JP2024506853A - ハイブリッドネットワークヒドロゲルの作製および使用のための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

本開示の実施形態は、ヒドロゲルを生成および使用するための新規組成物、組み合わせ組成物、方法およびシステムに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、脂肪族アルデヒドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とヒドラジドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とを有するポリマー主鎖、および少なくとも１つの８アームポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含む第２のポリマー主鎖を含む組成物を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、対象の状態を処置する方法であって、１種または複数の治療剤または細胞の非存在下または存在下で対象にヒドロゲルを投与する工程を含む、方法を提供する。

Description

本開示の実施形態は、一般に、ヒドロゲルを生成するための組成物、方法、およびシステムに関する。本明細書に開示される他の実施形態は、一般に、健康状態の処置における治療用途のためのヒドロゲルを生成および使用するための組成物、方法、およびシステムに関する。

ヒドロゲルの一般的な組成および機械的特性は生体組織のそれらと類似しているため、ヒドロゲルは生体材料として非常に興味深い。ヒドロゲルは再生医療に使用することができ、また、小分子、タンパク質ベース、および細胞ベースの治療薬のための足場材料または送達ビヒクルとしても機能することができる。粘弾性ヒドロゲルにより、注射部位の天然の細胞外マトリックスの機械的特性とより厳密に一致するように、注射およびその機械的特性の調節を行うことができる。粘弾性ヒドロゲルは、適応性の高い化学によって弾性挙動を調整することによって、一部はインビボ環境を再現するように操作することができる。しかし、これまで知られている粘弾性ヒドロゲルでは実質的な劣化および質量損失が発生しており、長期的利用が制限されている。

したがって、治療現場で使用するヒドロゲルの適応性の高い化学的利点を維持しながら、粘弾性ヒドロゲルを安定化するための新しい戦略および製剤を開発する必要がある。

本開示の実施形態は、ヒドロゲル（例えば、ハイブリッドネットワークヒドロゲル）を生成するための新規組成物、方法、およびシステムに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、限定されないが、脂肪族アルデヒドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とヒドラジドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とを有する第１のポリマー主鎖、および少なくとも１つの８アームポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を有する第２のポリマー主鎖を含む組成物であって、２つのポリマー主鎖の組み合わせが、改善された特性を有するハイブリッドネットワークヒドロゲルを生成することができる、組成物を提供する。

一部の実施形態では、第２のポリマー主鎖の８アームＰＥＧは、限定されるものではないが、少なくとも１つのひずみシクロオクチン（ｓｔｒａｉｎｅｄ ｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ）で官能化された少なくとも１つの８アームＰＥＧを含むことができる。ある特定の実施形態では、第２のポリマー主鎖の８アームＰＥＧは、限定されるものではないが、ビシクロノニンまたは類似の官能化剤で官能化された少なくとも１つの８アームＰＥＧを含むことができる。これらの実施形態によれば、少なくとも１つの８アームＰＥＧを含む第２のポリマー主鎖は、限定されるものではないが、任意選択でベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドをさらに含むことができる。一部の実施形態では、ヒアルロン酸主鎖、ＰＥＧマクロマー、またはそれらの組み合わせを、１つまたは複数のペプチドで修飾することができる。一部の実施形態では、ペプチドは長さ約２～約５０アミノ酸である。

一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、限定されるものではないが、等しい濃度、あるいは等しくない濃度の２つのポリマー主鎖を含むことができる。これらの実施形態によれば、１つのポリマー主鎖は、少なくとも１つの８アームＰＥＧを含む第２のポリマー主鎖の濃度と比較して、脂肪族アルデヒドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖およびヒドラジドで官能化された１つのヒアルロン酸主鎖を含むことができ、または少なくとも１つの８アームＰＥＧを有する第２のポリマー主鎖の量と比較して、脂肪族アルデヒドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖およびヒドラジドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖を有する、より少ないポリマー主鎖を含むことができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、限定されるものではないが、脂肪族アルデヒドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖およびヒドラジドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖を含むポリマー主鎖内に約２５重量％の総架橋濃度；および少なくとも１つの８アームＰＥＧを有する第２のポリマー主鎖中に約７５重量％の総架橋濃度を含むことができる。

一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、対象に送達するための幹細胞または他の治療用細胞などの細胞をさらに含むことができる。これらの実施形態によれば、本明細書に開示される組成物に好適な幹細胞としては、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、皮膚幹細胞、および間葉系幹細胞または間葉系間質細胞を挙げることができる。

一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含むことができる医薬組成物として製剤化することができる。これらの実施形態によれば、本明細書の組成物は、注射に好適な薬学的に許容される担体をさらに含むことができる医薬組成物中に製剤化されたハイブリッドネットワークヒドロゲルであり得る。

一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、少なくとも１種の活性薬剤をさらに含むことができる。これらの実施形態によれば、本明細書の組成物に含まれる活性薬剤は、組成物の分解前、分解後、または分解中にヒドロゲルから放出させることができる。これらの実施形態によれば、組成物は少なくとも１か月後に分解する可能性がある。

一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるヒドロゲルを形成する方法を提供する。これらの実施形態によれば、ヒドロゲルを形成する方法は、脂肪族アルデヒドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とヒドラジドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とを有する１つのポリマー主鎖を、少なくとも１つの８アームポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を有する第２のポリマー主鎖と組み合わせる工程を含むことができ、この方法はヒドロゲル形成のために外部刺激を必要としない。

一部の実施形態では、本明細書に開示される組み合わせ組成物は、少なくとも１つの８アームＰＥＧを有する第２のポリマー主鎖の濃度の増加と、脂肪族アルデヒドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とヒドラジドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とを有するポリマー主鎖の濃度の減少とを組み合わせることによって、ヒドロゲルの応力緩和の増大をもたらすことができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される組み合わせ組成物は、少なくとも１つの８アームＰＥＧを有する第２のポリマー主鎖の濃度の減少と、脂肪族アルデヒドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とヒドラジドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とを有するポリマー主鎖の濃度の増加とを組み合わせることによって、ある特定のヒドロゲル製剤の応力緩和の低減をもたらすことができる。これらの実施形態によれば、本明細書に開示されるハイブリッドネットワークヒドロゲル製剤の応力緩和を低減させる組み合わせ組成物および方法によって、応力緩和が低減していない組み合わせヒドロゲル製剤と比較して、応力緩和が低減しているまたは低減したヒドロゲル組成物に含まれる少なくとも１つの幹細胞の遊走が増加する可能性がある。これらの実施形態によれば、本明細書に開示されるハイブリッドネットワークヒドロゲル製剤の応力緩和の低減を使用する組み合わせ組成物および方法によって、応力緩和が低減していない組み合わせヒドロゲル製剤と比較して、応力緩和が低減しているまたは低減したヒドロゲル組み合わせ組成物に含まれる幹細胞からの少なくとも１つの抗炎症性サイトカインの分泌が増加する可能性がある。これらの実施形態によれば、本明細書に開示されるハイブリッドネットワークヒドロゲル製剤の応力緩和の増大を使用する組み合わせ組成物および方法によって、応力緩和が増大していない組み合わせヒドロゲル製剤と比較して、ハイブリッドネットワークヒドロゲル組成物に含まれる幹細胞からの少なくとも１つの炎症誘発性サイトカインの分泌が増加する可能性がある。

他の実施形態では、本明細書に開示される組成物、組み合わせ組成物および方法を使用して生成されるハイブリッドネットワークヒドロゲルは、それを必要とする対象における健康状態もしくは疾患を処置する、進行軽減する、発症軽減する、および／または予防するために使用することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される状態を処置および／または予防する方法には、炎症状態、自己免疫状態、血管状態、整形外科状態、がん、またはそれらの組み合わせを含めることができる。これらの実施形態によれば、本明細書に開示されるハイブリッドネットワークヒドロゲルは、対象の罹患組織または領域に対して注射によって直接的にまたは間接的に対象に投与することができる。これらの実施形態によれば、本明細書に開示されるハイブリッドネットワークヒドロゲルは、注射器、カテーテル、トロカール、カニューレ、またはそれらの組み合わせを介した注射によって対象に投与することができる。ある特定の実施形態では、短期または長期の処置のために、本開示のハイブリッドネットワークヒドロゲルを導入するために、大きなゲージの針またはカテーテルを使用することができる。

本開示のある特定の実施形態によるヒドロゲルの形成に使用されるマクロマーを示す概略図。 本開示の一部の実施形態による粘弾性ＨＡ－ヒドラゾンゲル系を示す概略図。 本開示の特定の実施形態による、ＨＡ－ヒドラゾンゲル系と混合したＰＥＧ－トリアゾールゲル系を示す概略図。 本開示の一部の実施形態による、ＨＡ－ＨｙｄおよびＨＡ－Ａｌｄのヒアルロン酸主鎖上で官能化されたヒドラジド基とアルデヒド基との間に形成されたヒドラゾン結合、ならびに（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチル（ＢＣＮ）基とベンズアルデヒド－Ｐｅｇ３－アジド（アジド）基との間に形成された結合を示す概略図。 本開示の一部の実施形態による、ＨＡヒドラジド、ＰＥＧ－ＢＣＮ、およびベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドを有し、安定なヒドラゾン結合およびトリアゾール結合を形成する弾性ＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲルを示す概略図。 本開示のある特定の実施形態による、ＨＡ－ヒドラゾン対ＰＥＧ－トリアゾールの異なる比率を有するＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲルについての用量反応およびゲル形成の時間経過の例を示すグラフ。ヒドロゲルのインサイチュでの形成を示す。 本開示のある特定の実施形態による、ＨＡ－ヒドラゾン対ＰＥＧ－トリアゾールの異なる比率を有するＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲルについての用量反応およびゲル形成の時間経過の例を示すグラフ。ヒドロゲルの膨潤弾性率を示す。 本開示のある特定の実施形態による、ＨＡ－ヒドラゾン対ＰＥＧ－トリアゾールの異なる比率を有するＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲルについての用量反応およびゲル形成の時間経過の例を示すグラフ。ヒドロゲルのインサイチュでの弾性率の概要を示すグラフ。 本開示のある特定の実施形態による、ヒドロゲルの応力緩和に対する粘弾性特性の効果を示すグラフ。ヒドロゲルの応力緩和挙動を示す。 本開示のある特定の実施形態による、ヒドロゲルの応力緩和に対する粘弾性特性の効果を示すグラフ。ヒドロゲル中のヒドラゾン架橋のパーセンテージ（粘弾性）の関数として計算された平均緩和時間を示す。 本開示のある特定の実施形態による、ヒドロゲルの応力緩和に対する粘弾性特性の効果を示すグラフ。ヒドロゲル中で緩和された応力のパーセンテージを示す。 本開示のある特定の実施形態による、ヒドロゲルの応力緩和に対する粘弾性特性の効果を示すグラフ。ＨＡ：ＰＥＧおよびＨａ－ａｌｄ：ＰＥＧ－ｐＨＡｌｄのモル比を示す。 本開示のある特定の実施形態による、ヒドロゲルの応力緩和に対する粘弾性特性の効果を示すグラフ。適合伸長パラメータ（β）を示す。 本開示のある特定の実施形態による、ヒドロゲルの応力緩和に対する粘弾性特性の効果を示すグラフ。応力緩和の平均時定数＜τ＞を示す。 本開示のある特定の実施形態による、ヒドロゲルの応力緩和に対する粘弾性特性の効果を示すグラフ。ＰＢＳ中で膨潤させた２４時間後のヒドロゲルの最終弾性率を示す。 本開示の実施形態による、ＨＡ－ヒドラゾン対ＰＥＧ－トリアゾールの異なる比率を有するＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲルについての用量反応および応力緩和の時間経過の例を示すグラフ。 本開示の実施形態による、ＨＡ－ヒドラゾン対ＰＥＧ－トリアゾールの異なる比率を有するＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲルについての用量反応および応力緩和の時間経過の例を示すグラフ。 本開示の実施形態による、ＨＡ－ヒドラゾン対ＰＥＧ－トリアゾールの異なる比率を有するＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲルについての用量反応および応力緩和の時間経過の例を示すグラフ。 図４Ａ～４Ｆは、本開示のある特定の実施形態による、注射器から排出された、７５％の弾性（７５％のＰＥＧ－トリアゾールおよび２５％のＨＡ－ヒドラゾン）を有する代表的なＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲルのタイムラプス画像の例を示す図。 図５Ａ～図５Ｄは、本開示の一部の実施形態による、封入の０日後または４日後に、１００％弾性または１２％弾性を有するＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲル内に封入された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の代表的な画像の例を示す図。図５Ｅは、本開示のある特定の実施形態による、ＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲル内への封入から４日後の、応力緩和の関数として特徴付けられる間葉系幹細胞（ＭＳＣ）形態の例を示すグラフ。 本開示の一部の実施形態による、粘弾性が増加しているヒドロゲル内に封入されたＭＳＣの応力緩和の関数としての形態学的変化の例を示すグラフ。 本開示の一部の実施形態による、粘弾性が増加しているヒドロゲル内に封入されたＭＳＣの応力緩和の関数としての形態学的変化の例を示す図。 本開示の一部の実施形態による、粘弾性が増加しているヒドロゲル内に封入されたＭＳＣの応力緩和の関数としての形態学的変化の例を示す図。 本開示の一部の実施形態による、８８％適応性ヒドラゾン結合条件における小さなクラスターの形成を示す代表的な画像を示す図。 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲルにおける応力緩和の関数としての形態学的変化を示すグラフ。 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲルにおける応力緩和の関数としての形態学的変化を示すグラフ。 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲル内への封入から４日後の間葉系幹細胞のＹａｐ／Ｔａｚ分析を示すグラフ。細胞におけるＹａｐ／Ｔａｚの核形成を示す図。 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲル内への封入から４日後の間葉系幹細胞のＹａｐ／Ｔａｚ分析を示す図。（上）陰性対照、０％粘弾性条件における封入後０日目の細胞形状の代表的な画像、および（下）陰性対照における４日目の細胞形状の代表的な画像を示す図。 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲル内への封入から４日後の間葉系幹細胞のＹａｐ／Ｔａｚ分析を示す図。（左）封入後４日目の小クラスターのＹａｐ／Ｔａｚ細胞シグナルの代表的な画像、および（右）顕著な細胞広がりを示す小クラスターの４日目の細胞形状の代表的な画像を示す図。 本開示の一部の実施形態による、適応性ヒドラゾン結合条件下で４日後のｒＭＳＣの平均細胞体積を示すグラフ。 本開示の一部の実施形態による、適応性ヒドラゾン結合条件下で４日後のｒＭＳＣの平均核体積を示すグラフ。 図７Ａ～図７Ｅは、本開示の一部の実施形態による、デュアルネットワークゲル内への封入から数日後のｒＭＳＣによる新生タンパク質沈着に対する応力緩和の効果の例を示す図。 本開示の一部の実施形態による、高い粘弾性を有するヒドロゲル内に多核構造を形成するためのＭＳＣ細胞の誘導遊走の例を示す図。 本開示の一部の実施形態による、高い粘弾性を有するヒドロゲル内に多核構造を形成するためのＭＳＣ細胞の誘導遊走の例を示す図。 本開示の一部の実施形態による、高い粘弾性を有するヒドロゲル内に多核構造を形成するためのＭＳＣ細胞の誘導遊走の例を示す図。 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲル中のｒＭＳＣによる新生タンパク質沈着に対する応力緩和の効果を示す図。いくつかの粘弾性条件からの単一細胞およびクラスター化された新生タンパク質沈着の代表的な画像を示す図。 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲル中のｒＭＳＣによる新生タンパク質沈着に対する応力緩和の効果を示すグラフ。平均分泌タンパク質厚さのグラフ表示を示す。 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲル中のｒＭＳＣによる新生タンパク質沈着に対する応力緩和の効果を示すグラフ。最大分泌タンパク質を示す。 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲル中のｒＭＳＣによる新生タンパク質沈着に対する応力緩和の効果を示すグラフ。各条件におけるｒＭＳＣの周囲に沈着したタンパク質の平均面積を示す。 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲル中のｒＭＳＣによる新生タンパク質沈着に対する応力緩和の効果を示すグラフ。８８％粘弾性条件におけるクラスター化ｒＭＳＣ対単一細胞ｒＭＳＣ間の沈着タンパク質の平均面積を示す。 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲル中のｒＭＳＣによる新生タンパク質沈着に対する応力緩和の効果を示す図。０％粘弾性条件におけるフィブロネクチンの沈着を示す代表的な画像を示す図。 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲル中のｒＭＳＣによる新生タンパク質沈着に対する応力緩和の効果を示す図。８８％粘弾性条件（図９Ｇ）におけるフィブロネクチンの沈着を示す代表的な画像を示す図。 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲル中のｒＭＳＣによる新生タンパク質沈着に対するＥｘｏ－１阻害の効果を示すグラフ。 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲル中のｒＭＳＣによる新生タンパク質沈着に対するＥｘｏ－１阻害の効果を示すグラフ。 本開示の一部の実施形態による、ヒドロゲル中のｒＭＳＣによる新生タンパク質沈着に対するＥｘｏ－１阻害の効果を示すグラフ。 本開示の一部の実施形態による、ＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲルへの封入から４日後のヒドロゲル応力緩和の関数としての、炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインのサイトカイン分泌のサイトカインアレイアッセイの例を示す図。 本開示の一部の実施形態による、ＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲルへの封入から４日後のヒドロゲル応力緩和の関数としての、炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインのサイトカイン分泌のサイトカインアレイアッセイの例を示す図。

