KR102189850B1 - 생리활성인자가 탑재된 고분자-세포 혼합 스페로이드 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생리활성인자가 흡착된 낙엽적층형 다공성 고분자 미세입자를 이용한 생리활성인자들이 탑재된 고분자-세포 혼합 스페로이드, 이의 제조방법 및 이를 다양한 용도에 이용하는 사용방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 독특한 구조를 가지는 낙엽 적층형 다공성 고분자 미세입자에 생리활성인자를 흡착시키고, 생리활성인자가 흡착된 낙엽적층형 다공성 고분자 미세입자를 세포와 혼합시킨 고분자-세포 혼합 스페로이드를 제조할 수 있으며, 상기 고분자에 탑재된 생리활성인자는 스페로이드로부터 서방형 방출되어 손상된 부위에서 세포의 분화 및 재생을 촉진시키는 효과를 가진다.

Description

생리활성인자가 탑재된 고분자-세포 혼합 스페로이드 및 이의 제조방법{Bioactive molecules-loaded polymer-cell mixed spheroid, and method for preparing thereof}
본 발명은 생리활성인자가 탑재된 고분자-세포 혼합 스페로이드, 이의 제조방법 및 이를 다양한 용도에 사용하는 방법에 관한 것이다.
최근 건강 및 삶의 질에 대한 관심이 높아짐에 따라 스키, 스케이트, 자전거와 같은 레저 및 스포츠 활동이 급격히 증가되고 있으며, 이에 따른 구강악안면에서의 외상 발생 빈도도 함께 높아지고 있다. 뿐만 아니라 구순구개열 등의 선천기형, 교통사고, 폭행 및 산업재해로 인한 외상, 그리고 종양 적출술 후 심각한 악골결손을 가진 환자들을 임상에서 만날 수 있다.
이러한 환자들은 얼굴의 추형으로 인한 심미적 및 심리적 측면에서 위축될 뿐만 아니라, 구강악안면 외상으로 인한 통증/불편함, 저작/언어/표현 기능의 장애 등으로 인해 사회에서 도태되는 심각한 사회적 문제를 야기시키고 있다.
상기의 문제를 해결하기 위해 뼈 이식술이나 뼈 신장술이 가장 보편화된 치료법으로 적용되고 있다. 구강 악안면부의 외상 재건을 위해 자가골이나 특수 처리된 동종골을 이용한 이식술, 결손된 부위에 신체의 다른 부위 조직을 떼어 돌려 붙이는 재건술, 인공매식체를 이용한 재건술 등의 방법을 이용하고 있다.
이 중에서 골 이식술은 자가골 또는 동종골 및 합성골이 주로 이용되며, 자가골은 골 생착이 우수한 반면 공여부의 수술이 필요하고 감염 등의 위험이 존재하는 단점이 있다. 또한, 합성골이나 동종골은 골채취를 위한 이차적인 수술이 필요없는 장점이 있지만, 골생착에 느리고 이식부위의 크기에 한계가 있다. 골 신장술은 비교적 큰 결손부위도 재생할 수 있지만, 장시간에 걸쳐 환자에게 불편을 야기하고 신생골의 양과 모양을 조절하기 힘든 단점이 있다.
최근에는, 상기와 같은 단점을 손쉽게 해결할 수 있는, 골 재생 촉진을 촉진할 수 있는 단백질 기반의 성장인자인 bone morphogenetic proteins [BMPs; BMP-2 혹은 BMP-7]를 이용한 연구가 지속되고 있고, 실제로 Infuse (Medtronics, Inc.)와 OP-1 putty (Stryker)가 상용화되어 임상에 사용되고 있다.
하지만, 사용된 성장인자인 BMP가 단순히 콜라겐 기반의 매트릭스에 적셔진 상태로 사용하게 되고, 골 재생을 촉진하기 위해 과량의 BMP들이 사용되고 있기 때문에 과량의 BMP들이 매우 빠른 속도로 방출되어(burst release), 세포/조직의 손상가능성, 원치 않는 부위에서의 골 형성, 암 조직의 형성 및 환자들의 상당한 경제적 부담 등이 임상적용을 위한 huddle로 생각되고 있다.
대부분의 임상의 및 연구자들은 사용된 성장인자인 BMP가 서방형으로 방출되는 시스템이 개발된다면 상기의 문제는 쉽게 해결될 수 있을 뿐만 아니라 보다 효과적인 골 재생을 위해 임상에서 폭넓게 사용될 수 있을 것으로 기대하고 있으나, 아직 이를 만족할만한 연구 결과는 없는 실정이다.
이를 위해 소수성 상호작용(hydrophobic interactions), 수소 결합(hydrogen bonding), 정전기적 인력(electrostatic attraction), 헤파린-기반의(heparin-mediated) 혹은 효소-기반의 결합(enzyme-mediated binding), 플라즈마 처리, 하이드로겔/리포좀/고형의 재료에 봉입(encapsulation) 등 수많은 기법들이 적용되어 임상적용 가능성을 타진하고 있으나, 제조과정에서 사용되는 유기용매 자체 혹은 고분자 용액과의 혼합 과정에서 발생되는 성장인자의 3차원 구조 붕괴 (성장인자의 활성이 사라져 버림), 표면개질에 사용되는 독성 화합물 (용매, 가교제 등)의 잔류 등으로 인해 식약처 승인을 통한 실제 임상 적용은 매우 요원한 것으로 알려져 있다.
단백질 기반의 성장인자는 체내에서 안정성이 좋지 못해 빠른 시간 내에 활성을 잃어버려 이들이 가지고 있는 우수한 특성을 체내에서 발현시키기에는 엄연한 한계가 존재한다.
이를 해결하기 위해 기존연구에서는 생분해성 고분자에 성장인자를 봉합(encapsulation)하는 방법 (고분자 용액과 성장인자의 단순 혼합 및 건조를 통한 제형 제조) 및 고분자 매트릭스의 표면에 성장인자와 특정결합(specific interaction)을 할 수 있는 작용기를 도입 혹은 성장인자와 표면 간의 공유결합을 유도하는 표면개질법이 사용되고 있다.
