KR101574506B1

KR101574506B1 - 체내 부피 유지 제제

Info

Publication number: KR101574506B1
Application number: KR1020140084220A
Authority: KR
Inventors: 이진호; 김태호; 오세행; 강성범
Original assignee: 한남대학교 산학협력단
Priority date: 2014-07-07
Filing date: 2014-07-07
Publication date: 2015-12-07

Abstract

본 발명은 구형의 미세입자 또는 생리활성물질이 도입된 구형의 미세입자에 세포를 도입시킨 체내 부피 유지 제제에 관한 것이다.
본 발명의 체내 주입제는 미세입자에 세포/생리활성물질을 탑재시킨 것으로, 근육세포의 증식과 분화에 효과적이고, 이를 주사 주입 시, 항문 주변부에 자리를 잡아 넓어진 항문관에 충진 효과를 주어 항문이 좁혀지는 부피유지 효과(bulking effect) 및 변실금의 근본적인 치료가 가능한, 손상된 항문 주변 조직의 재생을 유도하는 효과를 가진다.

Description

체내 부피 유지 제제{Bulking agent}

본 발명은 체내 부피 유지 제제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 체내에 도입된 제제가 수동적인 부피 유지 부여 효과(bulking effect)를 가지며, 상기 제제로부터 서서히 방출되는 생리활성물질 및 세포에 의해 주변의 손상된 조직 재생을 유도할 수 있는 체내 부피 유지 제제에 관한 것이다.

대변실금이란 사회적으로 인정될 수 없는 장소나 시간에 대변의 불수의적인 상실 문제를 일으키는 것으로 국제변실금학회에서 정의를 내리고 있다.

대변실금은 노인들이 요양기관에 입원하는 두 번째로 흔한 원인으로서 치매보다 많은 것으로 알려져 있다. 최근 국내의 연구를 보면, 우리나라 60세 이상 인구에서 15.5%가 대변실금을 갖고 있는 것으로 보고되고 있다. 대변실금은 대표적인 노인성 질환으로서 유병률이 연령의 증가와 밀접한 상관관계가 있음이 알려져 있으며, 최근 우리나라의 노령화 속도를 고려하면 향후 심각한 사회적 비용을 초래할 것으로 예상된다. 전 세계적으로 일반 인구에서의 대변실금 유병률이 2%에서 24%까지 보고되는 것을 고려하면, 국내 대변실금 환자는 약 400만명에 이를 것으로 추정된다.

이러한 대변실금은 고령, 요실금, 치매, 정신과적 질환, 분만 중 괄약근 손상, 만성 변비 등을 가진 인구에서 주로 발생되며, 당뇨, 파킨슨병, 중풍, 척수손상, 직장탈출증, 염증성 장질환, 방사선 관련 직장염, 선천성 항문기형 등의 질환도 대변실금을 유발하는 것으로 알려져 있다.

또한 항문질환의 수술 후 합병증으로도 발생될 수 있어서 치루수술의 27%, 치열수술 후 12%, 치핵 절제술 후 6%로 발생 빈도가 높으며, 최근 저위직장암에서 괄약근 보존수술이 증가하면서 수술 후에 78%까지 발생되었다고 보고된다. 일부 연구에서는 요양기관에 입원하는 노인환자의 30%가 일주일에 최소한 1회 이상의 대변실금을 경험한다고 전해지고 있다.

대변실금은 현대 의학이 해결하기 가장 어려운 난치질환의 하나이다. 국내 암환자의 50% 이상은 완치 가능한 반면, 대변실금을 위한 믿을 만한 치료법이 아직까지 전무한 상태이다. 대변실금은 항문직장의 해부생리에 영향을 미치는 항문괄약근, 신경계 이상을 비롯한 다양한 요소의 결과로 발생되기 때문에 치료가 쉽지 않다. 약물, 행동요법, 괄약근 성형술 등을 적절히 병합하여 치료하고 있으나 효과가 미미하고, 그에 대한 과학적 증거들이 불충분한 상태이다.

현재 말기 대변실금 환자의 치료는 천수신경자극술 등이 국내에서 극히 예외적인 경우에서 시행되는 상황이나 치료 효과가 시간에 따라 저하되고 치료기전 또한 명확하지 않다. 또한, 무선주파수 열에너지 치료, 인공괄약근 삽입술 등이 시도될 수 있으나 환자의 비용 부담이 크며, 치료효과가 분명치 않고 합병증이 높다. 결국, 사회적 활동이 많은 환자나 대변실금의 치료 요구가 많은 환자들은 결국 말기치료로서 복벽에 장루를 달고 평생을 살아야 하며, 관련 합병증을 피할 수 없다.

항문괄약근에 인공물질 등을 주사하여 괄약근의 두께를 증가시켜 괄약근의 압력을 개선하기 위한 연구는 1993년 이후 시도하여 왔으나, 현재까지 무작위 전향적 연구로 그 효과가 증명된 것은 없으며, 일관된 결과를 확인하지 못하였다.

이러한 주사제로는 실리콘(silicone), 실리콘계 물질(silicone-based agent), Bioplastique), 카본-코팅된 비드(carbon-coated beads, Acyst^TM), 카본-코팅된 지르코늄 옥사이드 비드(carbon-coated zirconium oxide beads, Durasphere), 자가 지방(autologous fat), 글루타르알데히드 가교된 콜라겐(glutaraldehyde cross-linked collagen, GAX), 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene, Polytef) 등이 약화된 항문괄약근에 주입되어 사용되고 있으나, 가격이 고가 (Durasphere제제의 경우 1 mL가 50만원 정도)일 뿐만 아니라, 주입된 재료의 다른 부분으로의 이동에 따른 추가적인 주입 및 재수술이 요구된다. 즉, 적용되는 재료는 단순히 항문용적을 증가시켜 치료효과를 얻고자 하는 기법으로 자체적인 수축력을 갖지 못하기 때문에 근본적인 항문기능의 회복은 기대하기 어렵다.

