CN115737916A - 一种功能性多肽水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了及一种功能性多肽水凝胶及其制备方法和应用，由末端偶联生物活性片段的功能自组装多肽与自组装多肽共混得到。本发明通过固相合成技术在自组装多肽末端引入具有生物活性的短肽序列，所形成的功能性多肽水凝胶既能保证凝胶的力学性能，也能发挥生物活性片段的生理作用。功能性多肽水凝胶中纳米纤维表面的活性片段可以促进凝胶支架与细胞的相互作用，能支持细胞的黏附、增殖、分化，促进细胞外基质的分泌与累积，并维持细胞表型。本发明提供的功能性多肽水凝胶使用的多肽序列均使用固相合成法合成，方法成熟，成本较低，且重复性高。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种功能性多肽水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，水凝胶因其具有天然的亲水性、生理条件响应性以及结构的可设计性，使得水 凝胶材料在组织工程和再生医学等领域得到广泛应用。随着材料工程、聚合物科学和化学等 领域的长足进步已能够实现对水凝胶材料进行功能性的调控和商品化制备，相应的水凝胶材 料不仅可以弥补临床需求的空缺，且具有良好的成本效益。尤其在临床疾病治疗过程中对软 组织修复材料的巨大需求，使得制备用于生物组织再生的水凝胶基细胞支架具有巨大潜力和 价值。
水凝胶是一类具有亲水基团，能被水溶胀但不溶于水的具有三维网络结构的聚合物。按 照材料来源可以分为天然水凝胶和合成水凝胶，天然水凝胶通常来自多肽(如纤维蛋白、胶 原蛋白、明胶)或多糖(如透明质酸、纤维素、壳聚糖)，这些天然聚合物可以通过聚合物链 之间的物理相互作用形成凝胶，或在某些情况下通过多价离子交联形成水凝胶。天然水凝胶 的一个主要优势，是它们通常具有无与伦比的生物相容性和生物可降解性。而合成水凝胶(例 如聚乙二醇、聚丙烯酸酯衍生物、聚甲基丙烯酸酯衍生物、聚丙烯酰胺、乳酸-羟基乙酸共聚 物、聚乙烯醇)具有结构可设计性，通常可以满足材料应用中对性能的需求，包括凝胶的力 学性能及化学功能改性。水凝胶产品具有良好的粘弹性和溶胀性，在吸水溶胀后，能够继续 保持其原有的结构而不解聚，使其广泛运用到生物支架，生物载药等领域。
尽管水凝胶在各个领域的应用已取得显著的成果，但目前可用于体内软组织的再生修复 的产品尚不成熟，现有产品难以满足临床上对软组织修复材料的巨大需求。当前临床上使用 的软组织填充材料主要为高密度聚乙烯和自膨胀水凝胶，均不可吸收，易排斥、感染及移位； 而常用的可吸收材料如玻璃酸钠凝胶，降解速率快，无任何组织再生性。
多肽因为其特殊的化学结构，决定了其具有优良的生物相容性和生物可降解性。其中， 离子互补型多肽属于化学合成产物，在水溶液中可以通过分子间自组装形成纳米纤维，最后 在生理条件下(无机盐溶液/缓冲盐溶液/细胞培养液)能形成力学性能较好的凝胶，离子互补 型多肽作为一种新型的组织工程材料被广泛使用。然而，单纯的多肽水凝胶不具有显著的生 物活性功能，难以提高细胞的黏附、增殖和分化能力，诱导组织再生修复。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种功能性多肽水凝胶及其制备方法和应用，本发明 提供的含有生物活性片段的功能自组装多肽水凝胶能够促进凝胶支架对细胞的粘附和细胞基 质分泌，诱导体内软组织再生修复。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下方案：
本发明提供了一种功能性多肽水凝胶，制备方法为，由末端偶联生物活性片段的功能自 组装多肽与自组装多肽共混得到。
优选的，所述末端偶联生物活性片段的功能自组装多肽，由具有生物活性的短肽序列通 过固相合成偶联到自组装多肽序列的羧基端(C端)得到。
优选的，所述具有生物活性的短肽序列包括RGD肽序列。
优选的，所述具有生物活性的短肽序列的氨基端(N端)包括1、2或4个甘氨酸。
优选的，所述具有生物活性的短肽序列长度≤16个氨基酸残基。
优选的，所述自组装多肽序列包括由亲、疏水性氨基酸交替排列的基本结构单元组成的 离子互补型多肽序列，所述离子互补型多肽序列包括KAEA、RADA、REKD或RKDE系列多肽中的一种或几种。
优选的，所述自组装多肽序列的适宜长度包括12或16个氨基酸残基。
优选的，所述自组装多肽即使是相同的氨基酸组成、相同的序列长度，氨基酸排列可以 不同，电荷分布也可以不同。
本发明提供了上述技术方案所述的功能性多肽水凝胶用于制备软组织再生修复的材料。