하지만, 제조과정에서 사용되는 유기용매에 의한 성장인자의 변성 (denaturation), 고분자 용액과의 혼합시 불가피한 물리적 힘 (stirring 등)에 의한 성장인자의 3차 구조 파괴 (단백질의 경우, 3차 구조는 곧 생물학적 특성을 의미), medical grade polymer의 화학구조 개질 (더 이상 medical grade polymer가 아님. 즉, 인체 사용을 위한 매우 어려운 허가를 식약처로부터 다시 받아야함.), 표면개질에 사용되는 독성 화합물 [1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS) 등) 혹은 환자에 따라 그 사용이 제한적인 헤파린의 잔류는 식약처 승인을 통한 인체적용에 커다란 걸림돌로 작용하고 있다.
따라서, 수많은 연구자들의 열정적인 연구에도 불구하고 성장인자의 서방형 방출이 가능한 시스템의 인체 적용예는 거의 전무한 실정이다.
한편, 세포를 이용한 초기의 연구에서는 골조직을 재생시키기 위해 골을 구성하고 있는 골아세포 (osteoblasts) 및 골세포 (osteocytes)가 고려되었으나, 이 세포들의 순수한 분리정제가 어려우며, 이미 성숙한 세포로서 골조직 재생에 도움이 되지 않다고 알려져 골전구세포 (osteoprogenitor cells) 혹은 줄기세포 (stem cells)를 이용한 연구가 활발히 진행되고 있다.
골 재건을 위해 세포를 단독으로 사용하는 경우, 세포가 도입된 부위에 생착하지 못하고 괴사되거나, 다른 부위로 이동(migration)되므로 세포의 생착/생존을 유도할 수 있는 스캐폴드(scaffold)와 세포를 함께 사용하는 경우가 대부분이다.
또한, 골전구세포 혹은 줄기세포를 이용하여 손상된 골조직을 재건하기 위해서는, 골전구세포 혹은 줄기세포를 골세포로 효과적으로 분화시키는 것이 매우 중요하다.
따라서, 골전구세포 혹은 줄기세포를 골손상 부위에서 안정적으로 생존시키고, 골 세포로의 분화를 유도할 수 있는 bioactive한 환경을 제공할 수 있는 지지체 (scaffold)의 개발이 필수적이며, Bioactive한 지지체로 성장인자의 서방형 방출이 가능한 다양한 scaffold가 개발되고 있으나, 골 이식재의 경우와 마찬가지로, bioactive한 지지체 제조과정에서 사용된 독성 물질의 잔류 및 복잡한 제조과정으로 인해 임상 적용이 가능한 지지체의 개발은 요원한 실정이다.
한국특허출원 2017-0071744
W.F. McKay, et al. A comprehensive clinical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (INFUSE Bone Graft). Int. Orthop. 2007, 31, 729-734. A.P. White, et al. Clinical applications of BMP-7/OP-1 in fractures, nonunions and spinal fusion. Int. Orthop. 2007, 31, 735-741.
이에 본 발명에서는 골 재생을 촉진시키는 성장인자 기반의 기술을 이용하여 손상된 골에 이식시킴에 있어 종래 기술의 문제들을 해결하기 위한 것으로서,
본 발명에서는 특별한 화학적 처리나 표면 개질 등의 추가 처리없이도 독특한 구조를 가지는 고분자만을 이용하여 성장인자를 효과적으로 탑재시키고, 여기에 손상 부위에 필요한 세포들을 사전에 주입하여 스페로이드 상태로 제조함으로써 상기 고분자에 탑재된 성장인자가 서방형으로 방출되어 상기 세포들의 재생 및 분화를 촉진시킬 수 있는 생리활성인자 탑재된 고분자-세포의 혼합 스페로이드를 제공하는 데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 생리활성인자 탑재된 고분자-세포의 혼합 스페로이드의 제조방법을 제공하는 데도 있다.
추가적으로, 본 발명은 상기 생리활성인자 탑재된 고분자-세포의 혼합 스페로이드를 다양한 용도에 사용하는 방법을 제공하는 데도 있다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위한 생리활성인자 탑재된 고분자-세포의 혼합 스페로이드는 생리활성인자가 탑재된 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자와 세포를 이용한 것을 그 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자는 분자량 1,000~1,000,000 g/mol이며, 생체적합성과 생분해성을 가지는 것으로, 폴리락틱산 (poly(lactic acid)), 폴리글리콜산 (poly(glycolic acid)), 폴리락틱산-글리콜산 공중합체(poly(lactic acid-co-glycolic acid)), 폴리카프로락톤 (polycaprolactone), 폴리락틱산-카프로락톤 공중합체 (poly(lactic acid-co-ε-caprolactone)), 폴리하이드록시부티릭산-하이드록시발러릭산 공중합체(polyhydroxybutyric acid-co-hydroxyvaleric acid), 폴리다이옥사논 (poly(dioxanone), 및 폴리포스포에스터 (poly(phosphoester))로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2 종 이상의 것일 수 있다.
상기 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자는 53㎛ 보다 작은 체(sieve)들을 이용하여 분리시켜, 그 평균 입경이 53㎛보다 작은 것들로만 이루어진 것이 바람직하다.
상기 세포는 상피세포, 섬유아세포, 골아세포, 연골세포, 심근 세포, 근세포, 간세포, 인간 유래 제대혈 세포, 중간엽 줄기세포, 골수유래줄기세포, 골막유래줄기세포, 혈관내피전구세포, 배아줄기세포, 역분화줄기세포 (induced pluripotent stem cell) 중에서 선택되는 단독 또는 2종 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 고분자-세포 혼합 스페로이드의 직경은 100~1,000 ㎛의 크기를 가지는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 생리활성인자는 사이토카인, 호르몬, 인슐린, 및 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 펩타이드/단백질; fibroblast growth factors (FGFs), vascular endothelial growth factor (VEGF), nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), transforming growth factors (TGFs), bone morphogenetic proteins (BMPs), epidermal growth factor (EGF), insulin-like growth factor (IGF), 및 platelet-derived growth factor (PDGF) 중에서 선택되는 1종 이상의 성장인자; 유전자; 및 백신 중에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 탑재된 생리활성인자는 상기 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자로부터 서방형 방출되는 데 특징이 있다.
