WO2019187695A1 - エタノールアミンリン酸リアーゼ組成物 - Google Patents

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WO2019187695A1
WO2019187695A1 PCT/JP2019/004568 JP2019004568W WO2019187695A1 WO 2019187695 A1 WO2019187695 A1 WO 2019187695A1 JP 2019004568 W JP2019004568 W JP 2019004568W WO 2019187695 A1 WO2019187695 A1 WO 2019187695A1
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lyase
pea
ethanolamine
enzyme
ethanolamine phosphate
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PCT/JP2019/004568
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Inventor
晋平 伊藤
Original Assignee
東洋紡株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates

Definitions

  • the present invention relates to a composition comprising ethanolamine phosphate (PEA) lyase and a method for stabilizing PEA lyase.
  • PEA ethanolamine phosphate
  • PEA lyase is an enzyme that catalyzes the reaction of producing acetaldehyde, phosphoric acid and ammonia from ethanolamine phosphate (PEA).
  • PEA ethanolamine phosphate
  • Patent Documents 1 and 2 a method for measuring PEA using PEA lyase is provided.
  • Patent Documents 1 and 2 it is expected that a short and simple measurement method using an enzyme method will be established and spread in the form of diagnostic agents and sensors that can be used in, for example, local hospitals and clinics.
  • the raw material enzymes used for reagents and sensors are distributed as dry products (for example, powder) (dry products).
  • dry products for example, powder
  • the dissolution concentration of the enzyme can be freely adjusted according to the purpose of use, and the type of buffer solution for dissolution can be arbitrarily selected, so that it can be developed for various uses.
  • the enzyme activity can be stably maintained for a long time in a dry state rather than in a solution state.
  • a method of precipitating the target enzyme from a solution containing enzyme protein with an organic solvent such as acetone or alcohol and collecting it to obtain a dry powder For example, a method of precipitating the target enzyme from a solution containing enzyme protein with an organic solvent such as acetone or alcohol and collecting it to obtain a dry powder.
  • the purpose of the present invention is to use a stabilizer that is easily available, has a uniform quality, and does not affect the appearance, performance, and quality of the enzyme product or the composition containing the enzyme, as a stabilizer for PEA lyase. It is to provide a PEA lyase composition.
  • the present inventors examined various substances in order to improve the storage stability of the PEA lyase composition, particularly the dry PEA lyase composition. As a result, it has been found that the stability of PEA lyase is greatly improved by the coexistence of any one or more of sugar, sugar alcohol, organic acid and polypeptide, and the present invention has been completed.
  • Item 1 An ethanolamine phosphate lyase composition containing (a) ethanolamine phosphate lyase, and (b) any one or more compounds selected from the group consisting of sugar, sugar alcohol, organic acid and polypeptide.
  • Item 2. Item 2.
  • the compound (b) is any one or more selected from the group consisting of ⁇ -cyclodextrin, trehalose, inositol, citrated bovine serum albumin (BSA), HSP70 subunit DnaK fragment, and sericin. Ethanolamine phosphate lyase composition.
  • Item 3. Item 3.
  • the ethanolamine phosphate lyase composition according to Item 2 wherein the compound (b) is one or more selected from the group consisting of trehalose, citric acid, and HSP70 subunit DnaK.
  • Item 4. Item 4. The ethanolamine phosphate lyase composition according to any one of Items 1 to 3, wherein the compound (b) is contained in an amount of 50 to 100% by weight based on the amount of protein of ethanolamine phosphate lyase.
  • a diagnostic agent for depression comprising the composition according to any one of Items 1 to 5.
  • Item 7. A method of stabilizing ethanolamine phosphate lyase by allowing ethanolamine phosphate lyase to coexist with any one or more compounds selected from the group consisting of sugar, sugar alcohol, organic acid and polypeptide.
  • the stability of dried PEA lyase, particularly freeze-dried product can be secured, and enzyme inactivation can be prevented even during long-term storage.
  • PEA lyase activity “PEA lyase (Ethanolamine-phosphate phospho-lyase)” is an enzyme having an activity to catalyze a reaction of producing acetaldehyde, phosphate and ammonia from ethanolamine phosphate (PEA) (ie, PEA lyase activity). Yes, it has been widely identified from microorganisms to mammals.
  • the PEA lyase activity can be measured based on the method described in Patent Document 1, for example. That is, PEA is hydrolyzed in the first reaction to produce acetaldehyde, phosphate, and ammonia, and then acetaldehyde dehydrogenase (ALDH) and oxidized nicotinamide adenine dinucleotide (NAD + ) are added in the second reaction. The acetaldehyde produced in the first reaction is oxidized to acetic acid.
  • ADH acetaldehyde dehydrogenase
  • NAD + oxidized nicotinamide adenine dinucleotide
  • NAD + is reduced to reduced nicotinamide dinucleotide (NADH), but only NADH strongly absorbs 340 nm ultraviolet light, so the change in absorbance of the sample at a wavelength of 340 nm before and after the reaction is used as an indicator.
  • the activity can be measured. More specifically, the activity can be measured using the following reagents and measurement conditions.
  • reaction mixture (1) (10 mL) prepared in advance is mixed with the reaction mixture (2) (0.1 mL) and the reaction mixture (3) (0.1 mL), and preheated at 37 ° C. for 5 minutes to obtain a reaction mixture.
  • ⁇ Measurement conditions Add 0.1 mL of the enzyme solution to 2.9 mL of the reaction mixture, mix gently, and use a spectrophotometer (light path length: 1.0 cm) controlled at 37 ° C. with water as a control. Record for minutes, and then measure the change in absorbance per minute ( ⁇ OD TEST ) from the linear portion (ie, after the reaction rate is constant).
  • ⁇ OD TEST absorbance per minute
  • an enzyme dilution solution dissolving PEA lyase is added to the reaction mixture instead of the enzyme solution, and the change in absorbance per minute ( ⁇ OD BLANK ) is measured in the same manner. From these values, PEA lyase activity is determined according to the following formula.
  • 1 unit (U) in the PEA lyase activity is the amount of enzyme that decreases 1 ⁇ mol NADH per minute under the above measurement conditions.
  • 3.0 is the volume (mL) of the reaction mixture
  • 6.22 is the NADH millimolar molecular extinction coefficient (cm 2 / ⁇ mol)
  • 1.0 is the optical path length (cm)
  • 0.2. 1 shows the liquid volume (mL) of an enzyme solution.
  • the enzyme activity is measured according to the above measurement method.
  • the PEA lyase applied to the present invention is preferably an isolated PEA lyase or a purified PEA lyase.
  • the PEA lyase applied to the present invention may exist in a state dissolved in a solution suitable for storage or in a freeze-dried state (for example, in powder form).
  • isolated when used with respect to the enzyme (PEA lyase) applied to the present invention means components other than the enzyme (for example, contaminating proteins derived from host cells, other components, culture fluid, etc.). This means a state that is not substantially included.
  • the isolated enzyme applied to the present invention has a contaminating protein content of less than about 20% by weight, preferably less than about 10%, more preferably less than about 5%. Even more preferably, it is less than about 1%.
  • the PEA lyase applied to the present invention may be present in a solution (for example, a buffer) suitable for storage or measurement of enzyme activity.
  • the PEA lyase applied to the present invention is preferably composed of any of the following polypeptides (a) to (c).
