células 10T1/2 como controlo positivo em ensaios de diferenciação.

Depois de três semanas, em meio adipogénico, os adipócitos podem ser identificados pela acumulação de goticulas lipidicas coloridas com vermelho do Nilo dentro do compartimento citoplasmático das células derivadas de rim. Depois de três semanas, em meio osteogénico, os osteoblastos podem ser identificados por um aumento na atividade de fosfatase alcalina em comparação com o crescimento de células derivadas de rim apenas em REGM.

Em resumo, estes dados mostram ainda gue as células derivadas de rim são células progenitoras potenciais, capazes de diferenciação em, pelo menos, duas linhagens de células distintas, os adipócitos e os osteoblastos. Estas células são, por conseguinte, uma fonte de células para a regeneração renal e aplicações de terapia celular. EXEMPLO 11

Tubulogenesis de células derivadas de rim in vivo

Três películas 35/65 PCL / PGA (10 cm de diâmetro x 2 mm de espessura), foram cultivadas com células derivadas de rim humano (10000 células/cm2) em REGM (Cambrex) , a 37°C e 5% de dióxido de carbono durante 8 dias (como descrito no 80

Exemplo 7). Foi preparada uma estrutura de espuma de 35/65 PCL/PGA de acordo com os métodos descritos na Patente US 6355699. As células/construções de pelicula foram então removidas do prato de pelicula de fundição, empilhadas em três camadas e aplicadas a um suporte de espuma de 35/65 PCL/PGA. Esta construção foi então cultivada durante um adicional de 24 horas e, em seguida, cortada em pedaços quadrados de 3 x 3 mm antes da implantação. Os implantes foram então lavados com PBS e transferidos para uma placa de 6 poços com PBS durante o transporte.

Os implantes foram implantados bilateralmente por via subcutânea na região dorsal lateral, torácico-lombar de ratinhos SCID. Ratinhos SCID machos (Fox Chase SCID CB estirpe 17SC) foram adquiridos a Taconic Inc., (Hudson, Nova Iorque) e tinham 5 semanas de idade. Dois dispositivos foram colocados em cada um dos ratinhos SCID. Duas incisões, cada uma com aproximadamente 5 mm de comprimento, foram feitas no dorso dos ratinhos. As incisões foram colocadas transversalmente ao longo da zona lombar cerca de 5 mm de palpação craniana à cristã iliaca, com uma em cada lado da linha mediana. A pele foi então separada a partir do tecido conjuntivo subjacente para fazer um pequeno bolso, e o implante foi colocado cerca de 10 mm para a incisão cranial. As incisões foram fechadas com sete clipes para feridas de metal Reflex. Após 3 semanas, os implantes foram removidos da bolsa subcutânea, fixados em formalina a 10%, embebidos em parafina, seccionados e corados com hematoxilina e eosina (H&E) e avaliadas por um patologista usando técnicas de microscopia de luz.

As células derivadas de rim formaram estruturas semelhantes a túbulos dentro das camadas da pelicula de PCL/PGA. Estes 81 túbulos mostraram uma parede epitelial distinta e um lúmen claro. As células derivadas de rim infiltraram-se na estrutura de espuma, depositando na matriz extracelular, e formando uma estrutura densa, semelhante a tecido. Além disso, as células derivadas de rim dentro da espuma estimularam a angiogénese e a formação de redes vasculares.

Em resumo, as células especificas do rim humano formaram estruturas tubulares, após exposição a um microambiente in vivo. A capacidade das células derivadas de rim de responder a sinais do microambiente e instruir as células para formar túbulos ilustra ainda mais a natureza de células progenitoras renais destas células. Além disso, as células migraram para as estruturas de espuma, formando uma estrutura semelhante a tecido que promoveu a angiogénese. Estes dados ilustram a utilidade das células derivadas de rim como como blocos de construção para a reconstrução de túbulos renais e, finalmente, para utilização em aplicações de manipulação de tecidos renais. EXEMPLO 12 Células derivadas de rim são renoprotetoras em modelos animais da doença renal Células derivadas de rim segregam vários factores tróficos que têm sido implicados na reparação e regeneração renal (ver Exemplo 6) . Portanto, quando as células derivadas de rim são administradas a um animal que tenha sofrido lesões renais, as células vão produzir factores tróficos que protegem e reparam o rim danificado. Células derivadas de rim serão testadas para a renoproteção em três diferentes modelos animais de insuficiência renal aguda, lesão induzida por fármaco, lesão de isquemia-refluxo e lesão induzida de obstrução do uréter. 82 A indução da insuficiência renal A isquemia/lesão de refluxo será induzida como segue. Ratos serão colocados numa gaiola limpa com água suficiente. A área cirúrgica será preparada por corte do pêlo. Os ratos (ratos de seis a oito semanas de idade C57BL/6J serão adquiridos em The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine) serão anestesiados por injeção de cetamina (100 mg/kg) e xilazina (mg/kg), por via intraperitoneal. O nivel de anestesia será avaliado pela falta de reflexo de beliscão na pata.

