BR112017000813B1 - sistemas de gel microporoso, usos de uma pluralidade de partículas de microgel em uma solução aquosa e um agente de recozimento, de camadas de sequestrantes covalentemente estabilizados de partículas de microgel, e de um sequestrante covalentemente estabilizado de partículas de microgel com espaços intersticiais, bem como método para a preparação de partículas de microgel - Google Patents

Abstract

Um sistema de gel microporoso para certas aplicações, incluindo aplicações biomédicas, inclui uma solução aquosa contendo uma pluralidade de partículas de microgel incluindo um agente de reticulação biodegradável. Em alguns aspectos, as partículas de microgel atuam como blocos de construção de gel que recozem uns com os outros para formar um sequestrante estabilizado covalentemente de partículas de microgel tendo espaços intersticiais no seu interior. Em certos aspectos, o recozimento das partículas de microgel ocorre após exposição a um agente de recozimento que está endogenamente presente ou é exogenamente adicionado. Em algumas modalidades, o recozimento das partículas de microgel requer a presença de um iniciador tal como a exposição à luz. Em modalidades particulares, as propriedades químicas e físicas dos blocos de construção de gel podem ser controladas para permitir o controle a jusante do sequestrante montado resultante. Em uma ou mais modalidades, as células são capazes de infiltrar-se rapidamente nos espaços intersticiais do sequestrante montado.

Description

Aplicações relacionadas

[001] Este pedido reivindica a prioridade a Pedido de Patente Pro-visório U.S. Nos. 62/025.844 depositado em 17 de julho de 2014, 62/059.463 depositado em 03 de outubro de 2014, e 62/103.002 depo-sitado em 13 de janeiro de 2015. A prioridade é reivindicada conforme o 35 USC § 119. Os pedidos de patente acima mencionados são aqui incorporados por referência como se apresentados completamente aqui.

Campo Técnico

[002] O campo técnico refere-se geralmente ao campo do tratamento de feridas, e em particular, a utilização de partículas de microgel e suportes, incluindo as partículas para o tratamento e vedação de feri-das e a aplicações de preenchedores de tecido.

Antecedentes

[003] Um conceito central ligado à geração e regeneração de tecidos é a migração coletiva de células, um processo pelo qual redes inteiras de células se movem em conjunto para uma área de desenvolvimento para facilitar a formação de tecido funcional. Os investigadores têm procurado desenvolver agentes de cura de feridas; no entanto, esses materiais exibem variabilidade de batelada a batelada e taxas de degradação que limitam suporte estrutural estendido para os tecidos em crescimento. Os materiais sintéticos são mais sintonizáveis do que os materiais naturais e as suas propriedades mecânicas foram modifica-das para permitir a utilização com uma vasta gama de tipos de tecidos. Apesar desta sintonia, no entanto, biomateriais injetáveis sintéticos têm se limitado os suportes não porosos ou nanoporosos que requerem a degradação física para a migração celular através do ma- terial. Hidrogéis sintéticos porosos que contêm poros interligados em microescala pré-formados permitem uma maior mobilidade celular sem a necessidade de degradação, contornando o equilíbrio entre a mobili-dade celular e estabilidade do material inerente os suportes não poro-sos. O modo típico de formação de poros inclui a remoção de tóxicos de porogênios, ou a degradação das micropartículas encapsuladas, o que implica que estes construtos sejam fundidos ex vivo, impedindo-os de se integrar perfeitamente com o tecido circundante como um bio-material injetável ou requerendo desenvolvimento in vivo a longo prazo para resolver a estrutura porosa. Por exemplo, Healionics Corporation desenvolveu uma tecnologia autodescrita como Regeneração Anigio- gênica de Modelo Esférico (ESTRELA) em que suportes de ESTRELA são formados por sinterização em conjunto uma matriz de grânulos empacotados de tamanho controlado, moldando um polímero dentro do espaço intersticial entre os grânulos, e os grânulos se dissolvendo para se obter uma rede de poros de vazios esféricos interligados. Como observado acima, no entanto, estes processos convencionais exigem a remoção de tóxicos de porogênios.

Sumário

[004] Feridas cutâneas humanas são uma ameaça cada vez maior para a saúde pública e para a economia e são muito difíceis de tratar. Os médicos, no tratamento de feridas cutâneas, procuram manter a área úmida porque feridas secas curam muito mais lentamente do que as úmidas. Para conseguir isso, os médicos costumam usar pomadas para preencher a ferida, bem como encher um buraco com preenchimento novo. No entanto, estes e outros métodos convencio-nais para a cicatrização de feridas não fornecem um suporte ideal para permitir que o tecido novo cresça. Como resultado, o crescimento de tecido novo, se for o caso, é relativamente lento e frágil o que conduz a tempos de cura mais longos, à medida que cura oportuna é ainda possível.

[005] No contexto da cura da engenharia de tecidos, os presentes inventores identificaram o padrão de ouro do desenvolvimento de suportes microporosos interligados que permitem redes celulares inter-ligadas e migração coletiva, sem a necessidade para degradação de suporte ou procedimentos invasivos de implante, é essencial integra-ção em quantidade com o tecido circundante. Na verdade, para ser mais eficaz, os presentes inventores identificaram que estes materiais devem facilitar a migração celular coletiva que medeia a regeneração, proporcionando sinais moleculares para promover a cicatrização de feridas e reconhecimento de nicho. Além disso, os presentes invento-res também identificaram que estes materiais devem ser capazes de ser facilmente substituídos por células de migração e matriz natural, proporcionando um suporte estrutural estável antes da substituição, e sendo facilmente entregue e se conformando ao sítio da lesão para minimizar respostas fibróticas e inflamatórias.

[006] Providos aqui são sistemas, composições, métodos e dis-positivos que aplicam estes princípios e fornecem um biomaterial que promove a rápida regeneração do tecido, mantendo o suporte estrutu-ral do tecido circundante de uma ferida. De fato, os presentes invento-res conseguiram soluções para necessidades médicas não satisfeitas e de longo efeito no campo da engenharia de tecidos usando uma química de material baseada em microgel, sob medida injetável ou flu-ida e fabricação microfluida de blocos de construção esféricos unifor-mes, incluindo, por exemplo, blocos de construção da espessura de um cabelo humano.

[007] A tecnologia aqui descrita utiliza química para gerar pequenos microgéis que podem ser montados em uma grande unidade, deixando para trás um caminho para infiltração celular. O resultado é um conjunto embalado de organismos microscópicos de polímero sintético (por exemplo, esferas) presas nas suas superfícies, semelhante a um frasco dos bolas de goma que estão grudadas. O conjunto cria um su-porte de partículas microporosas recozidas (por exemplo, um suporte de gel poroso) que preenche a ferida. Novo tecido cresce rapidamente nos espaços vazios entre as partículas de microgel, e como as partícu-las de microgel degradam no corpo, uma matriz de tecido recentemen-te crescida é deixada, onde a estava uma vez. Novo tecido continua crescendo até que a ferida esteja completamente curada.

[008] Os sistemas de microgel aqui descritos representam uma melhoria substancial em relação aos produtos convencionais. Por exemplo, as tecnologias aqui descritas não necessitam de fatores de crescimento adicionados para atrair as células para dentro do material. A geometria das redes de microgel descrita atrai células para migrar para o microgel.

[009] Os presentes inventores demonstraram que os microgéis descritos podem promover o crescimento de novas células e formação de redes de células ligadas a taxas anteriormente invisíveis. Por exemplo, durante os estudos in vivo, a regeneração significativa dos tecidos foi observada nas primeiras 48 horas, com muito mais cura ao longo de cinco dias em comparação com os materiais convencionais em uso hoje em dia.

[0010] As tecnologias aqui descritas são úteis para uma grande variedade de aplicações. Por exemplo, a tecnologia de microgel divul-gada pode ser utilizada para aplicações de feridas, incluindo danos agudos, como lacerações e fechamento cirúrgicos de feridas, e tam-bém mais aplicações crônicas como as úlceras diabéticas e feridas de grande área de queimaduras. Os suportes de hidrogel aqui descritos também podem ser úteis em situações de trauma, tais como campos de batalha ou salas de emergência.

[0011] Descritos aqui, em certos aspectos, são sistemas, compo- sições, métodos e dispositivos que compreendem um gel microporoso que compreende uma solução aquosa que compreende uma plurali-dade de partículas de microgel e um reticulante, incluindo, por exem-plo, um reticulante biodegradável. Géis microporosos aqui descritos são escoáveis e/ou injetáveis e podem ser aplicados de várias manei-ras diferentes, incluindo, por exemplo, topicamente ou por injeção. Géis microporosos escoáveis e/ou injetados podem ser inseridos por via transdérmica ou em tecidos profundos. Géis microporosos escoá-veis também podem ser administrados topicamente na derme e outros tecidos.

[0012] Em um aspecto, quando um agente de recozimento é aplicado à pluralidade de partículas de microgel, as partículas de microgel formam um suporte covalentemente estabilizado de partículas de microgel tendo espaços intersticiais nele. Em certas aplicações, os sistemas, as composições, métodos e dispositivos são especificamente concebidos para aplicações biomédicas. Em algumas modalidades, as partículas de gel microporoso compreendem ainda um reticulante, em que o reticulante inclui um reticulante de matriz metaloprotease (MMP) degradável. Em uma ou mais modalidades, um agente de recozimento compreende do Fator XIIa. Em outras modalidades ou adicionais, o agente de recozimento compreende Eosina Y, um agente de transfe-rência de radicais livres, ou uma combinação dos mesmos.

[0013] Em algumas modalidades, os sistemas de microgel, com-posições, métodos e dispositivos ainda compreende uma fonte de luz configurada para iluminar uma mistura de uma pluralidade de partícu-las de microgel e o agente de recozimento. Em uma ou mais modali-dades, as partículas de gel microporoso compreendem peptídeos ade-sivos de célula expostos na sua superfície. Em algumas modalidades, as partículas de gel microporoso compreendem um Peptídeo K. Em modalidades adicionais ou suplementares, as partículas de gel micro- poroso compreendem um peptídeo K que compreende um grupo lisina de Fator Xllla reconhecido. Em algumas modalidades, as partículas de gel microporoso compreendem um peptídeo Q. Em algumas modali-dades, o peptídeo Q compreende um grupo glutamina fator XIIIa reco-nhecido. Em certas modalidades, as partículas de gel microporoso compreendem um reticulante que é degradável. Em certas modalida-des, as partículas de gel microporoso compreendem espaços intersti-ciais que compreendem superfícies de borda que exibem concavidade negativa. Em uma ou mais modalidades, o suporte covalentemente estabilizado de partículas de microgel tem um volume vazio de cerca de 10% a cerca de 50%.

[0014] Em uma modalidade, um sistema de gel microporoso para aplicações biomédicas inclui uma solução aquosa que contém uma pluralidade de partículas de microgel formadas com um reticulante biodegradável, tais como um reticulante de matriz metaloprotease (MMP) degradável e um agente de recozimento que, quando aplicado à pluralidade de partículas de microgel faz com que as partículas de microgel formem um suporte covalentemente estabilizado de partículas de microgel tendo espaços intersticiais nele.

[0015] Em uma outra modalidade, um sistema de gel microporoso inclui um dispositivo de entrega e um conjunto de partículas de micro-gel biodegradáveis contidas em uma solução aquosa e armazenadas no dispositivo de entrega. Um agente de recozimento ou o precursor de agente de recozimento é também armazenado no dispositivo de entrega. O dispositivo de entrega pode conter um único ou múltiplos compartimentos, dependendo da modalidade particular empregue.

[0016] Em uma outra modalidade, um método de tratamento de tecido inclui entregar ao tecido uma solução de base aquosa que contém uma pluralidade de partículas de microgel decoradas com peptí- deos adesivos de célula, em que as partículas de microgel são forma das com um reticulante biodegradável, tais como reticulante de matriz metaloprotease (MMP) degradável. A pluralidade de partículas de mi-crogel é exposta a um agente de recozimento que recoze as partículas de microgel para formar um suporte covalentemente estabilizado de partículas de microgel tendo espaços intersticiais nele.

[0017] Em uma outra modalidade, um sistema de gel microporoso para aplicações biomédicas inclui um conjunto de partículas de microgel formadas por uma reação de um polímero de estrutura principal tendo uma ou mais porções de ligação de células, um ou mais componentes de recozimento, e um componente reticulante de rede biodegradável. O sistema de gel microporoso inclui um agente de recozi- mento endógeno ou exógeno que liga as partículas de microgel em conjunto in situ por meio dos componentes de recozimento de modo a formar um suporte estabilizado covalentemente de partículas de microgel tendo espaços intersticiais nele.

[0018] Em outro aspecto, aqui descrito, são sistemas, composições, métodos e dispositivos que compreendem um dispositivo ou me-canismo de entrega e gel microporoso. Em certas modalidades, o dis-positivo de entrega contém uma solução aquosa que compreende uma pluralidade de partículas de microgel e o agente de recozimento ou um precursor de agente de recozimento. Em uma ou mais modalidades, o dispositivo de entrega compreende um dispositivo de entrega de único compartimento que contém a solução aquosa que compreende uma pluralidade de partículas de microgel e o agente de recozimento. Em uma ou mais modalidades, o dispositivo de entrega compreende um dispositivo de entrega de múltiplo compartimento (por exemplo, duplo), em que um compartimento contém a solução aquosa contendo plurali-dade de partículas de microgel e um primeiro precursor de agente de recozimento e o segundo compartimento contém a solução aquosa contendo pluralidade de partículas de microgel e um segundo precur sor de agente de recozimento. Em certas modalidades, géis micropo- rosos ainda compreendem um reticulante degradável de (MMP) que compreende, pelo menos, um aminoácido D. Em modalidades adicio-nais ou suplementares, as partículas compreendem um microgel reti- culante degradável de (MMP) compreende uma pluralidade de amino- ácidos D.

[0019] Em ainda outro aspecto, descrito aqui é um sistema de gel microporoso que compreende: um dispositivo de entrega; uma plurali-dade de partículas de microgel biodegradáveis contidas nem uma so-lução aquosa e armazenadas no dispositivo de entrega; e um agente de recozimento ou o precursor de agente de recozimento armazenado no dispositivo de entrega. Em uma ou mais modalidades, as partículas de gel microporoso ainda compreendem um conjunto de partículas de microgel biodegradáveis de dois ou mais tipos, que estão contidos em uma solução aquosa e armazenados no dispositivo de entrega. Em certas modalidades, o dispositivo de entrega compreende dois com-partimentos, partículas de microgel biodegradáveis são armazenadas em cada um dos dois compartimentos, e um primeiro precursor de re- cozimento é armazenado em um compartimento e um segundo pre-cursor de recozimento é armazenado no outro compartimento, em que o agente de recozimento é formado pela presença de ambos o primeiro e segundo precursores de recozimento. Em uma ou mais modalidades, o dispositivo de entrega compreende um compartimento único e o conjunto das partículas de microgel biodegradáveis e o agente de re- cozimento são ambos armazenados no compartimento único. Em ain-da outras modalidades ou adicionais, o agente de recozimento com-preende um fotoiniciador e um agente de transferência de radicais li-vres armazenado no compartimento único. Em uma modalidade adici-onal ou suplementar, o sistema de gel microporoso ainda compreende um dispositivo emissor de luz configurado para iluminar uma mistura do conjunto de microgel biodegradável e o agente de recozimento. Em certas modalidades, as partículas de microgel compreendem esferas substancialmente monodispersas. Em uma ou mais modalidades, as esferas substancialmente monodispersas têm um diâmetro dentro da gama de cerca de 30 micrômetros a cerca de 150 micrômetros. Em modalidades adicionais ou suplementares, as partículas de microgel são ligadas covalentemente a uma outra depois do recozimento.

[0020] Provido aqui em outro aspecto é um método de tratamento de tecido, compreendendo: entregar ao tecido uma solução de base aquosa que contém uma pluralidade de partículas de microgel; e expor a pluralidade de partículas de microgel a um agente de recozimento que recoze as partículas de microgel para formar um suporte covalen- temente estabilizado de partículas de microgel tendo espaços intersti-ciais nele. Em algumas modalidades, a pluralidade de partículas de microgel é decorada com peptídeos adesivos de célula, e em que as partículas de microgel são formadas com um reticulante de matriz me-taloprotease (MMP) degradável. Em uma ou mais modalidades, o agente de recozimento é entregue ao tecido. Em algumas modalida-des, o agente de recozimento está presente no interior do tecido. Em modalidades ainda adicionais, o método ainda compreende iniciar o recozimento das partículas de microgel com exposição à luz. Em al-gumas modalidades, o comprimento de onda de luz é na gama visível. Em algumas modalidades, o comprimento de onda de luz é na gama de infravermelhos. Em uma ou mais modalidades, a solução de base aquosa e o agente de recozimento são entregues simultaneamente. Em algumas modalidades, a solução de base aquosa e o agente de recozimento são entregues sequencialmente. Em modalidades ainda adicionais ou suplementares, as partículas de microgel compreendem um composto químico terapeuticamente ativo. Em certas modalidades, as partículas de microgel expõem ou eluem o composto químico para o tecido. Em uma ou mais modalidades, o tecido compreende um sítio de reconstrução cosmética, desenvolvimento de ferida crônica, dano tecidual agudo, ou uma abertura de tecido causada por incisão cirúrgi-ca.

[0021] Em outro aspecto, é proporcionado um sistema ou dispositivo de gel microporoso que compreende: um conjunto de partículas de microgel compreendendo um polímero de estrutura principal tendo uma ou mais porções de ligação de células, um ou mais componentes de recozimento, e um ou mais componentes de reticulante de rede biodegradável; e um agente de recozimento endógeno ou exógeno que liga as partículas de microgel em conjunto in situ por meio dos componentes de recozimento de modo a formar um suporte estabiliza-do covalentemente de partículas de microgel tendo espaços interstici-ais nele. Em certas modalidades, o polímero de estrutura principal compreende poli (etileno glicol) vinil sulfona. Em uma ou mais modali-dades, as uma ou mais porções de ligação de células compreendem um peptídeo RGD, ou um seu fragmento, fibronectina ou um fragmento deste, colágeno ou um seu fragmento, ou laminina ou um seu frag-mento. Em algumas modalidades, as uma ou mais porções de ligação de célula compreendem um peptídeo RGD, ou um seu fragmento. Em uma modalidade, as uma ou mais porções de ligação de células com-preendem SEQ ID NO: 3 ou um seu fragmento. Em modalidades adi-cionais ou suplementares, os um ou mais componentes de recozimen- to compreendem um peptídeo K e um peptídeo Q. Em certas modali-dades, o peptídeo K compreende um grupo lisina do Fator Xllla reco-nhecido e a peptídeo Q compreende um grupo glutamina de Fator Xllla reconhecido. Em algumas modalidades, o componente reticulante de rede biodegradável compreende um reticulante de matriz metalopro-tease (MMP) degradável. Em uma ou mais modalidades, o reticulante de (MMP) degradável compreende aminoácido D. Em certas modali- dades, o conjunto de partículas de microgel compreende partículas de microgel de dois ou mais tipos. Em uma ou mais modalidades, as par-tículas de microgel de um primeiro tipo compreendem reticulante de (MMP) degradável que compreende aminoácido D, e partículas de mi-crogel de um segundo tipo consistem em reticulante de (MMP) degra- dável compreendendo apenas ácido aminoácido L. Em uma ou mais modalidades, o sistema ou dispositivo compreende um dispositivo de entrega de único compartimento contendo o conjunto de partículas de microgel e o agente de recozimento. Em uma ou mais modalidades, o sistema ou dispositivo ainda compreende um dispositivo de entrega de compartimento duplo, em que um compartimento contém a solução aquosa contendo pluralidade de partículas de microgel e um primeiro precursor de agente de recozimento e o segundo compartimento con-tém a solução aquosa contendo pluralidade de partículas de microgel e um segundo precursor de agente de recozimento, em que o agente de recozimento é formado pela presença dos primeiros e segundos precursores de agentes.

