KR20040060357A - 바이오센서용 기판 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 한 쪽 표면상에 금속 박막을 가진 고체기판; 상기 고체 기판의 금속박막 상에 말단의 시스테인 잔기를 통해 자기조립된 펩티드; 상기 펩티드에 결합된, 항체의 불변영역에 특이성을 가진 단백질; 및 상기 단백질과 결합된 항체를 포함하는 바이오센서용 기판에 관한 것이다.

Description

바이오센서용 기판 및 그 제조방법{Substrate for biosensor and method for preparing the same}

본 발명은 바이오센서에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항체의 반응특이성을 이용하는 바이오센서용 기판 및 그 제조방법에 관한 것이다.

일반적으로 항체의 반응특이성을 이용한 바이오센서는 검출하고자 하는 표적물질을 선택적으로 인지할 수 있는 감지부와 감지된 신호를 전기적 신호로 변환하는 신호변환부로 구성된다. 항체를 이용한 바이오센서에서 이종단백질의 교차반응성을 배제하고 표적물질의 검출 감도를 증가시키는 것이 무엇보다 중요하다. 고체 표면상에 고정화되는 생물분자의 밀도, 균일성, 활성도에 따라 개별 DNA, RNA, 항원, 및 기타 단백질 분자들의 검출한계와 비특이적 결합여부가 결정되며, 고정화 방법은 바이오센서의 검출한계와 비특이적 반응배제에 결정적인 역할을 한다.

생분자를 고체 표면상에 부착시키는 방법으로는 여러 가지 방법이 알려져 있으며, 그 중에서도 랑뮈르-블로젯(Langmuir-Bloegett; LB)기술과 자기조립(Self-Assembly; SA)기술이 대표적이다. LB 기술은 수면상에 살포된 양친매성(amphiphilic) 분자들이 기상-액상 계면간에 단분자막 형태로 존재하는 특성을 이용한 것이다. 이와 같은 단일분자막을 랑뮈르와 블로젯이 개발한 기술을 이용하여 고체기판의 표면상에 적층할 수 있다(Ulman, A.An Introduction to Ultrathin Organic Films: From Langmuir-Blodgett To Self-Assembly, 1st ed.; Academic Press; Boston, 1991; pp. 101-219). LB 기술은 수면상에 분산된 물질의 면적당 밀도를 임의로 조절함으로써 고체표면상에 적층되는 단분자층의 밀도를 조절할 수 있으며, 누적횟수 조절에 따라 고체기판 상에 단층 분자막 및 다층분자막을 제조할 수 있다. 그러나 이 방법은 많은 시간을 요하며 복잡한 장치를 필요로한다.

자기조립(SA) 기술은 나노크기의 분자들을 크기와 구성성분을 제어하면서 조립블록화 하고, 이들을 일정한 성질과 기능을 갖는 큰 구조로 조립하는 소위 바톰업(bottom-up) 방식을 이용한다. 예를 들어, 자기조립분자로서 티올기를 가진 알킬 티올(alkyl thiol)을 이용할 수 있다. 탄소수가 10개 이상 되는 긴 사슬구조의 알킬기 끝에 티올기를 가진 화합물을 용액에 녹인 후, 이 용액에 금을 입힌 기판을 넣으면 티올과 금표면사이의 친화력으로 인하여 흡착이 일어나며, 한층의 분자층이 만들어지게 된다. 자기조립되는 분자 말단의 작용기에 따라 표면의 젖음성(wettability)성질이 변하고, 알킬기의 길이에 따라서 기판의 성질이 변하므로 목적에 따라 적층 구조와 특성의 조절이 가능하다.