Os ratinhos anestesiados serão colocados no seu lado dorsal e ventral desinfectado com Betadine. Uma pequena incisão na linha média vai ser feita, em primeiro lugar na pele e, em seguida, no músculo peritoneal. Os intestinos irão ser movidos suavemente para o lado, os rins serão expostos e as artérias renais identificadas. Ambas as artérias renais serão presas durante 25 ou 30 minutos usando grampos vasculares. Durante este tempo, o rato vai ser mantido quente com almofadas de aquecimento de água circulante. Além disso, a área exposta será mantida aquecida com pedaços de gaze estéril quente e embebidas em soro fisiológico morno. Trinta minutos mais tarde, os grampos serão removidos, a parede peritoneal suturada com uma ou duas suturas descontínuos e a pele será fechada com grampos para feridas. A insuficiência renal induzida por fármacos vai ser realizada em ratinhos, utilizando uma única injeção subcutânea de cisplatina (5 ou 10 mg/kg). A insuficiência renal por obstrução do uréter induzida vai ser gerada em ratinhos como se segue. Os ratos serão anestesiados com isoflurano (1-3%). O abdómen será raspado e lavado com álcool a 70%, seguido de betadine. A incisão 83 abdominal na linha média de 2 centímetros será feita e a parede abdominal aberta. 0 rim esquerdo e o uréter serão dissecados e livres de gordura. Duas ligaduras 8-0 não absorvíveis serão colocadas no uréter, que é então cortado transversalmente entre as ligaduras. Os intestinos serão devolvidos ao abdómen e a camada muscular fechada com Dexon 4-0 e a pele fechada com agrafos.

Transplante de células

No momento da injeção das células, as células derivadas de rim serão descongeladas a 37°C (banho de água) e lavadas duas vezes em PBS e ressuspensas em 1 ml de PBS. As células serão contadas usando um hemocitómetro. A viabilidade celular é determinada por exclusão do corante azul de tripano. As células devem ter uma viabilidade de 75% ou superior no momento da injeção. Se a viabilidade for inferior a 75%, em seguida, as células serão descartadas. As células serão reconstituídas a uma concentração de 0,5 x 106 células/300 microlitros de PBS ou Ο,ΙχΙΟ6 células/300 microlitros de PBS. As células em suspensão em PBS (veículo transportador) vão ser injetadas na veia facial anterior, utilizando uma seringa de 1 ml equipada com uma agulha de calibre 26. Para estudos de lesões induzidas de isquemia/refluxo e obstrução do uréter, dez ratinhos por grupo de tratamento vão ser injetados com células ou PBS duas horas após a lesão. Para os estudos de insuficiência renal induzida por fármacos, todos os animais receberão células ou PBS 24 horas após a lesão.

Amostras de sangue (50 microlitros) serão recolhidas a partir da veia da cauda antes da indução da insuficiência renal e nos dias 2, 5 e 7. A creatinina sérica será analisada usando detecção por HPLC. Os níveis sanguíneos de 84 ureia-azoto (BUN) vão ser medidos utilizando um kit de detecção da Roche Diagnostics Systems (Branchburg, NJ).

Devido à secreção de factores tróficos renoprotetores, as células derivadas de rim podem prevenir o dano renal em modelos animais de insuficiência renal. EXEMPLO 13

Avaliação da eficácia renoprotetoras das células derivadas de rim de um modelo do roedor da doença da nefropatia obstrutiva 0 objetivo do estudo piloto foi avaliar o efeito renoprotetor de células derivadas de rim humano (HKDC) num modelo de lesão renal de obstrução ureteral unilateral (UUO) . 0 modelo UUO é um modelo eficaz para a nefropatia obstrutiva de curto prazo, e fibrose túbulo-intersticial. Para avaliar a eficácia renoprotetora, a biodistribuição de células, o sangue-nitrogénio-ureia (BUN), a creatinina sérica (SCR) e lesões histológicas foram avaliadas em ratos lesionados 12 dias após a transplantação de células. Neste relatório, os dados mostram que, no momento da necropsia, HKDC estavam presentes em ambos os rins lesados e não lesados. A avaliação histológica demonstrou que a administração de 0,2 X 106 HKDC causou uma redução mensurável da extensão total da lesão induzida pela obstrução da uretra tubular.

Apesar das muitas etiologias diferentes da doença renal crónica (DRC), a inflamação no espaço túbulo-intersticial, levando à fibrose, é uma caracteristica histológica de insuficiência renal crónica. Embora o uso generalizado de inibidores da enzima angiotensina conversora e bloqueadores 85 dos receptores da angiotensina para CKD representa um sucesso notável médico, esses fármacos raramente param a fibrose renal. Portanto, o desenvolvimento de novas estratégias que impeçam ou inibam a fibrinogénese intersticial é uma meta importante para a melhoria do padrão atual de tratamento. Apesar dos esforços focados no desenvolvimento de terapias farmacológicas baseadas em pequenas moléculas, as investigações numa abordagem baseada em terapia celular são limitadas.