[0022] Em um aspecto adicional, é descrito um método de tratamento de tecido que compreende: entregar ao tecido uma primeira camada de partículas de microgel decoradas com peptídeos adesivos de célula, em que as partículas de microgel são formadas com um re- ticulante biodegradável; expor a primeira camada de um agente de re- cozimento que recoze as partículas de microgel para formar um supor-te covalentemente estabilizado de partículas de microgel tendo espa-ços intersticiais no seu interior; entregar ao tecido uma segunda ca-mada de partículas de microgel decoradas com peptídeos adesivos de célula, em que as partículas de microgel são formadas com um reticu- lante biodegradável e em que as partículas de microgel na segunda camada diferem em uma de uma propriedade física ou composição química, em comparação com as partículas de microgel da primeira camada; e expor a segunda camada a um agente de recozimento que recoze as partículas de microgel para formar um suporte covalente- mente estabilizado de partículas de microgel tendo espaços interstici-ais nele. Em uma ou mais modalidades, as partículas de microgel na segunda camada têm um tamanho diferente. Em modalidades ainda adicionais, as partículas de microgel na segunda camada têm uma forma diferente. Em uma ou mais modalidade, as partículas de micro-gel na segunda camada têm uma rigidez diferente. Em certas modali-dades, componente químicos diferem de um componente químico na primeira camada. Em outra modalidade ou adicional, as partículas de microgel na segunda camada têm um componente químico de uma concentração diferente do mesmo componente químico na primeira camada.

[0023] Em outro aspecto, provido é um método de tratamento de tecido, compreendendo: entregar ao tecido uma solução de base aquosa que contém uma pluralidade de partículas de microgel decora-das com peptídeos adesivos de célula, em que as partículas de micro-gel são formadas com um reticulante biodegradável; expor a pluralida-de de partículas de microgel a um agente de recozimento que recoze as partículas de microgel para formar um suporte covalentemente es-tabilizado de partículas de microgel tendo espaços intersticiais nele.

[0024] Em uma outra modalidade, um método de tratamento de tecido inclui entregar ao tecido uma primeira camada de partículas de microgel decoradas com peptídeos adesivos de célula, em que as par-tículas de microgel são formadas com um reticulante biodegradável. A primeira camada é exposta a um agente de recozimento que recoze as partículas de microgel para formar um suporte covalentemente estabi-lizado de partículas de microgel tendo espaços intersticiais nele. Uma segunda camada de partículas de microgel decoradas com peptídeos adesivos de célula é entregue ao tecido, em que as partículas de mi crogel são formadas com um reticulante biodegradável e em que as partículas de microgel na segunda camada diferem em um de uma propriedade física ou composição química, em comparação com as partículas de microgel na primeira camada.

[0025] Em uma outra modalidade, um método de tratamento de tecido inclui entregar ao tecido uma solução de base aquosa que contém uma pluralidade de partículas de microgel decoradas com peptí- deos adesivos de célula, em que as partículas de microgel são formadas com um reticulante biodegradável. A pluralidade de partículas de microgel é exposta a um agente de recozimento que recoze as partícu-las de microgel para formar um suporte covalentemente estabilizado de partículas de microgel tendo espaços intersticiais nele.

[0026] Em ainda um aspecto adicional, descrito é um método de preparação de partículas de microgel que compreende: prover um dis-positivo microfluídicoque gera gotículas de água em óleo tendo uma pluralidade de canais de entrada que conduzem a um canal comum e um par de canais de compressão de óleo intersectando com o canal comum em uma localização à jusante que flui uma primeira solução de pré-polímero contendo uma estrutura principal do polímero modificado com oligopeptídeos para um primeiro canal de entrada; fluir uma se-gunda solução contendo um reticulante biodegradável para um segun-do canal de entrada; fluir um óleo e um tensoativo para o par de canais de compressão de óleo para formar gotículas contendo a primeira so-lução e a segunda solução de pré-polímero; e coletar as partículas de microgel formadas pela reticulação das gotículas. Em uma outra mo-dalidade, o método ainda compreende um terceiro canal de entrada interposto entre o primeiro canal de entrada e o segundo canal de en-trada, em que uma terceira solução inerte contendo um pré-polímero é escoada para o terceiro canal de entrada. Em uma ou mais modalida-des, o método ainda compreende chapear as gotículas geradas com um par adicional de canais de chapeamento localizados à jusante de uma localização, onde o par de canais de compressão de óleo inter- sectam com o canal comum, em que o par adicional de canais de cha- peamento transporta óleo e um tensoativo em uma concentração mais elevada do que o tensoativo contido no par à montante de canais de compressão de óleo. Em uma modalidade, o método ainda compreen-de a centrifugação das partículas de microgel coletadas. Em um outro aspecto, o método compreende a redução do teor de volume de água livre das partículas de microgel centrifugadas.

[0027] Em ainda outra modalidade, um método de preparação de partículas de microgel inclui prover um dispositivo de microfluido de geração de gotículas de água em óleo que tem uma pluralidade de ca-nais de entrada que conduzem a um canal comum e um par de canais de compressão de petróleo intersectando com o comum canal em uma localização a jusante. Uma primeira solução de pré-polímero contendo uma estrutura principal de polímero modificada com oligopeptídeos é vertida em um primeiro canal de entrada. Uma segunda solução con-tendo um reticulante biodegradável é vertida para um segundo canal de entrada. Um óleo e um tensoativo são vertidos para o par de canais de compressão de óleo para formar gotículas que contêm a primeira solução e a segunda solução de pré-polímero. Partículas de microgel são formadas por reticulação das gotículas que são em seguida reco-lhidas.

[0028] Outros objetivos, características e vantagens da presente invenção irão tornar-se evidentes para os versados na técnica a partir da descrição detalhada que se segue. Deve ser entendido, no entanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indi-cando algumas modalidades da presente descrição são dados a título de ilustração e não de limitação. Muitas variações e modificações den-tro do âmbito da presente divulgação podem ser feitas sem se afastar do espírito da mesma, e a divulgação inclui todas essas modificações. Além disso, aspectos de uma modalidade podem ser utilizados em ou-tras diferentes modalidades.

Breve Descrição dos Desenhos

[0029] As novas características da invenção são apresentadas com particularidade nas reivindicações anexas. Uma melhor compreensão das características e vantagens da presente invenção serão obtidas por referência à descrição detalhada seguinte que apresenta mo-dalidades ilustrativas, em que os princípios da invenção são utilizados, e os desenhos que acompanham dos quais:

[0030] A FIG. 1 ilustra uma porção de um suporte formado a partir de uma pluralidade de partículas de microgel recozido.

[0031] A FIG. 2A ilustra um processo exemplar de injeção de partículas de microgel a um sítio de ferida para a cura do mesmo.

[0032] A FIG. 2B ilustra esquematicamente uma reação de reco- zimento exemplar entre diferentes partículas de microgel potencializa-das por ligantes na superfície das partículas de microgel.

[0033] A FIG. 2C ilustra um processo exemplar de infiltração de tecido em um suporte formado dentro de um sítio de entrega sobre o tecido, em que a fronteira entre o tecido e os microgéis representa qualquer interface entre eles, onde as células podem passar através da interface de se movendo para dentro do tecido ou para fora em direção ao tecido a partir dos microgéis.

[0034] A FIG. 3 A ilustra uma vista de cima para baixo de um dis-positivo microfluídico de acordo com uma modalidade usada para gerar uma pluralidade de partículas de microgel como parte de um sistema de gel microporoso.

[0035] A FIG. 3B ilustra uma vista ampliada da região de geração de gotículas e região de compressão de óleo/tensoativo a jusante (vide região de caixa na FIG. 3A).

[0036] A FIG. 3C ilustra vistas em perspectiva, ampliadas de dois canais de ramificação ilustrados na FIG. 3A.

[0037] A FIG. 3D ilustra uma vista lateral do dispositivo microfluídi- co da FIG. 3A de acordo com uma modalidade.

[0038] A FIG. 3E ilustra uma fotografia tirada de uma redução para a prática do esquema ilustrado na FIG. 3B, onde solução fluorescente no lado esquerdo contém reticulante, a solução fluorescente à direita contém tampão de polímero e de reação, e o fluxo do meio contém uma solução líquida inerte para evitar a mistura das soluções da es-querda e direita antes da segmentação da gotícula. Fluorescência bri-lhante entre os fluxos da direita e do meio ilustra a mudança de pH no fluxo do meio devido à difusão de tampão de reação.

[0039] A FIG. 3F ilustra uma fotografia de uma redução para a prática do esquema ilustrado na FIG. 3B e FIG. 3E, ao mesmo tempo, mostrando a visão microscópica de luz da segmentação de gotícula após os fluxos de compressão de óleo serem introduzidos.

[0040] A FIG. 4A ilustra uma vista de cima para baixo de um dispositivo microfluídico de acordo com uma outra modalidade utilizada para gerar uma pluralidade de partículas de microgel como parte de um sistema de gel microporoso.

[0041] A FIG. 4B ilustra que, na região de segmentação de gotícu- la, o óleo mineral com 0,25% de Span® 80 comprime e segmentos PEG pre-gel, e a jusante uma solução a 5% Span® 80 em misturas de óleo mineral e impede a coalescência de microgéis a jusante antes da gelificação completa.

[0042] A FIG. 4C ilustra que gotículas não se recombinam durante a incubação na região da bifurcação e saem do microcanal para o poço de coleção.

[0043] A FIG. 5 ilustra uma junção em T de microfluidos exemplar que pode ser usada para gerar gotículas de microgel de acordo com uma modalidade.

[0044] A FIG. 6A ilustra um exemplar dispositivo de entrega na forma de uma seringa de dois canos de acordo com uma modalidade.

[0045] A FIG. 6B ilustra um dispositivo de entrega exemplar na forma de uma seringa de cano único de acordo com uma outra modalidade.

[0046] A FIG. 6C ilustra um dispositivo de entrega exemplar na forma de um tubo que mantém as partículas de microgel de acordo com uma modalidade.

[0047] A FIG. 7 A ilustra coloração de hematoxilina e eosina (coloração H&E) de seções de tecidos em camundongos SKH1-Hrhr para tecidos injetados com o suporte (Partículas Recozida Microporosa ou suporte "MAP"), bem como o controle não poroso vinte e quatro (24) horas após a injeção.

[0048] A FIG. 7B ilustra um gráfico de fechamento de feridas (%) como uma função de dias pós-injeção. Este gráfico mostra que durante um (5) período de cinco dias não há melhoria estatisticamente significativa nas taxas de fechamento da ferida para a utilização dos suportes em comparação com os controles bilaterais não porosos (N = 5).

[0049] A FIG. 7C ilustra imagens representativas de fechamento de ferida em um modelo de cura de ferida in vivo de 5 dias em camun-dongos SKH1-Hrhr comparando o suporte de gel (painéis esquerdos) com um controle de gel PEG não poroso (painéis da direita).

[0050] A FIG. 7D ilustra imagens representativas de fechamento de ferida em experiências com BALB/c in vivo de 7 dias. Após 7 dias in vivo, os suportes promovem a cicatrização da ferida significativamente mais rápida do que o controle sem tratamento, os géis que faltam os peptídeos K e Q, o gel de PEG não poroso, e uma cicatrização mais rápida do que o gel poroso pré-moldado. Géis porosos criados ex vivo para precisamente combinar o formato das feridas usando o método de moldagem canônico, baseado em agente porogênio, mostraram taxas de cicatrização de feridas apreciáveis, comparáveis aos supor-tes, mas falta injetabilidade (N > 5).

[0051] A FIG. 7E é um gráfico de barras ilustrando os dados de quantificação de fechamento de feridas de cicatrização de feridas de BALB/c in vivo para cada categoria de tratamento que corresponde à FIG. 7D. Todos os dados são apresentados como média +/- SEM. A significância estatística realizada usando teste-t bicaudal padrão (*: p < 0,05; ** p < 0,01).

[0052] A FIG. 7F ilustra traços de fechamento do leito da ferida durante 7 dias in vivo para cada categoria de tratamento que corresponde à FIG. 7D e à FIG. 7E.

[0053] A FIG. 7G ilustra que a solução contendas partículas de microgel ou pasta fluida pode ser injetada utilizando um dispositivo de seringa (por exemplo, uma seringa de calibre 25) como o da FIG. 6A ou 6B em um sítio de tratamento em que o microgel se conforma ao formato do sítio de injeção (por exemplo, neste caso um molde acrílico de laser de corte em forma de estrela) e subsequente recozimento do suporte na forma de estrela.

[0054] As FIGS. 8A e 8B ilustram imagens microscópicas coradas de tecido danificado (por exemplo, sítio de ferida) que foi tratado com o suporte de microgel (FIG. 8A) e com nenhum tratamento ou "simulacro" (FIG. 8B) em um modelo de camundongo vinte e um (21) dias após a excisão de pele e aplicação de gel. A redução da cicatriz permitida pelo microsequestrante de gel pode ser claramente vista na FIG. 8A. Quadrados indicam os folículos capilares e glândulas sebáceos (glândulas sebáceas) no tecido de reconstituição após a aplicação do gel a uma ferida. Círculos indicam partículas de microgel remanescen-tes no tecido de reconstituição.

[0055] A FIG. 8C ilustra um gráfico mostrando a espessura da epi- derme para o tecido tratado com o simulacro bem como o tecido trata-do com o suporte de gel.

[0056] A FIG. 8D ilustra um gráfico mostrando o número de glândulas sebáceas para o tecido tratado com o simulacro bem como o tecido tratado com o suporte de gel.

[0057] A FIG. 8E ilustra um gráfico que mostra o número de folícu- los capilares para o tecido tratado com o simulacro bem como o tecido tratado com o suporte de gel.

[0058] A FIG. 8F ilustra um gráfico que mostra a largura de cicatriz do tecido tratado com o simulacro bem como o tecido tratado com o suporte de gel.

[0059] A FIG. 8G ilustra um gráfico mostrando o número de cistos miliais para o tecido tratado com o simulacro bem como o tecido trata-do com o suporte de gel.

[0060] A FIG. 9 A ilustra um gráfico de módulo de armazenamento como uma função do tempo pós-mistura, durante diferentes cinéticas de gelificação (pH e temperatura). pH 8,25, a 25 graus Celsius, é re-presentada pela linha de fundo no gráfico; pH 8,8 a 25 graus Celsius, é representada pela linha superior no gráfico; e pH 8,25 a 37 graus Cel-sius, é representada pela linha do meio no gráfico.

[0061] A FIG. 9B ilustra diferentes percentagens em peso de hi- drogel que foram usadas para produzir diferentes materiais de rigidez no eixo x. O gráfico ilustrado módulo de armazenamento (Pa) para várias percentagens em peso de hidrogel.

[0062] A FIG. 9C ilustra diferentes estequiometrias de reticulante que foram usadas para produzir diferentes valores de rigidez no gel resultante no eixo x. O gráfico ilustrou o módulo de armazenamento (Pa) como uma função da razão r de extremidades livres de reticulante (-SH) para grupos vinila (-VS) sobre a molécula de PEG.

[0063] A FIG. 9D ilustra um gráfico da degradação de % como uma função do tempo, tanto para o controle não poroso (linha inferior do gráfico), bem como um gel poroso aqui descrito (linha superior do gráfico).

[0064] A FIG. 9E mostra imagens SEM de um suporte recozido com FXIIIa em 200 μm (painel superior) ou 100 μm (painel inferior).

[0065] A FIG. 9F ilustra imagens SEM de partículas de microgel sem FXIIIa em 200 μm (painel superior) ou 100 μm (painel inferior). Partículas de microgel não recozidas são vistas na FIG. 9F.

[0066] A FIG. 10 mostra um microgel fabricado utilizando a técnica descrita, em que a superfície do microgel foi aumentada com uma pro-teína fluorescente de albumina de soro bovino (BSA) (perímetro exte-rior) através da utilização de química de "clique" fosfina - azida. Além disso, as nanopartículas (500 nm) estão embutidas dentro do microgel durante a fabricação de microfluidos.

[0067] A FIG. 11 ilustra um processo exemplar de tratamento de tecido danificado utilizando o sistema de gel microporoso aqui descrito. Partículas de microgel são aplicadas (painel superior), opcionalmente, um aplicador é utilizado (segundo painel), recozimento de partículas de microgel é iniciado para formar um suporte (terceiro painel) e melhora da cicatrização de feridas é observada (painel inferior).

[0068] A FIG. 12A ilustra imagens fluorescentes demonstrando a formação de redes de célula 3D durante seis dias de cultura em supor-tes de gel porosos in vitro bem como géis não porosos após 6 dias. (350 Pa: módulo de volume idêntico os suportes de gel poroso, 600 Pa: módulo de microescala combinado a microgéis individuais).

[0069] A FIG. 12B ilustra um gráfico onde a sobrevivência de células vinte e quatro (24) horas após recozimento é maior do que 93% ao longo de três linhagens de células que representam diferentes tipos de tecidos humanos. HDF: fibroblastos dérmicos humanos, AhMSC: célu-las estaminais mesenquimais humanas derivadas de adipose, BMh- MSC: células estaminais mesenquimais humanas derivadas da medula óssea.

[0070] A FIG. 13 A ilustra um método exemplar para a combinação de células vivas com partículas de microgel pré-formadas antes de re- cozimento. As partículas de microgel são recozidas uma à outro, apri-sionando as células vivas no interior da rede microporosa interligada criada após recozimento de microgel.

[0071] As FIGS. 13B-D são imagens fotográficas que ilustram que as soluções de partículas de microgel combinadas com células vivas são moldáveis em formas de macroescala, e podem ser injetadas para formar formas complexas que são mantidas depois do recozimento. FIG. 13B ilustra injeção de seringa in vitro exemplar. FIG. 13C ilustra uma moldagem de formato in vitro exemplar. FIG. 13D ilustra um su-porte recozido in vitro exemplar. FIG. 13E ilustra que partículas de mi-crogel são moldáveis em formas de macroescala e podem ser realiza-das na presença de células vivas (indicadas pelas setas que apontam para células HEK-293T fluorescentes).

[0072] A FIG. 14A ilustra um gráfico mostrando que vários tamanhos de partículas de microgel podem ser sintetizados através de uma gama de frequências de produção de uma modalidade exemplar.

[0073] A FIG. 14B ilustra que o fornecimento de uma alta pressão de entrada para cada entrada de solução (em que as entradas de óleo são superiores a 30 psi) permite um aumento na frequência de produção em outra modalidade exemplar.

[0074] A FIG. 14C ilustra um gráfico que mostra que fabricação de precisão elevada de blocos de construção de microgel permite a cria-ção de suportes de gel definidos. Diferentes tamanhos de bloco de construção permitem um controle determinístico sobre as característi-cas de rede microporosa resultante, aqui apresentadas como tama-nhos de poros médios +/- desvio padrão (SD).

