JP6567485B2

JP6567485B2 - 材料に基づく細胞治療のための注射可能孔形成性ハイドロゲル

Info

Publication number: JP6567485B2
Application number: JP2016203350A
Authority: JP
Inventors: ナタニエルディー．ヒュービッシュ; クリストファーエム．マデル; カンウォンリー; マリアエム．シュー; デービッドジェイ．ムーニー
Original assignee: プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ
Priority date: 2010-10-06
Filing date: 2016-10-17
Publication date: 2019-08-28
Anticipated expiration: 2031-10-06
Also published as: CN107648668B; LT2624873T; EP2624873B1; CN107648668A; AU2011311904A1; DK2624873T3; SI2624873T1; JP2019141695A; KR20130130714A; KR20190009834A; JP6104806B2; WO2012048165A9; CA2813751A1; JP2013542777A; EP2624873A4; CN103237565A; PT2624873T; AU2011311904B2; ES2773858T3; CA2813751C

Description

関連出願
本願は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、2010年10月6日に出願された米国仮出願第61/390,594号に基づく、35U.S.C.§119(e)による優先権の恩典を主張する。

連邦政府によって後援された研究に関する記述
本発明は、国立衛生研究所により授与されたNIH R37DE013033および全米科学財団により授与されたMRSEC DMR-0820484の下で、政府の援助を受けて作成された。政府は、本発明における一定の権利を有する。

発明の分野
本発明は、生体適合性ハイドロゲル組成物に関する。

発明の背景
最近の数十年にわたり、生体適合性重合体は、細胞移植のための担体として機能する足場を形成するため、またはデバイスへ宿主細胞集団を動員するため、使用されてきた。

本発明は、多孔性ハイドロゲルを形成するための組成物および方法を提供する。例えば、対象へのハイドロゲル注射の後に、ハイドロゲル内にインサイチューで孔が形成される。周囲ハイドロゲル（バルクハイドロゲル）内の犠牲ポロゲンの分解を介してインサイチューで形成される孔は、細胞の動員または放出を容易にする。例えば、得られる孔は、初期ポロゲンのサイズの5％以内である。

初期には多孔性でないが、哺乳動物対象などのレシピエント動物の体内に滞留するうちにマクロ多孔性になる材料が、本明細書に開示される。これらの組成物は、従来の足場組成物を超えた有意な利点に関連している。本明細書に記載されたハイドロゲルは、初期には、移植された細胞を宿主炎症応答から防御し、次いで、炎症が鎮静した後（例えば、移植の12時間後、1日後、3日後、5日後、7日後、10日後、またはそれ以降、即ち、12時間、1日、3日、5日、7日、10日、またはそれ以上、レシピエントの体内に滞留した後）、移植された細胞を放出するために好適である。本明細書に記載されたハイドロゲルは、外科的充填剤としても機能し、さらに、宿主における炎症を最小化し、次いで、後に細胞を放出するという機能を兼ねる。

従って、本発明は、第1のハイドロゲルと第2のハイドロゲルとを含む組成物を提供し、ここで、第1のハイドロゲルは、第2のハイドロゲルより少なくとも10％速く（例えば、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、または少なくとも50％速く）分解し、第1のハイドロゲルまたは第2のハイドロゲルのいずれか（または両方）は、単離された細胞を含む。好ましくは、第1のハイドロゲルは、その場所に孔を残して分解するポロゲンを含む。例えば、第1のハイドロゲルはポロゲンであり、インサイチューでの分解の後に得られる孔は、初期ポロゲンのサイズの25％以内、例えば、初期ポロゲンのサイズの20％以内、15％以内、または10％以内である。好ましくは、得られる孔は、初期ポロゲンのサイズの5％以内である。第1のハイドロゲルは、より水溶性である（より低い溶解指数（solubility index）を含む）ため、第2のハイドロゲルより急速に分解する。あるいは、第1のハイドロゲルは、参照により本明細書に組み入れられる、ZillaのUSSN 10/980,989に記載されたような、プロテアーゼにより媒介される分解モチーフと架橋されているため、より急速に分解する。

第1のハイドロゲル組成物（ポロゲン）を形成するために使用される重合体の分子量は、およそ50キロダルトン（kDa）であり、第2のハイドロゲル組成物（バルク）を形成するために使用される重合体の分子量は、およそ250kDaを含む。より短い重合体（例えば、ポロゲンのもの）は、より長い重合体（例えば、バルク組成物のもの）と比較して、より急速に分解する。あるいは、組成物は、糖基（例えば、アルギン酸組成物のおよそ3〜10％の糖）の存在のため、より加水分解的に分解性となるよう修飾される。もう一つの例において、ポロゲンハイドロゲルは、バルクハイドロゲルと比較して、より酵素的に分解性である。複合（第1のハイドロゲルおよび第2のハイドロゲル）組成物は、例えば、酵素が、ポロゲンハイドロゲルを分解するために組成物に到達するよう、体液透過性である。いくつかの場合において、第2のハイドロゲルは、第1のハイドロゲルの周りに架橋されており、即ち、ポロゲン（第1のハイドロゲル）は、バルク（第2の）ハイドロゲルの中に完全に物理的に捕捉されている。

細胞または生理活性因子（例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、血管内皮増殖因子（VEGF）などの増殖因子、凝縮オリゴヌクレオチド、例えば、CpG、またはプラスミドDNA）が、ポロゲン相、バルクハイドロゲル相のいずれか、または両方の相へ任意で封入される。ポロゲンは、使用者によりあらかじめ定められた時間の経過とともにインサイチューで分解する。ポロゲンの分解により、細胞が、材料から放出されるか、または材料へ遊走してもよい。しかしながら、孔形成性ハイドロゲルは、初期には孔を欠くため、形成直後に機械的な支持を提供するのに有用である。適切な生理活性因子には、血管内皮増殖因子（例えば、VEGFA；GenBankアクセッション番号：（aa）AAA35789.1（GI：181971）、（na）NM_001171630.1（GI：284172472）、参照により本明細書に組み入れられる）、酸性繊維芽細胞増殖因子（aFGF、Genbankアクセッション番号：（aa）AAB29057.2（GI：13236891）、（na）NM_000800.3（GI：222144219）、参照により本明細書に組み入れられる）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF；GenBankアクセッション番号：（aa）AAB21432.2（GI：8250666）、（na）A32848.1（GI：23957592）、参照により本明細書に組み入れられる）、胎盤増殖因子（PIGFまたはPLGF；GenBankアクセッション番号：（aa）AAH07789.1（GI：14043631）、（na）NM_002632.4（GI：56676307）、参照により本明細書に組み入れられる）、レプチン（Genbankアクセッション番号：（aa）CBI71013.1（GI：285310289）、（na）NM_000230.2（GI：169790920）、参照により本明細書に組み入れられる）、造血増殖因子（例えば、HGF、Genbankアクセッション番号：（aa）AAA64297.1（GI：337938）、（na）NM_000601.4（GI：58533168）、参照により本明細書に組み入れられる）、VEGF受容体1（VEGFR-1、Genbankアクセッション番号：（aa）NP_002010.2（GI：156104876）、参照により本明細書に組み入れられる）、VEGFR-2（Genbankアクセッション番号：（aa）AAC16450.1（GI：3132833）、（na）EU826563.1（GI：194318421）、参照により本明細書に組み入れられる）、トランスフォーミング増殖因子β（TGF-β、Genbankアクセッション番号：（aa）AAA36738.1（GI：339564）、（na）NM_000660.4（GI：260655621）、参照により本明細書に組み入れられる）、骨形成タンパク質（例えば、BMP-4、Genbankアクセッション番号（aa）：NP_570912.2（GI；157276597）、（na）NM_001202.3（GI：157276592）、参照により本明細書に組み入れられる）、インスリン様増殖因子（IGF-1、Genbankアクセッション番号：（aa）CAA01954.1（GI：1247519）、（na）NM_001111283.1（GI：163659898）、参照により本明細書に組み入れられる）、繊維芽細胞増殖因子2（FGF-2）、血小板由来増殖因子（PDGF；GenBankアクセッション番号：（aa）AAA60552.1（GI：338209）、（na）NM_033023.4（GI：197333759）、参照により本明細書に組み入れられる）、上皮増殖因子（EGF、Genbankアクセッション番号：（aa）AAH93731.1（GI：62740195）、参照により本明細書に組み入れられる）、トランスフォーミング増殖因子α（TGF-α、Genbankアクセッション番号：（na）NM_003236.2（GI：153791671）、参照により本明細書に組み入れられる）、神経増殖因子（NGF、Genbankアクセッション番号：（aa）AAH32517.2（GI：34192369）、（na）NM_002506.2（GI：70995318）、参照により本明細書に組み入れられる）、脳由来神経栄養因子（BDNF、Genbankアクセッション番号：（aa）CAA62632.1（GI：987872）、（na）NM_170731.4（GI：219842281）、参照により本明細書に組み入れられる）、ニューロトロフィン-3（NT-3、Genbankアクセッション番号：（aa）NP_001096124.1（GI：156630995）、（na）NM_001102654.1（GI：156630994）、参照により本明細書に組み入れられる）、毛様体神経栄養因子（CNTF、Genbankアクセッション番号：（aa）AAB31818.1（GI：633830）、（na）NM_000614.3（GI：209574322）、参照により本明細書に組み入れられる）、およびグリア細胞由来神経栄養因子（GDNF、Genbankアクセッション番号：（aa）CAG46721.1（GI：49456801）、（na）NM_000514.3（GI：299473777）、参照により本明細書に組み入れられる）が含まれる。その他の適切な因子には、抗VEGF抗体、抗aFGF抗体、抗bFGF抗体、抗PIGF抗体、抗レプチン抗体、抗HGF抗体、抗VEGFR-1抗体、抗VEGFR-2抗体、バチマスタット（BB-94）、マリマスタット（BB-2516）、サリドマイド、O-(クロロアセチルカルバモイル)-フマギロール（TNP-470）、カルボキシアミドトリアゾール（CAI）、ミトキサントロン、ドキソルビシン、SU5416、抗TGF-β抗体、抗BMP抗体、抗IGF-1抗体、抗FGF-2抗体、抗PDGF抗体、抗EGF抗体、抗TGF-α抗体、および抗VEGF抗体が含まれる。ポロゲン相、バルクハイドロゲル相のいずれか、または両方の相への封入に適したその他の生理活性因子には、FMS様チロシンキナーゼ3リガンド（Flt3リガンド；Genbankアクセッション番号：（aa）AAI44040（GI：219519004）、（na）NM_004119（GI：121114303）、参照により本明細書に組み入れられる）、抗flt3リガンド、肝細胞増殖因子（Genbankアクセッション番号：（aa）AAB20169（GI：237997）、参照により本明細書に組み入れられる）、およびストロマ由来因子1（SDF-1）が含まれる。

あるいは、アデノウイルスが、ポロゲン相、バルクハイドロゲル相のいずれか、または両方の相へ任意で封入される。例えば、アデノウイルスは、骨芽細胞分化に関連した重要な転写因子であるrunt関連転写因子（例えば、Runx2；Genbankアクセッション番号：（aa）CAI13532（GI：55959066）、（na）NM_001024630（GI：226442782）、参照により本明細書に組み入れられる）をコードする。もう一つの局面において、アデノウイルスは、筋肉分化の調節における重要な役割を有するタンパク質であるMyoD（Genbankアクセッション番号：（aa）CAA40000（GI：34862）、（na）NM_002478（GI：77695919）、参照により本明細書に組み入れられる）をコードする。あるいは、アデノウイルスは、骨形成タンパク質、例えば、BMP-2（Genbankアクセッション番号：（aa）AF040249_1（GI：6649952）、（na）NM_001200（GI：80861484）、参照により本明細書に組み入れられる）またはBMP-4（Genbankアクセッション番号：（aa）NP_570912.2（GI：157276597）、（na）NM_001202.3（GI：157276592）、参照により本明細書に組み入れられる）をコードする。BMP-2は、とりわけ、骨修復に関与しており、BMP-4は、心組織の修復に関与している。一つの局面において、Runxをコードするアデノウイルス、およびBMP-2をコードするアデノウイルスが、ハイドロゲルへ封入される。