최근 근아세포 및 섬유아세포를 항문괄약근 또는 항문괄약근에 주입하여 대변실금 환자에서 임상적인 효과를 보았다는 보고가 있었다. 하지만, 세포 주입에 따른 항문괄약근 재생 및 치료기전의 구체적인 상관관계를 밝히지 못하고 있다.

한국특허 등록 10-0956415

H. Strasser et al., Lancet, 369, 2179 (2007); A. Frudinger et al., Gut, 59, 55 (2010)

이에 본 발명은 종래 대변실금을 포함하는 부피 유지 제제들이 가지는 여러 가지 문제들을 해결하기 위한 것으로서, 구형의 미세입자 또는 생리활성물질이 도입된 구형의 미세입자에 다양한 세포를 도입함으로써 체내의 부피 유지 효과는 물론 손상된 조직이나 근육의 재생이 가능한 체내 부피 유지 제제를 제공하는 데 그 목적이 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 체내 부피 유지 제제는 구형의 미세입자 표면에 세포를 도입시킨 것을 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 체내 부피 유지 제제는 구형의 미세입자의 표면에 생리활성물질과 세포를 도입시킨 것을 그 특징으로 한다.

상기 구형의 미세입자의 평균 입경은 25~500㎛인 것이 바람직하다.

본 발명에서 도입될 수 있는 세포는 근육세포, 배아줄기세포, 성체줄기세포, 유도만능줄기세포, 조직세포 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

상기 체내 부피 유지 제제는 전달체(delivery)에 분산시킨 것일 수 있다.

상기 전달체는 중량평균분자량 1,000 ~ 500,000 g/mol인 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱산 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱글리콜산 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리카프로락톤 공중합체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

상기 전달체(delivery)와 체내 부피 유지 제제는 1 : 0.1 ~ 1.5 부피비로 분산시키는 것일 수 있다.

상기 체내 부피 유지 제제는 주사 주입이 가능한 특징을 가진다.

상기 생리활성물질은 상기 구형의 미세입자의 표면에 헤파린을 도입시키고, 상기 헤파린에 포함된 음전하와 상기 생리활성물질에 포함된 양전하 간의 이온 결합으로 형성되는 것일 수 있다.

상기 생리활성물질은 fibroblast growth factors (FGFs), vascular endothelial growth factor (VEGF), nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF),Transforming growth factors (TGFs), Bone morphogenetic proteins (BMPs), Epidermal growth factor (EGF), Insulin-like growth factor (IGF), Platelet-derived growth factor (PDGF) 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 체내 부피 유지 제제를 변실금, 대변실금, 식도관 역류, 요실금 질환, 및 방광요관 역류로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 질환의 예방 또는 치료의 약제; 및 미용 성형 충진제로서 사용할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 구형의 미세입자에 다양한 세포를 도입시킴으로써 체내에서 손상된 주변 조직의 재생에 효과적이다.

또한, 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 생리활성물질이 도입된 구형의 미세입자에 세포를 도입함으로써, 고분자 입자에 의한 체내 부피 유지 효과와 상기 생리활성물질의 서방형 방출로 인한 도입된 세포의 증식 촉진 및 손상된 주변 조직의 재생을 유도하는 시너지 효과를 얻을 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 체내 부피 유지 제제는 대변실금, 요실금, 식도관 역류, 방광요관 역류, 및 미용 성형 충진제(보형물) 등을 포함하는 체내에서 부피 유지(형태 유지) 및 주변 조직의 재생이 필요한 다양한 용도에 적용 가능하다.

도 1은 PCL/Pluronic F127 고분자 입자의 표면에 헤파린과 생리활성물질이 결합되는 모식도 (A) 및 생리활성물질 탑재 고분자 입자에 근육세포가 도입된 모식도 (B)를 나타낸 것이다.
도 2는 불균일한 형태의 PCL 입자(A)와 온도감응성 매트릭스 내에 용융에 의해 형성된 구형의 PCL/Pluronic F127 미세입자(B)의 SEM 사진이다.
도 3은 헤파린의 도입 유무에 따른, PCL/Pluronic F127 고분자 입자 표면에 도입된 생리활성물질 (섬유아세포성장인자, 신경성장인자)의 양(A) 및 이들의 누적 방출량(B)을 나타낸 것이다.
도 4는 생리활성물질을 탑재한 PCL/Pluronic F127 미세입자(실시예 2, 3, 4)와 생리활성물질을 탑재하지 않은 PCL/Pluronic F127 미세입자(비교예 3)에서 in vitro 배양된 근육세포의 각 기간별 (0, 7, 14, 21 및 28일) DNA 총량을 나타낸 것이다.
도 5는 생리활성물질을 탑재한 PCL/Pluronic F127 미세입자(실시예 2, 3, 4)와 생리활성물질을 탑재하지 않은 PCL/Pluronic F127 미세입자(비교예 3) 내에서 in vitro 배양된 근육세포의 각 기간별 (0 및 28일) 특정 mRNA의 발현정도를 나타낸 것이다 (RT-PCR 분석, mRNA 발현은 GAPDH를 기준으로 표준화하여 나타내었음).
도 6은 생리활성물질을 탑재한 PCL/Pluronic F127 미세입자(실시예 2, 3, 4)와 생리활성물질을 탑재하지 않은 PCL/Pluronic F127 미세입자(비교예 3) 내에서 in vitro 배양된 근육세포의 각 기간별 (0 및 28일) Pax7, MHC 단백질 발현정도를 나타낸 것이다 (western blot 분석).
도 7은 PCL/Pluronic F127 미세입자로부터 서방형으로 방출되는 생리활성물질에 의해 근육세포의 myotube으로의 분화를 관찰하기 위한 confocal 현미경 사진이다 (파란색, 세포핵 (DAPI); 빨간색, Pax7, 초록색, MHC).
도 8은 hairless mouse의 등에 주사주입된 구형의 미세입자의 동물실험에 의한 균일한 초기 주입 및 일정기간 안정한 부피를 유지하는 결과를 보여주는 사진이다.
도 9는 괄약근 손상모델에 실시예 2와 비교예 4에 따른 체내 부피 유지 제제의 동물실험에 의한 조직염색 사진이다.