定義
本明細書で特に定義しない限り、用語は、本明細書に開示されるある特定の実施形態に関連する、当業者によって一般的に理解される、または適用可能な意味を有する。

特に指示がない限り、薬剤および／または化合物の量、分子量などの特性、反応条件を表すすべての数値は、本明細書に開示されるとおり、すべての場合において「約」という用語によって改変されるものと考えられる。したがって、特に異議を唱えない限り、明細書および特許請求の範囲における数値パラメータは、本明細書に開示されるように求められる所望の特性に応じて、約１０％～約１５％プラスおよび／またはマイナスで変動し得る近似値である。本明細書で表される数値には本質的に標準偏差が含まれており、これは数値の試験測定で見出された誤差から必然的に生じる。

本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、ヒトおよび非ヒト動物の両方を指す。本開示の「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例として非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。一部の実施形態では、対象はヒトを含む。他の実施形態では、対象は、骨修復または骨形成を必要とするヒトを含む。

本明細書で使用される場合、「処置」、「治療」および／または「治療レジメン」は、患者が発現する、または患者がかかりやすい可能性がある疾患、障害または生理学的状態に応じて行われる臨床介入を指す。処置の目的には、症状の緩和または予防、疾患、障害もしくは状態の進行または悪化の遅延もしくは停止、および／または疾患、障害もしくは状態の寛解が含まれる。

本明細書で使用される場合、「予防する」または「予防」は、介入がない場合の発症または重症度の時間および／または程度と比較して、特定の疾患、障害もしくは生理学的状態の発症を除去もしくは遅延させること、または特定の疾患、障害もしくは生理学的状態の重症度の程度を軽減することを指す。

「有効量」または「治療有効量」という用語は、有益なまたは望ましい生物学的結果および／または臨床結果をもたらすのに十分な量を指す。
「ヒドロゲル」は、高い吸水性を特徴とする少なくとも部分的に親水性の物質を指すことができる。一部の実施形態では、ヒドロゲルは、例えばネットワーク構造で、少なくとも部分的に親水性のポリマー、超吸収性ポリマー、または生体高分子を有することができる。一部の実施形態では、例えば、ヒドロゲルは、ヒドロゲル重量の約１０倍以上、ヒドロゲル重量の約５０倍以上、またはヒドロゲル重量の約１００倍以上の水を吸収することができる。「ヒドロゲル形成剤」という用語は、本明細書では「ヒドロゲル前駆体」とも呼ばれ、本明細書に開示されるヒドロゲルを作製するために使用することができる任意の化合物を指すことができる。

ある特定の実施形態では、「弾性」、「粘弾性」、「応力緩和度」、「応力緩和」、および／または「緩和」という用語は、本明細書に開示される組成物および／または組成物の特徴もしくは状態を説明するために交換可能に使用することができる。

ある特定の実施形態では、「第１のポリマーネットワーク」は、「第１のポリマー主鎖」と呼ぶことができる。ある特定の実施形態では、「第２のポリマーネットワーク」は、「第２のポリマー主鎖」と呼ぶことができる。ある特定の実施形態では、「ヒドロゲル」は「ハイブリッドネットワークヒドロゲル」と呼ぶことができ、その逆も同様である。

他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
（発明の詳細な説明）
以下のセクションでは、本発明の特定の実施形態を詳述するために、ある特定の例示的な組成物および方法について説明する。ある特定の実施形態を実施するのに、本明細書に概説した特定の詳細の全部あるいは一部を採用する必要はなく、濃度、時間、および他の特定の詳細は定型的実験を通じて改変することができることが当業者には明らかであろう。場合によっては、周知の方法、または構成成分が説明に含まれていないことがある。

本開示の実施形態は、本明細書に開示される健康状態の処置においてヒドロゲル（例えば、ハイブリッドネットワークヒドロゲル）を生成および使用するための新規組成物、方法、およびシステムに関する。一部の実施形態では、ヒドロゲルは、少なくとも１種または２種以上のヒドロゲル形成剤を使用して；１種または複数のタイプのヒドロゲル形成剤を水性媒体中で硬化または固化させて、三次元ネットワークを形成することによって形成することができる。ある特定の実施形態では、三次元ネットワークの形成により、１種または複数のタイプのヒドロゲル形成剤によって、本明細書に開示される組成物および方法で使用されるヒドロゲル複合体をゲル形成させることができる。

一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、少なくとも１種のポリマー材料を含むことができる。これらの実施形態によれば、ポリマー材料は、天然ポリマー材料、合成ポリマー材料、およびそれらの組み合わせであり得る。他の実施形態では、本明細書に開示される組成物、組み合わせ組成物および方法での使用に好適なポリマーは、ホモポリマーおよび／またはヘテロポリマーであり得る。これらの実施形態によれば、ポリマーは、限定されるものではないが、任意のコモノマー分布のクロスポリマーまたはコポリマーを含むことができ、直鎖状、分岐鎖状、超分岐鎖状、デンドリマー状、または任意の程度に架橋されたものであり得る。

ある特定の実施形態では、好適なポリマーとしては、ゼラチン、メチルセルロース、ヒドロキシメチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレンオキシド、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸の塩、ポリメタクリル酸の塩、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール、ポリ無水物、例としてポリ（メタクリル酸）無水物、ポリ（アクリル）無水物、ポリセバシン酸無水物（ｐｏｌｙｓｅｂａｓｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、コラーゲン、ポリ（ヒアルロン酸）、ヒアルロン酸含有ポリマーおよびコポリマー、ポリペプチド、デキストラン、硫酸デキストラン、キトサン、キチン、アガロースゲル、フィブリンゲル、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、本明細書に開示される組成物、組み合わせ組成物および方法での使用に好適なポリマーは、親水性ポリマーであり得る。ある特定の実施形態では、親水性ポリマーとしては、ポリ（エチレングリコール）、ポリオキサゾリン、ポリ脂肪族ポリウレタン、ポリエーテルポリウレタン、ポリエステルポリウレタン、ポリエチレンコポリマー、ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリ（エチレンオキシド）、ポリプロピレンオキシド、ポリプロピレングリコール、ポリテトラメチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリ（ヒドロキシエチルアクリレート）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、またはそれらの混合物もしくはコポリマー、が挙げられるが、これらに限定されない。

ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、上記で参照したポリマーに加えて、合成ポリマーポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含有することができる、またはさらに含有することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物、組み合わせ組成物および方法で使用するためのＰＥＧは、ＰＥＧコアデンドリマー、ＰＥＧブロックコポリマー、またはマルチアームＰＥＧであり得る。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物、組み合わせ組成物および方法で使用するためのマルチアームＰＥＧは、３アームＰＥＧ、４アームＰＥＧ、６アームＰＥＧ、または８アームＰＥＧであり得る。他の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、官能化マルチアームＰＥＧを含有することができる。一部の実施形態では、官能化マルチアームＰＥＧは、分子内に１つまたは複数のペンダント官能基を導入するために化学的に修飾されたマルチアームＰＥＧを含むことができる。他の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、ひずみシクロオクチンで官能化されたマルチアームＰＥＧを含有することができる。これらの実施形態によれば、ひずみシクロオクチンの非限定的な例としては、アザ－ジベンゾシクロオクチン（ＡＤＩＢＯ）、ビシクロノニン（ＢＣＮ）、ジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）、（ＯＣＴ）、アリールレスオクチン（ＡＬＯ）、モノフッ素化シクロオクチン（ＭＯＦＯ）、ジフッ素化シクロオクチン（ＤＩＦＯ）、ビアリールアザシクロオクチノン（ＢＡＲＡＣ）、またはジメトキシアザシクロオクチン（ＤＩＭＡＣ）部分、が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、ビシクロノニン（（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチル（ＢＣＮ））で官能化されたマルチアームＰＥＧを含有することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲル組成物または組み合わせ組成物は、ビシクロノニンで官能化された８アームＰＥＧを含むことができる。

ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、ヒアルロン酸（ＨＡ）を含有することができる。ＨＡは、多くの軟結合組織の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内の非硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）であり、Ｄ－グルクロン酸とＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンの交互単位で構成され、分子量（ＭＷ）が最大約６ＭＤａであり、交互のβ－１，４およびβ－１，３グリコシド結合を介して連結されている。一部の実施形態では、ＨＡは、限定されるものではないが脊椎動物の結合組織を含む天然組織、ヒト臍帯および鶏のとさかから抽出することができる。他の実施形態では、ＨＡは、例えば、感染性病原体を対象に移す潜在的なリスクを最小限に抑え、製品の均一性、品質、および／または入手可能性を増大させるために、微生物学的方法によって調製することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、官能化ＨＡを含有することができる。官能化ＨＡには、化学的に修飾された官能化ＨＡを含めることができる。ある特定の実施形態では、官能化ＨＡは、分子内に１つまたは複数のペンダント官能基を導入するために化学的に修飾された官能化ＨＡを含むことができる。さらに他の実施形態では、本明細書に開示される官能化ＨＡは、ＨＡ主鎖上に官能化された少なくとも１つのアルデヒド基を有することができる。他の実施形態では、本明細書に開示される官能化ＨＡは、ＨＡ主鎖上に官能化された少なくとも１つのヒドラジド基を有することができる。他の実施形態では、本明細書に開示される官能化ＨＡは、ＨＡ主鎖上に２種以上の薬剤群を有することができる。

一部の実施形態では、本明細書に開示されるＨＡ主鎖、ＰＥＧマクロマー、またはそれらの組み合わせは、少なくとも１種のペプチドでさらに修飾することができる。これらの実施形態によれば、ペプチドは、約２アミノ酸～約５０アミノ酸；約２アミノ酸～約４０アミノ酸、または約２アミノ酸～約３０アミノ酸、または１０アミノ酸未満のペプチド長を含むことができる。他の実施形態では、ＨＡ主鎖、ＰＥＧマクロマー、またはそれらの組み合わせを修飾して、細胞接着ペプチドをさらに含むことができる。本明細書で使用される場合、「細胞接着ペプチド」は、受容体－リガンド相互作用を介して細胞が結合する接着タンパク質から得られるアミノ酸配列を指すことができる。これらの実施形態によれば、溶液中の細胞接着ペプチドおよびその濃度を変化させることにより、得られるヒドロゲル組成物への細胞付着の安定性を制御する可能性を考慮に入れることができる。一部の実施形態では、細胞接着ペプチドは、約１μＭ～約１０ｍＭの最終ヒドロゲル濃度を有することができる。一部の実施形態では、細胞接着ペプチドは、約１μＭ、または約５０μＭ、または約１００μＭ、または約５００μＭ、または約１ｍＭ、または約２ｍＭ、または約５ｍＭ、または最大約１０ｍＭ、または本明細書に開示される範囲内の任意の濃度の最終ヒドロゲル濃度を有することができる。

一部の実施形態では、「細胞接着ペプチド」は、インテグリン結合のためのペプチドリガンドを含むことができる。インテグリン結合に好適なペプチドリガンドとしては、例えば、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ（配列番号１）、ＣＲＧＤＳ（配列番号２）、ＣＲＧＤＳＰ（配列番号３）、ＰＨＳＲＮ（配列番号４）、ＧＷＧＧＲＧＤＳＰ（配列番号５）、ＲＧＤＳＰＧＥＲＣＧ（配列番号６）、ＫＲＧＤＳ（配列番号８）、が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書で使用されるインテグリン結合のためのペプチドリガンドは、ベンズアルデヒド官能化ＲＧＤペプチドであり得る。一部の実施形態では、本明細書で使用するために開示されるインテグリン結合のためのペプチドリガンドは、ベンズアルデヒド－ＫＧＲＧＤＳ（配列番号７）であり得る。一部の実施形態では、インテグリン結合のためのペプチドリガンドは、約１μＭ～約１０ｍＭ、または約５００μＭ～約５ｍＭ、または約１ｍＭ～約２ｍＭの最終ヒドロゲル濃度を有することができる。

一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、ハイブリッドネットワークヒドロゲルを含むことができる。これらの実施形態によれば、ハイブリッドネットワークヒドロゲルは、例えば、単一のヒドロゲル複合体を形成する２つのポリマー主鎖から形成されたヒドロゲルを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、少なくとも２つのポリマー主鎖を含むことができる。これらの実施形態によれば、２つのポリマー主鎖は、各ポリマー主鎖が固有のポリマー構成成分、特性、特徴を有し、および／または反対の機械的特性を有するヒドロゲルを含むことができるが、これに限定されない。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、剛直で脆弱なネットワークをもたらすポリマー主鎖、または柔軟で延性のあるネットワークをもたらすポリマー主鎖を含有することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される２つのポリマー主鎖は、本明細書に開示される組み合わせポリマー含有ヒドロゲルを生成するために使用するために、本明細書に記載される化合物およびポリマーのいずれかを使用することができる。