ポロゲン相、バルクハイドロゲル相のいずれか、または両方の相への封入に適した細胞には、間葉系幹細胞、筋芽細胞、血管前駆細胞（例えば、成長（outgrowth）内皮細胞）、胚性幹細胞もしくは誘導多能性幹細胞に由来する分化細胞、誘導多能性細胞、または繊維芽細胞から分化状態へ直接再プログラムされた細胞が含まれる。

いくつかの例において、ポロゲン組成物が細胞を含み、他の例において、バルク組成物が細胞を含む。細胞が、組成物中に存在する（例えば、製作中に播種された）場合、細胞は、哺乳動物対象への投与の後に組成物から配備される。あるいは、組成物は、細胞を含まない；しかしながら、哺乳動物対象の組織への投与（例えば、ヒト患者への埋め込み）により、細胞が組成物へ動員される。哺乳動物は、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ならびに家畜または食用に飼育される動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、およびヤギであり得る。好ましい態様において、哺乳動物はヒトである。あるいは、対象は、ツメガエル、サンショウウオ、またはイモリなどの非哺乳類動物であってもよい。

本発明は、第1のハイドロゲルと第2のハイドロゲルとを含む組成物を対象へ投与する工程を含む、足場から哺乳動物対象の組織へ細胞を配備する方法を提供し、ここで、第1のハイドロゲルは、第2のハイドロゲルより少なくとも10％速く分解し、かつ前記組成物は、投与の時点では孔を欠いており、対象への滞留後に孔を含むようになり、かつ第1のハイドロゲルまたは第2のハイドロゲルは、単離された細胞を含む。

インビボで細胞を足場へ動員する方法は、第1のハイドロゲルと第2のハイドロゲルとを含む組成物を対象へ投与することにより実施され、ここで、第1のハイドロゲルは、第2のハイドロゲルより少なくとも10％速く分解し、かつ前記組成物は、投与の時点では孔を欠いており、対象への滞留後に孔を含むようになる。例えば、第2のハイドロゲル組成物と比較した第1のハイドロゲル組成物の、例えば、バルク組成物と比較したポロゲン組成物の相対的な分解性または可溶性のため、孔が作出される。

空隙率は、組成物からの細胞の動員および／または脱出に影響を及ぼす。孔は、ナノ多孔性、ミクロ多孔性、またはマクロ多孔性である。例えば、ナノ孔の直径は約10nm未満である。ミクロ孔は、約100nm〜約20μmの範囲の直径である。マクロ孔は約20μmより大きい（例えば、約100μmより大きい、または約400μmより大きい）。例示的なマクロ孔サイズには、50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、および600μmが含まれる。マクロ孔は、真核細胞が組成物の内外へ移動することを可能にするサイズのものである。一つの例において、マクロ多孔性組成物は、約400μm〜500μmの直径の孔を有する。好ましい孔サイズは適用に依る。例えば、細胞配備および細胞放出のため、好ましい孔径は、50μmより大きい。

ポロゲンのサイズは、複合材料全体のサイズに関係する。例えば、材料の完全性を保つため、ポロゲン直径は、複合物全体の最も小さな寸法の＜10％である。ポロゲンの密度は、複合組成物の全体積の10〜80パーセントである。例えば、ポロゲンの密度は、全体積の15％〜75％、20％〜70％、25％〜65％、30％〜60％、または35％〜55％である。好ましくは、ポロゲンの密度は、ハイドロゲルへの最適な細胞動員またはハイドロゲルからの最適な細胞放出を達成するため、全体積の少なくとも50％である。

ハイドロゲルは、約10〜約1,000,000パスカル（例えば、約10〜約100,000Pa、約10〜約150,000Pa、約10〜約200,000Pa、約10〜約300,000Pa、約10〜約400,000Pa、約10〜約500,000Pa、約10〜約600,000Pa、約10〜約700,000Pa、約10〜約800,000Pa、または約10〜約900,000Pa）の弾性率を有する。好ましくは、緩徐分解性ハイドロゲルは、約20キロPa〜60kPa、例えば、25kPa〜55kPa、30kPa〜50kPa、または35kPa〜45kPaの弾性率を含む。急速分解性ハイドロゲルは、分解前の封入の間の完全性を維持するため、初期には少なくとも40kPaの弾性率を含む。

好ましくは、緩徐分解性ハイドロゲル（即ち、第2のハイドロゲルまたは「バルク」）は、細胞接着タンパク質を模倣するRGDというアミノ酸配列を含む高分子量ペプチドを含む。あるいは、緩徐分解性ハイドロゲルは、PHSRNまたはDGEAなどの別の接着ペプチドアミノ酸モチーフを含む。例えば、緩徐分解性ハイドロゲルは、好ましくは、2〜10 RGDペプチド/重合体（例えば、アルギン酸重合体）により修飾されている。

「ハイドロゲル」とは、親水性である重合体鎖を含む組成物を意味する。例示的なハイドロゲルは、アルギン酸、ポリエチレングリコール（PEG）、PEGアクリレート、アガロース、および合成タンパク質、例えば、コラーゲンまたは改変タンパク質（即ち、自己集合ペプチドに基づくハイドロゲル）などの、細胞封入と適合性の材料から構成される。例えば、市販のハイドロゲルには、BD（商標）PuraMatrix（商標）が含まれる。BD（商標）PuraMatrix（商標）Peptide Hydrogelは、細胞培養のための明確な三次元（3D）微小環境を作出するために使用される合成マトリックスである。

例えば、ハイドロゲルは、完全にまたは部分的に生分解性である生体適合性重合体マトリックスである。ハイドロゲルを形成することができる材料の例には、アルギン酸およびアルギン酸誘導体、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸グリコール酸共重合体（PLGA）、ゼラチン、コラーゲン、アガロース、天然および合成の多糖、ポリペプチド、具体的には、ポリ(リジン)などのポリアミノ酸、ポリヒドロキシブチレートおよびポリεカプロラクトンなどのポリエステル、ポリ無水物；ポリホスファジン、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(アルキレンオキシド)、具体的には、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(アリルアミン)（PAM）、ポリ(アクリレート)、ポリ(4-アミノメチルスチレン)などの修飾スチレン重合体、プルロニックポリオール、ポリオキサマー（polyoxamer）、ポリ(ウロン酸)、ポリ(ビニルピロリドン)、ならびにグラフト共重合体を含む上記のものの共重合体が含まれる。コラーゲン、フィブリン、ヒアルロン酸、アガロース、およびラミニンリッチゲルなどの（これらに限定されない）合成重合体および天然に存在する重合体も使用され得る。

ハイドロゲルのための好ましい材料は、アルギン酸または修飾アルギン酸材料である。アルギン酸分子は、(1-4)結合したβ-D-マンヌロン酸単量体（M単位）およびαL-グルロン酸単量体（G単位）から構成され、それらの割合および重合体鎖上の連続的な分布は変動し得る。アルギン酸多糖は、二価カチオン（例えば、Ca⁺²、Mg⁺²、Ba⁺²）に対する強力な親和性を有し、これらの分子に曝された時に安定したハイドロゲルを形成する高分子電解質系である。

本明細書に記載された組成物は、臨床使用、例えば、骨の修復、再生、または形成；筋肉の修復、再生、または形成；および皮膚の修復、再生、または形成に適している。例えば、組成物は、単独で、もしくは骨の接着剤（セメント）もしくは粘着剤と共に、骨折に適用されるか、または疾患もしくは損傷のある筋肉組織に適用される。（細胞が播種された、または細胞を含まない）ハイドロゲルは、疾患、損傷、または（骨もしくは軟骨の場合）破損の部位に注射される。例えば、ハイドロゲルは、骨に注射される。骨または軟骨の修復、再生、または形成の促進において使用するための例示的な生理活性因子には、BMP-2、BMP-4、またはRunXが含まれる。

いくつかの場合において、組成物は、骨または軟骨の修復、再生、または形成を促進するための細胞を動員する。あるいは、第1のハイドロゲルまたは第2のハイドロゲルは、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、および骨前駆細胞からなる群より選択される単離された骨細胞を含む。あるいは、第1のハイドロゲルまたは第2のハイドロゲルは、単離された軟骨細胞を含み、単離された軟骨細胞には、軟骨芽細胞が含まれる。単離された骨細胞または単離された軟骨細胞は、自己細胞または同種細胞である。

筋肉での適用、例えば、筋断裂、筋挫傷、または筋緊張性損傷のため、（細胞が播種された、または細胞を含まない）ハイドロゲルが、損傷の部位に注射される。筋肉での適用に適した組成物には、第1のハイドロゲルと第2のハイドロゲルとを含む組成物が含まれ、ここで、第1のハイドロゲルは第2のハイドロゲルより少なくとも10％速く分解し、第1のハイドロゲルまたは第2のハイドロゲルは、筋肉の修復、再生、または形成において使用するための生理活性因子を含む。例えば、生理活性因子にはMyoDが含まれる。

いくつかの場合において、組成物は、筋肉または軟骨の修復、再生、または形成を促進するための細胞を動員する。あるいは、第1のハイドロゲルまたは第2のハイドロゲルは、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、および筋前駆細胞からなる群より選択される単離された筋細胞を含む。単離された筋細胞は、自己細胞または同種細胞である。

皮膚での適用、例えば、熱傷、擦過創、裂傷、または疾患のため、（細胞が播種された、または細胞を含まない）ハイドロゲルが、湿布または創部包帯剤として部位に直接適用される。好ましくは、部位（例えば、熱傷）に直接適用された時、バルクハイドロゲル内のポロゲンの過半数（例えば、50％超、60％超、70％超、80％超、または90％超）が、皮膚表面および皮膚組織へ向けられる。この様式において、生理活性因子または細胞は、皮膚の表面または皮膚の下層へ放出され、皮膚または標的組織から離れて遊走しない。皮膚の修復、再生、または形成において使用するための例示的な生理活性因子は、FGFである。

いくつかの場合において、組成物は、皮膚または軟骨の修復、再生、または形成を促進するための細胞を動員する。あるいは、第1のハイドロゲルまたは第2のハイドロゲルは、繊維芽細胞、皮膚細胞、上皮細胞、または皮膚前駆細胞からなる群より選択される単離された皮膚細胞を含む。単離された皮膚細胞は、自己細胞または同種細胞である。

ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはその他の薬剤などの生理活性因子は、精製されかつ／または単離されている。具体的には、本明細書において使用されるように、「単離された」または「精製された」核酸分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、組換え技術により作製された時には、他の細胞材料または培養培地を実質的に含まず、化学合成された時には、化学前駆物質またはその他の化学物質を実質的に含まない。精製された化合物は、重量（乾燥重量）で少なくとも60％、関心対象の化合物である。好ましくは、調製物は、重量で少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも99％、関心対象の化合物である。例えば、精製された化合物は、重量で少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、98％、99％、または100％（w/w）、所望の化合物であるものである。純度は、任意の適切な標準的な方法により、例えば、カラムクロマトグラフィ分析、薄層クロマトグラフィ分析、または高速液体クロマトグラフィ（HPLC）分析により測定される。精製されたまたは単離されたポリヌクレオチド（リボ核酸（RNA）またはデオキシリボ核酸（DNA））は、天然に存在する状態においてそれに隣接している遺伝子または配列を含まない。精製された、とはまた、ヒト対象への投与にとって安全である無菌性の程度、例えば、感染性病原体または毒性薬剤の欠如を定義する。

同様に、「実質的に純粋な」とは、それに天然に付随している成分から分離されたヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。典型的には、ヌクレオチドおよびポリペプチドは、重量で少なくとも60％、70％、80％、90％、95％、またはさらには99％、それらが天然に関連しているタンパク質および天然に存在する有機分子を含まない時、実質的に純粋である。

