CN112708700A - 一种用于2019-CoV-2检测的RNA阳性对照品及其生产和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于2019‑CoV‑2检测的冻干粉状RNA阳性对照品，它包括含有2019‑CoV‑2的ORF1和N基因片段的RNA序列、冻干保护剂和复溶液，利用在PCR扩增时，通过对阳性对照标准品的平行检测，首先判断PCR扩增体系的配制、扩增程序以及检测实验操作是否正确，试验是否成立。当加入有阳性对照品的体系出现扩增曲线，说明PCR扩增实验体系配制、扩增程序及检测操作正确，此时可根据样本有无扩增曲线来判读样本中是否检出2019‑CoV‑2，因此，检测过程中阳性对照品的使用能够消除环境和人为操作带来的误差或错误，指示实验的有效性，减少结果判读过程中的变量，从而提高检测试剂盒的检测准确性，该对照品为固态粉状物，方便运输、使用快捷、独立分装，进一步提高检测的稳定性和可靠性。

Description

一种用于2019-CoV-2检测的RNA阳性对照品及其生产和使用 方法

技术领域

本发明属于体外合成RNA领域，具体涉及一种用于2019-CoV-2检测的RNA 阳性对照品及其生产和使用方法。

背景技术

2019-CoV-2属于β属的新型冠状病毒，为RNA病毒，其有包膜，颗粒呈圆 形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm，是目前已知的可以感染人的第7种 冠状病毒，其余6种冠状病毒分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、 HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。其中前4种在人群中较为常见，致病 性较低，一般仅引起类似普通感冒的轻微呼吸道症状，另外2种是致病性较高的 SARS冠状病毒和MERS冠状病毒。核酸检测是临床病原学诊断的常用方法，其 具有灵敏高、特异性强等优点。目前，实时荧光RT-PCR技术已被列入我国 2019-CoV-2诊疗指南。

由于RT-PCR方法敏感性较高，尤其是荧光定量RT-PCR，非常容易出现实 验室污染，造成假阳性出现。为保证核酸检测结果的可靠性，所有RT-PCR试验 均需要设置为阴性和阳性对照。当前市面上出售的新冠肺炎核酸检测试剂盒的阳 性对照主要是假病毒、DNA质粒、反转录RNA等。这些阳性对照都存在一些缺 陷，假病毒的制备需要进行细胞培养、病毒纯化等过程，耗时长；质粒DNA无 法质控RNA病毒检测的全过程；液体反转录RNA不稳定，保存困难，容易降 解。因此，急需要开发一种稳定高、不易降解，同时可对核酸检测全过程进行质 控的阳性对照标准品。

发明内容

针对现有技术存在的不足，第一方面本发明在于提供一种用于2019-CoV-2 检测的RNA阳性对照序列，可以作为2019-CoV-2检测试剂盒的阳性对照品。

一种用于2019-CoV-2检测的冻干粉状RNA阳性对照品，所述阳性对照品包 括冻干粉状RNA固体和复溶液，所述冻干粉状RNA固体包括含有2019-CoV-2 的ORF1和N基因片段的RNA序列和冻干复合保护剂；所述复溶液为DEPC水。

进一步的，所述含有2019-CoV-2的ORF1和N基因片段的RNA序列为SEQID NO:1。

进一步的，所述冻干保护剂为含有3％～6％海藻糖、0.01％～0.1％甘氨酸、 DTT、0.1％～1％牛血清白蛋白、1mmol/L-5mmol/L DTT、0.1-0.3％Proclin 300、 0.1-1％甲酰胺的冻干复合保护剂。

本发明的第二方面还公布了一种用于2019-CoV-2检测的RNA阳性对照品的 生产方法，包括如下步骤：

S1：体外合成特异性RNA片段，利用2019-CoV-2的ORF1和N基因的特 异性引物，扩增出2019-CoV-2的ORF1和N的基因片段，然后再利用T7RNA 聚合酶，体外反转录出相应的RNA，纯化得到目标RNA片段，并优化终浓度；

