CN110330568A - 功能化和活性自组装多肽、水凝胶、制备方法、应用和生物支架 - Google Patents

功能化和活性自组装多肽、水凝胶、制备方法、应用和生物支架 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物材料领域，且特别涉及一种功能化和活性自组装多肽、水凝胶、制备方法、应用和生物支架。功能化自组装多肽包括活性肽和自组装多肽，所述活性肽通过至少一个甘氨酸接枝到自组装多肽上。其能够催化释放一氧化氮和促进内膜修复并具有良好地生物相容性，可以用于血管支架表面改性。

Description

功能化和活性自组装多肽、水凝胶、制备方法、应用和生物 支架
技术领域
本发明涉及生物材料领域，且特别涉及一种功能化和活性自组装多肽、水凝胶、制备方法、应用和生物支架。
背景技术
心血管支架在植入血管后会损伤血管内皮细胞，造成内皮细胞功能紊乱，导致内皮化延迟和不完全，血管支架植入后会导致晚期血栓和再狭窄。内皮化延迟和内皮化不完全是血管支架材料面临的一大难题。一氧化氮(NO)是人体中一种重要的信号分子，在心血管系统中发挥着极其重要的生物学功能，多年的研究表明，合适浓度NO能够促进内皮细胞的生长和迁移，保护血管内皮细胞避免氧化应激毒性，从而促进内膜修复。而传统NO供体型材料主要通过制备高分子涂层装载可以释放NO分子的物质，在血液环境中，持续释放NO达到抗凝血的目的。然而这种NO释放型模式，会带来释放速率过快，初期释放量过大，持续时间过短引起相应的血液病理状况及抗凝血时效受限等问题，这也限制了其在抗凝血方面的应用。通过在材料表面引入具有催化活性的小分子或离子，如硒代胱氨酸或铜离子，能够原位催化内源性NO供体分解释放NO。虽然此类构建方法能在一定程度上克服NO供体型材料的不足但仍然存在新的问题，如构建的表面与血液接触一定时间后将被血浆蛋白和细胞覆盖而失去功能，材料表面的内皮细胞相容性仍然不足等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种功能化自组装多肽，其可以用于血管支架表面改性，能够持续催化释放一氧化氮和促进内膜修复。
本发明的另一目的在于提供一种活性自组装多肽，其能够络合铜离子，继而能够有效促进一氧化氮供体分解，有良好地生物相容性，并能够促进内膜修复。
本发明的另一目的在于提供一种活性自组装多肽的制备方法，该方法操作简单。
本发明的另一目的在于提供一种活性自组装多肽水凝胶，其能够催化释放一氧化氮和促进内膜修复。
本发明的另一目的在于提供一种活性自组装多肽水凝胶的制备方法，该方法成本低廉，便于实施操作。
本发明的另一目的在于提供活性自组装多肽或功能化自组装多肽的应用，能够进一步扩大活性自组装多肽的应用范围。
本发明的另一目的在于提供一种生物支架，其具有良好的生物相容性，且具有能够催化释放一氧化氮和促进内膜修复。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：
本发明提出一种功能化自组装多肽，其能够催化释放一氧化氮和促进内膜修复，其包括活性肽和自组装多肽，所述活性肽通过至少一个甘氨酸接枝到自组装多肽上。
本发明还提供一种活性自组装多肽，其为铜离子与上述的功能化自组装多肽的金属络合物。
本发明还提供一种活性自组装多肽的制备方法，将铜离子与所述功能化自组装多肽按照摩尔比为1：1-5的比例混合后静置，得到所述活性自组装多肽。
本发明还提供一种活性自组装多肽水凝胶，其是由包括上述活性自组装多肽的原料制得的。
本发明还提供一种活性自组装多肽水凝胶的制备方法，包括以下步骤：将包括上述的活性自组装多肽的肽溶液制成水凝胶。
本发明还提供上述功能化自组装多肽或者活性自组装多肽在制备生物支架中的应用。
