JPH07227282A - Ｌ−メチオニン γ−リアーゼの安定化法 - Google Patents
Ｌ−メチオニン γ−リアーゼの安定化法Info
- Publication number
- JPH07227282A JPH07227282A JP6337280A JP33728094A JPH07227282A JP H07227282 A JPH07227282 A JP H07227282A JP 6337280 A JP6337280 A JP 6337280A JP 33728094 A JP33728094 A JP 33728094A JP H07227282 A JPH07227282 A JP H07227282A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- methionine
- lyase
- freeze
- solution
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 L-メチオニン，L-システイン等のアミノ酸の
検出及び定量等に有用なL-メチオニン γ-リアーゼを簡
便に且つ長期間安定に保存するための方法を提供。 【構成】 L-メチオニン γ-リアーゼと、（１）オリゴ
糖、（２）水溶性多糖類、（３）糖アルコール、（４）
タンパク質、（５）酸性アミノ酸、（６）グルタチオン
及び（７）N-アセチルシステインから成る群より選ばれ
た１種又は２種以上の物質とを共存させた溶液を凍結乾
燥することを特徴とするLーメチオニン γーリアーゼの安
定化方法、及び該方法により安定化されたL-メチオニン
γ-リアーゼ。
検出及び定量等に有用なL-メチオニン γ-リアーゼを簡
便に且つ長期間安定に保存するための方法を提供。 【構成】 L-メチオニン γ-リアーゼと、（１）オリゴ
糖、（２）水溶性多糖類、（３）糖アルコール、（４）
タンパク質、（５）酸性アミノ酸、（６）グルタチオン
及び（７）N-アセチルシステインから成る群より選ばれ
た１種又は２種以上の物質とを共存させた溶液を凍結乾
燥することを特徴とするLーメチオニン γーリアーゼの安
定化方法、及び該方法により安定化されたL-メチオニン
γ-リアーゼ。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、L-メチオニン、L-シス
テイン等のアミノ酸の検出及び定量等に有用なL-メチオ
ニン γ-リアーゼを安定化するための方法に関する。
テイン等のアミノ酸の検出及び定量等に有用なL-メチオ
ニン γ-リアーゼを安定化するための方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】L-メチオニン γ-リアーゼ［EC 4.4.1.1
1］は、Pseudomonas属、Aeromonas属等の微生物に由来
する酵素で、下記式１及び式２に示すように、ピリドキ
サール5'-リン酸（ＰＬＰ）を補酵素として、L-メチオ
ニンならびにその誘導体のα,γ-脱離反応やγ-置換反
応を触媒するほか、L-システイン類縁体のα,β-脱離反
応やβ-置換反応をも触媒する多機能型のピリドキサー
ル酵素である。
1］は、Pseudomonas属、Aeromonas属等の微生物に由来
する酵素で、下記式１及び式２に示すように、ピリドキ
サール5'-リン酸（ＰＬＰ）を補酵素として、L-メチオ
ニンならびにその誘導体のα,γ-脱離反応やγ-置換反
応を触媒するほか、L-システイン類縁体のα,β-脱離反
応やβ-置換反応をも触媒する多機能型のピリドキサー
ル酵素である。
【式１】
【式２】
【０００３】L-メチオニン γ-リアーゼは基質特異性が
優れており、これを用いることによりL-メチオニン，L-
システイン等のアミノ酸類の検出及び定量が可能なた
め、臨床検査等の分野への利用が期待されている酵素で
ある。L-メチオニン γ-リアーゼはまた、その活性中心
にタンパク質のシステイン残基に由来するＳＨ基を持つ
酵素であり、酵素活性の発現にはこのＳＨ基が必須であ
る、いわゆるＳＨ酵素の１つである。一般にＳＨ酵素
は、Hg2+のような重金属、p-メルクリ安息香酸（ＰＭ
Ｂ）、N-エチルマレイミド、ヨード酢酸などのＳＨ試薬
やフェリシアン化物などの酸化剤で失活する性質を有し
ているため、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）等のキレート剤や、例えば2-メルカプトエタノール
（2-ＭＥ）やジチオスレイトール（ＤＴＴ）等のチオー
ル化合物を含む溶液中に共存させることによりその活性
を保護するのが一般的である。また、ＰＬＰ等の補酵素
を共存させ、その酵素活性を保護することも広く行われ
ている。
優れており、これを用いることによりL-メチオニン，L-
システイン等のアミノ酸類の検出及び定量が可能なた
め、臨床検査等の分野への利用が期待されている酵素で
ある。L-メチオニン γ-リアーゼはまた、その活性中心
にタンパク質のシステイン残基に由来するＳＨ基を持つ
酵素であり、酵素活性の発現にはこのＳＨ基が必須であ
る、いわゆるＳＨ酵素の１つである。一般にＳＨ酵素
は、Hg2+のような重金属、p-メルクリ安息香酸（ＰＭ
Ｂ）、N-エチルマレイミド、ヨード酢酸などのＳＨ試薬
やフェリシアン化物などの酸化剤で失活する性質を有し
ているため、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）等のキレート剤や、例えば2-メルカプトエタノール
（2-ＭＥ）やジチオスレイトール（ＤＴＴ）等のチオー
ル化合物を含む溶液中に共存させることによりその活性
を保護するのが一般的である。また、ＰＬＰ等の補酵素
を共存させ、その酵素活性を保護することも広く行われ
ている。
【０００４】しかし、L-メチオニン γ-リアーゼの場
合、このような方法を利用して溶液状態で保存しても室
温では酵素活性が著しく低下し、また、低温でも徐々に
酵素活性が低下して、50日以上の長期間保存後の酵素活
性は当初の30％以下となる。また、L-メチオニン γ-リ
アーゼをキレート剤、補酵素、ＤＴＴ等の共存下で凍結
乾燥して低温保存した場合でも、長期間の保存では酵素
活性がかなり低下してしまうという問題があった。ま
た、L-メチオニン γ-リアーゼの保存方法としては、Ｅ
ＤＴＡ、ＰＬＰ、2-ＭＥを含む0.1Ｍ以上のリン酸カリ
ウム緩衝液（pH7.2）に該酵素を添加、溶解した後、こ
れを-20℃で凍結保存し、これを50mMのＤＴＴを含む0.0
1Ｍリン酸カリウム溶液中で、０℃、１時間透析処理し
て使用するという方法も報告されている（Analytical B
iochemistry 138, 421-424 (1984)）が、この方法でもL
-メチオニン γ-リアーゼを長期間安定に保存すること
は難しい。従って、L-メチオニン γ-リアーゼを安定な
状態で長期間保存し得る方法の開発が望まれている現状
にある。
合、このような方法を利用して溶液状態で保存しても室
温では酵素活性が著しく低下し、また、低温でも徐々に
酵素活性が低下して、50日以上の長期間保存後の酵素活
性は当初の30％以下となる。また、L-メチオニン γ-リ
アーゼをキレート剤、補酵素、ＤＴＴ等の共存下で凍結
乾燥して低温保存した場合でも、長期間の保存では酵素
活性がかなり低下してしまうという問題があった。ま
た、L-メチオニン γ-リアーゼの保存方法としては、Ｅ
ＤＴＡ、ＰＬＰ、2-ＭＥを含む0.1Ｍ以上のリン酸カリ
ウム緩衝液（pH7.2）に該酵素を添加、溶解した後、こ
れを-20℃で凍結保存し、これを50mMのＤＴＴを含む0.0
1Ｍリン酸カリウム溶液中で、０℃、１時間透析処理し
て使用するという方法も報告されている（Analytical B
iochemistry 138, 421-424 (1984)）が、この方法でもL
-メチオニン γ-リアーゼを長期間安定に保存すること
は難しい。従って、L-メチオニン γ-リアーゼを安定な
状態で長期間保存し得る方法の開発が望まれている現状
にある。
【０００５】
【発明の目的】本発明は、上記した如き状況に鑑みなさ
れたもので、L-メチオニン γ-リアーゼを簡便に且つ長
期間安定化し得る方法を提供するものである。
れたもので、L-メチオニン γ-リアーゼを簡便に且つ長
期間安定化し得る方法を提供するものである。
【０００６】
【発明の構成】本発明は、L-メチオニン γ-リアーゼ