  • A a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • B a polypeptide having a PEA lyase activity consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted, added and / or inverted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of human-derived PEA lyase.
  • polypeptide of (b) above one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted and / or added (hereinafter referred to as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1) as long as the polypeptide retains PEA lyase activity. These may be collectively referred to as “mutation.”)
  • “several” is not limited as long as the PEA lyase activity is maintained, for example, a number corresponding to less than about 20% of all amino acids, preferably a number corresponding to less than about 15%, More preferably, it is a number corresponding to less than about 10%, even more preferably a number corresponding to less than about 5%, and most preferably a number corresponding to less than about 1%. More specifically, the number of amino acid residues to be mutated is, for example, 2 to 127, preferably 2 to 96, more preferably 2 to 64, still more preferably 2 to 32, and even more preferably. Is 2 to 20, even more preferably 2 to 15, particularly preferably 2 to 10, and most preferably 2 to 5.
  • One or several mutations are DNA encoding the PEA lyase of the present invention using known techniques such as restriction enzyme treatment, treatment with exonuclease or DNA ligase, position-directed mutagenesis or random mutagenesis. It is possible to carry out by introducing a mutation into. Variant PEA lyase can also be obtained by other methods such as ultraviolet irradiation. Variant PEA lyase includes naturally occurring variants (for example, single nucleotide polymorphisms are also included) based on individual differences in microorganisms holding PEA lyase, differences in species and genus, and the like.
  • the mutation is present at a site that does not affect the active site or substrate binding site of PEA lyase.
  • the polypeptide of (c) above is a polypeptide comprising an amino acid sequence having an identity of 80% or more compared to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 as long as it retains PEA lyase activity.
  • the identity between the amino acid sequence of the PEA lyase of the present invention and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is 85% or more, more preferably 88% or more, still more preferably 90% or more, and still more preferably 93% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • Such a polypeptide comprising an amino acid sequence having a certain identity or more can be prepared based on the known genetic engineering techniques as described above.
  • Identities of amino acid sequences can be calculated using analysis tools that are commercially available or available through telecommunication lines (Internet). For example, the National Biotechnology Information Center (NCBI) homology algorithm BLAST (Basic local alignment search tool) http: // www. ncbi. nlm. nih. It can be calculated by using default (initial setting) parameters in gov / BLAST /. In the present invention, this method is used for calculation of amino acid sequence identity.
  • NCBI National Biotechnology Information Center
  • Isolation sources may be those derived from microorganisms that grow in a low temperature environment, a high temperature environment such as a volcano, an oxygen-free / high-pressure / light-free environment such as the deep sea, and a special environment such as an oil field.
  • the PEA lyase applied to the present invention includes not only PEA lyase directly isolated from microorganisms, but also isolated PEA lyase whose amino acid sequence has been modified by a protein engineering method, or a genetic engineering technique. Modified versions are also included. For example, an enzyme obtained from a microorganism classified into the genus Pantoea, Streptomyces, Arthrobacter or the like may be modified.
  • the method for producing PEA lyase applied to the present invention is not particularly limited.
  • the PEA lyase can be produced by culturing a microorganism expressing PEA lyase and purifying the obtained culture solution.
  • a method for producing a target protein by culturing a microorganism that expresses the protein and purifying the obtained culture solution has been already established in the art. Therefore, those skilled in the art can apply the knowledge to produce PEA lyase, and the mode is not particularly limited.
  • the method for constructing an expression system for PEA lyase is not particularly limited.
  • a microorganism having the ability to produce PEA lyase may be used as an expression system as it is.
  • a gene recombinant (hereinafter also referred to as “transformant”) prepared by introducing DNA encoding PEA lyase into an appropriate host vector system may be used as the expression system. From an industrial viewpoint, it is preferable to use a genetic recombinant for reasons such as easy control and higher safety.
  • DNA encoding PEA lyase can be easily prepared using standard genetic engineering techniques (Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989); continued Biochemistry experiment course "gene research method I, II, III", Japan Biochemical Society edition (1986) etc.).
  • a cDNA library is prepared from an appropriate source microorganism in which the PEA lyase applied to the present invention is expressed, and an appropriate DNA sequence peculiar to the DNA sequence of the PEA lyase is prepared from the cDNA library. This can be performed by selecting a desired clone using a probe or an antibody.
  • the separation of total RNA from the above microorganisms, the separation and purification of mRNA, the acquisition and cloning of cDNA, the determination of the base sequence, etc. can all be carried out according to conventional methods.
  • the method for screening PEA lyase DNA from a cDNA library is not particularly limited, and can be performed according to a usual method.
  • a method for selecting a corresponding cDNA clone by immunoscreening using the polypeptide-specific antibody, a plaque high using a probe that selectively binds to a target nucleotide sequence Hybridization, colony hybridization, etc., or a combination thereof can be selected as appropriate.
  • a PCR method or a modified DNA or RNA amplification method can be suitably used.
  • Primers used in the PCR method can also be appropriately designed and synthesized based on the base sequence determined above.
  • the amplified DNA or RNA fragment can be isolated and purified by, for example, gel electrophoresis or hybridization.
  • DNA encoding PEA lyase can be incorporated into an appropriate expression vector.
  • the type and structure of the expression vector are not particularly limited as long as the DNA can be replicated in an appropriate host cell and can be expressed.
  • the type of vector is appropriately selected in consideration of the type of host cell. Specific examples of such vectors include plasmid vectors, cosmid vectors, phage vectors, virus vectors (such as adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, retrovirus vectors, and herpes virus vectors).
  • An expression vector in which DNA encoding PEA lyase is incorporated can be introduced into a suitable host cell to form a transformant having the ability to produce the PEA lyase.
  • the host cell is not particularly limited as long as it can express the DNA and produce PEA lyase.
  • prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis
  • molds such as yeast and filamentous fungi
  • eukaryotic cells such as insect cells, cultured plant cells, and mammalian cells
  • Escherichia coli, Bacillus subtilis and filamentous fungi are preferable.
  • E. coli is particularly preferred.
  • exogenous DNA is usually present in the host cell, but a transformant obtained by so-called self-cloning using a microorganism from which the DNA is derived as a host is also a preferred embodiment.
  • the above transformant is preferably prepared by transfection or transformation using the expression vector shown above. Transformation may be transient or stable. Transfection and transformation can be performed using calcium phosphate coprecipitation method, electroporation, lipofection, microinjection, Hanahan method, lithium acetate method, protoplast-polyethylene glycol method, and the like.
  • the PEA lyase applied to the present invention can be produced by culturing a gene recombinant that expresses PEA lyase and purifying the obtained culture solution.
  • the culture method and culture conditions are not particularly limited as long as PEA lyase is produced. That is, on the condition that PEA lyase is produced, a method and conditions suitable for the growth of the microorganism to be used can be appropriately set.
  • PEA lyase can be obtained by performing separation and purification by appropriately combining concentration with a membrane, salting out such as ammonium sulfate precipitation, dialysis, and various chromatography.
  • the microbial cells are crushed by pressure treatment, ultrasonic treatment, mechanical method, or a method using an enzyme such as lysozyme, and if necessary, such as EDTA.
  • This enzyme can be obtained by adding a chelating agent and a surfactant to solubilize PEA lyase, separating and collecting it as an aqueous solution, and separating and purifying it. After the cells are collected from the culture solution in advance by filtration, centrifugation, or the like, the above series of steps (crushing, separating, and purifying the cells) may be performed.