이러한 자기조립(SA) 기술을 이용하여 단백질을 고정화하는 방법으로는 물리적 흡착에 의한 고정화 방법과 화학적 공유결합에 의한 고정화 방법의 두 가지가 있다. 물리적 흡착에 의한 고정화 방법은 금속기판과 단백질간의 소수성(hydrophobic) 또는 정전기적(electrostatic) 상호작용에 의해 단백질이 흡착되는 성질을 이용한 것이다. 물리적 흡착에 의한 단백질 고정화 기법은 단백질이 변성되기 쉽고, 단분자 막을 형성하기 어려우며, 막의 내구성이 떨어지게 되어, 결과적으로 단백질의 활성 보존이 어렵다(Sigal G.B. 등, Anal. Chem. 1996, 68, 490-497.). 이와 같이 물리적 흡착은 고정화 단백질의 대상이 제한되며, 단위면적에 고정화되는 단백질의 양을 제어하기가 어렵다.

고정화되는 단백질의 내구성을 향상시키기 위하여 단백질의 표면 작용기 치환을 통해 유기물 자기조립박막과 공유결합을 유도함으로써 안정된 단백질 박막을 형성하고자 하는 방법이 알려져 있다(N. Patel 등, Langmuir. 1997, 13, 6485-6490). 이러한 공유결합을 이용하는 고정화 방법은 기질 표면과 단백질이 모두 결합될 수 있는 가교물질을 이용하여 수행된다. 가장 널리 알려진 기술은 금을 입힌 표면상에 유기 알칸티올레이트(alkanethiolate)를 자기조립하고 표면개질을 통해 단백질의 작용기 치환과 공유결합을 유도하는 방법이다(Cass, T. and Ligler F.S.,Immobilized Biomolecules in Analysis-A Practical Approach, Oxford University Press, New York, 1998; pp. 60-72.). 그러나 가교물질을 이용한 치환반응은 종종 단백질의 입체적 구조를 변형시켜 단백질의 고유활성을 저하시킬 수 있으며, 표면에 존재하는 치환 대상 작용기가 다수 존재할 경우, 고정화된 단백질의 배향성 제어가 문제가 된다. 이러한 고정화 방법은 생물분자의 작용기 치환을 위해 부수적인 반응을 필요로 하며, 시간과 재료 소모가 많다.

따라서, 표적물질에 대한 선택도 및 검출 감도를 증가시키기 위해 표적물질과의 고정화 반응을 증진시킬 수 있는 바이오센서가 요구된다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 항체를 이용한 바이오센서에서 이종 단백질과의 비특이적 결합을 억제하고, 저농도 단백질 측정을 가능하게 하는, 바이오센서용 기판 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 의한 바이오센서용 기판을 개략적으로 나타낸 모식도이다.

도 2는 펩티드 또는 단백질류의 고정화에 따른 표면플라즈몬공명 생성각도를 비교한 것이다.

도 3은 소혈청알부민의 농도에 따른 표면플라즈몬공명 생성 각도의 변화를 도시한 것이다.

<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>

1. 기판

2. 한쪽 말단에 시스테인 잔기를 가진 펩티드

3. 표면처리제박막

4. 단백질

5. 항체

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 한 쪽 표면상에 금속 박막을가진 고체기판; 상기 고체 기판의 금속박막 상에 말단의 시스테인 잔기를 통해 자기조립된 펩티드; 상기 펩티드에 결합된, 항체의 불변영역에 특이성을 가진 단백질; 및 상기 단백질과 결합된 항체를 포함하는 바이오센서용 기판을 제공한다.

본 발명의 기판에서, 금속박막은 금, 은, 구리 또는 백금으로 형성된 것이 바람직하다.

본 발명의 기판에서, 펩티드는 5-25개의 아미노산을 포함하는 것이 바람직하고, 15-25개의 아미노산을 포함하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 기판에서, 고체기판은 표면처리제로 메르캅토에탄올 용액 또는 메르캅토프로피온산 용액을 사용하여 처리되는 것이 바람직하다.

본 발명의 기판에서, 항체는 모노클로날 항체인 것이 바람직하다.