と、（１）オリゴ糖、（２）水溶性多糖類、（３）糖ア
ルコール、（４）タンパク質、（５）酸性アミノ酸、
（６）グルタチオン及び（７）N-アセチルシステインか
ら成る群より選ばれた１種又は２種以上の物質とを共存
させた溶液を凍結乾燥することを特徴とするLーメチオニ
ンγーリアーゼの安定化方法、及び該方法により安定化
されたLーメチオニン γーリアーゼの発明である。ま
た、本発明は、L-メチオニン γ-リアーゼ、オリゴ糖及
び、（１）タンパク質、（２）アミノ酸、（３）グルタ
チオン及び（４）N-アセチルシステインから成る群より
選ばれた１種又は２種以上の物質、とを共存させた溶液
を凍結乾燥することを特徴とするLーメチオニン γーリア
ーゼの安定化方法、及び該方法により安定化されたLーメ
チオニン γーリアーゼの発明である。
と、（１）オリゴ糖、（２）水溶性多糖類、（３）糖ア
ルコール、（４）タンパク質、（５）酸性アミノ酸、
（６）グルタチオン及び（７）N-アセチルシステインか
ら成る群より選ばれた１種又は２種以上の物質とを共存
させた溶液を凍結乾燥することを特徴とするLーメチオニ
ンγーリアーゼの安定化方法、及び該方法により安定化
されたLーメチオニン γーリアーゼの発明である。ま
た、本発明は、L-メチオニン γ-リアーゼ、オリゴ糖及
び、（１）タンパク質、（２）アミノ酸、（３）グルタ
チオン及び（４）N-アセチルシステインから成る群より
選ばれた１種又は２種以上の物質、とを共存させた溶液
を凍結乾燥することを特徴とするLーメチオニン γーリア
ーゼの安定化方法、及び該方法により安定化されたLーメ
チオニン γーリアーゼの発明である。
【０００７】即ち、本発明者らはLーメチオニン γーリア
ーゼを簡便に長期間安定化し得る方法を見出すべく鋭意
研究を重ねた結果、L-メチオニン γ-リアーゼと、
（１）オリゴ糖、（２）水溶性多糖類、（３）糖アルコ
ール、（４）タンパク質、（５）酸性アミノ酸、（６）
グルタチオン及び（７）N-アセチルシステインから成る
群より選ばれた１種又は２種以上の物質とを共存させた
溶液を凍結乾燥するか、又は、L-メチオニン γ-リアー
ゼ、オリゴ糖及び、（１）タンパク質、（２）アミノ
酸、（３）グルタチオン及び（４）N-アセチルシステイ
ンから成る群より選ばれた１種又は２種以上の物質、と
を共存させた溶液を凍結乾燥することによりその目的が
達せられることを見出し、本発明を完成するに至った。
ーゼを簡便に長期間安定化し得る方法を見出すべく鋭意
研究を重ねた結果、L-メチオニン γ-リアーゼと、
（１）オリゴ糖、（２）水溶性多糖類、（３）糖アルコ
ール、（４）タンパク質、（５）酸性アミノ酸、（６）
グルタチオン及び（７）N-アセチルシステインから成る
群より選ばれた１種又は２種以上の物質とを共存させた
溶液を凍結乾燥するか、又は、L-メチオニン γ-リアー
ゼ、オリゴ糖及び、（１）タンパク質、（２）アミノ
酸、（３）グルタチオン及び（４）N-アセチルシステイ
ンから成る群より選ばれた１種又は２種以上の物質、と
を共存させた溶液を凍結乾燥することによりその目的が
達せられることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】本発明に係るオリゴ糖としては、例えばサ
ッカロース，マルトース，ラクトース，トレハロース等
の二糖類、例えばラフィノース，マルトトリオース等の
三糖類等が好ましくが挙げられるが、特に好ましいのは
トレハロース、ラフィノース等である。また、水溶性多
糖類としては例えばデキストラン等が好ましく挙げられ
る。オリゴ糖または水溶性多糖類の添加割合としては、
凍結乾燥前の酵素溶液に於ける濃度として通常0.1〜20
（w/v）％、好ましくは１〜10（w/v）％の範囲が挙げら
れる。本発明に係る糖アルコールとしては、例えばソル
ビトール、マンニトール、キシリトール等が好ましく挙
げられ、その添加割合としては、凍結乾燥前の酵素溶液
に於ける濃度として通常0.1〜20（w/v）％、好ましくは
１〜10（w/v）％の範囲が挙げられる。本発明に係るタ
ンパク質としては、例えばゼラチン加水分解物が好まし
く挙げられ、その添加割合としては、凍結乾燥前の酵素
溶液に於ける濃度として通常0.1〜20（w/v）％、好まし
くは１〜10（w/v）％の範囲が挙げられる。本発明に係
る酸性アミノ酸としては、例えばグルタミン酸，アスパ
ラギン酸等或はこれらの塩（例えばアルカリ金属塩）等
が、また、その他のアミノ酸としては例えばグルタミ
ン，アスパラギン等が好ましく挙げられる。これらアミ
ノ酸の添加割合としては、凍結乾燥前の酵素溶液に於け
る濃度として通常0.1〜20 （w/v）％、好ましくは１〜1
0（w/v）％の範囲が挙げられる。本発明に係るグルタチ
オンやN-アセチルシステインの添加割合としては、凍結
乾燥前の酵素溶液に於ける濃度として通常１〜20 mM、
好ましくは５〜10mMの範囲が挙げられる。
ッカロース，マルトース，ラクトース，トレハロース等
の二糖類、例えばラフィノース，マルトトリオース等の
三糖類等が好ましくが挙げられるが、特に好ましいのは
トレハロース、ラフィノース等である。また、水溶性多
糖類としては例えばデキストラン等が好ましく挙げられ
る。オリゴ糖または水溶性多糖類の添加割合としては、
凍結乾燥前の酵素溶液に於ける濃度として通常0.1〜20
（w/v）％、好ましくは１〜10（w/v）％の範囲が挙げら
れる。本発明に係る糖アルコールとしては、例えばソル
ビトール、マンニトール、キシリトール等が好ましく挙
げられ、その添加割合としては、凍結乾燥前の酵素溶液
に於ける濃度として通常0.1〜20（w/v）％、好ましくは
１〜10（w/v）％の範囲が挙げられる。本発明に係るタ
ンパク質としては、例えばゼラチン加水分解物が好まし
く挙げられ、その添加割合としては、凍結乾燥前の酵素
溶液に於ける濃度として通常0.1〜20（w/v）％、好まし
くは１〜10（w/v）％の範囲が挙げられる。本発明に係
る酸性アミノ酸としては、例えばグルタミン酸，アスパ
ラギン酸等或はこれらの塩（例えばアルカリ金属塩）等
が、また、その他のアミノ酸としては例えばグルタミ
ン，アスパラギン等が好ましく挙げられる。これらアミ
ノ酸の添加割合としては、凍結乾燥前の酵素溶液に於け
る濃度として通常0.1〜20 （w/v）％、好ましくは１〜1
0（w/v）％の範囲が挙げられる。本発明に係るグルタチ
オンやN-アセチルシステインの添加割合としては、凍結
乾燥前の酵素溶液に於ける濃度として通常１〜20 mM、
好ましくは５〜10mMの範囲が挙げられる。
【０００９】本発明に係る上記各種添加剤（但し、グル
タミン，アスパラギン等のアミノ酸は除く。）はそれぞ
れ単独で用いても、２種以上適宜組み合わせて用いても
何れにても良いが、２種以上組み合わせて用いる場合、
その一つをオリゴ糖とし、他を蛋白質、アミノ酸（グル
タミン、アスパラギン等の酸性アミノ酸以外のアミノ酸
も含む。）、グルタチオン及びN-アセチルシステインか
ら成る群より選ばれた１種又は２種以上とした場合は、
更に高い効果が得られる。この場合、得られたLーメチオ
ニン γーリアーゼの凍結乾燥品は37℃で３ヶ月保存後で
も酵素活性は変動しない。
タミン，アスパラギン等のアミノ酸は除く。）はそれぞ
れ単独で用いても、２種以上適宜組み合わせて用いても
何れにても良いが、２種以上組み合わせて用いる場合、
その一つをオリゴ糖とし、他を蛋白質、アミノ酸（グル
タミン、アスパラギン等の酸性アミノ酸以外のアミノ酸
も含む。）、グルタチオン及びN-アセチルシステインか
ら成る群より選ばれた１種又は２種以上とした場合は、
更に高い効果が得られる。この場合、得られたLーメチオ
ニン γーリアーゼの凍結乾燥品は37℃で３ヶ月保存後で
も酵素活性は変動しない。
【００１０】本発明で用いられるLーメチオニン γーリア
ーゼは、Pseudomonas属、Aeromonas属等本酵素を産生す
る微生物を常法により培養し、適宜精製を行う等の常法
（Analytical Biochemistry 138, 421-424 (1984)等）
により得られたものを用いれば足りる。その一例を示せ
ば例えば以下の如く行えば良い。即ち、Pseudomonas
属、Aeromonas属等のLーメチオニン γーリアーゼを産生
する微生物をL-メチオニン、尿素、グリセリン、リン酸
塩、酵母エキス等を含む適当な培地中で、20〜37℃で15