S2：制备冻干保护剂，在常温下，将3％～6％海藻糖、0.01％～0.1％甘氨酸、 DTT、0.1％～1％牛血清白蛋白、1mmol/L-5mmol/L DTT、0.1-0.3％Proclin 300、 0.1-1％甲酰胺混合后制得冻干保护剂；

S3：制备冻干粉状RNA阳性对照产品，将浓度为50～250nmol/mL液态RNA 序列片段和液态的冻干保护剂混匀，获得阳性对照混合液；将收到的阳性对照混 合液分装到冻干管中，冻干，真空包装。

进一步的，所述S1中特异性引物包括2对引物序列，第1对引物序列为

T7 CDC F1：CTCACTATAGGGAATCGTGTTGTCTG

T7 CDC R1：TTAGGCCTGAGTTGAGTCAGCACTG；

第2对引物序列为：

T7 CDC F2：CGCCATTCTAATACGACTCACTATAGGGA

T7 CDC R1：TTAGGCCTGAGTTGAGTCAGCACTG。

进一步的，S1所述体外合成RNA片段的具体步骤为：

S11：第一次扩增阳性对照质粒

首先用第1对引物T7 CDC F1和T7 CDC R1，以含有ORF1和N序列的阳 性质粒(1:108稀释)做模板，进行PCR扩增，用SYBR GreenⅠ染料法荧光PCR 快速鉴别PCR产物是否为特异性片段；

S12：第二次扩增第一次的PCR产物

将第1次PCR产物1：10⁵倍稀释，然后用第2对引物进行PCR梯度扩增， 反应体系和反应条件与步骤S1中相同，扩增后的PCR产物用柱式核酸提取试剂 盒纯化；

S13：体外反转录

将第2次扩增纯化后的PCR产物1：10³稀释，然后用T7 RNA聚合酶体外 反转录试剂盒体外合成对应RNA，用DNA酶去除多余DNA，柱式核酸提取试 剂盒纯化反转录产物，获得的纯化RNA，即为含有2019-CoV-2的ORF1和N基 因片段的新型冠状病毒RNA序列。

本发明的第三方面提供了一种用于2019-CoV-2检测的RNA阳性对照品的使 用方法，包括以下步骤：

A；溶解冻干粉状RNA固体：取所述干粉化的RNA阳性对照品，加50ul 的复溶液复溶，充分溶解、混匀、短暂离心后待用；

B：PCR扩增：取5ul步骤A中溶解后的液体，同检测样品一起进行核酸提 取，纯化后，直接进行RT-PCR或荧光定量RT-PCR检测；PCR扩增程序为50℃ 15min，95℃3min，循环一次；95℃15s，60℃60s，循环45次，荧光检测在 60℃收集，荧光通道选用FAM。

C：结果判读：对步骤B扩增得到的扩增曲线进行判读，对照组出现典型扩 增曲线，CT值在30±2区间内，则阳性对照结果正确。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：1.本发明中根据CDC公布的ORF1 和N基因，通过自行设计出的引物，扩增出包含ORF1和N基因片段的RNA序 列，并制备出稳定的RNA阳性对照，提高了2019-CoV-2核酸检测的标准化程度。

2.本发明中的2019-CoV-2核酸检测阳性对照标准品，可以用于各种以ORF1 和N基因为目标序列的2019-CoV-2核酸检测试剂盒。

3.本发明中的2019-CoV-2核酸检测阳性对照标准品，为固态粉状物，方便 运输、使用快捷、独立分装，能够进一步提高检测的稳定性和可靠性。

附图说明

图1为本发明所述性能检测实验1冻干阳性RNA阳性对照品在4°、37° 和-20°条件下的扩增曲线(1d、5d、7d)。

图2为本发明所述性能检测实验1液体RNA阳性对照品在4℃条件下的 扩增曲线(1d、5d、7d)。

图3为本发明所述性能检测实验1液体RNA阳性对照品37℃条件下的扩 增曲线(1d、5d、7d)。

图4为本发明所述性能检测实验1液体RNA阳性对照品-20℃条件下的 扩增曲线(1d、5d、7d)。

图5为本发明所述性能检测实验2图5：冻干RNA阳性对照品重复性试验 结果。

图6为本发明所述性能检测实验3图6：冻干RNA阳性对照品线性扩增曲 线图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案作进一步详细的说明。