一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物、組み合わせ組成物および使用のポリマー主鎖は、少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖を含むことができる。これらの実施形態によれば、ポリマー主鎖は、少なくとも１つの官能化ヒアルロン酸（ＨＡ）主鎖を含むことができるが、これに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるポリマー主鎖は、ＨＡ主鎖上で官能化されたヒドラジド基を含むことができるが、これに限定されない。一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリマー主鎖は、ＨＡ主鎖上で官能化されたアルデヒド基を含むことができるが、これに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるポリマー主鎖は、アルデヒド基を有する少なくとも１つの官能化ＨＡ主鎖およびヒドラジド基を有する少なくとも１つの官能化ＨＡ主鎖を含むことができるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるポリマー主鎖は、ヒドラジド基とアルデヒド基との間に少なくとも１つのヒドラゾン結合が形成される、アルデヒド基を有する官能化ＨＡ主鎖とヒドラジド基を有する官能化ＨＡ主鎖との組み合わせを含むことができるが、これに限定されない。一部の実施形態では、ポリマー主鎖は、粘弾性ＨＡゲルを形成する官能化ＨＡ主鎖のヒドラジド基とアルデヒド基との間のヒドラゾン結合を含むことができるが、これに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書で言及される「粘弾性」は、変形を受けるときに粘性性質と弾性性質の両方を示す材料の特性を指すことができる。一部の実施形態では、官能化ＨＡ主鎖のヒドラジド基とアルデヒド基との間にヒドラゾン結合を有する本明細書に開示されるポリマー主鎖は、柔軟で延性のあるネットワークをもたらすポリマー主鎖であり得る。

一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および使用方法におけるポリマー主鎖は、少なくとも１つの８アームＰＥＧを含むことができるが、これに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物および使用方法におけるポリマー主鎖は、少なくとも１つの官能化８アームＰＥＧを含むことができるが、これに限定されない。他の実施形態では、本明細書に開示される組成物および使用方法におけるポリマー主鎖は、ビシクロノニンで官能化された少なくとも１つの８アームＰＥＧ（ＰＥＧ－ＢＣＮ）を含むことができるが、これに限定されない。他の実施形態では、本明細書に開示される組成物および使用方法における本明細書のポリマー主鎖は、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドを含むことができるが、これに限定されない。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および使用方法におけるポリマー主鎖は、ＢＣＮとベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドのアジド基との間に形成された少なくとも１つの結合を有する、ビシクロノニン（ＢＣＮ）で官能化された８アームＰＥＧと、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドとの組み合わせを含むことができるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物および使用方法におけるポリマー主鎖としては、ＢＣＮとベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドのアジド基との間に形成された結合を有し、剛直で脆弱なネットワーを有するポリマー主鎖を生じるポリマー主鎖が挙げられるが、これに限定されない。

ある特定の実施形態では、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドを最初にＨＡ－ヒドラジドにコンジュゲートさせることができる。これらの実施形態によれば、ＨＡ－アルデヒドとＨＡ－ヒドラジド（ここでベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドを含有する）を組み合わせることができる。一部の実施形態では、次に、ＰＥＧ－ＢＣＮを、ＨＡ－アルデヒドとＨＡ－ヒドラジドとの組み合わせに加えることができ、ここで、ＨＡ－ヒドラジドは、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドを含有する。

一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、少なくとも２つのポリマー主鎖を含有することができる。これらの実施形態によれば、本明細書に開示されるヒドロゲルは、少なくとも２つのポリマー主鎖、官能化ＨＡ主鎖のヒドラジド基とアルデヒド基との間にヒドラゾン結合を有するポリマー主鎖；およびＰＥＧ－ＢＣＮとベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドのアジド基との間に形成された結合を有するポリマー主鎖を含有することができる。ある特定の実施形態では、これらの参照された組み合わせポリマー主鎖を有する本明細書に開示されるヒドロゲルによって、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドがＨＡ主鎖上でヒドラジドと反応する場合に、ヒドラジドとベンズアルデヒドとの間にほぼ、または本質的に不可逆的な結合の形成が生じ得る。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、少なくとも２つのポリマー主鎖（例えば、官能化ＨＡ主鎖のヒドラジド基とアルデヒド基との間にヒドラゾン結合を有する本明細書のポリマー主鎖、およびＰＥＧ－ＢＣＮとベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドのアジド基との間に形成された結合を有する本明細書に記載のポリマー主鎖）を使用して形成することができ、ここで、ゲルの形成にはゲルの安定化のための外部刺激は必要ではない。一部の実施形態では、開示された２つのポリマー主鎖を有するヒドロゲルは、約２～約１０分でゲル化するかまたはゲルを形成することができる。これらの実施形態によれば、開示された２つのポリマー主鎖を有するヒドロゲルは、約２分以下、約３分以下、約４分以下、約５分以下、約６分以下、約７分以下、約８分以下、約９分以下、または約１０分以下、または最長約３０分以下で、ゲル化するか、またはゲルを形成することができる。

ある特定の実施形態では、本明細書に開示される２つのポリマー主鎖を有する本明細書に開示される任意のヒドロゲルまたはヒドロゲルの組み合わせは、約１０日間以上、約１５日間以上、約１か月間以上、約２か月間以上、約３か月間以上、約４か月間以上、約５か月間以上、または約６か月間安定であり得る。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される２つのポリマー主鎖を有する本明細書に開示される任意のヒドロゲルまたはヒドロゲルの組み合わせは、約１５日間～約６か月間以上安定であり得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される２つのポリマー主鎖を有するヒドロゲルは、時間の経過とともに分解する可能性がある。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される２つのポリマー主鎖を有するヒドロゲルは、約１５日～約６か月にわたって分解する可能性がある。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される２つのポリマー主鎖を有するヒドロゲルは、約１０日以上、約１５日以上、約１か月以上、約２か月以上、約３か月以上、約４か月以上、約５か月以上、または約６か月にわたって分解する可能性がある。

一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、異なる比率で少なくとも２つのポリマー主鎖を含有することができる。これらの実施形態によれば、本明細書に開示されるヒドロゲルは、約１：２、または約１：３、または約１：４、または他の所定の比率の異なる比率で少なくとも２つのポリマー主鎖を含有することができる。他の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、少なくとも２つのポリマー主鎖を含有することができ、約３００～約５００Ｐａ；約３５０～約５００Ｐａ；約３５０～約４７５Ｐａ；または約３５０～約４５０Ｐａの剪断貯蔵弾性率を有することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、少なくとも２つのポリマー主鎖を含有することができ、約４００Ｐａの剪断貯蔵弾性率を有することができる。

他の実施形態では、本明細書に開示されるポリマー主鎖は、剛直で脆弱なネットワークを生成することができる一方、本明細書に開示される別のポリマー主鎖は、柔軟で延性のあるネットワークを生成することができ、２つのポリマー主鎖の比率は、所望の剛性、柔らかいまたは柔軟なネットワークのためのゲルの特性に影響を与える場合がある。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、２つのポリマー主鎖を、本明細書で選択され開示されるポリマーの約１：１の比、約１：２の比、約１：３の比、約１：４の比、または約１：５の比で含有することができる。

一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、２つのポリマー主鎖を含むことができ、ここで、１つのポリマー主鎖は、ヒドロゲル内の総架橋濃度の約１％～約９９％または約１％～約５０％で存在し得る、官能化ＨＡ主鎖のヒドラジド基とアルデヒド基との間の粘弾性ヒドラゾン結合を含む。他の実施形態では、他のポリマー主鎖または第２のポリマー主鎖は、総架橋濃度の約１％～約９９％、または約１％～約５０％で存在することができる、ＢＣＮとＰＥＧ－ＢＣＮおよびベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドのアジド基との間に形成された弾性結合を含有することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、２つのポリマー主鎖を有することができ、ここで、１つのポリマー主鎖は、総架橋濃度の約１０％～約２５％で存在することができる、官能化ＨＡ主鎖のヒドラジド基とアルデヒド基との間の粘弾性ヒドラゾン結合を含有する。一部の実施形態では、本明細書の他のポリマー主鎖または第２のポリマー主鎖は、総架橋濃度の約７５％～約９０％で存在することができる、ＢＣＮとＰＥＧ－ＢＣＮおよびベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドのアジド基との間に形成された弾性結合を含有することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、２つのポリマー主鎖を有することができ、ここで、１つのポリマー主鎖は、総架橋濃度の約２５％で存在することができる、官能化ＨＡ主鎖のヒドラジド基とアルデヒド基との間の粘弾性ヒドラゾン結合を含有する。一部の実施形態では、本明細書で開示される他のポリマー主鎖または第２のポリマー主鎖は、総架橋濃度の約７５％で存在することができる、ＢＣＮとＰＥＧ－ＢＣＮおよびベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドのアジド基との間に形成された弾性結合を含有することができる。

ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、少なくとも５％のアルキルヒドラゾン結合を含有することができ、官能化ＨＡヒドラジドアームの少なくとも約９５％をベンズアルデヒド－ＰＥＧ－アジドで官能化することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、約５％～約１００％のアルキルヒドラゾン結合を含有することができ、官能化ＨＡ－ヒドラジドアームの約９５％～約０％をベンズアルデヒド－ＰＥＧ－アジドで官能化することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、約５％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または１００％のアルキルヒドラゾン結合を含有することができる。これらの実施形態によれば、本明細書に開示されるヒドロゲルは、官能化ＨＡ－ヒドラジドアームを含有することができ、官能化ＨＡ－ヒドラジドアームの１００％、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または０％を、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ－アジドで官能化することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、１００％、約８８％、約７５％、約５０％、約２５％、約１５％、約５％、または０％のアルキルヒドラゾン結合を含有することができる。

ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドの濃度が増加すると、用量依存的にヒドロゲルの応力緩和が増大し得る、２つのポリマー主鎖を含むことができる。他の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドの濃度が増加すると、用量依存的にゲルの応力緩和が低減し得る、２つのポリマー主鎖を有することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドの濃度が増加すると、用量依存的にゲルの応力緩和の時定数が増大し得る、２つのポリマー主鎖を有することができる。他の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドの濃度が増加すると、ヒドロゲル形成が起こるまでの時間を延長することができる、２つのポリマー主鎖を含むことができる。

他の実施形態では、本明細書に開示される２つのポリマー主鎖から生成されるヒドロゲルは、約０．５～約２０００Ｐａのヤング率を含むことができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される２つのポリマー主鎖から生成されるヒドロゲルは、約０．５Ｐａ～約２０００Ｐａ、または約０．５Ｐａ、約１０Ｐａ、約５０Ｐａ、約１００Ｐａ、約２００Ｐａ、約３００Ｐａ、約４００Ｐａ、約５００Ｐａ、約６００Ｐａ、約７００Ｐａ、約８００Ｐａ、約９００Ｐａ、約１０００Ｐａ、約１２５０Ｐａ、約１５００Ｐａ、約１７５０Ｐａ、または約２０００Ｐａのヤング率を含むことができる。

一部の実施形態では、本明細書に記載のヒドロゲルは多孔質であり得る。他の実施形態では、細孔はヒドロゲル全体に均質に分散させることができる。一部の実施形態では、細孔はヒドロゲル全体に不均質に分散させることができる。さらに他の実施形態では、本明細書に記載のヒドロゲルは、ミクロンサイズの細孔を含むことができる。これらの実施形態によれば、本明細書に記載されるヒドロゲルは、約０．１μｍ～約９００μｍ、約１μｍ～約５００μｍ、または約１０μｍ～約２５０μｍ、または約１００μｍ～約２００μｍのおよその直径を有する細孔を含むことができる。

ある特定の実施形態では、限定されるものではないが、本明細書に開示される複合ヒドロゲルまたは組み合わせヒドロゲルを含むヒドロゲルを医薬組成物に製剤化することができる。これらの実施形態によれば、本明細書に開示される１種または複数のヒドロゲルまたはヒドロゲル複合体を含有する医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤をさらに含むことができる。本発明の方法で使用される医薬組成物のいずれも、凍結乾燥製剤または水溶液の形態の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含むことができる。

医薬組成物中の担体は、組成物の活性成分と適合し、好ましくは活性成分を安定化することができ、処置される対象に有害ではないという意味で「許容される」ものでなければならない。例えば、「薬学的に許容される」とは、生理学的に許容可能であり、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与された場合に通常好ましくない反応を生じないものを含む、組成物の分子実体および他の構成成分を指すことができる。いくつかの例では、本明細書に開示される医薬組成物で使用される「薬学的に許容される」担体は、哺乳動物、より具体的にはヒトにおいて使用するために、連邦または州政府の規制機関によって承認されているか、または米国薬局方または一般に認められている他の薬局方に列挙されているものであり得ることを意味する。

緩衝液を含む薬学的に許容される担体は当技術分野で周知であり、リン酸塩、クエン酸塩、およびその他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質；アミノ酸；疎水性ポリマー；単糖；二糖；および他の炭水化物；金属錯体；および／または非イオン性界面活性剤、を含むことができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０^ｔｈＥｄ．（２０００）リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ社）編Ｋ．Ｅ．フーバー（Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ）を参照のこと。

一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物または製剤は、静脈内、関節内注射、脳室内注射、大槽内注射、実質内注射、またはそれらの組み合わせなどの非経口投与用であり得る。そのような薬学的に許容される担体は、減菌液体、例として、水、および石油、動物、植物または合成油由来のものを含む油、例として、ピーナッツ油、大豆油、鉱油など、であり得る。生理食塩水ならびにデキストロース水溶液、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびグリセロール溶液も、特に注射液のために、液体担体として使用することができる。本明細書に開示される医薬組成物は、追加の構成成分、例えば、防腐剤、緩衝液、等張剤、抗酸化剤および安定剤、非イオン性湿潤または清澄剤、増粘剤をさらに含むことができる。本明細書に開示される医薬組成物は、単一の単位投薬量または複数投薬量形態でパッケージングすることができる。

本明細書に開示される非経口投与に好適な製剤としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤および製剤を意図したレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る水性および非水性の滅菌注射溶液；ならびに懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁液を挙げることができる。水溶液は、好適に緩衝化することができる（好ましくは、ｐＨ３～９に）。減菌条件下での好適な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準製薬技術によって容易に達成される。

インビボ投与に使用される医薬組成物は、減菌でなければならない。これは、例えば滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。滅菌注射液は、一般に、必要に応じて、上記に列挙した他の種々の成分とともに適切な溶媒に、必要な量のヒドロゲルを組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製する。一般に、分散液は、減菌活性成分を、基礎的な分散媒体および上記に列挙されるものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製する。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥およびフリーズドライ技術であり、これにより、活性成分と任意の追加的な所望の成分を添加した粉末が、その事前に滅菌濾過された溶液から得られる。