「単離された核酸」とは、天然に存在する核酸、または3種を超える別々の遺伝子にわたる天然に存在するゲノム核酸の断片と、構造が同一でない核酸である。この用語には、例えば、以下のものが内含される：（a）天然に存在するゲノムDNA分子の一部であるが、それが天然に存在する生物のゲノムにおいて、その分子の一部に隣接している核酸配列の両方が隣接していないDNA；（b）得られた分子が、天然に存在するベクターまたはゲノムDNAと同一ではないような様式で、ベクターまたは原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれた核酸；（c）cDNA、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により作製された断片、または制限断片などの単独の分子；および（d）ハイブリッド遺伝子の一部である組換えヌクレオチド配列、即ち、融合タンパク質をコードする遺伝子。本発明に係る単離された核酸分子には、合成により作製された分子、および化学的に改変されておりかつ/または修飾された骨格を有する核酸がさらに含まれる。

低分子とは、分子量が2000ダルトン未満である化合物である。低分子の分子量は、好ましくは1000ダルトン未満、より好ましくは600ダルトン未満であり、例えば、化合物は、500ダルトン未満、400ダルトン未満、300ダルトン未満、200ダルトン未満、または100ダルトン未満である。

「を含む（including）」、「を含有している（containing）」、または「を特徴とする」と同義である「を含む（comprising）」という移行用語は、非排他的すなわち非限定的であり、付加的な列挙されていない要素または方法の工程を排除しない。対照的に、「からなる」という移行句は、特許請求の範囲に明記されていない要素、工程、または成分を排除する。「から本質的になる」という移行句は、特許請求の範囲の範囲を、指定された材料または工程、および特許請求の範囲に記載された本発明の「基本的な新規の特徴に物質的に影響しないもの」へと制限する。

[本発明1001]
第1のハイドロゲルと第2のハイドロゲルとを含む組成物であって、第1のハイドロゲルが第2のハイドロゲルより少なくとも10％速く分解し、かつ第1のハイドロゲルまたは第2のハイドロゲルが、単離された細胞を含む、組成物。
[本発明1002]
第2のハイドロゲルが第1のハイドロゲルの周りに架橋されているか、または第1のハイドロゲルが第2のハイドロゲルの中に物理的に捕捉されている、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
血管内皮増殖因子（VEGF）、酸性繊維芽細胞増殖因子（aFGF）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）、胎盤増殖因子（PIGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、レプチン、造血増殖因子（HGF）、VEGF受容体-1（VEGFR-1）、VEGFR-2、骨形成タンパク質（BMP）ファミリーのメンバー、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、FMS様チロシンキナーゼ3リガンド（Flt3リガンド）、肝細胞増殖因子、ストロマ由来因子1（SDF-1）、インスリン様増殖因子（IGF）、抗VEGF抗体、抗aFGF抗体、抗bFGF抗体、抗PIGF抗体、抗レプチン抗体、抗HGF抗体、抗VEGFR-1抗体、抗VEGFR-2抗体、抗PDGF抗体、抗BMP抗体、抗Flt3リガンド、抗IGF抗体からなる群より選択される生理活性因子をさらに含む、本発明1001の組成物。
[本発明1004]
前記細胞が、間葉系幹細胞、筋芽細胞、血管前駆細胞、胚性幹細胞もしくは誘導多能性幹細胞に由来する分化細胞、誘導多能性細胞、または繊維芽細胞から分化状態へ直接再プログラムされた細胞である、本発明1001の組成物。
[本発明1005]
第1のハイドロゲルがポロゲンを含む、本発明1001の組成物。
[本発明1006]
第1のハイドロゲルが20kPa〜60kPaの弾性率を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1007]
第2のハイドロゲルが、PHSRN、DGEA、またはRGDであるアミノ酸配列を含むペプチドを含む、本発明1001の組成物。
[本発明1008]
第2のハイドロゲルが、アルギン酸重合体鎖1本当たり2〜10ペプチドの密度のRGDペプチドを含む、本発明1001の組成物。
[本発明1009]
第2のハイドロゲルが少なくとも40kPaの初期弾性率を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1010]
第1のハイドロゲルと第2のハイドロゲルとを含む組成物を対象へ投与する工程を含む、足場から哺乳動物対象の組織へ細胞を配備する方法であって、第1のハイドロゲルが第2のハイドロゲルより少なくとも10％速く分解し、かつ該組成物が、投与の時点では孔を欠いており、対象への滞留後に孔を含むようになり、かつ第1のハイドロゲルまたは第2のハイドロゲルが、単離された細胞を含む、方法。
[本発明1011]
第1のハイドロゲルと第2のハイドロゲルとを含む組成物を対象へ投与する工程を含む、インビボで足場へ細胞を動員する方法であって、第1のハイドロゲルが第2のハイドロゲルより少なくとも10％速く分解し、かつ該組成物が、投与の時点では孔を欠いており、対象への滞留後に孔を含むようになる、方法。
[本発明1012]
第1のハイドロゲルと第2のハイドロゲルとを含む組成物であって、第1のハイドロゲルが第2のハイドロゲルより少なくとも10％速く分解し、かつ第1のハイドロゲルまたは第2のハイドロゲルが、骨または軟骨の修復、再生、または形成の促進において使用するための生理活性因子を含む、組成物。
[本発明1013]
生理活性因子が、BMP-2、BMP-4、またはRunXを含む、本発明1012の組成物。
[本発明1014]
第1のハイドロゲルまたは第2のハイドロゲルが、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、および骨前駆細胞からなる群より選択される単離された骨細胞を含む、本発明1012の組成物。
[本発明1015]
第1のハイドロゲルまたは第2のハイドロゲルが、単離された軟骨細胞を含み、単離された軟骨細胞が、軟骨芽細胞を含む、本発明1012の組成物。
[本発明1016]
単離された骨細胞が、自己または同種の細胞である、本発明1014の組成物。
[本発明1017]
第1のハイドロゲルと第2のハイドロゲルとを含む組成物であって、第1のハイドロゲルが第2のハイドロゲルより少なくとも10％速く分解し、かつ第1のハイドロゲルまたは第2のハイドロゲルが、筋肉の修復、再生、または形成において使用するための生理活性因子を含む、組成物。
[本発明1018]
生理活性因子がMyoDを含む、本発明1017の組成物。
[本発明1019]
第1のハイドロゲルまたは第2のハイドロゲルが、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、および筋前駆細胞からなる群より選択される単離された筋細胞を含む、本発明1017の組成物。
[本発明1020]
単離された筋細胞が、自己または同種の細胞である、本発明1019の組成物。
[本発明1021]
第1のハイドロゲルと第2のハイドロゲルとを含む組成物であって、第1のハイドロゲルが第2のハイドロゲルより少なくとも10％速く分解し、かつ第1のハイドロゲルまたは第2のハイドロゲルが、皮膚の修復、再生、または形成において使用するための生理活性因子を含む、組成物。
[本発明1022]
生理活性因子がFGFを含む、本発明1021の組成物。
[本発明1023]
第1のハイドロゲルまたは第2のハイドロゲルが、繊維芽細胞、皮膚細胞、上皮細胞、または皮膚前駆細胞からなる群より選択される単離された皮膚細胞を含む、本発明1021の組成物。
[本発明1024]
単離された皮膚細胞が、自己細胞または同種細胞である、本発明1023の組成物。
[本発明1025]
ポロゲンの密度が、前記組成物の全体積の少なくとも50％である、本発明1005の組成物。
本発明のその他の特色および利点は、以下の好ましい態様の説明、および特許請求の範囲より明らかになるであろう。他に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、全て、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書に記載されたものに類似しているかまたは等価である方法および材料が、本発明の実施または試行において使用され得るが、適切な方法および材料が以下に記載される。本明細書に引用された公開された外国特許および特許出願は、全て、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書に引用されたアクセッション番号により示されるGenbankおよびNCBIの寄託は、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書に引用されたその他の公開された参照、文書、原稿、および科学文献は、全て、参照により本明細書に組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先されるであろう。さらに、材料、方法、および例は、例示的なものに過ぎず、限定的なものではない。