이하에서 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다.

본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위하여 사용되며, 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 다른 경우를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 경우 "포함한다(comprise)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급한 형상들, 숫자, 단계, 동작, 부재, 요소 및/또는 이들 그룹의 존재를 특정하는 것이며, 하나 이상의 다른 형상, 숫자, 동작, 부재, 요소 및/또는 그룹들의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아니다.

본 발명은 체내에 주입되어 부피 유지 효과를 나타낼 수 있는 체내 부피 유지 제제에 관한 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따른 체내 부피 유지 제제는 구형의 미세입자의 표면에 다양한 세포를 도입시킨 것일 수 있다. 즉, 구형의 미세입자를 제조하고, 상기 미세 입자의 표면에 세포를 도입시켜 사용할 수 있다.

상기 구형의 미세입자의 제조는 본 발명 출원인의 등록 특허(10-0956415, 고분자 구형입자의 제조방법)에 제시된 방법에 따라 수행될 수 있으며, 상기 특허의 모든 내용은 본 발명의 참조자료로 병합될 수 있으며, 본 발명에서는 그 상세한 설명을 생략한다.

본 발명에 다른 구형의 미세입자의 평균 입경은 작으면 작을수록 좋으나, 25㎛ 미만이 되면 입자가 혈관 속으로 들어가게 되는 문제가 있어서 바람직하지 못하다. 따라서, 본 발명에 다른 구형의 미세입자의 평균 입경은 25~500㎛가 바람직하다. 또한, 평균 입자 크기가 크면, 생리활성물질을 도입시키게 되는 경우 동일한 고분자 입자 무게에서 생리활성물질이 덜 붙게 되므로 조직재생 효과가 떨어질 수 있고, 체내 주입시 주변 조직에 상처가 날 수 있기 때문에 500㎛를 초과하지 않는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 체내 부피 유지 제제는 체내에 주사 주입되는 것이 바람직한 바, 이를 위해 주사주입이 가장 용이한 형태인 구형으로 존재하는 것이 체내 주입의 효율을 고려할 때 가장 양호하다고 할 수 있다.

본 발명에서는 상기 구형의 미세입자의 표면에 다양한 세포를 도입시킨다.

본 발명에서 사용되는 세포는 근육을 성장시키는 근육세포, 손상된 조직을 재생시킬 수 있는 배아줄기세포, 성체줄기세포, 유도만능줄기세포, 조직세포 등을 포함하는 의미이나, 상기 세포들에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서 구형의 미세입자 표면에 세포와 생리활성물질의 '도입'이라는 의미는, 구형의 미세입자 표면에 세포의 점착 (adhesion) 및 생리활성물질의 흡착(adsorption; specific 혹은 non-specific binding) 을 포함하는 것이다.

상기 세포들은 체내에 존재하는 해당 조직으로부터 효소 처리를 통해 획득된 세포를 의미하는 것으로, 상기 고분자 입자 표면에 도입된 후, 체내에 주입했을 경우 주변 조직들의 성장을 유도하는 역할을 수행한다.

상기 고분자 입자 표면으로 세포의 도입은 상기 고분자 입자와 세포를 혼합시킨 다음, 약 2~30시간 동안 약하게 흔들어주면서 수행될 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 체내 부피 유지 제제는 구형의 미세입자의 표면에 생리활성물질과 세포를 도입시킨 것일 수 있다. 이에 대한 상세 과정은 다음 도 1(B)을 참조할 수 있다. 도 1(B)에서의 세포의 일종으로 근육세포를 사용한 예를 제시하고 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

즉, 구형의 미세입자는 상기 언급한 바와 같이 본 발명 출원인의 등록 특허(10-0956415, 고분자 구형입자의 제조방법)에 제시된 방법에 따라 제조한 다음, 여기에 생리활성물질과 세포를 차례로 도입시킨다.

상기 구형의 미세입자의 평균 입경은 체내 주입, 및 생리활성물질 도입의 용이성 등을 고려하여 25~500㎛인 것이 바람직하고, 가장 바람직하기로는 100~200㎛인 것이다. 또한, 세포의 도입과 체내 주입을 고려하여 주사주입이 가장 용이한 구형의 형태를 가지는 것이 바람직하다.