  • Purification includes, for example, concentration under reduced pressure, membrane concentration, salting-out treatment such as ammonium sulfate and sodium sulfate, or precipitation treatment by a fractional precipitation method using a hydrophilic organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, etc., heat treatment or isoelectric point treatment.
  • adsorbent or a gel filtration agent adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and the like can be combined as appropriate.
  • the purified enzyme preparation is preferably purified to the extent that it shows a single band on electrophoresis (SDS-PAGE).
  • this enzyme is obtained as a recombinant protein.
  • the recombinant protein to which any peptide or protein is linked can be obtained.
  • PEA lyase can be obtained.
  • modification may be performed so that addition of sugar chain and / or lipid, or processing of N-terminal or C-terminal may occur.
  • Any one or more compounds selected from the group consisting of sugar, sugar alcohol, organic acid and polypeptide is not particularly limited, but preferred Examples include sugars for sucrose, galactose, arabinose, ribose, melibiose, melezitose, dextrin, ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, sugar alcohols for inositol, sorbitol, arabitol, xylitol, glucitol, ribitol, D-mannitol, trisodium citrate dihydrate for organic acids, sodium gluconate, sodium glutamate, bovine serum albumin (BSA) for polypeptides, major subunit of E.
  • BSA bovine serum albumin
  • coli-derived HSP70 There fragments were deficient ATPase region of DnaK (e.g. BPF-301; manufactured by Toyobo), and sericin are exemplified. More preferable examples include trehalose, citric acid, BPF-301 and the like.
  • the addition amount can be appropriately set within a range in which the object can be achieved. Accordingly, the concentration of each compound to be coexistent is not particularly limited, but a preferable lower limit is 30% by weight, more preferably 40% by weight, and further preferably 50% by weight. From the viewpoint of the risk of bringing in foreign substances, the preferable upper limit is 300% by weight, more preferably 200% by weight, and still more preferably 100% by weight. In addition, these addition density
  • concentrations are represented by the weight% with respect to PEA lyase enzyme protein.
  • the added compound has a protective action even when the enzyme is in a solution state, and contributes to stable retention of the enzyme activity in the solution.
  • the composition of the buffer solution used for the extraction / purification / drying of the PEA lyase and the stability test described above is not particularly limited, but preferably has a buffer capacity in the range of pH 4 to 9, for example, boric acid.
  • Goods such as ACES, BES, Bicine, Bis-Tris, CHES, EPPS, HEPES, HEPPSO, MES, MOPS, MOPSO, PIPES, POPSO, TAPS, TAPSO, TES, Tricine Buffering agents are mentioned. Mention may also be made of buffers based on dicarboxylic acids, such as phthalic acid, maleic acid, glutaric acid and the like. Among these, only 1 type may be applied and 2 or more types may be used together. Furthermore, one or more composite compositions including those other than the above may be used. Further, a chelating agent such as EDTA and / or a surfactant may be included in the buffer as necessary.
  • the concentration of these additives is not particularly limited as long as it has a buffer capacity, but the preferable upper limit is 100 mM or less, more preferably 50 mM or less. Moreover, a preferable minimum is 5 mM or more.
  • the content of the buffer is not particularly limited, but is preferably 0.1% (weight ratio) or more, particularly preferably 0.1 to 80% (weight). Ratio). For these, various commercially available reagents can be used.
  • the concentration of the enzyme solution used for the drying step is adjusted so that the protein concentration is preferably 5 g / L or more, more preferably 10 g / L or more. If the enzyme used in the drying process is too dilute, the recovery rate often decreases in the drying process, and the resulting dried product often has a shape that is difficult to handle. In addition, when the concentration is excessively high, drying may take time.
  • composition of the present invention contains the PEA lyase shown in 1 above and any one or more compounds selected from the group consisting of sugar, sugar alcohol, organic acid, and polypeptide described in 2 above. It is a composition characterized by these.
  • the form of the composition of the present invention is not particularly limited. Either a dry state such as freeze-drying or powder, or a liquid state may be used.
  • the PEA lyase stabilization method of the present invention comprises (a) a PEA lyase and (b) any one or more compounds selected from the group consisting of sugars, sugar alcohols, organic acids and polypeptides. It is characterized by that. Other components may coexist other than the above (a) and (b), and the composition is not particularly limited. Depending on the use of PEA lyase, it can be appropriately selected without any particular limitation.
  • the stability of PEA lyase in the present invention means that after maintaining PEA lyase at 37 ° C. for 3 weeks, the residual rate (%) of PEA lyase maintained is higher than when no stabilizer is added. Or at least PEA lyase activity is maintained.
  • the stability was improved was determined as follows.
  • the PEA lyase activity value (a) per dry product weight after drying and the dry product weight after storage at a constant temperature for a certain period of time The PEA lyase activity value (b) was measured and the relative value ((b) / (a) ⁇ 100) with respect to the measured value (a) of 100 was determined. This relative value was defined as the residual rate.
  • the presence or absence of the addition of the compound was compared, and when the residual ratio increased by the addition, it was judged that the stability was improved.
  • Depression diagnostic agent containing PEA lyase Another embodiment of the present invention is a depression diagnosis agent comprising the PEA lyase composition described in 3 above. Specifically, a PEA lyase is added to a measurement sample to perform a first enzyme reaction for generating acetaldehyde, phosphoric acid, and ammonia, and the generated acetaldehyde, phosphoric acid, and ammonia are generated.
  • a diagnostic agent for depression using a method for measuring PEA comprising a second step of quantifying at least one of the two and determining the amount of PEA in the measurement sample.
  • Example 1 Acquisition of Transformant A structural gene encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 1 was synthesized by Eurofin. The synthetic gene was introduced into a pET28b (+) vector by restriction enzyme treatment, and this was designated as a recombinant expression plasmid pET-EPL. This expression plasmid was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) competent cells, pre-cultured in SOC medium for 1 hr at 37 ° C., developed on LB-amp agar medium, and the colony Transformants were obtained. The obtained transformant was named Escherichia coli BL21 (DE3) (pET-EPL).
  • Example 2 Enzyme Preparation A colony of the transformant Escherichia coli L21 (DE3) (pET-EPL) obtained in Example 1 was inoculated into a 5 ml LB-amp liquid medium in one platinum ear test tube. The cells were cultured at 16 ° C for 16 hours. This was used as seed culture. Next, TB liquid medium (tryptone 1.2%, yeast extract 2.4%, glycerol 0.4%, KH 2 PO 4 0.23%, K 2 HPO 4 1.25%, pH 7.0) was added. It put into the test tube and sterilized by the autoclave, and was set as the medium of the main culture medium.
  • TB liquid medium tryptone 1.2%, yeast extract 2.4%, glycerol 0.4%, KH 2 PO 4 0.23%, K 2 HPO 4 1.25%, pH 7.0
  • TB medium 500 mL of TB medium was placed in a 2 L Sakaguchi flask and sterilized by autoclaving to obtain a main culture medium.
  • 5 mL of the seed culture solution was inoculated into the main culture medium, and cultured with shaking at a culture temperature of 37 ° C. and 180 rpm for about 3 hours.
  • IPTG was added to a final concentration of 1 mM to induce PEA lyase expression, and further cultured at a culture temperature of 20 ° C. and 180 rpm for approximately 21 hours. Thereafter, the cells were collected by centrifugation, and the cells were collected.