또한, 상기 생리활성인자의 서방형 방출은 상기 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자 내부의 다공들에 탑재된 생리활성인자가 다수의 낙엽들이 적층된 형태의 다공 구조를 통과하면서 상기 생리활성인자가 상기 다공 구조에 탈착/흡착이 반복되면서 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 생리활성인자는 상기 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자 표면과 내부의 다공들에 탑재되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 생리활성인자는 상기 낙엽적층 구조를 가지는 다공성 고분자 미세입자의 부피당 1 ng/ml 내지 1 mg/ml의 농도로 탑재되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 생리활성인자가 탑재된 고분자-세포 혼합 스페로이드의 제조방법은 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자를 제조하는 제1단계, 상기 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자에 생리활성인자를 탑재시키는 제2단계, 상기 생리활성인자가 탑재된 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자와 세포를 혼합하여 생리활성인자가 탑재된 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자-세포 혼합액을 제조하는 제3단계, 및 상기 제3단계의 고분자 미세입자-세포 혼합액을 세포 스페로이드 배양시스템에 분주하여 생리활성인자가 탑재된 낙엽적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자와 세포가 혼합된 스페로이드를 형성하는 제4단계를 포함하는 데 특징이 있다.
상기 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자-세포 혼합액 내의 낙엽적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자의 비율은 1% 내지 20%의 숫자비로 혼합되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 생리활성인자가 탑재된 고분자-세포 혼합 스페로이드를 골 재생, 연골 재생, 간 재생, 치아 재생 침샘 재생, 부갑상선 재생 중에서 선택되는 어느 한 조직의 재생; 항암/자가면역 치료를 위한 세포전달체; 및 약물독성 평가, 뇌기능 평가 중에서 선택되는 어느 하나의 동물 실험 대체를 위한 오가노이드로부터 선택된 어느 하나의 용도에 사용하는 방법을 제공한다.
상기 생리활성인자는 탑재된 상기 고분자로부터 서방형 방출되어, 상기 세포 조직의 재생 및 상기 재생된 조직의 분화를 가속화시키는 데 특징이 있다.
본 발명에 따르면, 독특한 구조를 가지는 낙엽 적층형 다공성 고분자 미세입자에 생리활성인자를 흡착시키고, 생리활성인자가 흡착된 낙엽적층형 다공성 고분자 미세입자를 세포와 혼합시킨 고분자-세포 혼합 스페로이드를 제조할 수 있으며, 상기 고분자에 탑재된 생리활성인자는 스페로이드로부터 서방형 방출되어 손상된 부위에서 세포의 분화 및 재생을 촉진시키는 효과를 가진다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 생리활성인자가 탑재된 낙엽적층 구조를 가지는 다공성 고분자 미세입자-세포의 혼합 스페로이드에서, 상기 낙엽적층 구조를 가지는 다공성 고분자 미세입자로부터 생리활성인자가 서방형 방출되는 모식도이고,
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 낙엽적층형 구조를 가지는 다공성 고분자 미세입자의 주사전자현미경 사진이며,
도 3은 본 발명 실시예 1~2, 비교예 1에서 제조된 생리활성인자가 탑재된 미세입자-세포 혼합 스페로이드의 형성 및 시간에 따른 직경 변화를 관찰한 광학현미경 사진이고,
도 4는 비교예 1에 따른 세포 스페로이드, 및 실시예 1~2에서 제조된 미세입자-세포 혼합 스페로이드의 형태 변화를 관찰한 주사전자현미경 사진으로, 각각 위의 것은 스페로이드의 표면 사진이고, 아래 것은 표면 일부를 확대한 사진이고,
도 5는 비교예 2에 따른 PCL 고분자 미세입자를 세포와 혼합하여 제조된 샘플의 구조를 확인한 SEM 사진이고,
도 6은 본 발명 실시예에 따라 생리활성인자가 탑재된 낙엽적층 구조를 가지는 다공성 고분자 미세입자로부터 BMP-2 방출 거동 (일일 및 누적)을 나타낸 그래프이다.
이하에서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위하여 사용되며, 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 다른 경우를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 경우 "포함한다(comprise)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급한 형상들, 숫자, 단계, 동작, 부재, 요소 및/또는 이들 그룹의 존재를 특정하는 것이며, 하나 이상의 다른 형상, 숫자, 동작, 부재, 요소 및/또는 그룹들의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아니다.
본 발명은 독특한 구조를 가지는 낙엽적층형 구조를 가지는 다공성 고분자 미세입자에 생리활성인자를 탑재시키고, 상기 생리활성인자가 탑재된 낙엽적층형 구조를 가지는 다공성 고분자 미세입자를 세포 스페로이드 제조에 응용한 생리활성인자가 탑재된 낙엽적층형 구조를 가지는 다공성 고분자 미세입자-세포 혼합 스페로이드와 이의 제조방법 및 이를 다양한 용도에 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 상기 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자는 본 출원인의 기 출원 특허인 2017-0071744에 상세히 설명되어 있으며, 상기 특허는 본 발명에 그대로 병합된다.
본 발명에 따른 '낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자'는 고분자 전체(표면 및 내부)에 걸쳐 다수의 낙엽들이 겹겹이 쌓인 것과 같은 구조를 가지며, 상기 겹겹이 쌓인 낙엽들 사이사이에는 무수히 많은 다공들이 존재하며, 상기 다공들은 서로 연결된 구조를 가지는 것을 포함하는 의미이다.