ある特定の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、希釈剤およびアジュバントなどの他の成分も含むことができる。許容される担体、希釈剤、およびアジュバントは、使用される用量および濃度ではレシピエントに対して無毒であり、好ましくは不活性であり、許容される担体、希釈剤、およびアジュバントとしては、緩衝液、例としてリン酸塩、クエン酸塩、またはその他の有機酸塩；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；アミノ酸、例としてグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン；単糖、二糖、および他の炭水化物、例としてグルコース、マンノース、またはデキストリン；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／または非イオン性界面活性剤、例としてＴｗｅｅｎ（登録商標）、プルロニック（登録商標）またはポリエチレングリコール、が挙げられる。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物（例えば、ヒドロゲルおよびハイブリッドネットワークヒドロゲル）のいずれかは、小分子、タンパク質ベース、抗体ベース、抗菌ベース、および細胞ベースの治療薬の足場材料または送達ビヒクルとして使用することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のヒドロゲルは幹細胞を含むことができる。本明細書での使用に好適な幹細胞の非限定的な例としては、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、皮膚幹細胞、および間葉系幹細胞または間葉系間質細胞を挙げることができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のヒドロゲルは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含むことができる。他の実施形態では、本明細書に記載のヒドロゲルは、脂肪組織幹細胞、軟骨細胞組織幹細胞、骨細胞組織幹細胞、またはそれらの組み合わせを含むことができる。本明細書での使用に好適な幹細胞は、当技術分野で知られている任意の供給源から得ることができる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、限定されないが、臍帯静脈からの内皮組織、包皮からの内皮組織、子宮内膜組織、ヒト胚性幹細胞、歯、皮膚および脂肪組織、または他の組織を含む、胚組織または成体組織から得ることができる。多能性細胞はまた、多能性を誘導することによって人工的に生成することができる。

ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、細胞が集中したポケットを伴って、または所望のように、均質または不均質にヒドロゲル全体に分散した幹細胞を含むことができる。他の実施形態では、幹細胞は、本明細書に記載のヒドロゲルによって封入することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のヒドロゲルは、約１０万幹細胞／ｍＬ～約４０００万幹細胞／ｍＬ、約５０万幹細胞／ｍＬ～約３０００万幹細胞／ｍＬ、約１００万幹細胞／ｍＬ～約２０００万幹細胞／ｍＬ、約１５０万幹細胞／ｍＬ～約１０００万幹細胞／ｍＬ、または約２００万幹細胞／ｍＬ～約２００万幹細胞／ｍＬを含むことができる。

一部の実施形態では、２つのポリマー主鎖の比率は、限定されるものではないが、移動、広がり、増殖、および分化を含む、１つまたは複数の細胞機能に影響を与えるように調節することができる、本明細書に開示されるヒドロゲルを含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの幹細胞を有する本明細書に開示されるヒドロゲルは、２つのポリマー主鎖を有することができ、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドの濃度の減少により、用量依存的に幹細胞広がりを増大させることができる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの幹細胞を収容する、または有する本明細書に開示されるヒドロゲルは、２つ以上のポリマー主鎖を含むことができ、２つ以上のポリマー主鎖の比率は、少なくとも１つの幹細胞の遊走を誘導または刺激して少なくとも１つの多核構造を形成するように調節または調整することができる。

ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、それを必要とする対象に送達するための追加の成分を含むことができる。これらの実施形態によれば、本明細書に開示されるヒドロゲルは、細胞をさらに含むことができる。これらの実施形態によれば、本明細書に開示されるヒドロゲルは、処置される対象と同じまたは異なる起源の細胞をさらに含むことができる。他の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、処置される、関連するまたは無関係の対象に由来する細胞をさらに含むことができる。他の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、細胞外マトリックスを沈着させる細胞をさらに含むことができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、新生タンパク質沈着を有する細胞を含むことができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、細胞の広がり、増殖、および／または生存に寄与し得る新生タンパク質沈着を有する細胞を含むことができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルはエキソソームを含むことができる。

ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、例えば、健康状態を処置するために対象に送達するために、１つまたは複数の健康状態に使用される幹細胞を含むことができる。これらの実施形態によれば、本明細書で使用する幹細胞としては、造血幹細胞（ＨＳＣ）、間葉幹細胞（ＭＳＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、またはそれらの任意の組み合わせとを挙げることができる。一部の実施形態では、本明細書で使用する幹細胞は、骨髄から単離することができる。一部の実施形態では、本明細書で使用する幹細胞は、末梢血から単離することができる。一部の実施形態では、本明細書で使用する幹細胞は、臍帯血から単離することができる。一部の実施形態では、本明細書で使用する幹細胞は、羊膜組織から単離することができる。一部の実施形態では、本明細書で使用する幹細胞は、末梢血から単離することができる。一部の実施形態では、本明細書で使用する幹細胞は、脂肪組織から単離することができる。一部の実施形態では、本明細書で使用する幹細胞は、自己由来末梢血、臍帯血、羊膜組織、脂肪組織、歯、および／または骨髄から単離することができる。本明細書で使用される場合、「自己由来」という用語は、本明細書に開示されるヒドロゲルで処置される同じ対象から得られる末梢血、臍帯血、羊膜組織、脂肪組織、および／または骨髄を指す。一部の他の実施形態では、本明細書で使用する幹細胞は、同種異系末梢血、臍帯血、羊膜組織、脂肪組織、および／または骨髄から単離することができる。本明細書で使用される場合、「同種異系」という用語は、本明細書に開示されるヒドロゲルで処置される対象と同じ種の異なる対象から得られる末梢血、臍帯血、羊膜組織、脂肪組織、および／または骨髄を指す。

一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、細胞のタンパク質分泌に寄与し得る新生タンパク質沈着を有する細胞を含むことができる。これらの実施形態によれば、封入された細胞を有する本明細書に開示されるヒドロゲルは、約０．５μｍ～約５．０μｍのタンパク質を分泌することができる。一部の実施形態では、内部に封入された細胞を有する本明細書に開示されるヒドロゲルは、約０．５μｍ～約５．０μｍ、または０．５μｍ、約１．０μｍ、約１．５μｍ、約２．０μｍ、約２．５μｍ、約３．０μｍ、約３．５μｍ、約４．０μｍ、約４．５μｍ、または約５．０μｍのタンパク質を分泌することができる。ある特定の実施形態では、タンパク質は、フィブロネクチンまたは他のＥＣＭ関連タンパク質を含むことができる。

ある特定の実施形態では、内部に細胞が封入された本明細書に開示されるヒドロゲルは、約０．５μｍ～約５．０μｍのタンパク質厚さを含むことができる。一部の実施形態では、内部に封入された細胞を有する本明細書に開示されるヒドロゲルは、約０．５μｍ、約１．０μｍ、約１．５μｍ、約２．０μｍ、約２．５μｍ、約３．０μｍ、約３．５μｍ、約４．０μｍ、約４．５μｍ、または約５．０μｍのタンパク質厚さを有することができる。

ある特定の実施形態では、内部に細胞が封入された本明細書に開示されるヒドロゲルは、細胞内にタンパク質の不均質な分布を含むことができる。一部の実施形態では、内部に細胞が封入された本明細書に開示されるヒドロゲルは、細胞の１つまたは複数の広がりアームに局在するタンパク質を含むことができる。一部の実施形態では、内部に細胞が封入された本明細書に開示されるヒドロゲルは、２つの細胞がクラスター化する接合部に局在するタンパク質を有することができる。

ある特定の実施形態では、内部に細胞が封入された本明細書に開示されるヒドロゲルは、例えば、封入された細胞を取り囲んでいる、タンパク質を沈着させることができる。これらの実施形態によれば、本明細書に開示されるヒドロゲルに封入された細胞を取り囲んでいる沈着タンパク質の平均面積は、約０．５μｍ^２～約１５０μｍ^２であり得る。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルに封入された細胞を取り囲む沈着タンパク質の平均面積は、約０．５μｍ^２、約１．０μｍ^２、約２．５μｍ^２、約５．０μｍ^２、約７．５μｍ^２、約１０μｍ^２、約１２．５μｍ^２、約１５．０μｍ^２、約１７．５μｍ^２、約２０μｍ^２、約２５μｍ^２、約３０μｍ^２、約３５μｍ^２、約４０μｍ^２、約４５μｍ^２、約５０μｍ^２、約５５μｍ^２、約６０μｍ^２、約６５μｍ^２、約７０μｍ^２、約７５μｍ^２、約８０μｍ^２、約８５μｍ^２、約９０μｍ^２、約９５μｍ^２、約１００μｍ^２、約１１０μｍ^２、約１２０μｍ^２、約１３０μｍ^２、約１４０μｍ^２、または約１５０μｍ^２であり得る。

一部の実施形態では、２つのポリマー主鎖のヒドロゲルは、少なくとも１つの幹細胞（例えば、間葉系幹細胞）を有するヒドロゲルをさらに含むことができる。これらの実施形態によれば、少なくとも１つの幹細胞を有するヒドロゲルをさらに含む２つのポリマー主鎖のヒドロゲルは、幹細胞の分泌プロファイルに影響を与えるように調節することができ、例えば、幹細胞によって放出されるサイトカインまたは他の薬剤の送達を調節することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される少なくとも１つの幹細胞を有するヒドロゲルの応力緩和を低減させることにより、幹細胞からのサイトカインの分泌を上方制御することができる。これらの実施形態によれば、本明細書に開示される少なくとも１つの幹細胞を有するヒドロゲルの応力緩和を低減させることによって調節されるサイトカインとしては、アクチビンＡ、アグリン、ＣＩＮＣ（サイトカイン誘導性好中球化学誘引物質）－１、ＭＣＰ－１（単球化学誘引物質タンパク質－１）、ＴＩＭＰ－１（組織阻害剤マトリックスメタロプロテイナーゼ１）、ＶＥＧＦ－Ａ（血管内皮増殖因子Ａ）、ＣＤ８６（分化クラスター８６）、β－ＮＧＦ（神経成長因子）、ＣＩＮＣ－２、ＣＩＮＣ－３、ＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）、ＴＮＦＳｆ６（腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー、メンバー６）、ＣＸ３ＣＬ１（Ｃ－Ｘ３－Ｃモチーフケモカインリガンド１）、ＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、ＩＣＡＭ－１（細胞間接着分子１）、ＩＮＦ（インターフェロン）－γ、ＩＬ（インターロイキン）－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１Ｒ６、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、レプチン、ＬＩＸ（ＬＰＳ誘導性ＣＸＣケモカイン）、Ｌ－セレクチン、ＭＩＰ－３α（マクロファージ炎症性タンパク質３α）、ＭＭＰ－８（マトリックスメタロプロテイナーゼ８）、ＰＤＧＦ－ＡＡ（血小板由来成長因子ＡＡ）、プロラクチンＲ、ＲＡＧＥ（終末糖化産物受容体（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ））、ＴＣＫ－１（胸腺ケモカイン－１）およびＴＮＦ（腫瘍壊死因子）－α、を挙げることができるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、少なくとも１つの幹細胞を有する本明細書に開示されるヒドロゲルは、２つのポリマー主鎖を含むことができ、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドの濃度を減少させると、その中に埋め込まれた幹細胞から用量依存的な様式で少なくとも１種の抗炎症性サイトカインの分泌を増加させることができる。他の実施形態では、少なくとも１つの幹細胞を有する本明細書に開示されるヒドロゲルは、２つのポリマー主鎖を有することができ、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドの濃度の減少により、その中に埋め込まれた幹細胞から用量依存的な様式でＩＬ－１０、ＩＬ－６、またはそれらの組み合わせを増加させることができる。一部の実施形態では、少なくとも１つの幹細胞を有する本明細書に開示されるヒドロゲルは、２つのポリマー主鎖を含むことができ、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドの濃度を増加させると、その中に埋め込まれた幹細胞から用量依存的な様式で少なくとも１種の炎症誘発性サイトカインの分泌を増加させることができる。一部の実施形態では、少なくとも１種の幹細胞を有する本明細書に開示されるヒドロゲルは、２つのポリマー主鎖を含むことができ、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドの濃度を増加させると、その中に埋め込まれた幹細胞から用量依存的な様式でＴＮＦ－αを増加させることができる。

一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物、組み合わせ組成物および方法において使用されるヒドロゲルは、少なくとも１種の活性薬剤をさらに含むことができる。一部の実施形態では、活性薬剤としては、生物学的活性を提供すること、または別様に疾患の診断、治療、緩和、処置、進行軽減、または予防に直接的な効果をもたらすこと、または対象の生理学的機能の回復、修正もしくは改変に直接的な効果をもたらすことを目的としている、あらゆる物質または物質の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される使用のための活性薬剤は、小分子、ペプチド、ポリヌクレオチド、遺伝子改変細胞、または抗体、抗体断片、またはそれらの組み合わせであり得る。他の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、活性薬剤を含むことができ、または注射時、注射直後に、局所的な投与領域に、状態を処置するために対象の標的領域に、注射後のヒドロゲルの分解期間中一定の速度で、注射後にヒドロゲルが完全に分解した直後、またはそれらの組み合わせで、活性薬剤を放出することができる。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物（例えば、ヒドロゲル）のいずれかは、健康状態を処置する、発症軽減する、進行軽減する、もしくは予防するために、または健康状態の処置と予防の両方のために、あるいは対象における待機的手術もしくは処置のために使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、限定されるものではないが、炎症性の状態または疾患、自己免疫の状態または疾患、血管の状態または疾患、整形外科的状態、がん、脊椎または脳の損傷（外傷性脳損傷）、組織または器官の修復または再生に使用されるもの、美容外科、インプラント、もしく形成外科、またはその他の該当する状態、またはそれらの組み合わせを含む、状態を処置する、発症軽減する、進行軽減する、または予防することができる。

ある特定の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象において、１つまたは複数の症状を緩和するための方法、および／または炎症性疾患を処置するための方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、少なくとも１つの幹細胞を有する本明細書に記載のヒドロゲルを、それを必要とする対象に投与することによって、炎症性疾患、障害、または状態を処置する方法を提供する。ある特定の実施形態では、ヒドロゲルは、１種または複数の追加の活性薬剤をさらに有することができる。このような追加の活性薬剤は、小分子または生物製剤であり得、例えば、アセトアミノフェン、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）、例としてアスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、エトドラク、およびセレコキシブ、コルヒチン、コルチコステロイド、例としてプレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾンなど、プロベネシド、アロプリノール、フェブキソスタット、およびスルファサラジンを含むことができる。他の例としては、タネズマブなどのモノクローナル抗体、ヘパリンおよびワルファリンなどの抗凝固薬、ジサイクロミンなどの抗コリン作用薬または鎮痙薬、アルブテロールおよびレバルブテロールなどのβ－２アゴニスト、臭化イプラトロピウムおよびチオトロピウムなどの抗コリン剤を挙げることができる。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物（例えば、ヒドロゲル）のいずれも、関節痛または組織損傷を軽減および／または処置するために使用することができる。ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される処置ヒドロゲルを必要とする対象における、１つまたは複数の症状を緩和するための方法、および／または関節痛もしくは組織損傷を処置するための方法、ならびにそのようなものを含む医薬組成物を提供する。他の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルは、皮膚、骨、筋肉、または他の組織などの対象の構造成分を修復するために使用することができる。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物（例えば、ヒドロゲル）のいずれかを、他の用途の中でも、動静脈瘻および形成異常、例えば、動脈瘤、例として神経血管および大動脈瘤、肺動脈偽動脈瘤、脳内動静脈瘻、海綿静脈洞部硬膜動静脈瘻および動脈門脈瘻、慢性静脈不全、精索静脈瘤、骨盤うっ血症候群、胃腸出血、腎出血、尿出血、静脈瘤性出血、子宮出血、鼻からの重度の出血（鼻血）、ならびに術前塞栓術（外科手術中の出血量を低減するため）、および伏在バイパス移植術における伏在静脈側枝の閉塞、を含む他の種々の疾患、症状および障害を処置するために使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のヒドロゲルは、がんを処置するために使用することができる。他の実施形態では、本明細書に記載のヒドロゲルは、固形腫瘍を有するがんを処置するために使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のヒドロゲルは、腫瘍への血液供給の遮断または本明細書に開示のヒドロゲルによって運ばれる細胞の産物による送達によって固形腫瘍を処置するために使用することができる。