Descrição Detalhada das Modalidades Ilustradas

[0075] Na descrição da modalidade preferida, é feita referência aos desenhos anexos que formam uma parte da mesma, e em que é mostrada a título de ilustração uma modalidade específica em que a matéira aqui descrita pode ser praticada. Deve ser entendido que ou-tras modalidades podem ser utilizadas e mudanças estruturais podem ser feitas sem sair do âmbito e espírito do tema inventivo aqui descrito. Além disso, vários aspectos de diferentes modalidades podem ser uti-lizados com outras modalidades aqui descritas sem se afastarem do âmbito da invenção.

[0076] Em um aspecto da matéria aqui descrita, um suporte de microgel sólido para aplicações biomédicas, tais como cicatrização de feridas, é divulgado que é formado quando uma pluralidade de partícu-las de microgel são recozidas uma à outra em uma reação de recozi- mento. A reação de recozimento, em um aspecto da matéria aqui des-crita, forma ligações covalentes entre as partículas de microgel adja-centes. Por exemplo, no estado pós-recozido, o suporte forma uma estrutura tridimensional que se conforma ao sítio de aplicação ou de entrega. Por causa da embalagem imperfeita das partículas de micro-gel, o suporte recozido formado a partir das partículas inclui espaços intersticiais nele formados onde as células podem migrar, se aglutinar, e crescer. A estrutura de suporte formado é porosa sob recozimento na ferida ou outro sítio de entrega (ao contrário do suporte sólido não poroso provido por produtos à base de fibrina). Esta porosidade inclui os espaços intersticiais mencionados acima, bem como poros nanos- cópicos que podem ser criados ou formados nas próprias partículas. A microporosidade da estrutura de suporte permite alta difusividade de nutrientes, crescimento celular e fatores de diferenciação, bem como migração de células, crescimento interno, e penetração. A microporo- sidade do suporte fornece a cura acelerada ou entrega de fármacos terapêuticos melhorada ou medicamentos sobre cola de fibrina con-vencional, polímeros hiper-ramificados, ou polímeros degradáveis com opções de reticulante, por causa da migração celular aumentada atra-vés de espaços intersticiais, mantendo a integridade global do suporte. Além, mas não se limitando a materiais biométricos a naturais, o perfil de degradação e propriedades físicas (por exemplo, dureza, difusidade interna, etc.) é melhorado, por exemplo, tendo uma ampla faixa dispo-nível e uma matriz mais ampla de sinais biológicos ou químicos tera- peuticamente ativos que podem ser incluídas dentro do material (por exemplo, antibióticos, esteroides, fatores de crescimento, e semelhan-tes podem ser carregados no suporte). Além disso, a liberação ou a eluição dos fármacos, compostos, ou de outro material para desenca-dear ou controlar a atividade biológica, em certas modalidades, pode ser sintonizada por meio da modificação do biomaterial desejado. Os compostos ou moléculas de sinal acima discutidos podem ser expostos ao tecido durante o processo de cura ou degradação do suporte. Os compostos ou moléculas de sinal também podem ser liberados ou eluídos na área afetada após a colocação inicial do suporte no sítio de entrega.

[0077] Uma vantagem da matéria aqui descrita além dos métodos tais como tecnologia STAR™ é que a formação de um suporte ocorre in vivo, permitindo que ele preencha completamente o espaço desejado e ser sintonizado para se ligar (quimicamente ou de outro modo) ao tecido circundante. Além disso, a formação de pré-entrega das partícu-las de microgel permite sintonia mecânica controlada do suporte for-mado resultante para coincidir com as propriedades do tecido circun-dante. Estas capacidades resultam em uma melhor vedação e integra-ção total com o tecido. Maior integração resulta na diminuição da pos-sibilidade de falha do material e maior regeneração de longo prazo. Isto também ajuda a evitar a contaminação do ambiente. Além disso, a natureza microporosa do suporte recozido é benéfica para reduzir a resposta a corpo estranho imune ao suporte.

[0078] A FIG. 1 ilustra uma porção do suporte tridimensional formado 10 que é formado por uma pluralidade de partículas de microgel recozido 12. O suporte 10 inclui nele espaços intersticiais 14 que são espaços vazios que formam microporos dentro do suporte maior 10. Os espaços intersticiais 14 têm dimensões e perfis geométricas que permitem a infiltração, ligação e crescimento de células. Deve ser apreciado que a natureza microporosa do suporte 10 aqui divulgado envolve uma rede de espaços intersticiais ou espaços vazios 14 locali-zados entre as partículas de microgel recozido 12 que formam a estru-tura de suporte maior. Em uma modalidade, os espaços intersticiais ou espaços vazios 14 criados dentro do suporte 10 exibem concavidade negativa (por exemplo, a superfície vazia interior é convexa). FIG. 1 ilustra um vazio exemplar 14 com paredes vazias 16 exibindo concavi-dade negativa. A concavidade negativa é causada porque as partículas de microgel 12 que são recozidas umas com as outras são, em geral ou substancialmente de forma esférica em uma modalidade preferida. Isto permite o empacotamento das partículas de microgel 12 que, de acordo com uma modalidade, produzem uma fração de baixo volume vazio entre cerca de 10% e cerca de 50% e, em outro enquadramento, entre cerca de 26% a cerca de 36%. Enquanto a fração de volume vazio é baixa, a concavidade negativa exibida em certas modalidades no âmbito da rede de espaços vazios 14 proporciona uma área superficial relativamente elevada para volume de vazio para células para interagir. Para um dado volume de células, que, em seguida, iria, em média, ser exposto a ainda mais superfícies e maiores (por exem-plo, nas paredes de vazios 16) para interagir com a rede de espaços vazios no suporte 10.

[0079] É importante notar que a rede de vazio consiste em regiões onde as superfícies de microgel estão em estreita proximidade (por exemplo, partículas de microgel recozido vizinhas próximas 12) que conduzem às regiões adesivas de área superficial elevada para que as células adiram e rapidamente migrem, enquanto regiões vizinhas adi-cionais nos espaços entre as partículas de microgel 12 têm um espaço vazio maior que pode permitir o crescimento de células e tecidos neste espaço. Por conseguinte, a adjacência combinada das áreas vazias mais apertadas e áreas vazias mais amplas se espera que tenha um efeito benéfico no crescimento de tecido e recrescimento, em compa-ração com vazios quer inteiramente pequenos ou todos vazios maio-res.

[0080] Note-se que na modalidade acima descrita, os resultados de concavidade negativa é devido à forma esférica das partículas de microgel 12. Em outras modalidades, as partículas de microgel 12 po-de não ser em forma esférica. Outras formas não esféricas podem ainda ser utilizadas no suporte 10. Ainda com referência à FIG. 1, o suporte 10 é formado por partículas de microgel 12 que são fixadas uma à outra por meio de superfícies de recozimento 17. Como expli-cado no presente documento, o superfícies de recozimento 17 são formadas, quer durante ou após a aplicação das partículas de microgel 12 no sítio de entrega pretendido.

[0081] O suporte 10 pode ser utilizado para várias aplicações, incluindo uma variedade de aplicações médicas, tais como a medicina de campo militar, tratamento médico-traumático, fechamento pós- cirúrgico, lesões por queimadura, desordens bolhosas inflamatórias, e autoimunes, e hereditárias, etc., Em uma ou mais modalidades, o su-porte 10 é utilizado como um selante de tecido (por exemplo, uma substância de cicatrização de ferida aguda, selante cirúrgico, agente tópico de espessura parcial, espessura total, ou feridas de encapsula-mento, úlceras de pressão, úlceras venosas, úlceras diabéticas, úlce- ras venosas crônicas, locais de enxerto de pele de doadores, cirurgia de pós-Moh, cirurgia pós-laser, feridas podiátricas, deiscência de feri-das, abrasões, lacerações, queimaduras de segundo ou terceiro grau, lesão por radiação, rasgos na pele e feridas de drenagem, e seme-lhantes). As FIGS. 2A-2C ilustram uma modalidade, onde o suporte 10 é utilizado para tratar um sítio de ferida 100 formado no tecido 102 de um mamífero. Em certas modalidades, o suporte 10 é usado para o tratamento de feridas agudas imediatas. Em feridas agudas, o suporte 10 fornece vários benefícios, incluindo um método rápido para selar feridas 100, evitar a perda de água transepidérmica, fornecer células ou medicamento (s), e melhorar a cicatrização de feridas da pele (por exemplo, locais de cirurgia, feridas de queimaduras, úlceras) para pro-porcionar o desenvolvimento de tecido mais natural (por exemplo, evi-tando a formação de tecido cicatricial). Uma vantagem particular do suporte 10, é a capacidade do suporte 10 para reduzir ou minimizar a formação de tecido cicatricial. O suporte 10 fornece uma alternativa mais eficaz para colas de tecido e outros preenchedores de tecidos injetáveis atuais e adesivos.

[0082] Como pode ser visto na FIG. 2A, as partículas de microgel 12 são entregues ao sítio da ferida 100, seguido pela iniciação da reação de recozimento para recozer as partículas de microgel 12 uma na outra para formar o suporte 10. Como visto na FIG. 2A, o sítio da ferida 100 é vedado pelo suporte 10 e conforme o tempo progride, o sítio da ferida 100 é curado para o tecido normal (ver também Fig. 11). FIG. 2B ilustra a forma como as partículas de microgel adjacentes 12 (partículas A e partículas B) submetem-se à iniciação química ou enzimática da reação de recozimento de modo a formar uma superfície de reco- zimento 17 entre as partículas de microgel 12. A Fig. 2C ilustra uma vista ampliada que ilustra a forma como o suporte 10 atua como um suporte estrutural, ainda permite a infiltração de tecido e reabsorção biomaterial devido à natureza porosa do suporte 10. Uma célula 106 é ilustrada infiltrando os espaços intersticiais formados dentro do suporte 10.

[0083] O suporte 10 pode também ser utilizado em uma capacidade de regeneração, por exemplo, aplicada ao tecido por queimaduras, feridas agudas e crônicas, e semelhantes. Em uma modalidade, o suporte 10 é utilizado para feridas crônicas. Em feridas crônicas, em que o processo de cicatrização normal é inibido, o suporte 10 pode ser uti-lizado não só para selar feridas, mas também para remover o excesso de umidade, e aplicar medicação (s), incluindo terapias celulares que podem ajudar na promoção do processo de cura de feridas normal. No caso de aplicações de preenchedores de tecido para a perda de volu-me relacionadas com o envelhecimento, lipoatrofia, lipodistrofia, cica-triz dérmica, ou ritides superficiais ou profundas, injeção das partículas de microgel 12 diretamente para dentro da derme através da agulha ou cânula pode ser usada para melhorar o contorno do tecido, perda de tecido, ou deslocamento de tecidos. Porque células usadas em medicina alternativa podem crescer dentro de partículas de microgel 12, células (por exemplo, células estaminais mesenquimais, fibroplas- tos, etc.) podem ser incluídas como uma terapia inicialmente polimeri- zando as células (1-20 células) dentro das partículas de microgel, ou células podem ser inicialmentes aderidas a partículas de microgel, ou células podem ser introduzidas com a solução de partícula de microgel (não aderida), antes de recozer in situsitu no tecido.

[0084] O suporte 10 pode também ser usado para o crescimento in vitro de tecido, as matrizes tridimensionais (3D) para estudos de ciên-cia biológica, e aplicações cosméticas e dermatológicas. Por exemplo, as células cancerosas podem ser semeadas juntamente com os pre-cursores de microgel e uma vez recozidas poderiam permitir o cresci-mento 3D rápido de esferoides tumorais para o teste de fármacos mais fisiologicamente relevante sem a necessidade de degradação da ma-triz, como seria necessário para outros géis de cultura 3D (por exem-plo, Matrigel®). Espera-se que a rápida capacidade de formar contatos entre as células na matriz 3D do gel recozido irá aumentar o cresci-mento e a formação de microtecidos a partir de um único tipo de célu-las ou de vários tipos de células que podem ser utilizadas para o ras- treio de fármacos ou cosméticos de teste. Camadas epidérmicas po-dem se formar sobre a superfície de um suporte 10, o que poderia permitir o teste de fármacos ou cosméticos, em um substituto mais semelhante à pele em comparação com modelos animais. Materiais de cultura 3D anteriores tanto podem permitir a sementeira de células dentro do gel de modo uniforme através do volume, mas não mantêm os contatos célula-célula, devido à falta de porosidade, ou criam poro-sidade, mas requerem que células sejam semeadas na sequência de fabricação e migrem para dentro do suporte.

[0085] Tal como aqui explicado, enquanto o suporte recozido 10 forma geralmente uma estrutura definida, os materiais precursores antes da recozimento final é fluido e pode ser entregue como uma pasta, suspensão, ou mesmo injetado no sítio de entrega de interesse. Outros hidrogéis injetáveis podem fornecer um suporte para recrescimen- to e regeneração tecidual in situ, no entanto estes materiais injetados exigem degradação de gel antes da reformação do tecido limitando a sua capacidade de fornecer suporte físico. O sistema de gel injetável microporoso aqui descrito contorna este desafio fornecendo uma rede microporosa interligada para reformação de tecido simultânea e de-gradação do material.

[0086] Formação microfluídica permite que partículas de microgel substancialmente monodispersas 12 se formem em um suporte partí-cula recozido microporosa interligado 10 (em um aspecto da matéria aqui descrita), permitindo desse modo que o produto químico controla- do, físico e propriedades geométricas das partículas de microgel 12 (por exemplo, blocos de construção), para proporcionar um controle à jusante das propriedades físicas e químicas do suporte montado 10. Formação in vitro, as células incorporadas no suporte 10 proliferam e formam redes tridimensionais extensas dentro de quarenta e oito (48) horas. In vivo, o sistema de gel injetável que forma o suporte 10 facilita a migração de células, resultando em formação rápida regeneração dos tecidos e estrutura do tecido cutâneo no prazo de cinco (5) dias. A combinação de microporosidade e injetabilidade alcançada com os suportes 10 permite novas vias para regeneração in vivo e criação de tecido novo.

[0087] A FIG. 2A ilustra o suporte 10 formado dentro de um sítio de ferida 100. Materiais bem sucedidos para benefício de regeneração de tecidos a partir de combinação precisa da taxa de degradação de material para o desenvolvimento do tecido. Se a degradação ocorre muito rapidamente, em seguida, suportes insuficientes irá permanecer para suportar o crescimento interno de tecido. Por outro lado, uma taxa que é muito lenta irá impedir o desenvolvimento adequado dos tecidos e pode promover a fibrose e/ou a rejeição imune. Ajuste das taxas de degradação com base no ambiente local foi abordado usando materiais hidroliticamente e enzimaticamente degradáveis. No entanto, a perda de dissociação de estabilidade mecânica de material com infiltração celular provou extremamente desafiador. Promoção da infiltração celular para o material também pode ser abordada utilizando uma matriz ligeiramente reticulada, no entanto, isto resulta muitas vezes em má combinação mecânica com os tecidos circundantes e estabilidade do material pobre. Alternativamente, a taxa de degradação do hidrogel pode ser ajustada por alteração da identidade da estrutura principal polimérica ou densidade de reticulação, combinando as taxas de de-gradação e formação de tecido. Embora estas técnicas possam ser ajustadas para dirigir as aplicações específicas de hidrogéis injetáveis, elas não proveem um percurso robusto para alcançar integração de tecido volumoso que não dependem de perda de estabilidade de mate-rial.

[0088] Cada sítio da ferida é único em seus requisitos de degradação química e física para regeneração de tecidos funcionais, requerendo uma estratégia de material que é robusta para uma variedade de ambientes desafiadores. O sistema de gel microporoso e o suporte resultante 10 que é criado como aqui descrito evita a necessidade de degradação do material antes do crescimento interno de tecido forne-cendo uma rede interligada estavelmente ligada de microporos para a migração de células e a integração em massa com o tecido circundan-te. O sistema de gel microporoso consegue estas características favo-ráveis ao, de acordo com uma modalidade, utilizar a automontagem de partículas de microgel 12 como "blocos de construção" ou "subunida- des", formadas por segmentação de gotícula de água em óleo de mi- crofluidos. De acordo com uma modalidade, as partículas de microgel 12 formadas deste modo são substancialmente monodispersas. As partículas de microgel 12 podem ser injetadas e moldadas em qualquer forma desejada. Grades de partículas de microgel 12 são então hibridadas uma com as outras através de funcionalidades de superfície para formar um suporte microporoso interligado 10 quer com ou sem células presentes nas redes porosas interligadas. O suporte 10 de um modo preferido, em uma modalidade, inclui partículas de microgel co- valentemente ligadas 12 que formam um suporte tridimensional 10 pa-ra a regeneração de tecido e crescimento interno.

[0089] Ao combinar injetabilidade e microporosidade, o sistema de gel microporoso proporciona um suporte biomaterial ideal para uma eficiente formação de rede celular in vitro e integração de tecido volu-moso in vivo. O sistema de gel microporoso modular também fornece suporte mecânico para a migração rápida de células, sinais molecula-res para a adesão celular direta, e reabsorção durante e após a rege-neração dos tecidos. Através de fabricação de microfluidos, as propri-edades química, física, e geométricas das partículas de microgel 12 podem ser previsíveis e uniformemente adaptadas, permitindo o con-trole a jusante das propriedades dos suportes emergentes 10. A abor-dagem baseada em blocos de construção novos nos quais robusta-mente alcançou automontagem imperfeita é desejável para atingir mi- croporosidade muda fundamentalmente o uso e implementação de hi- drogéis como construtos miméticos de tecidos, provendo um mudança filosófica na abordagem para suportes injetáveis para integração teci- dual em massa.

[0090] Em um aspecto do matéria aqui descrita, o sistema de gel microporoso utiliza partículas de microgel 12 tendo dimensões de diâ-metro dentro do intervalo de cerca de 5 μm até cerca de 1000 μm. As partículas de microgel 12 podem ser feitas a partir de um polímero hi- drofílico, polímero anfifílico, polímero sintético ou natural (por exemplo, poli (etileno-glicol) (PEG), poli (propileno glicol), poli (metacrilato de hidroxietila), ácido hialurônico (HA), gelatina, fibrina, quitosano, hepa- rina, heparano, e versões sintéticas de HA, gelatina, fibrina, quitosano, heparina, ou heparano). Em uma modalidade, as partículas de microgel 12 são feitas a partir de quaisquer polímeros naturais (por exemplo, HA modificado) ou sintéticos (por exemplo, PEG) capaz de formar um hidrogel. Em uma ou mais modalidades, uma rede polimérica e/ou qualquer outra rede de suporte capaz de formar um construto de hi- drogel sólido pode ser usada. Materiais de suporte adequados para a maioria das aplicações de medicina de engenharia de tecidos/regene- rativos são geralmente biocompatíveis e de preferência biodegradá-veis. Exemplos de suportes biocompatíveis e biodegradáveis adequa-dos incluem: carboidratos poliméricos naturais e seus derivados sinte- ticamente modificados, reticulados, ou substituídos, tais como gelatina, ágar, agarose, ácido algínico reticulado, quitina, gomas guar substituí-das e reticuladas, ésteres de celulose, especialmente com ácidos ni-trosos e ácidos carboxílicos, ésteres mistos de celulose, e éteres de celulose; polímeros naturais contendo nitrogênio, tais como proteínas e seus derivados, incluindo gelatinas reticuladas ou modificadas e que- ratinas; polímeros de vinila tais como poli (etilenoglicol) acrilato/meta- crilato sulfona de vinil/maleimida/norboreno/alila, poliacrilamidas, poli- metacrilatos, copolímeros e terpolímeros dos policondensados acima, tais como poliésteres, poliamidas, e outros polímeros, tais como poliu-retanos; e misturas ou copolímeros das classes acima referidas, tais como copolímeros de enxerto obtidos por inicializar a polimerização de polímeros sintéticos em um polímero natural preexistente. Uma varie-dade de polímeros biocompatíveis e biodegradáveis estão disponíveis para utilização em aplicações terapêuticas; Exemplos incluem: polica- prolactona, poliglicólido, polilactida, poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), e ácido poli-3-hidroxibutirato. Os métodos para produzir redes de tais materiais são bem conhecidos.