Estudos recentes têm demonstrado que a medula óssea derivadas de células estaminais mesenquimais (MSCs) são renotrópicas e ajudam a reparar os rins após a isquemia-reperfusão induzida por fármacos. Morigi et. al., Mesenchymal stem cells are renotropic, helping to repair de kidney and improve function in acute renal failure. J Am Soc Nephrol. Julho 2004, 15 (7):1794-804; Klahr e Morrissey. Obstructive nephropathy and renal fibrosisl. Am J Renal Physiol. Novembro 2002, 283 (5): F861-75.2002. Foi também demonstrado que as MSCs podem prevenir a insuficiência renal aguda induzida por glicerol. Herrera et al, Mesenchymal stem cells contribute to the renal repair on acute tubular epithelial injury. Int. J Mol Med. Dezembro 2004, 14(6):1035-1041. Curiosamente, estes efeitos protetores mediados por MSC, podem não agir por meio de mecanismos de diferenciação de células estaminais, mas sim através da secreção de fatores tróficos importantes que impedem a lesão celular e promovem a reparação epitelial e endotelial. MSCs têm realmente melhorado o resultado de lesão renal aguda em diversos modelos animais, mas se as MSCs podem atrasar a insuficiência renal crónica na doença renal está 86 ainda paRa ser determinado. Estudos têm demonstrado recentemente que as MSCs transplantadas poderiaM prevenir a perda de capilares peritubulares, bem como reduzir os marcadores de fibrose renal num modelo de rato da doença de Alport. Ninichuk et al., Multipotent mesenchymal stem cells reduce interstitial fibrosis but do not delay progression of chronic kidney disese in collagen4-A3-deficient mice. Kidney Int. 2006 Julho; 70(1):121-9. Infelizmente, este estudo mostra também que as MSCs transplantadas foram incapazes de promover a sobrevivência dos animais, ou mesmo retardar o aparecimento de insuficiência renal.

No estudo atual, os efeitos renoprotetoras e anti-fibróticos do HKDC no modelo de rato WO foi investigada. O modelo UUO da nefropatia obstrutiva, tem provado ser uma ferramenta valiosa para estudar as alterações celulares e moleculares que ocorrem dentro do interstício do rim. Este modelo também tem demonstrado utilidade na determinação da eficácia de tratamentos destinados a travar, ou mesmo inverter a fibrose, e, finalmente, a progressão de muitas doenças renais crónicas. Métodos

Modelo animal. Treze, ratos fêmeos CS7BL/6J (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine) foram anestesiados com 1-3% de isofluorano. O abdómen de cada animal foi rapado e limpo com álcool a 70%, seguido de betadine. Foi feita uma incisão abdominal na linha média. A parede abdominal foi aberta e os intestinos foram removidos para o peito e protegidos com gaze molhada. O rim esquerdo foi localizado e o uréter dissecado livre de gordura. Duas ligaduras 8-0 não absorvíveis foram colocadas sobre o uréter. Para o grupo de tratamento simulado, não foram usadas ligaduras. 87

Os intestinos foram devolvidos ao abdómen e um centímetro cúbico de solução salina quente foi colocado no interior da cavidade peritoneal. A camada de músculo foi então fechada com Dexon 4-0 e a pele fechada com agrafos. O isoflurano foi descontinuado e os animais foram deixados recuperar com 100% de oxigénio sobre uma almofada de aquecimento até ao ambulatório.

Preparação de células. HKDC, número de lote 032906, passagem 6 foram isoladas e expandidas como descrito no Relatório CBAT da invenção "Isolation of Human Kidney Derived Cells (Estudo 2)", 29 de Março de 2006, David

Colter, Agnes Seyda, Charito Buensuceso, Walter Laredo). HUTC (lote n° 2512380, passagem 6) foi obtido a partir do Stem Cell Internai Venture (Radnor, PA).

Transplantação de células. Imediatamente após os animais terem recuperado da cirurgia, HUTC e a passagem 10 hKDCs foram descongeladas a 37°C, lavadas duas vezes em solução salina equilibrada de Hanks p/o Ca++/Mg++ (HBSS) e ressuspensas em 1 ml de HBSS. As células foram então contadas utilizando um hemocitómetro e a viabilidade das células foi determinada por exclusão do corante azul de tripano. As células foram reconstituídas a uma concentração de Ι,ΟχΙΟ6 células viáveis/mililitro em HBSS. As células em suspensão em 200 microlitros de HBSS foram então transplantadas, por meio de injeção na veia da cauda, utilizando uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 27. 88

Tabela 9: Delineamento experimental. Animais com placebo foram submetidos a procedimentos cirúrgicos. Ho entanto, o uréter não foi obstruído.