図１は、画像化および機械的特性試験を介して証明されるような、ハイドロゲル内のインサイチューの孔の形成を示す、一連の模式図、写真、棒グラフ、および折れ線グラフである。スケールバー：（B、C、およびE）：1mm。図1Aは、ハイドロゲルの形成を例示する模式図である。左：急速分解性ハイドロゲルから構成されたミクロビーズ（赤色の球）および間葉系幹細胞（MSC；緑色）。中央：ミクロビーズおよびMSCが、第2のハイドロゲル形成性重合体材料（「バルクゲル」；灰色）と混合され、それがビーズの周りに架橋される。右：インサイチューでのミクロビーズの分解の後、完全なハイドロゲルネットワークが残り、孔のネットワークを通してMSCが放出される。図1Bは、製作直後のフルオレセイン（緑色）標識ポロゲンの蛍光顕微鏡写真である。図1Cは、アルギン酸ハイドロゲルネットワークへの封入の後のフルオレセイン（緑色）標識ポロゲンの蛍光顕微鏡写真である。図1Dは、標準ハイドロゲル（青色バー）または孔形成性ハイドロゲル（赤色バー）の弾性率測定を例示する棒グラフである。0日目には、孔が形成されていないため、孔形成性複合物および標準ハイドロゲルの全体硬度に統計的有意差は存在しない；しかしながら、4日後、複合物の率は、孔形成のため、実質的に下落する。図1Eは、ほぼ完全なネットワークを示す形成直後（0日目）、製作の5日後、または製作の10日後（その時点では有意な孔形成が観察された）の、孔形成性ハイドロゲルを示す一連の走査型電子顕微鏡写真である。図1Fおよび図1Gは、複合材料（50％ポロゲン体積分率）の弾性率が、標準ハイドロゲル（ポロゲンなし）の弾性率と実質的に異ならないが、空隙が形成されるにつれ、複合物の率が実質的に下落することを確証している。1週間目の複合物の弾性率の減少は、空隙の密度に対応し、低いポロゲン密度では、空隙の密度と、複合物の弾性率の減少との間に直線的な関係が存在する。図1Fの説明に示すとおりである。図1Hおよび図1Iは、複合材料（25％ポロゲン体積分率）の破壊靱性が、ポロゲンを含まない標準ハイドロゲルの破壊靱性と初期には類似しているが、短時間で初期値の数分の一にまで減少することを例示している。弾性率と同様に、破壊靱性の減少は、非直線的ではあるが、ポロゲンの密度と相関する。図1Hの説明に示すとおりである。図２は、インビトロの間葉系幹細胞配備を例示する、一連の写真、折れ線グラフ、および模式図である。具体的には、図2は、インビトロの孔形成性ハイドロゲルからの幹細胞放出を証明し、ポロゲンの組成の変動、および細胞をポロゲンへ区画化するかバルクへ区画化するかによって、放出を調整し得ることも示している。スケールバー：（A）：100μm。図2Aは、キャピラリーアッセイにより査定された、相互接続された空隙の形成の動力学を示す折れ線グラフである（エラーバーは平均値の標準誤差、n＝3〜4である）。（浸透極限；80％を超える）極めて高い分率のポロゲンが存在しない限り、最初の7日間で、相互接続された空隙が形成された。浸透ポロゲン密度未満では、実質的な相互接続された空隙の形成は観察されなかった。図2Bは、孔形成性ハイドロゲルの全体に分布させたカルセイン-AM染色細胞の三次元再構築を示す、一連の模式図および写真である。孔形成性ハイドロゲルにおいては、細胞形態の実質的な変化が、遊走し増殖する細胞の能力を示しているが、標準ハイドロゲルにおいては、細胞は低密度で、円形のままであった。Ki-67免疫蛍光（緑色）は、孔形成性ハイドロゲルにおいて、標準ハイドロゲルと比較して、増加した増殖を示し、核対比染色（ヘキスト、青色）は、より高い細胞充実性を示す。図2Cは、孔形成性ハイドロゲルにおける細胞充実性および細胞形態に対する空隙形成の効果を示す一式の蛍光顕微鏡写真である。具体的には、孔形成性ハイドロゲルの蛍光顕微鏡写真は、インビトロで、4〜10日後、生存している間葉系幹細胞（MSC）（カルセイン-AM、緑色）または死細胞（エチジウムホモダイマー、赤色）について染色したものである。球状の細胞形態は、ナノ多孔性材料に限局している細胞を示し、短い時間枠では、両方の材料に存在するが、より長い時間枠では、標準ハイドロゲルにのみ存在する。図2Dは、ポロゲン体積密度の関数としての、12日後に放出されたMSCの累積数を示す折れ線グラフである。図2Eは、孔形成性足場のバルク相、ポロゲン相、または標準ハイドロゲルのいずれかへ封入されたMSCについての配備の動力学を例示する折れ線グラフおよび模式図である。ポロゲンは、7.5％酸化型アルギン酸により調製され、100mM CaCl₂で架橋された。図2Fは、ポロゲンへ封入されたD1細胞について、ポロゲン製作条件の関数としての、孔形成性ハイドロゲルのポロゲン相からのMSC配備の動力学を示す折れ線グラフである。図2Gは、³H-チミジン取り込みの定量分析が、RGD依存的に増強された細胞増殖を示すことを示す棒グラフである。図2Hは、細胞放出に対するアルギン酸酸化度の効果を示す一連の折れ線グラフである。ポロゲンを架橋するためのカルシウムのレベルが一定（100mM）の時、酸化度が3％から7.5％へ増加すると、放出される細胞の総数が実質的に増加し、酸化度が低下すると、細胞放出がわずかに遅延した。ポロゲン酸化度が一定（7.5％）の時、ポロゲンを架橋するために使用されるカルシウムの濃度が25mMから100mMへ増加すると、放出される細胞の総数が低下し、細胞放出の開始がわずかに遅延した。図３は、インビボの間葉系幹細胞の配備、生着、および増殖の制御の結果を示す、一連の写真および折れ線グラフである。具体的には、図3は、ヌードマウスの皮下空間におけるインビボの孔形成性ハイドロゲルからの幹細胞放出を証明する。図3Aは、2×10⁶個のmCherry発現MSCが配備されたヌードマウスの、標準ハイドロゲル（左）、100mM CaCl₂でポロゲンが架橋された孔形成性ハイドロゲル（中央）、または生理食塩水（右）での注射の7日後または30日後の代表的な画像を示す写真である。ハイドロゲルのバルク成分は、2 RGD/重合体鎖で修飾されていた。初期には、生理食塩水のみの条件においてより多くの細胞が生着したが、後の時点では、この条件ではより少ない細胞が生着し、孔形成性ハイドロゲルから放出された時、実質的に多い細胞が最終的に生着した。図3Bは、孔形成性ハイドロゲル、標準ハイドロゲル、または生理食塩水で注射されたmCherry-MSCの（細胞密度に比例する）相対放射効率の定量化を示す折れ線グラフである。図3Cは、ポロゲンを架橋するために使用されるカルシウムの密度が減少すると、放出される細胞の全体密度が実質的に減少し、配備の動力学がわずかに遅延したことを示す折れ線グラフである（エラーバーはSEM、n＝4〜6である）。図3Dは、ヌードラット頭蓋欠損モデルを使用した、ヒト間葉系幹細胞により媒介される骨再生を増強する、孔形成性ハイドロゲルの能力を示す一連の写真である。臨界サイズの欠損を、ヌードラット（Charles River）の頭蓋に形成させた。欠損形成直後に、市販のヒト間葉系幹細胞（Lonza）を、生理食塩水（「細胞のみ」）、標準ハイドロゲル（2 RGD/アルギン酸重合体、60kPa）、または孔形成性ハイドロゲルのいずれかで、欠損空間へ移植した。埋め込みの4週間後の頭蓋欠損部における新たな骨形成のマイクロコンピュータによる断層撮影分析の代表的な横断面。孔形成性ハイドロゲルを介して細胞が送達された欠損部においては、実質的により多くの新たな骨が形成された。別個の集団を異なる時点で放出するための、孔形成性ハイドロゲルの使用を示す、一連の顕微鏡写真である。図4A〜図4Cは、孔形成性ハイドロゲルにおける4日間の培養の後の、組織培養プラスチックに接着したGFP発現筋芽細胞および成長内皮細胞（OEC）の蛍光顕微鏡写真である。ポロゲンを形成するために使用される化学を変化させ、以下のように、異なる細胞型を別個のコンパートメントに初めに置いた；（図4A）：バルク成分に筋芽細胞、ポロゲン成分にOEC；（図4B）：ビーズ成分に筋芽細胞、ポロゲン成分にOEC；（図4C）バルク成分に筋芽細胞およびOECの両方。図4Dは、等しい数のGFP-筋芽細胞およびOECが播種されたプラスチック基質の代表的な顕微鏡写真である。筋芽細胞はOECよりも増殖した。細胞はエチジウムホモダイマー（赤色）により染色されたため、GFP-筋芽細胞は黄色に見え、OECは赤色に見える。10倍の拡大率で得られた画像。ケモカインにより媒介される細胞動員のための、孔形成性ハイドロゲルの使用を示す、一連の顕微鏡写真である。具体的には、図5は、インビボの孔形成性ハイドロゲルによるケモカインにより媒介される細胞動員の制御を示す。最初は糖であったものをアルコール基に置換するため、アルギン酸をまず酸化し、次いで、水素化ホウ素ナトリウムで還元した。図5Aおよび図5Bは、標準注射可能アルギン酸ゲル（図5A）および孔形成性ハイドロゲル（図5B）への樹状細胞動員の蛍光顕微鏡写真である。ハイドロゲルの両方のセットに、2pgの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を負荷した。図5Cおよび5Dは、酸化型ポロゲン（図5C）または還元型ポロゲン（図5D）により製作された孔形成性ハイドロゲルへの樹状細胞動員の蛍光顕微鏡写真である。ケモカインは添加されなかった。組織学的検査のため、樹状細胞を、CD11c（緑色）およびNIHC-II（赤色）について染色し、ヘキストで核を対比染色した（青色）。図5Cおよび図5Dにおいては、核染色（白色）のみを実施した。この図は、酸化型アルギン酸から形成されたポロゲンを有する材料による宿主細胞動員と、還元型アルギン酸から形成されたポロゲンを有する材料による宿主細胞動員との違いを示している。スケールバー：100pm。図６は、幹細胞の孔形成性ハイドロゲルにおける増殖、ハイドロゲルからの配備、および骨を再生する能力の、バルク相組成の変動による制御を証明する、一連の折れ線グラフ、棒グラフ、および写真である。図6Aおよび図6Bは、60kPaの率を有するバルクゲルの中のRGDペプチドの密度（図6A）または10 RGDペプチド/アルギン酸重合体を提示するバルクハイドロゲルの弾性率（図6B）の関数としての、間葉系幹細胞による（DNA合成に比例する）24hr 3H-チミジン取り込み（D1；赤色曲線）または7日間の培養の後の孔形成性ハイドロゲルからの累積的なMSC配備（青色曲線）の分析を示す折れ線グラフである（データは平均値+/-SEM、n＝3〜5である）。RGD密度は、細胞増殖に対して有意な効果を有し、弾性率は、増殖および放出の両方に対して効果を有した（p＜0.05、ANOVA）。図6Aの説明に示すとおりである。図6Cは、孔形成の関数としてのDNA合成の分析を示す棒グラフである。図6Dは、50日間の培養の後の、凍結切片化された孔形成性ハイドロゲルの中のD1細胞におけるKi-67（増殖マーカー、緑色）についての染色を示す一連の写真である。図6Eおよび図6Fは、インビボの間葉系幹細胞の配備、生着、および増殖の制御を示す折れ線グラフである。図6Eは、アルギン酸重合体1本当たり2個（菱形）または10個（四角）のRGDペプチドによりバルク相が修飾された孔形成性ハイドロゲルで注射されたmCherry-MSCの（細胞密度に比例する）相対放射効率の定量化を示す折れ線グラフである。あるいは、細胞を、2 RGDペプチド/アルギン酸重合体を有する標準ハイドロゲル内に注入した（三角）。図6Fは、MSC送達の方法の関数としての、治癒（ヌードラット頭蓋欠損部に移植されたヒトMSCによる新たな骨形成）の率の定量化を示す。エラーバーはSEM、n＝4〜6である。図6Eの説明に示すとおりである。二成分（binary）アルギン酸から形成されたハイドロゲルの機械的特性およびインビトロ分解を示す一連の折れ線グラフおよび頻度棒グラフである。図7Aおよび図7Bは、20mg/mLの一定密度の酸化型アルギン酸（5％の理論上の酸化度）と未修飾高M_Wアルギン酸との二成分組み合わせを架橋することにより形成されたバルクハイドロゲルの弾性率（図7A）および分解（図7B）を示す。分解は、インビトロの4日後の乾燥質量を、初期乾燥質量と比較することにより、査定された。図7Cは、20mg/mL酸化型アルギン酸と7.5mg/mL未修飾アルギン酸との二成分混合物から形成されたポロゲンの直径のヒストグラムである。ポロゲン直径は、アミノフルオレセイン標識アルギン酸から調製されたポロゲンの蛍光顕微鏡写真を加工することにより測定された。エラーバーはSD、n＝3〜4である。移植された前駆細胞を、増殖するよう活性化し、傷害組織へ遊走して再生に関与する細胞へと分化するようプログラムするという幹細胞の生態学的地位の特定の局面を模倣する埋め込み式バイオマテリアルの模式図である。特異的な合図の提示を通して、移植された細胞の運命を制御するが、移植された細胞の材料からの遊走および宿主細胞の材料への遊走を防止するハイドロゲル足場の模式図である（左上）。下：この場合においては弾性率を介して、間葉系幹細胞の運命を制御するナノ多孔性ハイドロゲルの能力を示す例示的データ。右上：特異的な合図の提示を通して、移植された細胞の運命を制御し、宿主細胞の材料への遊走および移植された細胞の材料からの遊走も可能にするマクロ多孔性スポンジの模式図。マクロ多孔性ハイドロゲルを作製するための代替的な方法を示す一連の画像である。模式図（中央、右）に記載されるように、ポロゲンを「バルク」ハイドロゲルへ包埋するか、またはバルクハイドロゲルの非架橋領域を提供するため、フォトリソグラフィ技術を適用する。バルクハイドロゲルの架橋後、ハイドロゲルの非架橋部分およびポロゲンを、アセトンなどの溶媒を使用して除去する。左：マクロ多孔性ハイドロゲルの画像。急速分解性のアルギン酸に基づくハイドロゲルポロゲンを作出するための方法を示す模式図および棒グラフである。左上：NaIO₄によりアルギン酸をアルギン酸ジアルデヒドへ酸化するための化学反応スキーム。右上：過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化による、アルギン酸の架橋可能なグルロン酸リッチ部分の損失（短い直線セグメント）、および重合体M_Wの全体的な減少を示す模式図。下：20mg/mL未修飾アルギン酸（四角）、20mg/mLアルギン酸ジアルデヒド（5％の酸化度；菱形）、または20mg/mLアルギン酸ジアルデヒドと7.5mg/mL未修飾アルギン酸との二成分混合物（三角）から作成されたハイドロゲルからの経時的な乾燥質量の損失を示すデータ。ポロゲンの製作および特徴決定を例示する模式図である。孔形成性ハイドロゲルによる宿主細胞動員の制御を示す模式図である。具体的には、強力な抗腫瘍応答に関与するための、活性化された抗原提示樹状細胞の動員、プログラム、およびその後のリンパ節への標的化を可能にする、感染の微小環境を模倣する埋め込み式バイオマテリアル系の模式図が、この図に示される。ポロゲン相を構成するために使用される重合体が、ポロゲンの分解および加工にどのように影響するかを示す一連の顕微鏡写真である。具体的には、フルオレセイン標識アルギン酸ジアルデヒドを使用して形成されたポロゲンの蛍光顕微鏡写真が、この図に示される。20mg/mLアルギン酸ジアルデヒドを使用して作成されたか（左上）、20mg/mLアルギン酸ジアルデヒドと7.5mg/mL未修飾アルギン酸との二成分混合物を使用して作成されたかに関わらず、100mM CaCl₂での架橋の直後（上）、ポロゲンはほぼ完全である。しかしながら、ポロゲンを精製し、過剰のCaCl₂を除去するために使用された加工工程の後、アルギン酸ジアルデヒドのみにより作成されたポロゲンは、傷害を受け、形態の実質的な変化およびフルオレセイン標識重合体の溶液中への放出をもたらし、実質的なレベルのバックグラウンドフルオレセイン蛍光を生じた（左下）。対照的に、20mg/mLアルギン酸ジアルデヒドと7.5mg/mL未修飾アルギン酸との二成分混合物は、加工工程に耐え得るポロゲンをもたらした。