ある特定の実施形態では、組成物（例えば、ヒドロゲル）のいずれかは、注射用組成物であり得、本明細書のヒドロゲルは、局所薬物送達によって処置可能な任意の数の疾患、障害、および症状を処置するために、１種または複数の治療剤（例えば、活性薬剤）を局所的に送達するために使用することができる。

一部の実施形態では、本明細書に開示される方法を実行するために、治療有効量のヒドロゲルまたはそれを含む医薬組成物を、処置を必要とする対象に、好適な経路（例えば、実質注射、関節内注射）を介して、本明細書に開示される好適な量で投与することができる。一部の実施形態では、ヒドロゲルまたはそれを含む医薬組成物は、注射器、カテーテル、トロカール、カニューレなどを介した注射によって対象に投与することができる。

一部の実施形態では、本明細書に開示される方法を実行するために、治療有効量のヒドロゲルまたはそれを含む医薬組成物を、炎症性疾患の少なくとも１つの部位に投与することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法を実行するために、治療有効量のヒドロゲルまたはそれを含む医薬組成物を、関節痛の少なくとも１つの部位に投与することができる。

他の実施形態では、本明細書に開示されるヒドロゲルを生成、輸送、保存、および使用するためのキットを提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載される治療使用のためのキットは、医薬組成物中に製剤化された、本明細書に記載されるように本明細書に企図される組成物（例えば、ヒドロゲル）またはヒドロゲルを作製するための薬剤をさらに含む１つまたは複数の容器を含むことができる。

一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載される方法のいずれかにおいてヒドロゲルを作製、保存、または使用するための説明書をさらに含むことができる。説明書は、対象において目的の活性を達成するための、ヒドロゲルまたはそれを含む医薬組成物の対象への投与の説明を含むことができる。キットは、対象が処置を必要としているかどうかの識別に基づいて、処置に好適な対象を選択することの説明をさらに含むことができる。本明細書に記載のヒドロゲルの使用に関する説明書は、一般に、目的の処置のための投与量、投薬スケジュール、および投与経路に関する情報を含む。

一部の実施形態では、本明細書に記載のヒドロゲルのいずれかを生成するためのキットを提供する。他の実施形態では、キットは、本明細書に記載されるポリマー主鎖のうちの少なくとも２つを含むことができる。一部の実施形態では、キットは、２つのポリマー主鎖を組み合わせてヒドロゲルを形成する方法、ヒドロゲルの粘度を増加させる方法、ヒドロゲルの応力緩和を増大させる方法、またはそれらの組み合わせに関する説明書を含むことができる。

特定の実施形態では、容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、複数回用量パッケージ）、またはサブユニット用量であり得る。本開示のキットで提供される説明書は、典型的には、ラベルまたは添付文書に書かれた説明書である。ラベルまたは添付文書は、医薬組成物が対象における疾患または障害を処置する、発症を遅延させる、および／または疾患または障害を軽減するために使用されることを示す。

本明細書で提供されるキットは、好適なパッケージングに入っている。好適なパッケージングには、バイアル、ボトル、瓶、可撓性パッケージングなどが含まれるが、これらに限定されない。特定のデバイス、注入デバイスと組み合わせて使用するためのパッケージも企図される。キットは、滅菌アクセスポートを有することができる（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって突き刺すことができるストッパーを有するバイアルであり得る）。容器は滅菌アクセスポートを有することもできる。キットは、緩衝液および解釈のための情報などの追加的構成成分を任意選択で提供することができる。一部の実施形態では、キットは、容器と、容器上のまたは容器に付随するラベルまたは添付文書とを有することができる。一部の実施形態では、本開示は、上記のキットの内容物を含む製品を提供する。

以下の実施例は、ある特定の実施形態を説明するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、特許請求の範囲に記載の方法、組成物および装置の実施において良好に機能することが発見された技術を表すことを、当業者は理解すべきである。しかし、当業者であれば、本開示の見地から、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示された一部の実施形態において変更がなされ、依然として同様のまたは類似の結果が得られることを認識すべきである。

（実施例１）
１つの例示的な方法では、ヒドロゲル組成物を操作し、特徴付けた。本実施例では、（アルデヒド基とヒドラジド基の間で形成される）共有結合による適応性ヒドラゾン結合で架橋されたヒドロゲルを形成させ、得られたゲルを、ビシクロノニンで官能化された８アームポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）とヒアルロン酸（ＨＡ）上のペンダントアジドの間のアジドアルキン付加環化を促進する遅い反応性のひずみで安定化させた。

Ａ．マクロマーの形成
ある特定の例示的な方法では、ヒアルロン酸（ＨＡ）を、脂肪族アルデヒド（ＨＡ－Ａｌｄ）またはヒドラジド（ＨＡ－Ｈｙｄ）のいずれかで官能化した。簡単に説明すると、ＨＡ－Ａｌｄを、２００ｍｇのＨＡと過ヨウ素酸ナトリウム（１０３ｍｇ、過ヨウ素酸塩／ＨＡモル比１：１）を２０ｍＬのｄＨ_２Ｏに溶解したヒアルロン酸（ＨＡ、ＭＷ＝４００ｋＤａ、７４ｋＤａ）から合成した。反応物を暗所で２時間撹拌し、続いて２ｍＬのエチレングリコール中でクエンチした。次いで、溶液をｄＨ_２Ｏ（カットオフ分子量（ＭＷＣＯ）１４０００）に対して５日間透析し、凍結乾燥させた。ＨＡ－Ａｌｄは、使用するまで窒素下にて、－２０℃で保存した。官能化は、２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸アッセイを使用して決定した。要約すると、ＨＡ－Ａｌｄを２ｗｔ％で溶解し、続いてｄＨ_２Ｏ中でカルバジン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ｔ－Ｂｃ、１％トリクロロ酢酸中）と一晩反応させた。翌日、ＨＡ－ＡＬＤ／ｔ－ＢＣおよびｔ－ＢＣ標準を、２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ、０．１Ｍ四ホウ酸ナトリウム中６ｍＭ、ｐＨ８）と１時間反応させた。次いで、試料を０．５Ｎ塩酸と反応させ、マイクロプレートリーダー（テカン社（Ｔｅｃｏｎ））で３４０ｎｍにおいて吸光度を測定した。分子量（Ｍｎ）は、以下のようにゲル浸透クロマトグラフィーを使用して定量化した。１０ｍＬの超純水中の３％（ｗ／ｗ）ＨＡ－Ａｌｄ溶液を、サイズ５００Åおよび２５０～２０００Åのゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）／サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムに通して、屈折率検出器を使用してその分子量を測定した（図１Ａ）。

ＨＡ－Ｈｙｄは、１グラムのＨＡおよびアジピン酸ジヒドラジド（約１３ｇ、＞６０×モル過剰）を２００ｍＬのｄＨ_２Ｏに溶解したＨＡ（ＭＷ＝４００ｋＤａ、７４ｋＤａ）から合成した。１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ、１．５５ｇ、１０ｍｍｏｌ）およびヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、１．５３ｇ、１０ｍｍｏｌ）を別々にＤＭＳＯ／ｄＨ_２Ｏ混合物（１：１）に溶解し、ＨＡ溶液に滴加した。４時間にわたって３０分ごとにｐＨを６．８に調整し、２４時間反応させた。溶液をｄＨ_２Ｏ（３５００ＭＷＣＯ）に対して３日間透析し、その後生成物を冷アセトン中で沈殿させ、再度１週間透析した。生成物を凍結乾燥させ、使用のために窒素下にて、－２０℃で保存した。プロトン核磁気共鳴分光法（^１ＨＮＭＲ、Ｂｒｕｋｅｒ ＤＭＸ ３６０ＭＨｚ）を使用して、最終生成物を特徴付けた。分子量（Ｍｎ）は、上記の方法を使用するゲル浸透クロマトグラフィーを使用して定量化した。（図１Ａ）。

次に、８アームポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ、４０ｋＤａ）をビシクロノニン（（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチル（ＢＣＮ））で官能化した（ＰＥＧ－ＢＣＮ）。簡単に説明すると、８アームＰＥＧ（約１ｇ）と（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチル（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）カーボネート（ＢＣＮ－ＯＳｕ；１７５ｍｇ）を、ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）に溶解した。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２７７μＬ、２０７ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ、４ｘ）を混合物に加え、反応物を一晩撹拌し、濃縮し、水に溶解し、透析し（分子量カットオフ約２ｋＤａ）、凍結乾燥させた。官能化は、^１Ｈ－ＮＭＲにより、特徴的なＢＣＮピーク（δ２．２４、１．５７、１．３４、０．９２）の積分値をＰＥＧ主鎖からの積分値（δ３．６３）と比較することにより、９５％超であることが確認された。（図１Ａ）。

ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドは、アジド基とベンズアルデヒド基を含有する架橋剤である。（図１Ａ）。
デュアルゲルネットワークの形成
他の例示的な方法では、マクロマーを化学量論比でＰＢＳに溶解した。第１のゲルネットワーク系であるＨＡ－ヒドラゾンゲル系を、ＨＡ－ＡｌｄマクロマーとＨＡ－Ｈｙｄマクロマーを混合することによって形成した。これらのマクロマーを組み合わせると、ヒアルロン酸主鎖上で官能化されたヒドラジド基とアルデヒド基がヒドラゾン結合を形成する（図１Ｂおよび１Ｄ）。

第２のゲルネットワーク系であるＰＥＧ－トリアゾールゲル系を、ＰＥＧ－ＢＣＮとベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドマクロマーを混合することによって形成した。ＢＣＮは、８アームＰＥＧ上で官能化されているため、独自の主鎖を導入した。（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチル（ＢＣＮ）基とベンズアルデヒド－Ｐｅｇ３－アジド（アジド）基との間に形成されたネットワークは、不可逆的な結合を形成し、安定性をもたらした。（図１Ｃおよび１Ｄ）。

ＨＡ－ヒドラゾンゲル系によって、粘弾性ゲルが得られたが、ＰＥＧ－トリアゾールゲル系は、より弾性のあるゲルに寄与する。高弾性ゲルは、安定性は高いが注入性が不十分であり、一方、高粘弾性ゲルは注射しやすいが、注射後の溶液中での安定性が不十分である。どちらのデュアルゲルネットワークも、結合形成に外部活性化因子（すなわち、温度、ＵＶ光曝露、化学反応、光反応開始、酵素反応など）を必要としなかった。

ヒドロゲルの形成および特徴付け
ある特定の例示的な方法では、デュアルゲルネットワークについて、各ポリマー、ＨＡ－ヒドラジド、ＨＡ－アルデヒド、ＰＥＧ－ＢＣＮ、およびベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドをＰＢＳに溶解した。最初にＨＡ－ヒドラジド（官能性アームの１２％～１００％の範囲）とベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドを組み合わせ、その後ＨＡ－アルデヒドとＰＥＧ－ＢＣＮを組み合わせることにより、化学量論比でヒドロゲルが形成され、一緒に組み合わせるとヒドロゲルが形成された。組み合わせると、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドはヒドラジドとヒアルロン酸主鎖上で反応し、ヒドラジドとベンズアルデヒドが反応してほぼ不可逆的な結合を形成した（図１Ｄおよび１Ｅ）。結合を元に戻すことはできるが、この結合が分解するまでの時間スケールは数か月程度であった。

この反応により、ＨＡ主鎖に沿ったヒドラジド官能基がアジド部分に効果的に変換され、その後のビシクロノニン（ＢＣＮ）官能化８アームＰＥＧマクロマーとのひずみ促進アジド－アルキン付加環化（ＳＰＡＡＣ）反応への関与が起こった（図１Ｄ）。このＳＰＡＡＣ反応により安定なトリアゾール結合が形成され、これが得られたヒドロゲルの全体的な粘弾性特性に影響を与え、製剤の安定性を大幅に向上させた。このより安定な架橋を組み込むことにより、１．２６％（等式１）：

と計算されたヒドロゲルの予測フローリー・ストックマイヤー（Ｆｌｏｒｙ－Ｓｔｏｃｋｍａｙｅｒ）パーコレーション閾値で、８１アームＨＡ－ヒドラジドと８８アームＨＡ－アルデヒドに基づいて、安定な材料が達成された。アルキルヒドラゾン結合とベンジルヒドラゾン結合の比率を変更することで、実験者は組成的に規定された粘弾性応答の範囲に合わせて材料を調整することができた。

ＨＡ－ＡｌｄおよびＨＡ－Ｈｙｄマクロマーを単独で反応させる場合に形成される粘弾性ヒドロゲル；しかし、さらなる安定化を行わない場合、これらの材料はＭＳＣの封入および培養に必要なより長い時間スケールでは安定ではなかった（図１Ｂ）。ベンズアルデヒド－ＰＥＧ－アジド架橋剤を添加すると、ヒドラジド官能基は、ＳＰＡＡＣ反応に関与できるアジド官能基に効果的に変換され、前述の粘弾性ヒドロゲルを安定化させ、これにより応力緩和挙動が劇的に変化した（図１Ｃ）。したがって、架橋剤の組成を変更することにより、ヒドロゲル内で広範囲の粘弾性特性が達成され、応力緩和を特徴付けた。比較のために、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ－アジド架橋剤で官能化したＨＡ－ＨｙｄとＰＥＧ－ＢＣＮを反応させてＳＰＡＡＣネットワークを形成することにより、より弾性が高く安定なヒドロゲルを合成した（図１Ｅ）。

デュアルゲルネットワークの組み合わせから形成されたヒドロゲルは、結合形成に外部活性化因子（すなわち、温度、ＵＶ光曝露、化学反応、光反応開始、酵素反応など）を必要としなかった。

粘弾性ヒドラゾン結合対弾性トリアゾール結合の比を使用して、経時的にさまざまな程度の粘弾性および応力緩和（ＳＲ）を有するヒドロゲルを得た。具体的には、１００％、８８％、７５％、５０％、２５％、および０％の架橋が高速緩和アルキルヒドラゾン結合で構成されるヒドロゲルを製造した。ヒドロゲルのゲル化時間、最終貯蔵弾性率、粘弾性、および応力緩和時間を、平行平板レオメーター（ＤＨＲ－３）を使用してインサイチュで特徴付けた。平衡化後に測定されたデュアルゲルネットワーク（ＨＡ－ヒドラゾン：ＰＥＧ－トリアゾール）の剪断貯蔵弾性率は、すべての条件にわたって約４００Ｐａであった。