〜30時間振盪培養する。培養した菌体を集め、これを適
当な方法、例えば酸化アルミニウムと共に摩砕する等の
方法により破砕した後、適当な緩衝液等で抽出を行って
粗酵素溶液を得る。これをイオン交換カラムクロマトグ
ラフィー等を用いる常法により精製すれば、L-メチオニ
ン γーリアーゼが得られる。尚、得られたLーメチオニン
γーリアーゼを含む溶液を更に限外濾過による濃縮処
理、透析処理する等は任意である。本発明を実施するに
は例えば以下のようにして行えば良い。即ち、上記した
如き方法により得られたLーメチオニン γーリアーゼと、
（１）オリゴ糖、（２）水溶性多糖類、（３）糖アルコ
ール、（４）タンパク質、（５）酸性アミノ酸、（６）
グルタチオン及び（７）N-アセチルシステインから成る
群より選ばれた１種又は２種以上の化合物とを共存させ
た溶液、或は、上記した如き方法により得られたLーメチ
オニン γーリアーゼと、オリゴ糖と、（１）タンパク
質、（２）アミノ酸、（３）グルタチオン及び（４）N-
アセチルシステインから成る群より選ばれた１種又は２
種以上の化合物とを共存させた溶液［これらの溶液に
は、要すれば例えばリン酸塩，トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン，グッド（Good's）等の緩衝剤、例え
ばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の金属マスキ
ング剤、本酵素の補酵素であるＰＬＰ等、Lーメチオニン
γーリアーゼ溶液中に適宜添加されるものをこの分野で
通常添加される濃度範囲内で含有していても良い。］
を、常法により凍結乾燥すれば良い。得られた凍結乾燥
品はそのまま適当な温度にて保存可能であるが、保存温
度が低い方がより長期の保存ができるので通常-40〜30
℃、好ましくは-40〜10℃、より好ましくは-40〜-20℃
で保存することが望ましい。
ーゼは、Pseudomonas属、Aeromonas属等本酵素を産生す
る微生物を常法により培養し、適宜精製を行う等の常法
（Analytical Biochemistry 138, 421-424 (1984)等）
により得られたものを用いれば足りる。その一例を示せ
ば例えば以下の如く行えば良い。即ち、Pseudomonas
属、Aeromonas属等のLーメチオニン γーリアーゼを産生
する微生物をL-メチオニン、尿素、グリセリン、リン酸
塩、酵母エキス等を含む適当な培地中で、20〜37℃で15
〜30時間振盪培養する。培養した菌体を集め、これを適
当な方法、例えば酸化アルミニウムと共に摩砕する等の
方法により破砕した後、適当な緩衝液等で抽出を行って
粗酵素溶液を得る。これをイオン交換カラムクロマトグ
ラフィー等を用いる常法により精製すれば、L-メチオニ
ン γーリアーゼが得られる。尚、得られたLーメチオニン
γーリアーゼを含む溶液を更に限外濾過による濃縮処
理、透析処理する等は任意である。本発明を実施するに
は例えば以下のようにして行えば良い。即ち、上記した
如き方法により得られたLーメチオニン γーリアーゼと、
（１）オリゴ糖、（２）水溶性多糖類、（３）糖アルコ
ール、（４）タンパク質、（５）酸性アミノ酸、（６）
グルタチオン及び（７）N-アセチルシステインから成る
群より選ばれた１種又は２種以上の化合物とを共存させ
た溶液、或は、上記した如き方法により得られたLーメチ
オニン γーリアーゼと、オリゴ糖と、（１）タンパク
質、（２）アミノ酸、（３）グルタチオン及び（４）N-
アセチルシステインから成る群より選ばれた１種又は２
種以上の化合物とを共存させた溶液［これらの溶液に
は、要すれば例えばリン酸塩，トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン，グッド（Good's）等の緩衝剤、例え
ばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の金属マスキ
ング剤、本酵素の補酵素であるＰＬＰ等、Lーメチオニン
γーリアーゼ溶液中に適宜添加されるものをこの分野で
通常添加される濃度範囲内で含有していても良い。］
を、常法により凍結乾燥すれば良い。得られた凍結乾燥
品はそのまま適当な温度にて保存可能であるが、保存温
度が低い方がより長期の保存ができるので通常-40〜30
℃、好ましくは-40〜10℃、より好ましくは-40〜-20℃
で保存することが望ましい。
【００１１】本発明の方法により得られたLーメチオニン
γーリアーゼの凍結乾燥品を実際の測定等に使用する際
には、通常これを水で再溶解して用いれば良いが、溶解
後の安定性を考慮するとＥＤＴＡ，ＰＬＰ，2-ＭＥやＤ
ＴＴなどを含む適当な緩衝液で再溶解することが望まし
い。以下に参考例、実施例及び比較例を挙げて本発明を
更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制約
を受けるものではない。
γーリアーゼの凍結乾燥品を実際の測定等に使用する際
には、通常これを水で再溶解して用いれば良いが、溶解
後の安定性を考慮するとＥＤＴＡ，ＰＬＰ，2-ＭＥやＤ
ＴＴなどを含む適当な緩衝液で再溶解することが望まし
い。以下に参考例、実施例及び比較例を挙げて本発明を
更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制約
を受けるものではない。
【００１２】
【実施例】以下の参考例、実施例及び比較例に於いて、
L-メチオニン γ-リアーゼの活性測定は次の方法により
行った。 ・L-メチオニン γ-リアーゼ活性測定方法 （試液） ・酵素溶解液 １mMのＥＤＴＡ、0.02mMのＰＬＰ及び0.01％の2-ＭＥを
含む0.1Ｍリン酸緩衝液（pH7.2）を酵素溶解液とした。 ・基質溶液 25mMのL-メチオニンと0.01mMのＰＬＰを含む0.1Ｍリン
酸カリウム緩衝液（pH8.0）を基質溶液とした。 （操作方法）基質溶液 2.0mlを37℃で５分間加温する。
これに適当量のL-メチオニン γ-リアーゼを含む酵素溶
解液 0.02mlを加え、正確に37℃で10分間反応させた
後、50％トリクロロ酢酸溶液 0.25mlを加えて反応を停
止させる。次にこの1.0mlと1.0Ｍ酢酸緩衝液（pH5.0）
2.0ml及び0.1％ 3-メチル-2-ベンゾチアゾリノンヒドラ
ゾン塩酸塩（ＭＢＴＨ）溶液 0.8mlとを混合し50℃で30
分間加熱した後、冷却して320nmの吸光度 Ａtを測定す
る。空試験として基質溶液 2.0mlに50％トリクロロ酢酸
溶液 0.25mlをあらかじめ加えたものを37℃で５分間加
温後、酵素溶解液 0.02mlを加えて更に37℃で10分間反
応させる。以下上記と同様に操作して吸光度 Ａbを測定
する。酵素活性値は次式により求める。 L-メチオニン γ-リアーゼ活性値（u/ml）＝（Ａt−Ａ
b）× 2.74
L-メチオニン γ-リアーゼの活性測定は次の方法により
行った。 ・L-メチオニン γ-リアーゼ活性測定方法 （試液） ・酵素溶解液 １mMのＥＤＴＡ、0.02mMのＰＬＰ及び0.01％の2-ＭＥを
含む0.1Ｍリン酸緩衝液（pH7.2）を酵素溶解液とした。 ・基質溶液 25mMのL-メチオニンと0.01mMのＰＬＰを含む0.1Ｍリン
酸カリウム緩衝液（pH8.0）を基質溶液とした。 （操作方法）基質溶液 2.0mlを37℃で５分間加温する。
これに適当量のL-メチオニン γ-リアーゼを含む酵素溶
解液 0.02mlを加え、正確に37℃で10分間反応させた
後、50％トリクロロ酢酸溶液 0.25mlを加えて反応を停
止させる。次にこの1.0mlと1.0Ｍ酢酸緩衝液（pH5.0）
2.0ml及び0.1％ 3-メチル-2-ベンゾチアゾリノンヒドラ
ゾン塩酸塩（ＭＢＴＨ）溶液 0.8mlとを混合し50℃で30
分間加熱した後、冷却して320nmの吸光度 Ａtを測定す
る。空試験として基質溶液 2.0mlに50％トリクロロ酢酸
溶液 0.25mlをあらかじめ加えたものを37℃で５分間加
温後、酵素溶解液 0.02mlを加えて更に37℃で10分間反
応させる。以下上記と同様に操作して吸光度 Ａbを測定
する。酵素活性値は次式により求める。 L-メチオニン γ-リアーゼ活性値（u/ml）＝（Ａt−Ａ
b）× 2.74
【００１３】参考例１ L-メチオニン γ-リアーゼの精
製 0.25％L-メチオニン、0.1％尿素、0.1％グリセリン、0.