Grupo de tratamento Número de animais Género Material de teste Dose de células 1 3 Feminino Sam NA 2 5 Feminino HUTC 0,2X10b 3 5 Feminino hKDC 0,2X106

Biodistribuição. Todos os animais foram sacrificados no dia 12 pós-transplante de células por asfixia com dióxido de carbono. Os rins, pulmões, cérebro e coração foram removidos de cada animal. Metade de cada rim foi então fixada em 10% de formalina tamponada neutra para análise histológica. A restante metade do rim, e todos os outros órgãos foram congelados em azoto liquido. Todos os órgãos congelados foram então homogeneizados utilizando um Omni TH homogeneizador equipado com uma sonda de estator do gerador com rotor de 7 milímetros descartável (Omni International, Inc., Marietta, GA). 0 ARN total foi depois extraído usando um kit RNeasy Plus Mini (Qiagen, Valência, CA) . O ARN foi eluído com 50 mL de água tratada com DEPC e quantificado usando um 1000 NanoDrop (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). Em seguida, o ARN foi transcrito de forma inversa com hexâmeros aleatórios e reagentes de transcrição reversa Taqman (Applied Biosystems, Foster City, CA). As reações de PCR foram, em seguida, realizadas em amostras de cADN usando sondas iniciadoras de β2 microglobulina específicas humanos (número de catálogo 4310886E, Applied Biosystems, Foster City, CA) . A PCR foi então realizada utilizando um Sistema de Detecção de Sequências Prism 7900 HT ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA). 89

Análise química do soro. No momento da necropsia, foi recolhido o sangue total, deixado coagular, colocado em tubos de microcentrifugação e centrifugados a 2500 rpm durante 15 minutos para separar o plasma dos outros componentes sanguíneos. As amostras de soro foram então analisadas utilizando um analisador químico VetAce (Alpha Diagnostic Wassermann Technologies, LLC, West Caldwell, New Jersey).

Avaliação histológica. O tecido renal fixo foi embebido em parafina, seccionado (5 m de espessura) e corado com hematoxilina /eosina (Η & E) e tricrómico de Masson. As secções foram então marcadas por lesão tubular (necrose tubular, dilatação, infiltrado celular intersticial) e fibrose intersticial (deposição de colagénio) , utilizando um índice de pontuação que varia de 1 a 4 (1 = mínimo, 2 = leve, 3 = moderado, 4 = grave) . O avaliador era cego para as atribuições do grupo de tratamento.

Resultados

Biodistribuíção. Para avaliar a biodistribuição do órgão de células transplantadas, foi utilizada um método de RT-PCR. Um iniciador de PCR/sonda específica em tempo real para transcritos de ARN β2 microglobulina humana foi utilizada. Como mostrado na Tabela 10 e na Tabela 11, tanto HUTC como hKDCs pode ser detectada em muitos, mas não todos os animais. 0 tratamento com placebo serviu como controlo negativo eficaz devido ao facto de que não foram transplantadas células humanas para estes animais. Como mostrado na Tabela 10, o coração de animais 1 apresentou valores de Ct em todas as três medições replicadas. 0 valor médio de Ct para esta amostra foi de 36,5. Portanto, o sinal positivo é determinado quando todas as três medições 90 repetidas mostradas na Tabela 10 tem um valor de Ct positivo, e o valor médio de Ct é <36,5. Devido ao facto do animal 1 não ter recebido células humanas, um valor de Ct de 36,5 ou superior indica que as células humanas não são detectadas. Como mostrado na Tabela 11, não tecidos de animais tratados com placebo mostraram transcritos celulares humanos. No entanto, HUTC foi detectado em órgãos de 2 dos 5 animais testados. As células foram detectadas nos pulmões, nos rins e no rim lesionado não lesionado do animal 7 e no rim não lesionado, cérebro e pulmões do animal 8. hKDCs foram detectados em 3 dos 5 animais testados. As células foram detectados no rim lesionado, no rim não lesionado, coração, cérebro e pulmões do animal 11. Eles também foram detectados no rim lesionado, no rim não lesionado, e no coração do animal 12. hKDCs também foram detectados no rim não lesionado, no coração e nos pulmões do animal 13.

Química do soro. Para avaliar a função renal, foi medida ureia e a creatinina. No modelo de obstrução unilateral um dos dois rins permanece ileso. O animal é, portanto, capaz de compensar qualquer perda da função renal sustentada pelo rim lesionado. Devido ao rim remanescente não lesionado, BLTN e CrS deverão estar dentro do intervalo normal. Como mostrado na Tabela 12, os niveis séricos de ambos BUN e creatinina permanecem inalteradas entre os grupos de tratamento. O tratamento com placebo mostrou uma medição BUN significativa de 20,7 +/- 3,2 mg/dL e de creatinina de 0,4 +/- 0,06 mg/dl. O tratamento HUTC resultou numa medição média de BUN de 25,6 +/-5,0 mg/dL e de creatinina de 0,4 +/- 0,07. O tratamento HKDC resultou numa medição de BUN significativa de 26,0 +/- 4,7 mg/dL e de creatinina de 0,4 + /- 0,04 mg/dl. 91