本发明提供了一种功能性多肽水凝胶，由末端偶联生物活性片段的功能自组装多肽与自 组装多肽共混得到。与现有技术相比，本发明通过固相合成技术在自组装多肽末端引入具有 生物活性的短肽序列，所形成的功能性多肽水凝胶，既能保证凝胶的力学性能，也能发挥生 物活性片段的生理作用。功能性多肽水凝胶中纳米纤维表面的活性片段可以促进凝胶支架与 细胞的相互作用，能支持细胞的黏附、增殖、分化，促进细胞外基质的分泌与累积，并维持 细胞表型。本发明提供的功能性多肽水凝胶使用的多肽序列均使用固相合成法合成，方法成 熟，成本较低，且重复性高。
附图说明
图1为实施例制备路线示意图；
图2为实施例的功能性多肽水凝胶A的成胶过程；
图3为实施例的功能性多肽水凝胶A的可注射性能展示；
图4为实施例的KAEA16、KAEA16-RGD与KAEA16/KAEA16-RGD三种多肽的圆二色 谱；
图5为实施例的KAEA16、KAEA16-RGD与KAEA16/KAEA16-RGD三种多肽的透射电 子显微镜；
图6为实施例的KAEA16 1wt％、KAEA16/KAEA16-RGD 1wt％、KAEA16 3wt％、KAEA16/KAEA16-RGD 3wt％水凝胶的动态频率扫描曲线；
图7为实施例评估多肽水凝胶的细胞粘附性结果；
图8为实施例评估细胞内凋亡因子Caspase-3和炎症因子IL-6和MCP-1的结果；
图9为实施例4周后取裸鼠的重要脏器心、肝、脾、肺、肾HE染色结果；
图10为实施例CCK8实验评估KAEA16-RGD/KAEA16水凝胶上的脂肪间充质干细胞的增殖速度结果；
图11为实施例qPCR显示KAEA16-RGD/KAEA16对增殖标记物Ki-67结果；
图12为实施例qPCR显示KAEA16-RGD/KAEA16对成脂标志物Fabp4和Pparg的表达结果；
图13为实施例KAEA16-RGD/KAEA16促进脂肪间充质干细胞内脂滴的形成结果；
图14为实施例qPCR显示KAEA16-RGD/KAEA16促进骨髓间充质干细胞成骨标志物RUNX2和OCN的表达结果；
图15为实施例ALP染色实验显示KAEA16-RGD/KAEA16促进骨髓间充质干细胞成骨分化结果；
图16为实施例促进脂肪再生组织学油红染色结果；
图17为实施例促进脂肪再生HE染色结果；
图18为实施例促进脂肪再生Masson染色结果。
具体实施方式
本发明提供了一种功能性多肽水凝胶，由末端偶联生物活性片段的功能自组装多肽与自 组装多肽共混得到。
在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。
在本发明中，所述末端偶联生物活性片段的功能自组装多肽，由具有生物活性的短肽序 列通过固相合成偶联到自组装多肽序列的羧基端(C端)得到。
在本发明中，所述自组装多肽序列包括由亲、疏水性氨基酸交替排列的基本结构单元组 成的离子互补型多肽序列，所述离子互补型多肽序列包括KAEA、RADA、REKD或RKDE系列多肽中的一种或几种。在本发明中，所述自组装多肽序列的适宜长度包括12或16个氨基酸残基。在本发明中，所述自组装多肽即使是相同的氨基酸组成、相同的序列长度，氨基酸排列可以不同，电荷分布也可以不同。
在本发明中，所述具有生物活性的短肽序列包括RGD肽序列。在本发明中，所述具有生 物活性的短肽序列的氨基端(N端)包括1、2或4个甘氨酸。在本发明中，所述具有生物活 性的短肽序列长度≤16个氨基酸残基，更优选为4～12个氨基酸残基。
在本发明中，所述功能性多肽水凝胶的制备方法，优选包括以下步骤：将末端偶联生物 活性片段的功能自组装多肽与自组装多肽各自溶解于去离子水中，将两种多肽溶液按照质量 比1:1混合进行自组装，得到具有生物活性的功能性多肽水凝胶。
在本发明中，所述末端偶联生物活性片段的功能自组装多肽与自组装多肽优选委托南京 肽业生物科技有限公司合成。
在本发明中，所述末端偶联生物活性片段的功能自组装多肽与自组装多肽共混时，功能 自组装多肽的质量与去离子水的体积之比优选为10～100g：1L，更优选为10～50g：1L， 进一步优选为10～30g：1L。自组装多肽的质量与去离子水的体积之比优选为10～100g：1L， 更优选为10～50g：1L，进一步优选为10～30g：1L。
本发明对于所述混合的方式没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可，具体如搅拌混合。 在本发明的具体实施例中，所述混合的顺序优选为将末端偶联生物活性片段的功能自组装多 肽与自组装多肽各自溶解于去离子水中，将两种多肽溶液按照体积比1:1混合。