1％ＫＨ2ＰＯ4、0.1％Ｋ2ＨＰＯ4、0.01％ＭｇＳＯ4・
７Ｈ2Ｏ及び0.025％酵母エキスを含む培地 600ml（pH7.
2）を２リットル坂口フラスコにとり、これにPseudomon
as putidaを一白金耳植菌し、28℃、120rpmで18時間振
盪培養した。その後、培養液を遠心分離して菌体を集
め、集めた菌体を乳鉢中で酸化アルミニウムとの摩砕に
より破砕した。破砕した菌体に10mMリン酸カリウム緩衝
液（pH7.2、10mM ＥＤＴＡを含む）を加えて懸濁した
後、遠心分離して粗酵素溶液を得た。10mMリン酸カリウ
ム緩衝液（pH7.2、10mM ＥＤＴＡを含む）で平衡化した
DEAE-Toyopearl 650Ｍカラム（東ソー(株)製）に上記粗
酵素溶液を吸着させた後、0.04Ｍ ＫＣｌ及び10mM ＥＤ
ＴＡを含む10mMリン酸緩衝液（pH7.2）で該カラムを充
分に洗浄した。次いで0.08Ｍ ＫＣｌ及び10mM ＥＤＴＡ
を含む10mMリン酸緩衝液（pH7.2）によって目的酵素を
溶出した。得られた酵素溶液に0.12Ｍ ＫＣｌを含む0.1
Ｍピロリン酸ナトリウム緩衝液（pH8.3）を添加してpH
を8.2±0.1に調整した後、これを0.12Ｍ ＫＣｌを含む
0.02Ｍピロリン酸ナトリウム緩衝液（pH8.3）で平衡化
したDEAE-Sephadex A-50カラム（ファルマシア バイオ
テク(株)製）に吸着させた。0.02Ｍピロリン酸ナトリウ
ム緩衝液（pH8.3、0.12Ｍ ＫＣｌ含有）で該カラムを充
分に洗浄した後、0.25ＭＫＣｌを含む0.02Ｍピロリン酸
ナトリウム緩衝液（pH8.3）によって目的酵素を溶出し
た。得られた精製酵素溶液を、ADVANTEC社製PM-30膜を
用いて限外濾過濃縮し、0.02mM ＰＬＰ、0.01％ 2-ＭＥ
を含む0.1Ｍリン酸カリウム緩衝液（pH7.2）（酵素溶解
液）で透析して、L-メチオニン γ-リアーゼを得た。
製 0.25％L-メチオニン、0.1％尿素、0.1％グリセリン、0.
1％ＫＨ2ＰＯ4、0.1％Ｋ2ＨＰＯ4、0.01％ＭｇＳＯ4・
７Ｈ2Ｏ及び0.025％酵母エキスを含む培地 600ml（pH7.
2）を２リットル坂口フラスコにとり、これにPseudomon
as putidaを一白金耳植菌し、28℃、120rpmで18時間振
盪培養した。その後、培養液を遠心分離して菌体を集
め、集めた菌体を乳鉢中で酸化アルミニウムとの摩砕に
より破砕した。破砕した菌体に10mMリン酸カリウム緩衝
液（pH7.2、10mM ＥＤＴＡを含む）を加えて懸濁した
後、遠心分離して粗酵素溶液を得た。10mMリン酸カリウ
ム緩衝液（pH7.2、10mM ＥＤＴＡを含む）で平衡化した
DEAE-Toyopearl 650Ｍカラム（東ソー(株)製）に上記粗
酵素溶液を吸着させた後、0.04Ｍ ＫＣｌ及び10mM ＥＤ
ＴＡを含む10mMリン酸緩衝液（pH7.2）で該カラムを充
分に洗浄した。次いで0.08Ｍ ＫＣｌ及び10mM ＥＤＴＡ
を含む10mMリン酸緩衝液（pH7.2）によって目的酵素を
溶出した。得られた酵素溶液に0.12Ｍ ＫＣｌを含む0.1
Ｍピロリン酸ナトリウム緩衝液（pH8.3）を添加してpH
を8.2±0.1に調整した後、これを0.12Ｍ ＫＣｌを含む
0.02Ｍピロリン酸ナトリウム緩衝液（pH8.3）で平衡化
したDEAE-Sephadex A-50カラム（ファルマシア バイオ
テク(株)製）に吸着させた。0.02Ｍピロリン酸ナトリウ
ム緩衝液（pH8.3、0.12Ｍ ＫＣｌ含有）で該カラムを充
分に洗浄した後、0.25ＭＫＣｌを含む0.02Ｍピロリン酸
ナトリウム緩衝液（pH8.3）によって目的酵素を溶出し
た。得られた精製酵素溶液を、ADVANTEC社製PM-30膜を
用いて限外濾過濃縮し、0.02mM ＰＬＰ、0.01％ 2-ＭＥ
を含む0.1Ｍリン酸カリウム緩衝液（pH7.2）（酵素溶解
液）で透析して、L-メチオニン γ-リアーゼを得た。
【００１４】実施例１ 参考例１で得たL-メチオニン γ-リアーゼを約0.24u/ml
含む酵素溶解液に、所定の単糖類、オリゴ糖又は水溶性
多糖類を５（w/v）％となるように添加、溶解したもの
を1.0mlずつバイアル瓶に小分し、常法により凍結乾燥
した。得られた凍結乾燥品を37℃で２週間保存した後、
酵素溶解液1.0mlで再溶解して酵素活性を測定した。得
られた結果を、凍結乾燥原液の酵素活性を100％とした
場合の凍結乾燥後の酵素の残存活性率（％）として表１
に示す。
含む酵素溶解液に、所定の単糖類、オリゴ糖又は水溶性
多糖類を５（w/v）％となるように添加、溶解したもの
を1.0mlずつバイアル瓶に小分し、常法により凍結乾燥
した。得られた凍結乾燥品を37℃で２週間保存した後、
酵素溶解液1.0mlで再溶解して酵素活性を測定した。得
られた結果を、凍結乾燥原液の酵素活性を100％とした
場合の凍結乾燥後の酵素の残存活性率（％）として表１
に示す。
【表１】 表１の結果から、添加剤を加えない凍結乾燥品の、37℃
で２週間保存後のL-メチオニン γ-リアーゼの残存活性
率が19％であるのに対して、単糖類を添加した凍結乾燥
品では残存活性率が０％であること、即ち、単糖類はL-
メチオニン γ-リアーゼの不活化を促進することが判
る。一方、本発明に係るサッカロース，マルトース，ラ
クトース，トレハロース等の二糖類、ラフィノース，マ
ルトトリオース等の三糖類あるいはデキストラン等の水
溶性多糖類を加えた凍結乾燥品では80％以上の残存活性
率を示しており、本発明の方法によりL-メチオニン γ-
リアーゼを安定に保存し得ることが判る。また、上記で
調製した凍結乾燥品を５℃で50日間保存した後、それぞ
れ再溶解して酵素活性を測定したところ、凍結乾燥後の
酵素の残存活性率は、添加剤を加えない凍結乾燥品では
55％であったのに対し、本発明に係るオリゴ糖や水溶性
多糖類を加えた凍結乾燥品ではいずれも100％であっ
た。以上のことから、本発明の安定化方法を利用するこ
とにより、L-メチオニンγ-リアーゼを極めて安定に保
存し得ることが判る。
で２週間保存後のL-メチオニン γ-リアーゼの残存活性
率が19％であるのに対して、単糖類を添加した凍結乾燥
品では残存活性率が０％であること、即ち、単糖類はL-
メチオニン γ-リアーゼの不活化を促進することが判
る。一方、本発明に係るサッカロース，マルトース，ラ
クトース，トレハロース等の二糖類、ラフィノース，マ
ルトトリオース等の三糖類あるいはデキストラン等の水
溶性多糖類を加えた凍結乾燥品では80％以上の残存活性
率を示しており、本発明の方法によりL-メチオニン γ-
リアーゼを安定に保存し得ることが判る。また、上記で
調製した凍結乾燥品を５℃で50日間保存した後、それぞ
れ再溶解して酵素活性を測定したところ、凍結乾燥後の
酵素の残存活性率は、添加剤を加えない凍結乾燥品では
55％であったのに対し、本発明に係るオリゴ糖や水溶性
多糖類を加えた凍結乾燥品ではいずれも100％であっ
た。以上のことから、本発明の安定化方法を利用するこ
とにより、L-メチオニンγ-リアーゼを極めて安定に保
存し得ることが判る。
【００１５】実施例２ 参考例１で得たL-メチオニン γ-リアーゼを約0.24u/ml
含む酵素溶解液に、糖アルコールであるソルビトール、
キシリトール又はマンニトールを５（w/v）％となるよ
うに添加、溶解したものを1.0mlずつバイアル瓶に小分
し、常法により凍結乾燥した。得られた凍結乾燥品を37
℃で２週間保存した後、酵素溶解液1.0mlで再溶解して
酵素活性を測定した。得られた結果を、凍結乾燥原液の
酵素活性を100％とした場合の凍結乾燥後の酵素の残存
活性率（％）として表２に示す。
含む酵素溶解液に、糖アルコールであるソルビトール、
キシリトール又はマンニトールを５（w/v）％となるよ
うに添加、溶解したものを1.0mlずつバイアル瓶に小分
し、常法により凍結乾燥した。得られた凍結乾燥品を37
℃で２週間保存した後、酵素溶解液1.0mlで再溶解して
酵素活性を測定した。得られた結果を、凍結乾燥原液の
酵素活性を100％とした場合の凍結乾燥後の酵素の残存
活性率（％）として表２に示す。
【表２】 表２の結果から、添加剤を加えない凍結乾燥品の37℃で
２週間保存後のL-メチオニン γ-リアーゼの残存活性率
は19％であるのに対して、本発明に係る糖アルコールを
加えた凍結乾燥品では、いずれも60％前後の残存活性率
を示していること、即ち、本発明の方法によりL-メチオ
ニン γ-リアーゼを安定に保存し得ることが判る。ま
た、上記で調製した凍結乾燥品を５℃で50日間保存した
後、それぞれ再溶解して酵素活性を測定したところ、凍
結乾燥後の酵素の残存活性率は、添加剤を加えない凍結
乾燥品では55％であったのに対し、本発明に係る糖アル
コールを加えた凍結乾燥品ではいずれも100％であっ
た。以上のことから、本発明の安定化方法を利用するこ
とにより、L-メチオニンγ-リアーゼを極めて安定に保
存し得ることが判る。
２週間保存後のL-メチオニン γ-リアーゼの残存活性率
は19％であるのに対して、本発明に係る糖アルコールを
加えた凍結乾燥品では、いずれも60％前後の残存活性率
を示していること、即ち、本発明の方法によりL-メチオ
ニン γ-リアーゼを安定に保存し得ることが判る。ま
た、上記で調製した凍結乾燥品を５℃で50日間保存した
後、それぞれ再溶解して酵素活性を測定したところ、凍
結乾燥後の酵素の残存活性率は、添加剤を加えない凍結
乾燥品では55％であったのに対し、本発明に係る糖アル