  • the obtained bacterial cells were suspended in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0) containing 300 mM NaCl, 40 ⁇ M PLP, 5% Glycerol.
  • the suspension was fed to a French press (manufactured by Niro Soavi, NS1001L2K type) at a flow rate of 160 mL / min, and crushed at 700 to 1000 bar.
  • affinity purification was performed for the His tag that had been introduced into the N-terminal of PEA lyase at the time of synthesis. This purification was performed by HPLC, and the fraction whose activity was confirmed by measuring the PEA lyase activity of the fraction obtained by gradient elution of imidazole was used as a pool solution.
  • This pool solution was further added to a 50 mM Tris-HCl buffer solution (pH 7.0) containing 300 mM NaCl, 4 ⁇ M PLP while removing imidazol by hydroconcentration using a hollow fiber filter (Spectreum, polyethersulfone or polysulfone material).
  • the purified enzyme was obtained by substituting and concentrating to a concentration suitable for powdering.
  • Example 3 Screening of compounds having stabilizing effect of PEA lyase powder Using purified enzyme derived from Escherichia coli L21 (DE3) (pET-EPL), ⁇ -cyclodextrin, inositol (myo-inositol), glycine, glucone It was examined whether sodium acid, trisodium citrate dihydrate, BSA, sericin, and BPF-301 (manufactured by Toyobo) have a stabilizing effect. Table 1 shows the effects of PEA lyase and stabilizer.
  • the preparation obtained in Example 2 contains about 10 mg / ml of PEA lyase protein in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0). Examination of a 100% concentration stabilizer was carried out by dissolving 10 mg of the stabilizer in an enzyme solution containing 10 mg of PEA lyase to obtain a concentration of 100%. From the enzyme solution to which various stabilizers were added, exactly 2 ml each of the tare weight was dispensed into a measured vial. Moreover, what did not add a stabilizer was prepared for control. This was freeze-dried (FDR) to completely evaporate the water, and the weight of the vial was measured. The weight of the powder obtained by subtracting the tare weight was calculated.
  • FDR freeze-dried
  • the residual activity was 20% when stored at 37 ° C. for 3 weeks. Regardless of which stabilizer was added, the residual activity after storage at 37 ° C. for 3 weeks exceeded 20%, and the stabilizing effect could be confirmed.
  • inositol, sodium gluconate, trisodium citrate dihydrate, BSA, and BPF-301 showed a high stabilizing effect.
  • Example 4 Next, the stability in the case where two or more kinds of compounds were added to the compound showing a stabilizing effect in Example 3 using a purified enzyme derived from Escherichia coli L21 (DE3) (pET-EPL). Verified effect.
  • Table 2 shows the effects of PEA lyase and stabilizer.
  • the residual activity was 10% when stored at 37 ° C. for 4 weeks.
  • the residual activity when stored at 37 ° C. for 3 weeks was 69%, confirming the stabilizing effect.
  • Example 5 Furthermore, in Example 3, the synergistic effect was examined by simultaneously adding three kinds of compounds. Using a purified enzyme derived from Escherichia coli L21 (DE3) (pET-EPL) for the combination of trisodium citrate dihydrate and BPF-301, which showed a stabilizing effect, The stabilization effect when added simultaneously was verified. Table 3 shows the effects of PEA lyase and stabilizer.
  • the residual activity was 27% when stored at 37 ° C. for 4 weeks.
  • the residual activity when stored at 37 ° C for 3 weeks is 79%, and the highest stabilizing effect can be confirmed. It was.
  • composition produced according to the present invention can be supplied as a raw material for the PEA concentration determination kit.

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Abstract

入手が容易で、品質が均一であり、酵素製品や酵素を含む組成物の外観や性能、品質に影響を与えない安定化剤を使用することで、優れた安定化効果を示すエタノールアミンリン酸リアーゼ組成物及びその安定化方法を提供する。　（ａ）エタノールアミンリン酸リアーゼ、並びに（ｂ）糖、糖アルコール、有機酸およびポリペプチドよりなる群から選ばれるいずれか１つ以上の化合物を含有することを特徴とするエタノールアミンリン酸リアーゼ組成物及びエタノールアミンリン酸リアーゼの安定化方法。

Description

エタノールアミンリン酸リアーゼ組成物
　本発明は、エタノールアミンリン酸（ＰＥＡ）リアーゼを含む組成物及びＰＥＡリアーゼを安定化する方法に関する。