본 발명의 기판에서, 단백질은 항체의 불변부위와 특이성을 가지며, 펩티드와 상호작용할 수 있는 전하분포를 가지는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고체 기판의 일면에 금속박막을 형성하는 단계; 상기 금속박막 상에 한쪽 말단에 시스테인잔기를 가진 펩티드의 자기조립박막을 형성하는 단계; 상기 기판 상의 펩티드와 단백질을 결합시키는 단계; 및 상기 단백질과 항체를 결합시키는 단계를 포함하는, 바이오센서용 기판의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 방법에서, 펩티드는 5-25개의 아미노산을 포함하는 것이 바람직하고, 15-25개의 아미노산을 포함하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 방법에서, 단백질과 펩티드의 결합단계 이전에, 상기 기판을 메르캅토에탄올 용액 또는 메르캅토프로피온산 용액으로 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 보다 상세히 설명한다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 의한 바이오센서용 기판을 개략적으로 나타낸 모식도이다. 도 1에서 참조번호 1은 기판이고, 2는 한쪽 말단에 시스테인 잔기를 가진 펩티드이고, 3은 표면처리제막이고, 4는 항체의 불변부위에 특이성을 갖는 단백질이고, 5는 항체이다. 실리콘 또는 유리로 된 기판(1) 표면상에 금속박막을 형성한다. 금속박막은 금, 은, 구리 또는 백금으로 형성될 수 있으며, 금이 특히 바람직하다. 금속박막이 형성된 기판(1)을 한쪽 말단이 시스테인 잔기를 가진 펩티드를 함유하는 용액에 담근다. 1-2시간 경과하면 기판(1) 상에 자기조립박막이 형성된다.

펩티드가 자기조립된 기판(1) 표면에 금속에 의한 소수성(hydrophobic) 상호작용을 차단하기 위해 표면처리제를 처리한다. 표면처리제로는 메르캅토에탄올 용액 또는 메르캅토프로피오닌산 용액을 이용하며, 이 용액에 펩티드 기판을 담그어 메르캅토에탄올박막(3) 또는 메르캅토프로피온산박막(3)을 형성한다.

항체를 고정시키기 위해 항체의 불변부위 (constant region)에 특이성이 가지며, 펩티디와 상호작용할 수 있는 전하분포를 가지는 단백질(4)을 자기조립박막에 도입한다. 이와 같이 단백질이 도입된 기판을 항체 고정화 플랫폼이라 한다. 이를 위해, 기판을 단백질용액에 담그어 단백질을 고정시킨다. 펩티드 분자에 존재하는 전하를 띠는 작용기에 의해 단백질이 기판 상에 고정화 될 수 있다. 그러므로,펩티드 분자와 단백질이 결합될 수 있도록 적절하게 짝을 이뤄 이용하도록 한다. 즉, 펩티드 분자가 양의 전하를 가지는 경우에는 음의 전하를 갖는 단백질을, 펩티드 분자가 음의 전하를 가지는 경우에는 양의 전하를 갖는 단백질을 이용한다.

기판에 항체(5)를 도입하기 위해 상기 항체 고정화 플랫폼을 항체용액에 담그어 단백질과 항체의 결합을 유도한다. 본 발명에서 항체는 당업계에서 사용되는 어떠한 항체라도 이용할 수 있고, 또한 모노클로날 항체가 바람직하며, 특히 이뮤노글로불린 G(immunogloblulin G)계열의 항체가 더욱 바람직하다. 항체고정화 이후, 포스페이트 완충액에 담그어 고정되지 않은 항체를 세척하여 제거할 수 있다.