Histologia. A lesão tubular e grau de fibrose intersticial foram medidos quantitativamente em cortes histológicos de animais tratados com placebo, HUTC e HKDC. Como mostrado na Tabela 13, o tratamento com placebo resultou em lesão tubular minima, com uma pontuação de 1,0 em todos os três animais analisados. O tratamento HUTC resultou na reparação tubular minima, com uma pontuação média de lesão de 4,0. No entanto, em comparação com o tratamento HUTC, o tratamento HKDC resultou numa redução da extensão total da lesão tubular, em todos os cinco animais que demonstram uma pontuação de lesões de 3,0. No que diz respeito às alterações fibróticas, animais com tratamento simulado mostraram um grau minimo de deposição de colagénio no interstício dos rins e, por conseguinte, fibrose minima (pontuação média = 1,0). No entanto, tratamento HUTC e HKDC mostrou evidências de fibrose leve, com valores médios de 2,4 e 2,0, respectivamente.

Neste relatório, são descritos o efeito renoprotetor e anti-fibrótico do HKDC. Os dados mostram que as células humanas transplantadas residem em ambos os rins lesionados e não lesionados 12 dias após a transplantação. O tratamento HKDC causou uma redução mensurável do grau global de lesão tubular em comparação com o tratamento hUTC. Portanto, este estudo piloto indica que o HKDC extrai efeitos renoprotetoras no modelo da UUO de nefropatia obstrutiva. 92

Tabela 10: Biodlstrlbulção. O tecido do órgão foi avaliado por RT-PCR para detectar a presença de transcritos de ARM de β2 mieroglobulina humana. A análise foi realizada três vezes para cada tecido. Consulte a Tabela 9 para atribuições do grupo de tratamento, "Ct", limiar do ciclo, "Nd", não foi defcectado. "Rira (I)", rim lesado. Os dados aqui apresentados são resumidas na Tabela 11.

Grupo de tratamento 1 Grupo de tratamento 2 Grupo de tratamento 3 Animal Tecido Ct Animal Tecido Ct Animal Tecido Ct 1 Coração 35,78 4 Rim (I) 37,86 9 Rim (I) Nd 1 Coração 37,20 4 Rim (I) Nd 9 Rim (I) Nd 1 Coração 36,40 4 Rim (I) Nd 9 Rim (I) Nd 1 Cérebro Nd 4 Coração Nd 9 Coração Nd 1 Cérebro Nd 4 Coração Nd 9 Coração Nd 1 Cérebro 39, 13 4 Coração Nd 9 Coração Nd 1 Pulmões Nd 4 Cérebro Nd 9 Cérebro 37,37 1 Pulmões 37,76 4 Cérebro Nd 9 Cérebro Nd 1 Pulmões Nd 4 Cérebro Nd 9 Cérebro Nd 2 Coração Nd 4 Pulmões Nd 9 Pulmões Nd 2 Coração Nd 4 Pulmões 35, 84 9 Pulmões Nd 2 Coração Nd 4 Pulmões Nd 9 Pulmões Nd 2 Cérebro Nd 5 Rim (I) Nd 10 Rim (I) Nd 2 Cérebro Nd 5 Rim (I) Nd 10 Rim (I) 37,36 2 Cérebro Nd 5 Rim (I) Nd 10 Rim (I) Nd 2 Pulmões Nd 5 Coração Nd 10 Coração Nd 2 Pulmões Nd 5 Coração Nd 10 Coração Nd 93

Grupo de tratamento 1 Grupo de tratamento 2 Grupo de tratamento 3 Animal Tecido Ct Animal Tecido Ct Animal Tecido Ct 2 Pulmões Nd 5 Coração Nd 10 Coração Nd 3 Coração 38,72 5 Cérebro Nd 10 Cérebro Nd 3 Coração Nd 5 Cérebro 32,80 10 Cérebro Nd 3 Coração Nd 5 Cérebro Nd 10 Cérebro Nd 3 Cérebro Nd 5 Pulmões Nd 11 Rim (I) 36,48 3 Cérebro Nd 5 Pulmões Nd 11 Rim (I) 38,58 3 Cérebro Nd 5 Pulmões Nd 11 Rim (I) 35,72 3 Pulmões 37,76 6 Rim (I) Nd 11 Rim 32,22 3 Pulmões 37,76 6 Rim (I) Nd 11 Rim 31, 61 6 Coração Nd 11 Coração 33,55 6 Coração 35, 84 11 Coração 34,21 6 Coração 35, 84 11 Coração 32, 91 6 Cérebro Nd 11 Cérebro 35,33 6 Cérebro Nd 11 Cérebro 34, 94 6 Cérebro 37, 62 11 Cérebro 35,28 6 Pulmões Nd 11 Pulmões 33,73 6 Pulmões Nd 11 Pulmões 34,01 6 Pulmões Nd 11 Pulmões 33, 99 7 Rim (I) 33,41 12 Rim (I) 34, 62 7 Rim (I) 33, 12 12 Rim (I) 34,84 7 Rim (I) 33,45 12 Rim (I) 34,51 7 Rim 34,07 12 Rim 34, 94 94