따라서, 상기와 같이 독특한 구조를 가지는 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자를 이용하는 경우, 생리활성인자의 탑재와 서방형 방출을 위해 다공성 고분자 미세입자의 표면에 어떠한 첨가제 및 표면 개질법을 사용하지 않고, 본 발명의 다공성 고분자 미세입자 자체의 독특한 구조만으로 생리활성인자를 탑재한 후, 이를 서방형 방출시키는 데 특징이 있다.
또한, 종래 세포만을 이용한 세포 스페로이드에 비해 다양한 크기를 가지는 스페로이드의 제조가 가능하고, 고분자와 세포 간의 친화성 부족으로 사용하지 못했던 종래 문제점을 해결하여 고분자에 어떠한 표면처리나 표면개질을 사용하지 않고도 세포와 안정적인 스페로이드의 결합이 가능하도록 한 데 특징이 있다.
이러한 본 발명에 따른 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자는 분자량 1,000~1,000,000 g/mol이며, 생체적합성과 생분해성을 가지는 것으로, 폴리락틱산 (poly(lactic acid)), 폴리글리콜산 (poly(glycolic acid)), 폴리락틱산-글리콜산 공중합체(poly(lactic acid-co-glycolic acid)), 폴리카프로락톤 (polycaprolactone), 폴리락틱산-카프로락톤 공중합체 (poly(lactic acid-co-ε-caprolactone)), 폴리하이드록시부티릭산-하이드록시발러릭산 공중합체(polyhydroxybutyric acid-co-hydroxyvaleric acid), 폴리다이옥사논 (poly(dioxanone), 및 폴리포스포에스터 (poly(phosphoester))로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2 종 이상의 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 상기 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자는 53㎛ 보다 작은 다수개의 체(sieve)들을 이용하여 분리시켜, 그 평균 입경도 53㎛보다 작은 것들로만 이루어지도록 하였는 바, 이는 상기 낙엽적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자의 평균 입경이 53㎛보다 큰 경우에는 세포 스페로이드가 형성되는 것이 아니라 다공성 고분자 미세입자의 표면에 세포가 단순히 점착되는 문제가 있어 바람직하지 못하다.
또한, 본 발명의 스페로이드에 포함되는 상기 세포는 상피세포, 섬유아세포, 골아세포, 연골세포, 심근 세포, 근세포, 간세포, 인간 유래 제대혈 세포, 중간엽 줄기세포, 골수유래줄기세포, 골막유래줄기세포, 혈관내피전구세포, 배아줄기세포, 역분화줄기세포 (induced pluripotent stem cell) 중에서 선택되는 단독 또는 2종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서는 손상된 골 조직 등에는 생존하고 있는 세포의 존재 가능성이 희박하고, 생리활성인자가 탑재된다 하더라도 치료하고자 하는 손상 부위로의 정확한 전달이 어려운 점을 감안하여, 상기와 같이 손상 부위의 재생을 위해 필요한 세포 및 생리활성인자들을 직접 주입할 수 있는 세포 스페로이드를 제조하고자 한 것이다.
또한, 본 발명에 따르면, 상기 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세 입자에는 생리활성인자가 탑재될 수 있으며, 상기 탑재된 생리활성인자는 상기 다공성 고분자 미세 입자로부터 서방형 방출되는 것을 특징으로 한다.
상기 생리활성인자는 사이토카인, 호르몬, 인슐린, 및 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 펩타이드/단백질; fibroblast growth factors (FGFs), vascular endothelial growth factor (VEGF), nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), transforming growth factors (TGFs), bone morphogenetic proteins (BMPs), epidermal growth factor (EGF), insulin-like growth factor (IGF), 및 platelet-derived growth factor (PDGF) 중에서 선택되는 1종 이상의 성장인자; 유전자; 및 백신 중에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 생리활성인자가 상기 다공성 고분자 미세 입자 표면과 내부의 다공들에까지 탑재되는 것일 수 있다. 따라서, 다공성 고분자 미세입자 내부에 탑재된 생리활성인자는 상기 미세입자 내부의 쌓인 낙엽 형태의 다공 구조를 통과하면서 상기 다공 구조에 탈착/흡착이 반복된다. 이러한 생리활성인자가 상기 쌓인 낙엽 형태의 다공 구조를 통과하면서 탈착/흡착이 반복되므로 다공성 고분자 미세입자 밖으로 방출되는 시간이 종래 방법에 따라 탑재된 생리활성인자보다 더 길어지게 되는 효과를 가진다.
이러한 서방형 방출 특성은 종래 단순한 다공성 구조를 가지는 고분자 지지체에서 나타나는 방출 특성과는 상이한 것으로, 본 발명의 다공성 고분자 미세입자가 가지는 독특한 외부 및 내부의 구조로 인한 것으로 볼 수 있다.
즉, 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 생리활성인자가 탑재된 낙엽적층 구조를 가지는 다공성 고분자 미세입자-세포의 혼합 스페로이드에서, 상기 낙엽적층 구조를 가지는 다공성 고분자 미세입자로부터 생리활성인자가 서방형 방출되는 모식도를 나타낸 다음 도 1을 참조하면, 생리활성인자가 낙엽 적층형 구조를 가지는 다공성 고분자 미세입자의 표면 및 내부의 수많은 다공들에 어떠한 독성 물질의 사용 없이도 생리활성인자를 상기 다공성 고분자 미세입자의 표면 및 내부의 다공들에 단순 흡착시켜 탑재시킬 수 있다.
또한, 상기 생리활성인자가 탑재된 고분자를 세포와 혼합하여 고분자-세포 혼합 스페로이드를 제조할 수 있다. 이때, 상기 생리활성인자가 탑재된 고분자-세포 혼합 스페로이드에서는, 상기 낙엽 적층 형태의 다공 구조의 고분자를 통과하면서 탈착/흡착이 반복되므로 서방형 방출을 유도할 수 있는 것이다.
