CN110180026A - 一种生物支架及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种生物支架及其制备方法和应用，所述生物支架包括生物基质和缠结在生物基质中的长链DNA；所述生物支架中具有孔隙结构。本发明的生物支架采用生物基质胶作为主要支架材料，长链DNA缠结在生物基质中，作为机械锁锁定生物基质纤维，含有大量单分散液滴的溶胶在剪切力的作用下快速凝胶，缩短了天然生物基质的成胶时间，凝胶速度提高了10～100倍，孔隙结构促进了生物基质中的物质交换，为细胞提供了氧气和营养物质，排出了代谢废物，提高了细胞的移植存活率。

Description

一种生物支架及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及一种生物支架及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，细胞移植疗法获得巨大发展，已广泛应用于创伤、子宫内膜损伤、心力衰竭、肝衰竭、脊髓损伤和I型糖尿病等治疗领域。再生医学中支持细胞生长的生物支架在模拟人体器官生长发育的过程中起着至关重要的作用。在物理因素(如粘滞弹性、孔隙度、表面形貌)和生物因素(如生物相容性、生物降解性、抗原性/免疫原性)的双重调节下，新型支架材料可以被细胞重塑，促进形态发生，结合细胞表面受体并释放生长因子。
目前，临床比较常见的生物基质凝胶多为透明质酸(HA)，主要用于术后预防组织粘连，比如将交联透明质酸钠凝胶填充满宫腔，以防止宫腔术后粘连。胶原蛋白等生物基质多用于护肤产品及保健产品(口服)，鲜有用于临床组织修复相关治疗方法中，更少直接作为组织修复的细胞支架使用。但胶原蛋白约占生物体总蛋白的1/3，是缔结组织的重要结构，HA在各项临床指标中也表现出优异的性能，在组织修复与再生医学中起着十分重要的作用。
已有研究利用胶原蛋白、纤连蛋白和弹性蛋白等天然细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)作为模拟细胞微环境的支架材料。其中，I型胶原蛋白是人体中最丰富的蛋白质，主要以纤维形式存在于皮肤、肌腱、血管组织、内脏和骨骼中，具有细胞重塑、向细胞转导生物和机械信号的作用。但是，天然ECM材料十分柔软(杨氏模量E<200Pa)，凝胶缓慢，无法在剪切力的作用下保持结构的完整性。因此，需要提供新方法增强天然ECM支架的工学特性，同时保留其细胞重塑性。
Munoz-pinto等(Munoz-pinto,D.J.,Jimenez-vergara,A.C.,Gharat,T.P.&Hahn,M.S.(2015)Characterization of sequential collagen-poly(ethylene glycol)diacrylate interpenetrating networks and initial assessment of theirpotential for vascular tissue engineering.Biomaterials 40,32–42.)向胶原蛋白中加入具有工学性能的聚合物，如海藻酸盐、明胶和聚乙二醇等，与胶原蛋白形成互穿网络，克服了胶原蛋白的应用局限性。但是，由于天然胶原蛋白固有的生物降解性、多孔性、粘滞弹性和免疫原性，形成的互穿网络对细胞重塑和形态发生的促进作用逐渐减弱。DNA分子具有高度可编程特性，在智能水凝胶、可控释放和组织工程领域已被认为是一种具有应用前景的生物支架材料。但是，采用DNA凝胶作为细胞培养的支架材料，由于其成本高昂、易被核酸酶降解、缺乏机械转导性能，并且不具有天然ECM的粘滞弹性、孔隙度和表面形貌，限制了其在再生医学领域的广泛应用。
存在于基质深处200μm或远离毛细血管的细胞，由于氧气、营养物质的匮乏、以及代谢废物无法通过多孔基质排出，无法行使正常功能，存活率低。目前，细胞微环境工程限定微凝胶的粒径小于400μm以确保充足的物质运输，克服了在大体积组织中形成功能性血管的问题。微凝胶由于体积微小，仅含有有限数量的细胞，无法应用于再生医学领域。