コールを加えた凍結乾燥品ではいずれも100％であっ
た。以上のことから、本発明の安定化方法を利用するこ
とにより、L-メチオニンγ-リアーゼを極めて安定に保
存し得ることが判る。
【００１６】実施例３ 参考例１で得たL-メチオニン γ-リアーゼを約0.26u/ml
含む酵素溶解液に、ゼラチン加水分解物（(株)ニッピ製
ＮＰ−２０００）又は牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を
５（w/v）％となるように添加、溶解したものを1.0mlず
つバイアル瓶に小分し、常法により凍結乾燥した。得ら
れた凍結乾燥品を37℃で３週間保存した後、酵素溶解液
1.0mlで再溶解して、酵素活性を測定した。得られた結
果を、凍結乾燥原液の酵素活性を100％とした場合の凍
結乾燥後の酵素の残存活性率（％）として表３に示す。
含む酵素溶解液に、ゼラチン加水分解物（(株)ニッピ製
ＮＰ−２０００）又は牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を
５（w/v）％となるように添加、溶解したものを1.0mlず
つバイアル瓶に小分し、常法により凍結乾燥した。得ら
れた凍結乾燥品を37℃で３週間保存した後、酵素溶解液
1.0mlで再溶解して、酵素活性を測定した。得られた結
果を、凍結乾燥原液の酵素活性を100％とした場合の凍
結乾燥後の酵素の残存活性率（％）として表３に示す。
【表３】 表３の結果から、添加剤を加えない凍結乾燥品の37℃で
３週間保存後のL-メチオニン γ-リアーゼの残存活性率
が15％であるのに対して、本発明に係るタンパク質を添
加した凍結乾燥品の残存活性率はこれよりも高いことが
判る。特に、ゼラチン加水分解物を加えた凍結乾燥品で
は85％の残存活性率を示した。また、上記で調製した凍
結乾燥品を５℃で50日間保存した後再溶解して酵素活性
を測定したところ、凍結乾燥後の酵素の残存活性率は、
添加剤を加えない凍結乾燥品では55％であったのに対
し、ゼラチン加水分解物を加えた凍結乾燥品では100％
であった。以上のことから、本発明の安定化方法を利用
することにより、L-メチオニンγ-リアーゼを極めて安
定に保存し得ることが判る。
３週間保存後のL-メチオニン γ-リアーゼの残存活性率
が15％であるのに対して、本発明に係るタンパク質を添
加した凍結乾燥品の残存活性率はこれよりも高いことが
判る。特に、ゼラチン加水分解物を加えた凍結乾燥品で
は85％の残存活性率を示した。また、上記で調製した凍
結乾燥品を５℃で50日間保存した後再溶解して酵素活性
を測定したところ、凍結乾燥後の酵素の残存活性率は、
添加剤を加えない凍結乾燥品では55％であったのに対
し、ゼラチン加水分解物を加えた凍結乾燥品では100％
であった。以上のことから、本発明の安定化方法を利用
することにより、L-メチオニンγ-リアーゼを極めて安
定に保存し得ることが判る。
【００１７】実施例４ 参考例１で得られたL-メチオニン γ-リアーゼを約0.15
u/ml溶解した酵素溶解液に、所定のアミノ酸を５（w/
v）％となるように添加、溶解したものを1.0mlずつバイ
アル瓶に小分し、常法により凍結乾燥した。得られた凍
結乾燥品を37℃で４週間保存した後、酵素溶解液1.0ml
で再溶解して酵素活性を測定した。得られた結果を、凍
結乾燥原液の酵素活性を100％とした場合の凍結乾燥後
の酵素の残存活性率（％）として表４に示す。
u/ml溶解した酵素溶解液に、所定のアミノ酸を５（w/
v）％となるように添加、溶解したものを1.0mlずつバイ
アル瓶に小分し、常法により凍結乾燥した。得られた凍
結乾燥品を37℃で４週間保存した後、酵素溶解液1.0ml
で再溶解して酵素活性を測定した。得られた結果を、凍
結乾燥原液の酵素活性を100％とした場合の凍結乾燥後
の酵素の残存活性率（％）として表４に示す。
【表４】 表４の結果から、添加剤を加えない凍結乾燥品の37℃で
４週間保存後のL-メチオニン γ-リアーゼの残存活性率
が14％であるのに対して、アミノ酸のうち本発明に係る
酸性アミノ酸であるグルタミン酸ナトリウム又はアスパ
ラギン酸ナトリウムを加えた凍結乾燥品では、いずれも
70％以上の活性を維持していることが判る。また、その
他のアミノ酸については、L-メチオニン γ-リアーゼの
安定化効果は見られないことも判る。また、上記で調製
した凍結乾燥品を５℃で50日間保存した後、それぞれ再
溶解して酵素活性を測定したところ、凍結乾燥後の酵素
の残存活性率は、添加剤を加えない凍結乾燥品では55％
であったのに対し、本発明に係る酸性アミノ酸を加えた
凍結乾燥品ではいずれも100％であった。以上のことか
ら、本発明の安定化方法を利用することにより、L-メチ
オニンγ-リアーゼを極めて安定に保存し得ることが判
る。
４週間保存後のL-メチオニン γ-リアーゼの残存活性率
が14％であるのに対して、アミノ酸のうち本発明に係る
酸性アミノ酸であるグルタミン酸ナトリウム又はアスパ
ラギン酸ナトリウムを加えた凍結乾燥品では、いずれも
70％以上の活性を維持していることが判る。また、その
他のアミノ酸については、L-メチオニン γ-リアーゼの
安定化効果は見られないことも判る。また、上記で調製
した凍結乾燥品を５℃で50日間保存した後、それぞれ再
溶解して酵素活性を測定したところ、凍結乾燥後の酵素
の残存活性率は、添加剤を加えない凍結乾燥品では55％
であったのに対し、本発明に係る酸性アミノ酸を加えた
凍結乾燥品ではいずれも100％であった。以上のことか
ら、本発明の安定化方法を利用することにより、L-メチ
オニンγ-リアーゼを極めて安定に保存し得ることが判
る。
【００１８】実施例５ 参考例１で得たL-メチオニン γ-リアーゼを約0.52u/ml
含む酵素溶解液に、ゼラチン加水分解物とサッカロース
（又はトレハロース）とをそれぞれ５（w/v）％となる
ように添加、溶解したものを1.0mlずつバイアル瓶に小
分し、常法により凍結乾燥した。得られた凍結乾燥品を
37℃で３ヶ月間保存した後、酵素溶解液1.0mlで再溶解
し、酵素活性を測定した。得られた結果を、凍結乾燥原
液の酵素活性を100％とした場合の凍結乾燥後の酵素の
残存活性率（％）として表５に示す。
含む酵素溶解液に、ゼラチン加水分解物とサッカロース
（又はトレハロース）とをそれぞれ５（w/v）％となる
ように添加、溶解したものを1.0mlずつバイアル瓶に小
分し、常法により凍結乾燥した。得られた凍結乾燥品を
37℃で３ヶ月間保存した後、酵素溶解液1.0mlで再溶解
し、酵素活性を測定した。得られた結果を、凍結乾燥原
液の酵素活性を100％とした場合の凍結乾燥後の酵素の
残存活性率（％）として表５に示す。
【表５】 表５の結果から、添加剤を加えない凍結乾燥品の37℃で
３ヶ月間保存後のL-メチオニン γ-リアーゼの残存活性
率が８％であるのに対して、ゼラチン加水分解物とサッ
カロース（又はトレハロース）とを組合せて添加した凍
結乾燥品では、いずれも100％の残存活性率を示してい
ることが判る。この結果と実施例１及び実施例３の結果
との比較から、本発明に係るオリゴ糖とタンパク質とを
組み合わせて用いることによりL-メチオニン γ-リアー
ゼをより安定に保存し得ることが判る。
３ヶ月間保存後のL-メチオニン γ-リアーゼの残存活性
率が８％であるのに対して、ゼラチン加水分解物とサッ
カロース（又はトレハロース）とを組合せて添加した凍
結乾燥品では、いずれも100％の残存活性率を示してい
ることが判る。この結果と実施例１及び実施例３の結果
との比較から、本発明に係るオリゴ糖とタンパク質とを
組み合わせて用いることによりL-メチオニン γ-リアー
ゼをより安定に保存し得ることが判る。
【００１９】比較例１ 参考例１で得たL-メチオニン γ-リアーゼを約2.84u/ml
含む酵素溶解液をそのまま５℃で50日間保存した後、酵
素活性を測定した。その結果、50日間低温保存後の酵素
活性は保存前の酵素活性の28％にまで低下していること
が判った。
含む酵素溶解液をそのまま５℃で50日間保存した後、酵
素活性を測定した。その結果、50日間低温保存後の酵素
活性は保存前の酵素活性の28％にまで低下していること
が判った。
【００２０】比較例２ 参考例１で得たL-メチオニン γ-リアーゼを約0.26u/ml
含む酵素溶解液に、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を1.
2mMとなるように添加したものを1.0mlずつバイアル瓶に
小分し、常法により凍結乾燥した。得られた凍結乾燥品
を37℃で１週間保存した後、酵素溶解液1.0mlで再溶解
して酵素活性を測定した。得られた結果を、凍結乾燥原
液の酵素活性を100％とした場合の凍結乾燥後の酵素の
残存活性率（％）として表６に示す。
含む酵素溶解液に、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を1.
2mMとなるように添加したものを1.0mlずつバイアル瓶に
小分し、常法により凍結乾燥した。得られた凍結乾燥品
を37℃で１週間保存した後、酵素溶解液1.0mlで再溶解
して酵素活性を測定した。得られた結果を、凍結乾燥原
液の酵素活性を100％とした場合の凍結乾燥後の酵素の
残存活性率（％）として表６に示す。
【表６】 表６の結果から、添加剤を加えない凍結乾燥品の37℃で
１週間保存後のL-メチオニン γ-リアーゼの残存活性率
が32％であるのに対してＤＴＴを添加した凍結乾燥品の
残存活性率は５％であること、即ち、ＤＴＴにはL-メチ