또한, 생리활성물질의 도입은 먼저 상기 구형의 미세입자에 헤파린을 첨가하여 상기 고분자 입자 제조시 사용되고, 그 표면에 노출된 친수성 고분자의 이써 그룹(-O-)과 헤파린의 카르복실산 그룹 (-COOH) 간의 수소결합을 형성시킨다. 그 다음, 상기 헤파린에 포함된 음전하(-)와 상기 생리활성물질에 포함된 양전하(+) 간의 이온 결합을 통해서 상기 구형의 미세입자의 표면에 생리활성물질을 안정하게 도입시키게 된다.

본 발명에서 사용되는 ‘생리활성물질’은 체내의 세포, 조직(신경, 괄약근, 조직, 혈관 등을 포함) 및 장기의 기능을 증진 혹은 억제할 수 있는 물질을 의미하는 것으로, 대표적으로 성장인자, 호르몬, 단백질, 약물 등이 이에 포함된다.

본 발명의 생리활성물질로는 손상된 조직의 재생에 효과적이라고 알려진 fibroblast growth factors (FGFs), vascular endothelial growth factor (VEGF), nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), Transforming growth factors (TGFs), Bone morphogenetic proteins (BMPs), Epidermal growth factor (EGF), Insulin-like growth factor (IGF), 및 Platelet-derived growth factor (PDGF)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기와 같이 구형의 미세입자 표면에 생리활성물질을 도입시킨 다음, 세포를 도입시키는 과정을 거친다.

상기 세포는 체내에 존재하는 근육조직으로부터 효소 처리를 통해 획득된 세포를 의미하는 것으로, 상기 고분자 입자 표면에 도입된 후, 체내에 주입했을 경우 주변 근육의 성장을 유도하는 역할을 수행한다.

세포의 도입은 상기 생리활성물질이 도입된 고분자 입자와 세포를 혼합시킨 다음, 약 2~30시간 동안 약하게 흔들어주면서 수행될 수 있다. 따라서, 생리활성물질이 도입된 고분자 입자에 세포를 도입시키는 경우, 상기 세포는 상기 구형의 미세입자의 표면과 상기 생리활성물질 모두에 탑재될 수 있다.

따라서, 본 발명의 세포와 생리활성물질이 모두 도입된 구형의 미세입자를 이용한 체내 부피 유지 제제는 상기 생리활성물질의 서방형 방출이 가능하므로 변실금을 유발시키는 항문주변의 손상된 조직의 재생에 매우 효과적이고, 도입된 세포가 손상된 근육을 재생시키는 시너지 효과를 발휘할 수 있다.

상기 과정을 거쳐 제조된 본 발명에 따른 체내 부피 유지 제제는 원하는 목표 지점으로의 전달을 용이하게 할 수 있도록 전달체(delivery)에 분산시켜 사용하는 것이 바람직하다.

즉, 상기 제조된 체내 부피 유지 제제는 입자 상태를 가지는 것이므로, 그 입자 크기를 최적화시켰다 하더라도 체내 주입이 용이하지 않을 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 적절한 전달체에 분산시켜 사용한다.

상기 전달체는 중량평균분자량 1,000 ~ 500,000 g/mol인 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱산 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱글리콜산 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리카프로락톤 공중합체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 이 중에서 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 공중합체가 가장 바람직하게 사용될 수 있다.

상기 제조된 체내 부피 유지 제제를 분산시키기 위하여 상기 전달체는 물에 용해된 수용액 상태를 가지는 것이 바람직하며, 이때 상기 전달체의 농도는 1~50중량%가 바람직하다. 상기 범위를 벗어나 1중량% 미만인 경우 점도가 너무 낮아 미세입자가 바닥면으로 몰리거나 (미세입자의 불균일한 혼합) 체내 부피 유지 제제를 체내 주사주입 시 미세입자가 주사바늘에 걸리는 문제가 있고, 또한 50중량%를 초과하는 경우 점도가 너무 높아 미세입자와 균일한 혼합이 어려운 문제가 있어 바람직하지 못하다.

또한, 상기 전달체(delivery)와 체내 부피 유지 제제는 1 : 0.1 ~ 1.5 부피비로 분산되는 것이 바람직한데, 이는 적절한 점도를 유지하여 본 발명에 따른 상기 체내 부피 유지 제제가 주사 주입이 가능하도록 하기 위함이다. 그러나, 본 발명에 따른 상기 체내 부피 유지 제제는 주사 주입제인 것이 가장 바람직하나, 수술적인 방법을 통해 도입하는 것도 가능하다.

본 발명에 따라 제조된 구형의 미세입자 표면에 세포를 도입시킨 체내 부피 유지 제제 및 구형의 미세입자의 표면에 생리활성물질과 세포를 도입시킨 체내 부피 유지 제제를 체내 주입시 상기 생리활성물질은 ~ 60일 동안 서방형 방출을 나타내는 특징을 가진다.

따라서, 본 발명에 따른 체내 부피 유지 제제는 변실금, 대변실금, 식도관 역류, 요실금 질환, 및 방광요관 역류로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 질환의 예방 또는 치료의 약제; 및 미용 성형 충진제 등 체내에 주입되어 부피 유지 효과(bulking effect)를 발휘할 수 있는 다양한 용도에 사용 가능하며, 상기 열거된 질환들은 그 예시일 뿐, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 변실금 질환은 고령, 요실금, 치매, 정신과적 질환, 분만 중 괄약근 손상, 암 제거 수술에 의한 괄약근 손상, 만성 변비 등을 가진 인구에서 주로 발생되며, 당뇨, 파킨슨병, 중풍, 척수손상, 직장탈출증 이나, 염증성 장질환, 방사선 관련 직장염, 선천성 항문기형으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

이상에서 설명한 본 발명에 따른 체내 부피 유지 제제를 이하의 실시예에 의해 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다. 본 발명의 실시예들은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위하여 제공되는 것이며, 하기 실시예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 오히려, 이들 실시예는 본 개시를 더욱 충실하고 완전하게 하고, 당업자에게 본 발명의 사상을 완전하게 전달하기 위하여 제공되는 것이다.