这一难题可以通过植入含有细胞的微凝胶得以解决，微凝胶内的细胞通过对支架进行重塑从而形成完整的支架结构。与大型组织移植技术相比，微凝胶移植具有可注射性、微创性和低免疫原性。此外，微凝胶中的流体间质有利于在移植和血管形成期间，为细胞提供充足的营养物质和氧气，并排出代谢废物。
微凝胶的制备方法包括流式光刻技术(flow lithography)、PRINT(particlereplication in the non-wetting template)和步进闪光压印光刻技术(step and flashimprint lithography)。然而，上述方法需要采用高端模态，并且仅适用于刚性和快速凝胶材料。基于PDMS或同轴玻璃毛细管的微流控技术可用于制备单分散性微凝胶，该方法采用凝胶前体液滴作为模板进行微凝胶的制备，但是需要加入细胞相容性表面活性剂来稳定水-油界面，在液滴凝胶化后还需要重复洗涤和离心以诱导油-水相转移。
因此，提供一种新型生物支架材料，不仅具有优良的机械性能，而且具有良好的生物相容性和生物降解性，较低的抗原性和免疫原性，且制备工艺简便、成本低廉，促进天然ECM材料的功能化，在再生医学领域具有重要意义和广阔的应用前景。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种生物支架及其制备方法和应用，所述生物支架以生物基质作为主要材料，采用长链DNA作为互穿支架，在不改变天然基质的细胞重塑性的前提下，为其提供了适当的工学性能，提高了凝胶速度，加强了凝胶的结构稳定性，为功能化天然ECM材料提供了新的途径。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种生物支架，所述生物支架包括生物基质和缠结在生物基质中的长链DNA；
所述生物支架中具有孔隙结构。
本发明中，生物支架采用生物基质胶作为主要支架材料，长链DNA缠结在生物基质中，作为机械锁锁定生物基质纤维，含有大量单分散液滴的溶胶在剪切力的作用下快速凝胶，缩短了天然生物基质的成胶时间。
优选地，所述生物基质包括胶原蛋白、纤连蛋白或弹性蛋白中的任意一种或至少两种的组合，优选为胶原蛋白。
优选地，所述长链DNA的长度不小于10000nt，例如可以是10000nt、20000nt、50000nt、100000nt或200000nt。
本发明中，向生物基质中加入长度不小于10000nt的长链DNA，使得长链DNA在较低的重量分数下，便可以快速形成缠结结构，显著提高了溶胶的粘度；当空间中的缠结结构达到一定密度后，溶胶发生凝胶化。
优选地，所述生物支架中还包括长链DNA的互补链；
所述长链DNA通过与互补链部分杂交，形成互锁结构。
本发明中，加入长链DNA的互补链，生物基质对长链DNA与互补链的结合具有一定的空间位阻作用，长链DNA与互补链在动态驱动力的作用下发生部分杂交，在生物基质中形成机械互锁结构，实现了对生物基质链结构的紧密联锁。
本发明中，由于生物基质的空间位阻作用，长链DNA与互补链在静态条件下基本不发生杂交，溶胶在低温环境中保持流动性。
优选地，所述生物基质中装载有细胞。
优选地，所述长链DNA和/或长链DNA的互补链上包括功能性序列，优选为包括载药位点、RNA互补位点或核酸适配体位点中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选为包括核酸适配体位点。
优选地，所述核酸适配体靶向功能性蛋白，优选为靶向生长因子，进一步优选为靶向血管内皮生长因子。
本发明通过对DNA序列进行特殊设计，向长链DNA中引入对生长因子具有特异性和高亲和力的核酸适配体，当DNA被核酸酶降解后，生长因子从生物支架上可控释放，促进了支架的细胞重塑和形态发生。在本发明的具体实施例中，当血管内皮生长因子(VEGF)与核酸适配体连接并缓慢释放到内皮微环境中，促进了血管的形成。
优选地，所述长链DNA扩增模板包括如SEQ ID NO:1所述的核酸分子；
SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列为：
CTCAGACTCAGAAGACTCAGACTCAGACCCACCATTCGGACGGGTACCTGGCCAGAACACCCACCATTCGGACGGGCCCCACCATTCGGACGGGTACCTGGCCAGCTCAGACTCAGACTCAGACTCAGA.
优选地，所述长链DNA的互补链扩增模板包括如SEQ ID NO:2所示的核酸分子；
SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列为：
GGGTTTGAGTCTGAGTCTGAGTCTGAGTCTGAGTCTGAGTCTGAGTCTGAGTCTGAGTCTGAGTCTGAGTCTGAGTCTGGGTTT.
优选地，所述孔隙结构的孔径为10～100μm，例如可以是10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm或100μm。
本发明中，形成于分离的生物基质间的孔隙结构促进了生物基质中的物质交换，为细胞提供了氧气和营养物质，排出了代谢废物，提高了细胞活力，有利于提高细胞移植存活率。
第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的生物支架的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)设计DNA序列，进行滚环扩增，得到具有重复DNA序列的长链DNA及互补链；
(2)将生物基质与长链DNA按比例混合孵育，得到生物基质-长链DNA复合物；
将生物基质与长链DNA的互补链按比例混合孵育，得到生物基质-长链DNA的互补链复合物；
(3)将步骤(2)得到的生物基质-长链DNA复合物和生物基质-长链DNA的互补链复合物混合孵育后，加入微流体管道中，反应，得到所述生物支架。
优选地，步骤(2)所述生物基质与所述长链DNA的重量比为(0.2～100):1，例如可以是0.2:1、1:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1，优选为(0.2～50):1。
优选地，步骤(2)所述生物基质与所述长链DNA的互补链的重量比为(0.2～100):1，例如可以是0.2:1、1:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1，优选为(0.2～50):1。
优选地，步骤(2)所述孵育的pH为2.0～6.5，例如可以是2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0或6.5。
本发明中，在pH为2.0～6.5的条件下，长链DNA或互补链带负电，生物基质带正电，DNA与生物基质通过静电力作用相结合。
优选地，步骤(2)所述孵育温度为0～40℃，例如可以是0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃。
优选地，步骤(2)所述孵育时间为10min～24h，例如可以是10min、20min、30min、40min、50min、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h或24h。
优选地，步骤(3)所述孵育的pH为6.0～8.0，例如可以是6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0。
优选地，步骤(3)所述孵育的温度为0～40℃，例如可以是0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃。
优选地，步骤(3)所述孵育的时间为15s～60min，例如可以是15s、20s、30s、40s、50s、1min、10min、20min、30min、40min、50min或60min。
优选地，步骤(3)所述反应的温度为0～40℃，例如可以是0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃。
优选地，步骤(3)所述反应的时间为15s～1.5h，例如可以是15s、20s、30s、40s、50s、1min、10min、20min、30min、40min、50min、1h或1.5h。
本发明中，DNA互锁结构的形成促进了凝胶化的发生，显著缩短了成胶时间，与单独的生物基质相比，DNA-生物基质复合物的凝胶速度提高了10～100倍。
优选地，在步骤(2)之前还包括向长链DNA和/或长链DNA的互补链中加入功能性分子的步骤。
优选地，所述功能性分子包括药物、RNA或生长因子中的任意一种或至少两种的组合，优选为生长因子。
优选地，在步骤(2)之前还包括向生物基质中加入细胞的步骤。
优选地，在步骤(3)中还包括将油相加入微流体管道中的步骤。
本发明中，在向微流体管道中加入DNA-生物基质复合物的同时，加入油相，有利于凝胶微球的形成。
本发明中，在剪切力和毛细管力的共同调节作用下，DNA-生物基质乳化形成单分散性凝胶前体微滴，管道中的液滴被油相隔开，占据管道的整个横截面，保证在无表面活性剂的条件下不相互碰撞，有利于维持液相的稳定性。
作为优选技术方案，本发明提供了一种如第一方面所述的生物支架的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)设计DNA序列，进行滚环扩增，得到具有重复DNA序列的长链DNA及互补链，并向长链DNA和/或长链DNA的互补链中加入药物、RNA或生长因子；
(2)将载有细胞的生物基质与长链DNA按重量比为(0.2～50):1在pH为2.0～6.5、温度为0～40℃下混合孵育10min～24h，得到生物基质-长链DNA复合物；
将载有细胞的生物基质与长链DNA的互补链按重量比为(0.2～50):1在pH为2.0～6.5、温度为0～40℃下混合孵育10min～24h，得到生物基质-长链DNA的互补链复合物；
(3)将步骤(2)得到的生物基质-长链DNA复合物和生物基质-长链DNA的互补链复合物混合在pH为6.0～8.0、温度为0～40℃下孵育15s～60min后，加入微流体管道中，同时将油相加入微流体管道，在0～40℃下反应15s～1.5h，得到所述生物支架。
第三方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如第一方面所述的生物支架。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第四方面，本发明提供了一种第一方面所述的生物支架和/或如第三方面所述的药物组合物在制备疾病治疗药物、医用材料或医疗器械中的应用。
优选地，所述疾病包括创伤、子宫内膜损伤、心力衰竭、肝衰竭、脊髓损伤或I型糖尿病中的任意一种或至少两种的组合。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的生物支架采用生物基质胶作为主要支架材料，长链DNA缠结在生物基质中，作为机械锁锁定生物基质纤维，含有大量单分散液滴的溶胶在剪切力的作用下快速凝胶，缩短了天然生物基质的成胶时间，凝胶速度比天然胶原蛋白快10-100倍；
(2)本发明的生物支架中的孔隙结构促进了生物基质中的物质交换，为细胞提供了氧气和营养物质，排出了代谢废物，提高了细胞的移植存活率；
(3)长链DNA中含有功能性核酸适配体，靶向生长因子，当DNA被核酸酶降解后，生长因子从生物支架上可控释放，促进了支架的细胞重塑和形态发生，含有VEGF核酸适配体的生物支架促进了植入组织的血管形成；
(4)本发明的制备方法简便，成本低廉，成胶速度快，不添加表面活性剂或进行化学修饰，凝胶形貌精确可控，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为生物支架的制备原理图；
图2为剪切力成胶所得小球的明场图片；
图3(A)为体外培养1天的细胞存活率，图3(B)为体外培养3天的细胞存活率，图3(C)为体外培养7天的细胞存活率，其中，PI为死细胞染料，Calcein-AM为活细胞染料；
图4为本发明实施例9中的移植血管生成H&E染色图；
图5为本发明实施例9中移植血管生成免疫荧光成像图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1 DNA滚环扩增及纯化
设计靶向VEGF的核酸适配体，进行滚环扩增，得到长度超过10000nt的长链DNA，具体步骤如下：
(1)退火：反应体系为H2O 150.8μL，10×T4连接酶缓冲液5.2μL，5μM互补链模板12μL，10μM核酸适配体模板12μL，混匀后，90℃以300r的转速孵育10min，缓慢冷却至室温；
(2)连接：反应体系为退火产物180μL，10×T4连接酶缓冲液14.8μL，10U/μL T4连接酶5.2μL，混匀后，16℃以300r的转速孵育16h，之后65℃以300r的转速孵育10min，缓慢冷却到室温；
(3)滚环扩增(RCA)：反应体系为H2O 300μL，10×phi29聚合酶缓冲液50μL，100mMdNTP 10μL/种(四种碱基)，连接产物100μL，10U/μL phi29聚合酶10μL，混匀后，30℃以300r的转速孵育36h，加热至90℃孵育10min，缓慢冷却至室温；
(4)酒精提纯：向RCA产物中加入0.5M EDTA，至RCA产物变澄清，加入与RCA产物等体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合物，震荡混匀，3000r离心一分钟，取上清，加入1200μL乙醇，放入-20℃冰箱冻存过夜，4℃8000r离心15min，去上清，将沉淀放入真空干燥箱内完全干燥后取出，加入适量的水，加热90℃300r至DNA完全溶于1×PBS缓冲液中，缓慢冷却至室温，得到纯化的RCA产物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
实施例2含有VEGF的生物支架的制备
生物支架的制备原理图如图1所示，包含功能性位点的滚环扩增产物长链DNA结合功能性分子后，缠结在生物基质中，作为机械锁锁定生物基质纤维，与互补链发生部分杂交，在生物基质中形成机械互锁结构，含有大量单分散液滴的溶胶在剪切力的作用下快速凝胶，形成生物支架。
含有VEGF的生物支架的制备方法步骤如下：
(1)将5μL 0.01mg/mL的VEGF165与10μL 2mg/mL的RCA产物SEQ ID NO:1混匀，30℃以300r的转速孵育30min；
(2)分别取100μL浓度为2mg/mL的I型胶原蛋白(内含1×PBS缓冲液)，在pH为6.0的条件下，与2mg/mL的10μL RCA产物SEQ ID NO:1、20μL RCA的互补链(c-RCA)SEQ ID NO:2混匀，放入金属浴摇床4℃以1000r的转速孵育30min；
(3)使用1.0M NaOH将体系pH调至7.0后，放入金属浴摇床4℃以1000r的转速孵育30min，得到RCA-胶原复合物(RCA-Col)和RCA互补链-胶原复合物(c-RCA-Col)；
(4)将RCA-Col和c-RCA-Col在37℃下震荡混匀约1h，得到DNA胶原复合物(DNA-Col)，置于4℃下保存待用。
结果如图2所示，DNA-Col在37℃下震荡混匀1h，含有大量单分散液滴的溶胶在剪切力的作用下快速凝胶，而天然生物基质的成交时间约10～100h，本实施例的制备方法显著缩短了天然生物基质的成胶时间，凝胶速度提高了10～100倍。
实施例3含有VEGF的生物支架的制备
(1)将5μL 0.01mg/mL的VEGF165与10μL 2mg/mL的RCA产物SEQ ID NO:1混匀，30℃以300r的转速孵育30min；
(2)分别取500μL浓度为2mg/mL的I型胶原蛋白(内含1×PBS缓冲液)，在pH为6.5的条件下，与2mg/mL的10μL RCA产物SEQ ID NO:1、20μL RCA的互补链(c-RCA)SEQ ID NO:2混匀，放入金属浴摇床0℃以1000r的转速孵育24h；
(3)使用1.0M NaOH将体系pH调至8.0后，放入金属浴摇床0℃以1000r的转速孵育60min，得到RCA-胶原复合物(RCA-Col)和RCA互补链-胶原复合物(c-RCA-Col)；
(4)将RCA-Col和c-RCA-Col在0℃下震荡混匀约1.5h，得到DNA胶原复合物(DNA-Col)，置于4℃下保存待用。
实施例4含有VEGF的生物支架的制备
(1)将5μL 0.01mg/mL的VEGF165与10μL 2mg/mL的RCA产物SEQ ID NO:1混匀，30℃以300r的转速孵育30min；
(2)分别取2μL浓度为2mg/mL的I型胶原蛋白(内含1×PBS缓冲液)，在pH为2.0的条件下，与2mg/mL的10μL RCA产物SEQ ID NO:1、20μL RCA的互补链(c-RCA)SEQ ID NO:2混匀，放入金属浴摇床40℃以1000r的转速孵育10min；
(3)使用1.0M NaOH将体系pH调至6.0后，放入金属浴摇床40℃以1000r的转速孵育15s，得到RCA-胶原复合物(RCA-Col)和RCA互补链-胶原复合物(c-RCA-Col)；
(4)将RCA-Col和c-RCA-Col在40℃下震荡混匀约15s，得到DNA胶原复合物(DNA-Col)，置于4℃下保存待用。
实施例5含有功能性药物的生物支架的制备
(1)将5μL 0.01mg/mL的阿霉素(DOX)与10μL 2mg/mL含药物承载位点的RCA产物混匀，30℃以300r的转速孵育30min；
(2)分别取1000μL浓度为2mg/mL的纤连蛋白(内含1×PBS缓冲液)，在pH为6.0的条件下，与2mg/mL的10μL RCA产物、20μL RCA的互补链(c-RCA)混匀，放入金属浴摇床4℃以1000r的转速孵育30min；
(3)使用1.0M NaOH将体系pH调至7.0后，放入金属浴摇床4℃以1000r的转速孵育30min，得到RCA-纤连蛋白复合物和RCA互补链-纤连蛋白复合物；
(4)将步骤(3)得打的两种复合物在37℃下震荡混匀约1.5h，得到DNA-纤连蛋白复合物，置于4℃下保存待用。
实施例6含有功能性RNA的生物支架的制备
(1)将5μL 0.01mg/mL的功能性RNACOX_2引物序列与10μL 2mg/mL携带RNA互补序列的RCA产物混匀，30℃以300r的转速孵育30min；
(2)分别取100μL浓度为2mg/mL的弹性蛋白(内含1×PBS缓冲液)，在pH为6.0的条件下，与2mg/mL的10μL RCA产物、20μL RCA的互补链(c-RCA)混匀，放入金属浴摇床4℃以1000r的转速孵育30min；
(3)使用1.0M NaOH将体系pH调至7.0后，放入金属浴摇床4℃以1000r的转速孵育30min，得到RCA-弹性蛋白复合物和RCA互补链-弹性蛋白复合物；
(4)将步骤(3)得打的两种复合物在37℃下震荡混匀约1.5h，得到DNA-弹性蛋白复合物，置于4℃下保存待用。
实施例7凝胶微球的制备
(1)将RCA-Col和c-RCA-Col混匀，加入注射器中作为水相，由于空间位阻作用，DNA之间暂时不会互补成胶；
(2)将氟油加入另一注射器中作为油相；
(3)将两个注射器用注射泵以油相:水相为1:2的速度注入三通结构；
(4)油相将水相分割成小球，并通过在微管中流动为水相提供剪切力，打破空间位阻效应，使DNA互补，小球成胶形成凝胶微球，凝胶微球的直径约800μm。
实施例8孔隙结构增强了生物支架中的物质交换
按上述方法采用不同直径的微管制备出粒径约为300径的、800径和1000的微的含有细胞的微球DNA-Col，在体外进行培养。
结构如图3(A)、图3(B)和图3(C)所示，可以看出，随着时间的推移，微球DNA-Col内的细胞代谢旺盛，即使1000μm微球内的细胞，在体外培养一周后，仍然具有较高的存活率，说明微球的孔隙结构有利于内部细胞进行有效的物质交换。
制备的DNA-纤连蛋白复合物和DNA-弹性蛋白复合物同样具有促进内部细胞进行物质交换的作用。
实施例9 VEGF促进血管植入组织的血管生成
将混合有人静脉内皮细胞(HUVEC)的小球DNA-Col皮下注入balb/c小鼠皮下，两周后取出，进行H&E染色和免疫荧光标记，结果如图4和图5所示，发现有清晰完整的血管结构生成，其中，图5的左列为人血管静脉内皮细胞的靶向标记物标记的细胞形成的血管结构，中间列为DAPI染的细胞核(用于细胞定位)，右列为叠加场。
综上所述，本发明的生物支架采用生物基质胶作为主要支架材料，长链DNA缠结在生物基质中，作为机械锁锁定生物基质纤维，含有大量单分散液滴的溶胶在剪切力的作用下快速凝胶，缩短了天然生物基质的成胶时间；所述生物支架中的孔隙结构促进了生物基质中的物质交换，为细胞提供了氧气和营养物质，排出了代谢废物，提高了细胞的移植存活率；所述长链DNA中含有功能性核酸适配体，靶向生长因子，当DNA被核酸酶降解后，生长因子从生物支架上可控释放，促进了支架的细胞重塑和形态发生；本发明的制备方法简便，成胶速度快，不添加任何化学修饰，具有广阔的应用前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 清华-伯克利深圳学院筹备办公室
<120> 一种生物支架及其制备方法和应用
<130> 20190627
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ctcagactca gaagactcag actcagaccc accattcgga cgggtacctg gccagaacac 60
ccaccattcg gacgggcccc accattcgga cgggtacctg gccagctcag actcagactc 120
agactcaga 129
<210> 2
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gggtttgagt ctgagtctga gtctgagtct gagtctgagt ctgagtctga gtctgagtct 60
gagtctgagt ctgagtctgg gttt 84

Claims (10)

1.一种生物支架，其特征在于，所述生物支架包括生物基质和缠结在生物基质中的长链DNA；
所述生物支架中具有孔隙结构。
2.根据权利要求1所述的生物支架，其特征在于，所述生物基质包括胶原蛋白、纤连蛋白或弹性蛋白中的任意一种或至少两种的组合，优选为胶原蛋白；
优选地，所述长链DNA的长度不小于10000nt；