発明の詳細な説明
最近の数十年にわたり、生体適合性重合体は、細胞移植のための担体として機能する足場を形成するため、またはデバイスへ宿主細胞集団を動員するため、使用されてきた。一般に、乳酸グリコール酸共重合体（PLGA）などのスポンジ、またはアルギン酸などの合成ハイドロゲルが、使用されている。しかしながら、いずれの材料のセットも、短所を有する。例えば、スポンジは、典型的には、血清タンパク質を吸収するため、材料からの接着タンパク質または接着ペプチド（例えば、RGD）の提示を制御することが困難である。また、スポンジ材料は、典型的には、注射に適用できず、埋め込みのために侵襲性の手術を必要とし、また、移植された細胞または宿主細胞を、初期には対立的である可能性のある（例えば、炎症時に存在する好中球は幹細胞を攻撃する可能性がある）宿主環境へ曝す。他方、合成ハイドロゲルは、典型的には、注射可能であり、最小限に侵襲性の送達を可能にし、タンパク質と相互作用しない。しかしながら、本明細書に記載された本発明以前には、ハイドロゲル中の孔サイズが、典型的には、真核細胞の直径よりはるかに小さかったため、移植された細胞集団を拡張させ、傷害組織を修復させるために移植された細胞を放出すること、またはデバイスへ宿主細胞を動員することは困難であった。

本発明は、ハイドロゲル注射後にハイドロゲル内にインサイチューで孔を形成するための方法を含む。周囲ハイドロゲル内に封入された犠牲ポロゲンの分解を介して、インサイチューで孔が形成される。孔形成の動力学および開始は、ポロゲンを形成するために使用される材料を操作することにより制御され、細胞が、ポロゲン自体またはその周囲のハイドロゲルのいずれかへ封入される。実施例は、インビトロの幹細胞の配備、増殖、および分化を証明し、インビボの幹細胞の配備およびケモカインにより媒介される細胞動員も証明する。系は、このマトリックスにおける孔の形成を介して、重合体マトリックスからの細胞の配備、または重合体マトリックスへの局所的な細胞の動員の制御を媒介する。孔のサイズ、分布、および形成の動力学は、使用者によりあらかじめ定められ、孔の周囲のマトリックスの完全性は、このマトリックスの内部の細胞または生物学的因子と共に、不変である。

従って、（1）注射可能であり；（2）使用者が、不溶性の合図（insoluble cue）を使用して、細胞の運命を制御することを可能にし；かつ（3）細胞を配備するかまたは動員するため、時間経過とともに孔を形成する、材料を生成するための、ハイドロゲルの接着リガンド提示および／または弾性率（即ち、堅さ）などの不溶性の合図の使用が、本明細書に記載される。具体的には、本明細書に記載された方法は、孔形成相（以後「ポロゲン」と呼ぶ）または非分解性もしくは緩徐分解性の相（以後「バルク」と呼ぶ）のいずれかへ細胞が封入されることを可能にする過程を使用して、孔形成性ハイドロゲルを作出する。

本発明は、細胞封入を可能にする孔形成性ハイドロゲルを作出するための一般化されたアプローチのための方法、および細胞のハイドロゲルからの配備またはハイドロゲルへの動員の動力学を制御するための手段を提供する。ハイドロゲルミクロビーズ「ポロゲン」が形成され、次に、第2の「バルク」ハイドロゲルへ封入される。ポロゲンおよびバルクハイドロゲルを形成するために使用される重合体の組成は、変動し得る；しかしながら、ポロゲンは、バルクハイドロゲルより（例えば、10％、20％、50％、2倍、5倍、10倍、20倍、またはそれ以上）急速に分解しなければならない。細胞または生理活性因子（例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、血管内皮増殖因子（VEGF）などの増殖因子、凝縮オリゴヌクレオチド、例えば、CpG、またはプラスミドDNA）は、ポロゲン相、バルクハイドロゲル相のいずれか、または両方の相へ任意で封入される。ポロゲンは、使用者によりあらかじめ定められた時間の経過とともにインサイチューで分解し、その時点で、細胞が放出されるか、または材料へ遊走してもよい。しかしながら、孔形成性ハイドロゲルは、初期には孔を欠くため、形成直後に機械的な支持を提供するのに有用である（図1）。

細胞の放出または動員は、ポロゲン分解の動力学を制御することにより操作される。例えば、アルギン酸重合体はアルギン酸ジアルデヒドを生成するため酸化され、酸化度が増加するにつれ、放出される細胞の総数が増加する（図2、図3）。あるいは、ポロゲンを架橋するために使用される条件が、有意なポロゲン分解および細胞放出が起こり始める時点を操作するために改変される（図2）。さらに、宿主タンパク質との相互作用を容易にするかまたは阻害するため、ポロゲン化学を変化させることができる（図5）。

細胞の放出および細胞の運命は、バルクハイドロゲルの生物物理学的特性および生化学的特性（例えば、弾性率およびRGDなどのインテグリン結合接着ペプチドの密度）を操作することにより制御される。例えば、孔形成、バルクハイドロゲルのRGD密度、およびバルクハイドロゲルの弾性は、全て、これらの材料における細胞増殖に影響する（図2、図6）。相互に分離したポロゲンおよびバルクの直交の加工（orthogonal processing）は、細胞の放出および細胞の運命を操作するために系を調整する能力を増強する。例えば、幹細胞系統拘束は、孔形成の動力学とは独立して、弾性率またはRGD密度を変動させることによりモジュレートされる。対照的に、マクロ多孔性材料を形成するために使用される他の技術（例えば、溶媒に基づくポロゲンの抽出）は、細胞封入と適合性でなく、典型的には、ポロゲン相およびバルク相の両方の物理的特性に影響する。急速分解性バルクハイドロゲル材料の物理的特性および生化学的特性は、分解の過程で連続的に変化する。これらのパラメーターは、細胞の運命を調節するため、バルク相を設計するために利用される。

ハイドロゲル組成物
ハイドロゲルは、親水性である重合体鎖のネットワークを含む。（アクアゲルとも呼ばれる）ハイドロゲルは、時には、水が分散媒であるコロイドゲルとして見出される。ハイドロゲルは、高度に吸収性の（99.9％超の水を含有し得る）天然または合成の重合体である。ハイドロゲルはまた、その高い含水量ゆえに、天然組織に極めて類似した柔軟性の程度を有する。ハイドロゲルは、架橋された重合体から構成される。例示的なハイドロゲルは、アルギン酸、ポリエチレングリコール（PEG）、PEGアクリレート、アガロース、および合成タンパク質、例えば、コラーゲンまたは改変タンパク質（即ち、自己集合ペプチドに基づくハイドロゲル）などの、細胞封入と適合性の材料から構成される。例えば、市販のハイドロゲルには、細胞培養のための規定された三次元（3D）微小環境を作出するために使用される合成マトリックスである、BD（商標）PuraMatrix（商標）Peptide Hydrogelが含まれる。

例えば、ハイドロゲルは、完全にまたは部分的に生分解性である生体適合性重合体マトリックスである。ハイドロゲルを形成し得る材料の例には、アルギン酸およびアルギン酸誘導体、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸グリコール酸共重合体（PLGA）、ゼラチン、コラーゲン、アガロース、天然および合成の多糖、ポリペプチド、具体的には、ポリ(リジン)などのポリアミノ酸、ポリヒドロキシブチレートおよびポリεカプロラクトンなどのポリエステル、ポリ無水物；ポリホスファジン、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(アルキレンオキシド)、具体的には、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(アリルアミン)（PAM）、ポリ(アクリレート)、ポリ(4-アミノメチルスチレン)などの修飾スチレン重合体、プルロニックポリオール、ポリオキサマー、ポリ(ウロン酸)、ポリ(ビニルピロリドン）、ならびにグラフト共重合体を含む上記のものの共重合体が含まれる。コラーゲン、フィブリン、ヒアルロン酸、アガロース、およびラミニンリッチゲルなどの合成重合体および天然に存在する重合体も使用され得るが、これらに限定されない。

合成ハイドロゲルは、典型的には、注射可能であり、最小限に侵襲性の送達を可能にし、タンパク質と相互作用しない。従って、接着タンパク質または接着ペプチドの提示が正確に制御される。さらに、合成ハイドロゲルは、典型的には、細胞よりはるかに小さい孔メッシュサイズを有し（＜10nm、細胞は＞10um）、そのことは、宿主細胞が移植された細胞を攻撃するのを防止する。しかしながら、この小さな孔サイズは、移植された細胞が材料内に広範に増殖することも防止し、それが最終的に放出されて、様々な機能（例えば、機能的な組織の再生または疾患組織の破壊）に影響することも妨害する。

ハイドロゲルおよびスポンジの望ましい特色を組み合わせるため、いくつかの技術が導入されている。例えば、硬いマイクロスフェアがハイドロゲルへ封入され、次いで、マクロ多孔性ハイドロゲルを残すため、それが溶媒（例えば、アセトン）で抽出されたり、凍結乾燥がマクロ多孔性ハイドロゲルを生成するために適用されたりしている。ハイドロゲルは、インビボで急速に分解して、宿主細胞を放出するよう修飾され得る。しかしながら、本明細書に記載された本発明以前には、非分解性（または緩徐分解性）材料成分の細胞封入との組み合わせを可能にするアプローチは存在しなかった。ハイドロゲル材料の機械的特性および生化学的組成は、細胞の運命に強く影響し、分解自体が細胞の運命を本質的に調節することができる。

孔形成性組成物
ハイドロゲルミクロビーズ（「ポロゲン」）が形成される。次に、ポロゲンは、非分解性であるかまたはポロゲンと比較して遅い速度で分解する「バルク」ハイドロゲルへ封入される。細胞は、ポロゲンまたはバルクコンパートメントのいずれかへ任意で封入される。ハイドロゲル形成またはインビボの所望の部位への注射の直後には、複合材料は、孔を欠き、外科的充填剤として機能する。その後、ポロゲン分解により、インサイチューで孔が形成され、封入された細胞が、複合材料から離れて、周囲の組織または体内の遠隔の組織、例えば、リンパ節へ配備される。孔のサイズおよび分布は、ポロゲン形成、およびバルクハイドロゲルを形成する重合体との混合の間、制御される。

あるいは、ハイドロゲルは、細胞を封入されずに注射され、孔形成は、バルク成分もしくはポロゲン成分のいずれかから放出されるケモカインと組み合わせて、またはそれとは独立して、宿主細胞を動員する手段として使用される。ポロゲンは、「バルク」ハイドロゲルを形成するために使用される材料より急速に分解し、初期には、バルクハイドロゲル相を形成する重合体との混合に耐えるために十分に機械的に安定している限り、任意の生体適合性重合体から構成される。「バルク」は、任意のハイドロゲル形成性重合体から構成される。