实施例1

一种用于2019-CoV-2检测的RNA阳性对照标准品，其包含有2019-CoV-2 的ORF1和N基因片段的RNA序列和冻干保护剂，所述RNA序列包括ORF基 因和N基因的部分特异性序列SEQID NO:1，具体的序列为 ATCGTGTTGTCTGTACTGCCGTTGCCACATAGATCATCCAAATCCTAAAGGATTTTGTGACTTAAAAGGTAAGTATGTACAAATACCTACAACTTGTGCTAATG ACCCTGTGGGTTTTACACTTAAAAACACAGTCTGTACCGTCTGCGGTATGT GGAAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGCGAACCCATGCTTCAGT CAGCTGATGCACAATCGTTTTTAAACGGGTTTGCGGTGTAAGTGCAGCCCG TCTTACACCGTGCGGCACAGGCACTAGTACTGATGTCGTATACAGGGCTTTT GACATCTACAATGATAAAGTAGCTGGTTTTGCTATGATTCTTACTTTGTAGTT AAGAGACACACTTTCTCTAACTACCAACATGAAGAAACAATTTATAATTTAC TTAAGGATTGTCCAGCTGTTGCTAAACATATGTCTGATAATGGACCCCAAAA TCAGCGAAATGCACCCCGCATTACGTTTGGTGGACCCTCAGATTCAACTGG CAGTAACCAGAATGGAGAACGCAGTGGGGCGCGATCAAAACAACGTCGGC CCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACCGCTCTCACTCAACA TGGCAAGGAAGACCTTAAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTCCAATTAACA CCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGAC GAATTCGTGGTGGTGACGGTAAAATGAAAGATCTCAGTCCAAGATGGTATT TCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGCTAACA AAGACGGCATCATATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGCACCCGCAATCCTGCTAACAATGCTGCAATCGTGCTACAA CTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAG AGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTC AAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGG CTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGA ACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAA ACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAAGAAGCCTCGGCAAAA ACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGG TCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAG GAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTT CAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAA CGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATT TCAAAGATCAAGTCATTTTGCTGAATAAGCATATTGACGCATACAAAACATT CCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAGAAGGCTGATGAAACT CAAGCCTTACCGCAGAGACAGAAGAAACAGCAAACTGTGACTCTTCTTCC TGCTGCAGATTTGGATGATTTCTCCAAACAATTGCAACAATCCATGAGCAGTGCTGACTCAACTCAGGCCTAA。1)

采用套式PCR法，二次扩增，T7 RNA聚合酶体外转录系统，体外合成RNA 的方法得到RNA序列，所述RNA序列的具体合成方法为：利用特异性引物， 扩增出2019-CoV-2的ORF1和N基因片段的DNA序列，然后再利用T7RNA聚 合酶，体外反转录出相应的RNA，并用DNA酶去除多余的cDNA，纯化得到目 标RNA片段，并优化终浓度为10⁵稀释，CT值为30。所述冻干保护剂为含有 3％～6％海藻糖、0.01％～0.1％甘氨酸、DTT、0.1％～1％牛血清白蛋白、1mmol/L-5mmol/L DTT、0.1-0.3％Proclin 300、0.1-1％甲酰胺含3％～6％海藻糖、0.01％～0.1％甘氨酸、0.1％～1％牛血清白蛋白的冻干复合保护剂。

具体的所述用于2019-CoV-2检测的RNA阳性对照标准品生产方法，包括 以下步骤：

S1：体外合成特异性RNA片段，利用2019-CoV-2的ORF1和N基因的特 异性引物，扩增出2019-CoV-2的ORF1和N的基因片段，然后再利用T7RNA 聚合酶，体外反转录出相应的RNA，纯化得到目标RNA片段，并优化终浓度， 具体步骤为