　ＰＥＡリアーゼ［Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ-ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏ-ｌｙａｓｅ（ＥＣ ４．２．３．２）］は、エタノールアミンリン酸（ＰＥＡ）からアセトアルデヒド、リン酸およびアンモニアを生成する反応を触媒する酵素である。ＰＥＡは、近年うつ病のバイオマーカーとして注目され、ＰＥＡリアーゼを用いたＰＥＡの測定方法が提供されている（特許文献１及び２）。今後、酵素法による短時間かつ簡便な測定方法が、例えば地方の病院や診療所でも使用可能な診断薬やセンサーといった形態で確立・普及することが期待できる。
　一方、試薬やセンサに用いられる原料酵素はそのほとんどが乾燥状態（例えば粉末）の製品（乾燥品）として流通している。その理由としては、製品が軽く体積が小さいため、保管や輸送といった取り扱いが容易であり、乾燥しているため微生物汚染による腐敗の心配のないことが挙げられる。また、酵素の溶解濃度を使用目的に応じて自由に調整でき、溶解するための緩衝液の種類も任意に選定できるため、様々な用途に展開できる。さらに、一般的に乾燥状態である方が、溶液状態であるよりも酵素活性が安定的に長期間保持できる。
　酵素を乾燥状態にする手段は様々である。例えば、酵素タンパク質を含む溶液中からアセトンやアルコール等の有機溶媒によって目的酵素を析出させ、これを回収して乾燥粉末とする方法、酵素を含む溶液を噴霧し熱風を当てて乾燥させるスプレードライ法、酵素を含む溶液を凍結させ、減圧して乾燥するフリーズドライ法などがある。
　いずれの条件にしても、酵素を不用意に乾燥させた場合、タンパク質変性による活性の損失や再溶解時の濁質生成等の問題が発生することが多いため、酵素タンパク質を保護し変性失活を防ぐための安定化剤の添加が不可欠である。実際、ＰＥＡリアーゼを粉末化すると活性損失と再溶解時の濁質生成が確認されており、対策が必要であった。酵素製品に添加する安定化剤は、単に製品化時、乾燥による酵素タンパク質の変性失活を防止するだけでなく、保存中や流通過程での活性損失を防止する能力も具備する必要がある。
特許第５６８８１６３号 ＷＯ２０１１／０１９０７２
　本発明の目的は、ＰＥＡリアーゼの安定化剤として、入手が容易で、品質が均一であり、酵素製品や酵素を含む組成物の外観や性能、品質に影響を与えない安定化剤を使用したＰＥＡリアーゼ組成物を提供することである。
　本発明者らは、ＰＥＡリアーゼ組成物、特には乾燥状態のＰＥＡリアーゼ組成物の保存安定性を向上させるべく、種々の物質を検討した。その結果、糖、糖アルコール、有機酸およびポリペプチドのいずれか１つ以上の化合物を共存させることによってＰＥＡリアーゼの安定性が大きく向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下に関する。
項１．（ａ）エタノールアミンリン酸リアーゼ、並びに（ｂ）糖、糖アルコール、有機酸およびポリペプチドよりなる群から選ばれるいずれか１つ以上の化合物を含有するエタノールアミンリン酸リアーゼ組成物。
項２．（ｂ）の化合物がα-シクロデキストリン、トレハロース、イノシトール、クエン酸牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＨＳＰ７０サブユニットＤｎａＫフラグメントおよびセリシンよりなる群から選ばれるいずれか１つ以上である、項１に記載のエタノールアミンリン酸リアーゼ組成物。
項３．（ｂ）の化合物がトレハロース、クエン酸およびＨＳＰ７０サブユニットＤｎａＫよりなる群から選ばれるいずれか１つ以上である、項２に記載のエタノールアミンリン酸リアーゼ組成物。
項４．（ｂ）の化合物がエタノールアミンリン酸リアーゼのタンパク質量に対し、５０～１００重量％含まれる項１～３のいずれかに記載のエタノールアミンリン酸リアーゼ組成物。
項５．エタノールアミンリン酸リアーゼが下記（ａ）～（ｃ）のいずれかのタンパク質である項１～４のいずれかに記載のエタノールアミンリン酸リアーゼ組成物。　
　（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
　（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加もしくは置換されているアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＰＥＡリアーゼ活性を有するタンパク質
　（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、エタノールアミンリン酸リアーゼ活性を有するポリペプチド
項６．項１～５のいずれかに記載の組成物を含むうつ病診断薬。
項７．エタノールアミンリン酸リアーゼに、糖、糖アルコール、有機酸およびポリペプチドよりなる群から選ばれるいずれか１つ以上の化合物を共存させることによりエタノールアミンリン酸リアーゼを安定化する方法。
　本発明により、ＰＥＡリアーゼの乾燥品、特に凍結乾燥製品の安定性を確保し、長期間の保存においても酵素の失活を防止することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．ＰＥＡリアーゼ
１－１．ＰＥＡリアーゼ活性
　「ＰＥＡリアーゼ（Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ-ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏ-ｌｙａｓｅ）」は、エタノールアミンリン酸（ＰＥＡ）からアセトアルデヒド、リン酸およびアンモニアを生成する反応を触媒する活性（即ち、ＰＥＡリアーゼ活性）を持つ酵素であり、微生物から哺乳類動物まで広く同定されている。
　ＰＥＡリアーゼ活性は、例えば特許文献１に記載される方法に基づき測定することができる。すなわち、第１反応にてＰＥＡを加水分解してアセトアルデヒド、リン酸、およびアンモニアを生成した後、第２反応にてアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）と酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）を添加し、第１反応で生成したアセトアルデヒドを酸化して酢酸とする。この第２反応でＮＡＤ＋は還元されて還元型ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）となるが、ＮＡＤＨのみが３４０ｎｍの紫外線を強く吸収するため、反応前後における３４０ｎｍの波長における試料の吸光度の変化を指標に、活性を測定することができる。より具体的には、下記の試薬及び測定条件を用いて活性を測定することができる。
　ＰＥＡリアーゼ活性の測定方法
＜試薬＞
反応液（１）
　２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）
１００ｍＭ　ＫＣｌ水溶液
０．８ｍＭ　エチレングリコールビス(２-アミノエチルエーテル)‐Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ'－四酢酸（ＥＧＴＡ）溶液
５．０μＭ　ピリドキサール－５’－リン酸（ＰＬＰ）溶液
　２０Ｕ／ｍＬ　ＡＬＤＨ溶液
反応液（２）
　２０ｍＭ　ＮＡＤＨ溶液
反応液（３）
６００ｍＭ　ＰＥＡ溶液
酵素希釈溶液
　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）
３００ｍＭ　ＮａＣｌ溶液
＜手順１＞
ＰＥＡリアーゼ溶液を、予め氷冷した上記酵素希釈溶液で０．６～１．２Ｕ／ｍｌに希釈し、氷冷保存したものを酵素溶液とする。
＜手順２＞
予め調製した反応液（１）１０ｍＬに対し、反応液（２）０．１ｍＬ、反応液（３）０．１ｍＬを混合し、３７℃にて５分間予備加温したものを反応混液とする。
＜測定条件＞
　反応混液２．９ｍＬに酵素溶液０．１ｍＬを添加し、ゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計（光路長１．０ｃｍ）で、３４０ｎｍの吸光度変化を２～３分間記録し、その後直線部分から（即ち、反応速度が一定になってから）１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検は酵素溶液の代わりにＰＥＡリアーゼを溶解する酵素希釈溶液を反応混液に加えて、同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＰＥＡリアーゼ活性を求める。ここでＰＥＡリアーゼ活性における１単位（Ｕ）とは、上記の測定条件で１分間に１μｍоｌのＮＡＤＨを減少させる酵素量である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
なお、式中の３．０は反応混液の液量（ｍＬ）を、６．２２はＮＡＤＨのミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／μｍоｌ）を、１．０は光路長（ｃｍ）を、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）を示す。本発明においては、別段の表示をしない限り、酵素活性は上記の測定方法に従って測定される。
　本発明に適用されるＰＥＡリアーゼは、単離されたＰＥＡリアーゼ又は精製されたＰＥＡリアーゼであることが好ましい。また、本発明に適用されるＰＥＡリアーゼは、保存に適した溶液中に溶解した状態又は凍結乾燥された状態（例えば、粉末状）で存在してもよい。本発明に適用される酵素（ＰＥＡリアーゼ）に関して使用する場合の「単離された」とは、当該酵素以外の成分（例えば、宿主細胞に由来する夾雑タンパク質、他の成分、培養液等）を実質的に含まない）状態をいう。具体的には例えば、本発明に適用される単離された酵素は、夾雑タンパク質の含有量が重量換算で全体の約２０％未満、好ましくは約１０％未満、更に好ましくは約５％未満、より一層好ましくは約１％未満である。一方で、本発明に適用されるＰＥＡリアーゼは、保存又は酵素活性の測定に適した溶液（例えば、バッファー）中に存在してもよい。