[0091] Em uma ou mais modalidades, as partículas de microgel 12 incluem ainda produtos químicos ligados de forma covalente ou molé-culas que atuam como modificações de sinalização que são formadas durante a formação do partícula de microgel 12. Modificações de sina-lização incluem a adição de, por exemplo, peptídeos adesivos, proteí-nas da matriz extracelular (ECM), e semelhantes. Grupos funcionais e/ou ligantes também podem ser adicionados às partículas de microgel 12 após a sua formação, quer através de métodos covalentes ou de interações não covalentes (por exemplo, interações de carga-carga eletrostática ou sequestro de difusão limitada). Reticulantes são sele-cionados dependendo da característica de degradação desejada. Por exemplo, reticulantes para as partículas de microgel 12 podem ser de- gradados hidroliticamente, enzimaticamente, fotoliticamente, ou seme-lhantes. Em uma modalidade particularmente preferida, o reticulante é um reticulante degrádavel de matriz metaloprotease (MMP).

[0092] Exemplos desses reticulantes são peptídeos fabricados sin-teticamente ou naturalmente isolados com sequências que correspon-dem a substrato alvo MMP-1, substrato alvo MMP-2, substrato alvo MMP-9, sequências aleatórias, sequências alvo Omi, sequências de proteína alvo de choque térmico, e qualquer uma destas sequências listadas com todos ou alguns aminoácidos sendo quiralidade D ou qui- ralidade L. Em uma outra modalidade, as sequências de reticulante são polímeros hidroliticamente naturais e sintéticos degradáveis, con-sistindo nas mesmas estruturas principais listadas acima (por exemplo, heparina, alginato, poli (etilenoglicol), poliacrilamidas, polimetacrilatos, copolímeros e terpolímeros dos policondensados listados, tais como poliésteres, poliamidas e outros polímeros, tais como poliuretanos).

[0093] Em uma outra modalidade, os reticulantes são oligos de DNA fabricados sinteticamente ou naturalmente isolados com sequências que correspondem a: sequências de restrição de reconhecimento de enzimas, motivos de CpG, motivos de dedo de zinco, CRISPR ou sequências CAS-9, sequências de reconhecimento de garra, e domí-nios de ligação fator de transcrição. Qualquer um dos reticulantes das modalidades enumeradas são ativados em cada extremidade por um grupo reativo, definido como um grupo químico permitindo que o reti- culante participe na reação de reticulação para formar uma rede de polímero ou gel, em que estas funcionalidades podem incluir: aminoá- cidos cisteína, moléculas sintéticas e que ocorrem naturalmente con-tendo tiol, grupos contendo carbeno, ésteres ativados, acrilatos, norbo- renos, aminas primárias, hidrazidas, fosfenos, azidas, contendo grupos epóxi, grupos contendo SANPAH, grupos contendo diiazirina.

[0094] Em uma modalidade, a química usada para gerar partículas de microgel 12 permite recozimento subsequente e formação de su-porte 10 por meio de polimerização iniciado por radical. Isto inclui inici-adores químicos, tais como persulfato de amônio combinado com te- trametiletilenodiamina. Alternativamente, fotoiniciadores tais como Ir- gacure® 2959 ou Eosina Y em conjunto com um agente de transferên-cia de radicais livres, tal como um grupo tiol livre (utilizado em uma concentração dentro da gama de 10 μM a 1 mM) pode ser utilizado em combinação com uma fonte de luz que é utilizada para iniciar a reação, tal como aqui descrito. Um exemplo de um grupo tiol livre pode incluir, por exemplo, o aminoácido cisteína, tal como aqui descrito. Natural-mente, também podem ser utilizados peptídeos incluindo uma cisteína livre ou moléculas pequenas, incluindo um tiol livre. Outro exemplo de um agente de transferência de radicais livres incluem N-vinilpirrolidona (NVP).

[0095] Em alternativa, as reações de adição de Michael e pseudo-Michael, incluindo grupos α,β-insaturados de carbonila (por exemplo, acrilatos, vinilsulfonas, maleimidas, e semelhantes) a um grupo nu- cleofílico (por exemplo, tiol, amina, aminóxi) pode ser utilizado para recozimento de partículas de microgel 12 para formar o suporte 10. Em uma outra modalidade alternativa, partícula de microgel 12 de for-mação química permite a formação da rede através de transições de sol-gel iniciadas incluindo fibrinogênio em fibrina (através da adição da enzima trombina catalítica).

[0096] As funcionalidades que permitem a hibridação de partícula- partícula estão incluídas, quer durante ou após a formação das partí-culas de microgel 12. Em uma ou mais modalidades, estas funcionali-dades incluem grupos carbonila α,β-insaturados, que podem ser ativa-dos para o recozimento, quer através de reação iniciada por radical com grupos carbonila α,β-insaturados em partículas adjacentes ou re-ações de adição de Michael e pseudo-Michael com funcionalidades nucleófilas que, ou são apresentadas exogenamente como um agente de ligação multifuncional entre partículas ou como grupos funcionais presentes nas partículas adjacentes. Este método pode usar vários tipos de população de partículas de microgel 12 que, quando mistura-dos formam um suporte 10. Por exemplo, partículas de microgel 12 do tipo X apresentando, por exemplo, grupos superficiais nucleofílicos podem ser usadas com partículas de microgel 12 tipo Y apresentando, por exemplo, grupos carbonila α,β-insaturados. Em uma outra modali-dade, as funcionalidades participantes de química de clique podem ser incluídas permitindo a ligação, quer diretamente às partículas de mi-crogel 12 adjacentes que apresentam funcionalidades de clique com-plementar ou através de uma molécula multifuncional exogenamente apresentada que participa ou inicia (por exemplo, cobre) reações cli-que.

[0097] A funcionalidade de recozimento pode incluir qualquer fun-cionalidade previamente discutida usado para reticulação de microgel que é ortogonal ou semelhante (se os grupos reativos potenciais per-manecem) em termos das suas condições de iniciação (por exemplo, temperatura, luz, pH) em comparação com a primeira reação de reticu- lação. Por exemplo, se a reação de reticulação inicial consiste em uma reação de adição de Michael que é dependente da temperatura, a fun-cionalidade de recozimento subsequente pode ser iniciada através de temperatura ou fotoiniciação (por exemplo, eosina Y, Irgacure®). Como outro exemplo, os microgéis iniciais podem ser fotopolimerizados a um comprimento de onda de luz (por exemplo, ultraviolent com Irgacu- re®), e o recozimento das partículas de microgel 12 ocorre ao mesmo ou outro comprimento de onda de luz (por exemplo, visível com Eosina Y) ou vice versa. Além de recozimento com reações de acoplamento covalente, as porções de recozimento podem incluir interações não covalentes hidrofóbicas, hóspede/hospedeira (por exemplo, ciclodex- trina), hibridação entre sequências de ácidos nucleicos complementa-res ou imitações de ácido nucleico (por exemplo, proteína de ácido nu- cleico) em partículas de microgel adjacentes 12, ou interações iônicas. Um exemplo de uma interação iônica consistiria de funcionalidade de alginato nas superfícies das partículas de microgel que são recozidas com o Ca2+. As assim chamadas reações "A + B" podem ser utiliza-das para recozimento de partículas de microgel 12. Nesta modalidade, dois tipos separados de microgel (Tipo A e Tipo B) são misturados em proporções variáveis (entre 0,01:1 e 1:100 de A: B) e as funcionalida-des de superfície do tipo A reagem com o tipo B (e vice-versa) para iniciar o recozimento. Estes tipos de reação podem cair em qualquer dos mecanismos listados aqui.

[0098] Em uma modalidade, as partículas de microgel 12 são fa-bricadas usando métodos quer microfluidicos ou milifluidicos, gerando escalas de comprimentos de partículas de microgel determinísticas com pequena variabilidade e em alto rendimento (por exemplo, as fre-quências superiores a 10 partículas/segundo). O coeficiente de varia-ção do comprimento da escala de partícula de microgel 12 (por exem-plo, diâmetro) pode estar dentro de 35% ou mais preferivelmente den-tro de 15% e ainda mais preferivelmente dentro de 5% da escala de comprimento médio. Mili ou microfluidos permitem que propriedades de material uniforme, pré-determinado, conciso sejam incluídas pré-, em, e pós-formação de partículas de microgel 12. Além disso, o mecanismo de produção de microfluídicos/milifluídicos permite a facilidade de produção de aumento de escala bem como o controle de boa quali-dade sobre a composição química e as características físicas das par-tículas de microgel 12. As tecnologias milifluídicas e/ou microfluídicas para geração de partículas de microgel 12 são processos facilmente escaláveis para criar grandes quantidades de material para as neces-sidades comerciais, mantendo a alta precisão e rigor nas característi- cas de partículas de microgel 12.

[0099] Em uma modalidade, as partículas de microgel 12 são formadas utilizando métodos automatizados fluídicos que dependem de geração de emulsão de água-em-óleo. Isto inclui métodos microfluídi- cos ou milifluídicos utilizando vidro/PDMS, PDMS/PDMS, vidro/vidro, ou chips de plástico moldados/modulados/em relevo para criar gotícu- las de água em óleo com uma variação de distribuição de tamanho que é inferior a 35%.

[00100] As FIGS. 3A-3F ilustram uma modalidade de um dispositivo microfluídico 20 que é utilizado para gerar as partículas de microgel 12. O dispositivo microfluídico 20 é formado em um material de substrato 22 tal como PDMS, que pode incluir um outro material de substrato 24 (por exemplo, vidro) que é ligado ao substrato 22. Nesta modalidade, o dispositivo microfluídico 20 inclui uma primeira entrada 26, uma segunda entrada 28, e uma terceira entrada 30. Como visto na FIG. 3A, a terceira entrada 30 é interposta entre a primeira entrada 26 e a segunda entrada 28. Nesta modalidade, a primeira entrada 26 é acoplada a uma solução contendo uma estrutura principal de 4 braços poli (etileno-glicol) vinilsulfona (PEG-VS) (20 kDa) que foi pré-mo- dificadas para oligopeptídeos com propriedades adesivas de células (por exemplo, RGD) e funcionalidades de recozimento de superfí- cie/tecido (por exemplo, peptídeos, K e Q). A estrutura principal de PEG-VS pode ser pré-functionalizada com 500 μM de peptídeo K (Ac- FKGGERCG-NH2 [SEQ ID NO: 1]) (Genscript), 500 μM de peptídeo Q (Ac-NQEQVSPLGGERCG-NH2 [SEQ ID NO: 2]), e 1 mM de RGD (Ac- RGD SP GERCG-NH2 [SEQ ID NO: 3]) (Genscript). A entrada de da solução com a primeira entrada 26 pode conter cerca de 5% (em peso) de PEG-VS modificado contido num tampão de 0,3 M de trietanolami- na (Sigma), pH 8,25. A segunda entrada 28 é acoplada a uma solução contendo o reticulante, que, em uma modalidade, é um substrato de 12 mM de uma matriz metaloprotease (MMP) modificada de di-cisteína (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2 [SEQ ID NO: 4]) (Genscript). Em experiências realizadas que utilizaram de imagem fluorescente, o substrato de MMP foi pré-reagido com 10 μM de Alexa-Fluor 647- maleimida (Life Technologies). Claro que, em aplicações práticas, não é necessário o uso da sonda fluorescente. Todas as soluções podem ser esterilizadas por filtração através de uma membrana de 0,2 μm de polietersulfona (PES) de em um filtro de seringa Luer-lock.

[00101] Conforme aqui utilizado, os peptídeos K referem-se aos peptídeos que nele contem um grupo lisina fator XIIIa reconhecido. Tal como aqui utilizado, peptídeos Q referem-se aos peptídeos que contêm no seu interior um grupo glutamina fator XIIIa reconhecido. Assim, podem ser utilizadas sequências peptídicas além daquelas especifi-camente referidas acima. O mesmo se aplica para a sequência do peptídeo RGD que está listada acima.

[00102] A terceira entrada 30 é acoplada a uma solução aquosa contendo 5% em peso de PEG-VS (não modificada por peptídeos K, Q, ou RGD). A solução aquosa de PEG-VS é preferivelmente viscosi-dade combinada com a solução de PEG-VS introduzida através da primeira entrada 26 e pode ser usada para controlar o pH da solução reticulante e para inibir a reticulação até que a formação de gotículas. Por ter a terceira entrada 30 interposta entre a primeira entrada 26 e a segunda entrada 28 da solução aquosa de PEG-VS atua como uma barreira que impede que qualquer mistura difusora de material de so-luções reativas a montante da região de geração de gotículas. Isso aumenta significativamente a vida útil do dispositivo antes de ocorrer incrustações. As FIGS. 3E e 3F ilustram como a solução líquido inerte impede a mistura das soluções esquerdas e direitas antes da gotícula de segmentação.

[00103] Com referência às Figs. 3A, 3B, e 3C, a primeira entrada 26, segunda entrada 28, e terceira entrada 30 estão ligadas a, respec-tivamente, os canais 32, 34, 36. Os canais se cruzam na junção 38 e são realizados em um canal comum 40. A quarta entrada 42 é propor-cionada no dispositivo e é acoplada a uma fase oleosa que contém um tensoativo (por exemplo, SPAN® 80 a 1%, em volume, embora outros agentes tensoativos possam ser utilizados). A quarta entrada 42 está ligada a dois canais 44, 46 que se cruzam na junção 48 a uma região a jusante do canal comum 40. A junção 48 no dispositivo 20 é onde as gotículas de base aquosa são formadas que incluem o componente de PEG-VS e o reticulante. Os conteúdos das gotículas são submetidos a mistura e irão formar as partículas de microgel 12 mediante gelifica- ção, que nesta modalidade é uma função da temperatura ambiente e a passagem do tempo. Neste dispositivo, uma quinta entrada 50 é provi-da, que é acoplada a uma outra fase de óleo que contém um tensoati- vo a uma percentagem volumétrica maior do que a ligada à quarta en-trada 42. Por exemplo, a quinta entrada 50 pode ser ligada a uma fase de óleo contendo 5% de SPAN® 80 em volume. Mais uma vez, outros agentes tensoativos além de SPAN® 80 poderiam também ser usadas. A quinta entrada 50 está ligada a dois canais 52, 54 que se cruzam na junção 56 em uma orientação de prensa como ilustrado.

[00104] O canal comum 40 continua para uma série de canais de ramificação progressivamente ramificando 58. Os canais de ramifica-ção 58 permitem o fluxo contínuo de partículas de microgel 12 através dos canais paralelos individuais onde as condições ambientais locais podem ser opcionalmente controladas. Por exemplo, a temperatura dos canais de ramificação individual 58 pode ser controlada para regular as condições de reticulação para as partículas de microgel 12. Da mesma forma, os canais de ramificação 58 podem ser iluminadas com a luz para controlar reações ativadas pela luz. As partículas de microgel 12 podem ser removida do dispositivo 20 através da saída 59. De- ve ser entendido, no entanto, que a regulação da temperatura dos ca-nais de ramificação 58 ou o uso de ativação de luz é inteiramente

[00105] Conforme melhor visto na FIG. 3D, a primeira entrada 26, segunda entrada 28, a terceira entrada 30, quarta entrada 42, e quinta entrada 50 estão ligadas, respectivamente, para as linhas de fluido 26', 28', 30', 42' e 50' que se conectam a um dispositivo de bombeamento 51 ou múltiplos dispositivos de bombeamento 51 que bombeia respec-tivos fluidos para as entradas conectadas correspondentemente 28, 28, 30, 42, 50. O dispositivo de bombeamento 51 pode incluir bombas separadas ligadas a cada fluido diferente. Exemplos de tipos de bom-bas que podem ser utilizadas incluem bombas de seringa ou outras bombas comumente utilizadas em ligação com dispositivos microfluídi- cos. Em um aspecto, o dispositivo de bombeamento 51 utiliza o gás sob pressão regulada acima de um reservatório de fluido para bombear o fluido para a taxa de desejada (s) através do dispositivo.

[00106] As FIGS. 4A-4C ilustram uma modalidade alternativa de um dispositivo microfluídico 60 que é utilizado para gerar as partículas de microgel 12. Nesta modalidade alternativa, ao contrário da modalidade das FIGS. 3A-3C, não há uma terceira entrada 30 que transporta uma solução aquosa que é usada para separar o PEG e componentes de reticulação antes da geração de gotículas. Em vez disso, nesta moda-lidade, o dispositivo microfluídico 60 inclui uma primeira entrada 62, uma segunda entrada 64, uma terceira entrada 66, e uma quarta en-trada 68. A primeira entrada 62 é acoplada a uma fonte de PEG-VS modificada tal como a descrita acima. A segunda entrada 64 é acopla-da a um reticulante. A terceira entrada 66 é acoplada a uma fonte con-tendo óleo e um tensoativo. A quarta entrada 68 é acoplada a uma fonte contendo óleo e um tensoativo a uma concentração maior do que a ligada à terceira entrada 66. Nesta modalidade, a primeira entrada 62 e a segunda entrada 64 são acopladas aos respectivos canais 70, 72 que conduzem para um canal comum 74. A terceira entrada 66 é acoplada a um par de canais 76, 78 que se cruzam com o canal co-mum 74 em uma junção 80 (melhor vista na FIG. 4B), onde ocorre a geração de gotículas (gotículas formarão as partículas de microgel 12 após reação). A quarta entrada 68 é acoplada a um par de canais 82, 84 que se cruzam com o canal comum 74 em uma localização a jusan-te 86 (melhor vista na fig. 4B) com relação à junção 80. Como visto na FIG. 4A, o dispositivo 60 inclui uma série de canais de ramificação que progressivamente se ramificam 88, que são semelhantes aos descritos no contexto da modalidade das FIGS. 3A-3C. As partículas de microgel 12 que passam através dos canais de ramificação 88 podem reco-lhidas em uma câmara de recolha 90 ou semelhante, que podem ser removidas a partir do dispositivo 60. O fluido é provido ao dispositivo 60 usando linhas de fluido e um dispositivo de bombeamento tal como descrito anteriormente, no contexto da modalidade das FIGS. 3A-3C.