アルギン酸組成物
組成物および方法において利用される重合体は、天然に存在するものであってもよいし、または合成により作成されたものであってもよい。一例において、ポロゲンおよびバルクハイドロゲルの両方が、アルギン酸から形成される。「アルギン酸」という用語は、本明細書において使用されるように、アルギン酸の多数の誘導体（例えば、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、またはアルギン酸プロピレングリコール）をさす。例えば、参照により本明細書に組み入れられるPCT/US97/16890を参照のこと。

ポロゲン形成に適したアルギン酸重合体は、5,000〜500,000Daのダルトン分子量を有する。重合体は、急速分解を容易にするため、（例えば、過ヨウ素酸ナトリウム（参照により本明細書に組み入れるBouhadir et al.,2001,Biotech.Prog.17:945-950）による酸化により）任意でさらに修飾される。下記実施例においては、ハイドロゲルミクロビーズを形成するため、二価カチオン（例えば、Ca2+またはBa2+）の槽への同軸気流による噴霧器を通した押し出しにより、重合体を架橋した。気流速度が高いほど、ポロゲン直径は小さくなる。

ポロゲンを形成するために使用される二価イオンの濃度は、5〜500mMで変動し得、重合体の濃度は、1重量％〜5重量％で変動し得る。しかしながら、バルク相より有意に小さいポロゲンを作製する任意の方法が適切である。宿主タンパク質および細胞とのある程度の相互作用を有するポロゲンを作製するため（例えば、糖残基の＞5％の程度に酸化されたアルギン酸は、宿主細胞と有意に相互作用する、図5）、またはこの相互作用を阻害するため（例えば、NaBH4により還元された酸化型アルギン酸は、タンパク質もしくは宿主細胞との最小限の相互作用を示す、図5）、ポロゲン化学をさらに操作することができる。

バルクハイドロゲルの形成に適したアルギン酸重合体は、5,000〜500,000Daのダルトン分子量を有する。バルクハイドロゲルがポロゲンより緩徐に分解する限り、分解を容易にするため、重合体を（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化により）さらに修飾してもよい。細胞応答を制御するための生物学的な合図（例えば、RGDなどのインテグリン結合接着ペプチド）を提示するよう、重合体を修飾することもできる。細胞応答をさらに制御するため、オリゴヌクレオチド、増殖因子、または薬物などの生理活性因子を、ポロゲンまたはバルクハイドロゲルのいずれかへ封入することもできる。バルクハイドロゲルを形成するために使用される二価イオンの濃度は、5〜500mMで変動し得、重合体の濃度は、1重量％〜5重量％で変動し得る。バルク重合体の弾性率は、例えば、封入された細胞の運命を制御するため、調整される。

実施例1：ハイドロゲル内でのインサイチューの孔形成
画像化および機械的特性試験を介して証明される、ハイドロゲル内のインサイチュー孔形成が、図1に示される。図1Aに示されるように、急速分解性ハイドロゲル（赤色の球）から構成されたミクロビーズを、第2のハイドロゲル形成性重合体材料と混合し、それをビーズの周りに架橋させた。インサイチューのミクロビーズの分解の後、完全なハイドロゲルネットワーク（桃色）が、孔のネットワークと共に残った。標準ハイドロゲル（左バー）または孔形成性ハイドロゲル（右バー）の弾性率測定を決定した（図1D）。0日目には、孔が形成されていなかったため、孔形成性複合物と標準ハイドロゲルとの間に全体的な硬度の統計的有意差は存在しなかった；しかしながら、4日後、複合物の率は、孔形成のゆえに、実質的に下落する。

本明細書に記載されたハイドロゲルの生成に関連した付加的な方法は、以下の通りである。Bouhadir et al.Polymer 1999;40:3575-84（参照により本明細書に組み入れられる）は、過ヨウ素酸ナトリウムによるアルギン酸の酸化を記載し、反応を特徴決定している。Bouhadir et al.Biotechnol.Prog.2001;17:945-50（参照により本明細書に組み入れられる）は、アルギン酸ジアルデヒド（アルギン酸ジアルデヒドは、アルギン酸内の糖のあるパーセント（例えば、5％）がアルデヒドを形成するよう酸化されている高M_Wアルギン酸である）を形成するための高分子量アルギン酸の酸化、およびハイドロゲルを急速に分解させるための適用を記載している。Kong et al.Polymer 2002;43:6239-46（参照により本明細書に組み入れられる）は、グルロン酸（GA）含量を実質的に低下させることなく、グルロン酸（GA）リッチアルギン酸の重量平均分子量（M_W）を低下させるための、ガンマ照射の使用を記載している（例えば、ガンマ照射は、アルギン酸のマンヌロン酸、MAブロックを選択的に攻撃する）。アルギン酸は、GAブロックおよびMAブロックから構成され、アルギン酸にその硬度（弾性率）を与えるのはGAブロックである。Kong et al.Polymer 2002;43:6239-46（参照により本明細書に組み入れられる）は、高M_W GAリッチアルギン酸と、照射された低M_W高GAアルギン酸との二成分組み合わせが、カルシウムにより架橋されて硬いハイドロゲルを形成するが、同一の全体重量濃度の高M_W GAリッチアルギン酸のみから作成されたハイドロゲルより、急速に分解し、低い溶液粘性も有することを示している。Alsberg et al.J Dent Res 2003;82(11):903-8（参照により本明細書に組み入れられる）は、照射された低M_WGAリッチアルギン酸から作成されたハイドロゲルの分解プロファイルを、骨組織工学への適用と共に記載している。Kong et al.Adv.Mater 2004;16(21):1917-21（参照により本明細書に組み入れられる）は、ガンマ照射手法を酸化反応と組み合わせることによる、ハイドロゲル分解プロファイルの制御、および軟骨工学への適用を記載している。

水素バイオマテリアルの分解を制御するための技術は、当技術分野において周知である。例えば、Lutolf MP et al.Nat Biotechnol.2003;21:513-8（参照により本明細書に組み入れられる）は、哺乳動物酵素（MMP）を介して分解するよう操作された、ポリ(エチレングリコール)に基づく材料を記載している。Bryant SJ et al.Biomaterials 2007;28(19):2978-86（US 7,192,693 B2；参照により本明細書に組み入れられる）は、マクロスケールの孔を有するハイドロゲルを作製するための方法を記載している。孔鋳型（例えば、ポリ-メタクリル酸メチルビーズ）をバルクハイドロゲル内に封入し、次いで、バルクハイドロゲルを完全なまま残して、ポロゲンを抽出するため、アセトンおよびメタノールを使用する。Silva et al.Proc.Natl.Acad.Sci USA 2008;105(38):14347-52（参照により本明細書に組み入れられる；US 2008/0044900）は、アルギン酸スポンジからの内皮前駆細胞の配備を記載している。スポンジは、アルギン酸ハイドロゲルを形成し、次いで、それを凍結乾燥することにより作成される（氷晶が孔を形成する）。これらの材料は、（単独で送達された細胞と比較して）細胞の治療効果を改善するが、これらの材料は、外科的に植え込まれなければならず（即ち、注射不可能であり）、細胞封入を適用できず（細胞は凍結乾燥時に死滅するであろう）、この方法は、弾性率を制御することにより細胞の運命を制御することを困難にする。Ali et al.Nat Mater 2009（参照により本明細書に組み入れられる）は、樹状細胞を動員し、抗腫瘍応答を誘発するようプログラムするための、多孔性足場の使用を記載している。Huebsch et al.Nat Mater 2010;9:518-26（参照により本明細書に組み入れられる）は、封入された間葉系幹細胞の分化を制御するための、ハイドロゲルの弾性率の使用を記載している。

（1）注射可能であり；（2）使用者が不溶性の合図を使用して細胞の運命を制御することを可能にし；かつ（3）細胞を配備するかまたは動員するための孔を時間経過とともに形成する、材料を生成するための、ハイドロゲルの接着リガンド提示および／または弾性率（即ち、堅さ）などの不溶性の合図の使用が、本明細書に記載される。具体的には、本明細書に記載された方法は、孔形成相（以後「ポロゲン」と呼ぶ）または非分解性もしくは緩徐分解性の相（以後「バルク」と呼ぶ）のいずれかへ細胞が封入されることを可能にする過程を使用して、孔形成性ハイドロゲルを作出する。本明細書に記載された方法において、ポロゲンは、溶媒ではなく加水分解により分解する。このことは、細胞がポロゲンまたはその周りのバルクゲルのいずれかへ封入され、ゲルへ封入されたタンパク質またはその他の生理活性化合物が変性する確率は極めて低いことを意味する。

以下に詳細に記載されるように、ポロゲンは、封入の間には完全性を保つが、急速に分解して、走査型電子顕微鏡検により可視である空隙を生じ、複合材料の弾性率および破壊靱性の損失をもたらした。具体的には、走査型電子顕微鏡写真（SEM）は、形成直後（0日目）の孔形成性ハイドロゲルは、ほぼ完全なネットワークを保有しているが；製作の10日後までに、有意な孔形成が観察されることを示した（図1E）。複合材料（50％ポロゲン体積分率）の弾性率は、標準ハイドロゲル（ポロゲンなし）の弾性率と実質的に異なっていなかった；しかしながら、空隙が形成されるにつれ、複合物の率は実質的に下落する（図1Fおよび図1G）。1週間目の複合物の弾性率の減少は、空隙の密度に対応し、低いポロゲン密度では、空隙の密度と複合物の弾性率の減少との間に直線的な関係が存在する。複合材料（25％ポロゲン体積分率）の破壊靱性は、ポロゲンを含まない標準ハイドロゲルの破壊靱性に初期には類似していたが、初期値の数分の一にまで減少する（図HおよびI）。弾性率と同様に、破壊靱性の減少は、非直線的ではあるが、ポロゲンの密度と相関する。これらの結果は、ポロゲンが、封入の間には完全性を保ち、インサイチューで分解して空隙を形成することを証明している。

実施例2：インビトロおよびインビボの細胞の放出
分解性アルギン酸ポロゲンを、骨髄間質幹細胞（D1）と共に、高分子量バルクアルギン酸ゲルへ封入することにより、孔形成性ハイドロゲルを形成した。ポロゲンは、20mg/mLアルギン酸ジアルデヒド（高Mw高グルロン酸含量アルギン酸内のアルギン酸糖残基の7.5％の理論上の酸化）と、7.5mg/mL高Mw高グルロン酸（GA）含量アルギン酸との二成分混合物により形成された。この重合体混合物を、重合体を架橋するため、0.1M CaCl₂および0.1M HEPESの槽へ同軸窒素気流によりガラス噴霧器を通して押し出した。ポロゲンを、無血清細胞培養培地により徹底的に洗浄した。バルクハイドロゲルは、アルギン酸重合体1本当たり2個のRGDペプチドにより修飾された、20mg/mL高Mw高GA含量アルギン酸で形成された。D1細胞およびポロゲンを、注射器を使用して、バルクハイドロゲル材料へ混合し、次いで、複合物を硫酸カルシウムで架橋した。インビトロでの時間経過とともにこの系から放出されたD1細胞の数が、図2に示される。（1）ポロゲンを形成するために使用されるCaCl₂の濃度を制御することにより、（2）ポロゲンの組成（酸化度）を変動させることにより、そして（3）細胞の区画化（ポロゲン内かバルクゲル内か）を変動させることにより、放出の動力学を修飾することができた。

具体的には、インビトロの間葉系幹細胞配備が、図2に例示される。幹細胞は、インビトロで孔形成性ハイドロゲルから放出され、この放出は、ポロゲンの組成の変動、および細胞をポロゲン内に区画化するかバルク内に区画化するか、によって調整され得た。細胞充実性および孔形成性ハイドロゲルからの流出に対するポロゲン密度（0〜80体積パーセント）の効果は、図2Cに示される。具体的には、孔形成性ハイドロゲルの蛍光顕微鏡写真において、インビトロの4〜10日後、生存している間葉系幹細胞（MSC）（カルセイン-AM、緑色）または死細胞（エチジウムホモダイマー、赤色）について染色した。球状の細胞形態は、ナノ多孔性材料に限局している細胞を示し、短い時間枠では両方の材料に存在するが、より長い時間枠では標準ハイドロゲルにのみ存在する。ポロゲン体積密度の関数としての、12日後に放出されたMSCの累積数が、図2Dに示される。