또한, 상기 생리활성인자는 상기 낙엽적층 구조를 가지는 다공성 고분자 미세입자의 부피당 1 ng/ml 내지 1 mg/ml의 농도로 탑재되는 것이 효과적인 세포의 분화 및 조직의 재생 혹은 과량의 생리활성인자에 의한 부작용을 최소하는 측면에서 바람직하다.
본 발명에 따른 생리활성인자가 탑재된 고분자-세포 혼합 스페로이드의 제조방법은 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자를 제조하는 제1단계, 상기 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자에 생리활성인자를 탑재시키는 제2단계, 상기 생리활성인자가 탑재된 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자와 세포를 혼합하여 생리활성인자가 탑재된 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자-세포 혼합액을 제조하는 제3단계, 및 상기 제3단계의 고분자 미세입자-세포 혼합액을 세포 스페로이드 배양시스템에 분주하여 생리활성인자가 탑재된 낙엽적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자와 세포가 혼합된 스페로이드를 형성하는 제4단계를 포함하여 이루어진다.
본 발명에 따른 낙엽적층형 구조를 가지는 고분자 미세입자를 제조하는 제1단계는 한국특허 출원번호 2017-0071744에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다.
또한, 제2단계에서는 상기 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자에 생리활성인자를 탑재시키는 과정이다.
상기 생리활성인자를 다공성 고분자 재료에 탑재시키는 방법은, 일정한 농도로 제조된 생리활성인자 수용액과 다공성 고분자 미세입자를 주사기에 넣고 음압과 양압을 번갈아 걸게 되면, 다공성미세입자 내로 상기 생리활성인자를 함유한 수용액의 침투 및 고분자 미세입자 표면에 흡착으로 인해 상기 다공성 고분자 재료의 표면과 내부에 도입되게 된다.
본 발명에 따른 상기 각 생리활성인자 용액은 증류수, 식염수, 소혈청알부민이 0.1 내지 20%로 포함된 인산완충용액 중에서 선택되는 1종 이상의 수용액을 이용하는 것이 바람직하나, 생리활성인자의 활성을 유지시킬 수 있는 용액이면 이에 한정되지 않고 다른 용액을 사용해도 무방하다.
또한, 제3단계는 상기 생리활성인자가 탑재된 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자와 세포를 혼합하여 생리활성인자가 탑재된 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자-세포 혼합액을 제조한다. 세포 현탁액과 생리활성인자가 탑재된 고분자 미세입자를 액상에서 혼합하는 과정이며, 상기 세포현탁액은 세포가 배양액에 suspension된 상태를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 세포 현탁액 내 생리활성인자가 탑재된 낙엽적층형 구조를 가지는 고분자 미세입자의 비율은 세포 현탁액 내 세포수 대비 1% 내지 20%의 숫자비(숫자%)로 혼합하는 것이 바람직하다.
세포 현탁액 내의 세포수는 hemocytometer를 이용하여 카운팅하므로, 낙엽적층형 구조를 가지는 미세입자도 세포배양액에 suspension 시키고 hemocytometer를 이용하여 카운팅한다. 그 다음, 각 용액으로부터 원하는 수만큼의 세포 및 입자를 채취하고 이를 원하는 세포/입자 비율로 혼합하여 사용하며, 상기 숫자%는 이러한 방법으로 계산된 함량을 의미한다.
생리활성인자가 탑재된 미세입자가 세포와의 혼합 비율이 20%를 초과하면 스페로이드 형성에 참여하지 못하는 잉여의 미세입자가 낭비될 수 있다. 또한 혼합 비율이 1% 미만이면 세포에 혼합되는 생리활성인자가 탑재된 미세입자의 양이 적어져 일반적인 세포 스페로이드와 비슷해지므로 그 혼합 효과가 없기 때문이다.
제4단계는 상기 제3단계의 생리활성인자가 탑재된 낙엽적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자-세포 혼합액을 세포 스페로이드 배양시스템에 분주하여 생리활성인자가 탑재된 낙엽적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자와 세포가 혼합된 스페로이드를 형성시키도록 하는 것이다.
이때 사용되는 세포 스페로이드 배양시스템과 배양 조건은 특별히 한정되지 않으며, 공지된 모든 방법에 따라 각 세포의 배양 조건에 따라 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 생리활성인자가 탑재된 낙엽적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자-세포 혼합 스페로이드는 골 재생, 연골 재생, 간 재생, 치아 재생 침샘 재생, 부갑상선 재생 중에서 선택되는 어느 한 조직의 재생; 항암/자가면역 치료를 위한 세포전달체; 및 약물독성 평가, 뇌기능 평가 중에서 선택되는 어느 하나의 동물 실험 대체를 위한 오가노이드로부터 선택된 어느 하나의 용도에 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명에서는 상기 생리활성인자가 탑재된 낙엽적층형 다공성 고분자 미세입자로부터 서방형 방출되어, 상기 세포 조직의 재생 및 상기 재생된 조직의 분화를 가속화시키는 것이다.
이하에서 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 이하의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 이하의 실시예에서는 특정 화합물을 이용하여 예시하였으나, 이들의 균등물을 사용한 경우에 있어서도 동등 유사한 정도의 효과를 발휘할 수 있음은 당업자에게 자명하다.
실시예 1~2 : 생리활성인자 탑재된 낙엽적층형 구조를 가지는 다공성 고분자 미세입자-세포 혼합 스페로이드 제조
1)낙엽적층구조 미세입자의 제조
본 출원인의 기 출원 특허인 2017-0071744에 기재된 방법에 따라 낙엽적층형 구조를 가지는 미세입자를 제조하였다.
생체적합성*?*생분해성을 나타내는 폴리카프로락톤 (polycaprolactone, PCL)을 테트라글리콜에 15중량%로 혼합하고, 90℃에서 폴리카프로락톤을 용해시켜 테트라글리콜과 혼합시켰다. 90℃에서 혼합된 폴리카프로락톤 용액을 4℃에서 80 rpm으로 냉각시켰다. 냉각된 폴리카프로락톤 용액에 증류수를 과량 넣어서 미세입자 형성 유도와 잔여 테트라글리콜을 완전히 세척해 내었다. 세척과정에서 냉각된 폴리카프로락톤 미세입자가 서로 분리되어 다양한 크기의 미세입자가 형성된다.