실시예 1

1. 구형의 미세입자 제조

폴리카프로락톤(PCL, Mw : 43,000~50,000Da, 녹는점: ~ 60℃, Polysciences, Inc, USA)을 Freezer mill (SPEX 6750, CentiPrep Inc, USA)을 이용하여 마이크로 단위의 입자로 분쇄한 후, 이를 미세입자 분리용 체(micro sieve)를 이용하여 크기별로 분리된 불균일한 형태를 가지는 고분자 입자를 얻었다.

폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 공중합체(Pluronic F127, Mw : 12,500 Da, Sigma, USA) 17.5 중량%의 수용액을 제조하였다. 상기 PCL 고분자 입자:Pluronic 공중합체 수용액을 1 : 50 중량비로 혼합하고, 4℃에서 분산시켜서 고분자 입자가 고르게 분산된 졸 상의 고분자 매트릭스 수용액을 제조하였다. 상기 졸 상의 고분자 매트릭스 수용액을 상온(25℃)에서 1시간 동안 방치시켜 겔 상태로 유도시켰다.

또한, 상기 PCL 고분자 입자가 분산된 겔 상의 고분자 매트릭스 수용액을 PCL 고분자 입자의 용융점 이상의 온도인 63℃로 예열된 항온조에서 1시간 동안 방치시켰다. 이 경우, 상기 PCL 고분자 입자들이 겔상의 Pluronic F127 내부에서 용융과 동시에 주변 입자와의 접촉없이 열역학적으로 안정한 구형으로 변하게 된다. 또한, Pluronic F127이 용융된 PCL 미세입자 표면에 anchoring [Pluronic F127의 hydrophobic site (PPO)와 PCL 간의 hydrophobic interaction]되어 PCL/Pluronic F127 미세입자를 형성하게 된다.

상기 용융 및 구형화 과정 후, 상기 겔 상의 고분자 매트릭스 수용액을 1시간 동안 상온에서 식히고, 4℃에서 겔 상의 고분자 매트릭스를 다시 졸화시켰다. 상기 졸 상의 고분자 매트릭스 수용액을 원심분리 (1,000 rpm)시켜 상층액은 제거하고 이를 건조하여 구형의 PCL/Pluronic F127 미세입자를 제조하였다.

2. 세포의 도입

상기 제조된 구형의 PCL/Pluronic F127 미세입자의 표면에 근육세포를 도입시키기 위하여, 상기 구형의 PCL/Pluronic F127 미세입자 중 100 ~ 200㎛ 크기를 가지는 입자를 입자 분리용 체를 이용하여 분리하였다.

상기 분리된 입자 10mg에 1.0 x 10⁷cells/mL의 세포 현탁액을 균일하게 혼합시키고, 24 시간동안 약하게 흔들어주면서 seeding 하였다. 초기 도입된 세포의 약 20%가 상기 PCL/Pluronic F127 미세입자에 안정하게 도입된 것을 확인하였다.

3. 체내 부피 유지 제제 제조

상기 구형의 미세입자와 이의 전달을 위한 전달체인 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 공중합체(Pluronic F127, Mw : 12,500 Da, 25 중량%의 농도)를 1 : 1 중량비로 혼합하여, Pluronic F127에 상기 구형의 미세입자가 고르게 분산된 체내 부피 유지 제제를 제조하였다.

실시예 2

1. 구형의 미세입자 제조

상기 과정은 실시예 1의 과정을 동일하게 진행하였다.

2. 구형의 미세입자에 생리활성물질의 도입

상기 실시예 1의 1)에서 제조된 구형의 PCL/Pluronic F127 미세입자를 1mg/mL (in 2wt% NaCl 수용액)의 헤파린 용액에 4℃, 3시간 동안 침지시켜 헤파린을 도입시켰다. 그 다음, 상기 고분자 입자를 2 wt% NaCl 수용액으로 완전히 세척, 동결 건조시켜 그 표면에 헤파린이 도입된 구형의 미세입자를 제조하였다.

상기 헤파린이 도입된 구형의 PCL/Pluronic F127 미세입자에 bFGF(섬유아세포성장인자)이 200ng/mL 농도로 PBS에 용해된 생리활성물질 수용액을 0.2mL 떨어뜨린 후, 3시간 동안 방치시켜, 헤파린이 도입된 구형의 PCL/Pluronic F127 미세입자에 bFGF(생리활성물질)를 도입시켰다.

3. 근육세포의 도입 및 체내 부피 유지 제제 제조

상기 생리활성물질이 도입된 구형의 PCL/Pluronic F127 미세입자에 근육세포 도입 과정, 및 전달체 분산 과정은 상기 실시예 1과 동일한 과정을 거쳐 체내 부피 유지 제제를 제조하였다.

실시예 3

헤파린이 도입된 PCL/Pluronic F127 미세입자에 생리활성물질로서 NGF(신경성장인자)를 도입시킨 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 과정으로 체내 부피 유지 제제를 제조하였다.

실시예 4

실시예 2와 3에서 제조된 체내 부피 유지 제제를 5:5의 중량비로 혼합하여, 체내 부피 유지 제제를 제조하였다. 즉, 실시예 4에 따른 체내 부피 유지 제제는 생리활성물질로서 bFGF와 NGF가 5:5로 혼합된 것이다.