オニン γ-リアーゼの安定化効果はないことが判る。
１週間保存後のL-メチオニン γ-リアーゼの残存活性率
が32％であるのに対してＤＴＴを添加した凍結乾燥品の
残存活性率は５％であること、即ち、ＤＴＴにはL-メチ
オニン γ-リアーゼの安定化効果はないことが判る。
【００２１】比較例３ 参考例１で得たL-メチオニン γ-リアーゼを約1.67u/ml
含む酵素溶液を-20℃で50日間凍結保存した後、50mM Ｄ
ＴＴを含む0.01Ｍリン酸カリウム溶液中で１時間透析し
て再溶解したものについて酵素活性を測定した。その結
果、70日間凍結保存後の酵素活性は保存前の30％にまで
低下していることが判った。実施例６参考例１で得たL-
メチオニン γ-リアーゼを約2.72u/ml含む酵素溶解液
に、グルタチオン又はN-アセチルシステインを10mMとな
るように添加、溶解したものを1.0mlずつバイアル瓶に
小分し、常法によ り凍結乾燥した。得られた凍結乾燥
品を37℃で２ヶ月間保存した後、酵素溶解液1.0mlで再
溶解し、酵素活性を測定した。得られた結果を、凍結乾
燥原液の酵素活性を100％とした場合の凍結乾燥後の酵
素の残存活性率（％）として表７に示す。
含む酵素溶液を-20℃で50日間凍結保存した後、50mM Ｄ
ＴＴを含む0.01Ｍリン酸カリウム溶液中で１時間透析し
て再溶解したものについて酵素活性を測定した。その結
果、70日間凍結保存後の酵素活性は保存前の30％にまで
低下していることが判った。実施例６参考例１で得たL-
メチオニン γ-リアーゼを約2.72u/ml含む酵素溶解液
に、グルタチオン又はN-アセチルシステインを10mMとな
るように添加、溶解したものを1.0mlずつバイアル瓶に
小分し、常法によ り凍結乾燥した。得られた凍結乾燥
品を37℃で２ヶ月間保存した後、酵素溶解液1.0mlで再
溶解し、酵素活性を測定した。得られた結果を、凍結乾
燥原液の酵素活性を100％とした場合の凍結乾燥後の酵
素の残存活性率（％）として表７に示す。
【表７】 表７の結果から、添加剤を加えない凍結乾燥品の37℃で
２ヶ月間保存後のL-メチオニン γ-リアーゼの残存活性
率が１０％であるのに対して、グルタチオン又はN-アセ
チルシステインを添加した凍結乾燥品では、いずれも６
５％前後の残存活性率を示していること、即ちグルタチ
オンやN-アセチルシステインにはL-メチオニン γ-リ
アーゼの凍結乾燥時の失活を防止する効果があることが
判る。また、比較例２の結果から、チオール化合物の１
種であるＤＴＴにはL-メチオン γ-リアーゼの凍結乾
燥時の失活を防止する効果はないことが判明しているの
で、グルタチオンやN-アセチルシステインにこのような
効果があることは意外なことであった。
２ヶ月間保存後のL-メチオニン γ-リアーゼの残存活性
率が１０％であるのに対して、グルタチオン又はN-アセ
チルシステインを添加した凍結乾燥品では、いずれも６
５％前後の残存活性率を示していること、即ちグルタチ
オンやN-アセチルシステインにはL-メチオニン γ-リ
アーゼの凍結乾燥時の失活を防止する効果があることが
判る。また、比較例２の結果から、チオール化合物の１
種であるＤＴＴにはL-メチオン γ-リアーゼの凍結乾
燥時の失活を防止する効果はないことが判明しているの
で、グルタチオンやN-アセチルシステインにこのような
効果があることは意外なことであった。
【００２２】実施例７ 参考例１で得たL-メチオニン γ-リアーゼを約0.52u/ml
含む酵素溶解液に、トレハロース（又はサッカロース）
が５（w/v）％、又はトレハロース（又はサッカロー
ス）及びグルタミン（又はグルタミン酸Na）が夫々５
（W/V）％となるように添加、溶解したものを1.0mlずつ
バイアル瓶に小分し、常法によ り凍結乾燥した。得ら
れた凍結乾燥品を37℃で16ヶ月間保存した後、酵素溶解
液1.0mlで再溶解し、酵素活性を測定した。得られた結
果を、凍結乾燥原液の酵素活性を100％とした場合の凍
結乾燥後の酵素の残存活性率（％）として表８に示す。
含む酵素溶解液に、トレハロース（又はサッカロース）
が５（w/v）％、又はトレハロース（又はサッカロー
ス）及びグルタミン（又はグルタミン酸Na）が夫々５
（W/V）％となるように添加、溶解したものを1.0mlずつ
バイアル瓶に小分し、常法によ り凍結乾燥した。得ら
れた凍結乾燥品を37℃で16ヶ月間保存した後、酵素溶解
液1.0mlで再溶解し、酵素活性を測定した。得られた結
果を、凍結乾燥原液の酵素活性を100％とした場合の凍
結乾燥後の酵素の残存活性率（％）として表８に示す。
【表８】 表８の結果から、添加剤を加えない凍結乾燥品の37℃で
２ヶ月間保存後のL-メチオニン γ-リアーゼの残存活性
率が０％であるのに対して、トレハロース（又はサッカ
ロース）のみを添加した凍結乾燥品では、０％の残存活
性率を示し、トレハロース（又はサッカロース）とグル
タミン（又はグルタミン酸Na）とを組合せて添加した凍
結乾燥品では、３７〜６２％の残存活性率を示している
ことが判る。これらのことから、トレハロース（又はサ
ッカロース）とグルタミン（又はグルタミン酸Na）とを
組合せて用いることにより、L-メチオニン γ-リアー
ゼの凍結乾燥時の安定性を、トレハロース（又はサッカ
ロース）単独の場合よりも向上させることができること
が判る。
２ヶ月間保存後のL-メチオニン γ-リアーゼの残存活性
率が０％であるのに対して、トレハロース（又はサッカ
ロース）のみを添加した凍結乾燥品では、０％の残存活
性率を示し、トレハロース（又はサッカロース）とグル
タミン（又はグルタミン酸Na）とを組合せて添加した凍
結乾燥品では、３７〜６２％の残存活性率を示している
ことが判る。これらのことから、トレハロース（又はサ
ッカロース）とグルタミン（又はグルタミン酸Na）とを
組合せて用いることにより、L-メチオニン γ-リアー
ゼの凍結乾燥時の安定性を、トレハロース（又はサッカ
ロース）単独の場合よりも向上させることができること
が判る。
【００２３】実施例８ 参考例１で得たL-メチオニン γ-リアーゼを約2.72u/ml
含む酵素溶解液に、トレハロースが５（w/v）％、又は
トレハロースが５（w/v）％及びグルタチオン（又はN-
アセチルシステイン）が10mMとなるように添加、溶解し
たものを1.0mlずつバイアル瓶に小分し、常法によ り凍
結乾燥した。得られた凍結乾燥品を37℃で２ヶ月間保存
した後、酵素溶解液1.0mlで再溶解し、酵素活性を測定
した。得られた結果を、凍結乾燥原液の酵素活性を100
％とした場合の凍結乾燥後の酵素の残存活性率（％）と
して表９に示す。
含む酵素溶解液に、トレハロースが５（w/v）％、又は
トレハロースが５（w/v）％及びグルタチオン（又はN-
アセチルシステイン）が10mMとなるように添加、溶解し
たものを1.0mlずつバイアル瓶に小分し、常法によ り凍
結乾燥した。得られた凍結乾燥品を37℃で２ヶ月間保存
した後、酵素溶解液1.0mlで再溶解し、酵素活性を測定
した。得られた結果を、凍結乾燥原液の酵素活性を100
％とした場合の凍結乾燥後の酵素の残存活性率（％）と
して表９に示す。
【表９】 表９の結果から、添加剤を加えない凍結乾燥品の37℃で
２ヶ月間保存後のL-メチオニン γ-リアーゼの残存活性
率が１０％であるのに対して、トレハロースのみを添加
した凍結乾燥品では、２５％の残存活性率を示し、トレ
ハロースとグルタチオン（又はN-アセチルシステイン）
とを組合せて添加した凍結乾燥品では、８９〜９５％の
残存活性率を示していることが判る。これらのことか
ら、トレハロースとグルタチオン（又はN-アセチルシス
テイン）とを組合せて用いることにより、L-メチオニン
γ-リアーゼの凍結乾燥時の安定性を、トレハロース
単独の場合よりも向上させることができることが判る。
２ヶ月間保存後のL-メチオニン γ-リアーゼの残存活性
率が１０％であるのに対して、トレハロースのみを添加
した凍結乾燥品では、２５％の残存活性率を示し、トレ
ハロースとグルタチオン（又はN-アセチルシステイン）
とを組合せて添加した凍結乾燥品では、８９〜９５％の
残存活性率を示していることが判る。これらのことか
ら、トレハロースとグルタチオン（又はN-アセチルシス
テイン）とを組合せて用いることにより、L-メチオニン
γ-リアーゼの凍結乾燥時の安定性を、トレハロース
単独の場合よりも向上させることができることが判る。
【００２４】
【発明の効果】以上述べたことから明かな如く、本発明
は、L-メチオニン、L-システイン等のアミノ酸の検出及
び定量等に有用なL-メチオニン γ-リアーゼの安定化方
法を提供するものであり、本発明を利用することによ
り、従来は保存が難しかったL-メチオニン γ-リアーゼ
を簡便に且つ長期間安定に保存することが可能となるの
で、斯業に貢献するところ大なる発明である。
は、L-メチオニン、L-システイン等のアミノ酸の検出及
び定量等に有用なL-メチオニン γ-リアーゼの安定化方
法を提供するものであり、本発明を利用することによ
り、従来は保存が難しかったL-メチオニン γ-リアーゼ
を簡便に且つ長期間安定に保存することが可能となるの
で、斯業に貢献するところ大なる発明である。
Claims (13)
- 【請求項１】 L-メチオニン γ-リアーゼと、（１）オ
リゴ糖、（２）水溶性多糖類、（３）糖アルコール、
（４）タンパク質、（５）酸性アミノ酸、（６）グルタ
チオン及び（７）N-アセチルシステインから成る群より