이와 같은 방법으로 제조된 기판은 표적물질에 대한 선택성 및 감도를 높일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예1: 항체 고정화 플렛폼의 제작

1) 기판 및 펩티드 제조

두께 0.1 mm의 커버 글래스 상에 스퍼터링(sputtering) 방법을 이용하여 2 nm 두께의 크롬(Cr)막을 형성한 후에, 그 위에 43 nm의 금(Au) 박막을 형성하였다. 형성된 금 박막을 피라나(piranha) 용액(황산 70부피분율과 과산화수소수 30 부피분율로 혼합하여 만든 용액)에 5분간 담그어 세척한 후, 에탄올에 30분간, 이후 탈이온수(deionized Water)에 2시간 담그어 세정작업을 완료하였다.고상합성법(solid phase synthesis)을 이용하여 말단에 시스틴(cystein) 잔기를 가진, 18개의 아미노산으로 구성된 펩티드를 제조하였다. 합성된 펩티드의 아미노산 서열은 CKGRGKGRGKGRGKGRGK(C: 시스테인, K: 리신, G: 글리신, R: 아르기닌)로 구성되었다. 합성된 펩티드는 분자량이 1842이며, 수용성 물질을 나타낸다.

2) 자기조립박막의 형성

상기 펩티드를 함유하는 수용액에 금 박막이 형성된 기판을 2시간 담그어 자기조립박막을 형성시켰다. 자기조립된 펩티드 기판을 300mM의 메르캅토에탄올 용액에 12시간 담그어 메르캅토에탄올막을 형성시켜 금속-단백질간의 소수성 상호작용을 차단(blocking)하였다.

3) 단백질 도입

항체 고정화를 위해 항체의 불변부위에 특이성을 가지는 단백질인 단백질 A (Sigma-Aldrich사)를 도입하였다. 이를 위해 0.01 mg/mL 농도의 단백질 수용액에 상기 펩티드 기판을 12시간 담그었다.

4) 단백질 고정화 여부의 측정

항체 고정화 플렛폼에서의 단백질 고정화 여부를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 하였다. 금 박막이 형성된 기판(기판1); 기판1에 펩티드만 도입된 기판(기판2); 기판2에 단백질 A를 도입한 기판(기판3); 기판2에 단백질 G(Prozyme inc.)를 도입한 기판(기판4); 기판2에 IgG를 도입한 기판(기판5)에 대하여 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)기법을 이용하여 단백질 고정화 여부를 확인하였다. 기판4 및 기판5는 기판3의 제조방법에서 단백질 A 대신 각각 단백질 G 및IgG를 사용한 것을 제외하고는 동일한 방식에 의하여 제작하였다.

상기 기판1~5를 각각 표면플라즈몬 공명장치(Optrel사, 모델명: Multiskop)를 이용하여 도 2와 같은 결과를 얻었다. 도 2에 의하면, 순수한 금 박막의 경우와 비교하였을 때 펩티드가 고정화된 상태에서는 표면 플라즈몬 공명현상이 발생되는 광원의 입사각의 위치가 증가함을 알 수 있다. 즉, 금속박막을 기준으로 표면플라즈몬 공명 생성각도(반사도 최저점에서의 입사각)의 증가를 통해 결합 여부 확인할 수 있었다. 단백질 G의 경우 입사각의 증가가 상당히 미미하나, 단백질 A의 경우에는 입사각이 뚜렷하게 증가하였다. 이것은 펩티드 표면상에 단백질 A가 고정화되었음을 의미한다. 단백질 G의 경우, 표면 전하분포 및 단백질의 입체적 구조의 부조화에 따라 상호작용이 없으므로 결합이 안되었음을 표면 플라즈몬 공명 생성각도의 변화가 거의 없음을 통해 확인하였다. IgG의 경우에도 역시 표면 플라즈몬 공명현상이 발생하는 광원의 입사각이 증가한 것을 통해 IgG가 고정화되었음을 알 수 있으나, 펩티드와의 비특이적 상호작용으로 인해 항체를 이용한 바이오센서에서 그 효용성이 제한되며, 고정되는 항체의 양이 과다함으로 고정화 방법으로 적절하지 못하다.