S11：第一次扩增含有ORF1和N序列的阳性质粒

首先用第1对引物T7 CDC F1和T7 CDC R1，以中国CDC公开发布的ORF1 和N序列，合成含有ORF1和N序列的阳性质粒，1:10⁸稀释后做模板，进行 PCR扩增，PCR反应体系为引物1上游1ul，引物1下游1ul，SYBR GreenⅠ染 料1ul，阳性质粒1：10⁸稀释2ul，用16ul的无核酸酶水溶解all ready qPCR冻 干颗粒，混匀后进行PCR扩增，PCR反应条件：95℃3min预变性，3步PCR 循环扩增，95℃10sec，55℃10sec，72℃60sec收集荧光，共40个循环，PCR 反应结束后，用SYBR GreenⅠ染料法荧光PCR快速鉴别PCR产物是否为特异 性片段；第1对引物序列为

T7 CDC F1：CTCACTATAGGGAATCGTGTTGTCTG；2)

T7 CDC R1：TTAGGCCTGAGTTGAGTCAGCACTG；3)

S12：第二次扩增第一次的PCR产物

将第1次PCR产物1：10⁵倍稀释，然后用第2对引物T7 CDC F2和T7 CDC R1进行qPCR梯度扩增，反应体系和反应条件与步骤S11中相同，扩增后的PCR 产物用柱式核酸提取试剂盒纯化；第2对引物序列为：

T7 CDC F2：CGCCATTCTAATACGACTCACTATAGGGA；4)

T7 CDC R1：TTAGGCCTGAGTTGAGTCAGCACTG。5)

S13:体外反转录含有ORF1和N基因片段的RNA阳性对照

将第2次扩增纯化后的PCR产物1：10³稀释，然后利用T7 RNA聚合酶进 行体外反转录，并用DNA酶消化去除多余的DNA，柱式核酸提取试剂盒纯化反 转录产物，获得的纯化RNA，即为含ORF1和N基因片段的RNA阳性对照。

RNA阳性对照的验证

分别用CDC公开的ORF1ab和N基因两套新型冠状病毒引物和探针，同时 做qPCR和RT-qPCR，结果在qPCR中无扩增曲线，在RT-qPCR中有扩增曲线， 证明RNA阳性对照中无残余的cDNA。

RNA阳性对照最佳稀释度确定：

用无核酸酶水将RNA阳性对照进行10倍梯度稀释，测定各个稀释度的CT 值，确定最佳的RNA稀释比例。CT值为30时，对应的是1：10⁵稀释。因此1： 10⁵可以作为阳性对照品的最佳稀释度。

S2、制备冻干保护剂，在常温下，将3％～6％海藻糖、0.01％～0.1％甘氨酸、 DTT、0.1％～1％牛血清白蛋白、1mmol/L-5mmol/L DTT、0.1-0.3％Proclin 300、 0.1-1％甲酰胺混合后制得冻干保护剂；

S3：制备冻干粉状RNA阳性对照产品，将浓度为50～250nmol/mL液态 RNA序列片段和液态的冻干保护剂混匀，获得阳性对照混合液；将收到的阳性 对照混合液分装到冻干管中，将管盖轻放平置于管口上方，无需扣紧压实；设置 冻干程序；冷冻进程结束后点击自动按钮执行加塞操作；加塞后的冻干产品应立 即进行压盖，压盖后的产品用真空包装机进行包装。将液态的终浓度为0.2M的 冻干保护剂和液态的终浓度为50～250nmol/mL的RNA序列充分混匀，获得RNA 阳性对照混合液。然后，将RNA阳性对照混合液分装到冻干管中进行冻干。冻 干步骤为：半加塞：将管盖轻放平置于管口上方，无需扣紧压实。真空冷冻干燥： 分装好的核酸产品置于冻干机中进行真空冷冻干燥。程序为：预冷冻，温度-25℃， 预冷冻时间1.5小时；升华，温度-4℃，升华时间10小时；解析干燥，温度10℃， 解析干燥时间0.5小时：加强干燥，充氮气，温度25℃，加强干燥时间0.5小时。 加塞：冷冻进程结束后点击自动按钮执行加塞操作。压盖：加塞后的冻干产品应 立即进行压盖操作，防止产品吸潮。真空包装：压盖后的产品用真空包装机进行 包装操作，包装袋选用铝箔袋，能够更好的保持产品的干燥状态，防止吸潮影响 产品的性能。