本发明还提供一种生物支架，其包括上述活性自组装多肽。
本发明的有益效果是：本发明的功能化自组装多肽通过铜肽的两个甘氨酸将铜肽接枝到自组装多肽上，且具有促进组织损伤修复、血管生成等作用。
活性自组装多肽采用自组装多肽螯合铜离子，形成的水凝胶材料具有优异的原位催化释放NO的能力，通过控制加入的铜离子的量可以控制NO的释放量，且成分为由氨基酸，与传统的材料相比具有优异的生物相容性，降解产物无毒副作用。本发明形成的水凝胶具有仿细胞外基质结构，能够促进细胞的粘附与增值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1和对比例1的水凝胶的结构示意图；
图2为实施例1的功能化自组装多肽的质谱图；
图3为实施例1的功能化自组装多肽的高效液相色谱图；
图4为实施例1的活性自组装多肽水凝胶和对比例1的水凝胶的TEM图；
图5为实验例2的检测结果图；
图6为实验例1的检测结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的功能化和活性自组装多肽、水凝胶、制备方法、应用和生物支架进行具体说明。
自组装多肽通过亲疏水作用、静电作用、π-π堆积等可以自组装形成纳米纤维，纤维相互交错，形成纳米纤维网络结构，这种结构与天然细胞外基质结构类似，调节pH后还可以进一步形成高含水量的水凝胶。因此自组装多肽形成的纳米纤维结构能够促进细胞的生长和迁移，且它的成分为氨基酸，具有良好的细胞相容性。这种自组装多肽具有可设计性，在自组装多肽的基础上，利用现有的肽的固相合成技术，可以在自组装多肽的羧基端接枝具有特定功能的短肽，从而到达某种特定功能，例如在自组装多肽的羧基端接枝与内皮细胞特异性识别的序列REDV，可以选择性的促进内皮细胞的粘附与增值。因此自组装多肽不仅可以模拟天然细胞外基质的结构，还可以接枝一些短肽来模拟天然细胞外基质的功能。
鉴于此，本发明中选用的自组装多肽与活性肽进行接枝，得到可以促进一氧化氮释放并具有组织修复功效的功能化自组装多肽。
具体地，该功能化自组装多肽包括活性肽和自组装多肽，所述活性肽通过至少一个甘氨酸接枝到自组装多肽上。具体地，活性肽通过两个甘氨酸接枝到自组装多肽上，且优选地，活性肽为GHK。其中，铜肽(GHK)为活性短肽，GHK与铜离子有很好的亲和力，GHK与铜离子络合后能催化释放NO、抗氧化等作用。
本发明在自组装多肽的羧基端接枝短肽GHK，GHK可以螯合铜离子催化人内源NO性供体释放NO，保护血管内皮细胞避免氧化应激毒性，在一定浓度范围可以促进血管内皮细胞增殖。
本发明通过两个甘氨酸将铜肽(GHK)接枝到自组装多肽上，使得形成的功能化自组装多肽具有催化释放一氧化氮和促进内膜修复的功效。
进一步地，自组装多肽为离子互补型自组装多肽，优选为RADA16-1。采用该自组装多肽能够保证铜肽的接枝作用，继而保证功能化自组装多肽的效果。
需要说明的是，本发明实施例记载的自组装多肽除了采用RADA16-1，还可以采用RADA16-11、EAK16-1、EAK16-11、EFK8、KLD12、RADA16-GG-GHK、RADA16-GG-RGD、RADA16-GG-PRG、RADA16-GG-YIG、RADA16-GG-IKVAV等离子互补型自组装多肽，或者是可以采用A6KpH4、H2V6pH4、V6K2pH7、L6K2pH7、V6K2pH4等两亲性多肽。
进一步优选地，该功能化自组装多肽为RADA16-1-GG-GHK。
本发明提供一种功能化自组装多肽通过现有的固相合成法制备得到。
本发明实施例还提供一种活性自组装多肽，其为铜离子与上述的功能化自组装多肽的金属络合物。
本申请还提供一种活性自组装多肽的制备方法，包括以下步骤：
将铜离子和所述功能化自组装多肽按照摩尔比为1：1-5的比例混合后静置，得到上述活性自组装多肽。