選ばれた１種又は２種以上の物質とを共存させた溶液を
凍結乾燥することを特徴とするLーメチオニン γーリアー
ゼの安定化方法。 - 【請求項２】 オリゴ糖がサッカロース、マルトース、
ラクトース、トレハロース、ラフィノース又はマルトト
リオースである請求項１に記載の安定化方法。 - 【請求項３】 オリゴ糖がトレハロース又はラフィノー
スである請求項１に記載の安定化方法。 - 【請求項４】 水溶性多糖類がデキストランである請求
項１に記載の安定化方法。 - 【請求項５】 糖アルコールがソルビトール、マンニト
ール又はキシリトールである請求項１に記載の安定化方
法。 - 【請求項６】 タンパク質がゼラチンの加水分解物であ
る請求項１に記載の安定化方法。 - 【請求項７】 酸性アミノ酸がグルタミン酸、アスパラ
ギン酸又はこれらのアルカリ金属塩である請求項１に記
載の安定化方法。 - 【請求項８】 L-メチオニン γ-リアーゼ、オリゴ糖及
び、（１）タンパク質、（２）アミノ酸、（３）グルタ
チオン及び（４）N-アセチルシステインから成る群より
選ばれた１種又は２種以上の物質、とを共存させた溶液
を凍結乾燥することを特徴とするLーメチオニン γーリア
ーゼの安定化方法。 - 【請求項９】 オリゴ糖がサッカロース、マルトース、
ラクトース、トレハロース、ラフィノース又はマルトト
リオースである請求項８に記載の安定化方法。 - 【請求項１０】 タンパク質がゼラチンの加水分解物で
ある請求項８又は９に記載の安定化方法。 - 【請求項１１】 アミノ酸が、グルタミン、グルタミン
酸又はグルタミン酸の塩である請求項８又は９に記載の
安定化方法。 - 【請求項１２】 Lーメチオニン γーリアーゼと、（１）
オリゴ糖、（２）水溶性多糖類、（３）糖アルコール、
（４）タンパク質、（５）酸性アミノ酸、（６）グルタ
チオン及び（７）N-アセチルシステインから成る群より
選ばれた１種又は２種以上の物質とを共存させた溶液を
凍結乾燥して成る、安定化されたLーメチオニン γーリア
ーゼ。 - 【請求項１３】 Lーメチオニン γーリアーゼ、オリゴ糖
及び、（１）タンパク質、（２）アミノ酸、（３）グル
タチオン及び（４）N-アセチルシステインから成る群よ
り選ばれた１種又は２種以上の物質、とを共存させた溶
液を凍結乾燥して成る、安定化されたLーメチオニン γー
リアーゼ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06337280A JP3125610B2 (ja) | 1993-12-24 | 1994-12-26 | Ｌ−メチオニン γ−リアーゼの安定化法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34824593 | 1993-12-24 | ||
| JP5-348245 | 1993-12-24 | ||
| JP06337280A JP3125610B2 (ja) | 1993-12-24 | 1994-12-26 | Ｌ−メチオニン γ−リアーゼの安定化法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07227282A true JPH07227282A (ja) | 1995-08-29 |
| JP3125610B2 JP3125610B2 (ja) | 2001-01-22 |
Family
ID=26575728
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06337280A Expired - Fee Related JP3125610B2 (ja) | 1993-12-24 | 1994-12-26 | Ｌ−メチオニン γ−リアーゼの安定化法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3125610B2 (ja) |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1084954A (ja) * | 1996-07-25 | 1998-04-07 | Rikagaku Kenkyusho | 酵素を熱活性化する方法 |
| WO1999018119A1 (fr) * | 1997-10-03 | 1999-04-15 | Shionogi & Co., Ltd. | Procede de lyophilisation de proteines |
| EP0910630A1 (en) * | 1996-07-03 | 1999-04-28 | Molecular Biology Resources, Inc. | Method and formulation for stabilization of enzymes |
| WO2002020807A1 (en) * | 2000-09-05 | 2002-03-14 | Shionogi & Co., Ltd. | L-methionine $g(g)-lyase with modified function |
| JP2005245315A (ja) * | 2004-03-04 | 2005-09-15 | Kikkoman Corp | フルクトシルペプチドオキシダ−ゼの安定化方法 |
| US7318931B2 (en) | 2001-06-21 | 2008-01-15 | Genentech, Inc. | Sustained release formulation |
| JP2008044953A (ja) * | 2000-07-26 | 2008-02-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | 生物学的物質用の保存及び貯蔵媒体 |
| JP2009000128A (ja) * | 2001-01-31 | 2009-01-08 | Asahi Kasei Pharma Kk | 糖化蛋白質測定用組成物 |
| WO2013041542A1 (en) * | 2011-09-19 | 2013-03-28 | Alf Lamprecht | Pharmaceutical formulations comprising spherolyophilisates of biological molecules |
| WO2014119516A1 (ja) * | 2013-01-29 | 2014-08-07 | 東洋紡株式会社 | ジアホラーゼ組成物 |
| CN109847056A (zh) * | 2019-03-29 | 2019-06-07 | 广州市微生物研究所 | 一种mgl冻干辅助制剂、mgl冻干粉及mgl冻干方法 |
| WO2019187695A1 (ja) * | 2018-03-26 | 2019-10-03 | 東洋紡株式会社 | エタノールアミンリン酸リアーゼ組成物 |
| RU2733440C2 (ru) * | 2018-06-04 | 2020-10-01 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Способ получения фермента метионин-гамма-лиазы, противоопухолевое лекарственное средство ГЛФ МГЛ на основе этого фермента и применение этого средства для торможения роста опухоли (варианты) |
-
1994
- 1994-12-26 JP JP06337280A patent/JP3125610B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0910630A4 (en) * | 1996-07-03 | 2002-04-03 | Molecular Biology Resources | METHOD AND FORMULATION FOR STABILIZING ENZYMES |
| EP0910630A1 (en) * | 1996-07-03 | 1999-04-28 | Molecular Biology Resources, Inc. | Method and formulation for stabilization of enzymes |
| JPH1084954A (ja) * | 1996-07-25 | 1998-04-07 | Rikagaku Kenkyusho | 酵素を熱活性化する方法 |
| WO1999018119A1 (fr) * | 1997-10-03 | 1999-04-15 | Shionogi & Co., Ltd. | Procede de lyophilisation de proteines |
| JP2008044953A (ja) * | 2000-07-26 | 2008-02-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | 生物学的物質用の保存及び貯蔵媒体 |
| WO2002020807A1 (en) * | 2000-09-05 | 2002-03-14 | Shionogi & Co., Ltd. | L-methionine $g(g)-lyase with modified function |