通过采用上述技术方案，能够生产出冻干粉反应试剂，且该生产方法步骤 简单，易于操作，适应大批量生产的需求。本方案中生产的冻干粉反应试剂投入 使用时，能够即用即溶解，使检测更加便捷，同时冻干粉相对于液态的反应试剂 而言性能更加稳定，不容易降解；而且，由于RNA阳性对照品是同一批次单管 冻存的，在每次PCR扩增时，确保阳性对照是稳定的、可重复的、一致的，这 样既起到了标定每次检测过程的一致性，也确保了每次检测结果的准确性和一致 性。

按照上述方法生产的一种用于2019-CoV-2检测的RNA阳性对照标准品为 干粉状，使用时即用即溶，便可形成1管液态的阳性对照，使用时只需按照备件 样品一同处理，提取核酸、进行PCR检测即可。

实施例2

所述阳性对照标准品使用时的具体使用方法为：

A：复溶RNA阳性对照品

取所述干粉化的RNA阳性对照品，加50ul的复溶液复溶，充分溶解、混 匀、短暂离心后待用；

B：PCR扩增

每次反应取5ul，同检测样品一起进行核酸提取，纯化后，直接进行RT-PCR 或荧光定量RT-PCR检测；扩增程序为50℃15min，95℃3min，循环一次；95℃ 15s，60℃60s，循环45次，荧光检测在60℃收集，荧光通道选用FAM。

C：结果判读

对S2扩增得到的扩增曲线进行判读，对照组出现典型扩增曲线，CT值在 30±2区间内，可判定，阳性对照结果正确，试验成立。若对照组无扩增曲线， 说明本次实验无效，需重新进行。

RNA阳性对照标准品性能检测试验1

主要用于2019-CoV-2检测的RNA阳性对照标准品稳定性的检测，具体步 骤如下：

将27份冻干RNA阳性对照和27份液体RNA阳性对照，在37℃、4℃、 -20℃三个不同保存条件下，分别放入9份，在1、3、7d时各取出3份，进行 荧光定量PCR检测，记录CT值，通过计算均值和变异系数，冻干RNA阳性对 照的稳定性比液体RNA阳性对照的稳定性好。具体数据见表1-2，原始扩增曲 线见图1-图4。

表1：冻干RNA阳性对照稳定性结果

表2：液体RNA阳性对照的稳定性

RNA阳性对照标准品性能检测试验2

主要用于2019-CoV-2检测的冻干RNA阳性对照标准品重复性的检测，具 体步骤如下：

取10份标定后分装后阳性对照品，分别进行荧光定量RT-PCR，CT值分别 30.21,30.21,30.23,30.21,30.26,30.22,30.23,30.21,30.25,30.24，CV值为0.17％(小 于5％)，重复性性非常好，见图5。

RNA阳性对照标准品性能检测试验3

主要用于2019-CoV-2检测的冻干RNA阳性对照标准线性测定

取标定后冻干RNA阳性对照品，复溶液溶解后，再10倍稀释4个梯度， 用这4个稀释度做荧光定量PCR反应，制定定量标准曲线。根据PCR结果的 CT值分析，所绘制的标准曲线的斜率为-3.05，Ct值与起始模板拷贝数的对数相 关性R2＝0.9989，扩增效率E为110％。见图6。

RNA阳性对照标准品性能检测实验4

主要用于2019-CoV-2检测的冻干RNA阳性对照标准品通用性的测定，用 市售新型冠状病毒核酸检测试剂盒检测此阳性对照3份，Ct值分别为30.23，30.25, 30.19，结果显示此阳性对照可以通用于检测ORF和N基因的2019-CoV-2检测 试剂盒。