优选，铜离子和功能化自组装多肽的摩尔比为1:2.5-3.5；
优选地，静置时间为3-24h。
进行静置能够进一步保证铜离子与功能化自组装多肽作用，而铜离子和功能化自组装多肽采用上述比例，能够进一步保证活性自组装多肽的活性，保证其催化释放NO效果。
进一步地，本发明还提供一种活性自组装多肽水凝胶，其是由包括上述活性自组装多肽的原料制得的。本发明实施例采用自组装多肽螯合铜离子，形成的水凝胶材料具有优异的原位催化释放NO的能力，通过控制加入的铜离子的量可以控制NO的释放量，且多肽由氨基酸缩合而成，与传统的材料相比具有优异的生物相容性，降解产物无毒副作用。本发明形成的水凝胶具有仿细胞外基质结构，能够促进细胞的粘附与增值，本发明也为材料表面改性提供了一种新思路。
进一步地，本发明还提供一种活性自组装多肽水凝胶的制备方法，将包括上述活性自组装多肽的肽溶液制成水凝胶；
优选地，所述肽溶液中还包括自组装多肽；
优选地，在所述肽溶液中的所述活性自组装多肽和所述自组装多肽的体积比为0.5-5:9；
将所述肽溶液与PBS溶液混合，随后静置，制得所述活性自组装多肽水凝胶；
优选地，所述PBS溶液的pH值为5-9。
由于接枝铜肽后的自组装多肽自组装不能形成纳米纤维，因此，在制备该活性自组装多肽水凝胶时需要添加自组装多肽，才能有效地形成纳米纤维水凝胶。
具体地，将自组装多肽与的活性自组装多肽分别与水进行混合溶解得到母液，其中，自组装多肽的母液的浓度为2-10mg/ml，活性自组装多肽的母液的浓度为2-10mg/ml。
而后将自组装多肽的母液与活性自组装多肽的母液混合，且功能化自组装多肽和自组装多肽按照的体积比为0.5-5：9的比例进行混合形成肽溶液。且混合均匀再与PBS混合均匀，而后静置1-8小时，保证各个物质能够充分作用。
本发明还提供上述功能化自组装多肽或活性自组装多肽在制备生物支架中的应用。能够进一步扩大功能化自组装多肽的应用范围。
本发明还提供一种生物支架，其包括上述的活性自组装多肽，该活性自组装多肽设置于支架的表面，继而能够促进一氧化氮的释放，提升支架的生物相容性，且能够起到修复内膜的功效。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种功能化自组装多肽(编号为R-GHK)，结构为RADA16-1-GG-GHK，其是通过两个甘氨酸将铜肽接枝到RADA16-1上得到。本实施例的R-GHK是发明人委托上海波泰生物科技有限公司制备得到。
本实施例还提供一种活性自组装多肽(编号R-GHK-Cu)，其为铜离子与上述的功能化自组装多肽的金属络合物，结构为RADA16-1-GG-GHK-Cu。
本实施例还提供一种R-GHK-Cu的制备方法，具体地，将铜离子和所述功能化自组装多肽按照摩尔比为1：1的比例混合后，静置4h，得到的该活性自组装多肽。
本实施例还提供一种活性自组装多肽水凝胶，其是由包括上述功能化自组装多肽的原料制得的。
本实施例还提供一种活性自组装多肽水凝胶的制备方法，将RADA16-1与本实施例的功能化自组装多肽分别与水进行混合溶解得到母液，RADA16-1的母液的浓度为2mg/ml，功能化自组装多肽的母液的浓度为2mg/ml。
而后将RADA16-1的母液与本实施例的功能化自组装多肽的母液进行混合形成混合溶液，混合溶液中RADA16-1与本实施例的功能化自组装多肽的体积比为9:0.5，而后再将50μL混合溶液与50μl PBS溶液(pH值为8.5)混合均匀，而后静置4小时。
本实施例还提供一种生物支架表面改性，其包括上述活性自组装多肽。将上述的功能化自组装多肽涂布于支架表面。
实施例2-10
实施例2-10提供的功能化自组装多肽与实施例1提供的功能化自组装多肽的结构相同。且实施例2-10提供的活性自组装多肽与实施例1提供的活性自组装多肽的结构相同，区别在于具体操作条件不同。且实施例2-10提供的活性自组装多肽水凝胶的制备方法与实施例1提供的活性自组装多肽水凝胶的制备方法的操作相同，区别在于具体地操作条件不同。
实施例2
活性自组装多肽的制备：铜离子和功能化自组装多肽的摩尔比为1:2，静置时间为5小时。
活性自组装多肽水凝胶的制备方法：活性自组装多肽的母液的浓度和自组装多肽的浓度均为10mg/ml，活性自组装多肽和自组装多肽的体积比为1:9，静置时间为1小时，肽溶液与PBS的体积比为1:1，PBS的pH为5。
实施例3
活性自组装多肽：铜离子和功能化自组装多肽的摩尔比为1:1，静置时间为3小时。
活性自组装多肽水凝胶的制备方法：活性自组装多肽的母液的浓度和自组装多肽的浓度均为8mg/ml，活性自组装多肽和自组装多肽的体积比为2:9，静置时间为8小时，PBS的pH为9。
实施例4
活性自组装多肽：铜离子和功能化自组装多肽的摩尔比为1:3，静置时间为7h。
活性自组装多肽水凝胶的制备方法：活性自组装多肽的母液的浓度和自组装多肽的浓度均为5mg/ml，活性自组装多肽和自组装多肽的体积比为4:9，静置时间为4小时，PBS的pH为8.5。
实施例5
活性自组装多肽：铜离子和功能化自组装多肽的摩尔比为1:5，静置时间为6h。
活性自组装多肽水凝胶的制备方法：活性自组装多肽的母液的浓度和自组装多肽的浓度均为9mg/ml，活性自组装多肽和自组装多肽的体积比为5:9，静置时间为4小时，PBS的pH为8.5。
实施例6
活性自组装多肽：铜离子和功能化自组装多肽的摩尔比为1:4，静置时间为10h。
活性自组装多肽水凝胶的制备方法：活性自组装多肽的母液的浓度和自组装多肽的浓度均为3mg/ml，活性自组装多肽和自组装多肽的体积比为3:9，静置时间为4小时，PBS的pH为7。
实施例7
活性自组装多肽：铜离子和功能化自组装多肽的摩尔比为1:2，静置时间为12h。
活性自组装多肽水凝胶的制备方法：活性自组装多肽的母液的浓度和自组装多肽的浓度均为4mg/ml，活性自组装多肽和自组装多肽的体积比为4.5:9，静置时间为5小时，PBS的pH为8.5。
实施例8
活性自组装多肽：铜离子和功能化自组装多肽的摩尔比为1:2.5，静置时间为24h。
活性自组装多肽水凝胶的制备方法：活性自组装多肽的母液的浓度和自组装多肽的浓度均为10mg/ml，活性自组装多肽和自组装多肽的体积比为4.5:9，静置时间为6小时，PBS的pH为6.5。
实施例9
活性自组装多肽：铜离子和功能化自组装多肽的摩尔比为1:4，静置时间为18h。
活性自组装多肽水凝胶的制备方法：活性自组装多肽的母液的浓度和自组装多肽的浓度均为9mg/ml，活性自组装多肽和自组装多肽的体积比为3.5:9，静置时间为5小时，PBS的pH为7.5。
实施例10
活性自组装多肽：铜离子和功能化自组装多肽的摩尔比为1:3.5，静置时间为20h。
活性自组装多肽水凝胶的制备方法：活性自组装多肽的母液的浓度和自组装多肽的浓度均为8.5mg/ml，活性自组装多肽和自组装多肽的体积比为2.5:9，静置时间为4小时，PBS的pH为5.5。
对比例1:将RADA16-1粉末50mg，用水配置成10mg/ml的母液。而后取上述RADA溶液150μl于玻璃瓶内，再取50μlPBS于玻璃瓶内，与RADA混合均匀，静置4小时，得到RADA16水凝胶。
对对比例1和实施例1的活性自组装多肽水凝胶进行拍照，具体结果参见图1，图1中的左侧为实施例1的活性自组装多肽水凝胶，图1中的右侧为对比例1的水凝胶，通过图1可知，活性自组装多肽水凝胶制备成功。
同时对实施例1的功能化自组装多肽进行表征，具体参加图2-图3。图2为功能化自组装多肽的质谱图，图3为功能化自组装多肽的高效液相分析图；图4为对比例1和功能化自组装多肽的TEM图。
实验例1：
分别将对比例1和实施例1的活性自组装多肽水凝胶转移到48孔板内，但因形成水凝胶后凝胶为酸性，不适合细胞的生长，需要在凝胶表面加500PμlPBS，静置3-5分钟，吸走表面的PBS，重复加3次PBS，以平衡其PH。用胰酶把内皮细胞培养瓶内的细胞消化下来，计算细胞密度，把细胞密度调节为8000/ml，每个孔加200微升的细胞悬浮液，培养24小时，进行细胞染色、拍照。检测结果参见图6。
根据图6可知，实施例1的活性自组装多肽水凝胶组内皮细胞的生长状态要更好，内皮细胞铺展的面积更大，内皮细胞的数量也更多。
实验例2：对催化释放一氧化氮进行检测
将RADA16-1与实施例1的活性自组装多肽R-GHK-Cu以一定的比例混合按照实施例1提供的活性自组装多肽水凝胶的制备方法制备活性自组装多肽水凝胶，RADA16-1与R-GHK-Cu总量为200微升保持不变，通过改变R-GHK-Cu的含量形成不同的样品，加入50微升PBS触发形成水凝胶，R-GHK-Cu质量添加量为5％。用Sievers280i仪器测试水凝胶催化，结果参见图5。
根据图5可知，含量为5％的R-GHK-Cu具有催化释放NO的能力。正常内皮细胞释放NO的量为0.5-4ⅹ10-10mol/cm2.min，样品5％的NO释放量为2.3ⅹ10-10mol/cm2.min，有利于内皮细胞的生长与粘附。
综上所述，本发明的功能化自组装多肽通过铜肽的两个甘氨酸将铜肽接枝到自组装多肽上，继而使得功能化自组装多肽能够催化促进一氧化氮的释放，且具有促进内膜修复、血管内皮细胞生长等作用。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种功能化自组装多肽，其特征在于，包括活性肽和自组装多肽，所述活性肽通过至少一个甘氨酸接枝到自组装多肽上；
优选地，所述活性肽通过两个甘氨酸接枝到自组装多肽上；
优选地，所述活性肽为GHK。
2.根据权利要求1所述的功能化自组装多肽，其特征在于，所述自组装多肽为离子互补型自组装多肽。
3.根据权利要求2所述的功能化自组装多肽，其特征在于，所述离子互补型自组装多肽为RADA16-1；
优选地，所述功能化自组装多肽为RADA16-1-GG-GHK。
4.一种活性自组装多肽，其特征在于，其为铜离子与权利要求1至3任一所述的功能化自组装多肽的络合物。
5.一种权利要求4所述的活性自组装多肽的制备方法，其特征在于，将铜离子与所述功能化自组装多肽按照摩尔比为1：1-5的比例混合后静置，得到所述活性自组装多肽。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述铜离子和所述功能化自组装多肽的摩尔比为1:2.5-3.5；
优选地，静置时间为3-24h。
7.一种活性自组装多肽水凝胶，其特征在于，其是由包括权利要求4所述的活性自组装多肽的原料制得的。
8.一种活性自组装多肽水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将包括权利要求4所述的活性自组装多肽的肽溶液制成水凝胶；
优选地，所述肽溶液中还包括自组装多肽；
优选地，在所述肽溶液中的所述活性自组装多肽和所述自组装多肽的体积比为0.5-5:9；
优选地，所述制备方法包括：将所述肽溶液与PBS溶液混合，随后静置，制得所述活性自组装多肽水凝胶；
优选地，所述PBS溶液的pH值为5-8。
9.权利要求1至3任一所述的功能化自组装多肽或权利要求4所述的活性自组装多肽在制备生物支架中的应用。
10.一种生物支架，其特征在于，其包括权利要求4所述的活性自组装多肽。
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