在本发明中，所述孵育的温度优选为室温，所述孵育的时间优选为0.5～60min，更优选 为0.5～10min，进一步优选为5～10min。在本发明中，所述孵育过程中，末端偶联生物活性 片段的功能自组装多肽与自组装多肽进行自组装。
本发明提供了上述技术方案所述的功能性多肽水凝胶在各类疾病治疗过程中对软组织再 生修复的应用。
与现有技术相比，本发明通过固相合成技术在自组装多肽末端引入具有生物活性的短肽 序列，所形成的功能性多肽水凝胶，既能保证凝胶的力学性能，也能发挥生物活性片段的生 理作用。功能性多肽水凝胶中纳米纤维表面的活性片段可以促进凝胶支架与细胞的相互作用， 能支持细胞的黏附、增殖、分化，促进细胞外基质的分泌与累积，并维持细胞表型。本发明 提供的功能性多肽水凝胶使用的多肽序列均使用固相合成法合成，方法成熟，成本较低，且 重复性高。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明 保护的范围。
实施例
本实施例的功能性多肽水凝胶A的制备路线如图1所示，具体步骤如下：
1.1自组装多肽(多肽1，KAEA16)的合成
该多肽由南京肽业生物科技有限公司代为合成，其中，KAEA16多肽序列为： Ac-KAEAKAEAKAEAKAEA-NH 2。
1.2末端偶联生物活性片段的功能自组装多肽(多肽2，KAEA16-RGD)的合成
该多肽由南京肽业生物科技有限公司代为合成，其中，KAEA16-RGD多肽序列为：Ac-(KAEA) 4GPRGDSGYRGDS-NH 2。
1.3功能性多肽水凝胶A(简称为KAEA16/KAEA16-RGD)的制备
将多肽KAEA16和KAEA16-RGD按照质量浓度3wt％各自溶解于100uL去离子水中，将两种多肽溶液等比例混合后，加入40μL的DMEM培养液，充分混匀后观察溶液成胶过程。
功能性多肽水凝胶A的成胶过程如图2所示，由图2可知，在DMEM培养液中，KAEA16/KAEA16-RGD混合肽溶液可在30s内形成水凝胶，满足水凝胶注射入人体后需要快速成胶的特性。
功能性多肽水凝胶A的可注射性能如图3所示，由图3可知，功能性多肽水凝胶可以顺 利的从注射器针头中注射出来并且迅速恢复凝胶状态。
KAEA16、KAEA16-RGD与KAEA16/KAEA16-RGD三种多肽的圆二色谱如图4所示， 由图4可知，三种样品KAEA16、功能化肽KAEA16-RGD和功能化自组装肽混合溶液 KAEA16/KAEA16-RGD均表现出典型的β-折叠结构谱图。KAEA16/KAEA16-RGD混合溶液 的正负峰值与纯KAEA16相差不大，说明KAEA16/KAEA16-RGD混合溶液中β-折叠的含量 与纯KAEA16中的β-折叠含量相当，KAEA16/KAEA16-RGD具有良好的自组装性。
KAEA16、KAEA16-RGD与KAEA16/KAEA16-RGD三种多肽的透射电子显微镜如图5 所示，由图5可知，KAEA16/KAEA16-RGD混合肽溶液形成了均匀的长纳米纤维(图c)， 且对比图a可以发现，混合肽组装的纳米纤维直径比纯KAEA16多肽组装的纳米纤维大， KAEA16、KAEA16-RGD与KAEA16/KAEA16-RGD三种多肽的直径范围分别为(6-10nm)、 (6-15nm)和(6-20nm)，不同多肽的纤维直径与多肽中氨基酸数量相符。
KAEA16 1wt％、KAEA16/KAEA16-RGD 1wt％、KAEA16 3wt％、KAEA16/KAEA16-RGD3wt％水凝胶的动态频率扫描曲线如图6所示，由图6可知，相同浓度的KAEA16和 KAEA16/KAEA16-RGD的G’与G”值相近，表明，功能性多肽的加入对其力学性能的影响不 大。相比较而言，KAEA16 3％与KAEA16/KAEA16-RGD 3％凝胶的G’明显高于KAEA16 1％、 KAEA16/KAEA16-RGD 1％凝胶的G’，具有更好的力学性能。且该水凝胶体系可以通过调节 固含量的方法来直接调控水凝胶力学强度的高低，储能模量随着固含量的升高而升高，且最 低成胶浓度可以低至1％，表明最大含水量可以高达99％。
测试例
(1)细胞安全性评价实验
将脐静脉内皮细胞分别培养于1％和2％的KAEA16和KAEA16-RGD/KAEA16多肽水凝胶上，在37℃、5％CO 2条件下培养72小时后，评估多肽水凝胶的细胞粘附性，结果如图7 所示。由图7可知，脐静脉内皮细胞在KAEA16-RGD/KAEA16水凝胶上呈现较好的细胞粘 附性。
