CN105504069A - 促进成骨细胞黏附和成骨分化的融合肽及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种促进成骨细胞黏附和成骨分化的融合肽及制备方法和应用，所述融合肽包含RADA16-I肽和偶联于RADA16-I肽序列的C端的osteostatin肽(TRSAW)；其中所述RADA16-I肽的氨基酸序列为SEQ？ID？NO:1。本发明还提供了一种含有上述融合肽的药物组合物。本发明的融合肽不仅能够促进MC3T3-E1骨细胞黏附、增殖，同时还能促进成骨分化，具有良好的应用前景。

Description

促进成骨细胞黏附和成骨分化的融合肽及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物学和医学领域，具体地，本发明涉及一种能促进成骨相关细胞黏附及成骨分化的新型多肽及其应用。
背景技术
骨移植是修复脊柱融合、骨损伤和骨肿瘤等原因造成的骨缺损的常用临床治疗方法。自体骨移植一直以来被作为骨移植的金标准，但由于存在取材有限、术区疼痛、增加出血感染风险等原因限制了其在临床上的应用。科学家们一直试图寻找各种具有骨传导性、成骨活性和骨诱导性的替代材料。目前，多种合成骨替代材料已经被运用于临床，如羟基磷灰石、陶瓷材料等，但是合成骨替代材料存在不利于细胞黏附以及生物相容性差等缺点。为了解决上述的问题，需要新的材料来对其表面进行修饰或是替换，水凝胶材料是很好的选择。
RADA16-I(AcN-RADARADARADARADA-CONH2)由16肽氨基酸组成，是自组装多肽水凝胶的代表，首先由ZhangS等于1993年报道，其能在水相离子或生理盐溶液触发下，分子水平组装成β折叠，并往复形成互补离子键，最终组装成纳米纤维，其纤维直径10-20nm，孔径5-200nm，含水量大于99％。研究表明，水凝胶结构能够模拟细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)及其微环境，为细胞提供良好的体外生长环境，有利于细胞的黏附、增殖和分化；但是，目前作为支架材料的水凝胶缺乏促进成骨分化的能力。
Osteostatin(Thr-Arg-Ser-Ala-Trp)是PTHrPC末端结构域PTHrP(107-111)五肽片段，能够介导PTH/PTHrP受体非相关性受体，LozanoD等的研究表明在体外促进成骨细胞生长和分化。此外，TrejoCG等的研究表明osteostatin在骨缺损兔体内能促进骨再生。
发明内容
本发明的目的是提供了一种融合肽，该融合肽不仅能够促进MC3T3-E1骨细胞黏附、增殖，同时还能促进成骨分化。所述融合肽包含RADA16-I肽和偶联于RADA16-I肽序列的C端的osteostatin肽(TRSAW)；其中所述RADA16-I肽的氨基酸序列为SEQIDNO:1。
在根据本发明的一个实施方案中，所述融合肽的氨基酸序列为SEQIDNO:2RADARADARADARADAGGTRSAW。
在根据本发明的一个实施方案中，所述融合肽是由RADA16-I肽序列的C端经由氨基酸残基GG与osteostatin肽(TRSAW)偶联形成。
在根据本发明的一个实施方案中，所述融合肽的氨基酸序列为SEQIDNO:3RADARADARADARADAGGWASRT。
本发明还提供了一种制备上述融合肽的方法，所述方法是固相合成法。
进一步地，本发明提供了上述融合肽在制备促进细胞黏附和/或成骨分化的药物中的应用。
进一步地，本发明还提供了一种促进细胞黏附和/或成骨分化的药物组合物，所述药物组合物包含上述的融合肽，以及任选地加入药学上可接受的辅料。
在根据本发明的一个实施方案中，所述药物组合物包含RADA16-I肽和如权利要求1～4中的任一项所述的融合肽。
在根据本发明的一个实施方案中，所述RADA16-I肽和所述融合肽的混合比例为1：1。
在根据本发明的一个实施方案中，所述药物组合物为水凝胶。
本发明的融合肽具有以下有益效果：