以上所述，仅是本发明的实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制， 任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，利用上述揭 示的方法内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，均属于权利要求书 保护的范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种用于2019-CoV-2检测的RNA阳性对照品及其生产和使用方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1703

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atcgtgttgt ctgtactgcc gttgccacat agatcatcca aatcctaaag gattttgtga 60

cttaaaaggt aagtatgtac aaatacctac aacttgtgct aatgaccctg tgggttttac 120

acttaaaaac acagtctgta ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatggct gtagttgtga 180

tcaactccgc gaacccatgc ttcagtcagc tgatgcacaa tcgtttttaa acgggtttgc 240

ggtgtaagtg cagcccgtct tacaccgtgc ggcacaggca ctagtactga tgtcgtatac 300

agggcttttg acatctacaa tgataaagta gctggttttg ctatgattct tactttgtag 360

ttaagagaca cactttctct aactaccaac atgaagaaac aatttataat ttacttaagg 420

attgtccagc tgttgctaaa catatgtctg ataatggacc ccaaaatcag cgaaatgcac 480

cccgcattac gtttggtgga ccctcagatt caactggcag taaccagaat ggagaacgca 540

gtggggcgcg atcaaaacaa cgtcggcccc aaggtttacc caataatact gcgtcttggt 600

tcaccgctct cactcaacat ggcaaggaag accttaaatt ccctcgagga caaggcgttc 660

caattaacac caatagcagt ccagatgacc aaattggcta ctaccgaaga gctaccagac 720

gaattcgtgg tggtgacggt aaaatgaaag atctcagtcc aagatggtat ttctactacc 780

taggaactgg gccagaagct ggacttccct atggtgctaa caaagacggc atcatatggg 840

ttgcaactga gggagccttg aatacaccaa aagatcacat tggcacccgc aatcctgcta 900

acaatgctgc aatcgtgcta caacttcctc aaggaacaac attgccaaaa ggcttctacg 960

cagaagggag cagaggcggc agtcaagcct cttctcgttc ctcatcacgt agtcgcaaca 1020

gttcaagaaa ttcaactcca ggcagcagta ggggaacttc tcctgctaga atggctggca 1080

atggcggtga tgctgctctt gctttgctgc tgcttgacag attgaaccag cttgagagca 1140

aaatgtctgg taaaggccaa caacaacaag gccaaactgt cactaagaaa tctgctgctg 1200

aggcttctaa gaagcctcgg caaaaacgta ctgccactaa agcatacaat gtaacacaag 1260

ctttcggcag acgtggtcca gaacaaaccc aaggaaattt tggggaccag gaactaatca 1320

gacaaggaac tgattacaaa cattggccgc aaattgcaca atttgccccc agcgcttcag 1380

cgttcttcgg aatgtcgcgc attggcatgg aagtcacacc ttcgggaacg tggttgacct 1440

acacaggtgc catcaaattg gatgacaaag atccaaattt caaagatcaa gtcattttgc 1500

tgaataagca tattgacgca tacaaaacat tcccaccaac agagcctaaa aaggacaaaa 1560

agaagaaggc tgatgaaact caagccttac cgcagagaca gaagaaacag caaactgtga 1620

ctcttcttcc tgctgcagat ttggatgatt tctccaaaca attgcaacaa tccatgagca 1680

gtgctgactc aactcaggcc taa 1703

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcactatag ggaatcgtgt tgtctg 26

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttaggcctga gttgagtcag cactg 25

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgccattcta atacgactca ctataggga 29

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttaggcctga gttgagtcag cactg 25

Claims (8)

1.一种用于2019-CoV-2检测的冻干粉状RNA阳性对照品，其特征在于：所述阳性对照品包括冻干粉状RNA固体和复溶液；所述冻干粉状RNA固体包括含有2019-CoV-2的ORF1和N基因片段的RNA序列和冻干复合保护剂；所述复溶液为DEPC水。

2.根据权利要求1所述的用于2019-CoV-2检测的冻干粉状RNA阳性对照品，其特征在于：所述含有2019-CoV-2的ORF1和N基因片段的RNA序列为SEQ ID NO:1。