세척이 끝난 PCL 미세입자는 53 ㎛보다 작은 다양한 체들을 이용하여 분류시키고, 동결건조시켜 평균 입경이 53 ㎛보다 작은 미세입자들로만 이루어진 낙엽적층형 구조를 가지는 PCL 고분자 미세입자를 얻었다.
2) 생리활성인자의 탑재
상기 1)에서 제조된 낙엽적층형 구조를 가지는 PCL 다공성 고분자 미세입자에 골형성단백질인 BMP-2(bone morphogenetic protein-2)를 탑재시켰다. 상기 BMP-2를 낙엽적층형 구조를 가지는 PCL 다공성 고분자 미세입자 부피당 1μg/mL의 농도로 제조하고, 낙엽적층구조 미세입자에 음압과 양압을 통하여 탑재하였다. 그 후 4℃에서 3시간 보관하여 BMP-2를 낙엽적층구조 미세입자 표면에 흡착을 유도하였고 PBS로 3회 세척하여 흡착되지 않은 BMP-2를 씻어주었다. 그 후 동결건조하여 BMP-2가 흡착된 낙엽적층구조 미세입자를 제조하였다.
3) 세포 스페로이드 배양시스템 제조
세포 스페로이드 배양시스템 내부에 concave well이 36개씩 4귀퉁이에 형성되어 있으며, 가운데 십자 모양으로 배양액 교환용 홈이 위치한 플라스틱 몰드에 용융 상태의 4 중량%의 아가로스 용액을 부어 세포 스페로이드 배양시스템을 제작하였다.
4) 세포 스페로이드 배양시스템을 이용한 미세입자-세포 스페로이드 제조
상기 2)에서 제조된 BMP-2가 흡착된 낙엽적층형 구조의 미세입자 비율이 세포 혼합용액의 세포수 대비 각각 5, 10% 숫자비로 포함되도록 rat에서 획득한 골수줄기세포와 혼합시켜 1 mL의 고분자 미세입자-세포 혼합액을 제조하였다.(표 1 조성 참조)
상기 3)에서 제작된 세포 스페로이드 배양시스템에 상기 BMP-2가 흡착된 미세입자-세포 혼합액을 분주하고, 미세입자와 세포가 세포 스페로이드 배양시스템 내의 concave well에 균일하게 위치할 수 있도록, well 외부에 잉여로 존재하는 세포와 미세입자는 제거하였다. 그 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양시켰다.
세포 양
(x106 cells)		 BMP-2가 흡착된 미세입자 양(x106 particle) 세포 현탁액 내 미세입자의 양 (숫자%)
실시예 1 2.85 0.15 5
실시예 2 2.7 0.3 10
비교예 1 3.0 0 0
비교예 2 2.7 0.3 10
비교예 1 : 세포만을 이용한 세포 스페로이드 제조
본 발명과 같이 낙엽적층형 구조를 가지는 고분자 미세입자가 포함되지 않고, rat에서 획득한 골수줄기세포만으로 이루어진 세포 현탁액을 이용하여 상기 실시예 1~2에서와 동일하게 세포 스페로이드를 제조하였다.
비교예 2 : 53 ㎛보다 큰 평균 입경을 가지는 낙엽적층형 구조를 가지는 PCL 다공성 고분자 미세입자를 이용한 제조
상기 실시예의 1)의 낙엽적층형 구조를 가지는 PCL 다공성 고분자 미세입자의 제조시, 53 ㎛보다 큰 다양한 크기의 체(sieve)들(54, 100㎛, 200㎛)을 이용하여 분리시켜, 최종 제조된 미세입자의 평균입경이 53 ㎛보다 큰 것들로만 이루어진 낙엽적층형 구조의 PCL 다공성 고분자 미세입자를 제조하였다.
또한, 상기 제조된 낙엽적층형 구조의 PCL 다공성 고분자 미세입자에 상기 실시예 2)와 동일한 방법으로 BMP-2를 흡착시키고, BMP-2 흡착된 낙엽적층형 구조의 미세입자 비율이 세포 혼합용액의 세포수 대비 10% 숫자비로 포함되도록 rat에서 획득한 골수줄기세포와 혼합시켜 1 mL의 고분자 미세입자-세포 혼합액을 제조하였다. 상기 3)에서 제작된 세포 스페로이드 배양시스템에 상기 BMP-2가 흡착된 미세입자-세포 혼합액을 분주하고, 미세입자와 세포가 세포 스페로이드 배양시스템 내의 concave well에 균일하게 위치할 수 있도록, well 외부에 잉여로 존재하는 세포와 미세입자는 제거하였다. 그 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양시켰다.
실험예 1 : 낙엽적층형 구조를 가지는 고분자 미세입자의 구조 확인
상기 실시예의 1)에 따라 PCL 고분자 미세입자의 구조를 주사전자현미경 (SEM)을 통해 관찰하였으며 그 결과를 다음 도 2에 나타내었다.
다음 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 고분자 미세입자는 고분자 전체(표면 및 내부)에 걸쳐 다수의 낙엽들이 적층되어 있는 것과 같은 낙엽적층형 구조를 가지며, 상기 겹겹이 쌓인 낙엽들 사이사이에는 무수히 많은 다공들이 존재하며, 상기 다공들은 서로 연결된 구조를 가지는 것을 확인하였다.
실험예 2: 생리활성인자가 탑재된 낙엽적층구조 고분자 미세입자-세포 스페로이드의 형성 과정 확인
상기 실시예 1~2, 비교예 1에서 생리활성인자가 탑재된 낙엽적층구조 고분자 미세입자-세포 스페로이드가 형성되는 과정을 광학현미경으로 관찰하였으며, 그 결과를 다음 도 3에 나타내었다. 비교예 2에서는 3차원 구조의 스페로이드 형성이 되지 않아, 광학현미경 관찰이 어려워 본 실험에서는 제외시켰다.