ヒドラゾン結合を、生理学的ｐＨで急速に形成させ、マクロマーを含有する足場を作製して、時間の経過とともにネットワークを安定化し、これにより注射が可能になった。ヒドラゾン結合は、初期粘弾性条件（ＨＡ－ＡｌｄおよびＨＡ－Ｈｙｄのみ）でのヒドロゲルの即時ゲル化（Ｇ’＞Ｇ”）によって観察されるように、試料を充填するときに捕捉できるよりも速く生理学的ｐＨで形成された。

よりゆっくりとゲル化するＳＰＡＡＣ架橋を追加しても、Ｇ’とＧ’’の交差点は依然として比較的急速に発生し、約５分後に弾性ゲル（デュアルゲルネットワークＨＡ－ヒドラゾンと濃度が増加しているＰＥＧ－ＢＣＮの組み合わせ）が形成され始め、一方、粘弾性ゲル（ＨＡ－ｈｙｄおよびＨＡ－ａｌｄ）はほぼ瞬時に形成され（図２Ａ）、約９０００秒（２．５時間）後に定常状態のネットワーク形成に達する。種々のヒドロゲル製剤の最終剪断貯蔵弾性率は１６００Ｐａ～２４００Ｐａの範囲であった（図２Ａ）。

２４時間後、異なるゲル条件間で弾性率に有意差は観察されなかった（図２Ｂ）。すべてのゲルは、約１０，０００Ｐａ未満のインサイチュ弾性率を有し、２５％および７５％の粘弾性組成を有するゲルは、調べた他のゲルと比較して、著しく高いインサイチュ弾性率を有していた（図２Ｃ）。ＨＡ－ヒドラゾンゲル系内のヒドラゾン結合は急速に形成されるため、ＨＡ－ヒドラゾン－アジドおよびＰＥＧ－ＢＣＮゲル系の成分が時間の経過とともにネットワークを安定させ、注射を可能にする足場が作製される。

完全なネットワーク形成後、ヒドロゲルの応力緩和特性を試験した。１０％のひずみを１秒間かけて加え、６時間一定に保ち、加えられた剪断応力の緩和を各ヒドロゲル条件について監視した（図２Ｄ）。応力緩和の量は、ヒドロゲル内に存在するアルキルヒドラゾン結合のパーセントに応じて変化し、１００％対０％のアルキルヒドラゾン製剤の応力緩和がそれぞれ、約９０％からわずか２％までの範囲であった（図２Ｄ～２Ｅ）。アジド架橋剤によるＨＡ－Ｈｙｄの官能化が０～１００％に増加すると、存在するアルキルヒドラゾン架橋が減少し、ヒドロゲルの粘弾性特性が変化した。応力緩和データをさらに分析すると、１００％と８８％のアルキルヒドラゾン結合条件では応力緩和のパーセントに有意差はなく、どちらも加えられた応力の８０％超で緩和することが示された（図２Ｆ）。アルキルヒドラゾン架橋含有量がさらに減少すると、応力緩和特性に大きな差異が観察された。具体的には、すべての試料は、加えられた応力の５０％未満を緩和し、５０％、２５％、および０％の製剤では加えられた応力の１０％以下を緩和した（図２Ｅ）。これらの結果は、ネットワーク内に存在する動的結合が少なく、ＰＥＧ対ＨＡのモル比が１を大幅に超えているため、ヒドロゲルの応力緩和能力が急激に低下していることを示唆している（図２Ｇ）。

すべての応力緩和曲線を初期値に正規化し、データをコールラウシュ・ウィリアムズ・ワッツ（Ｋｏｈｌｒａｕｓｃｈ－Ｗｉｌｌｉａｍｓ－Ｗａｔｔｓ）関数（等式２）：

に適合させた。
この等式では、正規化応力σ／σ_０は、伸長パラメータ、βによって記述される分布に存在する時定数τ_ｋを有する指数関数的減衰としてモデル化された。ヒドロゲルの応力緩和は、ヒドロゲルネットワーク内に存在する組成的およびトポロジカルな不均質性（すなわち、共有結合的に適応性の高い複数の化学、ポリマー鎖のもつれとループ、および異なるポリマーネットワーク主鎖）に起因する広範囲の緩和時定数を包含する。コールラウシュ・ウィリアムズ・ワッツ（Ｋｏｈｌｒａｕｓｃｈ－Ｗｉｌｌｉａｍｓ－Ｗａｔｔｓ）関数を、広範に不均質な緩和時間スケールを示す試料の緩和挙動を記述するための経験的関係として使用した。緩和時定数の不均質性は、βによって定性的に理解され、値１は特異緩和時定数を表し、０への偏差はこの分布の広がりを表す（０＜β＜１）。モデルパラメータは、例示的な方法の各ヒドロゲル組成物の伸長パラメータを示す図２Ｈにまとめられている。伸長パラメータには、ほとんどの条件でβ＞０．５という中程度の不均質性があった。

時定数および伸長パラメータがわかったら、時間領域全体（ｔ＝０～ｔ＝∞）にわたってモデルを積分することによって、平均緩和時定数（〈τ〉）を計算した（等式３）：

各ヒドロゲル組成物の特徴的な緩和時間を、等式３および応力緩和データに適合するパラメータを使用して計算した。これらの特徴的な緩和時間は、４桁の大きさ（〈τ_８８％〉＝４．２×１０^３ｓ～〈τ_０％〉＝１．４×１０^７ｓ）に及ぶことが見出され、およそ１時間半から６か月の範囲であり得るヒドロゲル内の緩和の時間スケールを正確に制御できることを示している（図２Ｉ）。

ある特定の例示的な方法では、各ヒドロゲル製剤の平衡膨潤剪断貯蔵弾性率を決定するために、試料をＰＢＳ中で２４時間膨潤させ、その後、本明細書に詳述する方法に従ってレオロジーについて分析した。最終的な平衡貯蔵弾性率（Ｇ’）は、すべての条件にわたって約４００±１５０Ｐａであることが見出され、どの条件間でも有意差はなかった（図２Ｊ）。したがって、これらの製剤を使用した細胞培養実験では、ヒドロゲルの特性間の主な差異は応力緩和挙動であった。

剪断レオロジーを使用して、ヒドロゲルの粘弾性特性を測定するために使用される１つの試験は、応力緩和試験であった。この試験では、一定のひずみを加え、応答する応力を経時的に測定した。弾性材料は一定の応力を維持するが、粘弾性材料は応力緩和を示す。経時的な応力緩和のパーセントを測定し、これは、ＰＥＧ－トリアゾール含有量１００％から０％までに応じて、それぞれ９２％～２％の範囲であった（図３Ａおよび３Ｂ）。具体的には、ＰＥＧ－トリアゾール含有量が０％の場合は応力の９２％が緩和され、ＰＥＧ－トリアゾール含有量が１２％の場合は応力の８４％が緩和され、ＰＥＧ－トリアゾール含有量が２５％の場合は応力の３９％が緩和され、ＰＥＧ－トリアゾール含有量が５０％の場合は応力の９％が緩和され、ＰＥＧ－トリアゾール含有量が７５％の場合は応力の３％が緩和され、ＰＥＧ－トリアゾール含有量が１００％の場合は応力の２％が緩和された。ゲルの応力を、経時的に正規化した（図３Ｃ）。

これらのデータは、ゲルに投入されるＰＥＧ－トリアゾールの量が増加する（弾性が増加する）とゲルの応力緩和が著しく低減するのに対し、ゲルの弾性が増大するにつれて応力緩和の時定数が増加することを示している。すべてのゲル製剤は、２４時間後に類似の膨潤剪断貯蔵弾性率値を示した。これにより、ＨＡ－ヒドラゾン対ＰＥＧ－トリアゾールの比を調整して、ゲルのバルク剪断貯蔵弾性率を変化させないままで、経時的にゲル内の粘弾性および応力緩和を制御することができることが示された。

別の例示的な方法では、この実施例で開示される固有のデュアルゲルネットワークにより高弾性ゲルが注射可能になることができるかどうかを決定するために、標準注射器から排出される濃度が増加しているＰＥＧ－トリアゾール含有量を有する（したがって選択可能性が増加する）ゲルのタイムラプスビデオを撮影した。１００％ＰＥＧ－トリアゾール弾性ゲル対照は、注射器から排出させることができなかった。しかし、７５％のＰＥＧ－トリアゾールおよび２５％のＨＡ－ヒドラゾンを有するゲルは、注射器から排出することができ、排出後にゲルの形態を維持することができた（図４Ａ～４Ｆ）。

（実施例２）
別の例示的な方法では、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を異なる適応性を有するゲルに封入し、ＭＳＣセクレトームプロファイルを材料特性の関数として測定した。まず、ラットＭＳＣを、ペニシリン・ストレプトマイシン、ファンギゾンおよび１０％ＦＢＳを補充した低グルコースダルベッコ改変イーグル中で培養した。開示された例示的な方法では、継代５～６の間のＭＳＣを使用した。次に、ゲルネットワークＨＡ－ヒドラゾンとＰＥＧ－トリアゾールの組み合わせを有するヒドロゲルを実施例１に記載のように調製し、この実施例では「ＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワーク」と呼んだ。ＭＳＣは、１００万細胞／ｍＬ～５００万細胞／ｍＬの間の密度でＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークに封入した。ＭＳＣの形態を、核（ＤＡＰＩ）およびアクチン細胞骨格を免疫染色する（ローダミンファロイジン）ことによって定量化し、レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して画像化した。

培養０日および４日後、ＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークに封入されたＭＳＣの形態を、核（ＤＡＰＩ）およびアクチン細胞骨格を免疫染色する（ローダミンファロイジン）ことによって定量化し、レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して画像化した。図５Ａおよび５Ｂは、０％粘弾性組成物（１００％ＰＥＧ－トリアゾールおよび０％ＨＡ－ヒドラゾン）を有するＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲル内に封入されたＭＳＣの０日後（図５Ａ）および４日後（図５Ｂ）の形態を示す。図５Ｃおよび５Ｄは、８８％粘弾性組成物（１２％ＰＥＧ－トリアゾールおよび８８％ＨＡ－ヒドラゾン）を有するＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲル内に封入されたＭＳＣの０日後（図５Ｃ）および４日後（図５Ｄ）の形態を示す。図５Ｅは、応力緩和の関数として特徴付けしたＭＳＣの形態を示す。９２％ＳＲ条件は４日目までに完全に分解したが、８４％および３９％ＳＲ条件は両方とも顕著な細胞広がりを示し、それぞれ具現化率は１．２５および１．２０であった。９％～２％ＳＲ製剤中のＭＳＣは球形のままであり、具現化率は１．２０未満であった。

（実施例３）
別の例示的な方法では、ラット間葉系幹細胞（ｒＭＳＣ）を、ここで１ｍＭのＲＤＧペプチドリガンドＫＲＧＤＳ（配列番号８）を含有する同じＨＡ－ＰＥＧヒドロゲル製剤に１００万細胞／ｍｌの密度で封入した。ＲＧＤは、ベンズアルデヒド基で官能化されているためＨＡ－Ｈｙｄに結合しており、したがってｒＭＳＣと相互作用することができる。まず、ｒＭＳＣの生存率を、カルセインＡＭおよびエチジウムホモ二量体のｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色を使用して測定した。２４時間後、すべての試料で８５％超の生存率が測定された（図６Ａ）。次に、ｒＭＳＣの形態を、マトリックス応力緩和の関数として調査した（図６Ｂ）。４日間の培養後、ｒＭＳＣを含むヒドロゲルを固定および染色して、共焦点顕微鏡で細胞骨格形態（Ｆ－アクチン、緑色）および核形状（Ｄａｐｉ、青色）を視覚化した（図６Ｈ）。実験の過程で、１００％粘弾性製剤は完全に分解され、これはおそらく、ｒＭＳＣ分泌プロテアーゼと、培地中のアルデヒドと血清タンパク質の潜在的な反応との組み合わせによるものであり、これらの両方によって効果的に架橋が破壊された。この観察によって、長期の細胞研究のために純粋なヒドラゾン材料を安定化する必要性がさらに強調された。１００％ＳＰＡＡＣ（弾性）ヒドロゲルでは、ｒＭＳＣは比較的球形のままであり、具現化率はほぼ１．０のままで、０日目から４日目まで有意差はなかった（図６Ｃ）。対照的に、粘弾性が最も高い状態、すなわち８８％にあるｒＭＳＣは、４日目までに大幅に大きくなり、より広がり、伸長した。０日目から４日目までの培養の時間経過にわたって、８８％粘弾性ヒドロゲルにおける周囲のネットワークの物理的リモデリングにより、細胞具現化率は１．２０を超えるまで増加した。興味深いことに、２５、５０、および７５％の粘弾性条件におけるｒＭＳＣは、ほぼ球形のままであり、４日目までに顕著な広がりを示さなかった（図６Ｃ～６Ｇ）。これにより、形態に影響を与えるために臨界量の粘弾性、つまり再配置に必要な細胞周囲架橋の量が生じた。これは、おそらく、他の条件では４日後に１．２０未満の具現化率が示されたため、ｒＭＳＣがより長い緩和時間と比較して２時間程度のより速い応力緩和でネットワークに応答したためであると考えられる（図６Ｈ）。

これらの例示的な方法では、すべての条件にわたって、約８８％のアルキルヒドラゾン架橋で封入されたｒＭＳＣ（例えば、適応性が高いが、長期培養に安定である）を使用すると、ある特定の他の条件と比較して、４日目までに顕著な広がりが実証された。（図６Ｊ）。０日目から４日目までの培養の時間経過にわたって、細胞のアスペクト比はおよそ１．０から１．６０±０．１８を超えるまで増加し、これは周囲ネットワークの物理的リモデリングを示していた。０、２５、５０、および７５％のアルキルヒドラゾン含有ヒドロゲルに封入されたｒＭＳＣは、アスペクト比１．２０±０．０３８以下でほぼ球形のままであり、４日目までに顕著な広がりを示さなかった（図６Ｃ～６Ｇおよび６Ｊ）。対照的に、８８％アルキルヒドラゾンの小さなクラスター内のｒＭＳＣが観察され；この表現型は、他の条件では見られなかった（図６Ｈ）。

ネットワーク適応性の関数としての機械的感受性を、核対細胞質のＹＡＰ比の分析によって測定した。４日目までに、８８％粘弾性条件では、それぞれ２．８±１．２および２．８±１．３である平均の核対細胞質比を有する７５％および０％のより遅い応力緩和条件と比較して、平均の核対細胞質比が６．５±１．３で、ＹＡＰのより大きな核局在が実証された。（図６Ｋ～６Ｌ）。これとともに、８８％粘弾性条件下で４日目までに小さな細胞クラスターが再び観察され、ＹＡＰについて染色された（図６Ｍ）。さらに、ＹＡＰ局在化の影響をよりよく理解するために、８８％、７５％、０％の粘弾性条件について細胞および核体積を、４日目に分析した。７５％および０％アルキルヒドラゾン条件と比較して、８８％アルキルヒドラゾン条件では細胞体積が著しく増加し、平均細胞体積はそれぞれ約３２００±１７００μｍ^３および３５００±１６００μｍ^３であったのに対し、約６１００±４５００μｍ^３であった（図６Ｎ）。しかし、核体積はすべての条件にわたって一貫しており、平均体積は約１２００μｍ^３であった（図６Ｏ）。