本发明所述序列为SEQIDNO:2的融合肽，因RADA16-I由带不同电荷的极性氨基酸与非极性氨基酸交替排列组成，能够形成稳定的β折叠结构，功能短肽基团(TRSAW)通过两个甘氨酸序列与RADA16-I相接，甘氨酸为极性不带电荷氨基酸，具有较强亲水性，同时不带电荷的特性，能够减少对RADA16-I自组装能力的影响；序列为SEQIDNO:3的融合肽，因功能基团通过两个甘氨酸(GG)与RADA16-I连接，能够功能基团作为侧链突出于β折叠之外，行使独立的生物学功能。
本发明所述融合肽是自组装纳米水凝胶融合肽，通过实验验证，所述融合肽在体外试验中显示了良好的促进骨细胞(MC3T3-E1)粘附、增殖以及促进成骨分化的性能，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为原子力显微镜观察(AFM)观察不同多肽纤维结构；其中，A:TRSAW；B:RADA16-TRSAW；C:RADA16；D:TRSAWmx。
图2为不同时相点对细胞计数，观察材料表面的细胞粘附情况；其中，a表示实验组与空白组对照有显著差异，P<0.05。
图3为CCK-8法检测MC3T3-E1细胞不同时间点在材料表面的增殖情况；培养1天时空白组与RADA16和TRSAWmx组有显著差异(P<0.05)，RADA16组与TRSAW组无显著差异(P>0.05)；第3、5和7天各组间有显著差异(P<0.05)。
图4为MC3T3-E1细胞不同时间点在材料表面的ALP活性；其中，a表示实验组与空白组比较有显著差异(P<0.05)；b:与RADA16-I组比较有显著差异(P<0.05)。
图5为MC3T3-E1细胞在3组材料培养14天后的茜素红-S染色情况(×40)；A组(空白)细胞密度较小，仅有少量钙结节形成；B组(RADA16-I)细胞密度较大，可见数个钙结节形成；C组(TRSAWmx)可见大量橘红色钙结节着色。
图6为Real-timePCR检测MC3T3-E1细胞在3种材料上培养14天时ALP、OCN和VEGF基因的表达；a表示实验组与空白组比较有显著差异(P<0.05)；b:与RADA16-I组比较有显著差异(P<0.05)。
图7为激光共聚焦显微镜分别观察MC3T3-E1细胞在三组材料三个不同时相点的生长状态(×400)。
图8为多肽结构图，其中，A为I-TASSER模拟SEQIDNO:2多肽结构图；B为I-TASSER模拟SEQIDNO:3多肽结构图
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处说描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1多肽的设计
以RADA16-I肽，序列为SEQIDNO:1(AcN-RADARADARADARADA-CONH2)作为基础，在其C末端借肽键直接偶联一段osteostatin肽(TRSAW)，该多肽(融合肽)氨基酸序列为SEQIDNO:2(RADARADARADARADAGGTRSAW)，分子量为2387.54；或者在RADA16-I肽的C端经两个氨基酸残基GG与osteostatin肽(TRSAW)偶联，该多肽(融合肽)氨基酸序列为SEQIDNO:3(RADARADARADARADAGGWASRT)，上述多肽均由苏州强耀生物科技有限公司合成。
实施例2多肽可促进细胞黏附、增殖及分化性能
1.自组装多肽母液的制备
向肽粉(每10mg分装)内加入1ml无菌超纯水，移液枪吹打混匀后，超声波清洗机室温超声处理30min去除溶液粘性，得到1％(m/v)的多肽母液。取RADA16-I和RADA16-TRSAW母液等体积混合，得到1％(m/v)TRSAWmx母液。
2.原子力显微镜(AFM)观察自组装多肽的纤维结构