１－２．ポリペプチド
　本発明に適用されるＰＥＡリアーゼは、下記（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチドで構成されることが好ましい。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加および／または逆位したアミノ酸配列からなり、ＰＥＡリアーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、ＰＥＡリアーゼ活性を有するポリペプチド。
　配列番号１で示されるアミノ酸配列は、ヒト由来のＰＥＡリアーゼのアミノ酸配列である。
　上記（ｂ）のポリペプチドは、ＰＥＡリアーゼ活性を保持する限度で、配列番号１に示されるアミノ酸において、１若しくは数個のアミノ酸配残基が置換、欠失、挿入及び／又は付加（以下、これらを纏めて「変異」とする場合がある。）されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。ここで「数個」とは、ＰＥＡリアーゼ活性が維持される限り制限されないが、例えば、全アミノ酸の約２０％未満に相当する数であり、好ましくは約１５％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約１０％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約５％未満に相当する数であり、最も好ましくは約１％未満に相当する数である。より具体的には、変異されるアミノ酸残基の個数は、例えば、２～１２７個、好ましくは２～９６個、より好ましくは２～６４個、更に好ましくは２～３２個であり、一層好ましくは２～２０個、より一層好ましくは２～１５個、特に好ましくは２～１０個、最も好ましくは２～５個である。
　一又は数個の変異は、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法やランダム突然変異導入法など公知の手法を利用して本発明のＰＥＡリアーゼをコードするＤＮＡに変異を導入することによって実施することが可能である。また、紫外線照射など他の方法によってもバリアントＰＥＡリアーゼを得ることができる。バリアントＰＥＡリアーゼには、ＰＥＡリアーゼを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じるバリアント（例えば、一塩基多型も含まれる。）
　また、ＰＥＡリアーゼの活性を維持するという観点からは、ＰＥＡリアーゼの活性部位又は基質結合部位に影響を与えない部位において上記変異が存在することが好ましい。
　上記（ｃ）のポリペプチドは、ＰＥＡリアーゼ活性を保持することを限度で、配列番号１に示されるアミノ酸配列と比較した同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。好ましくは、本発明のＰＥＡリアーゼが有するアミノ酸配列と配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性は８５％以上であり、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。このような一定以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上述するような公知の遺伝子工学的手法に基づいて作製することができる。
　アミノ酸配列の同一性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。例えば、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　ｌｏｃａｌ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｓｅａｒｃｈ　ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／　においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出することができる。本発明ではアミノ酸配列の同一性の計算にこの方法を用いる。
　本発明に適用されるＰＥＡリアーゼの別の由来として、例えば、土壌や河川・湖沼などの水系又は海洋に存在する微生物や各種動植物の表面または内部に常在する微生物等を挙げることができる。低温環境、火山などの高温環境、深海などの無酸素・高圧・無光環境、油田など特殊な環境に生育する微生物に由来するものを単離源としてもよい。
　本発明に適用されるＰＥＡリアーゼには、微生物から直接単離されるＰＥＡリアーゼだけでなく、単離されたＰＥＡリアーゼをタンパク質工学的な方法によりアミノ酸配列等を改変したものや、遺伝子工学的手法により改変したものも含まれる。例えば、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒоｂａｃｔｏｒ）属に分類される微生物等から取得した酵素を改変したものであってもよい。
１－３．ＰＥＡリアーゼの製造方法
　本発明に適用されるＰＥＡリアーゼを製造する方法は特に限定されないが、例えば、ＰＥＡリアーゼを発現する微生物を培養し、得られた培養液を精製することによって製造することができる。
　一般に、目的のタンパク質を、該タンパク質を発現する微生物を培養し、得られた培養液を精製することによって製造する方法は既に当該技術分野において確立されている。よって、当業者はその知見を適用してＰＥＡリアーゼを製造することができ、その態様は特に制限されない。
　本発明に適用されるＰＥＡリアーゼの製造方法において、ＰＥＡリアーゼの発現系を構築する方法は特に限定されない。例えば、ＰＥＡリアーゼの生産能を有する微生物をそのまま発現系として用いればよい。あるいは、ＰＥＡリアーゼをコードするＤＮＡを適当な宿主ベクター系に導入して作製した遺伝子組み換え体（以下「形質転換体」とも言う）を発現系としてもよい。産業上は、制御がしやすい、安全性がより高い等の理由で遺伝子組み換え体を用いることが好ましい。
　遺伝子組み換え体を作製する場合、ＰＥＡリアーゼをコードするＤＮＡは、標準的な遺伝子工学的手法を用いて容易に調製することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｄ　Ｅｄ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ」、日本生化学会編（１９８６）等参照）。具体的には、上述の、本発明に適用されるＰＥＡリアーゼが発現される適当な起源微生物より、ｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ｃＤＮＡライブラリーから、前記ＰＥＡリアーゼのＤＮＡ配列に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより実施できる。
　上記の微生物からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング、塩基配列の決定等は、いずれも常法に従って実施することができる。ＰＥＡリアーゼのＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。例えば、ｃＤＮＡによって産生されるポリペプチドに対して、該ポリペプチド特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のヌクレオチド配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等、あるいはこれらの組合せ等を適宜選択して実施することができる。
　ＤＮＡの取得に際しては、ＰＣＲ法またはその変法によるＤＮＡ若しくはＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。ＰＣＲ法に使用されるプライマーも上記で決定した塩基配列に基づいて適宜設計し合成することができる。尚、増幅させたＤＮＡ若しくはＲＮＡ断片の単離精製は、例えばゲル電気泳動法、ハイブリダイゼーション法等によることができる。
　ＰＥＡリアーゼをコードするＤＮＡは、適当な発現ベクターに組み込むことができる。発現ベクターは、適当な宿主細胞内で該ＤＮＡを複製可能であり、且つ、その発現が可能である限り、その種類や構造は特に限定されない。ベクターの種類は、宿主細胞の種類を考慮して適当に選択される。このようなベクターの具体例としては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）等を挙げることができる。
　ＰＥＡリアーゼをコードするＤＮＡが組み込まれた発現ベクターは、適当な宿主細胞に導入され、該ＰＥＡリアーゼを産生する能力を有する形質転換体とすることができる。宿主細胞は、そのＤＮＡを発現してＰＥＡリアーゼを生産することが可能である限り、特に制限されない。具体的には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、糸状菌などのカビ、昆虫細胞、植物培養細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。中でも大腸菌、枯草菌、糸状菌が好ましい。大腸菌が特に好ましい。
　また、形質転換体においては、通常、外来性のＤＮＡが宿主細胞中に存在するが、ＤＮＡが由来する微生物を宿主とする、いわゆるセルフクローニングによって得られる形質転換体も好適な実施形態である。