細胞体積の劇的な増加により、ＹＡＰの核対細胞質の比率がよりよく理解された。核体積はすべての条件にわたって比較的同じままでありながら、ＹＡＰシグナルが核内でより多くなるにつれて、ＹＡＰの核内の強度が増大した；対照的に、細胞質内の強度は、（アルキルヒドラゾン結合およびＨＡ含有量の増加に伴い）細胞質体積が増加するにつれて低下した。８８％アルキルヒドラゾン条件における細胞形態およびＹＡＰの変化によって、粘弾性による細胞の広がりおよび形態変化が可能になる、細胞周囲領域の適応性架橋の臨界割合が示唆された。具体的には、ｒＭＳＣは高速応力緩和時間スケール（約２時間）を有するネットワークに応答し、これにより微小環境の再配置が可能になり、形態およびクラスター化の変化が起こった。８８％アルキルヒドラゾン結合条件では、顕著な細胞の広がりおよびＹＡＰ核局在化が実証された。これは、ＨＡ対ＰＥＧのモル比によって説明され、８８％適応性ヒドラゾン結合条件ではＨＡ対ＰＥＧ比が１を超えていたのに対し、その後のすべての条件ではＰＥＧ対ＨＡ比が１を超えていたことが想起される。（ＹＡＰ／ＴＡＺは、細胞の構造、形状、および極性によって定義される細胞の物理的性質の主要なセンサーである。ＹＡＰ／ＴＡＺ活性化は、細胞接着、および細胞が組織足場および周囲のＥＣＭから受ける機械的シグナルなど、細胞の「社会的」挙動も反映する。）
（実施例４）
別の例示的な方法では、ラット間葉系幹細胞（ｒＭＳＣ）の広がりおよび形態を評価した。共有結合による適応性ネットワークにおける細胞の広がりおよび形態には、ミクロンのサイズスケールにわたる複数の結合の緩和の調整が必要である。ｒＭＳＣは代謝的に活性であり、短い培養期間の後でも高濃度のマトリックス分子を沈着させることができる。したがって、本明細書では、マトリックス沈着をヒドロゲルの応力緩和特性の関数として特徴付けた。これは、ｒＭＳＣを含むゲルにおけるｒＭＳＣの新生タンパク質沈着を測定することによって行った。簡単に説明すると、ｒＭＳＣを、細胞密度３００万細胞／ｍｌでＲＧＤを含有するＨＡ－ＰＥＧヒドロゲル製剤に封入した。封入の際、非標準アミノ酸Ｌ－ホモプロピルアルギルグリシン（ＨＰＧ）を、０日目と２日目に１００μＭの濃度で培地に加えた。４日後、ヒドロゲルを固定し、免疫染色した。その後、ＨＰＧを新たに合成されたタンパク質に組み込み、ＨＰＧ上でアジド官能化蛍光色素分子の銅触媒クリック反応を介して沈着したタンパク質の視覚化が可能になり、細胞膜を、共焦点顕微鏡でＨＣＳ ｃｅｌｌ ｍａｓｋ ｂｌｕｅ染色を使用して視覚化した（図７Ａおよび７Ｂ）。ｒＭＳＣは、弾性対照製剤および８８％粘弾性条件で封入した。８８％粘弾性条件では、特にはるかにまばらであった弾性対照と比較して、細胞周囲領域全体にわたって広範なタンパク質沈着を実証した（図７Ｃ）。データを、共焦点顕微鏡によって定量化し、ＩｍａｇｅＪの「ＢｏｎｅＪ」プラグインを使用して分析した。８８％粘弾性条件では、平均タンパク質厚さが１．５±０．３４μｍ、平均最大タンパク質厚さが２．５±０．６２μｍであった。対照的に、１００％ＳＰＡＡＣヒドロゲルは、平均タンパク質厚さが１±０．３６μｍ、平均最大タンパク質厚さが約１．７±０．９２μｍであった（図７Ｄ）。図７Ｅは、約２．５ミクロンおよび１．８ミクロンの２つの極限条件における最大分泌タンパク質厚さを示す。このデータを総合して、ｒＭＳＣが高速応力緩和ヒドロゲル内に、細胞全体を包含する重要な細胞周囲マトリックスを構築する能力を実証した。

一方法では、７日間の培養後にヒドロゲルを固定し、免疫染色したこと以外は上記と同じ条件下で、弾性対照製剤および８８％粘弾性条件でｒＭＳＣを封入した。図８Ａ～８Ｃは、高粘弾性ヒドロゲル中で多核構造を形成した封入ｒＭＳＣを示す。

次に、ｒＭＳＣを含むゲルにおける新生タンパク質沈着を測定することによって、マトリックス沈着をヒドロゲルの応力緩和特性の関数として特徴付けた。非標準アミノ酸Ｌ－ホモプロピルアルギルグリシン（ＨＰＧ）の組み込みにより、ヒドロゲル内で新生タンパク質を視覚化した。ｒＭＳＣを、すべてのヒドロゲル条件：ヒドロゲルあたり０％、２５％、５０％、７５％、および８８％適応性ヒドラゾン結合、で封入した。図９Ａは、８８％、７５％、および０％粘弾性のタンパク質沈着について有意差のある集団における分泌タンパク質の視覚化の代表的な画像を示し、８８％粘弾性条件からの単一細胞およびクラスター化新生タンパク質沈着の両方を含む。

８８％アルキルヒドラゾン条件では、特に弾性対照と比較して、細胞周囲領域全体にわたって広範なタンパク質沈着を実証した。８８％アルキルヒドラゾン条件では、平均タンパク質厚さが１．４５±０．３８μｍ、および平均最大タンパク質厚さが２．３１±０．７７μｍであった（図９Ｂ～９Ｃ）。７５％アルキルヒドラゾン条件では、平均タンパク質厚さが１．２１±０．３０μｍ、および平均最大タンパク質厚さが約１．８８±０．５９μｍであり、５０、２５、および１００％ＳＰＡＡＣヒドロゲルの平均タンパク質厚さが１．０５±０．２５μｍ以下、および平均最大タンパク質厚さが約１．７±０．５７μｍ以下であった（図９Ｂ～９Ｃ）。沈着新生タンパク質の総面積により、最高速緩和ヒドロゲル（８８％アルキルヒドラゾン）が最大の総新生タンパク質沈着量を有することが示された（図９Ｄ）。

８８％アルキルヒドラゾン中のｒＭＳＣを、２つの異なる表現型、すなわち一緒にクラスター化したものと単一細胞として残ったものに分離した。これら２つの群内の細胞を新生タンパク質沈着の総量について分析すると、クラスター内に存在するｒＭＳＣは、単一細胞と比較して高濃度の新生タンパク質を分泌した（図９Ｅ）。この分析をさらに進めるために、沈着した新生タンパク質内のフィブロネクチンおよびコラーゲン含有量の組成を定量化した。封入細胞によって最小限のコラーゲンが沈着したが（データは示さず）、フィブロネクチンは高度に分泌され、８８％アルキルヒドラゾン条件ではｒＭＳＣから伸長する分岐鎖に局在することが示された。０％アルキルヒドラゾン条件では、フィブロネクチン沈着が細胞の周囲に均一に見られた（図９Ｆ～９Ｇ）。総合すると、このデータは、ｒＭＳＣが高速緩和ヒドロゲル内の細胞ニッチの周囲に、高濃度のフィブロネクチンで構成される大きな細胞周囲マトリックスを構築していることを示唆している。

本明細書に開示されるこれらのデータは、Ｅｘｏ－１阻害研究を通じて見られるように、細胞周囲マトリックスの形成および組成に対する組成的に規定された応力緩和の影響についてのより深い理解を提供し、これは細胞の機械感知能力にさらに寄与する場合がある。これらの研究は、Ｅｘｏ－１の阻害により、８８％および７５％適応性結合条件の両方で、新生タンパク質沈着がそれぞれ０．９１±０．１１μｍおよび０．９１±０．１４μｍ減少し、０．９４±０．１６μｍの０％適応性結合条件の対照レベルまで減少することを実証した（図１０Ａ～１０Ｂ）。Ｅｘｏ－１阻害細胞のアスペクト比をさらに分析すると、ｒＭＳＣの広がり形態の減少が実証され、８８％および７５％適応性結合条件のアスペクト比はここではそれぞれ１．２７±０．０８１μｍおよび１．２２±０．０７２μｍとなり、これは、１．２６±０．０３４μｍの０％適応性結合対照のものと同様である（図１０Ｃ）。これは、細胞の広がりにつながる機械感知に必要であるため、沈着新生タンパク質の役割の１つの可能性を示した。

（実施例５）
別の例示的な方法では、材料特性の関数としてＭＳＣセクレトームプロファイルを評価するために、ＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲルへの封入後４日目のＭＳＣの分泌プロファイルを、ラットサイトカインアレイＣ２キットを使用して測定した。すべてのデータを、対照培地を参照アレイとして使用し、ＤＮＡ濃度に対して正規化し、炎症誘発性および抗炎症性サイトカインのサイトカイン分泌をヒドロゲルの応力緩和の関数として特徴付けた。図１１Ａは、ラットサイトカインアレイＣ２キットで試験されたすべてのサイトカインのヒートマップを示し、図１１Ｂは、アレイアッセイによって検出された炎症誘発性および抗炎症性サイトカイン分泌の詳しい検証を示す。

これらのデータは、より高いレベルの応力緩和を有するヒドロゲルにおいてＭＳＣ分泌プロファイルが増加したことを実証し、粘弾性によって４日後にサイトカイン分泌が調節されたことを示している。４日目では、３９％ＳＲ条件のＭＳＣのサイトカイン分泌レベルが最も高かったが、２％ＳＲ条件のＭＳＣの分泌レベルは最も低かった。特に、ゲルの応力緩和が低減すると抗炎症性サイトカインであるインターロイキン１０（ＩＬ－１０）が減少し、一方、応力緩和が低減すると炎症誘発性サイトカインである腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａ）が増加した。２５％弾性（７５％粘弾性）条件のＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲルは、サイトカインの最大の分泌を実証した。抗炎症性環境の特徴的なサイトカインであるＩＬ－１０は、２５％弾性条件から最も多く分泌され、炎症誘発性環境の特徴的なサイトカインであるＴＮＦ－αは７５％弾性条件から最も多く分泌された。ＩＬ－１０およびＩＬ－６は、より粘弾性のネットワークでは上方制御され、より剛直なネットワークでは減少した。炎症誘発性サイトカインＴＮＦ－αは、より剛直なネットワーク内でより上方制御された。

本明細書に開示されるように、これらのデータは、新規なＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークヒドロゲルを、投与によりＭＳＣ細胞の送達、広がり、および／またはＭＳＣサイトカイン分泌を促進するように調整することができることを実証する。例えば、ヒドロゲルの応力緩和（ＰＥＧ－トリアゾール）をもたらすための投与。ＭＳＣ細胞広がりを促進すると、損傷した組織領域への注射後の回復努力が増大することができる。注射部位の炎症環境に対するＰＥＧ－ＨＡデュアルネットワークゲルの寄与は、注射部位に局所的な抗炎症緩和をもたらすだけでなく、組織の回復を高めることもできる。

実施例１～５で使用した方法
以下の方法論は、本明細書に提供される実施例１～５に開示される例示的な方法において実行した。

ＨＡ－アルデヒドの合成および特徴付け。要約すると、Ｈａ（５００ｋＤａ、５００ｍｇ）を５０ｍＬのｄＨ_２Ｏに溶解し、次いで過ヨウ素酸ナトリウム（２６７．５ｍｇ、過ヨウ素酸塩／ＨＡモル比１：１）を反応混合物に加えた。反応物を暗所で２時間撹拌し、続いて７０μＬのエチレングリコール中でクエンチした。次いで、反応物をｄＨ_２Ｏ（カットオフ分子量（ＭＷＣＯ）８０００）に対して３日間透析し、凍結乾燥させた。ＨＡ－Ａｌｄを液体窒素中で急速冷凍させ、さらに使用するまで－２０℃で保存した。ＨＡ－Ａｌｄマクロマーの官能化は、２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）アッセイを使用して定量化した。要約すると、ＨＡ－Ａｌｄを２ｗｔ％で溶解し、次いでｄＨ_２Ｏ中でカルバジン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ｔｅｒｔ－Ｂｕｔｙｌ ｃａｒｂａｚｔｅ）（ｔ－Ｂｃ、１％トリクロロ酢酸中）と反応させた。２４時間後、ＨＡ－ＡＬＤ／ｔ－ＢＣおよびｔ－ＢＣ標準を、０．５ｍｌのＴＮＢＳ（０．１四ホウ酸ナトリウム中６ｍＭ、ｐＨ８）と１時間反応させた。次いで、試料を０．５Ｎ塩酸と反応させ、マイクロプレートリーダーで３４０ｎｍにおいて吸光度を測定した（官能化約３５％）。

ＨＡ－ヒドラジドの合成および特徴付け。要約すると、Ｈａ（６０ｋＤａ、５００ｍｇ）を１００ｍｌ ｄＨ_２Ｏに溶解した後、アジピン酸ジヒドラジド（約６．５ｍｇ、＞６０×モル過剰）を反応物に大過剰モルで加え、ｐＨを６．８に調整した。１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ、７７６ｍｇ、４ｍｍｏｌ）およびヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、７６５ｍｇ、約６ｍｍｏｌ）を別々にＤＭＳＯ／ｄＨ_２Ｏ混合物（１：１）に溶解し、反応物に滴加した。４時間にわたって３０分ごとにｐＨを６．８に調整し、その後２４時間反応させた。溶液をｄＨ_２Ｏ（８０００ＭＷＣＯ）に対して３日間透析し、その後凍結乾燥させた。乾燥したら、生成物を秤量し、５ｗｔ％ＮａＣｌ／ｄＨ_２Ｏ溶液に溶解し、純粋なエタノール中に沈殿させ、さらに３日間透析した。次に、生成物を液体窒素中で凍結乾燥させ、急速冷凍させ、さらに使用するまで－２０℃で保存した。ＨＡ－Ｈｙｄは。^１ＨＮＭＲを使用して特徴付けた（官能化約４０％）。

ＰＥＧ－ＢＣＮの合成および特徴付け。要約すると、８アーム４０ｋＤａ ＰＥＧ－アミン（１．０ｇ、０．２ｍｍｏｌアミン）およびＢＣＮ－ｏＳｕ（０．１ｇ、０．３４３ｍｍｏｌ、１．７ｘ）を５０ｍｌ丸底（ＲＢ）フラスコに加え、８０℃で一晩乾燥させた。最小量の乾燥ＤＭＦをＲＢフラスコに加えて内容物（１０ｍｌ）を溶解させた。次いで、フラスコをアルゴンガス雰囲気下に置き、室温で撹拌した。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．８ｍｍｏｌ、４ｘ）を溶液に加え、反応を一晩放置して進行させた。翌日、反応混合物をｄＨ_２Ｏで希釈し、３日間透析した（８０００ＭＷＣＯ）。透析した溶液を３日間凍結乾燥させ、乾燥白色粉末をＰＥＧ－ＢＣＮ生成物として得た（０．９８５ｇ、収率９８％）。末端基の官能化は、^１ＨＮＭＲを使用して確認した（官能化＞９５％）。