Grupo de tratamento 1 Grupo de tratamento 2 Grupo de tratamento 3 Animal Tecido Ct Animal Tecido Ct Animal Tecido Ct 7 Rim 33,78 12 Rim 35,55 7 Rim 33, 81 12 Rim 34,32 7 Coração Nd 12 Coração 34,52 7 Coração 38,79 12 Coração 34,71 7 Coração 39, 97 12 Coração 34,38 7 Cérebro Nd 12 Cérebro 25,19 7 Cérebro Nd 12 Cérebro Nd 7 Cérebro Nd 12 Cérebro Nd 7 Pulmões 31, 69 12 Pulmões Nd 7 Pulmões 31,84 12 Pulmões Nd 7 Pulmões 31, 92 12 Pulmões 39,21 8 Rim (I) Nd 13 Rim (I) Nd 8 Rim (I) Nd 13 Rim (I) 38, 66 8 Rim (I) Nd 13 Rim (I) Nd 8 Rim 34,16 13 Rim 33,52 8 Rim 34, 61 13 Rim 33,36 8 Rim 34.08 13 Rim 32, 69 8 Coração Nd 13 Coração 36,76 8 Coração Nd 13 Coração 34,55 8 Coração Nd 13 Coração 34,28 8 Cérebro 31,59 13 Cérebro Nd 8 Cérebro 31,73 13 Cérebro 38,78 95

Grupo de tratamento 1 Grupo de tratamento 2 Grupo de tratamento 3 Animal Tecido Ct Animal Tecido Ct Animal Tecido Ct 8 Cérebro 31,76 13 Cérebro 38,01 8 Pulmões 32, 64 13 Pulmões 33, 52 8 Pulmões 32, 96 13 Pulmões 33,79 8 Pulmões 33, 44 13 Pulmões 34,11

Tabela 11: Resumo da bíodlstrlhuxção. Os dados mostrados descrevem o número de animais positivos para células humanas/número total de animais testados, O sinal positivo é determinado quando as três medições repetidas mostradas na Tabela 10 têm um valor positivo Ct e o valor médio Gt é <36,5, Consulte a Tabela 9 para atribuições do grupo de tratamento. "Nd" , não determinado. “'Rim (I)", rim lesado.

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Rim (I) Nd 1/5 2/5 Rim Nd 1/5 3/5 Coração 0/3 0/5 3/5 Cérebro 0/3 1/5 1/5 Pulmões 0/3 1/5 2/5 96

Tabela 12: Químlcs do soro. Consulte a Tabela 9 para o grupo de tratamento com as atribuições de SEM, e média do erro

Tratamento Número do animal BUN (mg/dL) Creatinina (mg/dL) 1 22 0,4 1 2 23 0,4 3 17 0,3 Média: 20,7 Média: 0,4 SEM: 3,2 SEM: 0,06 4 24 0,4 5 21 LO O 2 6 26 0,4 7 23 0,4 8 34 0,3 Média: 25,6 Média: 0,4 SEM: 5,0 SEM: 0,07 9 33 LO O 10 24 0,4 3 11 20 0,4 12 26 0,4 13 27 0,4 Média: 26,0 Média: 0,4 SEM: 4,7 SEM: 0,04 97

Tabela 13: Histologia. 0 grau da lesão tubular renal (necrose tubular, dilatação do infiltrado celular e intersticial) e fibrose (deposição de colagénio) foi marcado, de forma cega, utilizando um indice de pontuação varia de 1 a 4 (1 — minimo, 2 = leve, 3 = moderado, 4 grave). Grupo de tratamento 1 Animal Fibrose Necrose tubular 1 1 1 2 1 1 3 1 1 Média: 1,0 Média: 1,0 Grupo de tratamento 2 Animal Fibrose Necrose tubular 4 2 4 5 2 4 6 2 4 7 3 4 8 3 4 Média: 2,4 Média: 4,0 Grupo de tratamento 3 9 2 3 10 2 3 11 2 3 12 2 3 13 2 3 Média: 2,0 Média: 3,0

Embora a invenção anterior tenha sido descrita com algum detalhe por meio de ilustração e exemplo para fins de clareza de entendimento, será prontamente aparente para um 98 vulgar perito na técnica à luz dos ensinamentos desta invenção que certas alterações e modificações poderão ser nela introduzidas sem sair do âmbito das reivindicações anexas. 99