| US7118903B2 (en) | 2000-09-05 | 2006-10-10 | Shionogi & Co., Ltd. | L-methionine $g(g)-lyase with modified function |
| JP2009000128A (ja) * | 2001-01-31 | 2009-01-08 | Asahi Kasei Pharma Kk | 糖化蛋白質測定用組成物 |
| US8067020B2 (en) | 2001-06-21 | 2011-11-29 | Genetech, Inc. | Sustained release formulation |
| US7318931B2 (en) | 2001-06-21 | 2008-01-15 | Genentech, Inc. | Sustained release formulation |
| JP4557571B2 (ja) * | 2004-03-04 | 2010-10-06 | キッコーマン株式会社 | フルクトシルペプチドオキシダ−ゼの安定化方法 |
| JP2005245315A (ja) * | 2004-03-04 | 2005-09-15 | Kikkoman Corp | フルクトシルペプチドオキシダ−ゼの安定化方法 |
| WO2013041542A1 (en) * | 2011-09-19 | 2013-03-28 | Alf Lamprecht | Pharmaceutical formulations comprising spherolyophilisates of biological molecules |
| WO2014119516A1 (ja) * | 2013-01-29 | 2014-08-07 | 東洋紡株式会社 | ジアホラーゼ組成物 |
| JP2014143942A (ja) * | 2013-01-29 | 2014-08-14 | Toyobo Co Ltd | ジアホラーゼ組成物 |
| WO2019187695A1 (ja) * | 2018-03-26 | 2019-10-03 | 東洋紡株式会社 | エタノールアミンリン酸リアーゼ組成物 |
| JPWO2019187695A1 (ja) * | 2018-03-26 | 2021-03-18 | 東洋紡株式会社 | エタノールアミンリン酸リアーゼ組成物 |
| RU2733440C2 (ru) * | 2018-06-04 | 2020-10-01 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Способ получения фермента метионин-гамма-лиазы, противоопухолевое лекарственное средство ГЛФ МГЛ на основе этого фермента и применение этого средства для торможения роста опухоли (варианты) |
| CN109847056A (zh) * | 2019-03-29 | 2019-06-07 | 广州市微生物研究所 | 一种mgl冻干辅助制剂、mgl冻干粉及mgl冻干方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3125610B2 (ja) | 2001-01-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Melchior Jr et al. | Ethoxyformylation of proteins. Reaction of ethoxyformic anhydride with. alpha.-chymotrypsin, pepsin, and pancreatic ribonuclease at pH 4 | |
| Fisher | [3] l-Glutamate dehydrogenase from bovine liver | |
| Stevens | Isolation and characterization of a rat liver enzyme with both cysteine conjugate beta-lyase and kynureninase activity. | |
| JP3125610B2 (ja) | Ｌ−メチオニン γ−リアーゼの安定化法 | |
| Jakoby | [104a] Enzymes of γ-aminobutyrate metabolism (bacterial): 1. γ-Aminobutyraldehyde dehydrogenase2. γ-Aminobutyric-Glutamic Transaminase3. Succinic Semialdehyde Dehydrogenase4. γ-Aminobutyrate and α-Ketoglutarate Assay | |
| Nagai et al. | A thiol-disulfide transhydrogenase from yeast | |
| Yorifuji et al. | Arginine racemase of Pseudomonas graveolens: I. Purification, crystallization, and properties | |
| Pan et al. | Comparative studies on methionine, selenomethionine, and their ethyl analogues as substrates for methionine adenosyltransferase from rat liver | |
| JPH08187095A (ja) | コレステロールオキシダーゼの安定化法 | |
| Roon et al. | Fermentation of agmatine in Streptococcus faecalis: occurrence of putrescine transcarbamoylase | |
| Lu et al. | l-Ornithine: 2-oxoacid aminotransferase from squash (Cucurbita pepo, L.) cotyledons: Purification and properties | |
| Blonde et al. | THE EFFECTS OF IONS AND FREEZE–THAWING ON SUPERNATANT AND MITOCHONDRIAL MALATE DEHYDROGENASE | |
| Folk et al. | Mechanism of Action of Guinea Pig Liver Transglutaminase: VIII. ACTIVE SITE STUDIES WITH “REPORTER” GROUP-LABELED HALOMETHYL KETONES | |
| Soda et al. | [222] Amino acid racemase (Pseudomonas striata) | |
| JPH11502410A (ja) | 補酵素還元システムにより安定化されている試薬 | |
| Leung et al. | Purification and properties of 4-hydroxy-2-ketopimelate aldolase from Acinetobacter | |
| Takada et al. | ADP-ribosylarginine hydrolases | |
| Tower | [8] Enzymatic determination of glutamine and asparagine | |
| Yorifuji et al. | Purification, crystallization and properties of Mn2+ dependent guanidinoacetate amidinohydrolase from a Pseudomonas | |
| Martensen et al. | Micrococcal nuclease cleavage of nucleotide linked to glutamine synthetase yields phosphotyrosine at the ligation site. | |
| AU700666B2 (en) | Isoenzyme calibrator/control products | |
| Yonaha et al. | ω-Amino acid-pyruvate aminotransferase | |
| Fan et al. | Functional Groups of Diphosphopyridine Nucleotide-linked Isocitrate Dehydrogenase from Bovine Heart: STUDIES OF CYSTEINE RESIDUES | |
| Turner et al. | [13] l-Alanine: 4, 5-Dioxovalerate aminotransferase (Rhodopseudomonas spheroides) | |
| JPH0118719B2 (ja) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20001003 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |