CN103237565B - 用于基于材料的细胞疗法的可注射的成孔水凝胶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了在水凝胶注射后用于在水凝胶内原位形成小孔的组合物和方法。在周围水凝胶中的自牺牲性制孔剂原位降解形成小孔，从而加速细胞的募集或者释放。这里所公开的是最初不含有小孔，但是在一段时间后变成多孔性的材料。

Description

用于基于材料的细胞疗法的可注射的成孔水凝胶
相关申请
根据美国法典35U.S.C.§119(e)，本申请要求2010年10月6日递交的美国临时申请第61/390,594的优先权，该申请通过引证在此全部并入本文。
联邦政府资助研究声明
本发明获得了国家卫生部授予的NIH R37DE013033奖金和国家科学基金会授予的MRSEC DMR-0820484奖金的政府支持。政府享有本发明的某些权利。
技术领域
本发明涉及生物相容性水凝胶组合物。
技术背景
近十年来，生物相容性聚合物已经被用于形成脚手架，用作细胞移植的载体，或者用于将宿主细胞募集进入装置。
发明内容
本发明提供了用于形成多孔水凝胶的组合物和方法。例如，当水凝胶被注射入主体之后，水凝胶内部原位形成小孔。通过自牺牲性制孔剂的降解作用原位形成小孔，在周围水凝胶(主体水凝胶)内部所形成的这些小孔能够促进细胞的募集或者释放。例如，所得小孔的大小时最初制孔剂大小的5％之内。
这里所公开的是一种本来不是多孔的材料，但是这种材料在进驻受体动物体内之后，会变成大孔材料，所述受体动物例如哺乳动物主体。该组合物与之前的脚手架组合物相比具有显著的优势。这里所描述的水凝胶非常适于在开始的时候保护移植的细胞免受宿主炎症性反应的影响，然后在发炎作用平息之后(例如，在进驻受体体内12小时之后，或者在移植后1天、3天、5天、7天或者10天或者更长的时间之后)。这里描述的水凝胶还可以另外作为一种外科填充剂，进一步最小化宿主体内的发炎作用，然后随后释放细胞。
因此，本发明提供了一种组合物，这种组合物包括一种第一水凝胶和一种第二水凝胶，其中，第一水凝胶比第二水凝胶降解快至少10％(例如，快至少15％、快至少20％、快至少25％、快至少30％、快至少3 5％、快至少40％、快至少45％、或者快至少50％)，并且其中，第一水凝胶或者第二水凝胶(或者二者中)包括一种分离的细胞。优选的，第一水凝胶包括一种制孔剂，这种制孔剂能够在其存在的地方留下一个小孔。例如，第一水凝胶是一种制孔剂，并且降解后原地产生小孔，其尺寸在最初制孔剂尺寸的25％以内，例如，在最初制孔剂尺寸的20％以内，在最初制孔剂尺寸的15％以内或者在最初制孔剂尺寸的10％以内。优选的，所得小孔的大小时最初制孔剂大小的5％之内。第一水凝胶比第二水凝胶降解的更快，这是由于第一水凝胶更易溶于水(包括较低的可溶性指数)。换句话说，第一水凝胶降解的更快是由于它与Zilla所著的美国专利系列号10/980,989(该申请通过引证在此全部并入本文)中描述的蛋白酶调解的降解作用基序相交联。
用于形成第一水凝胶组合物的聚合物(一种制孔剂)分子量是大约50千道尔顿(kDa)，并且，用于形成第二水凝胶组合物的聚合物(散装凝胶)的分子量大约是250kDa。较短的聚合物(例如，制孔剂聚合物)比较长的聚合物(例如，散装组合物聚合物)降解的更快。做为选择，可以对一种组合物进行修饰，根据糖基基团的存在(例如，海藻酸盐组合物中含有大约3-10％糖)使其更容易被水解降解。在另一个实施例中，所述制孔剂水凝胶与散装水凝胶相比更容易被酶解降解。这里的合成(第一和第二水凝胶)组合物对体液是可渗透的，例如，比方说酶可以进入组合物中降解制孔剂水凝胶。在某些情况下，第二水凝胶在第一水凝胶周围相交联，也就是说，制孔剂(第一水凝胶)在物理上完全被包括在散装水凝胶(第二水凝胶)之内。
细胞或生物活性因子(例如，生长因子(比如粒性白细胞/巨噬细胞菌落刺激因子(GM-CSF)、血管内皮生长因子(VEGF))、浓缩的低聚核苷酸(例如，CpG)或质粒DNA)被选择性的包裹入制孔剂相中或者散装水凝胶相中，或者二者中皆包括。使用者预先确定制孔剂原位降解的时间过程。在制孔剂退化的过程中，细胞被释放并迁徙进入所述材料中。但是，由于他们最初不含有小孔，成孔水凝胶可以在形成后立即提供机械支持。合适的生物活性因子包括血管内皮生长因子(例如，VEGFA；GenBank登记号码：(aa)AAA35789.1(GI：181971)、(na)NM_001171630.1(GI：284172472)，通过引证在此并入本文)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF，Genbank登记号码：(aa)AAB29057.2(GI：13236891)、(na)NM_000800.3(GI：222144219)，通过引证在此并入本文)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；GenBank登记号码：(aa)AAB21432.2(GI：8250666)、(na)A32848.1(GI：23957592)，通过引证在此并入本文)、胎盘生长因子(PIGF或者PLGF；Genbank登记号码：(aa)AAH07789.1(GI：14043631)、(na)NM_002632.4(GI：56676307)，通过引证在此并入本文)，瘦素(Genbank登记号码：(aa)CBI71013.1(GI：285310289)、(na)NM_000230.2(GI：169790920)，通过引证在此并入本文)、造血生长因子(例如，HGF，Genbank登记号码：(aa)AAA64297.1(GI：337938)，(na)NM_000601.4(GI：58533168)，通过引证在此并入本文)、血管内皮生长因子(VEGF)受体-1(VEGFR-1，Genbank登记号码：(aa)NP_002010.2(GI：156104876)，通过引证在此并入本文)、血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)(Genbank登记号码：(aa)AAC16450.1(GI：3132833)，(na)EU826563.1(GI：194318421)，通过引证在此全部并入本文)、转化生长因素-β(TGF-β，Genbank登记号码：(aa)AAA36738.1(GI：339564)、(na)NM_000660.4(GI：260655621)，通过引证在此全部并入本文)、骨形态发生蛋白质(例如，骨形态发生蛋白质(BMP)-4、Genbank登记号码：(aa)NP_570912.2(GI：157276597)、(na)NM_001202.3(GI：157276592)，通过引证在此全部并入本文)、胰岛素-样生长因子(IGF-1，Genbank登记号码：(aa)CAA01954.1(GI：1247519)，(na)NM_001111283.1(GI：163659898)，通过引证在此全部并入本文)、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、血小板衍生生长因子(PDGF；Genbank登记号码：(aa)AAA60552.1(GI：338209)，(na)NM_033023.4(GI：197333759)，通过引证在此全部并入本文)、表皮生长因子(EGF，Genbank登记号码：(aa)AAH93731.1(GI：62740195)，通过引证在此全部并入本文)、转化生长因素-α(TGF-α，Genbank登记号码：(na)NM_003236.2(GI：153791671)，通过引证在此全部并入本文)、神经生长因子(NGF，Genbank登记号码：(aa)AAH32517.2(GI：34192369)、(na)NM_002506.2(GI：70995318)，通过引证在此全部并入本文)、脑-衍生的神经营养性因子(BDNF，Genbank登记号码：(aa)CAA62632.1(GI：987872)、(na)NM_170731.4(GI：219842281)，通过引证在此全部并入本文)、神经素营养因子-3(NT-3，Genbank登记号码：(aa)NP_001096124.1(GI：156630995)，(na)NM_001102654.1(GI：156630994)，通过引证在此全部并入本文)，纤毛状神经营养性因子(CNTF、Genbank登记号码：(aa)AAB31818.1(GI：633830)、(na)NM_000614.3(GI：209574322)，通过引证在此全部并入本文)、和胶质细胞系-衍生的神经营养因子(GDNF，Genbank登记号码：(aa)CAG46721.1(GI：49456801)、(na)NM_000514.3(GI：299473777)，通过引证在此全部并入本文)。其他适当的因子包括抗血管内皮生长因子(VEGF)抗体、抗-酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)抗体、抗-碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)抗体、抗-胎盘生长因子(PIGF)抗体、抗-瘦素抗体、抗-造血生长因子(HGF)抗体、抗-血管内皮生长因子受体(VEGFR)-1抗体、抗血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)抗体、巴马司他(BB-94)、马立马司他(BB-2516)、瑟利德米、O-(氯乙酰-氨甲酰基)-烟曲霉素(TNP-470)、羧基氨基咪唑(CAI)、米托蒽醌、亚德利亚霉素、SU5416、抗TGF-β抗体、抗-骨形态发生蛋白质(BMP)抗体、抗-胰岛素-样生长因子(IGF)-1抗体、抗-成纤维细胞生长因子(FGF)-2抗体、抗-血小板衍生生长因子(PDGF)抗体、抗-表皮生长因子抗体、抗-TGF-α抗体、和抗-血管内皮生长因子(VEGF)抗体。适用于被包裹入制孔剂相、散装水凝胶相或者被包裹入两相之中的其他生物活性因子包括FMS-样酪氨酸激酶3配位体(Flt3配位体；Genbank登记号码：(aa)AAI44040(GI：219519004)、(na)NM_004119(GI：GI：121114303)，通过引证在此全部并入本文)、抗-FMS-样酪氨酸激酶3(Flt3)配位体、肝细胞生长因子(Genbank登记号码：(aa)AAB20169(GI：237997)，通过引证在此全部并入本文)、和基质衍生的因子1(SDF1)。
作为选择，腺病毒可以被任选的包裹入制孔剂相、散装水凝胶相或者被包裹入两相之中。例如，腺病毒编码仑特鸽-有关的转录因子(例如，Runx2；Genbank登记号码：(aa)CAI13532(GI：55959066)，(na)NM_001024630(GI：226442782)，通过引证在此全部并入本文)，这是一种对成骨细胞分化十分关键的转录因子。在另一个方面，腺病毒编码MyoD(Genbank登记号码：(aa)CAA40000(GI：34862)，(na)NM_002478(GI：77695919)，通过引证在此全部并入本文)，这是一种在调节肌分化过程中发挥关键作用的蛋白质。做为选择，腺病毒编码骨形态发生蛋白质，例如骨形态发生蛋白质(BMP)-2(Genbank登记号码：(aa)AF0402491(GI：6649952)，(na)NM_001200(GI：80861484)，通过引证在此全部并入本文)或骨形态发生蛋白质(BMP)-4(Genbank登记号码：(aa)NP_570912.2(GI：157276597)，(na)NM_001202.3(GI：157276592)，通过引证在此全部并入本文)。骨形态发生蛋白质(BMP)-2尤其涉及在骨修复过程中，而骨形态发生蛋白质(BMP)-4涉及心脏组织修复过程。在一个方面，能够编码Runx的腺病毒和能够编码骨形态发生蛋白质(BMP)-2的腺病毒被包裹入水凝胶。
适合于被包裹入所述制孔剂相、散装水凝胶相、或者二者之中的细胞包括间充质干细胞、成肌细胞、血管祖细胞(例如，结疤内皮细胞)、来源于胚胎干细胞的分化细胞或者诱导性多功能干细胞、诱导性多功能细胞、或者能够直接从成纤维细胞改编成一种分化状态的细胞。
在一些实施例中，所述制孔剂组合物包括细胞，并且在其他实施例中，所述散装组合物包括细胞。如果所述细胞存在于组合物中(例如，在制备时被放入)，则所述细胞被配制成在对哺乳动物主体给药之后从组合物中释放。做为选择，所述组合物不包括细胞；于此相反，当被给药进入哺乳动物主体组织中之后(例如，在输入人类病人体内之后)，细胞被募集进入组合物中。所述哺乳动物可以是任意哺乳动物，例如，人类、灵长类动物、老鼠、大鼠、狗、猫、马，以及通过消耗食物生长的家畜或者动物，例如，牛、羊、猪、小鸡和山羊。在一种优选的实施方案中，所述哺乳动物是人类。做为选择，所述主体可以是非哺乳动物，例如，非洲蟾蜍、火蜥蜴或者蝾螈。
本发明提供了将细胞从脚手架配调配入哺乳动物主体组织中的方法，包括对所述主体给药一种组合物，所述组合物包括一种第一水凝胶和一种第二水凝胶，其中，第一水凝胶比第二水凝胶降解快至少10％，并且其中，所述组合物在被给药的时候不含有小孔，并且，其中，所述组合物在进入所述主体之后才包括小孔，并且其中，所述第一水凝胶或者第二水凝胶包括分离的细胞。
通过对主体给药一种组合物来实施在体内将细胞募集进入脚手架中的方法，其中，所述组合物包括一种第一水凝胶和一种第二水凝胶，其中，所述第一水凝胶的降解比第二水凝胶的降解快至少10％，并且，其中，所述组合物在给药的时候不含有小孔，但是在进入主体之后包括小孔。例如，通过第一水凝胶组合物与第二水凝胶组合物相比(例如，制孔剂组合物和散装组合物相比)的相对降解性或者可溶性产生小孔。
孔隙率会影响细胞募集进入组合物中和/或从所述组合物中出来。小孔是纳米孔、微米孔或者大孔。例如，纳米孔的直径小于大约10纳米。微米孔的直径在大约100纳米到20微米的范围内。大孔的直径大于大约20微米(例如，大于大约100微米或者大于大约400微米)。示例性的大孔孔径包括50微米、100微米、150微米、200微米、250微米、300微米、350微米、400微米、450微米、500微米、550微米、和600微米。大孔的尺寸可以允许真核细胞转移进入组合物或者从组合物中转移出来。在一个实施例中，大孔组合物具有的孔径为大约400微米到大约500微米。优选的孔径大小取决于其应用。例如，用于细胞调配和细胞释放，优选的孔隙直径是大于50微米。
制孔剂的尺寸与所有组合材料的尺寸有关。例如，对于保持完整的材料，所述制孔剂的直径小于全部合成材料最小尺寸的10％。制孔剂的密度在合成的组合物总体积的百分之10-80之间。例如，制孔剂的密度占总体积的百分比在15％到75％之间，在20％到70％之间，在25％到65％之间，在30％到60％之间，或者在35％到55％之间。优选的，制孔剂的密度占总体积的至少50％，从而实现最佳的细胞向水凝胶中的募集或者细胞从水凝胶中释放。
水凝胶所具有的弹性模量在大约10帕斯卡到大约1,000,000帕斯卡之间(例如，从大约10帕斯卡到大约100,000帕斯卡，从大约10帕斯卡到大约150,000帕斯卡，从大约10帕斯卡到大约200,000帕斯卡，从大约10帕斯卡到大约300,000帕斯卡，从大约10帕斯卡到大约400,000帕斯卡，从大约10帕斯卡到大约500,000帕斯卡，从大约10帕斯卡到大约600,000帕斯卡，从大约10帕斯卡到大约700,000帕斯卡，从大约10帕斯卡到大约800,000帕斯卡，或者从大约10帕斯卡到大约900,000帕斯卡)。优选的，降解缓慢的水凝胶具有的弹性模量在大约20千帕斯卡到60千帕斯卡之间，例如，25千帕斯卡到55千帕斯卡之间，在30千帕斯卡到50千帕斯卡之间，或者在35千帕斯卡到45千帕斯卡之间。在降解之前，为了维持水凝胶在包裹过程中的完整性，降解较快的水凝胶具有的弹性模量起初至少为40千帕斯卡。
优选的，降解缓慢的水凝胶(即，第二水凝胶或者“散装”)包括高分子量肽，具有类似细胞粘连蛋白的RGD的氨基酸顺序。做为选择，所述降解缓慢的水凝胶包括一种不同的粘合剂肽氨基酸部分，比如PHSRN或者DGEA。例如，所述降解缓慢的水凝胶优选的被2-10RGD肽/聚合物(例如，海藻酸盐聚合物)所修饰。
“水凝胶”指的是一种组合物，这种组合物包括亲水性聚合物链。示例性的水凝胶由与细胞包裹相容的材料组成，所述材料例如海藻酸盐、聚乙二醇(PEG)、PEG-丙烯酸盐、琼脂糖和合成蛋白(例如，胶原蛋白或者工程蛋白质(即，自组装肽-基水凝胶)。例如，市场上可买到的水凝胶包括BDTM PuraMatrixTM.BDTM PuraMatrixTM肽水凝胶是一种合成基质，通常用于制备给定的细胞培养三维(3D)微环境。
例如，所述水凝胶是一种生物相容性聚合基质，这种生物相容性聚合基质是完全生物可降解的或者部分生物可降解的。可以形成水凝胶的材料的实施例包括海藻酸盐和海藻酸盐衍生物，聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、明胶、胶原蛋白、琼脂糖、自然的多糖和合成的多糖、聚氨基酸(例如多肽，尤其是聚(赖氨酸))、聚酯(比如聚羟基丁酯和聚ε-己内酯)、聚酐；聚膦嗪、聚(乙烯醇)、聚(烯基氧化物)，尤其是聚(环氧乙烷)、聚(烯丙胺)(PAM)、聚(丙烯酸酯)、修饰的聚苯乙烯(比如聚(4-氨基甲基苯乙烯)、复合多元醇、polyoxamers、聚(糖醛酸)、聚(乙烯基吡硌烷酮)、和上述物质的共聚物，包括接枝共聚物。
还可以使用合成的聚合物和天然存在的聚合物，例如，但不局限于，胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、琼脂糖和富集粘连蛋白的凝胶剂。
一种优选的用于水凝胶的材料是海藻酸盐或者修饰海藻酸盐材料。海藻酸盐分子由(1-4)-连接的-β-D-甘露糖醛酸(M单元)和α-L-古罗糖醛酸(G单元)单体组成，这两个单体在聚合链上的比例和分布顺序可以发生变化。海藻酸盐多糖是一种聚合电解质系统，这种系统对于二价阳离子(例如，Ca+2、Mg+2、Ba+2)具有很强的亲和力，当暴露在这些分子中时，会形成稳定的水凝胶。
这里描述的组合物适合于临床应用，例如，骨修复、再生、或者形成；肌肉修复、再生或者形成；以及皮肤修复、再生或者形成。例如，所述组合物可以单独被用于骨折，或者与骨胶黏剂(粘固剂)或者胶一起用于骨折或者用于患病的肌肉组织或者被损坏的肌肉组织。将所述水凝胶(接种了细胞或者没有接种细胞的水凝胶)注射入疾病位点、受伤位点或者骨折位点(对于骨或者软骨的情况)。例如，将该水凝胶注射入骨头中或者注射到骨头上。能够用于促进骨或者软骨组织修复、再生或者形成的示例性的生物活性因子包括骨形态发生蛋白质(BMP)-2、骨形态发生蛋白质(BMP)-4或者RunX。
有时候，所述组合物补充细胞从而促进骨或者软骨修复、再生或者形成。作为选择，第一水凝胶和第二水凝胶包括一种分离的骨细胞，所述骨细胞选自由骨细胞、破骨细胞、骨先质细胞所组成的组中。做为选择，第一水凝胶或者第二水凝胶包括一种分离的软骨细胞，其中，所述分离的软骨细胞包括成软骨细胞。所述分离的骨细胞或者分离的软骨细胞是一种自体细胞或者异源细胞。
在用于肌肉应用时，例如，用于肌肉撕裂、肌肉劳损或者肌肉拉伤时，该水凝胶(接种细胞或者没有接种细胞的水凝胶)被注射到伤害位点。适当的用于肌肉的组合物包括一种包括第一水凝胶和第二水凝胶的组合物，其中，所述第一水凝胶的降解速度比第二水凝胶的降解速度快至少10％，并且，其中，第一水凝胶或者第二水凝胶包括一种生物活性因子，这种生物活性因子可以用于肌肉修复、再生或者形成。例如，所述生物活性因子包括MyoD。
有时候，所述组合物补充细胞从而促进肌肉或者软骨修复、再生或者形成。做为选择，第一水凝胶或者第二水凝胶包括一种分离的肌细胞，所述分离的肌细胞选自由骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和肌祖细胞所组成的组中。所述分离的肌细胞是一种自体细胞或者异源细胞。
对于皮肤应用，例如，皮肤灼伤、皮肤擦伤、皮肤划破或者皮肤疾病，该水凝胶(接种细胞或者没有接种细胞的水凝胶)可以直接作为泥敷剂或者伤口涂剂应用。优选的，当直接应用于治疗位点(例如，灼伤位点)时，在散装水凝胶中的大多数制孔剂(例如，超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、或者超过90％的制孔剂)被应用在皮肤表面或者进入皮肤组织。通过这种方式可以将生物活性因子或者细胞释放如皮肤表面或者皮肤底层，并且不离开皮肤或者靶点组织。可以用于皮肤修复、再生或者形成的示例性的生物活性因子是成纤维细胞生长因子(FGF)。
有时候，所述组合物补充细胞从而促进皮肤或者软骨修复、再生或者形成。做为选择，第一水凝胶或者第二水凝胶包括一种分离的皮肤细胞，所述分离的皮肤细胞选自由骨成纤维细胞、真皮细胞、表皮细胞或者皮肤祖细胞所组成的组中。所述分离的皮肤细胞是一种自体细胞或者异源细胞。
生物活性因子，比如多聚核苷酸、多肽或者其他试剂，可以被纯化和/或分离。具体地说，如这里所使用的，“分离的”或者“纯化的″核苷酸分子、多聚核苷酸、多肽或者蛋白质是指在通过重组技术产生时基本上不含有其他细胞物质或者培养基的物质，或者是指通过化学合成的化学前体物或者其他化学试剂。纯化后的化合物按重量计算(干重)占所关心化合物的至少60％。优选的，所述制剂按重量计算占所关心化合物的至少75％，更优选的占至少90％，并且最优选的，占至少99％。例如，纯化后的化合物按重量计算占理想化合物的至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，98％，99％，或者100％(重量/重量)。可以通过任何适当的标准方法来调节纯度，例如，通过柱形色谱法、薄层色层分析法、或者高效液相色谱(HPLC)分析。纯化后的或者分离的多聚核苷酸(核糖核酸(RNA)或者脱氧核糖核酸(DNA))不含有哪些在其天然存在形式中存在的侧链基因或者序列。纯化的也用于定义一种灭菌程度，这种灭菌程度可以安全的对人类主体给药，例如，不具有传染性或者毒剂。
同样，“基本上纯的”是指从其天然伴随的成分中分离出来的核苷酸或者多肽。通常，当核苷酸和多肽按重量计算不含有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或者甚至至少99％的蛋白质和其天然伴随存在的有机分子时，这种核苷酸和多肽是基本上纯的。
“分离的核苷酸”是指其结构与任意天然存在的核苷酸不相同的核苷酸，或者与天然存在的基因组核苷酸超过三个分离的基因片段不同的核苷酸。该术语包括，例如，(a)一种DNA，这种DNA属于天然存在的基因组DNA分子的一部分，但是这部分DNA不是天然存在有机体基因组分子的侧链核苷酸序列；(b)一种核苷酸，这种核苷酸与一种载体整合或者以某种方式整合入原核生物或者真核生物基因组DNA中，从而使所得到的分子不与任意天然存在的载体或者基因组DNA相一致；(c)一种分离的分子，例如互补DNA、基因组片段、通过聚合酶链式反应(PCR)产生的片段、或者限制性片断；和(d)一种重组核苷酸序列，这种重组核苷酸序列是杂合基因的一部分，即，一种基因编码的融合蛋白。根据本发明的分离的核苷酸分子进一步包括合成产生的分子，以及任意具有改变的化学主链和/或具有修饰的主链的核苷酸。
小分子是分子量小于2000道尔顿的化合物。优选的，所述小分子的分子质量小于1000道尔顿，更优选的，小于600道尔顿，例如，所述化合物的分子质量小于500道尔顿、400道尔顿、300道尔顿、200道尔顿或者100道尔顿。
术语“包括(comprising)”与“包含(including)”、“含有(containing)”或者“具有…的特征”是同义词，都属于开放式定义，不排除其他未列出的成分或者方法步骤。相反，术语“由。。。组成”不包括任何在权利要求中没有特别指出的成分、步骤或者组分。术语“基本上由。。。组成”将权利要求的范围限制在指定的材料或者步骤，“以及那些本质上不影响要求保护的发明的本质和新颖特性的材料或者步骤”。
从下面关于本发明优选的实施方案的表述中，以及从权利要求书中，本发明的其他特点和优势将变得显而易见。除非另有定义，这里使用的所有科技用语与本发明所属领域普通技术人员通常的理解具有相同的含义。虽然与这里描述的方法和材料相似的任何方法和材料都可以被用于实施或者检测本发明，但是下面描述的是适当的方法和材料。这里应用的所有公开的外国专利和专利申请在此通过引证全部并入本文。Genbank和NCBI指明的登记号码也通过引证在此全部并入本文。这里引用的其他出版的参考文献、文件、原稿和科学文献通过引证在此全部并入本文。如果出现矛盾，以本发明说明书包括定义为准。此外，这里所述的材料、方法和实施例只起到说明作用，并不作为限制。
附图简要说明
图1是一系列示意图、照片、条线图和线图，通过成像和机械性能试验显示了水凝胶内部原位生成小孔的过程。图1A是一种示意图，显示了水凝胶的形成。左侧：由快速降解的水凝胶(红色球)和间充质干细胞(MSCs；绿色球)组成的微珠。中间：微珠和间充质干细胞(MSCs)与一种用于形成第二水凝胶的聚合物材料(“散装凝胶”；灰色)相混合，所述聚合物材料在小珠周围交联。右侧：在微珠原位降解之后，留下完整的水凝胶网络，其中包括孔网，通过这种孔网可以释放间充质干细胞(MSCs)。图1B是成形立即制作的制孔剂的荧光显微照片，所述制孔剂是用荧光素(绿色)标记的。图1C是在包裹入海藻酸盐水凝胶网络之后制作的制孔剂的荧光显微照片，所述制孔剂是用荧光素(绿色)标记的。图1D是一种条线图，显示了标准水凝胶(蓝色条带)或者成孔水凝胶(红色条带)的弹性模量测量结果。在第0天，所有成孔合成物和标准水凝胶之间没有显著的统计学上的差异，这是由于还没有形成小孔的缘故；然后，4天之后，基本上由于小孔形成，合成物的模量降低。图1E是一系列扫描电子显微照片，描绘了刚刚形成的水凝胶(0天)，其显示十分完整的网络，还描述了形成5天之后、或者形成10天之后，以及在可以观察到明显的小孔形成的时间拍摄的成孔水凝胶。附图1F和附图1G验证了所述合成材料(50％体积百分比的制孔剂)的弹性模量本质上与标准水凝胶的弹性模量(不含制孔剂)没有不同，但是当小孔形成时，合成物的弹性模量充分降低。一周内合成物弹性模量的下降对应于成孔密度，并且，在制孔剂密度较低的时候，成孔密度和合成物弹性模量的减少之间存在线性关系。附图H和附图I描述了合成材料(25％制孔剂体积百分率)的断裂韧度最初与不含有制孔剂的标准水凝胶的断裂韧度相似，但是随后降低到初始值的一小部分。与弹性模量相似，断裂韧度的下降程度与制孔剂密度成比例，虽然不是以线性方式。标尺：(B、C和E)：1毫米。
图2是一系列照片、线状图和示意图，显示了体外间充质干细胞的调配。具体地说，图2显示了体外干细胞从成孔水凝胶中释放出来，还显示了可以通过改变制孔剂组合物和相对于散装水凝胶来讲制孔剂中的细胞分布区域来调节所述释放。附图2A是一种线状图，描述了互相联系的小孔形成动力学，这种动力学是使用毛细管试验进行评价的(误差线是平均标准误差，n＝3-4)。在7天之后即可以形成相互连通的小孔，除非制孔剂的比例非常高(超过渗透极限；80％)。在略少于渗透制孔剂密度的情况下没有观察到实际上相互连接的小孔形成。附图2B是一系列示意图或者照片，显示了钙黄绿素-AM染色的细胞在成孔水凝胶中分布的三维构造。细胞形态学本质上的改变描述了细胞在成孔水凝胶内的迁徙能力和增值能力，而细胞稀疏的分散在标准水凝胶之内。Ki-67免疫荧光(绿色)显示了增加的增殖作用，而核复染色(Hoescht，蓝色)显示成孔水凝胶内部比标准水凝胶呈现更高的多孔性。附图2C是一组荧光显微照片显示了小孔形成对成孔水凝胶内部的细胞含量和细胞形态的作用。具体地说，在体外培养4-10天后，对成孔水凝胶中的活体间充质干细胞(MSC)(使用钙黄绿素-AM，绿色)或者死细胞(使用乙锭均二聚物，红色)染色。球形的细胞形态表示纳米材料范围内细胞，这种细胞在两种材料中存在的时间非常短，但是在标准水凝胶中，这种细胞存在的时间比较长。图2D是线性图，显示了12天之后的累积释放的间充质干细胞(MSC)数，作为制孔剂体积密度的函数。图2E是线性图和示意图，显示了包裹入散装水凝胶相的间充质干细胞(MSC)使用动力学、包裹入成孔脚手架的制孔剂相的间充质干细胞(MSC)使用动力学、或者被包裹入标准水凝胶中的间充质干细胞(MSC)使用动力学。使用7.5％氧化的海藻酸盐制备制孔剂，并在100mM氯化钙中交联。图2F是线性图，显示了从成孔水凝胶的制孔剂相使用间充质干细胞(MSC)的动力学，作为适合于将D1细胞包裹入制孔剂的制孔剂成形条件的函数。图2G是条状图，显示了3H-胸腺嘧啶核苷的整合作用的定量分析，所述细胞能够以RGD-依赖形式增殖。图2H是一系列线性图，显示了海藻酸盐氧化程度对细胞释放的作用。当与制孔剂交联的钙是一个常数(100mM)时，增加氧化程度(从3-7.5％)会增加释放细胞的总数，而稍微降低氧化程度会延迟细胞释放。当制孔剂的氧化程度是常数(7.5％)时，增加与制孔剂交联的钙浓度(从25-100mM)会降低释放细胞的总数，并且稍微延迟细胞释放的发生。标尺：(A)：100μm.
图3是一系列照片和线性图，显示了体内控制间充质干细胞使用、移入和增殖的结果。具体的，图3A显示了在裸鼠皮下空隙内干细胞在体内从成孔水凝胶中释放出来。图3A是照片，显示了注射了2x106个mCherry-表达间充质干细胞(MSC)的裸鼠的代表性照片，或者在注射后7或30天后在标准水凝胶中(左侧)、与100mM氯化钙交联的成孔水凝胶中(中间)、或者盐水(右侧)中的照片。使用2-RGD/聚合链来修饰水凝胶的散装部分。一开始，较多的细胞进入只有盐水的环境中，但是在随后的时间点，在该环境中只含有较少的细胞，而当从成孔水凝胶中释放时，更多细胞最终移入。图3B是线性图，显示了注射入成孔水凝胶、标准水凝胶或者盐水中的mCherry-间充质干细胞(MSC)相对发光效率(与细胞密度成比例)的定量分析。图3C是线性图，显示了如果与制孔剂交联的钙密度减少的话，会充分的减少释放的细胞总密度，并轻微的延迟使用动力学(误差线是SEM，n＝4-6)。图3D是一系列照片，通过使用裸鼠头盖骨缺陷模型显示了成孔水凝胶提高人类间充质干细胞调解的骨再生能力。在裸鼠(Charles River)的头盖骨上形成准确大小的缺口。在缺口形成之后，立刻向缺口空隙中移入市场上可买到的人类间充质干细胞(Lonza)，所述细胞或者位于盐水(“只有细胞”)中、或者处于标准水凝胶中(2RGD/海藻酸盐聚合物，60千帕)，或者处于成孔水凝胶中。在向头盖骨缺口中植入4周之后，对新形成的头盖骨横截面进行微CT分析。在通过成孔水凝胶递送细胞的缺口中有明显更多的骨形成。
图4是一系列显微照片，描述了使用成孔水凝胶在不同的时间释放不同的种群。图4A-图4C是GFP-表达成肌细胞和结疤内皮细胞(OECs)的荧光显微照片，在成孔水凝胶内培养四天之后，这些细胞被附着到组织培养塑料上。其中，在成孔水凝胶中，用来形成小孔的化学品是不同的，并且不同的细胞型最初放置于不同的培养室：(图4A)：在散装水凝胶中的成肌细胞，在制孔剂组分中的结疤内皮细胞(OECs)；(图4B)：在小珠组分中的成肌细胞，在制孔剂组分中的结疤内皮细胞(OECs)；(图4C)：成肌细胞和结疤内皮细胞(OECs)都位于散装水凝胶组分中。图4D是塑料底物代表性的显微照片，在此底物上接种了相同数量的GFP-成肌细胞和结疤内皮细胞(OECs)。成肌细胞的生长超过结疤内皮细胞(OECs).使用乙锭均二聚物(红色)对细胞进行染色，从而使GFP-成肌细胞呈现黄色而结疤内皮细胞(OECs)呈现红色。图像被放大10倍。
图5是一系列显微照片，描述了使用水凝胶进行趋化因子-调解的细胞募集。具体地说，图5显示了在体内通过成孔水凝胶控制趋化因子-调解的细胞募集。首先氧化海藻酸盐，然后使用硼氢化钠还原，在原来糖的位置产生醇基。图5A和图5B是被募集进入标准水凝胶中的树突状细胞的荧光显微照片(图5A)、被募集进入可注射的海藻酸盐水凝胶中的树突状细胞的荧光显微照片和被募集进入成孔水凝胶中的树突状细胞的荧光显微照片(图5B)。两个水凝胶组中都含有2pg的粒性白细胞-巨噬细胞集落刺激因子。图5C和图5D是被募集入成孔水凝胶中的树突状细胞的荧光显微照片，所述成孔水凝胶使用氧化的制孔剂(图5C)或者还原的制孔剂(图5D)制备的。不加入趋化因子。为了进行组织研究，使用CD11c(绿色)和NIHC-II(红色)染色，使用Hoescht核复染色(蓝色)。在图5C和图5D中，只进行核染色(白色)。本图显示了含有氧化海藻酸盐制成的制孔剂和含有还原海藻酸盐制成的制孔剂材料在宿主细胞募集方面的差异。标尺：100pm.
图6是一系列线性图、直方图和照片，显示了在成孔水凝胶内控制干细胞增殖，从水凝胶中利用干细胞和通过改变散装相组合物再生骨骼的能力。图6A和图6B是线性图，显示了间充质干细胞在24小时内整合3H-胸腺嘧啶(与DNA合成成比例)的分析(D1；红色曲线)，或者在培养7天之后累计的间充质干细胞(MSC)使用和散装水凝胶(弹性模量为60千帕)中RGD肽密度之间的函数曲线(蓝色曲线)，或者(图6B)含有10RGD肽/海藻酸盐聚合物的散装水凝胶的弹性模量(数据是平均数+/-SEM，n＝3-5)。RGD密度对细胞增殖有显著地影响，而弹性模量对增殖和释放都有影响(p＜0.05，统计学方差分析)。图6C是条线图，显示了DNA合成分析(作为小孔形成的函数)。图6D是一系列照片，显示了培养50天后，低温切割成孔水凝胶，对其中的D1细胞进行Ki-67(增殖标记物，绿色)进行染色所得到的照片。图6E和6F是线性图，显示了活体内对间充质干细胞使用、移入和增殖的控制。图6E是一系列线性图，显示了mCherry-间充质干细胞(MSC)相对发光效率的定量分析(与细胞密度成比例)，所述mCherry间充质干细胞(MSC)被注射入成孔水凝胶中，其中，使用每海藻酸盐中有2()，或者10()RGD肽聚合物修饰水凝胶中的散装相。作为选择，将细胞注射进入含有2RGD肽/海藻酸盐聚合物()的标准水凝胶中。图6F显示了治愈百分比(将人间充质干细胞(MSC)移植入裸鼠头盖骨缺陷后产生的新骨形成)的定量分析，作为间充质干细胞(MSC)传递方法的函数。误差线SEM，n＝4-6.
图7是一系列线性图和条形频率图，显示了二元海藻酸盐形成的水凝胶的机械性能和体外降解作用。图7A和7B显示了通过将氧化海藻酸盐(理论氧化程度为5％)和未修饰的高分子量海藻酸盐相交联的二元结合物形成的散装水凝胶的弹性模量(图7A)和降解作用(图7B)，其中未修饰的高分子量海藻酸盐的常数密度是20毫克/毫升。通过比较4天之后体外干重与最初干重来评价降解作用。图7C是显示了由20毫克/毫升氧化海藻酸盐和7.5毫克/毫升未修饰的海藻酸盐二元混合物形成的制孔剂直径。通过处理制孔剂的荧光显微照片来测量制孔剂的直径，其中制孔剂是由氨基荧光素标记的海藻酸盐制备的。误差线是SD，n＝3-4.
图8显示了可移植的生物材料，这种生物材料模拟干细胞生态位中能够使移植的祖细胞增殖的方面并设计他们分化成细胞，所述细胞能够迁入受伤的组织中并参与再生。
图9是水凝胶脚手架示意图(左上侧)，所述水凝胶脚手架通过呈递特异性插入信号控制移植的细胞历程，但是防止移植的细胞迁出材料，防止宿主细胞迁入材料。底部：实验数据描述了在通过弹性模量的情况下纳米孔径的水凝胶控制间充质干细胞历程的能力。右侧，上侧：大孔海绵示意图，所述大孔海绵通过呈递专门的插入信号控制移植历程，同时允许宿主细胞迁入，以及移植细胞迁出材料。
图10是一系列图像，描述了作为替换的产生大孔水凝胶的策略。如示意图(中心，右侧)中所描述的，将制孔剂包埋如“散装”水凝胶中，或者使用照相平版印刷方法提供散装水凝胶的非交联区域。当交联所述散装水凝胶后，使用溶剂，例如丙酮，除去水凝胶和制孔剂中的非交联部分。左侧，大孔水凝胶的图片。
图11是示意图和条形图，描述了制备快速降解的海藻酸盐-基水凝胶制孔剂的方法。左上侧：使用NaIO4将海藻酸盐氧化为海藻酸盐二醛的化学反应方案。右上侧：描述可交联的、海藻酸盐富含古罗糖醛酸部分的损失(短的直线部分)、和由于高碘酸钠氧化作用造成的聚合物质量的全面下降。下部：描述了水凝胶随着时间变化的干重损失的数据，所述水凝胶由20毫克/毫升未修饰的海藻酸盐制成(方形)、由20毫克/毫升海藻酸盐二醛制成(5％氧化程度；菱形)、或者由20毫克/毫升海藻酸盐二醛和7.5毫克/毫升未修饰的海藻酸盐二元混合物制成(三角形)。
图12是一种示意图，显示了制孔剂的制备和表征。
图13是一种示意图，显示了使用成孔水凝胶控制宿主细胞募集。具体的说，该图是可移植性生物材料系统的示意图，所述可移植生物材料细胞模拟感染的微环境，允许活化的抗原呈递树状细胞募集、涉及并随后靶向淋巴结来参与有效的抗肿瘤反应。
图14是一系列显微照片，显示了如何使用包括制孔剂相的聚合物影响制孔剂的降解和加工。具体的说，这些图中显示了使用荧光素标记的海藻酸盐二醛制备的制孔剂的荧光显微照片。在100mM氯化钙中交联(顶部)之后，无论是使用20毫克/毫升海藻酸盐二醛制备的制孔剂(左上侧)还是使用20毫克/毫升海藻酸盐二醛与7.5毫克/毫升未修饰的海藻酸盐二元混合物制备的制孔剂都是非常完整的。然后，使用冲洗步骤纯化制孔剂并除去过量的氯化钙，之后，完全由海藻酸盐二醛制备的制孔剂被破坏，导致其形态改变并向溶液中释放荧光素标记的聚合物，从而产生相当水平的背景荧光素荧光(左下侧)。相反，20毫克/毫升海藻酸盐二醛与7.5毫克/毫升未修饰的海藻酸盐二元混合物产生的制孔剂能够经得起冲洗步骤。
具体实施方式
近十年来，生物相容性聚合物已经被用于形成脚手架，作为细胞移植的载体，或者用于募集宿主细胞群进入装置。通常，使用海绵，例如聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)，或者合成的水凝胶，例如海藻酸盐。然而这两种材料都有各自的缺点。例如，海绵通常吸附血清蛋白，因此很难控制粘附的蛋白质或者多肽(例如，RGD)从材料中呈递。同时，海绵材料通常不适用于注射，并且需要采用侵入性外科手术的方式植入，并且将移植的细胞或者宿主细胞暴露在一开始可能不利于宿主的环境中(例如，在发炎过程中，嗜中性白细胞可能攻击干细胞)。另一方面，合成水凝胶通常是可注射的，只需要最少的侵入性传递，并且不会与蛋白质发生相互作用。但是，在这里描述的发明之前，水凝胶的孔径大小通常要远远小于真核生物的直径，因此难于扩增移植的细胞群体，释放移植细胞从而允许其修复受损组织或者将宿主细胞募集进入装置。
本发明包括在水凝胶注射之后，在水凝胶内部原地形成小孔的方法。通过包裹在周围水凝胶中的牺牲性制孔剂的降解作用可以原位形成小孔。通过变换用于形成制孔剂的材料来控制小孔形成的动力学和发生，并且，细胞或者被包裹入制孔剂本身中或者被包裹入制孔剂周围的水凝胶中。实施例显示了干细胞的体外调配、增殖和分化，以及干细胞体内调配和趋化因子调节的细胞募集。通过在基质内形成小孔，所述系统调节细胞从聚合物基质中受控制的调配，或者将细胞局部募集进入聚合物母体。使用者预先确定小孔的尺寸、分布、和形成动力学，而含有小孔的基质完整性，以及处于该基质中的细胞或者生物因子的完整性不变。
因此，这里描述的是使用不溶性信号(例如，水凝胶附着配位体呈递和/或弹性模数(即，硬度))来产生(1)可注射的材料，(2)使使用者能够通过利用不可溶信号控制细胞历程的材料；和(3)随着时间的流逝产生小孔从而调配或募集细胞的材料。具体的说，这里描述的方法通过利用一种允许细胞被包裹入成孔相(此后叫做“制孔剂”)或者非降解相或者缓慢降解相(此后叫做“散装”)的过程产生成孔水凝胶。
本发明提供了一种概括性方法，用于制备成孔水凝胶，这种成孔水凝胶能够包裹细胞，本发明还提供了一种控制细胞从水凝胶中被调配出或者被募集进入水凝胶中的动力学的方式。水凝胶微珠“制孔剂”形成后背包裹入第二水凝胶(“散装”水凝胶)中。用于形成制孔剂和散装水凝胶的聚合物组成可以是变化的，但是，制孔剂必须比散装水凝胶降解的快(例如，快10％、20％、50％、2X、5X、10X、20X或更快)。细胞或者生物活性因子(例如，生长因子，比方说，粒性白细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、血管内皮生长因子(VEGF)、浓缩低聚核苷酸，例如CpG或质粒DNA)可以任选的被装入制孔剂相或者散装水凝胶相，或者被装入两相中。在使用者预先确定的时间内，制孔剂原地降解，同时释放细胞，或者细胞被移入材料中。然而，由于最开始没有小孔，成孔水凝胶能够有效的立即提供机械支持(图1)。
通过控制制孔剂降解动力学来操控细胞释放或者募集。例如，氧化海藻酸盐聚合物来制备海藻酸盐二醛，当氧化程度增加时，释放的细胞总数增加(图2、图3)。做为选择，可以改变用于交联制孔剂的条件来控制制孔剂明显降解的时间和细胞开始释放的时间(图2)。可以进一步改变制孔剂化合物来促进或者抑制其与宿主蛋白的相互作用(图5)。
通过操控散装水凝胶的生物物理和生物化学性质(例如，整合蛋白-结合附着肽，比如，RGD)来控制细胞释放和细胞历程。例如，小孔形成、散装水凝胶RGD密度和散装水凝胶弹性都影响这些材料内的细胞增殖(图2，图6)。正交处理制孔剂和散装水凝胶使其彼此分开，能够提高系统协调能力，从而操控细胞释放和细胞历程。例如，不依赖于小孔形成动力学，通过改变弹性模量或者RGD调整干细胞系定型。相反，其他用于制备大孔材料的方法(例如，基于溶剂的制孔剂提取)与细胞包覆是不协调的，并通常会影响制孔剂相和散装相的物理性能。在降解过程中，散装水凝胶的物理性质的生物化学性质随着快速降解不断变化。这些参数被用于设计散装相从而调节细胞历程。
水凝胶组合物
水凝胶包括亲水性聚合物链网络。水凝胶(也叫做“水相凝胶”)有时以胶状凝胶存在，其中，水是分散介质。水凝胶的吸收能力非常强(他们含有超过99.9％的水)的天然聚合物或者合成聚合物的吸收剂。水凝胶同时具有与自然组织非常相似的柔韧程度，这是由于他们较高的含水率。水凝胶由交联聚合物组成。示例性的水凝胶由与细胞包裹物相容的材料组成，所述包括材料例如海藻酸盐、聚乙二醇(PEG)、PEG-丙烯酸盐、琼脂糖和合成蛋白(例如，胶原蛋白或者工程蛋白质(即，自组装肽-基水凝胶)。例如，市场上可买到的水凝胶包括BDTM PuraMatrixTM肽水凝胶，这是一种合成基质，通常用于制备确定的三维(3D)微环境，用于细胞培养。
例如，所述水凝胶是一种生物相容性聚合基质，这种生物相容性聚合基质是完全生物可降解的或者部分生物可降解的。可以形成水凝胶的材料的实施例包括海藻酸盐和海藻酸盐衍生物，聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、明胶、胶原蛋白、琼脂糖、自然的多糖和合成的多糖、聚氨基酸(例如多肽，尤其是聚(赖氨酸))、聚酯(比如聚羟基丁酯和聚ε-己内酯)、聚酐；聚膦嗪、聚(乙烯醇)、聚(烯基氧化物)，尤其是聚(环氧乙烷)、聚(烯丙胺)(PAM)、聚(丙烯酸酯)、修饰的聚苯乙烯(比如聚(4-氨基甲基苯乙烯)、复合多元醇、polyoxamers、聚(糖醛酸)、聚(乙烯基吡硌烷酮)、和上述物质的共聚物，包括接枝共聚物。
还可以使用合成的聚合物和天然存在的聚合物，例如，但不局限于，胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、琼脂糖和富集粘连蛋白的凝胶剂。
一种优选的用于水凝胶的材料是海藻酸盐或者修饰海藻酸盐材料。海藻酸盐分子由(1-4)-连接的-β-D-甘露糖醛酸(M单元)和α-L-古罗糖醛酸(G单元)单体组成，这两个单体在聚合链上的比例和分布顺序可以发生变化。海藻酸盐多糖是一种聚合电解质系统，这种系统对于二价阳离子(例如，Ca+2、Mg+2、Ba+2)具有很强的亲和力，当暴露在这些分子中时，会形成稳定的水凝胶。
合成水凝胶通常是可注射的，只需要最少的侵入性传递，并且不会与蛋白质发生相互作用。从而，附着蛋白质或者肽的呈递被精密控制。此外，合成水凝胶通常具有的孔径粒度远远小于细胞(小于10纳米，而细胞大于10微米)，从而防止宿主细胞攻击移植的细胞。但是，这种小的孔径大小也会组织移植的细胞在材料内大面积增殖，并最终阻止他们释放并影响各种各样的功能(例如，功能性组织的再生或者病变组织的破坏)。
已经引入一些方法使水凝胶和海绵的理想特点相结合，例如，坚硬的微球体已经被包裹入水凝胶，然后用溶剂萃取(例如，丙酮)，从而产生一种大孔水凝胶，并且，冷冻干燥已经被用于产生大孔水凝胶。可以对水凝胶进行修饰从而在体内快速降级并释放宿主细胞。然而，在这里所描述的发明之前，没有任何方式允许非降解材料(或者缓慢降解材料)组分与细胞包裹物结合。水凝胶材料的机械性能和生物化学组成能够严重影响细胞历程，并且其自身的降解作用可以本质上调节细胞历程。
成孔组合物
制备水凝胶微珠(“制孔剂”)。随后，将制孔剂包裹入“散装”水凝胶，散装水凝胶或者是不可降解的，或者是只能以与制孔剂相比更加缓慢的速度降解。细胞选择性的被包裹入制孔剂或者散装部分。在水凝胶形成之后或者将水凝胶注射进入理想的体内位点之后，所述合成材料中不含小孔，并可以作为一种手术填充剂。随后，制孔剂降解原位产生小孔，被包裹的细胞被调配出合成材料并进入周围组织或者较远的组织，例如体内的淋巴结。在制孔剂形成期间控制小孔的尺寸和分布，并混合用于形成散装水凝胶的聚合物。
做为选择，所述水凝胶不包裹细胞即被注射，使用小孔形成作用来募集宿主细胞，单独使用或者与散装水凝胶部分或者制孔剂部分释放出的趋化因子结合使用。所述制孔剂由任意生物相容性聚合物组成，只要所述聚合物的降解速度比用于形成“散装”水凝胶的材料更快即可，并且，起初，制孔剂具有足够的机械稳定性，能够与形成散装水凝胶相的聚合物相混合。所述“散装”由任意可以形成水凝胶的聚合物组成。
海藻酸盐组合物
在本发明组合物和方法中使用的聚合物是天然存在的或者是合成的。在一个实施例中，制孔剂和散装水凝胶都由海藻酸盐组成。这里使用的术语“海藻酸盐”指的是各种各样的藻朊酸衍生物(例如，钙盐、钠盐或者钾盐，或者丙二醇藻朊酸酯)。参见，例如，PCT/US97/16890，通过引证在此并入本文。
适用于形成制孔剂的海藻酸盐聚合物所具有的道尔顿分子量是5,000到500,000Da。所述聚合物选择性的进一步被修饰(例如，通过使用高碘酸钠氧化)(Bouhadir etal.，2001，Biotech.Prog.17：945-950，通过引证在此并入本文)，从而促进快速降解。在如下所述的实施例中，通过使用共轴气流喷雾器挤入二阶阳离子浴(例如，Ca2+或者Ba2+)中交联聚合物，形成水凝胶微珠。气流速率越高，制孔剂直径越低。
用于形成制孔剂的二价离子的浓度可以在5到500mM范围内变化，聚合物的浓度范围按重量计算是1％-5％。然而，任何能够产生比散装相明显小的制孔剂的方法都是适当的。制孔剂化学可以进一步被操作从而产生能够与宿主蛋白质或者细胞发生一些相互作用的制孔剂(例如，将海藻酸盐氧化到大于5％的糖基明显与宿主细胞发生相互作用的程度，图5)，或者从而抑制这种相互作用(例如，使用NaBH4还原氧化的海藻酸盐，还原后的海藻酸盐与蛋白质或者与宿主细胞显示最小的相互作用，图5)。
适用于形成散装水凝胶的海藻酸盐聚合物所具有的道尔顿分子量是5,000到500,000Da。所述聚合物可以进一步被修饰(例如，使用高碘酸钠氧化)，从而促进降解作用，只要散装水凝胶降解的明显比制孔剂慢得多。所述聚合物还可以被修饰来呈递生物信号，从而控制细胞反应(例如，整合因子结合附着肽，比如RGD)。制孔剂或者散装水凝胶都可以用于包裹生物活性因子，比如低聚核苷酸、生长因子或者药物，从而进一步控制细胞反应。用于形成散装水凝胶的二价离子的浓度可以在5到500mM范围内变化，聚合物的浓度范围按重量计算是1％-5％。定制散装聚合物的弹性模量，例如，控制被包裹细胞的历程。
实施例1：在水凝胶内原位形成小孔
图1显示了图像和机械性能试验，介绍了水凝胶内部原位形成的小孔。如图1所述，微珠由快速降解的水凝胶组成(红色球)，将磁珠与第二水凝胶形成的聚合物材料相混合，所述聚合物材料在小珠周围交联。在微珠原位降解之后，留下完整的水凝胶网络(桃红色)，其中包括孔网。确定标准水凝胶(左侧)或者成孔水凝胶(右侧条带)的弹性模量测量结果(图1D)。在第0天，所有成孔合成物和标准水凝胶之间没有显著的统计学上的差异，这是由于还没有形成小孔的缘故；然后，4天之后，基本上由于小孔形成，合成物的模量降低。
下面描述了其他涉及水凝胶生产的方法。Bouhadir et al.Polymer 1999；40：3575-84(通过引证在此全部并入本文)描述了使用高碘酸钠氧化海藻酸盐，并对该反应进行定性。Bouhadir et al.Biotechnol.Prog.2001；17：945-50(通过引证在此全部并入本文)描述了将高分子量海藻酸盐氧化成海藻酸盐二醛(海藻酸盐二醛是一种高分子量的海藻酸盐，其中，海藻酸盐中一定百分比(例如，5％)的糖被氧化形成醛)，并用于制备快速降解的水凝胶。Kong et al.Polymer 2002；43：6239-46(通过引证在此全部并入本文)描述了使用γ-射线减少富含古罗糖醛酸的海藻酸盐的重均摩尔质量(Mw)，并不显著减少GA含量(例如，γ射线选择性的攻击甘露糖醛酸，海藻酸盐的MA部分。海藻酸盐由GA部分和MA部分组成，GA部分为海藻酸盐提供刚性(弹性模量)。Kong et al.Polymer 2002；43：6239-46(通过引证在此全部并入本文)显示了高分子量、富含GA的海藻酸盐经过照射之后，与低分子量、高GA的海藻酸盐形成二元结合物，所述二元结合物与钙交联形成硬水凝胶，但是与由相同质量浓度的只有高分子量GA富集海藻酸盐组成的水凝胶相比，所述硬水凝胶降解的更快，并且与具有更少的溶液粘度。Alsberg et al.J Dent Res 2003；82(11)：903-8(通过引证在此全部并入本文)描述了照射过的低分子量、富含GA的海藻酸盐的降解曲线，用于骨骼组织设计中。Kong et al.Adv.Mater 2004；16(21)：1917-21(通过引证在此全部并入本文)描述了通过将γ辐射方法和氧化反应相结合控制水凝胶的降解曲线，并用于软骨设计。
控制氢生物材料降解作用的方法在本领域内十分有名的。例如，Lutolf MP etal.Nat Biotechnol.2003；21：513-8(通过引证在此全部并入本文)描述了设计用于通过哺乳动物酶(MMPs)降解的聚(乙二醇)基材料。Bryant SJ et al.Biomaterials 2007；28(19)：2978-86(US 7,192,693B2；通过引证在此全部并入本文)描述了一种产生具有大规格孔的水凝胶的方法。一种小孔模板(例如，聚甲基丙烯酸甲酯小珠)被包裹入散装水凝胶中，然后使用丙酮和甲醇提取制孔剂，而散装水凝胶保持完整。Silva etal.Proc.Natl.Acad.Sci USA 2008；105(38)：14347-52(通过引证在此全部并入本文；US2008/0044900)描述了内皮祖细胞从海藻酸盐海绵中的调配。通过形成海藻酸盐水凝胶来制备海绵，然后对其进行冷冻干燥(冰晶形成小孔)。这些材料能够改善细胞的治疗作用(与只递送细胞相比)，但是这些材料必须被手术移植(即，非-可注射的)，不适用于细胞包裹(在冷冻干燥时细胞会死亡)，并且这种方法使通过弹性模量控制细胞历程变得更加困难。Ali et al.Nat Mater 2009(通过引证在此全部并入本文)描述了使用多孔脚手架募集树突状细胞并设计使他们发生抗肿瘤反应。Huebsch et al.Nat Mater 2010；9：518-26(通过引证在此全部并入本文)描述了通过使用水凝胶弹性模量控制被包裹的间充质干细胞的分化作用。
这里描述了使用不溶性插入信号，例如，水凝胶附着配位体呈递和/或弹性模量(即，硬度)来产生材料，所述材料是：1)可注射性的；2)允许使用者通过不可溶性插入信号控制细胞历程；和3)在一段时间内形成小孔，并用于调配或募集细胞。具体地说，这里描述的方法产生成孔水凝胶，使用这种方法能够将细胞包裹入成孔水凝胶相(此后被称为“制孔剂”)或者被包裹入非降解相或者缓慢降解相(此后被称为“散装相”)中。在这里所描述的方法中，使用水解、而不是其他溶剂降解制孔剂相，这意味着细胞被包裹入制孔剂中，或者被包裹入制孔剂周围的散装水凝胶中，并且，将蛋白质或者其他生物活性化合物包裹入凝胶状后其变性的机会微乎其微。
如在下面详细描述的那样，在包裹期间，制孔剂保持完整，但是快速降解产生小孔，这种小孔通过扫描电子显微镜是可视的，并且会导致弹性模量的损失和合成材料断裂韧度的损失。具体地说，扫描电子显微照片(SEM)描绘了刚刚形成的水凝胶(0天)，其占有十分完整的网络，然而，在形成10天之后，可以观察到明显的小孔形成(图1E)。所述合成材料(50％体积百分比的制孔剂)的弹性模量本质上与标准水凝胶的弹性模量(不含制孔剂)没有不同，但是当小孔形成时，合成材料的弹性模量明显降低(图1F和图1G)。一周内合成物弹性模量的下降对应于成孔密度，并且，在制孔剂密度较低的时候，成孔密度和合成物弹性模量的减少之间存在线性关系。合成材料(25％制孔剂体积百分率)的断裂韧度最初与不含有制孔剂的标准水凝胶的断裂韧度相似，但是随后降低到初始值的一小部分(图H和I)。与弹性模量相似，断裂韧度的下降程度与制孔剂密度成比例，虽然不是以线性方式。这些检测结果显示，制孔剂在包裹期间保持完整，并原位降解形成小孔。
实施例2：细胞的体外和体内释放
通过将可降解的海藻酸盐制孔剂，以及骨髓基质干细胞(D1)包裹进入高分子量的散装海藻酸盐凝胶中形成成孔水凝胶。使用20毫克/毫升的海藻酸盐二醛(高分子量、高古罗糖醛酸含量的海藻酸盐中海藻酸盐糖残基的理论氧化率是7.5％)和7.5毫克/毫升的高分子量、高古罗糖醛酸(GA)含量的海藻酸盐二元混合物制备制孔剂。在0.1M CaCl2和0.1MHEPES的恒温浴中交联聚合物，使用同轴氮气流通过玻璃喷雾器挤出这种聚合物混合物。使用血浆游离细胞培养基大面积的洗涤制孔剂。对每个海藻酸盐聚合物使用两个RGD肽修饰高分子量、高GA含量的海藻酸盐，使用20毫克/毫升这种海藻酸盐形成散装水凝胶。使用注射器将D1细胞和制孔剂混合进入散装水凝胶中，然后使用硫酸钙交联所述合成物。图2中显示了一段时间内在体外从系统中释放出来的D1细胞的数目。释放的动力学可以通过以下方式修饰：1)控制用于形成制孔剂的CaCl2浓度，通过2)改变制孔剂的组成(氧化程度)，并通过3)改变细胞的分布区域(或者在制孔剂内，或者在散装水凝胶中)。
具体地说，图2显示了体外间充质干细胞的调配。体外干细胞从成孔水凝胶中释放出来，并通过改变制孔剂的组成和相对于大块水凝胶来讲制孔剂中的细胞分布区域来调节所述释放。图2C显示了制孔剂密度(0-80体积百分数)对细胞含量方面的作用以及从成孔水凝胶的流出。具体地说，在体外培养4-10天后，对成孔水凝胶中的活体间充质干细胞(MSC)(使用钙黄绿素-AM，绿色)或者死细胞(使用乙锭均二聚物，红色)染色。球形的细胞形态表示纳米材料范围内细胞，这种细胞在两种材料中存在的时间非常短，但是在标准水凝胶中，这种细胞存在的时间比较长。图2D显示了12天之后的累积释放的间充质干细胞(MSC)数，作为制孔剂体积密度的函数。
如图2D所示，制孔剂的尺寸与所有合成材料的尺寸有关。具体地说，对于保持完整的材料，所述制孔剂的直径小于全部合成材料最小尺寸的10％。在细胞募集和细胞释放中，制孔剂的密度占总体积的百分之10-80之间，例如，制孔剂的密度占总体积的百分比在15％到75％之间，在20％到70％之间，在25％到65％之间，在30％到60％之间，或者在35％到55％之间。优选的，所述密度的制孔剂占总体积的至少50％。
进行物理实验和体外实验，从而确定相互连接的空洞形成动力学，以及间充质干细胞释放的相应动力学(分别是图2A和图2E)。在这里的体外试验中，使用克隆衍生的、市场上可以买到的老鼠间充质干细胞系(D1)。使用一种毛细管实验评价小孔形成。简言之，首先通过称量缓冲液饱和的合成物成孔水凝胶的重量来测定相互连接的小孔密度，然后，使用纸巾轻轻的接触凝胶表面，在使用毛细管作用吸走水分之后重新承重水凝胶。根据质量的相对变化计算孔隙度。对于活体外细胞释放试验，使用2个RGD肽/海藻酸盐聚合物修饰成孔水凝胶的散装成分，得到60千帕的弹性模量。在7天之后即可以形成相互连通的小孔，除非制孔剂的比例非常高(超过渗透极限；80％)。在略少于渗透制孔剂密度的情况下没有观察到实际上相互连接的小孔形成。图2F显示了从成孔水凝胶的制孔剂相使用间充质干细胞(MSC)的动力学，作为适合于将D1细胞包裹入制孔剂的制孔剂成形条件的函数。
随后使用老鼠间充质干细胞(MSC)系进行释放研究。通过观察可知，细胞释放与整体小孔密度和细胞形态的逐渐变化成比例，反应了微米级限制的损失。进行实验确定小孔形成对水凝胶内细胞含量和细胞增殖的作用。使用钙黄绿素-AM染色定性确定细胞含量，而通过对Ki-67表达进行免疫染色来定性地确定增殖作用，或者通过测定3H-胸腺嘧啶结合定量确定增殖作用。图2B显示了三维重建的钙黄绿素-AM染色的细胞，这种细胞遍布成孔水凝胶。细胞形态学本质上的改变描述了细胞在成孔水凝胶内的迁徙能力和增值能力，而细胞稀疏的分散在标准水凝胶之内。Ki-67萤光免疫检验法指出了与标准水凝胶相比，成孔水凝胶内部具有更高的细胞含量，和增加的增值作用。图2G显示了3H-胸腺嘧啶核苷的整合作用的定量分析，显示细胞能够以RGD-依赖的形式进行增殖。
进行研究，确定化学成分的变化或者用于合成制孔剂的交联条件的变化是否能够转变细胞释放的动力学(Bouhadir KH，Lee KY，Alsberg E，Damm KL，Anderson KW，MooneyDJ.Degradation of Partially Oxidized Alginate and Its Potential Applicationfor Tissue Engineering(部分氧化地海藻酸盐的降解作用及其在组织设计方面的应用前景).Biotechnol.Prog.2001；17：945-50)。图2H显示了对细胞释放动力学的控制，所述控制是通过细胞进入制孔剂相或者进入制孔剂周围的散装相的分室作用实现的，而且，与较低浓度的钙进行交联的制孔剂降解的比较慢，在稍后的时间点释放细胞。使用具有较低浓度的钙制备而成的制孔剂会产生更加均质的交联。
使用恒定的散装组分(2个RGD/聚合物，60千帕)、恒定的制孔剂密度(50％)，和改变的制孔剂组合物制备成孔水凝胶。通过改变海藻酸盐聚合物的理论氧化程度来改变制孔剂的化学组成。在氧化反应期间，通过改变高碘酸钠与海藻酸盐的比例来控制氧化程度(Bouhadir 2001)。使用20毫克/毫升氧化的海藻酸盐和5毫克/毫升未修饰的、高分子量海藻酸盐的二元混合物形成制孔剂。在25-100mM的氯化钙中交联，形成制孔剂。图2H显示了海藻酸盐氧化程度对细胞释放的作用。钙以恒定的常数与制孔剂(100mM)交联，从3-7.5％增加氧化程度会增加释放细胞的综述，而稍微降低氧化程度会延迟细胞释放。当制孔剂的氧化程度是常数(7.5％)时，增加与制孔剂交联的钙浓度(从25-100mM)会降低释放细胞的总数，并且稍微延迟细胞释放的发生。
实施例3：控制间充质干细胞在体内调配，移入，和增殖
最后，进行体内试验来确定成孔水凝胶是否可以被用于操控间充质干细胞(MSC)在活体内的释放动力学。对此，将表达间充质干细胞(MSC)的mCherry皮下移植进入裸鼠体内。使用非侵入性荧光照片观察细胞移入，增殖和调配。结果显示，与在盐水中递送细胞相比，成孔水凝胶不但延迟了移入，而且这种材料会最终导致更多的增殖。水凝胶提供了一种微环境，这种微环境允许细胞在形成小孔之后增殖。最后，由于这些材料能够有效促进体内间充质干细胞(MSC)释放和扩散，可以在裸鼠头盖骨缺口上使用人类间充质干细胞(MSC)，再生头盖骨缺口。这回导致改善的矿物化骨再生，甚至在更早的时间点再生。
具体地说，对于体内试验，对D1细胞进行修饰从而组成性地表达一种可检测的标记物，例如，mCherry或者绿色荧光蛋白质(GFP)，并且将D1细胞被包裹入不含制孔剂的标准散装水凝胶中、包裹入成孔水凝胶中，或者与盐水相混合。其次，使用18-针将细胞注射到裸鼠的后背中。通过IVIS系统(Caliper生命科学公司)观察mCherry荧光，以此来检测一段时间内的细胞释放和增殖。这些数据显示与标准水凝胶相比，成孔水凝胶具有明显更多的细胞释放和增殖(图3)。此外，虽然通过简单盐水注射细胞也增殖，但是从成孔水凝胶中的调配可以1)改变局部细胞传递和增殖的动力学，并且，2)最后产生更多数量的递送细胞(图3)。
具体地说，进行实验来确定通过改变制孔剂的组成控制细胞在体内释放动力学的能力。如图3A所示，在裸鼠皮下空隙内，干细胞在体内从成孔水凝胶中释放出来。向裸鼠中注射2x106MCherry-表达间充质干细胞(MSC)，在注射后7或30天后在标准水凝胶中(左侧)、成孔水凝胶中(中间)，其中，在所述成孔水凝胶中制孔剂与100mM或者50mM氯化钙交联、或者盐水(右侧)。使用2-RGD/聚合链来修饰水凝胶的大块部分。一开始，较多的细胞进入只有盐水的环境中，但是在随后的时间点，在该环境中只含有较少的细胞，而当从成孔水凝胶中释放时，更多细胞最终移入。图3B显示了注射入成孔水凝胶、标准水凝胶或者盐水中的mCherry-间充质干细胞(MSC)相对发光效率(与细胞密度成比例)的定量分析。如果与制孔剂交联的钙密度减少的话，会充分的减少释放的细胞总密度，并轻微的延迟使用动力学(图3C；误差线是SEM，n＝4-6)。通过使用裸鼠头盖骨缺陷模型显示了成孔水凝胶提高人类间充质干细胞调解的骨再生能力(图3D)。在裸鼠(Charles River)的头盖骨上形成准确大小的缺口。在缺口形成之后，立刻向缺口空隙中移入市场上可买到的人类间充质干细胞(Lonza)，所述细胞或者位于盐水(“只有细胞”)中、或者处于标准水凝胶中(2RGD/海藻酸盐聚合物，60千帕)，或者处于成孔水凝胶中。图3D的首行显示了在向头盖骨缺口中植入4周之后，对新形成的头盖骨进行微CT分析。在通过成孔水凝胶递送细胞的缺口中有明显更多的骨形成。在输入12周之后，强力霉素整合入新形成的骨(绿色)中，这显示成孔水凝胶在组织内部产生阳性强力霉素染色，而不是皮下组织的假阳性。
实施例4：两种不同的细胞群体在不同的时间的体外释放
按照实施例1和实施例2的描述形成成孔水凝胶。相等数量(大约106个细胞/毫升成孔水凝胶合成物)的表达绿色荧光蛋白质(GFP)的成肌细胞和结疤内皮细胞(OECs，血管祖细胞)被包裹入材料的不同间隔中。在体外培养5天之后，使用乙锭均二聚物同型二聚体(EtD-1；红色)对释放的细胞和附着在组织培养塑料上的细胞进行染色。如图4所示，被包裹进入散装水凝胶的细胞类型被更快的配置。对结疤内皮细胞(OECs)也使用这种调配方式，结疤内皮细胞(OECs)比绿色荧光蛋白质(GFP)-成肌细胞的迁徙更慢、增殖更少(对添加相等细胞数的底物进行分析可知，图4d)。
具体地说，图4显示了通过利用成孔水凝胶在不同的时间释放不同的群体。图4A-4C显示了在成孔水凝胶中培养4天之后，表达绿色荧光蛋白质(GFP)的成肌细胞和附着在组织培养塑料上的结疤内皮细胞(OECs)上的荧光显微照片，其中，在成孔水凝胶中，用于形成制孔剂的化学品是变化的，并且最初将不同的细胞型放入不同的间隔中。图4A描述了在散装组分中的成肌细胞、在制孔剂组分中的结疤内皮细胞(OECs)，而图4B描述了在小珠组分中的成肌细胞、在制孔剂组分中的结疤内皮细胞(OECs)。图4C描述了在散装组分钟的成肌细胞和结疤内皮细胞(OECs)。在塑料底物上接种相等数量的绿色荧光蛋白质(GFP)-成肌细胞和结疤内皮细胞(OECs)(图4D)。成肌细胞的生长超过结疤内皮细胞(OECs)使用乙锭均二聚物(红色)对细胞进行染色，从而使绿色荧光蛋白质(GFP)-成肌细胞呈现黄色而结疤内皮细胞(OECs)呈现红色。
实施例5：通过具有不同制孔剂配方的成孔水凝胶从皮下组织募集宿主淋巴细胞
按照实施例1和实施例2的描述形成成孔水凝胶。为了形成制孔剂相，将7.5毫克/毫升的高分子量、富含GA的海藻酸盐聚合物与20毫克/毫升海藻酸盐二醛(7.5％理论氧化程度)或者海藻酸盐二醛(其中醛基被还原为醇基)相结合。没有包裹细胞的成孔水凝胶随后被注射到C57/BL6或者Balb/c老鼠的后背上。14天之后，通过组织性观察宿主树突状细胞的募集。
如下所述，利用成孔水凝胶进行趋化因子-调解的细胞募集。首先氧化海藻酸盐，然后使用硼氢化钠还原，在原来糖的位置产生醇基。图5A和图5B显示了通过标准水凝胶、可降解的海藻酸盐水凝胶和成孔海藻酸盐水凝胶募集的树突状细胞(DC)的比较。两个水凝胶组中都含有2微克的粒性白细胞-巨噬细胞集落刺激因子。这充分表明从邻近组织的水凝胶(靠近成像边缘的高细胞面积)中有更多的细胞深入成孔水凝胶。图5C和图5D显示了侵入成孔水凝胶中树突状细胞基线的比较，所述成孔水凝胶中，制孔剂由海藻酸盐二醛(图5C)制成，或者由还原的海藻酸盐二醛(图5D)制成，不含有GM-CSF。在不含有GM-CSF的情况下发生较少的基线细胞渗入。为了进行组织研究，使用CD11c(绿色)和NIHC-II(红色)染色，使用Hoescht核复染色(蓝色)。本图显示了含有氧化海藻酸盐制成的制孔剂和含有还原海藻酸盐制成的制孔剂材料在宿主细胞募集方面的差异。
实施例6：通过改变散装相组合物控制成孔水凝胶内部干细胞的增殖作用
该方法的目的是使用不溶性插入信号控制细胞扩散和释放。因此，确定附着配位体的密度和制孔剂周围非降解水凝胶的机械性能是否会影响细胞。如图6所示，配位体的密度显著地改变DNA合成，而改变弹性模量会在一周内改变DNA合成和细胞释放。不溶性插入信号，例如附着配位体密度，在很长一段时间内都对细胞有影响，例如图6D中所示的组织学。
具体地说，进行研究确定成孔水凝胶散装组分的组成是否会控制细胞增殖和体内移入。图6A和图6B显示了间充质干细胞在24小时内整合3H-胸腺嘧啶(与DNA合成成比例)的分析(D1；红色曲线)，或者在培养7天之后累计的间充质干细胞(MSC)使用和散装水凝胶(弹性模量为60千帕)中RGD肽密度之间的函数曲线(蓝色曲线)，或者含有10RGD肽/海藻酸盐聚合物的散装水凝胶的弹性模量(数据是平均数+/-SEM，n＝3-5)。RGD密度对细胞增殖有显著地影响，而弹性模量对增殖和释放都有影响(p＜0.05，统计学方差分析)。图6C显示了DNA合成分析(作为小孔形成的函数)。图6D显示了培养50天后，低温切割成孔水凝胶，对其中的D1细胞进行Ki-67(增殖标记物，绿色)进行染色所得到的照片。
通过散装水凝胶的组成控制调配的干细胞历程
按照实施例1的方法制备成孔水凝胶。通过变换散装水凝胶的组成(整合蛋白-结合的RGD肽的密度和弹性模数)，可以控制间充质干细胞(MSC)的增殖和体外释放。在体内，通过增加每个海藻酸盐聚合体链中RGD肽的密度，即从2个增加到10个，可以增加被调配如皮下空间的mCherry-标记的老鼠MSC的总密度(图6E)。将人MSC调配如裸鼠头盖骨缺口中来进行治疗性研究。4星期后，对老鼠进行安乐死，通过苏木精/伊红染液评价治疗程度(根据新骨形成)。简单的说，缺口内新形成的骨面积除以缺口总面积，得到“治愈百分比”指标。使用这种定量指标可以发现，在导致新骨形成方面，通过成孔水凝胶传递的间充质干细胞实际上比通过标准水凝胶或者盐水传递的多(图6F)。此外，散装水凝胶成分的弹性模量在第4周对新骨形成产生实质上的影响，与从硬度为8千帕的10RGD/海藻酸盐聚合物散装相的成孔水凝胶中的调配相比，当从硬度为60千帕，含有10RGD/海藻酸盐聚合物散装相的成孔水凝胶中被调配时，明显产生更多的新骨形成(p＜0.05，2端t-测验)。
因此，当mCherry-标记的D1细胞通过成孔水凝胶被调配进入裸鼠的皮下组织时，将散装成分中的RGD密度从2个增加到10个/海藻酸盐聚合物能够实质上增加被移植的细胞总数，并不显著影响细胞调配动力学。
这个实施例还显示了散装水凝胶的弹性对细胞调节的组织再生的影响，但是，如在这里所描述的，散装水凝胶相的许多其他方面(例如，基质结合的生长因子或其肽类似物的呈递)被设计从而影响细胞调解的组织再生。
实施例7，由二元海藻酸盐形成的水凝胶的机械性能和体外降解
图7A和7B显示了通过将氧化海藻酸盐(理论氧化程度为5％)和未修饰的高分子量海藻酸盐相交联的二元结合物形成的散装水凝胶的弹性模量和降解作用，其中未修饰的高分子量海藻酸盐的常数密度是20毫克/毫升。通过比较4天之后的体外干重和原始干重来评定降解作用。由20毫克/毫升氧化的海藻酸盐和7.5毫克/毫升未修饰的海藻酸盐形成的制孔剂的直径被显示在图7C。通过处理从氨基荧光素标记的海藻酸盐制备的制孔剂的荧光显微照片，来确定制孔剂的直径。
其他实施方式
虽然本发明已经结合其具体描述进行了说明，但是之前的描述只用于解释，而不是用于限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求书来定义。其他方面、优势和修改也处于权利要求书要求保护的范围内。
这里引用的专利和科技文献构成了本领域普通技术人员能够获得的知识。这里引用的所有的美国专利以及公布的或者未被公布的美国专利申请通过引证在此全部并入本文。这里引用的所有的国外专利以及国外专利申请通过引证在此全部并入本文。这里引用的Genbank和NCBI的登记号码通过引证在此全部并入本文。其他发表的参考文献、文件、稿件和科学文献通过引证在此全部并入本文。
尽管本发明已经通过结合优选的实施方案进行了具体的显示和描述，但是本领域普通技术人员可以理解，在形式和细节方面可以进行多种变化，只要不脱离本发明权利要求书所定义的本发明要求保护的范围即可。

Claims (38)

1.一种组合物，这种组合物包括一种第一生物可降解的水凝胶和一种第二生物可降解的水凝胶，其中，所述的组合物最初不是大孔的但是在进驻受体体内之后会变成大孔的，其中，所述第一生物可降解的水凝胶比第二生物可降解的水凝胶水解降解快至少10％从而在其存在的位置上留下大孔，并且其中，所述第一生物可降解的水凝胶包括氧化的海藻酸盐。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一生物可降解的水凝胶或者第二生物可降解的水凝胶或者上述两种水凝胶包括一种分离的细胞，一种生物活性因子和/或一种肿瘤抗原。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中，所述第一生物可降解的水凝胶或者所述第二生物可降解的水凝胶或者上述两种水凝胶包括一种树突状细胞或者一种趋化因子。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的第一生物可降解的水凝胶、第二生物可降解的水凝胶或两种水凝胶将细胞募集进入第一生物可降解的水凝胶、第二生物可降解的水凝胶或两种水凝胶中。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述第二生物可降解的水凝胶在所述第一生物可降解的水凝胶周围交联，或者，其中第一生物可降解的水凝胶物理上被包裹在第二生物可降解的水凝胶中。
6.根据权利要求1所述的组合物，进一步包括生物活性因子，选自血管内皮生长因子(VEGFA)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胎盘生长因子(PIGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)、瘦素、造血生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)受体-1(VEGFR-1)、血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)、骨形态发生蛋白质(BMP)族的成员、粒性白细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、FMS-样酪氨酸激酶3(Flt3)配位体、肝细胞生长因子、基质衍生因子(SDF-1)、胰岛素-样生长因子(IGF)、抗-血管内皮生长因子(VEGF)-抗体、抗-酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)抗体、抗-碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)抗体、抗-胎盘生长因子(PIGF)抗体、抗瘦素抗体、抗-高血糖因子抗体、抗-血管内皮生长因子受体(VEGFR)-1抗体、抗-血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)抗体、抗-血小板衍生生长因子(PDGF)抗体、抗-骨形态发生蛋白质(BMP)抗体、抗-FMS-样酪氨酸激酶3(Flt3)配位体、抗胰岛素-样生长因子(IGF)抗体。
7.根据权利要求2所述的组合物，其中，所述分离的细胞是间充质干细胞、成肌细胞、血管祖细胞、诱导性多功能细胞或从成纤维细胞直接改编成分化状态的细胞。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述的间充质干细胞包括骨髓基质干细胞。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述第一生物可降解的水凝胶以制孔剂形式降解形成所述的大孔。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述第一生物可降解的水凝胶的弹性模量在20千帕到60千帕之间。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述第二生物可降解的水凝胶包括一种肽，这种肽具有PHSRN，DGEA或者RGD的氨基酸序列。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述第二生物可降解的水凝胶包括海藻酸盐聚合物链，其中所述的海藻酸盐聚合物链具有RGD且其密度是每海藻酸盐聚合物链具有2个到10个RGD。
13.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述第二生物可降解的水凝胶的初始弹性模量是40kPa。
14.权利要求1的组合物在在制备将细胞从脚手架中调配到哺乳动物主体组织中去的药物的应用，其中所述组合物在给药的时候不含有大孔，并且其中所述组合物在居住于主体中后包括大孔。
15.权利要求1的组合物在制备向主体给药从而在体内将细胞募集进入脚手架中的药物的应用，其中，所述组合物在给药的时候不含有大孔，并且，其中在居住于主体中后，所述组合物包括大孔。
16.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述第一生物可降解的水凝胶或者第二生物可降解的水凝胶包括一种生物活性因子，用于加速骨或软骨修复、再生或者形成。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中，所述生物活性因子包括BMP-2，BMP-4或者RunX。
18.根据权利要求16所述的组合物，其中，所述第一生物可降解的水凝胶或者第二生物可降解的水凝胶包括分离的骨细胞，所述分离的骨细胞选自由成骨细胞、破骨细胞和骨先质细胞所组成的组中。
19.根据权利要求16所述的组合物，其中，所述第一生物可降解的水凝胶或者第二生物可降解的水凝胶包括一种分离的软骨细胞，其中，所述分离的软骨细胞包括成软骨细胞。
20.根据权利要求18所述的组合物，其中，所述分离的骨细胞是自体细胞或者异源细胞。
21.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述第一生物可降解的水凝胶或者第二生物可降解的水凝胶包括一种生物活性因子，用于肌肉修复、再生或者形成。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中，所述生物活性因子包括MyoD。
23.根据权利要求21所述的组合物，其中，所述第一生物可降解的水凝胶或者第二生物可降解的水凝胶包括一种分离的肌细胞，所述分离的肌细胞选自由骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和肌祖细胞所组成的组中。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中，所述分离的肌细胞是一种自体细胞或者异源细胞。
25.权利要求1所述的组合物，其中，所述第一生物可降解的水凝胶或者第二生物可降解的水凝胶包括一种生物活性因子，用于皮肤修复、再生或者生成。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中，所述生物活性因子是成纤维细胞生长因子(FGF)。
27.根据权利要求25所述的组合物，其中，所述第一生物可降解的水凝胶或者第二生物可降解的水凝胶包括一种分离的皮肤细胞，所述分离的皮肤细胞选自由骨成纤维细胞、真皮细胞、表皮细胞或者皮肤祖细胞所组成的组中。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中，所述分离的皮肤细胞是一种自体细胞或者异源细胞。
29.根据权利要求8所述的组合物，其中，所述制孔剂密度是总组合物体积的至少5％。
30.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述第一生物可降解的水凝胶或者第二生物可降解的水凝胶包括交联聚合物。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中，所述交联聚合物包括选自由Ca+2、Mg+2和Ba+2构成的二价阳离子。
32.根据权利要求1所述的组合物，其中，至少5％的海藻酸盐被氧化。
33.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一生物可降解的水凝胶包括比第二生物可降解的水凝胶短的聚合物。
34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述第一生物可降解的水凝胶包括具有5,000到500,000Da分子量的氧化的海藻酸盐聚合物。
35.根据权利要求33所述的组合物，其中所述第二生物可降解的水凝胶包括具有5,000到500,000Da分子量的氧化的海藻酸盐聚合物。
36.根据权利要求33所述的组合物，其中所述第一生物可降解的水凝胶包括具有50千道尔顿(kDa)分子量的聚合物。
37.根据权利要求33所述的组合物，其中所述第二生物可降解的水凝胶包括具有250千道尔顿(kDa)分子量的聚合物。
38.根据权利要求14所述的应用，其中树突状细胞被募集到所述大孔内，并且设计使得活化的抗原呈递树突状细胞发生抗肿瘤反应。
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