Claims

REINVINDICAÇOES 1. População de células derivadas de rim humano isoladas ou purificadas, capazes de autorrenovação e de expansão em cultura, em que a população de células é positiva para a expressão de marcadores de superfície celular HLA I e CD44 e pelo menos um de Oct-4, Red-1, Pax-2, caderina-11, FoxDl, WT1, Eyal, HNF3B CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7, ou GDF5 e negativa para a expressão de marcadores de superfície de células CD133, E-caderina, Wnt-4 e pelo menos um dos Sox2, FGF4, hTERT, SIX2 ou GATA-4.
2. População de células da reivindicação 1, que é positiva para, pelo menos, um dos marcadores de superfície celular CD24, CD29, CD49c, CD73, CD 166, ou SSEA-4, e negativa para pelo menos um dos marcadores de superfície celular HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD138 ou CD141.
3. População de células da reivindicação 1, em que as células são derivadas de córtex do rim, medula do rim ou região subcapsular renal.
4. População de células da reivindicação 1, em que a população celular segrega pelo menos um dos factores tróficos FGF2, HGF, TGFa, TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 ou VEGF e não segrega, pelo menos, um dos factores tróficos PDGF-BB ou IL12p70.
5. Método para a preparação de uma população de células derivada de rim humano isolada compreendendo, a incubação do tecido obtido a partir de uma região subcapsular, um córtex ou medula de um rim humano, na presença de uma ou mais metaloproteases, protease neutra, ou enzima mucolítica para dissociar, pelo menos, 1 uma porção de tecido em células individuais, plaqueamento das células num substrato, identificar dentro das referidas células um subconjunto de células que seja positivo para a expressão de marcadores de superfície celular HLA I e CD44 e pelo menos um de Oct-4, Rex-1, Pax-2, caderina-11, FoxDl, WT1, Eyal, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7, ou GDF5 e negativo para a expressão de marcadores de superfície celular CD133, E-caderina, e Wnt-4 e pelo menos um dos Sox2, FGF4, hTERT, SIX2 ou GATA-4, e isolamento do referido subconjunto de células para proporcionar a referida população de células derivadas de rim humano.
6. Método de rastreio de um candidato a fármaco para o tratamento de uma desordem envolvendo células renais num sujeito humano, compreendendo os passos de: (a) proporcionar uma população de células derivadas de rim humano isoladas ou purificadas obtida a partir de uma região subcapsular, um córtex ou medula de um rim humano, capaz de autorrenovação e de expansão em cultura, em que a população de células é positiva para a expressão de marcadores de superfície celular HLA I e CD44 e pelo menos um de Oct-4, Red-1, Pax-2, caderina-11, FoxDl, WT1, Eyal, HNF3B CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7, ou GDF5 e negativa para a expressão de marcadores de superfície celular CD133, E-caderina, e Wnt-4 e pelo menos um de Sox2, FGF4, hTERT, SIX2 ou GATA-4; (b) cultivar a população de células derivadas de rim humano, sob condições de proliferação para obter uma composição celular que compreende as células com potencial ou potencial aumentado para a autorrenovação e expansão in vitro; 2 (c) expor as células de cultura obtidas a partir do passo (a) ou (b) ao medicamento candidato; e (d) detectar a presença ou a ausência de um efeito do fármaco candidato sobre a sobrevivência das células ou numa caracteristica morfológica, funcional ou fisiológica e/ou propriedade biológica molecular das referidas células, pelo que um efeito, que altera a sobrevivência das células, uma caracteristica morfológica, funcional ou fisiológica das células, e/ou uma propriedade da biologia molecular das células indica uma atividade do candidato a fármaco para tratar as desordens celulares renais.
7. Método para ensaiar a toxicidade de uma substância de teste para afectar a função da célula renal que compreende os passos de: (a) proporcionar uma população de células derivadas de rim humano isoladas ou purificadas obtido a partir de uma região subcapsular, um córtex ou medula de um rim humano, em que a população de células capaz de autorrenovação e de expansão em cultura, é positiva para a expressão de marcadores de superfície celular HLA I e CD44 e pelo menos um de Oct-4, Rex-1, Pax-2, caderina-11, FoxDl, WT1 , Eyal, HNF3B CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7, ou GDF5 e negativa para a expressão de marcadores de superfície celular CD133, E-caderina, e Wnt-4 e pelo menos um dos Sox2, FGF4, hTERT, SIX2 ou GATA-4; (b) expor a população de células à substância de teste; e (c) detectar a presença ou a ausência de um efeito da substância de ensaio sobre a sobrevivência das células na população ou numa caracteristica morfológica, funcional ou fisiológica e/ou propriedade biológica molecular das células na população, no qual um efeito 3 que altera a sobrevivência das células, uma caracteristica morfológica, funcional ou fisiológica das células e/ou uma propriedade biológica molecular das células na população indica a toxicidade da substância teste para a função das células do rim.