[00107] As condições fluídicas que conduzem à formação de partículas de microgel 12 incluem, em uma modalidade, mistura no chip de soluções aquosas à base de PEG e a base de reticulante, em que uma parte contém polímero de base e a outra contém o agente de reticula- ção ou iniciador. É claro que, nas modalidade das FIGS. 3A-3C, existe uma mistura de três entradas, que inclui os componentes acima men-cionados além da adição do fluxo inerte à base aquosa. Estas solu-ções de PEG e reticulante são misturadas em qualquer proporção vo-lumétrica de 1:1, ou outra proporção controlável (controlada por taxas de fluxo relativas no dispositivo) de até 1: 100 As relações das taxas de fluxo aquosa e óleo totais são controladas para determinar uma partícula de microgel 12 de tamanho específico, onde essas propor-ções podem variar de 4:1 (aquosa:óleo) até 1:10 (aquosa: óleo).

[00108] Conforme explicado acima, na modalidade das FIGS. 3A- 3D, o dispositivo de chip 20 é projetado para ter três soluções de base aquosa combinadas para formar as partículas de microgel 12, em que o polímero de base e agente de reticulação/iniciador são separados por uma solução não reativa a montante do gerador de gotícula para impedir a reação de soluções e incrustação do chip ao longo do tempo na região a montante da geração de gotículas. Nesta configuração, a porção de solução não reativa deve ser igual a ou menor do que as soluções de base e reticulante, de 1 a 0,05 vezes a taxa de volume das outras soluções. Esta modalidade pode, assim, melhorar a confia-bilidade e vida útil de chips usados para a geração de microgel. Além disso, nesta modalidade ou na anterior, células podem ser introduzidas em qualquer uma das duas ou três soluções aquosas introduzidas para permitir encapsulamento dessas células (células únicas de grupos de 2-20 células por partícula) dentro de partículas de microgel 12 tal que células encapsuladas podem produzir fatores para melhorar cura de feridas ou crescimento interno de células.

[00109] Enquanto FIGS. 3A-3D e 4A-4C ilustram diferentes modali-dades de um dispositivo microfluídico 20, 60 que podem ser utilizados para gerar partículas de microgel 12, em uma modalidade alternativa, o percurso de escoamento de microfluidos pode incluir uma arquitetura de ‘junção T’ tal como o ilustrado na FIG. 5. Nesta modalidade, o dis-positivo microfluídico 92 inclui uma junção formada entre um primeiro canal 94 que transporta a fase aquosa enquanto um segundo canal 96 inclui a fase de óleo. Gotículas 97 são formadas e transportadas atra-vés de um canal de saída 98 (que podem ser as mesmas que os pri-meiro ou segundo canais 94, 96). Em alternativa, configurações dife-rentes de formação de gotículas podem ser utilizadas para gerar as partículas de microgel 12. Por exemplo, o dispositivo pode gerar gotí- culas 97 usando o gradiente de confinamento devido a paredes supe-riores e inferiores não paralelas tal como aquele divulgado em Dangla et al., gotículas microfluídicas acionadas por gradientes de confina- mento, Proc Natl Acad Sci USA 110(3): 853-858 (2013), que é incorpo-rada aqui por referência.

[00110] Em dispositivos microfluídicos descritos acima, as superfícies de canal devem ser modificadas de tal modo que a fase aquosa é não úmida, que pode incluir uma fluoração da superfície, ou converter as superfícies para tornar hidrofóbica ou fluorofílica, quer por um tra-tamento baseado em silano covalente ou outra abordagem baseada em adsorção não específica. Alternativamente, um polímero de plástico contendo grupos fluorofílicos compreende o material de chip e pode ser combinado com os revestimentos de superfície anteriormente mencionados ou sem um revestimento de superfície. Além disso, o óleo usado na modalidade preferida deve ser ou um óleo mineral (óleo de parafina) suplementado com um tensoativo não-iônica, óleo vegetal enriquecido com um tensoativo iônico, ou um óleo fluorado suplemen-tado com um tensoativo fluorado (ou qualquer combinação destas dois sistemas de óleo/tensoativos). Estes métodos microfluídicos ou miliflu- ídicos geram populações monodispersas (coeficiente de variação infe-rior a 35%) de partículas de microgel 12 em taxas iguais ou superiores a 10 Hz, onde a coleta é realizada manualmente (com a mão) ou utili-zando sistemas de manuseio de fluidos automatizados. Para evitar a coalescência das partículas de microgel 12 antes de se completar a reação de reticulação, tensoativo suficiente é necessário para estabili-zar as gotículas de pré-gel, no entanto, os níveis elevados de tensoati- vo também destabilizam o processo de geração de gotículas. Portanto, uma modalidade preferida do sistema de geração de microfluidos de partícula de microgel 12 inclui uma baixa concentração de tensoativo no fluxo de óleo de compressão inicial (1% ou menos) que cria gotícu- las seguido pela adição de uma solução de óleo + tensoativo a partir de uma entrada separada que é fundida com a solução de gotículas e óleo formada e contém um nível mais elevado de tensoativo (até 10 vezes ou mesmo 50 vezes mais elevado do que o tensoativo inicial). Isto é ilustrado, por exemplo, nas modalidades das FIGS. 3A-3D e 4A- 4C.

[00111] Em uma outra modalidade alternativa, os dois fluxos de compressão de óleo têm a mesma concentração de tensoativo. Em ainda outra modalidade, não existe um segundo fluxo de óleo de com-pressão, e apenas o fluxo de óleo de focagem em fluxo para gerar go- tículas. Além disso, como explicado acima, em algumas modalidades alternativas, não há nenhum segundo fluxo de óleo de compressão e apenas o fluxo de óleo junção t é usado para gerar gotículas. É claro, a junção de gotícula de junção t pode ser, opcionalmente, combinada com uma segunda entrada de óleo de focagem com concentração de tensoativo igual ou maior.

[00112] Após a formação, partículas de microgel 12 são extraídas a partir da fase de óleo, utilizando quer centrifugação através de uma fase aquosa, ou filtração através de um dispositivo de filtração de membrana sólida. Por exemplo, a filtração pode ser utilizada para re-duzir o volume de solução aquosa livre que prende as partículas de microgel 12 (volume livre). Em uma modalidade, o volume livre aquoso é inferior a cerca de 35% do volume total. Em uma outra modalidade, para a geração de populações intencionalmente polidispersas, geração de partícula de microgel é realizada em uma plataforma mili ou micro fluidificada, gerando estoques de partículas de microgel 12 rela-tivamente monodispersos que são então misturados em proporções desejadas para se obter distribuições determinísticas e proporções de tamanhos de partículas de microgel 12. Proporções de tamanhos de partículas de microgel 12 podem ser controladas com precisão para controlar estrutura de poros, ou propriedades químicas com uma pro-porção estequiométrica final de: 1:1, 10:1, ou superior a 100:1.

[00113] Em alternativa, geração de partículas de microgel 12 atra- vés de um sistema de água-em-óleo pode também ser realizada utili-zando métodos de mistura sônica ou um vórtice rotativo. Estes últimos métodos geram populações polidispersas de partículas de microgel 12 com faixas de tamanho de 100 nanômetros a 500 micrômetros. Estas partículas podem ser, em seguida, filtradas utilizando filtros porosos, filtração de microfluidos, ou outras técnicas conhecidas na área para se obter uma distribuição de tamanho mais estreita de partículas de microgel 12 (por exemplo, o coeficiente de variação de menos do que 50%). Como outra alternativa, as partículas de microgel de componen-te 12 de diferentes formas podem ser fabricadas utilizando a litografia de fluxo de parada, litografia de fluxo contínuo, e outros métodos para criar partículas com uma forma que se baseia na formação de fluxos (vide Amini et al., Publicação Internacional No. WO/2013/049404, que é aqui incorporada por referência) combinados com a polimerização iniciada por UV através de um máscara que define a forma. Neste ca-so, as partículas de microgel 12 são não esférica com dimensões lon-gas e curtas, que podem variar entre 5 e 1000 micrômetros. Partículas que se conformam também podem ser fabricadas através da geração de partículas esféricas em uma emulsão de água em óleo, seguida por extrusão através das referidas partículas através de constrições micro- fabricadas que têm escalas de comprimento menores do que o diâme-tro da partícula. As partículas anteriormente esféricas adoptam a forma da constrição conforme elas transitam para um gel e retêm aquela forma conforme elas gelificam na constrição por qualquer uma das re-ações reticulantes listadas acima. Os géis retêm essa forma depois de sair da construção microfabricada. Partículas que se conformam po-dem permitir um controle adicional dos poros, e adesão melhorada dentro do suporte final formado por recozimento de partículas de mi-crogel 12.

[00114] Em uma ou mais modalidades, as partículas de microgel 12 são modificadas de forma covalente ou não (por exemplo, a inclusão espacialmente dentro por difusão) para fornecer moléculas biologica-mente ativas (por exemplo, fármacos de moléculas pequenas, antibió-ticos, peptídeos, proteínas, esteroides, polímeros de matriz, fatores de crescimento, antígenos, anticorpos, etc.). A inclusão de moléculas de sinalização após a formação da partícula de microgel 12 pode ser rea-lizada através de difusão passiva, imobilização de superfície (temporá-ria ou permanente), e/ou grandes quantidades de imobilização (tempo-rária ou permanente).

[00115] Em uma outra modalidade, as nanopartículas são incluídas na solução de pré-polímero inicial e incorporadas nas partículas de microgel 12 durante a polimerização inicial ou gelificação, e as nano- partículas podem incluir moléculas biologicamente ativas para libera-ção e entrega sustentada ou rápida. Em uma outra modalidade, partí-culas de microgel 12, que contêm aminas primárias livres (incluídas como parte de um oligopeptídeo contendo lisina) podem ser modifica-das com NHS-azida. Para este conjunto de partículas de microgel 12 pode ser adicionada uma proteína modificada com uma NHS-fosfina, resultando na superfície de revestimento das partículas de microgel 12 com a proteína modificada. A FIG. 10 ilustra uma modalidade na qual uma partícula de microgel 12 tem nanopartículas nela incorporadas e uma superfície que foi modificada com uma proteína utilizando química clique.

[00116] Após a produção e modificação opcional, as partículas de microgel 12 (que podem ser uma mistura homogênea ou heterogênea) podem ser aplicadas a um sítio desejado (in vitro, in situ, in vivo). O sítio desejado sobre o tecido de mamífero 102 pode incluir, por exem-plo, um sítio de ferimento 100 ou outro sítio do tecido danificado. As partículas de microgel 12 podem ser introduzidas por si só, em uma solução salina isotônica aquosa ou suspensão (de preferência com 30- 99% de fração de volume de partículas de microgel 12, e de preferên-cia menos 1-30% de fração de volume). Alternativamente, partículas de microgel 12 podem ser introduzidas juntamente com as células como células individuais ou agregadas com células de proporções de partículas de 10:1 para criar redes celulares densas dentro do suporte recozido final de 10 ou 1: 100 ou mesmo 1: 1000 para criar suportes esparsamente semeados 10 com células que produzem fatores solú-veis úteis para a regeneração. Em uma outra modalidade as partículas de microgel 12 podem ser cultivadas com as células a uma baixa fra-ção de volume de partículas (<10%) por um período de tempo em meio de células permissivas para promover a adesão às partículas de microgel individuais 12. Estas partículas de microgel aderidas em célu-la composta 12 podem ser introduzidas como o componente ativo que iria recozer para formar um suporte semeado em célula microporosa 10, que pode ser benéfico para aumentar a velocidade de atividade regenerativa. Localizações in vitro desejadas para introduzir partículas de microgel 12 incluem placas de poços (por exemplo, 6 poços, 96 po-ços, 384 poços) ou dispositivos fluídicos para formar microambientes de cultura microporosa 3D para células após o recozimento, e permitir ensaios biológicos subsequentes ou ensaios de triagem de alto rendi-mento com condições 3D mais fisiologicamente relevantes ou multice- lulares. Para a introdução in vitro, soluções de partículas de microgel 12 podem ser pipetadas em poços ou introduzidas por meio de injeção por seringa seguida por introdução de uma solução de recozimento ou acionando recozimento fotoquimicamente. Alternativamente, uma so-lução de solução de partículas de microgel 12 pode ser misturada com uma solução de recozimento de atuação lenta (recozimento ocorrendo ao longo de 10-30 min) antes da entrega. Localizações in situ incluem sítios de feridas externas (por exemplo, cortes, bolhas, feridas, úlceras de pressão, úlceras venosas, úlceras diabéticas, úlceras vasculares crônicas, sítios de enxerto de pele de doadores, locais de cirurgia pós- Moh, sítios de cirurgia pós-laser, feridas podiátricas, deiscência de fe-rida, escoriações, lacerações, queimaduras de segundo ou terceiro grau, lesão por radiação, rasgos na pele e feridas de drenagem, etc.). Uma vez que a epiderme é uma estrutura epitelial, a solução de partí-cula de microgel pode ser usada para curar outras superfícies epiteli- ais (fissuras uroteliais (bexiga ou intestino, etc.), aerodigestiva (pulmão, gastrointestinal), similarmente a pitélio de pele (isto é, úlcera estomacal ou duodenal; após trauma de penetração para fístulas de pulmão, bexiga ou intestino. etc.). Além disso, a solução de partícula de microgel pode ser aplicada a outros tecidos através de um cateter ou cânula, tais como tecido do sistema nervoso e o tecido cardíaco onde crescimento interno de tecido seria benéfico para evitar cicatrizes e para facilitar a cicatrização regenerativa após uma lesão, tal como após o trauma da medula espinhal, paralisia cerebral/acidente vascular cerebral e infarto do miocárdio.

[00117] Para a introdução in situ, solução contendo partículas de microgel pode ser armazenada separadamente de uma solução de recozimento e ser misturada durante a introdução (um método análogo ao adesivo de epóxi) para evitar a iniciação prematura da reação de recozimento antes da entrada em um sítio da ferida 100.

[00118] Em uma outra, as duas soluções podem ser armazenadas dentro de uma seringa ou aplicador de aperto de tubo com dois canos de diâmetros iguais ou desiguais, de tal modo que quando o êmbolo mergulhador da seringa tem o tubo comprimido ou espremido ele si-multaneamente entrega tanto as partículas de microgel 12 quanto a solução de hibridação a estequiometria correta. FIG. 6A ilustra uma tal modalidade de um dispositivo de entrega 110, que inclui um primeiro cano 112, um segundo cano 114 e um êmbolo 116 que é usado para administrar a solução que contém as partículas de microgel 12 de ca- da cano 112, 114. Por exemplo, o primeiro cano 112 contém partículas de microgel 12 e trombina a uma concentração variando de 0,1 a 5 U/ml e o segundo cano 114 contém as partículas de microgel e FXIII 12 a uma concentração de 0,1 a 1000 U/mL). Em ambos os canos 112, 114 existe uma fração de volume 1 para 1 de partículas de microgel 12 contendo peptídeo K e Q onde a concentração da faixa de pep- tídeos k e Q de 1- - 1000 μM nas partículas de microgel 12. Na modalidade, ao misturar a trombina ativa o FXII (para formar FXIIIa) e o FXIIIa resultante é responsável para recozimento e ligação de superfície dos peptídeos K e Q nas partículas de microgel adjacentes 12.

[00119] Em alternativa, os dois canos 112, 114 podem conter dois tipos de partículas de microgel separadas 12 com porções de recozi- mento que requerem a combinação para iniciar a reticulação. Um método alternativo de armazenamento e entrega seria em uma seringa de único cano 110, tal como ilustrado na FIG. 6B ou um tubo compressí- vel multiuso ou de uso único, como ilustrado na FIG. 6C (por exemplo, semelhante à pasta de dentes ou pomada com antibiótico), no qual a pasta de partícula de microgel pode ser apertada a um volume deseja-do e espalhada sobre o sítio da ferida 100 e, em seguida, recozida por exposição à luz, em que o agente ativo para fotoquímica é Eosina-Y a uma concentração de 100 μM embora as concentrações dentro da gama de 10 μM - 1 mM também funcionem. De um modo preferido, Eosina Y é acompanhada com um agente de transferência de radical, que pode ser, por exemplo, uma espécie química com um grupo tiol livre. Um exemplo de um tal agente de transferência inclui radicais de cisteína ou peptídeos incluindo cisteína (s) aqui descrita (por exemplo, utilizada a uma concentração de 500 μM). A luz deve ser entregue através de um amplo espectro de luz branca (incandescente ou LED), ou uma luz LED verde ou azul. A lanterna, varinha, lâmpada, ou mes-mo a luz ambiente pode ser usada para fornecer a luz branca. A expo sição deve ocorrer entre 0,1 segundo e 1000 segundos, e a intensida-de da luz deve variar entre 0,01 mW/cm2 100 mW/cm2 no sítio da hi- bridação. Em uma outra modalidade, o recozimento mediado por luz pode ser realizado utilizando uma luz UV (comprimentos de onda entre 300-450 nm), em que o agente para fotoquímica é IRGACURE® 2959, a uma concentração de 0,01% p/v a 10% p/v. O tempo de exposição deve ser entre 0,1 segundo e 100 segundos, com uma intensidade de luz de 0,1 mW/cm2 a 100 mW/cm2 em um sítio de recozimento. Para modalidades em que a luz de recozimento iniciada é utilizada, precur-sores de microgel 12 seriam armazenados em seringa opaca (opaca no que diz respeito à gama de comprimentos de onda que inicia o re- cozimento) ou recipientes de tubos de espremer 110 antes da utiliza-ção. Localizações in situ desejadas incluem cortes internos e aberturas do tecido (por exemplo, a partir de incisões cirúrgicas ou resseções), feridas de queimaduras, feridas de radiação e úlceras, ou em aplica-ções de cirurgia plástica para preencher o local de tecidos e estimular o crescimento interno de tecidos e regeneração em vez dos processos fibróticos comum aos injetáveis contemporâneos.

[00120] A entrega utilizando seringas de cano duplo ou simples é também adequada para esta indicação, bem como hibridação utilizan-do uma fotoativação e uma fonte de luz UV ou branca que pode ser inserida no local cirúrgico. Para tanto as aplicações in situ e in vivo, a pasta de partícula de microgel pode ser distribuída usando um aplica- dor estéril para ficar alinhada com a ferida ou amontoada no interior e em torno do sítio da ferida 100 (dentro da ferida e 2 mm a 1 cm além das extensões da ferida original) para criar um suporte recozido que se estende além do sítio da ferida 100 ou defeito de tecido para proporci-onar uma proteção adicional, umidade, e estrutura para suportar a re-generação do tecido.