用超纯水分别稀释TRSAW、RADA16-I、RADA16-TRSAW和TRSAWmx母液，得到0.5‰(m/v)的稀释液，超声波清洗机室温超声处理30min。取不同多肽稀释液各5ìL分别滴加到清洁的圆形云母片上，静置15s后，用100μL超纯水沿液滴边缘冲洗3次。30℃室温静置，待云母片自然干燥后，AFM进行观察。AFM参数设置为轻敲模式，扫描区域为2μm×2μm，扫描频率是1.0Hz；扫描探针(Model：ArrowUHFAuD)参数：弹性系数(k)为6(1.5-21.0)N/m，材质Si，无涂层，尖端半径为10±2nm。结果显示，原子力显微镜下分别观察RADA16-I、RADA16-TRSAW、TRSAW和TRASWmx四组短肽的纳米结构。如图1所示，TRSAW呈云絮状，无法形成纳米纤维状结构。RADA16-TRSAW自组装成粗细不规则的斑片状纳米纤维，纤维之间未连接搭载，表明功能片段的加入会影响RADA16-Iβ折叠形成，从而影响多肽自组装成长的纳米纤维。但是，将RADA16-I与RADA16-TRSAW按1：1比例混合后得到的TRSAWmx能形成长纳米纤维，RADA16-I纤维直径为(12.8±1.7nm，TRASWmx纤维直径为(17.6±2.1)nm。两者均能形成纳米纤维网状结构。
3.细胞黏附性能测定
分别向24孔板中放入14mm圆形盖玻片，并滴加RADA16-I和TRSAWmx工作液并使其成胶。在空白盖玻片、RADA16-I水凝胶、TRSAWmx水凝胶上滴加1mLMC3T3-E1细胞悬液，分别在第10、30、60、90分钟吸净孔内培养基，PBS清洗1次，以除去未粘附的细胞，随机选取视野对细胞进行计数。
测定结果如图2所示，计数后得到的细胞个数，各组数据经过统计学处理10min时空白组与RADA16组有统计学差异(P<0.05)；30、60和90min时，空白组分别与RADA16和TRSAWmx间有统计学差异(P<0.05)，RADA16与TRSAWmx间无显著差异(P>0.05).
4.增殖活力测定
在96孔板内，滴加RADA16-I和TRSAWmx工作液各50μL/孔，培养板置于37℃、5％CO2的孵箱中静置1h成胶后，分别在空白孔、RADA16-I水凝胶、TRSAWmx水凝胶上滴加100μL密度为5×104/ml的MC3T3-E1细胞悬液。每天换液，在培养的1、3、5、7天，吸去孔中培养基，按每10：1的比例混合成骨培养液和CCK-8试剂，每孔加入100μLCCK-8混合液，培养板置于37℃、5％CO2的孵箱中孵育1h后，以酶标仪在450nm测OD(450)值。
CCK-8检测细胞增殖结果如图3所示，培养1天时空白组与RADA16和TRSAWmx组有显著差异(P<0.05)，RADA16组与TRSAW组无显著差异(P>0.05)；第3、5和7天各组间有显著差异(P<0.05)。
5.细胞碱性磷酸酶活性测定
分别向24孔板中放入14mm圆形盖玻片，并滴加RADA16-I和TRSAWmx工作液，培养板置于37℃、5％CO2的孵箱中静置成胶。在空白盖玻片、RADA16-I水凝胶、TRSAWmx水凝胶上接种1mLMC3T3-E1细胞悬液(密度：5×104/mL)。而后培养板置于37℃、5％CO2的孵箱中，每隔天换液，培养3d、7d和14d后，吸净孔内的培养基，PBS清洗2次，每孔加入1％TritonX-100(100μL)反复吹打，显微镜观察细胞破碎。严格按照碱性磷酸酶试剂盒说明在96孔板内进行加样，以酶联免疫检测仪在520nm处测定D(520)，同时用BCA法测定蛋白浓度，并计算ALP的活力。
ALP试剂盒检测各时间点ALP活性，如图4所示，在3、7、14天时各组间均有显著差异(P<0.05)。提示TRSAWmx上培养的MC3T3-E1细胞能够表达更高的碱性磷酸酶活性，成骨分化效果优于RADA16水凝胶。
6.细胞茜素红S染色
分别向24孔板中放入14mm圆形盖玻片，并滴加RADA16-I和TRSAWmx工作液，培养板置于37℃、5％CO2的孵箱中静置成胶。在空白盖玻片、RADA16-I水凝胶、TRSAWmx水凝胶上接种1mLMC3T3-E1细胞悬液(密度：5×104/mL)。而后培养板置于37℃、5％CO2的孵箱中，每隔换液，诱导培养14d后，吸净孔内的培养基，PBS清洗2次，4％多聚甲醛固定20min后，PBS清洗3次，加入茜素红-S染液室温下染色10min,PBS清洗残留染液，随机取视野拍照。
通过14天诱导培养后茜素红-S染色观察钙结节的生成情况结果如图5所示，空白组细胞密度较小，仅有少量钙结节形成；RADA16-I组细胞密度较大，可见数个钙结节形成；TRSAWmx组可见大量橘红色钙结节着色。
7.Realtime-PCR测定成骨相关因子