図2Dに示されるように、ポロゲンのサイズは、複合材料全体のサイズに関係する。具体的には、材料の完全性を保つためには、ポロゲン直径は、複合物全体の最も小さな寸法の＜10％である。ポロゲンの密度は、細胞動員および細胞放出の両方のため、全体積の10〜80パーセント、例えば、全体積の15％〜75％、20％〜70％、25％〜65％、30％〜60％、または35％〜55％である。好ましくは、ポロゲンの密度は、全体積の少なくとも50％である。

相互接続された空隙の形成の動力学、およびそれに対応する間葉系幹細胞放出の動力学を決定するため、物理学的研究およびインビトロ研究を実施した（それぞれ、図2Aおよび図2E）。クローン由来の市販のマウス間葉系幹細胞株（D1）を、これらのインビトロの研究のために使用した。キャピラリーアッセイを、空隙の形成を査定するために使用した。簡単に説明すると、まず、緩衝液を飽和させた複合孔形成性ゲルを計量し、次いで、ペーパータオルでゲルの表面にそっと触れて水を吸い取った後、ゲルを再計量することにより、相互接続された空隙の密度を測定した。質量の相対変化に基づき、空隙分率を計算した。インビトロ細胞放出アッセイについては、孔形成性ハイドロゲルのバルク成分は、2 RGDペプチド/アルギン酸重合体により修飾されており、60kPaの弾性率を有していた。（浸透極限；80％を超える）極めて高い分率のポロゲンが存在しない限り、最初の7日間で相互接続された空隙が形成された。浸透ポロゲン密度未満では、実質的な相互接続された空隙の形成は観察されなかった。ポロゲンへ封入されたD1細胞について、ポロゲン製作条件の関数としての、孔形成性ハイドロゲルのポロゲン相からのMSC配備の動力学が、図2Fに例示される。

その後、マウスMSC株で、放出研究を実施した。全体孔密度、およびミクロンスケール限局の損失を反映する細胞形態の緩徐な変化に比例して、細胞放出が観察された。ハイドロゲル内の細胞充実性および細胞増殖に対する孔形成の効果を決定するための実験を実施した。カルセイン-AM染色を使用して、細胞充実性を定性的に決定し、Ki-67発現についての免疫染色により定性的に、または³H-チミジン取り込みを測定することにより定量的に、増殖を決定した。孔形成性ハイドロゲルの全体に分布させたカルセイン-AM染色細胞の三次元再構築は、図2Bに提示される。孔形成性ハイドロゲルにおいては、細胞形態の実質的な変化が、遊走し増殖する細胞の能力を示しているが、標準ハイドロゲルにおいては、細胞は低密度で、円形のままであった。Ki-67免疫蛍光は、孔形成性ハイドロゲルにおいて、標準ハイドロゲルと比較して、より高い細胞充実性、および増加した増殖を示した。³H-チミジン取り込みの定量分析は、RGD依存的に増強された細胞増殖を示した（図2G）。

化学組成またはポロゲンを形成するために使用される架橋条件を変動させることにより、細胞放出の動力学がモジュレートされるか否かを決定するための研究を実施した（Bouhadir KH,Lee KY,Alsberg E,Damm KL,Anderson KW,Mooney DJ.Degradation of Partially Oxidized Alginate and Its Potential Application for Tissue Engineering.Biotechnol.Prog.2001;17:945-50）。図2Hは、細胞放出動力学が、細胞をポロゲンへ区画化するか、その周囲のバルクゲルへ区画化するかにより制御されたこと、およびより低い濃度のカルシウムで架橋されたポロゲンが、より緩徐に分解し、より遅い時点で細胞を放出したことを示している。ポロゲンを製作するために使用されるカルシウムの濃度が低いほど、架橋はより均質になった。

一定のバルク成分（2 RGD/重合体、60kPa）および一定のポロゲン密度（50％）で、ポロゲン組成を変動させて、孔形成性ハイドロゲルを形成した。アルギン酸重合体の理論上の酸化度を変動させることにより、ポロゲンの化学組成を操作した。酸化反応中の過ヨウ素酸ナトリウムとアルギン酸との比率を変動させることにより、酸化度を制御した（Bouhadir 2001）。20mg/mL酸化型アルギン酸と、5mg/mL未修飾高M_Wアルギン酸との二成分混合物を、ポロゲンを形成するために使用した。25〜100mM CaCl₂の槽において架橋することにより、ポロゲンを形成した。細胞放出に対するアルギン酸酸化度の効果が、図2Hに示される。ポロゲンを架橋するためのカルシウムのレベルが一定（100mM）の時、3％から7.5％へ酸化度を増加させると、放出される細胞の総数が実質的に増加し、酸化度を低下させると、細胞放出がわずかに遅延した。ポロゲンの酸化度が一定（7.5％）の時、ポロゲンを架橋するために使用されるカルシウムの濃度を25mMから100mMへ増加させると、放出される細胞の総数が低下し、細胞放出の開始がわずかに遅延した。

実施例3：インビボの間葉系幹細胞の配備、生着、および増殖の制御
最後に、インビボのMSCの放出動力学を操作するために、孔形成性ハイドロゲルを使用し得るか否かを決定するためのインビボ研究を実施した。そのため、mCherryを発現するマウスMSCを、ヌードマウスへ皮下移植した。細胞の生着、増殖、および配備を、非侵襲性の蛍光画像化により観察した。これは、孔形成性ゲルが、生理食塩水で送達された細胞と比較して、生着を遅延させることのみならず、これらの材料が、最終的により大きな増殖をもたらすことを示した。ハイドロゲルは、孔が形成された後、増殖に適した微小環境を提供する。最後に、これらの材料が、インビボのMSCの放出および拡張を促進するのに有用であったため、ヒトMSCを、ヌードラットの頭蓋欠損を再生するために投与した。これは、初期の時点ですら、石灰化された骨の再生の改善をもたらした。

具体的には、インビボ研究のため、D1細胞を、検出可能マーカー、例えば、mCherryまたは緑色蛍光タンパク質（GFP）を構成的に発現するよう修飾し、ポロゲンを含まない標準バルクゲル、孔形成性ハイドロゲルのいずれかへ封入するか、または生理食塩水と混合した。次に、細胞を18ゲージ針を通してヌードマウスの背部に注射した。IVIS系（Caliper Life Sciences）上で観察されたmCherry蛍光を介して、時間経過による細胞の放出および増殖をモニタリングした。これらのデータは、孔形成性ハイドロゲルからの細胞の放出および増殖が、標準ゲルより有意に多いことを明らかにした（図3）。さらに、単純な生理食塩水注射により送達された場合にも、細胞は増殖したが、孔形成性ハイドロゲルからの配備は、（1）局所的な細胞の送達および増殖の動力学を改変し、（2）実質的により多数の細胞を最終的に送達した（図3）。

具体的には、ポロゲンの組成を変動させることにより、インビボの細胞放出の動力学を操作する能力を決定するための実験を実施した。図3に示されるように、ヌードマウスの皮下空間においてインビボで孔形成性ハイドロゲルから幹細胞を放出させた。標準ハイドロゲル（左）、100mMもしくは50mM CaCl₂によりポロゲンが架橋された孔形成性ハイドロゲル（中央）、または生理食塩水（右）での注射の7日後または30日後に、2×10⁶個のmCherry発現MSCを、ヌードマウスへ配備した。ハイドロゲルのバルク成分は、2 RGD/重合体鎖で修飾されていた。初期には、生理食塩水のみの条件においてより多くの細胞が生着したが、後の時点では、この条件ではより少ない細胞が生着し、孔形成性ハイドロゲルから放出された時、実質的に多い細胞が最終的に生着した。孔形成性ハイドロゲル、標準ハイドロゲル、または生理食塩水で注射されたmCherry-MSCの（細胞密度に比例する）相対放射効率の定量化が、図3Bに示される。ポロゲンを架橋するために使用されるカルシウムの密度を減少させると、放出される細胞の全密度が実質的に減少し、配備の動力学がわずかに遅延した（図3C；エラーバーはSEM、n＝4〜6である）。ヒト間葉系幹細胞により媒介される骨再生を増強する、孔形成性ハイドロゲルの能力を、ヌードラット頭蓋欠損モデルにおいて証明した（図3D）。臨界サイズの欠損を、ヌードラット（Charles River）の頭蓋において形成した。欠損形成直後に、市販のヒト間葉系幹細胞（Lonza）を、生理食塩水（「細胞のみ」）、標準ハイドロゲル（2 RGD/アルギン酸重合体、60kPa）、または孔形成性ハイドロゲルのいずれかで、欠損空間へ移植した。図3Dの上列は、埋め込みの4週間後の頭蓋欠損部における新たな骨形成のマイクロコンピュータによる断層撮影分析の代表的な横断面を示す。孔形成性ハイドロゲルを介して細胞が送達された欠損部において、実質的に多くの新たな骨が形成された。埋め込み後12週間目の新たに形成された骨へのドキシサイクリン取り込み（緑色）は、孔形成性ハイドロゲルが、皮下組織の偽陽性染色ではなく、組織内の陽性ドキシサイクリン染色をもたらすことを証明している。

実施例4：2種の異なる細胞集団の別個の時点におけるインビトロ放出
孔形成性ハイドロゲルを、実施例1および2に記載されたようにして形成した。等しい数（複合孔形成性ハイドロゲル1mL当たりおよそ106細胞）のGFP発現筋芽細胞および成長内皮細胞（OEC、血管前駆細胞）を、この材料の別々のコンパートメントへ封入した。5日間のインビトロ培養の後、放出された細胞および組織培養プラスチックへ接着した細胞を、エチジウムホモダイマー（EtD-1；赤色）により染色した。図4に示されるように、バルクゲルへ封入された細胞型は、より急速に配備された。配備のこのパターンは、GFP-筋芽細胞より緩徐に遊走し、GFP-筋芽細胞ほど広範に増殖しないOECですら起こった（等しい数の両方の細胞型が添加された基質の分析に基づく；図4d）。

具体的には、異なる時点で別個の集団を放出するための孔形成性ハイドロゲルの使用は、図4に示される。孔形成性ハイドロゲルにおける4日間の培養の後の、組織培養プラスチックへ接着したGFP発現筋芽細胞および成長内皮細胞（OEC）の蛍光顕微鏡写真が、図4A〜4Cに示される。ここで、ポロゲンを形成するために使用される化学を変化させ、異なる細胞型を別個のコンパートメントに初めに置いた。図4Aは、バルク成分への筋芽細胞、ポロゲン成分へのOECを示し、図4Bは、ビーズ成分への筋芽細胞、ポロゲン成分へのOECを示している。図4Cは、バルク成分への筋芽細胞およびOECの両方を示している。等しい数のGFP-筋芽細胞およびOECをプラスチック基質へ播種した（図4D）。筋芽細胞はOECよりも増殖した。細胞をエチジウムホモダイマー（赤色）で染色したため、GFP-筋芽細胞は黄色に見え、OECは赤色に見える。

実施例5：異なるポロゲン製剤を含む孔形成性ハイドロゲルによる皮下組織からの宿主リンパ球の動員
孔形成性ハイドロゲルを、実施例1および2に記載されるようにして形成した。ポロゲン相を形成するため、7.5mg/mLの高Mw GAリッチアルギン酸重合体を、20mg/mLのアルギン酸ジアルデヒド（7.5％の理論上の酸化度）、またはアルデヒド基がアルコール基に還元されたアルギン酸ジアルデヒドのいずれかと組み合わせた。細胞が封入されていない孔形成性ハイドロゲルを、次に、C57/BL6マウスまたはBalb/cマウスの背部に注射した。14日後、宿主樹状細胞の動員を組織学的検査により観察した。