优选地，所述生物支架中还包括长链DNA的互补链；
所述长链DNA通过与互补链部分杂交，形成互锁结构。
3.根据权利要求1或2所述的生物支架，其特征在于，所述生物基质中装载有细胞；
优选地，所述长链DNA和/或长链DNA的互补链上包括功能性序列，优选为包括载药位点、RNA互补位点或核酸适配体位点中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选为包括核酸适配体位点；
优选地，所述核酸适配体靶向功能性蛋白，优选为靶向生长因子，进一步优选为靶向血管内皮生长因子；
优选地，所述长链DNA包括如SEQ ID NO:1所述的核酸分子；
优选地，所述长链DNA的互补链包括如SEQ ID NO:2所示的核酸分子。
4.根据权利要求1-3任一项所述的生物支架，其特征在于，所述孔隙结构的孔径为10～100μm。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的生物支架的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)设计DNA序列，进行滚环扩增，得到具有重复DNA序列的长链DNA及互补链；
(2)将生物基质与长链DNA按比例混合孵育，得到生物基质-长链DNA复合物；
将生物基质与长链DNA的互补链按比例混合孵育，得到生物基质-长链DNA的互补链复合物；
(3)将步骤(2)得到的生物基质-长链DNA复合物和生物基质-长链DNA的互补链复合物混合孵育后，加入微流体管道中，反应，得到所述生物支架。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述生物基质与所述长链DNA的重量比为(0.2～100):1，优选为(0.2～50):1；
优选地，步骤(2)所述生物基质与所述长链DNA的互补链的重量比为(0.2～100):1，优选为(0.2～50):1；
优选地，步骤(2)所述孵育的pH为2.0～6.5；
优选地，步骤(2)所述孵育的温度为0～40℃；
优选地，步骤(2)所述孵育的时间为10min～24h；
优选地，步骤(3)所述孵育的pH为6.0～8.0；
优选地，步骤(3)所述孵育的温度为0～40℃；
优选地，步骤(3)所述孵育的时间为15s～60min；
优选地，步骤(3)所述反应的温度为0～40℃；
优选地，步骤(3)所述反应的时间为15s～1.5h。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)之前还包括向长链DNA和/或长链DNA的互补链中加入功能性分子的步骤；
优选地，所述功能性分子包括药物、RNA或生长因子中的任意一种或至少两种的组合，优选为生长因子；
优选地，在步骤(2)之前还包括向生物基质中加入细胞的步骤；
优选地，在步骤(3)中还包括将油相加入微流体管道中的步骤。
8.根据权利要求5-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)设计DNA序列，进行滚环扩增，得到具有重复DNA序列的长链DNA及互补链，并向长链DNA和/或长链DNA的互补链中加入药物、RNA或生长因子；
(2)将载有细胞的生物基质与长链DNA按重量比为(0.2～50):1在pH为2.0～6.5、温度为0～40℃下混合孵育10min～24h，得到生物基质-长链DNA复合物；
将载有细胞的生物基质与长链DNA的互补链按重量比为(0.2～50):1在pH为2.0～6.5、温度为0～40℃下混合孵育10min～24h，得到生物基质-长链DNA的互补链复合物；
(3)将步骤(2)得到的生物基质-长链DNA复合物和生物基质-长链DNA的互补链复合物混合在pH为6.0～8.0、温度为0～40℃下孵育15s～60min后，加入微流体管道中，同时将油相加入微流体管道，在0～40℃下反应15s～1.5h，得到所述生物支架。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1-4任一项所述的生物支架；
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
10.一种如权利要求1-4任一项所述的生物支架和/或如权利要求9所述的药物组合物在制备疾病治疗药物、医用材料或医疗器械中的应用；
优选地，所述疾病包括创伤、子宫内膜损伤、心力衰竭、肝衰竭、脊髓损伤或I型糖尿病中的任意一种或至少两种的组合。
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