[00121] Um processo de recozimento é iniciado através da aplica- ção de um estímulo (por exemplo, iniciador de radical, enzima, adição de Michael, etc.) ou através de interações com um estímulo que já está presente no local de aplicação das partículas de microgel 12 que interage com grupos funcionais sobre a superfície das partículas de microgel 12, formando um suporte sólido altamente poroso contíguo 10 formado a partir das partículas de microgel (ligado) recozido 12. Se for utilizado no tecido, o processo de recozimento pode permitir a fusão da suporte 10 para o tecido envolvente, proporcionando uma vedação eficaz, uma medicação local e/ou dispositivo de entrega de células, um suporte vascularizado para a detecção in vivo, e um melhor percurso para a regeneração do tecido. O processo de recozimento permite formação de gel no local/sob demanda (que é ideal para in vitro e em aplicações in vivo), por exemplo, a entrega através de uma pequena incisão a um sítio cirúrgico minimamente invasivo ou através de injeção com uma agulha ou através de um cateter ou cânula. O suporte 12 pode compreender populações homogêneas ou heterogêneas de partículas de microgel 12. Como foi discutido, as populações hete-rogêneas de partículas de microgel 12 podem variar em composição física (por exemplo, no tamanho, forma, ou rigidez) ou variar em com-posição química (por exemplo, proporções variadas de ligantes degra-dáveis, ou aminoácidos L- ou D- para modificar a velocidade de de-gradação, porções variadas de recozimento, porções de adesão celu-lar, ou carregamento de microgéis 12 com moléculas bioativas ou na- nopartículas). A composição heterogênea do suporte recozido final 10 pode ser aleatória ou estruturada em camadas de composição unifor-me para criar gradientes em estruturas microporosas (variando tama-nhos de partículas de microgel 12 em camadas, por exemplo) ou gra-dientes de composição química (por camadas de partículas de micro-gel 12 com diferente composição ou carregamento molécula bioativa). Os gradientes podem ser úteis no direcionamento crescimento interno de células e a regeneração de tecidos in vivo, ou o desenvolvimento de estruturas de tecidos in vitro. Gradientes em composição de partícula de microgel 12 poderiam ser alcançadas entregando as pastas sequenciais de um gel de uma única composição, seguido de recozi- mento, e então posterior entrega do próximo gel de uma segunda composição, seguido por recozimento que liga a nova camada de mi- crogéis à camada anterior, até que um número desejado de camadas tenha sido acumulada. A espessura de cada camada pode ser contro-lada usando o volume de pasta injetado e a área do sítio de injeção. Uma modalidade alternativa de alcançar gradientes é carregar um aplicador de seringa multicano tal como o ilustrado na FIG. 6A com composições de microgel diferentes em cada um dos canos. Cada um dos canos são ao mesmo tempo comprimidos e alimentados para o bocal 120 em folhas em camadas. O bocal 120 do próprio aplicador de seringa pode ser não circular ou retangular, para criar uma pasta fluida em camadas de composição múltipla, que é injetada em um sítio em uma estrutura em forma de fita, que pode então ser recozida no pre-sente arranjo. Formação do suporte recozido estruturalmente contíguo 10 pode ser conseguida através de processos de radicais, enzimáticos ou químicos (por exemplo, química de clique).

[00122] Em uma ou mais modalidades, o recozimento ocorre através de interações químicas de superfície entre as partículas de microgel 12 uma vez que elas estão prontas para ser colocadas no sítio de entrega. Em uma modalidade, o processo ocorre através de recozi- mento iniciado por radical através de grupos polimerizáveis de superfície (por exemplo, iniciação de radical por iniciadores por radicais fo- tossensíveis, etc.). Em uma outra modalidade, o processo ocorre atra-vés da química enzimática através de substratos enzimaticamente ati-vos apresentados em superfície (por exemplo, enzimas transglutami-nase, como fator XIIIa). Em uma outra modalidade, o processo ocorre através de ligação covalente via reações de adição de Michael e pseudo-Michael. Este método pode usar vários tipos de populações de partículas de microgel que, quando misturadas formam um suporte sólido 10 (por exemplo, apresentação de partículas de microgel 12 do tipo A, por exemplo, grupos nucleofílicos e apresentação de superfície de partícula de microgel 12 tipo B, por exemplo, grupos carbonila α,β- insaturados). Em uma outra modalidade, o processo ocorre através de ligação de química de clique. De igual modo, este método pode usar populações de partícula de microgel 12 heterogêneas que quando mis-turadas formam um gel sólido microporoso. Em uma outra modalidade, o recozimento pode ser alcançado utilizando a luz (por exemplo, quer luz branca ou luz de UV) para iniciar uma reação química entre molé-culas nas superfícies de gel, mediada por uma molécula de luz ativada em solução e em torno (ou diretamente covalentemente ligada a) os microgéis, tal como aqui descrito.

[00123] Em uma modalidade preferida, as partículas de microgel 12 incluem uma estrutura principal polimérica de PEG com base em com-binação com um reticulante enzimaticamente degradável para permitir biorreabsorbância. Em certas modalidades, a estrutura polimérica à base de PEG é uma estrutura principal de 4 braços poli (etileno glicol) vinilsulfona (PEG-VS) previamente modificada com os oligopeptídeos para propriedades adesivas de células (por exemplo, RGD) e funciona-lidades de recozimento de superfície (por exemplo, peptídeos K e Q) e o reticulante é uma metaloprotease de matriz reticulante degradável de (MMP).

[00124] Em uma ou mais modalidades, as partículas de microgel 12 são formadas por uma emulsão de água em óleo. Gelificação de partí-culas de microgel 12 ocorre após a combinação de solução de PEG com uma solução de reticulante (seguido brevemente por particiona- mento em gotículas de microgel antes da conclusão da gelificação). Uma variedade de substratos, incluindo ligantes peptídicos, pode ser ainda adicionada para bioatividade reforçada. Em uma modalidade, a formação de suporte é realizada por adição e ativação de fotoiniciador de radicais para as partículas de microgel 12 purificadas para induzir a reticulação química. Em uma outra modalidade, a formação de suporte é conseguida através da utilização e/ou a ativação de uma enzima transglutaminase endogenamente presente ou exogenamente aplica-da, o Fator XIII, para as partículas de microgel 12 purificadas que foram modificadas com dois ligandos peptídicos ou pré-formação, durante a formação, ou pós-formação enzimática para induzir a reticulação. Em uma modalidade separada, a formação de suporte é conseguida utilizando uma combinação de métodos enzimáticos e radicais acima mencionados.

[00125] O suporte resultante 10 da matéria presentemente divulgada proporciona vantagens em relação às tecnologias atuais de suporte poroso devido à capacidade para formar um suporte microporoso to-talmente interligado in vivo. Em geral, matrizes porosas proveem maior acesso para as células vivas por causa da liberdade de circulação através dos poros (ou seja, não necessitando de degradação para permitir a penetração como todos os suportes atuais e anteriores não porosos e nanoporosos). Por exemplo, quando da implantação e reco- zimento de um suporte 10 em uma ferida da pele in vivo, invasão de células significativamente aumentada e estrutura de tecidos em cres-cimento foram observadas após 5 dias quando em comparação com um gel não poroso do mesmo material, como visto nas FIGS. 7B. FIG. 7A ilustra coloração H&E de seções de tecidos em camundongos SKH1-Hrh injetados com tecido para 10 (identificada como suporte MAP), bem como o controle não poroso 24 horas após a injeção. FIG. 7B ilustra um gráfico de fechamento de feridas (%) como uma função de dias pós-injeção. Este gráfico mostra que em um período de cinco (5) dias não há melhoria estatisticamente significativa nas taxas de fe-chamento de feridas para a utilização do suportes 10 quando compa-rado com os controles bilaterais não porosos (N = 5). FIG. 7C ilustram imagens representativas de fechamento da ferida durante um modelo de cura de ferida de cinco dias in vivo em camundongos SKH1-Hrhr. FIG. 7D ilustra imagens representativas de fechamento da ferida du-rante experiências camundongos BALB/c de 7 dias in vivo. FIG. 7E ilustra dados de quantificação de fechamento de feridas a partir de ci- catrização de feridas de camundongos BALB/c in vivo. Após 7 dias in vivo, os suportes 10 promoveram fechamento de feria significativa-mente mais rápida do que nenhum controle de tratamento, o gel PEG não poroso, e os géis faltando os peptídeo k e Q. Géis porosos criados ex vivo para precisamente combinar o formato das feridas usando o método canônico, baseado em porogênios, de fundição mostraram ta-xas apreciáveis de cicatrização de feridas, comparáveis aos suportes 10, mas faltando injetabilidade (N > 5). FIG. 7F ilustra traços de fe-chamento do leito da ferida durante 7 dias in vivo para cada categoria de tratamento correspondente à fig. 7D.

[00126] Além disso, os agentes terapêuticos aplicados às partículas de microgel 12 ou ao suporte 10 podem ser liberados lentamente ou rapidamente, e o suporte 10 tem a capacidade de se quebrar ao longo de um período predeterminado de tempo, quer a partir de hidrólise, proteólise, ou enzimólise, dependendo do tratamento a que se destina (por exemplo, se ele estiver sendo utilizado para o tratamento de uma ferida crônica, um reticulante mais estável que se degrada lentamente ao longo do tempo é utilizado). Além disso, a qualidade de recozimen- to do suporte de microgel 10 permite que o suporte 10 funcione como um selante de tecido (por exemplo, feridas agudas, fechamento cirúr-gico, etc.), e o preenchimento de diferentes formas moldadas que são clinicamente úteis para imitar tecidos. FIG. 7G ilustra como a partícula de microgel contendo solução ou suspensão pode ser aplicada utili-zando um dispositivo de seringa como o das FIGS. 6A ou 6B em um sítio de tratamento onde o microgel se conforma ao formato do sítio de injeção (por exemplo, neste caso um sítio em forma de estrela) e sub-sequente recozimento do suporte 10 em um formato de estrela.

[00127] Ao ajustar a velocidade de degradação dos suportes de mi-crogel 10 formando a resposta regenerativa ou de formação de cicatriz em uma ferida pode ser modificada. Em uma modalidade, a taxa de degradação dos suportes de microgel 10 foi modificada usando ami- noácidos D em vez de L no reticulante de MMP degradável. Ajustar a proporção de partículas de microgel 12 com quiralidade D- ou L no re- ticulante ajustado a taxa de degradação no tecido. Os suportes 10 fei-tos a partir de misturas de microgéis reticulados D e L (com uma pro-porção de 1:1) resultaram em géis presentes no tecido 21 dias após a injeção, no entanto nos géis apenas D, não houve nenhum gel rema-nescente após 21 dias in vivo. A resposta de cura do tecido e formação de cicatrizes também depende da estequiometria de D: L, e assim a taxa de degradação. As FIGS. 8A-8G mostram os efeitos de redução de cicatrizes quando se utiliza uma mistura 1:1 de D:L, como compa-rado diretamente a uma ferida sem tratamento. Espessura dérmica é dobrada e o tamanho da cicatriz é reduzido em 25% no tratamento com gel 1:1 D:L. Além disso, seis (6) vezes mais folículos capilares e glândulas sudoríparas estão presentes no caso tratado com gel, em comparação com o caso de nenhum tratamento.

Experimental

[00128] Uma abordagem emulsão de água-em-óleo de microfluidos foi utilizada para segmentar uma fase aquosa pré-gel contínua em blocos de construção de suporte uniforme, tal como aqui descrito. Gerar partículas de microgel 12 como blocos de construção em série em mi- croescala, ao invés de usar o vórtice típico e abordagens baseadas em sonicação permitiu um controle apertado sobre o ambiente de forma-ção e as propriedades dos materiais finais do suporte emergente 10. Ao ajustar as taxas de fluxo, tanto da solução pré-gel quanto o fluxo de óleo de compressão, assim como a geometria do canal microfluídico, uma gama de tamanhos de partículas de microgel foi criada com baixa polidispersividade. Embora o método de fabricação fosse em série, ele manteve praticidade em sua natureza de alto rendimento, com taxas de geração que variaram de 250 Hz para partículas maiores (> 100 μm) a -1200 Hz para partículas pequenas (~ 15 μm). Isto traduz-se aproximadamente 100 μl de gel pré-inchado a cada 50 min durante um único dispositivo. Esta abordagem, em última instância resultou em partículas que eram altamente monodispersas, tanto física quanto quimicamente. A geração microfluídica de "blocos de construção" de partículas de microgel é um processo facilmente escalável: um requisi-to prático para ampla adoção e utilização.

[00129] As partículas de microgel resultante 12 foram feitas de uma malha de hidrogel completamente sintética de estruturas principais de poli (etileno) glicol-vinil sulfona (PEG-VS) decoradas com o peptídeo adesivos de células (RGD [SEQ ID NO: 3]) e dois substratos peptídi- cos transglutaminase (K [SEQ ID NO: 1] e Q [SEQ ID NO: 2]). As par-tículas de microgel 12 foram reticuladas através do tipo de adição de Michael com sequências de peptídeos sensíveis a metaloprotease de matriz terminada em cisteína que permitiram degradação do material controlada por células e reabsorção posterior.

[00130] As partículas de microgel 12 foram purificadas em uma so-lução aquosa de meios de cultura celular isotônica para armazena-mento e, quando utilizadas para formar um gel foram recozidas uma à outra através de uma ligação de amida não canônica entre os peptí- deos K e Q mediados pelo Fator XIII ativado (FXIIIa), uma enzima que ocorre naturalmente responsável pela estabilização de coágulos san- guíneos. Este processo de recozimento mediado por enzima, permitiu a incorporação de células vivas em um suporte de formação dinâmica 10 que continha redes microporosas interligadas. A seguir à adição de FXIIIa, mas antes de recozimento suporte, uma suspensão das partí-culas de microgel 12 pode ser entregue através da aplicação de serin-ga, em última análise, solidificando na forma da cavidade em que são injetadas. FIG. 9A ilustra o modo como a cinética de recozimento po-dem ser alterados pelo ajuste do pH e da temperatura. O ambiente de recozimento escolhido para este experimento foi pH 8.25 e uma tem-peratura de 37°C.

[00131] As mudanças estruturais que conduzem a mais um aumento de três vezes no módulo de armazenamento nos géis recozidos foram observadas após a adição de FXIIIa para as partículas de microgel 12. O recozimento foi confirmado como sendo necessário para a formação de suporte através de observação de SEM de vácuo alto, em que ao desidratarem os suportes adotaram uma malha altamente esticada, ao passo que blocos de interligação sem FXIIIa se separam em grânulos esféricos individuais (FIG.9E).

[00132] Ao ajustar o tamanho das partículas de microgel e composição um conjunto diversificado de suportes montados 10 puderam ser gerados. Ao utilizar partículas de microgel 12 a partir de 30 a 150 μm de diâmetro, com redes de poros de diâmetros médio variação de 10 ~ a 35 ~ μm foi obtida). Diferentes percentagens de peso de PEG e es- tequiometrias reticulantes foram rastreadas para demonstrar uma gama de módulos de armazenamento facilmente realizáveis a partir de ~ 10 a 1000 Pa, que se estende do regime de rigidez necessário para imitações de tecidos moles de mamíferos. FIG. 9B ilustra que diferen-tes percentagens em peso de hidrogel foram usadas para produzir di-ferentes materiais de rigidez. FIG. 9C ilustra diferentes estequiometrias de reticulante (razão r de extremidades de reticulante (-SH) a grupos vinila (-VS)) que foram usados para produzir diferentes valores de rigi-dez no gel resultante. FIG. 9D ilustra um gráfico da degradação em % como uma função do tempo, tanto para o controle não poroso, bem como o gel poroso inventivo aqui descrito. Cinéticas de degradação, de gel poroso à base de partículas e o não poroso são mostradas por volumes iguais de géis in vitro. Os géis porosos, à base de partículas degradam mais rapidamente do que o gel não poroso devido à área de superfície maior para razões de volume e de transporte mais rápidas através do gel microporoso. A degradação foi efetuada utilizando 1: 1000 TrypLE®, resultando em concentrações mais elevadas do que protease em um leito de ferida e cinéticas de degradação mais rápidas. FIG. 9E mostra imagens SEM de um suporte recozido com FXIIIa. FIG. 9F ilustra imagens SEM de partículas de microgel 12 sem FXIIIa. Partículas não recozidas são vistas na FIG. 9F.

[00133] A fim de avaliar a capacidade do suporte gerado para suportar o crescimento celular e a formação da rede, uma morfologia celular in vitro e modelo de proliferação usando três linhagens de células humanas foram desenvolvidos. Estes incluíram: fibroblastos dérmicos (HDF), células estaminais mesenquimais derivadas de adiposo (Ah- MSC) e células estaminais mesenquimais derivadas da medula óssea (BMhMSC). Uma suspensão de célula única foi incorporada dinami-camente dentro de um gel recozido FXIIIa. As três linhagens celulares exibiram viabilidade celular elevada (> 93%), após vinte e quatro (24) horas de cultura dentro do suporte. As linhas de células HDF e AhMSC demonstraram proliferação continuada ao longo de um período de cul-tura de seis dias com tempos de duplicação de 1,5 e 2 dias, respecti-vamente. BMhMSCs foram observados para sofrer proliferação, bem como, no entanto, com um tempo de duplicação calculado estendido de ~ 12 dias.

[00134] As células incorporados no suporte começaram a exibir morfologia de propagação 90 minutos após o início de recozimento. Depois de dois (2) dias em cultura, todas as células observadas dentro dos suportes exibiram uma morfologia completamente espalhada, que continuou até o dia seis (6). Importante, uma vasta rede de formação para todas as linhagens celulares foi observada por dia dois (2). Redes celulares aumentaram em tamanho e complexidade durante toda a experiência. As BMhMSCs eram de particular interesse, assim como sua formação de rede extensa e a taxa de proliferação mais lenta indi-cou que essas células eram capazes de espalhar a comprimentos ex-tremos, formando redes celulares altamente interconectadas no supor-tes microporosos. Nomeadamente, as células que foram cultivadas em géis não porosos de propriedades químicas idênticas (5% em peso, G = 600 Pa de gel) e propriedades mecânicas (4,5% em peso, G’ = 350 Pa de gel) mantiveram viabilidade mas não exibiram qualquer formação de rede apreciável, mesmo após seis dias em cultura.

[00135] Foi suposto que a capacidade dos suportes para permitir que tanto a proliferação celular quanto a formação da rede conveniente in vitro fosse indicativa de uma capacidade para suportar a migração de células in vivo e a integração do tecido volumoso no âmbito do suporte. Para testar esta hipótese, foi utilizado um modelo de cicatri- zação de feridas da pele de murino, dirigindo um tecido de interesse para biomateriais porosos implantados anteriores. Importante, a contração da ferida foi prevenida utilizando uma tala de borracha suturada que limitava o fechamento de crescimento interno de tecido, melhor simulando a resposta de cura humana. Por causa da injetabilidade do suporte baseado em partículas de microgel, as partículas de microgel foram capazes de ser entregues diretamente no sítio da ferida, em se-guida recozendo in situ via FXIIIa exógeno. Isto proporcionou uma in-terface uniforme, ligando simultaneamente "blocos de construção" de partículas de microgel um com o outro, bem como resíduos de a lisina e glutamina endógenos presentes no tecido circundante. Do mesmo modo, observou-se uma interface uniforme para o controle quimica-mente idêntico, não porosa bilateral. Apesar da sua interface seme-lhante, o suporte gerado resultou em fechamento da ferida significati-vamente mais rápido do que os controles não porosos (60% versus 100% de área da ferida permanecendo depois de 5 dias, respectiva-mente) quando injetado nas feridas de camundongos CLR : SKH1-H rh como pode ser visto na FIG. 7B.

[00136] As disparidades nas taxas de fechamento da ferida levaram à investigação das diferenças nas respostas teciduais para o gel não poroso e à base de partes injetáveis. A injeção de suporte usando as partículas de microgel resultou em re-epitelização extensiva de ferida após cinco (5) dias in vivo. Células de queratina-5+ foram observadas com morfologia escamosa estratificada sobre a superfície apical do suporte, no entanto não há células (queratina-5+ ou outra forma) foram observadas após a borda da ferida não porosa. Importante, o suporte foi capaz de sustentar a formação do que parecia ser um folículo de cabelo completo com glândula sebácea adjacente dentro do leito da ferida semelhante à estrutura destas glândulas na pele não lesada. Ainda, outros exemplos de estruturas de tecido de queratina-5+ grandes foram observados dentro do suporte incluindo estruturas tubulares e invaginações epiteliais. Supõe-se que, em conjunto, estes resultados são uma indicação de migração coletiva de ordem superior (ou seja, o movimento dos aglomerados multicelulares em concerto) contribuindo para a regeneração da epiderme. Embora as células fossem capazes de se infiltrar nos controles bilaterais não porosos (como indicado por coloração com DAPI), sem evidência de formação de re-epitelização ou tecido cutâneo foi encontrada após cinco (5) dias in vivo.