다음 도 3을 참조하면, 본 발명과 같이 생리활성인자가 탑재된 낙엽적층형 구조를 가지는 고분자 미세입자-세포로 이루어진 실시예의 혼합 스페로이드는 배양 후 하루가 지나면 미세입자와 세포가 뭉친 형태를 가지는 3차원의 스페로이드가 형성됨을 확인할 수 있다.
이와 같은 결과로부터, 본 발명에 따른 생리활성인자가 탑재된 낙엽적층형 구조를 가지는 고분자 미세입자를 세포와 혼합하더라도 종래 세포만을 이용한 스페로이드에서와 마찬가지로 3차원의 스페로이드를 효과적으로 형성할 수 있음을 확인하였다.
실험예 3: 낙엽적층구조 미세입자-세포 스페로이드의 형태 분석
상기 실시예 1~2, 비교예 1~2에서 제조된 3차원 구조의 각 세포 스페로이드의 형태 변화를 2주간에 걸쳐 주사전자현미경(SEM)으로 확인하였으며, 그 결과를 다음 도 4와 5에 나타내었다.
다음 도 4를 참조하면, 발 본명 실시예 1~2의 방법에 따르면 세포와 고분자 미세입자를 혼합시킨 후 1일이 지나면 미세입자와 세포가 뭉친 형태의 3차원 구조의 고분자-세포의 혼합 스페로이드가 형성됨을 확인하였다.
또한, 실시예 1~2와 같이 고분자 미세입자를 혼합시킨 고분자-세포의 혼합 스페로이드의 경우 시간이 지남에 따라 비교예 1의 세포만을 이용한 스페로이드에 비해 전체 스페로이드의 직경 변화가 거의 없이 유지하고 있음을 확인하였다.
이는 도 1의 구조에서와 같이, 본 발명에 따른 낙엽적층구조의 다공성 고분자 미세입자의 독특한 표면구조가 넓은 표면적을 제공하여 세포가 점착하기 쉬워 세포 점착성능이 향상되고, 이러한 구조로 인하여 세포와 낙엽적층형 구조를 가지는 다공성 고분자 미세입자 간의 결합이 단단하게 유지되기 때문인 것으로 볼 수 있다.
이러한 결과로부터, 본 발명과 같이 낙엽 적층형 구조를 가지는 고분자 미세입자를 세포와 혼합하여 하이브리드 구조의 세포 스페로이드를 효과적으로 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 일정 시간이 지나도 그 크기를 일정하게 유지할 수 있음을 확인하였는 바, 이는 종래 크기 조절이 제한적이었던 세포 스페로이드의 문제를 현저하게 해결한 결과로 볼 수 있다.
또한, 상기 고분자 미세입자-세포의 혼합 스페로이드를 확대한 사진을 참조하면, 본 발명에서 사용한 낙엽적층형 구조의 고분자 미세입자와 세포가 서로 복잡하게 결합하여 뭉친 형태를 가지는 것을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 고분자 미세입자-세포의 혼합 스페로이드에서는 고분자 미세입자의 함량이 세포의 함량보다 상대적으로 적게 포함되므로, 전체 혼합 스페로이드에서 고분자 미세입자가 중간 중간에 박힌 구조를 형성하게 된다. 따라서, 고분자 미세입자들이 스페로이드에서 세포들 간의 빽빽한 결합 사이사이에 느슨한 구조체 역할을 하여 세포들 간의 간격을 이격시켜 일종의 통로를 만들게 된다.
또한, 본 발명에 따른 낙엽 적층형 다공성 고분자 미세입자는 외부 및 내부에 전체적으로 다공성 구조를 가지고 있기 때문에 통로가 된 고분자 미세입자들 사이로 세포 스페로이드의 내부 중심부까지 산소 및 영양분을 공급할 수 있는 효과를 가지므로 스페로이드의 크기가 커지더라도 세포 내부에서의 세포 괴사를 효과적으로 방지할 수 있는 구조를 제공하는 것이다.
그러나, 낙엽적층형 구조를 가지는 PCL 다공성 고분자 미세입자 중, 평균입경이 53 ㎛보다 큰 미세입자-세포로 이루어진 비교예 2에서도 3차원의 스페로이드가 형성되는지를 관찰한 다음 도 5의 결과를 참조하면, 본 발명 실시예에서와 같이 고분자와 세포가 3차원의 스페로이드를 형성하지 못하고 세포들이 입자의 표면에 점착되고 스페로이드를 형성하지 못함을 확인하였다. 이는 비교예에서 사용한 PCL 다공성 고분자 미세입자가 낙엽적층형 구조를 가지더라도, 평균 입경이 53㎛보다 큰 경우에는 세포 스페로이드가 형성되지 못하는 것을 알 수 있다.
즉, 미세입자의 크기가 작을 경우, 세포 (크기, 10 ~ 50㎛)와 미세입자의 크기가 유사해 서로 균일하게 섞이고 서로 간의 충분한 점착력으로 스페로이드를 형성할 수 있으나, 미세입자의 크기가 53㎛보다 클 경우, 세포와 미세입자가 균일하게 섞이기 보다는 미세입자 사이에 적은 양의 세포가 존재하고 이때 세포와 미세입자 간의 점착력이 미세입자들을 응집시킬 정도의 힘이 되지 못하여 스페로이드를 형성하기 보다는 단순히 미세입자 표면에 점착되는 결과를 낳는다.
실험예 4: BMP-2 방출 거동 확인
BMP-2가 흡착된 낙엽적층구조 미세입자(실시예 1) 5 mg을 소태아혈청이 1% 비율로 들어있는 PBS (보관 용액)에 넣고 37℃, 50 rpm에서 보관하였다. 매일 보관용액을 채취하고 새로운 보관 용액으로 갈아주었으며, 채취한 보관 용액은 효소면역정량법으로 BMP-2의 양을 측정하였다. 측정된 양은 일일 방출량과 누적 방출량으로 나타내었으며, 그 결과를 다음 도 6에 나타내었다.
다음 도 6의 결과를 참조하면, 어떠한 첨가제 및 표면 개질법 없이도, 다공성 고분자 미세입자로부터 세포의 골세포로의 분화 및 신생골 형성을 위한 유효농도의 생리활성인자가 서방형으로 방출되고 있음을 확인할 수 있었다. 즉, 생리활성인자가 탑재된 고분자-세포 혼합 스페로이드 내 세포의 분화 촉진을 통한 조직의 재생을 보다 효과적으로 유도할 수 있음을 기대할 수 있었다.

Claims (14)

  1. 53 ㎛보다 작은 다양한 체들을 이용하여 분류시켜 평균 입경이 53 ㎛보다 작은 미세입자들로만 이루어진 낙엽적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자의 표면과 내부의 다공들에 생리활성인자가 탑재된 고분자 미세입자가 세포수 대비 1% 내지 20%의 숫자비로 세포와 세포 사이에 들어가 세포들 간의 간격을 이격시키는 구조체 역할을 하여 세포들 간에 통로를 만든 구조의 생리활성인자가 탑재된 고분자-세포 혼합 스페로이드이고,
    상기 낙엽적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자에 탑재된 상기 생리활성인자는 상기 낙엽적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자의 다공들을 통과하면서 상기 다공들에 탈착/흡착이 반복되면서 서방형 방출되는 것을 특징으로 하는 직경 100~1,000 ㎛의 크기를 가지는 생리활성인자가 탑재된 고분자-세포 혼합 스페로이드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자는 분자량 1,000~1,000,000 g/mol이며, 생체적합성과 생분해성을 가지는 것으로, 폴리락틱산 (poly(lactic acid)), 폴리글리콜산 (poly(glycolic acid)), 폴리락틱산-글리콜산 공중합체(poly(lactic acid-co-glycolic acid)), 폴리카프로락톤 (polycaprolactone), 폴리락틱산-카프로락톤 공중합체 (poly(lactic acid-co-ε-caprolactone)), 폴리하이드록시부티릭산-하이드록시발러릭산 공중합체(polyhydroxybutyric acid-co-hydroxyvaleric acid), 폴리다이옥사논 (poly(dioxanone), 및 폴리포스포에스터 (poly(phosphoester))로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2 종 이상의 것인 생리활성인자가 탑재된 고분자-세포 혼합 스페로이드.
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 세포는 상피세포, 섬유아세포, 골아세포, 연골세포, 심근 세포, 근세포, 간세포, 인간 유래 제대혈 세포, 중간엽 줄기세포, 골수유래줄기세포, 골막유래줄기세포, 혈관내피전구세포, 배아줄기세포, 역분화줄기세포 (induced pluripotent stem cell) 중에서 선택되는 단독 또는 2종 이상인 것인 생리활성인자가 탑재된 고분자-세포 혼합 스페로이드.
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 생리활성인자는 사이토카인, 호르몬, 인슐린, 및 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 펩타이드/단백질;
    fibroblast growth factors (FGFs), vascular endothelial growth factor (VEGF), nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), transforming growth factors (TGFs), bone morphogenetic proteins (BMPs), epidermal growth factor (EGF), insulin-like growth factor (IGF), 및 platelet-derived growth factor (PDGF) 중에서 선택되는 1종 이상의 성장인자;
    유전자; 및
    백신 중에서 선택되는 어느 하나인 것인 생리활성인자가 탑재된 고분자-세포 혼합 스페로이드.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 53 ㎛보다 작은 다양한 체들을 이용하여 분류시키고, 동결건조시켜 평균 입경이 53 ㎛보다 작은 미세입자들로만 이루어진 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자를 제조하는 제1단계,
    상기 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자의 부피당 1 ng/ml 내지 1 mg/ml의 농도로 생리활성인자를 혼합하여 상기 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자의 표면과 내부의 다공들에 생리활성인자를 탑재시키는 제2단계,
    상기 생리활성인자가 탑재된 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자를 세포수 대비 1% 내지 20%의 숫자비로 세포와 혼합하여 생리활성인자가 탑재된 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자-세포 혼합액을 제조하는 제3단계, 및
    상기 제3단계의 생리활성인자가 탑재된 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자-세포 혼합액을 세포 스페로이드 배양시스템에 분주하여 생리활성인자가 탑재된 낙엽적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자가 세포와 세포 사이에 들어가 세포들 간의 간격을 이격시키는 구조체 역할을 하여 세포들 간에 통로를 가지는 구조의 직경 100~1,000 ㎛의 크기의 생리활성인자가 탑재된 고분자-세포 혼합 스페로이드를 형성하는 제4단계를 거쳐 제조되며,
    상기 고분자 미세입자에 탑재된 상기 생리활성인자는 상기 낙엽적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자의 다공들을 통과하면서 상기 다공들에 탈착/흡착이 반복되면서 서방형 방출되는 것을 특징으로 하는 생리활성인자가 탑재된 고분자-세포 혼합 스페로이드의 제조방법.
  12. 삭제
  13. 제1항에 따른 생리활성인자가 탑재된 고분자-세포 혼합 스페로이드를 골 재생, 연골 재생, 간 재생, 치아 재생 침샘 재생, 부갑상선 재생 중에서 선택되는 어느 한 조직의 재생; 항암/자가면역 치료를 위한 세포전달체; 및 약물독성 평가, 뇌기능 평가 중에서 선택되는 어느 하나의 동물 실험 대체를 위한 오가노이드로부터 선택된 어느 하나의 용도에 사용하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 생리활성인자는 탑재된 상기 고분자로부터 서방형 방출되어, 상기 조직의 재생 및 상기 재생된 조직의 분화를 가속화시키는 것인 사용하는 방법.
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