　上記の形質転換体は、好ましくは、上記に示される発現ベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって調製される。形質転換は、一過性であっても安定的な形質転換であってもよい。トランスフェクション及びトランスフォーメーションはリン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、Ｈａｎａｈａｎの方法、酢酸リチウム法、プロトプラスト－ポリエチレングリコール法等を利用して実施することができる。
　本発明に適用されるＰＥＡリアーゼは、ＰＥＡリアーゼを発現する遺伝子組換え体を培養し、得られた培養液を精製することにより製造することができる。培養方法及び培養条件は、ＰＥＡリアーゼが生産される限り特に限定されない。即ち、ＰＥＡリアーゼが生産されることを条件として、使用する微生物の生育に適合した方法及び条件を適宜設定できる。
　得られた培養液を回収する方法としては、ＰＥＡリアーゼを菌体外に分泌する微生物を用いる場合は、例えば培養上清をろ過、遠心処理等することによって不溶物を除去した後、限外ろ過膜による濃縮、硫安沈殿等の塩析、透析、各種クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて分離、精製を行うことによりＰＥＡリアーゼを得ることができる。
　他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理、機械的手法、又はリゾチーム等の酵素を利用した手法等によって破砕した後、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加してＰＥＡリアーゼを可溶化し、水溶液として分離採取し、分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。
　精製は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿処理、加熱処理や等電点処理、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせて実施することができる。
　該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
　なお、培養液からのＰＥＡリアーゼ活性を有するタンパク質の採取（抽出、精製など）にあたっては、ＰＥＡリアーゼ活性及び熱安定性のうちいずれか１つ以上を指標に行うのが好ましい。
　組換えタンパク質として本酵素を得ることにすれば種々の修飾が可能である。例えば、本酵素をコードするＤＮＡと他の適当なＤＮＡとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行うことで、任意のペプチドないしタンパク質が連結された組換えタンパク質からなるＰＥＡリアーゼを得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、あるいはＮ末端若しくはＣ末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。上記のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。
　なお、上記１－３に記載の方法で製造するまでもなく、市販品として適当なものがあれば、それを本発明に適用しても差し支えない。
２．糖、糖アルコール、有機酸およびポリペプチドよりなる群から選ばれるいずれか１つ以上の化合物
本発明に適用される糖、糖アルコール、有機酸およびポリペプチドから選ばれる化合物は特に限定されないが、好ましい例として、糖ではシュークロース、ガラクトース、アラビノース、リボース、メリビオース、メレジトース、デキストリン、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、γ－シクロデキストリン、糖アルコールではイノシトール、ソルビトール、アラビトール、キシリトール、グルシトール、リビトール、Ｄ－マンニトール、有機酸ではクエン酸３ナトリウム二水和物、グルコン酸ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、ポリペプチドでは牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、大腸菌由来ＨＳＰ７０のメジャーサブユニットであるＤｎａＫのＡＴＰａｓｅ領域を欠損させたフラグメント（例えばＢＰＦ－３０１；東洋紡製）、セリシンなどが例示される。より好ましくは、トレハロース、クエン酸、ＢＰＦ－３０１等を挙げることができる。
　これらの化合物は、安定化剤として、酵素の乾燥製品化の工程で酵素タンパク質を保護し工程での回収率を向上させ、乾燥製品の保存期間中の失活を防止する目的であるから、その目的を達成し得る範囲で適宜添加量を設定できる。したがってこれらの共存させる各化合物の濃度は特に限定されるものではないが、好ましい下限は３０重量％、更に好ましくは４０重量％、更に好ましくは５０重量％である。夾雑物の持込の危険性の観点からは、好ましい上限は３００重量％、更に好ましくは２００重量％、更に好ましくは１００重量％である。なお、これらの添加濃度は、ＰＥＡリアーゼ酵素タンパク質に対する重量％で表している。例えば、４０ｍｇ／ｍｌのＰＥＡリアーゼに対して１００重量％の安定化剤を添加したとすると、１ｍｌあたり４０ｍｇ安定化剤を溶解したことになる。また、添加された化合物は酵素が溶液の状態であっても保護作用を有し、溶液中酵素活性の安定的な保持に寄与する。
　上記に示すＰＥＡリアーゼの抽出・精製・乾燥化、および安定性試験に用いる緩衝液の組成は特に限定しないが、好ましくはｐＨ４～９の範囲で緩衝能を有するものであればよく、例えばホウ酸、トリス塩酸、リン酸カリウム等の緩衝剤や、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ，ＣＨＥＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅといったグッド緩衝剤が挙げられる。また、フタル酸、マレイン酸、グルタル酸などのような、ジカルボン酸をベースとした緩衝剤も挙げることができる。これらのうち１種のみを適用してもよいし、２種以上を併せて用いてもよい。更には上記以外を含む１種以上の複合組成であってもよい。また、必要に応じて緩衝液中にＥＤＴＡ等のキレート剤、および／または、界面活性剤を含んでいてもよい。
　これらの添加濃度としては、緩衝能を持つ範囲であれば特に限定されないが、好ましい上限は１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。また、好ましい下限は５ｍＭ以上である。
　乾燥粉末あるいは凍結乾燥物などの中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１％（重量比）以上、特に好ましくは０．１～８０％（重量比）の範囲で使用される。
　これらは、種々の市販の試薬を用いることができる。
　乾燥工程に供する酵素液は、好ましくはタンパク質濃度として５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１０ｇ／Ｌ以上であるように濃度を調整する。乾燥工程に供する酵素があまりに希薄な場合、乾燥工程で回収率が低下することが多く、得られた乾燥製品が取り扱いにくい形状となることが多い。また、過度に高濃度である場合、乾燥に時間がかかることがある。
３．組成物
　本発明の組成物は、上記１で示したＰＥＡリアーゼ、並びに上記２で説明した糖、糖アルコール、有機酸、およびポリペプチドよりなる群から選ばれるいずれか１つ以上の化合物を含むことを特徴とする組成物である。
　本発明の組成物の形態は特に限定されない。凍結乾燥や粉末などの乾燥状態および液体状態のどちらでもよい。
４．安定化方法
　本発明のＰＥＡリアーゼの安定化方法は、（ａ）ＰＥＡリアーゼ、並びに（ｂ）糖、糖アルコール、有機酸およびポリペプチドよりなる群から選ばれるいずれか１つ以上の化合物を共存させることを特徴とする。
　上記（ａ）、（ｂ）以外に他の成分が共存していても良く、その組成は特に限定されない。ＰＥＡリアーゼの用途に応じて、特に制限を受けることなく適宜選択することが出来る。
　本発明におけるＰＥＡリアーゼの安定性とは、ＰＥＡリアーゼを３７℃で３週間保存した後、維持されているＰＥＡリアーゼの残存率（％）が安定化剤を添加しない場合に比して増大するか、あるいは少なくともＰＥＡリアーゼ活性が維持されることを意味する。
　具体的には、安定性が向上しているかどうかの判断は、以下のようにして行った。
　後述のＰＥＡリアーゼ酵素活性の測定方法に記載の活性測定法において、乾燥化を行った後の乾燥品重量あたりのＰＥＡリアーゼ活性値（ａ）と、一定温度で一定期間保存した後の乾燥品重量あたりのＰＥＡリアーゼ活性値（ｂ）を測定し、測定値（ａ）を１００とした場合に対する相対値（（ｂ）／（ａ）×１００）を求めた。この相対値を残存率とした。そして、該化合物の添加の有無を比較して、添加により残存率が増大した場合、安定性が向上したものと判断した。
５．ＰＥＡリアーゼを含むうつ病診断薬
　本発明の別の態様は、上記の３で説明したＰＥＡリアーゼ組成物を含むうつ病診断薬である。具体的には、測定サンプルに、ＰＥＡリアーゼを添加し、アセトアルデヒド、リン酸、およびアンモニアを生成させる第１の酵素反応を行う第１の工程と、生成した前記アセトアルデヒド、前記リン酸、前記アンモニアの少なくともいずれかを定量して、前記測定サンプル中のＰＥＡ量を決定する第２の工程とを含む、ＰＥＡの測定方法を利用した、うつ病診断薬である。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　実施例１　形質転換体の取得