[00137] Através de uma investigação mais aprofundada, verificou- se que o suporte promoveu a integração em massa via complexa for- mação da rede vascular in vivo. Depois de cinco (5) dias, ambas as células endoteliais e pericitos de suporte estavam presentes dentro do suporte, enquanto apenas ramificações individuais de células endoteli- ais sem pericitos de suporte estavam presentes nos controles bilaterais não porosos. A presença de células endoteliais e pericitos co- localizados era evidência de formação de rede de vasos maduros. Para nosso conhecimento, este é o primeiro exemplo de migração de pe- ricito precoce (< 7 dias) em um material injetável sintético ou suporte poroso implantado sem a inclusão de fatores de crescimento exógenos.

[00138] Enquanto investiga a interface perfeita provida pelos suportes injetáveis diferenças foram observadas em ambas quantidades ce-lulares globais e imunes em um dia (1). Depois de um (1) dia pós- injeção, os suportes continham um número significativamente maior de células dentro do suporte que os seus controles não porosos bilaterais. Isto corroborou a maior facilidade de mobilidade celular previamente observada nas nossas experiências de formação de rede in vitro. Além disso, o suporte e seu tecido circundante continham um número signi-ficativamente menor de células polimorfonucleares, quando compara-dos com o controle não poroso bilateral do mesmo camundongo. Este resultado indicou uma menor resposta imune inata inicial global para os suportes no dia um (1). Depois de cinco (5) dias pós-injeção, as frações inferiores de CD11b+ Células (leucócitos ativados) estavam presentes tanto no tecido circundante quanto dentro do suporte em relação aos controles não porosas, indicando um nível mais baixo sustentado da resposta imune inflamatória, de acordo com o que foi observado no suportes microporosos ex vivo construídos e implantados. Com-binados, esses dois resultados suportam um componente geométrico atualmente pouco explorado à estimulação imunológica a partir de bi- omateriais injetáveis quimicamente idênticos.

[00139] O suporte baseado em partículas de microgel recozido, re-presenta uma nova classe de biomaterial injetável que introduz porosi-dade interligada de microescala através de automontagem imperfeita robusta alcançada e recozimento de blocos de construção individuais. Esta abordagem permite o controle de propriedades hierárquicas de microescala e macroescala através da composição química determi- nística e geração de partículas microfluídicas. Ambas as células vivas incorporadas e tecido hospedeiro circundante são capazes de infiltrar imediatamente o suporte sem a necessidade de degradação do mate-rial, um feito nunca antes conseguido usando suportes injetáveis.

[00140] In vivo, as partículas de microgel injetáveis encheram com-pletamente o vazio do tecido, proporcionando um limite sem emenda com o tecido circundante. A microporosidade interconectada do suporte resultante promoveu migração celular no sítio da ferida que resultou em maior integração de massa com o tecido circundante enquanto destaca uma resposta imune do hospedeiro reduzida, em comparação com um controle não poroso injetável. Em última análise, isso levou à reformação de tecido saudável mais rápida do que com géis não poro-sos injetáveis semelhantemente compreendidos.

[00141] Este sistema de gel apresenta uma mudança fundamental na abordagem de biomateriais modulares fundo - topo, utilizando o espaço negativo de formação de rede para promover o desenvolvimento de redes tridimensionais complexos em escalas de tempo inéditas utilizando tecnologias de hidrogel atuais. A natureza "Plug and Play" desta estratégia permite a incorporação de uma grande variedade de materiais já estabelecidos (por exemplo, a fibrina), sinais (por exemplo, fatores de crescimento), e as populações de células (por exemplo, células estaminais). Combinações complexas de blocos de construção com propriedades físicas e químicas determinísticas e podem permitir a regeneração dos tecidos em uma variedade de nichos distintos fisiológicos (por exemplo, neural, cardíaca, pele, etc.), onde suportes de partículas recozida são adaptados para cada nicho através de suas propriedades de bloco de construção. A combinação única de microporosidade, injetabilidade e montagem modular inerente a suportes tem o potencial de alterar o formato da regeneração de tecido in vivo e criação e tecido de novo.

[00142] Geradores de gotícula de água em óleo microfluídicos foram fabricados utilizando litografia suave, como descrito anteriormente. Resumidamente, moldes mestres foram fabricados em wafers de silício de grau mecânicos (wafer de Universidade) usando KMPR 1025 ou 1050 fotorresiste (Microchem). Diferentes alturas de canal foram obtidas por fotorresiste rotatório em velocidades diferentes, por suges-tões do fabricante. Dispositivos foram moldados com os mestres usando kit poli (dimetil) siloxano (PDMS) Sylgard® 184 (Dow Corning). A base e o reticulante foram misturados em uma proporção de 10:1 em massa, vertidos sobre o molde, e desgaseificados antes da cura durante 6 horas a 65 °C. Canais foram selados por t ratamento do mol-de PDMS e uma lâmina de microscópio de vidro (VWR) com plasma de oxigênio a 500 mTorr e 75 W durante 15 segundos. Imediatamente após a selagem do canal, os canais foram funcionalizados por injeção de 100 μl de uma solução de RAIN-X® e reagir durante 20 minutos à temperatura ambiente. Os canais foram em seguida secos por ar se-guido de dessecação durante a noite.

[00143] As gotículas foram geradas usando um sistema de segmen-tação de água-em-óleo microfluídicos como ilustrado nas FIGS. 3A-3F e 4A-4C. A fase aquosa é uma mistura de volume 1:1 de duas partes: (i) a 10% p/v 4arm PEG-VS (20 kDa) em 300 mM de trietanolamina (Sigma), pH 8,25, pré-functionalizada com 500μM de peptídeo K (Ac- FKGGERCG-NH2 [SEQ ID NO: 1]) (Genscript), 500 μM de peptídeo Q (Ac-NQEQVSPLGGERCG-NH2 [SEQ ID NO: 2]), e 1 mM de RGD (Ac- RGD SP GERCG-NH2 [SEQ ID NO: 3]) (Genscript) e (ii) uma 8 mM de matriz metaloprotease (MMP) modificada de di-cisteína (12 mM para o dispositivo de três entrada) (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2 [SEQ ID NO: 4]) (Genscript) substrato pré-reagido com 10 μM de Alexa- Fluoro 647-maleimida (Life Technologies). Todas as soluções foram esterilizadas por filtração através de uma membrana de 0,2 μm de po- lietersulfona (PES) em um filtro de seringa de Leur-Lok antes da sua utilização no sistema de segmentação.

[00144] Geração foi realizada a 37 °C em uma fase d e microscópio incubado (NIKON® Eclipse Ti) para monitoramento em tempo real da qualidade do microgel. As soluções aquosas de entrada não sensivel-mente se misturam até segmentação de gotícula (número Peclet > 10). A fase oleosa foi um óleo mineral pesado (Fisher) suplementado com 0,25% v/v de SPAN® 80 (Sigma-Aldrich). A jusante da região de seg-mentação, uma segunda entrada de óleo com uma alta concentração de SPAN® 80 (5% v/v) foi adicionada e misturada à emulsão de gotí- culas de fluxo. Em última análise, a mistura de microgel-em-óleo saiu em um grande poço (12 mm de diâmetro, volume de ~ 1 mL), onde as partículas de microgel curadas a 37°C durante um mí nimo de 1 hora. A mistura foi, em seguida, extraída e purificada por sobreposição da so-lução de óleo em um tampão aquoso de solução salina tamponada com HEPES a pH 7,4 e a peletização em uma centrífuga de topo de mesa a 18000 xg durante 5 minutos. O pélete à base de microgel foi lavado em solução salina tamponada com HEPES a pH 7.4 com 10 mM de CaCl2 e 0,01% p/v de Pluronic F-127 (Sigma). A solução aquosa de microgel foi, em seguida, deixada inchar e equilibrar com tampão durante pelo menos 2 horas a 37°C.

[00145] Para determinar o regime operacional de segmentação de gotícula, a operação do dispositivo foi monitorizada em tempo real usando uma câmara de alta velocidade (Phantom), seguido por análi- se de imagem para o tamanho e medida de polidispersidade (utilizando o software ImageJ), bem como a frequência de segmentação (Fan-tasma PC2). Para segmentação de gotícula estável nesta plataforma: (i) iniciar todos os fluxos simultaneamente (ambos os fluxos aquosos e ambos os fluxos de óleo) a 5 μl/min até que todo o ar foi descarregado do dispositivo, (ii) virar para baixo as taxas de fluxo aquoso à taxa vo-lumétrica geral desejada (taxa de fluxo aquoso entre 1,5 e 2 μL/minute e taxas de fluxo de óleo entre 1 e 5 μL/minuto por 5 minutos, (iii) aspirar todo o líquido acumulado do poço de coleta para garantir coleção de μgels monodispersas, e (iv) executar geração.

[00146] Partículas de microgel de "bloco de contrução" equilibradas e completamente inchadas foram sedimentadas por centrifugação a 18000 xg durante cinco minutos, e o excesso de tampão (HEPES pH 7,4 + 10 mM de CaCl2) foi removido por aspiração e secagem com um pano de limpeza. Subsequentemente, as partículas de microgel foram divididas em alíquotas, contendo cada uma 50 μl de blocos de cons-trução concentradas. Um volume igual de HEPES pH 7,4 + 10 mM de Cacl2 foi adicionado às soluções concentradas de bloco de construção. Metade destas incluem trombina (Sigma) a uma concentração final de 2U/mL e a outra metade inclui o FXIII (CSL Behring) a uma concentração final de 10 U/ml. Estas soluções foram, em seguida, bem misturadas e centrifugadas a 18000 xg, seguido de remoção do excesso de líquido com um pano de limpeza (American Cleanstat).

[00147] O recozimento foi iniciado por mistura de volumes iguais de soluções de bloco de construção contendo trombina e FXIII utilizando uma pipeta de deslocamento positivo (Gilson). Estas soluções foram bem misturadas por pipetagem para cima e para baixo, repetidamente, em conjunto, com agitação, utilizando a ponta da pipeta. A solução misturada foi então pipetada na localização desejada (molde, placa de poço, ferida de camundongo, etc).

[00148] Para determinar a cinética de gelificação para cada microgel, uma macroescala (50 μL) de gel não poroso foi gerada com a mesma composição química. Uma solução de 30 μl de peptídeos 2X PEG-VS + (peptídeos RGD, K, Q) dissolvidos em 0,3 M de TEOA foi combinado com 30 μL de reticulante 2X MMP-1 dissolvido em água. A mistura foi rapidamente agitada em vórtice e 50 μL da mistura foi colocado entre dois discos reológicos de 8 mm com um espaçamento de 1 mm (Anton Paar Physica Rheometer MCR301). O módulo de armazenamento foi, em seguida, medido ao longo de um período de 20 minutos (2,5 Hz, 0,1% de deformação).

[00149] Para determinar o módulo de armazenamento em massa das partículas de microgel pré-recozidas e suporte pós-recozidos um varrimento de amplitude (0,01-10% de deformação) foi realizado para encontrar o intervalo de amplitude linear para cada um. Uma amplitude dentro do intervalo linear foi escolhida para executar uma varredura de frequência (0.5-5Hz). Para as partículas de microgel pré-recozidas, 50 μl, de partículas de microgel (5% em peso de PEG-VS 4-braço PM = 20 kDa, r = 0,8 MMP-1 de reticulante, com concentrações de peptí- deos sintéticos de 250 μM de K sintético, 250 μM de Q sintético, 500 μM de RGD sintético) foi injetado entre dois discos reológicos de 8 mm com um espaçamento de 1 mm. Para a medição de suporte pós- recozido, foi primeiro pipetado 50 μl, de partículas de microgel (N = 3) (5% em peso de PEG-VS 4-braço PM = 20 kDa, r = 0,8 MMP-1 de reti- culante, com concentrações de peptídeos sintéticos de 250 μM de K sintético, 250 μM de Q sintético, 500 μM de RGD sintético) enriqueci-das com FXIIIa, concentração final de 5 U/ml, e trombina, 1 U/ml de concentração final, entre duas lâminas de vidro. Esta mistura foi dei-xada parcialmente em recozimento durante 10 minutos antes da remo-ção da placa de vidro superior e a colocação em uma incubadora umi- dificada a 37°C durante 90 minutos. Os suportes foram então coloca- dos em solução salina tamponada com HEPES (pH 7,4) durante a noi-te para atingir o equilíbrio. As amostras foram, em seguida, colocadas entre dois discos de 8 mm no reômetro e testadas de forma idêntica às partículas de microgel pré-recozidas.

[00150] Para determinar o tamanho médio dos poros nos suportes de microgel recozido, soluções de estoque de partículas de microgel de tamanhos diferentes foram usadas para hibridar três suportes sepa-rados a partir de cada (9 suportes no total), como descrito acima. Usando uma Nikon Ti eclipse equipada com LED laser C2 confocal, fatias individuais foram tiradas em cada gel, separadas por 50 μm entre cada fatia (10 fatias por gel, com 30 fatias totais para cada tipo gel). Estas imagens foram então analisadas utilizando um script personali-zado gravado em MATLAB®, para identificar as regiões de poros e calcular o tamanho de cada um em px2. Cada tamanho do poro indivi-dual foi, em seguida, utilizado para calcular o tamanho médio dos poros para aquele gel, e convertido para μm2 utilizando o pixel para conversão de μm a partir da imagem original microscópia (0,31μm/px). Estas áreas foram então convertidas para uma medida de comprimento característica forçando as áreas para um círculo, e calculando o di-âmetro característico desses círculos. Par 30 μm de partículas de mi-crogel, diâmetro médio dos poros foi cerca de 12 μm. Para 100 μm de partículas de microgel, diâmetro médio dos poros foi cerca de 19 μm. Para 150 μm de partículas de microgel, diâmetro médio dos poros foi cerca de 37 μm. Note-se que os interstícios ou espaços vazios são contínuos e não semelhantes aos das regiões abertas esféricas bem definidas ligadas por poros circulares como produzido por meio de lixi-viação de micropartículas ou métodos de fabricação de gel de opala inversos, no entanto, referindo-se a um diâmetro de poros é útil sim-plesmente descrever a escala de comprimento dos espaços vazios.

[00151] Para determinar se as partículas de microgel foram cova- lentemente ligadas depois da adição de FXIIIa, SEM foi usado para diretamente visualizar suportes. Misturas de partículas de microgel fo-ram tratadas com FXIIIa (10 U/ml) ou apenas com tampão. Subse-quentemente, as soluções de blocos de construção foram colocadas sobre um 1 x 1 em peça de wafer de silício, e secas em uma câmara de alto vácuo SEM (Hitachi S4700) (1x103 mTorr). Blocos de Constru-ção com ou sem FXIIIa foram então visualizados utilizando 10 kV (10 mA max) de ambos 200x ou 500x como pode ser visto nas FIGS. 9D e 9F.

[00152] Células HEK293T constitutivamente expressando GFP através de transfecção lentiviral foram mantidas em DMEM (Life Technologies) suplementado com 10 μg/ml de puromicina. Três linhagens celulares foram usadas para experiências in vitro: fibroblastos dérmicos humanos (HDF, Life Technologies), células estaminais me- senquimais humanas derivadas da medula óssea (BMhMSC, Life Technologies), e células estaminais mesenquimais humanas derivadas de tecido adiposo (AhMSC, Life Technologies). Todas as linhagens celulares foram mantidas de acordo com as especificações do fabricante (antes e depois da incorporação em géis porosos ou não porosos). Especificamente, para as populações MSC em soro reduzido, meio basal (Life Technologies) foi usado para reter severidade.

[00153] Para a quantificação da proliferação celular e visualizações de a formação de rede em suportes poroso in vitro, suportes à base de partículas foram recozidos com partículas de microgel, tal como des-crito acima, com a adição de suspensões de células para as soluções de bloco de construção antes do recozimento. Para cada linhagem de células, suspensões de células foram preparadas a uma concentração final de 25 x 106 células/ml em meios de cultura respectivos não su-plementados com soro. Subsequentemente, 2 μl de suspensão de cé-lulas foi adicionado a 50 μl da mistura de partículas de microgel e con tendo FXIII combinado com 50 μl de mistura de partículas de microgel contendo trombina (500 células^l de gel). Esta mistura foi injetada no canto de um poço PDMS de fundo de capa deslizante. O topo do poço foi coberto com uma segunda capa deslizante e a mistura μgel^lula foi permitida submeter a recozimento por 90 min a 37°C.

[00154] Após o recozimento ser completado, a tampa deslizante superior foi removida, e o meio de cultura completo adequado foi adi-cionado à poço PDMS. Para o ponto de tempo do dia 0, PFA a 4% foi adicionado diretamente aos poços PDMS e deixado fixar durante a noite a 4°C. Outras células foram cultivadas em 5% de CO2 e 37°C durante os tempos indicados (2, 4, e 6 dias), altura em que elas foram lavadas uma vez com 1X PBS e fixadas com PFA a 4% durante a noite a 4°C. As células HEK-293-T foram incorporadas d entro de um molde em forma de estrela misturando as células com partículas de microgel (como descrito acima) e pipetando 5 μl da mistura no centro do molde. Imediatamente a seguir, as partículas de microgel sem células foram pipetadas no restante do molde, e recozidas tal como descrito acima.

[00155] A proliferação foi avaliada através da contagem do número de núcleos de células presentes nos construtos de suporte à base de partículas após 0, 2, 4, e 6 dias de cultura in vitro. Os núcleos foram corados com uma solução DAPI de 2 μg/ml em 1X PBS durante 2 ho-ras, seguido de visualização de uma Nikon C2 utilizando o laser LED de 405 nm. Especificamente, cada suporte foi fotografado tomando 55 fatias z em uma altura total z de 150 μm e comprimindo cada 5 fatias em uma imagem de projeção de intensidade máxima (MIP). Núcleos em MIPs foram enumerados usando um roteiro MATLAB® personali-zado, contando o número total de células. Para cada ponto de tempo, imagens da pilha z de três suportes de microgel separados foram ana-lisadas, em que cada imagem da pilha z mediu um volume total de 1270 x 1270 x 150 μm3 (ou ~280 NL). As contagens de 90 minutos conduzem a um cálculo de ~525 células^l de gel, consistente com a quantidade experimental adicionada (500 células^l de gel).

[00156] Para a visualização de formação de rede celular dentro dos suportes de microgel in vitro, construtos foram preparados, cultivados, e fixados como descrito acima. Os suportes foram bloqueados com 1% de BSA em 1X PBS durante 1 hora à temperatura ambiente, seguido por coloração para f-actina por meio de um conjugado de rodamina-B de faloidina (Life Technologies) durante 3 horas à temperatura ambien-te. Os suportes foram então lavados com 1% de BSA em 1X PBS, se-guido de contracoloração com uma solução DAPI de 2 μg/ml em 1X PBS durante 1 hora à temperatura ambiente. A visualização foi reali-zada como em imagiologia de proliferação, com a exceção da utiliza-ção de uma lente de imersão em água de 40x de ampliação. Total de alturas de pilhas de imagens foi de 130 μm, com o número total de fa-tias em 260 (capturas de volume ~ 15 nl).