在6孔细胞培养板中分别用RADA16-I和TRSAWmx工作液成胶，在空白孔、RADA16-I水凝胶、TRSAWmx水凝胶上加入3mL1×105/mL的MC3T3-E1细胞悬液。培养板置于37℃、5％CO2的孵箱中，在培养第14天后，吸净培养基，PBS清洗3次，随后加入TRIzol提取RNA，各取1μLmRNA逆转录获得cDNA。随后根据TaKaRa公司逆转录反应步骤，进行RT-PCR反应。引物序列(见表1)。使用2-△△Ct对基因相对表达量进行计算。
根据Real-timePCR结果将空白组表达量定义为1，每组的相对表达量如图6所示。ALP基因表达RADA16组为空白组的(1.530x.101)倍，TRSAWmx组为空白组的(3.806x.823)倍；OCN基因表达RADA16组为空白组的(1.490x.223)倍，TRSAWmx组为空白组的(4.746x.452)倍；VEGF基因表达RADA16组为空白组的(2.207x.249)R倍，TRSAWmx组为空白组的(3.914x.204)R倍。TRSAWmx组培养细胞的ALP、OCN和VEGF基因表达明显高于空白组和RADA16-I组(P<0.05).
8.激光共聚焦显微镜观察细胞生长
分别向24孔板中放入14mm圆形盖玻片，并滴加RADA16-I和TRSAWmx工作液，培养板置于37℃、5％CO2的孵箱中静置成胶。在空白盖玻片、RADA16-I水凝胶、TRSAWmx水凝胶上接种1mLMC3T3-E1细胞悬液(密度：5×104/mL)。培养板置于37℃、5％CO2的孵箱中，每隔换液，培养3、7、14天后，吸净孔内培养基，PBS清洗3次，4％多聚甲醛固定30min，用PBS清洗3次，0.2％TritonX-100室温通透10min，PBS清洗3次，加入5％BSA封闭1h，随后PBS清洗3次，加入配置好的罗丹明-鬼笔环肽(5U/mL)工作液，室温避光孵育30min。用PBS清洗3次，10μg/ml的DAPI染液浸没样本，室温避光孵育10min。PBS清洗3次，封片后，激光共聚焦荧光显微镜拍照，如图7所示。
本发明通过将RADA16-I的C末端与PTHrP(107-111)氨基酸活性末端相接，构建的新型自组装纳米水凝胶RADA16-TRSAW，能够兼顾细胞黏附和促成骨相关性能。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (10)

1.一种融合肽，其特征在于，所述融合肽包含RADA16-I肽和偶联于RADA16-I肽序列的C端的osteostatin肽(TRSAW)；其中所述RADA16-I肽的氨基酸序列为SEQIDNO:1。
2.如权利要求1所述的融合肽，其特征在于，所述融合肽的氨基酸序列为SEQIDNO:2。
3.如权利要求1所述的融合肽，其特征在于，所述融合肽是由RADA16-I肽序列的C端经由氨基酸残基GG与osteostatin肽(TRSAW)偶联形成。
4.如权利要求3所述的融合肽，其特征在于，所述融合肽的氨基酸序列为SEQIDNO:3。
5.一种制备如权利要求1～4中任一项所述的融合肽的方法，其特征在于，所述方法是固相合成法。
6.如权利要求1～4中任一项所述的融合肽在制备促进细胞黏附和/或成骨分化的药物中的应用。
7.一种促进细胞黏附和/或成骨分化的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1～4中任一项所述的融合肽，以及任选地加入药学上可接受的辅料。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含RADA16-I肽和如权利要求1～4中的任一项所述的融合肽。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述RADA16-I肽和所述融合肽的混合比例为1：1。
10.如权利要求7～9中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为水凝胶。
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