실시예 5

생분해성 고분자로서 폴리카프로락톤 대신에 폴리락틱산(Mw : 110,000 Da)을 사용하여 구형의 폴리락틱산/Pluronic F127 미세입자를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 과정으로 체내 부피 유지 제제를 제조하였다.

실시예 6

생분해성 고분자로서 폴리카프로락톤 대신에 폴리글리콜산(Mw : 80,000 Da)을 사용하여 구형의 폴리글리콜산/Pluronic F127 미세입자를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 과정으로 체내 부피 유지 제제를 제조하였다.

실시예 7

생분해성 고분자로서 폴리카프로락톤 대신에 폴리다이옥산온(Mw : 100,000 Da)을 사용하여 구형의 폴리다이옥산온/Pluronic F127 미세입자를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 과정으로 체내 부피 유지 제제를 제조하였다.

실시예 8

생분해성 고분자로서 폴리카프로락톤 대신에 폴리락틱산-글리콜산 공중합체 (Mw : 80,000 Da)을 사용하여 구형의 폴리락틱산-글리콜산 공중합체/Pluronic F127 미세입자를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 과정으로 체내 부피 유지 제제를 제조하였다.

비교예 1~2

상기 실시예 2와 3에서, 헤파린을 도입시키는 과정 없이, 상기 PCL/Fluronic F127 미세입자에 생리활성물질을 직접 도입시킨 체내 부피 유지 제제를 제조하였다.

비교예 3

상기 실시예 2에서, 구형의 PCL/Fluronic F127 미세입자에 헤파린과 생리활성물질을 도입시키고, 근육세포를 도입시키지 않은 체내 부피 유지 제제를 제조하였다.(도 1(A) 구조 참조)

실험예 1 : 고분자 입자의 형태 관찰

상기 실시예 1~3에 따른 미세입자의 형태를 확인하였다. 구형화 전의 불균일한 형태 및 구형화 후 구형의 미세입자의 형태를 주사전자현미경(SEM; Model S-3000N, Hitachi, Japan)으로 관찰하였으며, 그 결과를 다음 도 2에 나타내었다.

다음 도 2에서와 같이, 본 발명에 따른 미세입자는 불규칙한 형태의 PCL 입자들(crushed PCL particles; A)을 졸-겔 상전이법, 및 재졸화 과정을 통하여 구형의 구조 (B)로 변화된 것을 알 수 있다. 또한, 이들의 평균 직경은 25 ~ 500㎛범위를 가지는 것을 확인하였다.

실험예 2 : 헤파린 포함에 따른 생리활성물질 도입 효과 확인

헤파린 포함 여부에 따라 PCL/Pluronic F127 미세입자에 탑재된 생리활성물질(실시예2-bFGF, 실시예3-NGF)의 정량분석은 상기 생리활성물질이 탑재된 고분자 입자를 phosphate buffered saline (PBS pH ~7.4)로 3회 세척한 후, 탑재된 생리활성물질의 함량을 ELISA kit을 이용하여 정량하였으며, 그 결과를 다음 도 3(A)에 나타내었다.

또한, 상기 구형의 미세입자에 도입된 생리활성물질의 시간에 따른 방출거동 분석을 위해, 10 mg의 미세입자를 1mL의 완충용액 (0.1 wt% BSA를 포함한 PBS)에 함침시킨 후, 37˚C, 50rpm의 속도로 회전하는 항온조에 일정시간 (28일 이상) 보관하였다. 정해진 시간마다 전체 완충용액을 조심스럽게 채취하고 다시 새로운 완충용액을 교환해 주는 방법으로 시료를 채취하였으며, 얻어진 완충용액으로부터 용출된 생리활성물질의 양을 ELISA kit (R&D System)을 이용하여 분석하였으며, 그 결과를 다음 도 3(B)에 나타내었다.

다음 도 3(A)은 PCL/Pluronic F127 미세입자 내 생리활성물질 [신경성장인자 (NGF), 섬유아세포성장인자 (bFGF)]의 도입량을 나타낸 것이다[신경성장인자 (- 헤파린), 1.18 ± 0.18 ng/mg; 신경성장인자 (+ 헤파린), 3.85 ± 0.63 ng/mg; 섬유아세포성장인자 (- 헤파린); 1.48 ± 0.15 ng/mg, 섬유아세포성장인자 (+ 헤파린), 4.50 ± 0.80 ng/mg)]. 이를 참조하면, 본 발명에 따른 헤파린이 도입된 미세입자 (+ 헤파린, 실시예 2, 3)의 경우, 헤파린이 도입되지 않은 미세 입자 (- 헤파린, 비교예 1, 비교예 2)에 비해 생리활성물질의 도입량이 그 종류에 상관없이 모두 더 높은 값을 나타냄을 확인할 수 있었다. 이는 상세한 설명에서 설명한 바와 같이, 헤파린의 음전하와 생리활성물질의 양전하 간의 이온결합에 의한 결과라고 할 수 있다.

또한, 생리활성물질의 방출특성을 측정한 다음 도 3(B)를 참조하면, 헤파린이 도입된 고분자 입자(실시예 2, 3)는 생리활성물질의 초기 burst 방출이 현저하지 않았으며, 28일에 걸쳐 생리활성물질이 서방형으로 방출되고 있음을 확인할 수 있었으나, 헤파린이 도입되지 않은 고분자 입자(비교예 1, 2)의 경우 초기 7일 동안 대부분의 생리활성물질이 초기 burst 방출되는 것을 알 수 있었다.