3.根据权利要求1所述的用于2019-CoV-2检测的冻干粉状RNA阳性对照品，其特征在于：所述冻干保护剂为含有3％～6％海藻糖、0.01％～0.1％甘氨酸、DTT、0.1％～1％牛血清白蛋白、1mmol/L-5mmol/L DTT、0.1-0.3％Proclin 300、0.1-1％甲酰胺的冻干复合保护剂。

4.权利要求1所述的一种用于2019-CoV-2检测的冻干粉状RNA阳性对照品的生产方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1：体外合成特异性RNA片段，利用2019-CoV-2的ORF1和N基因的特异性引物，扩增出2019-CoV-2的ORF1和N的基因片段，然后再利用T7RNA聚合酶，体外反转录出相应的RNA，纯化得到目标RNA片段，并优化终浓度；

S2：制备冻干保护剂，在常温下，将3％～6％海藻糖、0.01％～0.1％甘氨酸、DTT、0.1％～1％牛血清白蛋白、1mmol/L-5mmol/L DTT、0.1-0.3％Proclin 300、0.1-1％甲酰胺混合后制得冻干保护剂；

S3：制备冻干粉状RNA阳性对照产品，将浓度为50～250nmol/mL液态RNA序列片段和液态的冻干保护剂混匀，获得阳性对照混合液；将收到的阳性对照混合液分装到冻干管中，冻干，真空包装。

5.根据权利要求4所述的一种用于2019-CoV-2检测的RNA阳性对照品的生产方法，其特征在于：所述S1中特异性引物包括2对引物序列，第1对引物序列为T7 CDC F1：CTCACTATAGGGAATCGTGTTGTCTG

T7 CDC R1：TTAGGCCTGAGTTGAGTCAGCACTG；

第2对引物序列为：

T7 CDC F2：CGCCATTCTAATACGACTCACTATAGGGA

T7 CDC R1：TTAGGCCTGAGTTGAGTCAGCACTG。

6.根据权利要求4或5所述的一种用于2019-CoV-2检测的冻干粉状RNA阳性对照品的生产方法，其特征在于：S1所述体外合成RNA片段的具体步骤为：

S11：第一次扩增阳性对照质粒

首先用第1对引物T7 CDC F1和T7 CDC R1，以含有ORF1和N序列的阳性质粒做模板，进行PCR扩增PCR反应结束后并用SYBR GreenⅠ染料法荧光PCR快速鉴别PCR产物是否为特异性片段；

S12：第二次扩增第一次的PCR产物

将第1次PCR产物1：10⁵倍稀释，然后用第2对引物进行PCR梯度扩增，反应体系和反应条件与步骤S1中相同，扩增后的PCR产物用柱式核酸提取试剂盒纯化；

S13：体外反转录

将第2次扩增纯化后的PCR产物1：10³稀释，然后体外合成对应RNA，去除多余的DNA，柱式核酸提取试剂盒纯化反转录产物，获得的纯化RNA，即为含有2019-CoV-2的ORF1和N基因片段的新型冠状病毒RNA序列。

7.根据权利要求4所述的一种用于2019-CoV-2检测的冻干粉状RNA阳性对照品的生产方法，其特征在于：所述冻干的具体程序为预冷冻、升华、解析干燥和加强干燥四个过程。

8.一种用于2019-CoV-2检测的RNA阳性对照品的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：

A；溶解冻干粉状RNA固体：取所述干粉化的RNA阳性对照品，加50ul的复溶液复溶，充分溶解、混匀、短暂离心后待用；

B：PCR扩增：取5ul步骤A中溶解后的液体，同检测样品一起进行核酸提取，纯化后，直接进行RT-PCR或荧光定量RT-PCR检测；PCR扩增程序为50℃15min，95℃3min，循环一次；95℃15s，60℃60s，循环45次，荧光检测在60℃收集，荧光通道选用FAM。

C：结果判读：对步骤B扩增得到的扩增曲线进行判读，对照组出现典型扩增曲线，CT值在30±2区间内，则阳性对照结果正确。

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