실시예 2: 항체가 고정된 기판의 제조

1) 항체의 도입

본 실시예에서 고정화를 위한 항체로는 소혈청알부민(Bovine Serum Albumin, BSA)에 대한 단일클론 항체를 사용하였으며, 소혈청알부민 항체(anti-BSA) 120 nM 의 수용액에 상기 실시예1에서 제조된 항체 고정화용 플랫폼을 6시간 동안 담그어단백질과 항체의 결합을 유도하였다. 항체고정화 이후, pH 7.4의 포스페이트 완충액에 6시간 담그어 고정되지 않은 항체를 세척하였다.

2) 최소 검출 농도의 결정

고정화된 항체에 특이적으로 반응하는 소혈청알부민을 항원으로 하여, 항원 농도에 따른 신호 응답곡선(도 3 참조)을 작성하였다. 항원의 농도가 각각 0M, 100pM, 1nM, 10nM, 100nM인 항원용액 각각에 항체가 고정된 기판을 120분간 담그어 항원-항체반응을 유도하였다.

도 3에 소혈청알부민 농도에 따른 표면플라즈몬공명 생성각도의 위치를 도시하였다. 도 3에 의하면 소혈청알부민 농도가 증가함에 따라, 표면플라즈몬공명 생성각도 또한 증가하는 추세를 보이고 있으며, 소혈청 알부민이 100pM 농도의 매우 낮은 농도에서도 검출되는 것을 보여주고 있다. 즉, 농도가 10배 증가할 때 표면 플라즈몬 생성각도가 약 0.1도 정도 증가하는데 0 M과 100 pM사이의 표면 플라즈몬 생성각도의 차이가 0.1도이므로 10 pM을 측정하여 예상되는 표면 플라즈몬 생성각도는 0 M의 경우와 같아지므로 소혈청알부민 기준 저농도 측정한계는 100 pM이 된다는 것을 알 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 기능성 펩티드 분자와 유기물의 혼합 자기조립을 통하여 단백질의 비특이적 반응을 억제하고, 단백질 수용체의 선택적 흡착을 통해 배향성이 확보된 항체 고정화가 가능하다. 그리하여, 진단용 키트, 바이오센서의 개발 및 유용물질의 생산을 위한 효소의 고정화, 단백질 칩 등생명공학분야에서 광범위하게 활용될 수 있다.

Claims (9)

1. 한 쪽 표면상에 금속 박막을 가진 고체기판;

   상기 고체 기판의 금속박막 상에 말단의 시스테인 잔기를 통해 자기조립된 펩티드;

   상기 펩티드에 결합된, 항체의 불변영역에 특이성을 가진 단백질; 및

   상기 단백질과 결합된 항체를 포함하는 바이오센서용 기판.
2. 제 1항에 있어서, 상기 금속박막이 금, 은, 구리 또는 백금으로 형성된 것을 특징으로 하는 기판.
3. 제 1항에 있어서, 상기 펩티드가 5-25개의 아미노산으로 구성되는 것을 특징으로 하는 기판.
4. 제 1항에 있어서, 상기 고체기판이 표면처리제로 메르캅토에탄올 용액 또는 메르캅토프로피온산 용액을 사용하여 처리되는 것을 특징으로 하는 기판.
5. 제 1항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 기판.
6. 제 1항에 있어서, 상기 단백질이 항체의 불변부위와 특이성을 가지며, 펩티드와 상호작용할 수 있는 전하분포를 가지는 것을 특징으로 하는 기판.
7. 고체 기판의 일면에 금속박막을 형성하는 단계;

   상기 금속박막 상에 한쪽 말단에 시스테인잔기를 가진 펩티드의 자기조립박막을 형성하는 단계;

   상기 기판 상의 펩티드와 단백질을 결합시키는 단계; 및

   상기 단백질과 항체를 결합시키는 단계를 포함하는, 바이오센서용 기판의 제조방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 5-25개의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 단백질과 펩티드의 결합단계 이전에, 상기 기판을 메르캅토에탄올 용액 또는 메르캅토프로피온산 용액으로 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.