실험예 3 : 생리활성물질 탑재 여부에 따른 고분자 입자에서의 in vitro 근육세포 배양

생리활성물질 탑재 여부에 따라 근육세포의 myotube으로의 분화여부를 확인하는 in vitro 세포 배양 실험을 수행하였다. 근육세포는 손상된 항문 주변에 많이 존재하는 줄기세포로써, 서방형으로 방출되는 생리활성물질에 의한 이들의 특정세포로의 분화 및 특정 조직의 재생 가능성을 예측할 수 있다. 먼저, 서방형으로 방출되는 생리활성물질에 의한 근육세포의 근육 조직으로의 분화 여부를 확인하였다. 세포 배양 실험을 위한 모델 세포로 근육세포를 사용하였는데, 이의 분리 및 동정은 4-6주된 흰쥐의 가자미 근에서 전플라스크 방법 (preplate method)을 이용하였다. 섬유아세포성장인자, 신경성장인자 및 섬유아세포성장인자와 신경성장인자가 혼합 탑재된 PCL/Pluronic F127 입자(실시예 2, 3, 4)에서 배양된 근육세포의 증식 myotube로의 분화 거동을 생리활성물질이 탑재되지 않은 동일한 입자(실시예 1)와 비교분석하였다 [PCL/F127 입자 (미세입자), 섬유아세포성장인자 탑재 PCL/F127 입자 (섬유아세포성장인자), 신경성장인자 탑재 PCL/F127 입자 (신경성장인자), 섬유아세포성장인자/신경성장인자 탑재 PCL/F127 입자 (2종의 성장인자)].

근육세포의 고분자 입자 (생리활성물질 탑재 및 비탑재: 10mg) 내로의 균일한 도입을 위해, 상기 미세 입자들을 1mL 세포 현탁액(세포 밀도, 1.0x10⁷ cells/ml)으로 채워진 주사기에 침지시켰으며, 상기 미세 입자에 세포가 부착되도록 37℃에서 24 시간동안 약하게 흔들어주었으며, 이를 새로운 24-well 배양용기로 이동, 배양액의 추가 과정을 거친 후, 일정기간 37 ℃의 5% CO₂ 인큐베이터에서 28일동안 배양하였다 (mild shaking, 50 rpm). 세포 배양액은 3일에 한번씩 교환하여 주었으며, 시간에 따른 세포의 증식을 DNA content 분석을 통해 확인하였으며, 그 결과를 다음 도 4에 나타내었다.

다음 도 4를 참조하면, 먼저 초기 도입된 세포의 약 20%가 고분자 입자에 안정하게 도입되었음을 확인하였다. 또한, 생리활성물질이 세포의 증식을 촉진시킴을 확인할 수 있었으나(실시예 2~4), 성장인자의 종류에 따른 세포증식의 유의한 차이는 확인할 수 없었다. 이는 생리활성물질이 세포의 이동/생존/성장을 강화시키고 세포의 자가사멸 (apoptosis)을 억제시키기 때문인 것으로 보인다.

또한, 생리활성물질이 도입되지 않은 실시예 1은 실시예 2~4의 효과에는 못미치나 세포의 생존/증식을 위한 적절한 환경을 제공하고 있음도 알 수 있다.

실험예 4 : Quantitative PCR 분석

미세 입자에 도입된 근육세포의 myotube 세포로의 분화 여부를 관찰하기 위해 myotube 세포의 특이적 표지인자로 알려진 MyF5, Pax7, MyoG, MHC를 이용한 PCR 분석을 수행하였으며, 그 결과를 다음 도 5에 나타내었다.

도 5를 참조하면, 생리활성물질을 탑재하지 않은 그룹(실시예 1)에 비해 생리활성물질을 도입시킨 그룹 (실시예 2, 3, 4)에서, 표지인자의 종류에 상관없이 높은 유전자 발현 결과, 즉, 미세입자로부터 서방형으로 방출되는 생리활성물질이 근육세포의 myotube 세포로의 분화에 좋은 환경을 제공하고 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 5 : Western blot

미세 입자에 도입된 근육세포의 myotube으로의 분화거동을 보다 구체적이고 객관적으로 분석해 보기 위해 myotube 세포의 특이적 표지인자로 알려진 Pax7, MHC를 이용한 western blot 분석을 수행하였으며, 그 결과를 다음 도 6에 나타내었다.

도 6을 참조하면, 세포 배양시간이 증가함에 따라 Pax7, MHC 발현이 점점 증가하는 것을 알 수 있으며, 특히 섬유아세포성장인자/신경성장인자가 탑재된 PCL/Pluronic F127 미세입자(실시예 4)에서 가장 높은 MHC 발현, 즉, 가장 우수한 myotube으로의 분화유도를 확인할 수 있었다.

실험예 6 : 면역형광염색법( Immunohistochemistry )

면역형광염색법을 통해 근육세포의 myotube으로의 분화를 시각적으로 분석하였다. myotube 세포에 특이적으로 결합하는 Pax7, MHC 항체 (antibody)를 배양 중인 세포(실시예 1~4)에 적용한 후, 현미경장비를 이용하여 결과를 분석하였으며, 그 결과를 다음 도 7에 나타내었다.

도 7을 참조하면, 모든 미세입자에서 세포들(파란색, 세포핵)이 매우 고르게 분포된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 세포배양 7일째, 모든 입자 그룹에서 Pax7 발현(빨간색)이 약하게 나타나고, 그 후 MHC 발현(초록색)이 세포배양 28일까지 점차적으로 증가되는 것을 알 수 있다. 특히, 2종의 성장인자를 혼합 도입된 그룹(실시예 4)에서 가장 높은 MHC의 발현, 즉, myotube로의 유도가 가장 우수함을 관찰할 수 있었다.