　配列番号１のポリペプチドをコードする構造遺伝子をＥｕｒｏｆｉｎ社により合成した。合成遺伝子から制限酵素処理によりｐＥＴ２８ｂ（＋）ベクターへ導入し、これを組換え発現プラスミドｐＥＴ－ＥＰＬと命名した。この発現プラスミドをエシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）株コンピテントセルに形質転換し、ＳＯＣ培地中で１ｈｒ、３７℃で前培養後、ＬＢ－ａｍｐ寒天培地に展開し、コロニーである該形質転換体を取得した。得られた形質転換体を、エシェリヒア・コリーＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－ＥＰＬ）と命名した。
実施例２　酵素の準備
　実施例１にて取得した形質転換体、エシェリヒア・コリーＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－ＥＰＬ）のコロニーを一白金耳試験管５ｍｌのＬＢ－ａｍｐ液体培地に植菌し、３０℃で１６時間培養した。これを種培養とした。
　次に、ＴＢ液体培地（トリプトン１．２％、イーストイクストラクト２．４％、グリセロール０．４％、ＫＨ２ＰＯ４　０．２３％、Ｋ２ＨＰＯ４　１．２５％、ｐＨ７．０）を試験管に入れ、オートクレーブで滅菌し、本培養培地の培地とした。
　ＴＢ培地５００ｍＬを２Ｌ坂口フラスコに入れ、オートクレーブで滅菌し、本培養培地とした。５ｍＬの種培養液を本培養培地に植菌し、培養温度３７℃、１８０ｒｐｍでおよそ３時間振とう培養した。ＯＤ６６０がおよそ３．０に到達したことを確認した後、終濃度が１ｍＭになるようＩＰＴＧを添加し、ＰＥＡリアーゼ発現を誘導して、さらに培養温度２０℃、１８０ｒｐｍでおよそ２１時間培養した。その後、菌体を遠心分離により集菌し、菌体を回収した。得られた菌体を３００ｍＭ　ＮａＣｌ、４０μＭ　ＰＬＰ、５％Ｇｌｙｃｅｒｏｌを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。
　懸濁液をフレンチプレス（Ｎｉｒｏ　Ｓｏａｖｉ製、ＮＳ１００１Ｌ２Ｋ型）に流速１６０ｍＬ／分で送液し、７００～１０００ｂａｒで破砕した。破砕液を遠心除濁したのち、合成時にあらかじめＰＥＡリアーゼのＮ末に導入していたＨｉｓタグに対するアフィニティー精製を行った。この精製はＨＰＬＣにより実施し、Ｉｍｉｄａｚｏｌのグラジエント溶出で得られたフラクションのＰＥＡリアーゼ活性を測定して活性が確認されたフラクションをプール液とした。このプール液はさらに、中空糸フィルター（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ製、ポリエーテルスルホンまたはポリスルホン素材）を用いた加水濃縮によりＩｍｉｄａｚｏｌを除きつつ、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、４μＭ　ＰＬＰを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）へ置換され、粉末化に適当な濃度まで濃縮して精製酵素を得た。
実施例３　ＰＥＡリアーゼ粉末の安定化効果を有する化合物のスクリーニング
　エシェリヒア・コリーＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－ＥＰＬ）由来の精製酵素を用いて、α－シクロデキストリン、イノシトール（ｍｙｏ－イノシトール）、グリシン、グルコン酸ナトリウム、クエン酸３ナトリウム二水和物、ＢＳＡ、セリシン、ＢＰＦ－３０１（東洋紡製）が安定化効果を奏するか否かを検討した。表１にＰＥＡリアーゼと安定化剤の影響を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　実施例２で取得した標品は、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に約１０ｍｇ／ｍｌのＰＥＡリアーゼタンパク質を含んでいる。１００％濃度の安定化剤の検討は、１０ｍｇのＰＥＡリアーゼを含有する酵素液に対して、１０ｍｇの安定化剤を溶解して１００％濃度とし、活性測定を行った。各種安定化剤を添加した酵素溶液から正確に２ｍｌずつ、風袋重量を測定済みのバイアルに分取した。また、コントロールには、安定化剤を添加しないものを用意した。これを凍結真空乾燥（ＦＤＲ）して、水分を完全に蒸発させた後、バイアルの重量を測定し、風袋重量を差し引いて得られた粉末重量を算出した。その後に約１０ｍｇの粉末をスピッツロールに正確に計量し、（１）直ちに活性測定、（２）３７℃で３週間保存してから活性測定、を行い粉末重量あたりの活性を計算した。活性残存率は、ＦＤＲ直後の粉末重量あたりの活性を１００％として、３７℃処理後の各サンプルの粉末重量あたりの活性の割合を算出した。その結果、糖類、糖アルコール類、タンパク質類で何も添加しない場合と比較して安定性の向上が見られた（表１）。
　具体的には安定化剤が無添加の場合、３７℃で３週間保存すると残存活性が２０％であった。いずれの安定化剤を加えても、３７℃で３週間保存後の残存活性が２０％を上回り、安定化効果を確認することができた。中でもイノシトール、グルコン酸ナトリウム、クエン酸３ナトリウム二水和物、ＢＳＡ、ＢＰＦ－３０１を添加した場合には高い安定化効果を示した。
実施例４
　次に、実施例３で安定化効果が見られた化合物に対して、エシェリヒア・コリーＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－ＥＰＬ）由来の精製酵素を用いて、２種類以上の化合物を添加した場合の安定化効果を検証した。表２に、ＰＥＡリアーゼと安定化剤の影響を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　具体的には、安定化剤を無添加の場合、３７℃で４週間保存すると残存活性が１０％であった。安定化剤としてクエン酸３ナトリウム二水和物とＢＰＦ－３０１を同時に加えると、３７℃で３週間保存したときの残存活性が６９％となり、安定化効果を確認することができた。
実施例５
　さらに、実施例３において、３種類の化合物を同時に添加することにより、相乗効果を検討した。安定化効果が見られたクエン酸３ナトリウム二水和物とＢＰＦ－３０１の組み合わせに対し、エシェリヒア・コリーＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ－ＥＰＬ）由来の精製酵素を用いて、３種類目の化合物を同時に添加した場合の安定化効果を検証した。表３に、ＰＥＡリアーゼと安定化剤の影響を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　具体的には、安定化剤を無添加の場合、３７℃で４週間保存すると残存活性が２７％であった。安定化剤としてクエン酸３ナトリウム二水和物とＢＰＦ－３０１及びトレハロースを同時に加えると、３７℃で３週間保存したときの残存活性が７９％となり、最も高い安定化効果を確認することができた。
　本発明により製造した組成物は、ＰＥＡ濃度定量キットの原料としての供給が可能である。

Claims (7)

  1. （ａ）エタノールアミンリン酸リアーゼ、並びに（ｂ）糖、糖アルコール、有機酸およびポリペプチドよりなる群から選ばれるいずれか１つ以上の化合物を含有するエタノールアミンリン酸リアーゼ組成物。
  2. （ｂ）の化合物がα-シクロデキストリン、トレハロース、イノシトール、クエン酸牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＨＳＰ７０サブユニットＤｎａＫフラグメントおよびセリシンよりなる群から選ばれるいずれか１つ以上である、請求項１に記載のエタノールアミンリン酸リアーゼ組成物。
  3. （ｂ）の化合物がトレハロース、クエン酸およびＨＳＰ７０サブユニットＤｎａＫよりなる群から選ばれるいずれか１つ以上である、請求項２に記載のエタノールアミンリン酸リアーゼ組成物。
  4. （ｂ）の化合物がエタノールアミンリン酸リアーゼのタンパク質量に対し、５０～１００重量％含まれる請求項１～３のいずれかに記載のエタノールアミンリン酸リアーゼ組成物。
  5. エタノールアミンリン酸リアーゼが下記（ａ）～（ｃ）のいずれかのタンパク質である請求項１～４のいずれかに記載のエタノールアミンリン酸リアーゼ組成物。
    　（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
    　（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加もしくは置換されているアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＰＥＡリアーゼ活性を有するタンパク質
    　（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、エタノールアミンリン酸リアーゼ活性を有するポリペプチド
  6. 請求項１～５のいずれかに記載の組成物を含むうつ病診断薬。
  7. エタノールアミンリン酸リアーゼに、糖、糖アルコール、有機酸およびポリペプチドよりなる群から選ばれるいずれか１つ以上の化合物を共存させることによりエタノールアミンリン酸リアーゼを安定化する方法。
     
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