8. Células geneticamente modificadas para utilização num método de tratamento de uma doença num sujeito humano com terapia genética caracterizado por as células serem preparadas por: proporcionar uma população de células derivadas de rim humano isoladas ou purificadas obtida a partir de uma região subcapsular, um córtex ou um medula de um rim humano, em que a população de células é capaz de autorrenovação e de expansão em cultura, positiva para a expressão de marcadores de superfície celular HLA I e CD44 e pelo menos um de Oct-4, Rex-1, Pax-2, Caderina -11, FoxDl, WT1, Eyal, HNF3B CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7, ou GDF5 e negativa para a expressão de marcadores de superfície celular CD133, E-caderina, e Wnt-4 e pelo menos um de Sox2, FGF4, hTERT, SIX2 ou GATA-4, alterar geneticamente pelo menos uma célula da população de células derivadas de rim humano isoladas ou purificadas para produzir um produto genético terapêutico, expandir as células geneticamente modificadas em cultura.
9. População de células da reivindicação 1, que é negativa para pelo menos um dos marcadores de superfície celular HLA II, CD80, ou CD86.
10. Células geneticamente modificadas para utilização num método de tratamento de uma doença de acordo com a 4 reivindicação 8, em que a população de células é negativa para pelo menos um dos marcadores de superficie celular HLA II, CD80, ou CD86.
11. População de células não imunogénicas da reivindicação 9, para utilização no tratamento de um indivíduo humano através de transplante alogénico.
12. Células geneticamente alteradas para uso num método de tratamento de uma doença de acordo com a reivindicação 10, através de transplante alogénico.
13. População de células de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4 para utilização na redução ou eliminação da doença do tecido do rim isquémico ou para substituição de tecidos renais, órgãos, componentes ou estruturas que estejam danificadas devido a trauma, idade, lesão metabólica ou tóxica, doenças ou perda idiopática num sujeito humano.
14. Células geneticamente modificadas para utilização num tratamento de uma doença de acordo com a reivindicação 10 ou reivindicação 12, em que o tratamento consiste em reduzir ou eliminar a doença do tecido do rim isquémico ou A substituição de tecidos renais, órgãos, componentes ou estruturas que estejam danificadas devido a trauma, idade, lesão metabólica ou tóxica, doenças ou perda idiopática num sujeito humano.
15. População de células de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4 para uso de acordo com a reivindicação 13, em que um efeito selecionado a partir de: (a) formação de vasos sanguíneos que fornecem sangue ao tecido isquémico; (b) fluxo sanguíneo para o tecido isquémico; (c) suprimento de oxigénio para o 5 tecido isquémico; e (d) suas combinações sejam induzidas.
16. Células geneticamente modificadas para utilização de acordo com a reivindicação 14, em que um efeito selecionado a partir de: (a) formação de vasos sanguíneos que fornecem sangue ao tecido isquémico; (b) fluxo sanguíneo para o tecido isquémico; (c) fornecimento de oxigénio ao tecido isquémico; e (d) suas combinações sejam induzidas.
17. População de células de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4 para utilização de acordo com a reivindicação 13, em que o tratamento consiste na indução da formação de tecido da região subcapsular renal, tecido do córtex do rim, ou tecido da medula do rim.
18. Células geneticamente modificadas para utilização de acordo com a reivindicação 14, em que a formação de tecido da região subcapsular renal, tecido do córtex do rim, ou tecido da medula do rim é induzida.
19. Método da reivindicação 5, compreendendo ainda o isolamento de uma única célula derivada de rim humano por diluição limitante e expansão da única célula em cultura de células.
20. Células geneticamente modificadas para utilização de acordo com a reivindicação 8, em que a doença é selecionada a partir da doença renal, lesão renal, isquemia renal, ou de um defeito genético no sujeito humano.
21. Células geneticamente modificadas para uso no tratamento de uma doença de acordo com a reivindicação 6 células serem 8, caracterizado pelo facto das transplantadas in utero para produzir células de rim humano no sujeito humano pré-natal ou pós-natal após o transplante, em que as células produzem produtos terapêuticos para reduzir ou eliminar a doença no sujeito humano.
22. Método da reivindicação 6 ou 7, em que a característica morfológica e funcional, ou fisiológica da célula é o aumento da formação de túbulos renais ou a expressão de BMP ou receptores de BMP.
23. Método da reivindicação 6 ou 7, em que a característica morfológica e funcional, ou fisiológica das células é o aumento da secreção de, pelo menos, um ou mais dos factores tróficos FGF2, HGF, TGFa, TIMP-1, TIMP-2, VEGF, ou MMP-2.
24. Método da reivindicação 6, em que a desordem é a doença renal isquémica ou danos nos tecidos do rim, órgãos, componentes ou estruturas devido a traumatismo, idade, lesão metabólica ou tóxica, doença ou perda idiopática num sujeito humano.
25. Método da reivindicação 7, em que o aumento da toxicidade da substância de ensaio é medido como uma diminuição na formação de túbulos renais ou diminuição da expressão de BMP ou receptor de BMP. 7