실험예 7 : 체내 부피 유지 효과 평가 ( in vivo )

근육세포/생리활성물질 탑재 고분자 입자의 체내 부피유지능을 평가하기 위해 동물실험이 진행되었다. 동물모델로는 털이 없으며 피부층이 얇아 피하에 주입된 재료의 부피변화를 손쉽게 관찰할 수 있는 hairless mouse (20~30 g)가 선정하여 수행되었다. 균일하게 혼합되어 있는 PCL 입자/Pluronic F127 혼합액 [PCL/Pluronic F127 용액, 1/1.2 (w/v); PCL/Pluronic F127 입자 (미세입자), 섬유아세포성장인자 탑재 PCL/Pluronic F127 입자 (섬유아세포성장인자), 신경성장인자 탑재 PCL/Pluronic F127 입자 (신경성장인자), 섬유아세포성장인자/신경성장인자 탑재 PCL/Pluronic F127 입자 (2종의 성장인자)]를 주사바늘을 통해 hairless mouse의 등에 주사 주입 하였다 (0.1 mL/mouse). 고분자 입자는 (100 ~ 200 ㎛) ethylene oxide (EO) 가스 멸균 후에 주사 주입 하였다. 동물실험을 진행하여 4주 동안 시간에 따른 부피변화를 관찰하였으며, 그 결과를 다음 도 8에 나타내었다.

다음 도 8을 참조하면, 모든 군에서 피하에 도입된 미세입자가 4주 동안 체내에서 이동 없이 존재하며 초기 부피를 안정하게 유지함을 확인할 수 있었다.

실험예 8 : 체내 조직 재생 유도능 평가 ( in vivo )

생리활성물질/근육세포 탑재 미세입자의 대변실금 치료 효능 평가를 위한 동물실험이 수행되었다. 이를 위해 괄약근 제거를 통해 개발된 대변실금 동물모델 (잡종견)의 항문괄약근 부위에 근육세포, 섬유아세포성장인자 탑재 고분자 구형입자(비교예 3), 섬유아세포성장인자/근육세포 탑재 구형입자(실시예 2)를 주사 주입하였으며, 시술 후 3개월째 도입된 근육세포의 생존 및 주변 괄약근의 재생 유도능을 평가하였고 그 결과를 다음 도 9에 나타내었다.

도 9를 참조하면, 최초 도입된 근육세포[빨간색; 어떠한 매트릭스 없이 세포 현탁액 (6 x 10⁷ cells)만을 주입] 대부분이 도입 부위로부터 사라짐을 관찰 할 수 있었으나, 섬유아세포성장인자/근육세포 탑재 구형입자(실시예 2)에서는 구형입자의 매트릭스 역할에 의해 세포가 도입된 위치에 안정하게 존재할 뿐 만 아니라, 손상된 주변 근육(초록색)의 재생을 유도함을 확인할 수 있었다.

아울러, 섬유아세포성장인자 미세입자(비교예 3)의 경우에도 주변 근육조직의 재생을 유도함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 구형입자 도입의 매트릭스 역할에 의한 세포의 이동억제 및 서방형으로 방출되는 생리활성물질에 의한, 도입된 근육세포의 활성 및 주변 세포/조직의 재생 촉진에 의한 결과라 판단된다.

Claims

구형의 비다공성 미세입자 표면에 생리활성물질로서 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF)와 근육세포, 배아줄기세포, 성체줄기세포, 유도만능줄기세포, 조직세포 중에서 선택되는 어느 하나의 세포를 도입시킨 구형의 비다공성 미세입자; 및
구형의 비다공성 미세입자 표면에 생리활성물질로서 신경 성장인자(nerve growth factor, NGF)와 근육세포, 배아줄기세포, 성체줄기세포, 유도만능줄기세포, 조직세포 중에서 선택되는 어느 하나의 세포를 도입시킨 구형의 비다공성 미세입자를
혼합하여 2종의 생리활성물질을 포함하는 구성으로 된 것을 특징으로 하는 대변실금용 체내 부피 유지 제제.
삭제
제1항에 있어서,
상기 구형의 비다공성 미세입자의 평균 직경은 25 ~ 500㎛인 것인 대변실금용 체내 부피 유지 제제.
삭제
제1항에 있어서,
상기 체내 부피 유지 제제는 전달체(delivery)에 분산시킨 것인 대변실금용 체내 부피 유지 제제.
제5항에 있어서,
상기 전달체는 중량평균분자량 1,000 ~ 500,000 g/mol인 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱산 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리락틱글리콜산 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리카프로락톤 공중합체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인 것인 대변실금용 체내 부피 유지 제제.
제5항에 있어서,
상기 전달체(delivery)와 체내 부피 유지 제제는 1 : 0.1 ~ 1.5의 부피비로 분산시키는 것인 대변실금용 체내 부피 유지 제제.
제1항에 있어서,
상기 체내 부피 유지 제제는 주사 주입이 가능한 것인 대변실금용 체내 부피 유지 제제.
제1항에 있어서,
상기 생리활성물질은 상기 구형의 비다공성 미세입자의 표면에 헤파린을 도입시키고, 상기 헤파린에 포함된 음전하와 상기 생리활성물질에 포함된 양전하 간의 이온 결합으로 형성되는 것인 대변실금용 체내 부피 유지 제제.
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