ペプチド合成。ベンズアルデヒド－ＫＧＲＧＤＳ（配列番号７）は、標準Ｆｍｏｃ化学およびリンクアミドＭＢＨＡ樹脂を使用して、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｔｒｉｂｕｔｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで合成した。要約すると、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）とフェノール（１：１）を９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）、および２．５％脱イオン水の溶液に溶解することによって、ペプチド切断溶液を形成した。合成ペプチドを２時間かけて切断した。切断されたペプチドを冷ジエチルエーテル中で沈殿させ、遠心分離によって回収し、一晩乾燥させた。次いで、切断されたペプチドを、アセトニトリル：水の直線勾配を使用するＣ_１８カラムでの逆相ＨＰＬＣ（ウォーターズ社（Ｗａｔｅｒｓ）Ｄｅｌｔａ Ｐｒｅｐ ４０００）精製によって精製した。精製ペプチドの収集された画分は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析法によって同定した。

ヒドロゲル形成およびレオロジー特徴付け。官能化ＨＡを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に３ｗｔ％で溶解した。官能化ＰＥＧ－ＢＣＮを１０ｗｔ％でＰＢＳに溶解し、アジド－ＰＥＧ３－フェノールアルデヒド（ブロードファーム（ＢｒｏａｄＰｈａｒｍ））架橋剤を、２０ｍＭの濃度で溶解した。ヒドロゲルは、化学量論に基づいて最終ポリマー含有量が３ｗ／ｖ％となるように形成した。インサイチュでのレオロジー測定は、８ｍｍの平行プレート形状を備えたＴＡインスツルメント（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）ＤＨＲ－３レオメーターを使用して実行した。ヒドロゲルの形成は、時間掃引（１．０Ｈｚ；０．５％ひずみ）によって評価した。応力緩和実験では、加えられた応力の大部分（＞９０％）を緩和する１００％粘弾性条件の時間によって決まるように、１秒間かけて１０％ひずみを加えた後、６時間の測定を行った。製剤は、ＨＡ－ヒドラジドを効果的にアジドに変換する小分子ベンズアルデヒド－ＰＥＧ－アジドでＨＡ－ヒドラジドを修飾することにより、ヒドロゲル内に存在するアルキルヒドラゾン結合の割合を変えることによって定義した。製剤は、１００％（純粋なアルキルヒドラゾン）、８８％アルキルヒドラゾン（すなわち、官能性ＨＡ－ヒドラジドアームの１２％がベンズアルデヒド－ＰＥＧ－アジドで官能化されている）、７５％、５０％、２５％、および０％（純粋なＳＰＡＡＣ、すなわち官能性ＨＡ－ヒドラジドアームの１００％がベンズアルデヒド－ＰＥＧ－アジドで官能化されている）から構成されており、これらの官能性を達成するために必要な割合のＰＥＧ－ＢＣＮとＨＡが組み込まれている。実験中の蒸発を防ぐために、ヒドロゲルの周囲に鉱油を塗布した。理論モデルは、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）の曲線近似アプリケーションを使用して適合させた。

細胞培養および封入。Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット間葉系幹細胞（ｒＭＳＣ）を増殖させ、培養した。要約すると、継代２で細胞を取得し、成長培地、具体的には１０％ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢを補充した低グルコース（１ｎｇ／ｍｌグルコース）のダルベッコ改変イーグル培地で継代５まで増殖させた。培地を２４時間後に交換し、その後８０～９０％の細胞コンフルエンシーに達するまで３日ごとに交換した。所望の細胞コンフルエンシーに達したら、細胞を液体窒素中にて継代５で保存した。ヒドロゲルは、１００％（純粋にアルキルヒドラゾン）、８８％、７５％、５０％、２５％、および０％（純粋にＳＰＡＡＣ）の、所望の３ｗｔ％ヒドロゲル製剤の化学量論に基づいて、ＨＡ－Ｈｙｄを、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ－アジド架橋剤、およびＫＧＲＧＤＳ（配列番号７）と事前反応させ、それらを一晩反応させることによって製造した。翌日、ＨＡ－Ａｌｄ、ＰＥＧ－ＢＣＮ、およびＰＢＳを、改変注射器バレル内で、化学量論比で混合した。継代５のｒＭＳＣを解凍し、成長培地内に置いた。ｒＭＳＣ懸濁液を遠心分離し（２００ｒｃｆ、５分間）、得られたペレットをＨＡ－Ｈｙｄ、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ－アジド、ＫＲＧＤＳ混合物中に細胞密度１～５００万細胞／ｍｌとなるように再懸濁した。次いで、細胞懸濁液を、ＨＡ－Ａｌｄ、ＰＥＧ－ＢＣＮおよびＰＢＳとともに注射器バレル内で混合した。ヒドロゲルを、柔軟なゲルが形成されるまで（５分以下）反応させた後、ベンズアルデヒド官能化カバースリップ（１００、８８、および７５％条件で）またはアジド官能化カバースリップ（５０、２５、および０％条件で）のいずれかに置き、さらに２分間反応させた後、１ｍｌの成長培地を加えた。

細胞生存率、形態、およびＹＡＰ。生存率アッセイでは、細胞を、カルセインＡＭ／エチジウムホモ二量体Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ溶液で染色した。形態学的変化およびＹＡＰ（Ｙｅｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ１）を分析するために、ＨＡ－ＰＥＧヒドロゲル中で成長させたｒＭＳＣを、４日間の成長後にホルマリンで固定し（３０分、室温）、その後ＰＢＳですすいだ。固定後、ヒドロゲルを、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過処理し（１時間、室温）、５％ＢＳＡ（ＰＢＳ中（１時間、室温））を使用して遮断した。試料を、ブロッキング緩衝液中で、ＤＡＰＩ（１：１０００）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ６４７ファロイジン（１：３００）とインキュベート（一晩、４℃）（形態）、またはブロッキング緩衝液中でＤＡＰＩ（１：１０００）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ６４７ファロイジン（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１：３００）、およびＹＡＰ（１：５００）（ＹＡＰ核：細胞質比）とインキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄して過剰な汚れを除去した後、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０）を使用して蛍光標識ｒＭＳＣを画像化した。ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用して、粒子分析プラグインを使用して形態学的変化を視覚化し、定量化した。Ｉｍａｒｉｓを使用して、ＹＡＰの変化を視覚化し、定量化した。

新生タンパク質沈着。細胞を、３００万細胞／ｍｌの濃度で封入し、０．２０１ｍＭ シスチン、１００μｇ／ｍｌ ピルビン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍｌ ２－ホスホ－Ｌ－アスコルビン酸三ナトリウム塩、１０％ ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、０．５μｇ／ｍｌ アンホテリシンＢおよび０．１ｍＭ Ｌ－ホモプロパルギルグリシン（ＨＰＧ）、を含むグルタミン、メチオニン、シスチン非含有高グルコースＤＭＥＭで培養した。培地を２日ごとに交換した。４日後、ヒドロゲルをホルマリンで固定し（３０分、室温）、その後ＰＢＳで３回（５分、室温）洗浄した。次に、細胞を、ＰＢＳ中のＨＣＳ Ｃｅｌｌ Ｍａｓｋ Ｂｌｕｅ染色（１：１０００、３０分、室温）で染色した。次いで、ヒドロゲルを、１％ＢＳＡで３回さらに洗浄した（１０分間、室温）。洗浄が完了したら、単官能性アジドをＰＢＳに１：５００の希釈率で加えた（４５分、室温）。再度、ヒドロゲルを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで３回洗浄し、硫酸銅溶液中のＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ６４７アジド染料をヒドロゲルに加えた（一晩、４℃）。翌日、ヒドロゲルをＰＢＳで３回洗浄し（１０分間、室温）、次いで画像化した。沈着タンパク質を、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０）を使用して画像化し、沈着タンパク質厚さを定量化した。要約すると、１μｍの細胞切片を包含するＺスライスの最大強度投影を、各チャネルに対して投影し、得られた投影を、Ｏｔｓｕの閾値処理を利用して二値化した。ＨＣＳ Ｃｅｌｌ Ｍａｓｋチャネルを新生タンパク質チャネルから差し引いて、分析される細胞の所定の１μｍ切片の細胞外側に分泌された新生タンパク質のみを示すマスクを得た。分泌されたタンパク質の厚さは、「ＢｏｎｅＪ」プラグイン（ＩｍａｇｅＪ）を使用して定量化し、各スライスの平均厚さならびに最大厚さを報告した。有意性を得るために、細胞ごとに合計５つのスライスを分析し、条件ごとに合計３０個の細胞を分析した。

統計分析。すべてのデータは、条件ごとに３つのヒドロゲルの複製を使用して収集した。各ヒドロゲルについて、少なくとも３０個の細胞を分析した。新生タンパク質沈着では、ヒドロゲルあたり３０個の細胞を分析し、細胞あたり５つのＺスライスを分析した。データは、一元配置ＡＮＯＶＡおよびテューキー事後比較またはスチューデントのｔ検定を使用して比較した。データは、平均値±標準偏差として提示する。

本明細書に開示され特許請求される組成物および方法はすべて、本開示に照らして過度の実験をすることなく作製し、実行することができる。組成物および方法を、好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物および方法および方法の工程または工程の順序に変形形態を適用し得ることは、当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも、どちらにも関連するある特定の薬剤が、同じかまたは類似の結果を達成する限り、本明細書に記載の薬剤の代わりになり得ることが明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似の代替物および改変はすべて、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であると見なされる。

Claims (29)

1. 脂肪族アルデヒドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とヒドラジドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とを含む第１のポリマー主鎖；および
   少なくとも１つの８アームポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含む第２のポリマー主鎖
   を含む、組成物であって、
   前記第１および第２のポリマー主鎖の組み合わせが、ハイブリッドネットワークヒドロゲルを生成する、組成物。
2. 前記少なくとも１つの８アームＰＥＧが、少なくとも１つのひずみシクロオクチンで官能化された少なくとも１つの８アームＰＥＧを含む、請求項１に記載の組成物。
3. 前記少なくとも１つのひずみシクロオクチンがビシクロノニンを含む、請求項２に記載の組成物。
4. 前記第２のポリマー主鎖が、少なくとも１つの８アームＰＥＧを含み；任意選択でベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドをさらに含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
5. 前記少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖、ＰＥＧマクロマー、またはそれらの組み合わせが、少なくとも１つのペプチドで修飾されている、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
6. 前記組成物が、前記第１のポリマー主鎖中において、脂肪族アルデヒドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖およびヒドラジドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖を含む前記ポリマー主鎖中に２５重量％の総架橋濃度；ならびに、少なくとも１つの８アームＰＥＧを含む前記第２のポリマー主鎖中に７５重量％の総架橋濃度を含む、請求項１に記載の組成物。
7. 前記組成物が、幹細胞をさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
8. 前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、皮膚幹細胞、および間葉系幹細胞のうちの１種または複数を含む、請求項７に記載の組成物。
9. 前記組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物に製剤化されている、請求項１～８のいずれか１項に記載の組成物。
10. 前記組成物が、対象への注射または注入用に製剤化される薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物に製剤化される、請求項９に記載の組成物。
11. 前記組成物が、健康状態を処置するために使用される少なくとも１種の活性薬剤をさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物。
12. 対象において少なくとも１か月後に分解する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組成物。
13. 前記少なくとも１種の活性薬剤が、前記組成物の分解前、分解後、または分解中に前記組成物から放出可能な活性薬剤を含む、請求項１１に記載の組成物。
14. ハイブリッドネットワークヒドロゲルを生成する方法であって、脂肪族アルデヒドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とヒドラジドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とを含む１つのポリマー主鎖を、少なくとも１つの８アームポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含む第２のポリマー主鎖と組み合わせる工程を含み、ヒドロゲル形成のために外部刺激を必要としない、方法。
15. 少なくとも１つの８アームＰＥＧを含む前記第２のポリマー主鎖が、ビシクロノニンで官能化された少なくとも１つの８アームＰＥＧを含む、請求項１４に記載の方法。
16. 少なくとも１つの８アームＰＥＧを含む前記第２のポリマー主鎖が、ベンズアルデヒド－ＰＥＧ３－アジドをさらに含む、請求項１４または１５に記載の方法。
17. 前記ハイブリッドネットワークヒドロゲルの応力緩和が、少なくとも１つの８アームＰＥＧを含む前記第２のポリマー主鎖の濃度の増加と、脂肪族アルデヒドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とヒドラジドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とを含む前記ポリマー主鎖の濃度の減少とを組み合わせることによって増大する、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記ハイブリッドネットワークヒドロゲルの応力緩和が、少なくとも１つの８アームＰＥＧを含む前記第２のポリマー主鎖の濃度の減少と、脂肪族アルデヒドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とヒドラジドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とを含む前記ポリマー主鎖の濃度の増加とを組み合わせることによって低減する、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記ハイブリッドネットワークヒドロゲルが、少なくとも１つの幹細胞をさらに含む、請求項１４～１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 少なくとも１つの幹細胞が前記ハイブリッドネットワークヒドロゲル中に存在する場合、前記少なくとも１つの幹細胞の遊走を増大させるために、前記ハイブリッドネットワークヒドロゲルの応力緩和を低減させる工程をさらに含む、請求項１８または１９に記載の方法。
21. 少なくとも１つの幹細胞が前記ハイブリッドネットワークヒドロゲル中に存在する場合、前記ハイブリッドネットワークヒドロゲルの応力緩和を低減させる工程、および前記少なくとも１つの幹細胞からの少なくとも１種の抗炎症性サイトカインの分泌を増加させる工程をさらに含む、請求項１８または１９に記載の方法。
22. 少なくとも１つの幹細胞が前記ハイブリッドネットワークヒドロゲル中に存在する場合、前記ハイブリッドネットワークヒドロゲルの応力緩和を増大させる工程、および前記少なくとも１つの幹細胞からの少なくとも１種の炎症誘発性サイトカインの分泌を増加させる工程をさらに含む、請求項１８または１９に記載の方法。
23. 少なくとも１つの幹細胞を含む前記ハイブリッドネットワークヒドロゲルの応力緩和を低減させる工程、および前記少なくとも１つの幹細胞の少なくとも１つの多核構造の形成を増大させる工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
24. 対象における健康状態を処置する、発症軽減する、進行軽減する、または予防する方法であって、請求項９～１３のいずれか１項に記載の組成物の治療有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。
25. 前記健康状態が、炎症状態、自己免疫状態、血管状態、整形外科状態、がん、形成手術、組織もしくは器官の外傷、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２４に記載の方法。
26. 前記組成物を投与する工程が、注射により投与する工程を含む、請求項２４または２５に記載の方法。
27. 投与する工程が、前記健康状態を有する前記対象の患部に直接投与する工程を含む、請求項２４に記載の方法。
28. 請求項１～１３のいずれか１項に記載の組成物と、少なくとも１つの容器とを含む、キット。
29. 脂肪族アルデヒドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とヒドラジドで官能化された少なくとも１つのヒアルロン酸主鎖とを含むポリマー主鎖；および少なくとも１つの８アームポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含む少なくとも１つの第２のポリマー主鎖を含む、請求項２８に記載のキット。

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