将间充质干细胞培养于1％ KAEA16-RGD/KAEA16多肽水凝胶上，在37℃、5％CO 2条 件下培养72小时后，评估细胞内凋亡因子Caspase-3和炎症因子IL-6和MCP-1的表达，结果如图8所示。由图8可知，Caspase-3、IL-6和MCP-1的表达量相较于空白组细胞未见显著性变化，表明KAEA16-RGD/KAEA16多肽水凝胶A的细胞相容性良好。
将KAEA16-RGD/KAEA16水凝胶复合脂肪间充质干细胞，注射于裸鼠皮下用于脂肪组 织再生，4周后取裸鼠的重要脏器心、肝、脾、肺、肾进行HE染色，结果如图9所示。由图 9可知，各器官组织未见明显毒性，表明多肽水凝胶KAEA16-RGD/KAEA16具有良好的体内 生物相容性。
(2)生物功能评价实验
将间充质干细胞培养于1％ KAEA16-RGD/KAEA16多肽水凝胶上，在37℃、5％CO 2条 件下培养72小时后，评估细胞增殖速度变化，结果如图10和11所示。由图10可知，CCK8实验显示培养于KAEA16-RGD/KAEA16水凝胶上的脂肪间充质干细胞的增殖速度明显变快。由图11可知，qPCR结果显示KAEA16-RGD/KAEA16对增殖标记物Ki-67的表达有显著促 进作用。综上所述，KAEA16-RGD/KAEA16水凝胶可以有效提升脂肪间充质干细胞的增殖能 力。
将间充质干细胞培养于1％ KAEA16-RGD/KAEA16多肽水凝胶上，在37℃、5％CO 2条 件下培养72小时后，评估细胞成脂过程，结果如图12和13所示。由图12可知，qPCR结果显示KAEA16-RGD/KAEA16对成脂标志物Fabp4和Pparg的表达有显著促进作用。由图13 油红染色结果显示，KAEA16-RGD/KAEA16可以促进脂肪间充质干细胞内脂滴的形成。
将骨髓间充质干细胞培养于1％ KAEA16-RGD/KAEA16多肽水凝胶上，在37℃、5％CO 2 条件下培养72小时后，评估细胞成骨分化过程，结果如图14和15所示。由图14可知，qPCR 结果显示，KAEA16-RGD/KAEA16能够促进骨髓间充质干细胞成骨标志物RUNX2和OCN的表达。由图15ALP染色实验可知，KAEA16-RGD/KAEA16可以促进骨髓间充质干细胞成 骨分化。
将KAEA16-RGD/KAEA16水凝胶复合脂肪间充质干细胞注射到裸鼠皮下，与注射PBS对照组对比，评估体内脂肪组织再生过程，结果如图16、17和18所示。由图16、17和18 可知，组织学油红染色、HE和Masson染色均可见KAEA16-RGD/KAEA16组显著促进脂肪 再生。
Claims (10)
1.一种功能性多肽水凝胶的制备方法，其特征在于，由末端偶联生物活性片段的功能自 组装多肽与自组装多肽共混得到。
2.根据权利要求1所述的功能性多肽水凝胶的制备方法，其特征在于，所述末端偶联生物 活性片段的功能自组装多肽，由具有生物活性的短肽序列通过固相合成偶联到自组装多肽序 列的羧基端即C端得到。
3.根据权利要求2所述的功能性多肽水凝胶的制备方法，其特征在于，所述具有生物活性的短肽序列包括RGD肽序列。
4.根据权利要求2所述的功能性多肽水凝胶的制备方法，其特征在于，所述具有生物活性的短肽序列的氨基端即N端包括1、2或4个甘氨酸。
5.根据权利要求2所述的功能性多肽水凝胶，其特征在于，所述具有生物活性的短肽序列长度≤16个氨基酸残基。
6.根据权利要求1或2所述的功能性多肽水凝胶的制备方法，其特征在于，所述自组装多肽序列包括由亲、疏水性氨基酸交替排列的基本结构单元组成的离子互补型多肽序列，所 述离子互补型多肽序列包括KAEA、RADA、REKD或RKDE系列多肽中的一种或几种。
7.根据权利要求1或2所述的功能性多肽水凝胶的制备方法，其特征在于，所述自组装多肽序列的适宜长度包括12或16个氨基酸残基。
8.根据权利要求1或2所述的功能性多肽水凝胶的制备方法，其特征在于，所述自组装多肽即使是相同的氨基酸组成、相同的序列长度，氨基酸排列相同或者不同，电荷分布相同或者不同。
9.一种功能性多肽水凝胶，其特征在于，由权利要求1到8任一项所述的制备方法所得。
10.权利要求1到8任一项所述的功能性多肽水凝胶的应用，其特征在于，用于制备软组织再生修复材料。
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Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2530482A1 (en) * | 2003-06-25 | 2005-02-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Self-assembling peptides incorporating modifications and methods of use thereof |