[00157] Suportes PEG-VS (5% em peso de PEG-VS 4-braço PM = 20 kDa, r = 0,8 MMP-1 de reticulante, com concentrações de peptí- deos sintéticos de 250 μM de K sintético [SEQ ID NO: 1], 250 μM de Q sintético [SEQ ID NO: 2], 500 μM de RGD sintético [SEQ ID NO: 3]) foram utilizados para encapsular células (500 células^L). As linhagens celulares utilizadas foram as mesmas que em experiências de suporte de microgel. Géis foram formados por 20 minutos (TEOA 0,3 M, pH 8,25) antes de serem colocados em meios apropriados. Os géis foram fixados depois de pontos de tempo predeterminados (T = 90 minutos, 2 dias, 4 dias, e 6 dias), utilizando PFA durante a noite a 4°C, lavados e armazenados em PBS. Os géis foram corados como nos suportes de microgel. Todas as amostras foram armazenadas a 4°C em PBS com P/S quando não estando em imegem. A visualização foi realizada utili-zando uma NIKON® C2 confocal exatamente como no suporte de mi- crogel em experiências in vitro.

[00158] Camundongos CLR:SKH1-Hrhr (Charles River Laboratories) (N = 6 por teste) foram anestesiados com isofluorano (1,5% durante 10 minutos), seguido por corte de unhas e injeção de analgésico (buprenorfina, 60 μL por 20 g a 0,015 μg/μL). A pele foi esticada e um perfurador de biópsia de quatro mm foi utilizado para criar feridas cir-culares idênticas na parte traseira do camundongo. A periferia das fe-ridas foi protegida usando uma tala de borracha costurada através de 7-8 pontos ao redor da pele para impedir o fechamento da ferida pela contração. Hidrogel não poroso ou poroso incluindo 10 U/ml de FXIIIa foi injetado nos leitos das feridas, deixando submeterem-se a gelifica- ção durante 10 minutos, seguido por revestimento posterior da ferida por um envoltório de gaze elástica para evitar a interação dos animais. Os camundongos foram em seguida separados em gaiolas individuais. Medicamento para dor foi administrado subcutaneamente a cada 12 horas pelas próximas 48 horas ('para o Dia 1 sacrifícios para matar a dor foram administrados uma vez após cirurgia).

[00159] No Dia 1, camundongos (N = 6) foram sacrificados através de sobredosagem de isofluorano, seguido por deslocação da coluna vertebral posterior. A pele do dorso foi removida usando tesouras ci-rúrgicas e o sítio da ferida foi isolado por meio de um perfurador de biópsia de 10 mm. As amostras foram imediatamente fixadas com for- maldeído a 4% a 4°C (durante a noite), seguido por transferência para o etanol e incorporando a amostra em um bloco de parafina. Os blocos foram secionados a 6 μm de espessura por micrótomo (Leica) e foram submetidos a coloração com Hematoxilina e Eosina (H & E). Para quantificação de infiltração de células dentro dos hidrogéis e resposta imune em torno dos hidrogéis, uma série de 3 campos aleatórios de alta potência (40X) (HPF) foram examinados para cada seção. As amostras foram analisadas para a infiltração de células (> 0,1 mm no gel) por contagem do número total de células de qualquer tipo nos hi- drogéis injetados (N = 5 com uma soma de células em 3 seções anali-sadas por ferida). Mais de 95% das células que se infiltraram nos géis eram neutrófilas. Para medir a resposta imune, foram examinadas a média de 3 HPFs de diferentes seções da ferida. O número total de leucócitos/HPF dentro de 0,2 mm do hidrogel na borda da ferida foi quantificado e teve a média calculada para cada tipo de ferida. A con-tagem de leucócitos para cada ferida foi comparada com o seu controle bilateral no mesmo animal e a diferença relativa foi registrada como uma fração da resposta imune geral de cada animal. Esta comparação foi possível porque cada animal tinha uma ferida injetada com o supor-te de microgel e um ferimento com o controle não poroso.

[00160] As feridas foram fotografadas diariamente após fechamento das feridas. Cada sítio da ferida foi fotografado usando câmera de alta resolução (NIKON® COOLPIX®). Fração de fechamento foi determi-nada comparando a área de pixel da ferida para a área de pixel dentro do orifício central de 10 mm da tala de borracha vermelha. Frações de fechamento foram normalizadas para o Dia 0 para cada tipo camun- dongo/suporte (FIG. 7B).

[00161] No dia 5, camundongos (N = 6) foram sacrificados e o tecido coletado no dia 1. As amostras foram imediatamente submersas em fluido de temperatura de corte ideal TISSUE-TEK® (OCT) e conge-ladas em um bloco sólido com nitrogênio líquido. Os blocos foram en-tão crio-secionados a espessura de 25 μm por micrótomo criostato (Leica) e mantidos congelados até à sua utilização. As seções foram depois fixadas com paraformaldeído durante 30 minutos à temperatura ambiente, hidratadas com PBS, e mantidas a 4°C até serem coradas.

[00162] Lâminas contendo seções de tecido ou foram bloqueadas com soro de cabra normal (NGS) a 3% em 1X PBS + 0,05% Tween-20 (PBST) e bloqueadas ou simultaneamente permeabilizadas com 0,2% de Triton® X-100 em NGS a 3% em 1X PBST para seções coradas com anticorpo antiqueratina-5 apenas. As seções foram então lavadas em NGS a 3% em 1X PBST. Diluições de anticorpo primário foram preparadas como se segue em NGS a 3% em 1X PBST: Camundongo anti-rato CD11b (BD Pharmingen) - 1:100 Camundongo anti-rato PECAM-1 (BD Pharmingen) - 1:100 Camundongo anticoelho NG2 (Millipore) - 1:100 Queratina-5 de camundongo anticoelho (Covance, Inc.) - 1:250

[00163] As seções foram coradas com anticorpos primários durante a noite a 4°C, e subsequentemente lavadas com 3% de NGS em 1X PBST. Os anticorpos secundários foram todos preparados em 3% de NGS em 1X PBST a uma diluição de 1:100. As seções foram incuba-das em anticorpos secundários durante 1 hora à temperatura ambiente, e subsequentemente lavadas com 1X PBST. As seções foram con-trastadas com 2 μg/ml de DAPI em 1X PBST durante 30 minutos à temperatura ambiente. As seções foram montadas em meio de monta-gem Antifade Gold.

[00164] Imagens de pilha Z confocais adquiridas a partir de seções de tecido do dia 5 de ambos os blocos de tecido não porosos e estrutura do microgel foram comprimidas em MIPs, seguido de separação em imagens individuais correspondentes a cada um dos canais de laser (isto é, gel, DAPI, CD11b). A imagem do canal gel foi usada para traçar a borda da interface gel - tecido usando o ilustrador Adobe. A largura desta linha foi ampliada em 75 μm tanto para o tecido quanto para dentro do gel a partir da interface (150 μm na espessura total). As novas extremidades desta linha foram então usadas para cortar as imagens DAPI original e CD11b, para capturar apenas as áreas cor-respondentes a +/- 75 μm a partir da interface de gel de tecido. Estas imagens foram então importadas para ImageJ, e cobertas para fundir os canais DAPI e CD11b em uma única imagem. Esta imagem foi ana-lisada utilizando o plugin contador de células do ImageJ, em que tanto o número total de núcleos foi quantificado, bem como o número total de células CD11b+. Finalmente, a fração de núcleos com um sinal de CD11b+ correspondente foi relatada tanto para dentro do tecido quanto dentro do gel.

[00165] A FIG. 11 ilustra um exemplo de método de tratamento de tecido danificado 102. A FIG. 11 ilustra um sítio de ferida 100 formado no tecido 102 de um mamífero. Na operação 500, um dispositivo de entrega 110 (por exemplo, tubo, conforme ilustrado) que contém nele a suspensão de partículas de microgel 12 contidas em uma solução aquosa é utilizado para distribuir as partículas de microgel 12 para o sítio da ferida 100. Em seguida, como visto na operação 510, um apli- cador opcional 122 é usado para espalhar as partículas de microgel 12 para dentro e através do sítio da ferida 100. O aplicador 122 também é utilizado para corar a superfície superior, exposta das partículas de microgel 12, geralmente niveladas com a superfície do tecido 102. O aplicador 122 também pode ser usado para corar a parte superior, su-perfície exposta das partículas de microgel 12 empilhadas ou elevadas em relação à superfície do tecido 102 para permitir uma maior estrutura para crescimento interno celular e prevenção de uma interface com o tecido comprimido após a cura completa. Em seguida, como visto na operação 520, o recozimento das partículas de microgel 12 é iniciado para formar o suporte 10 de partículas de microgel recozidas 12. Neste exemplo particular, uma fonte de luz 124, sob a forma de uma lanterna é usada para iluminar uma mistura de partículas de microgel 12, um fotoiniciador (por exemplo, eosina Y), e um agente de transferência de radicais livres (por exemplo, peptídeo RGD). Naturalmente, também podem ser utilizadas outras modalidades de recozimento, tal como aqui descritas. A reação de recozimento ilustrada na FIG. 11 provoca a formação de um suporte covalentemente estabilizado 10 de partículas de microgel 12 tendo nelas espaços intersticiais. As células 106 (como visto na FIG. 2C) a partir do tecido circundante 102, em seguida, co-meçam a infiltrar-se os espaços dentro do suporte 10, crescer, estimu-lar, e, finalmente, efetuar o processo de cicatrização do tecido 102. Em uma modalidade, após à reação de recozimento uma bandagem ou curativo úmido é opcionalmente colocado sobre a ferida preenchida com suporte para protegê-la de danos durante o processo de cicatri- zação. Depois de um período de tempo decorrido, tal como ilustrado na operação 530, o suporte 10 se degradada e o tecido 102 é devolvido a um estado curado.

[00166] A fim de avaliar a capacidade do suporte de gel poroso para suportar o crescimento celular e a formação da rede, uma morfologia celular in vitro e modelo de proliferação foi desenvolvido usando três linhagens de células humanas: fibroblastos dérmico (HDF), células estaminais mesenquimais derivadas de tecido adiposo (AhMSC) e cé-lulas estaminais mesenquimais derivadas da medula óssea (BMh- MSC). Uma suspensão de uma única célula foi incorporada dinamica-mente dentro de um suporte de gel porosa recozido FXIIIa. As três li-nhagens celulares exibiram viabilidade celular elevada (> 93%, a FIG. 12B) após vinte e quatro (24) horas de cultura dentro do suporte de gel poroso.

[00167] As células incorporadas no suporte de gel poroso começaram a exibir morfologia de propagação noventa (90) minutos após o aparecimento de recozimento. Depois de dois (2) dias em cultura, to-das as células observadas dentro dos suportes de gel poroso exibiram uma morfologia completamente espalhada, que continuou até a dia seis. Importante, uma vasta rede de formação para todas as linhagens celulares foi observada no dia dois. Redes celulares aumentaram em tamanho e complexidade através da totalidade da experiência. As BMhMSCs foram de particular interesse, assim como a sua formação de rede expansiva e taxa de proliferação mais lenta indicaram que es-tas células eram capazes de espalhar a extremos, formando redes ce-lulares altamente interligadas no suportes microporosos como pode ser visto na FIG. 12A.

[00168] As partículas de microgel 12 podem ser combinadas e mis-turadas com uma solução de células vivas 106 antes do recozimento para criar um suporte microporoso 10 que contém células vivas 106 que residem na rede microporosa e dispersas quer de forma homogê-nea ou heterogeneamente no interior do suporte de gel recozido ma-croscópico 10 como visto na FIG. 13A.

[00169] As partículas de microgel 12 podem ser purificadas para uma solução aquosa de meios isotônicos de cultura celular para arma-zenamento e, quando utilizadas para formar um gel poroso foram re- cozidas uma na outra através de uma ligação de amida não canônica entre os peptídeos K e Q mediados pelo fator XIII ativado (FXIIIa), uma enzima que ocorre naturalmente responsável pela estabilização de co-águlos sanguíneos. Este processo de recozimento mediado por enzima permitiu a incorporação de células vivas 106 em um suporte poroso de formação dinâmica 10 que continha redes microporosas interligadas. A seguir à adição de FXIIIa, mas antes de recozimento de suporte, uma suspensão das partículas de microgel 12 pode ser entregue via aplicação por seringa (Fig. 13A), em última análise, solidificando na forma da cavidade em que são injetadas como pode ser visto nas FIGS. 13B-E.

[00170] Fabricação microfluídica das partículas de microgel 12 permite o controle determinístico sobre o tamanho do microgel e a produção de frequência conforme ilustrado na FIG. 14A. A pressão que é aplicada às entradas do sistema microfluídico 20, determina a frequência de produção de microgel (FIG. 14B). Além disso, os supor- tes de microgel poroso 10 criados usando partículas de microgel de diferentes tamanhos 12 têm características porosas distintas, tais como o tamanho médio dos poros dentro da rede, como se vê na fig. 14C.

[00171] Enquanto modalidades foram mostradas e descritas, várias modificações podem ser feitas sem sair do âmbito dos conceitos in-ventivos aqui descritos. A matéria aqui descrita, por conseguinte, não deve ser limitada, exceto para as seguintes reivindicações e seus equivalentes.

Claims (28)

1. Sistema de gel microporoso, caracterizado pelo fato de que compreende: uma solução aquosa compreendendo uma pluralidade de partículas de microgel esféricas tendo diâmetro na faixa de 30 μm a 1000 μm; e um agente de recozimento que, quando aplicado à pluralidade de partículas de microgel esféricas, faz com que as partículas de microgel esféricas formem um sequestrante covalentemente estabilizado de partículas de microgel esféricas tendo espaços intersticiais interconectados no seu interior em que o diâmetro do poro médio é de pelo menos 12 μm.

2. Sistema de gel microporoso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as partículas de microgel esféricas ainda compreendem um agente de reticulação degradável.

3. Sistema de gel microporoso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o agente de reticulação degra- dável compreende um reticulante degradável com metaloprotease de matriz (MMP).

4. Sistema de gel microporoso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente de recozimento compreende o Fator XIIIa.

5. Sistema de gel microporoso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente de recozimento compreende Eosina Y, um agente de transferência de radical livre, ou uma combinação destes.

6. Sistema de gel microporoso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que ainda compreende uma fonte de luz configurada para iluminar uma mistura da pluralidade de partículas de microgel esféricas e do agente de recozimento.

7. Sistema de gel microporoso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as partículas de microgel esféricas compreendem peptídeos adesivos de células expostos em uma superfície do mesmo.

8. Sistema de gel microporoso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as partículas de microgel esféricas compreendem um peptídeo K.

9. Sistema de gel microporoso de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o peptídeo K compreende um grupo lisina reconhecido pelo Fator XIIIa.

10. Sistema de gel microporoso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as partículas de microgel esféricas compreendem um peptídeo Q.

11. Sistema de gel microporoso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o peptídeo Q compreende um grupo de glutamina reconhecido pelo Fator XIIIa.

12. Sistema de gel microporoso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os espaços intersticiais interco- nectados compreendem superfícies de borda exibindo concavidade negativa.

13. Sistema de gel microporoso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sequestrante covalentemente estabilizado de partículas de microgel esféricas tem um volume vazio de 10% a 50%.

14. Sistema de gel microporoso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende um dispositivo de entrega.

15. Sistema de gel microporoso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de entrega contém a solução aquosa compreendendo uma pluralidade de partículas de microgel esféricas e o agente de recozimento ou um precursor do agente de recozimento.

16. Sistema de gel microporoso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de entrega compreende um dispositivo de entrega de compartimento único contendo a solução aquosa compreendendo uma pluralidade de partículas de microgel esféricas e o agente de recozimento.

17. Sistema de gel microporoso de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de entrega compreende um dispositivo de entrega de compartimento duplo, em que um compartimento contém a solução aquosa contendo uma pluralidade de partículas de microgel esféricas e um primeiro precursor de agente de recozimento e o segundo compartimento contém a solução aquosa contendo a pluralidade de microgel esféricas e um segundo precursor do agente de recozimento.

18. Sistema de gel microporoso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o agente de reticulação degradável (MMP) compreende pelo menos um aminoácido D.

19. Sistema de gel microporoso de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que as partículas de microgel esféricas compreendem um agente de reticulação degradável (MMP) compreendendo uma pluralidade de aminoácidos D.

20. Sistema de gel microporoso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as partículas de microgel esféricas estão presentes em uma fração volumétrica de 30-99% na solução aquosa.

21. Sistema de gel microporoso de acordo com a reivin-dicação 1, caracterizado pelo fato de que as partículas de microgel esféricas tem um módulo de armazenamento mínimo de 10 Pa.

22. Sistema de gel microporoso de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizado pelo fato de que os espaços intersticiais interconectados são definidos por um diâmetro médio dos poros de 12 μm a 37 μm.

23. Sistema de gel microporoso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é capaz de sofrer recozimento em 30 minutos ou menos.

24. Sistema de gel microporoso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: um dispositivo de entrega; uma pluralidade de partículas de microgel esféricas biodegradáveis tendo diâmetro na faixa de 30 μm a 1000 μm contidas em uma solução aquosa e armazenadas no dispositivo de administração; e um agente de recozimento ou precursor do agente de recozimento armazenado no dispositivo de administração.

25. Uso de uma pluralidade de partículas de microgel esféricas e um agente de recozimento, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para cicatrização de feridas, em que o agente de recozimento emparelha as partículas de microgel esféricas para formar um sequestrante covalentemente estabilizado tendo espaços intersticiais interligados no mesmo em que o diâmetro do poro médio é de pelo menos 12 μm.

26. Uso de camadas de sequestrantes covalentemente estabilizados de partículas de microgel esféricas, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, tendo diâmetro na faixa de 30 μm a 1000 μm, em que, pelo menos, um sequestrante covalentemente estabilizado tem espaços intersticiais interconectados no mesmo definidos por um diâmetro do poro médio de pelo menos 12 μm, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para cicatrização de feridas.

27. Uso de um sequestrante covalentemente estabilizado de partículas de microgel esféricas tendo diâmetro na faixa de 30 μm a 1000 μm tendo espaços intersticiais interconectados no mesmo definidos por um diâmetro do poro médio de pelo menos 12 μm, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para cicatrização de feridas.

28. Método para a preparação de partículas de microgel esféricas, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que compreende: proporcionar um dispositivo microfluídico gerador de gotícu- las de água em óleo que tem uma pluralidade de canais de entrada que conduzem a um canal comum e um par de canais de compressão de óleo que se cruzam com o canal comum em uma localização a jusante; fluir uma primeira solução pré-polímero contendo uma estrutura principal polimérica modificada com oligopeptídeos em um primeiro canal de entrada; fluir uma segunda solução contendo um agente de reticulação biodegradável para um segundo canal de entrada; fluir um óleo e um tensoativo para o par de canais de compressão de óleo para formar gotículas contendo a primeira solução de pré-polímero e a segunda solução; e coletar partículas de microgel esféricas formadas por reticulação cruzada das gotículas.

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