以下に詳細に記載されるように、孔形成性ハイドロゲルを、ケモカインにより媒介される細胞動員のために利用した。最初は糖であったものをアルコール基に置換するため、アルギン酸を、まず酸化し、次いで、水素化ホウ素ナトリウムにより還元した。図5Aおよび図5Bは、標準分解性アルギン酸ハイドロゲルによる樹状細胞（DC）動員と、孔形成性アルギン酸ハイドロゲルによる樹状細胞（DC）動員との比較を示す。ハイドロゲルの両方のセットに、2ugの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を負荷した。これは、ハイドロゲル隣接組織（画像の端に近い細胞充実性が高い区域）からの、孔形成性ハイドロゲルへの細胞の浸潤の方が、実質的に多かったことを示している。図5Cおよび5Dは、GM-CSFを含まないアルギン酸ジアルデヒド（図5C）または還元型アルギン酸ジアルデヒド（図5D）からポロゲンが形成された孔形成性ハイドロゲルへの基線DC侵入の比較を示す。GM-CSFが存在しない場合には、実質的に少ない基線細胞浸潤が起こった。組織学的検査のため、樹状細胞がCD11c（緑色）およびNIHC-II（赤色）について染色され、核がヘキストで対比染色されている（青色）。この図は、酸化型アルギン酸から形成されたポロゲンを含む材料による宿主細胞動員と、還元型アルギン酸から形成されたポロゲンを含む材料による宿主細胞動員との違いを示している。

実施例6：バルク相組成を変動させることによる孔形成性ハイドロゲルにおける幹細胞増殖の制御
このアプローチの目的は、不溶性の合図を使用して、細胞の拡張および放出を操作することである。従って、接着リガンドの密度、およびポロゲン周囲の非分解性ハイドロゲルの機械的特性が、細胞に対する効果を有するか否かを決定した。図6に示されるように、リガンドの密度は、DNA合成を有意に改変し、弾性率の改変は、1週間にわたりDNA合成および細胞放出の両方を改変した。図6Dに組織像により示されるように、接着リガンド密度などの不溶性の合図は、長い時間枠で、細胞に対する効果を有した。

具体的には、孔形成性ハイドロゲルのバルク成分の組成が、インビボの細胞の増殖および生着をモジュレートするか否かを決定するための研究を実施した。60kPaの率を有するバルクゲルにおけるRGDペプチドの密度、または10 RGDペプチド/アルギン酸重合体を提示するバルクハイドロゲルの弾性率の関数としての、（DNA合成に比例する）間葉系幹細胞による24hr ³H-チミジン取り込み（D1；赤色曲線）または7日間の培養の後の孔形成性ハイドロゲルからの累積的なMSC配備（青色曲線）の分析（データは平均値+/-SEM、n＝3〜5である）が、図6Aおよび6Bに示される。RGD密度は、細胞増殖に対する有意な効果を有し、弾性率は、増殖および放出の両方に対する効果を有した（p＜0.05、ANOVA）。孔形成の関数としてのDNA合成の分析は、図6Cに示される。50日間の培養の後の、凍結切片化された孔形成性ハイドロゲルの中のD1細胞におけるKi-67（増殖マーカー、緑色）についての染色が、図6Dに示される。

配備された幹細胞の運命の、バルクハイドロゲルの組成を介した制御
孔形成性ハイドロゲルを、実施例1に記載されるようにして形成した。バルクハイドロゲルの組成（インテグリン結合RGDペプチドの密度および弾性率）を操作することにより、インビトロの間葉系幹細胞（MSC）の増殖および放出を制御することが可能であった。インビボで、RGDペプチドの密度をアルギン酸重合体鎖1本当たり2ペプチドから10ペプチドへ増加させることにより、皮下空間へ配備されたmCherry標識マウスMSCの全体密度を増加させることができた（図6E）。治療的研究のため、ヒトMSCをヌードラットの頭蓋欠損部へ配備した。4週間後、ラットを安楽死させ、（新たな骨形成による）治癒の程度を、ヘマトキシリン／エオシン染色により査定した。簡単に説明すると、「治癒パーセント」計量を生成するため、欠損部内の新たに形成された骨の面積を、欠損部の全面積で割った。この定量的計量を使用して、孔形成性ハイドロゲルでのMSC送達が、新たな骨形成を誘導する能力に関して、標準ハイドロゲルまたは生理食塩水を介した送達より実質的に優れていることが見出された（図6F）。さらに、60kPa、10 RGD/アルギン酸重合体バルク相を含む孔形成性ハイドロゲルからの配備は、8kPa、10 RGD/アルギン酸重合体バルク相を含む孔形成性ハイドロゲルからの配備より、有意に多い骨形成をもたらしたように（p＜0.05、両側t検定）、バルクハイドロゲル成分の弾性率は、4週間目の新たな骨形成に対する実質的な効果を有していた。

従って、mCherry標識D1を、孔形成性ハイドロゲルを介してヌードマウスの皮下組織へ配備した時、バルク成分のRGD密度が2 RGDペプチド/アルギン酸重合体から10 RGDペプチド/アルギン酸重合体へ増加すると、細胞配備動力学には有意に影響せずに、生着した細胞の総数が実質的に増加した。

本明細書に記載されるように、本実施例は、細胞により媒介される組織再生に対するバルクハイドロゲルの弾性の効果を証明したが、バルクハイドロゲル相の他の多くの局面、例えば、マトリックスに結合した増殖因子またはそのペプチド模倣体の提示が、細胞により媒介される組織再生に影響を及ぼすために操作される。

実施例7：二成分アルギン酸から形成されたハイドロゲルの機械的特性およびインビトロ分解
20mg/mLの一定の密度の酸化型アルギン酸（5％の理論上の酸化度）と未修飾高M_Wアルギン酸との二成分組み合わせを架橋することにより形成されたバルクハイドロゲルの弾性率および分解が、図7Aおよび図7Bに示される。インビトロでの4日後の乾燥質量を、初期乾燥質量と比較することにより、分解を査定した。20mg/mL酸化型アルギン酸と7.5mg/mL未修飾アルギン酸との二成分混合物から形成されたポロゲンの直径は、図7Cに示される。ポロゲン直径は、アミノフルオレセイン標識アルギン酸から調製されたポロゲンの蛍光顕微鏡写真の処理により測定された。

他の態様
本発明を、その詳細な説明と共に記載したが、上記の説明は、本発明を例示するためのものであって、添付の特許請求の範囲の範囲により定義される本発明の範囲を制限するためのものではない。他の局面、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。

本明細書において言及された特許および科学文献は、当業者が利用可能な知識を確立する。本明細書に引用された米国特許および公開されたまたは未公開の米国特許出願は、全て、参照により組み入れられる。本明細書に引用された公開された外国特許および特許出願は、全て、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書に引用されたアクセッション番号により示されるGenbankおよびNCBIの寄託は、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書に引用されたその他の公開された参照、文書、原稿、および科学文献は、全て、参照により本明細書に組み入れられる。

本発明の好ましい態様を参照しながら、本発明を具体的に示し記載したが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱することなく、形態および詳細の様々な変化をそれらに施し得ることが、当業者には理解されるであろう。

Claims

犠牲ポロゲンハイドロゲルミクロビーズとバルクハイドロゲルとを含む複合組成物であって、投与の時点ではマクロ孔を欠いており、犠牲ポロゲンハイドロゲルミクロビーズが、対象に滞留後にその場所にマクロ孔のネットワークを残してバルクハイドロゲルより少なくとも10％速く分解し、
(ａ) 犠牲ポロゲンハイドロゲルミクロビーズが、酸化型アルギン酸を含む、
(ｂ) 犠牲ポロゲンハイドロゲルミクロビーズが、還元型アルギン酸を含む、または
(ｃ) 犠牲ポロゲンハイドロゲルミクロビーズが、バルクハイドロゲルより短い重合体を含む、
、複合組成物。
バルクハイドロゲルが犠牲ポロゲンハイドロゲルミクロビーズの周りに架橋されているか、また犠牲ポロゲンハイドロゲルミクロビーズがバルクハイドロゲルの中に物理的に捕捉されている、請求項1記載の複合組成物。
血管内皮増殖因子（VEGF）、酸性繊維芽細胞増殖因子（aFGF）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）、胎盤増殖因子（PIGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、レプチン、造血増殖因子（HGF）、VEGF受容体-1（VEGFR-1）、VEGFR-2、骨形成タンパク質（BMP）ファミリーのメンバー、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、FMS様チロシンキナーゼ3リガンド（Flt3リガンド）、肝細胞増殖因子、ストロマ由来因子1（SDF-1）、インスリン様増殖因子（IGF）、抗VEGF抗体、抗aFGF抗体、抗bFGF抗体、抗PIGF抗体、抗レプチン抗体、抗HGF抗体、抗VEGFR-1抗体、抗VEGFR-2抗体、抗PDGF抗体、抗BMP抗体、抗Flt3リガンド、抗IGF抗体からなる群より選択される生理活性因子をさらに含む、請求項1記載の複合組成物。
免疫細胞動員因子を含む、請求項1記載の複合組成物。
免疫細胞動員因子がケモカインを含む、請求項4記載の複合組成物。
ケモカインが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）を含む、請求項5記載の複合組成物。
犠牲ポロゲンハイドロゲルミクロビーズが20kPa〜60kPaの初期弾性率を含む、請求項1記載の複合組成物。
バルクハイドロゲルが、PHSRN、DGEA、またはRGDであるアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項1記載の複合組成物。
バルクハイドロゲルが、アルギン酸重合体鎖1本当たり2〜10ペプチドの密度のRGDペプチドを含む、請求項1記載の複合組成物。
バルクハイドロゲルが少なくとも40kPaの初期弾性率を含む、請求項1記載の複合組成物。
プログラム因子をさらに含む、請求項1記載の複合組成物。
プログラム因子が、凝縮オリゴヌクレオチドを含む、請求項11記載の複合組成物。
凝縮オリゴヌクレオチドが、CpGまたはプラスミドDNAを含む、請求項12記載の複合組成物。
腫瘍抗原をさらに含む、請求項1記載の複合組成物。
犠牲ポロゲンハイドロゲルミクロビーズが、前記複合組成物の全体積の少なくとも50％の密度または50％〜80％の密度で存在する、請求項1記載の複合組成物。
犠牲ポロゲンハイドロゲルミクロビーズとバルクハイドロゲルが生分解性である、請求項1記載の複合組成物。
マクロ孔が直径50μm、100μm、または400μmより大きい、請求項1記載の複合組成物。
マクロ孔が、直径20μmより大きい、請求項1記載の複合組成物。
犠牲ポロゲンハイドロゲルミクロビーズが、少なくとも40kPaの初期弾性率を含む、請求項1記載の複合組成物。
犠牲ポロゲンハイドロゲルミクロビーズが、複合組成物の最も小さな寸法の10％未満の直径を含む、請求項1記載の複合組成物。
ポロゲンハイドロゲルミクロビーズが、細胞をさらに含む、請求項1記載の複合組成物。
バルクハイドロゲルが、細胞をさらに含む、請求項1記載の複合組成物。
細胞が、幹細胞を含む、請求項21または22記載の複合組成物。
幹細胞が、間葉系幹細胞（MSC）である、請求項23記載の複合組成物。
細胞が、筋芽細胞、血管前駆細胞、誘導多能性細胞、または胚性幹細胞もしくは誘導多能性幹細胞に由来する分化細胞を含む、請求項22記載の複合組成物。
インビボで足場へ宿主細胞を動員するための、請求項1〜25のいずれか一項記載の複合組成物。
宿主細胞が、ポロゲンハイドロゲルミクロビーズの分解後にマクロ孔へ遊走する、請求項26記載の複合組成物。
宿主細胞がリンパ球または抗原提示細胞を含む、請求項26記載の複合組成物。
抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項28記載の複合組成物。
樹状細胞が、マクロ孔に動員され、抗腫瘍応答を誘発するために抗原提示樹状細胞により活性化されるようプログラムされる、請求項26記載の複合組成物。