| US20120014925A1 (en) * | 2010-07-16 | 2012-01-19 | Yoshiyuki Kumada | Self-Assembling Peptides Incorporating Modifications and Methods of Use Thereof |
| CN104356402A (zh) * | 2014-10-10 | 2015-02-18 | 孙念峰 | 功能性自组装纳米多肽水凝胶 |
| CN110330568A (zh) * | 2019-07-23 | 2019-10-15 | 西南交通大学 | 功能化和活性自组装多肽、水凝胶、制备方法、应用和生物支架 |
| CN110396124A (zh) * | 2019-08-21 | 2019-11-01 | 上海交通大学 | 自组装多肽及其作为止血剂的用途 |
| CN110665014A (zh) * | 2019-10-15 | 2020-01-10 | 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 | 一种双模式成像功能的稀土mof纳米颗粒的制备方法 |
| WO2022211624A1 (en) * | 2021-03-30 | 2022-10-06 | Rijksuniversiteit Groningen | Tailor-made functionalized self-assembled peptide (nano)fibers and hydrogels, and methods, uses and kits related thereto |
-
2022
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Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2530482A1 (en) * | 2003-06-25 | 2005-02-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Self-assembling peptides incorporating modifications and methods of use thereof |
| US20120014925A1 (en) * | 2010-07-16 | 2012-01-19 | Yoshiyuki Kumada | Self-Assembling Peptides Incorporating Modifications and Methods of Use Thereof |
| CN104356402A (zh) * | 2014-10-10 | 2015-02-18 | 孙念峰 | 功能性自组装纳米多肽水凝胶 |
| CN110330568A (zh) * | 2019-07-23 | 2019-10-15 | 西南交通大学 | 功能化和活性自组装多肽、水凝胶、制备方法、应用和生物支架 |
| CN110396124A (zh) * | 2019-08-21 | 2019-11-01 | 上海交通大学 | 自组装多肽及其作为止血剂的用途 |
| CN110665014A (zh) * | 2019-10-15 | 2020-01-10 | 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 | 一种双模式成像功能的稀土mof纳米颗粒的制备方法 |
| WO2022211624A1 (en) * | 2021-03-30 | 2022-10-06 | Rijksuniversiteit Groningen | Tailor-made functionalized self-assembled peptide (nano)fibers and hydrogels, and methods, uses and kits related thereto |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 杨莎莎;卫思丽;毛芸;郑晗雪;冯娟涛;王文君;李红民;: "RADA-16的研究进展", 基因组学与应用生物学, no. 02 * |
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