JP2015533507A - 直接核酸増幅キット、試薬及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
核酸を含有する試料をカラムに添加すると、緩衝液、変性剤(塩酸グアニジンなど)、Triton X−100、イソプロパノール及びpH指示薬を含有してよい結合溶液の(カラムのシラノール基に対して)低いpH及び塩濃度によって、核酸が結合する;
カラムを5mM KPO4、pH8.0又は類似物、80%EtOH)で洗浄する;及び
カラムを緩衝液又は水で溶離する。
i)ポリメラーゼと封鎖剤及びdNTPとを混合して、それらの混合物を得る工程、及び
ii)混合物を乾燥させて乾燥試薬組成物を形成する工程
を含む核酸増幅用の乾燥試薬組成物を製造する方法が提供される。
i)核酸を含有する溶液を上記の乾燥試薬組成物とともにインキュベートする工程及び、
ii)核酸を増幅させる工程
を含む、核酸増幅方法が提供される。
i)本明細書上文に記載される方法を用いて核酸を増幅して、増幅核酸を作製する工程、
ii)増幅核酸を検出する工程、及び
iii)所望により増幅核酸を定量化する工程
を含む検出系を用いる、増幅核酸の検出及び/又は定量化方法が提供される。
化学物質及びそれらの供給源の一覧を下に記載する:
核酸を保存するためのFTA紙は、GE Healthcare UK Limitedより得た;
正常なヒト血液(Tissue Solutions Ltd);
ゲノムDNA(Promega product code G152A);
1kb DNAラダー(Promega 製品コードG571A);
Harris Uni−coreパンチ、1.2mm(Sigma、カタログ番号Z708860−25ea、ロット3110);
OmniKlentaq ポリメラーゼ(Mo Bio Inc、カタログコード1225−250);
デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)(Life Tech);
PCR等級ウシ血清アルブミン(Life Tech);
順方向及び逆方向β−グロビンプライマー(Sigma Genosys)(β−グロビン1.3 順方向 5’−TTAGGCCTTAGCGGGCTTAGAC−3’(配列番号1)及びβ−グロビン 1.3 逆方向 5’−CCAGGATTTTTGATGGGACACG−3’(配列番号2));
α−シクロデキストリン(Fluka コード28705)及び
滅菌水(Sigma 製品コードW4502)。
フィコール70(GE Healthcare);
フィコール400(GE Healthcare)及び
メレジトース(Sigma)
サイクル配列ミックス 10X:
Trizma(Sigma);
KCl(Sigma);
MgCl(Sigma)及び
ヌクレアーゼフリー水(Sigma)
交換緩衝液:
Tris/HCl pH8.5(Sigma);
1M CaCl2(Sigma);
1.0M MgCl2(Sigma);
2.0M KCl(Sigma)及び
RHODAFAC RE−960(7% RE960)(Kao Chemicals)
実験結果
qPCRを用いる、セルロースマトリックスからの乾燥した血液スポットからのDNA測定
PCR試薬をシクロデキストリンと合し、表1中の以下の条件下で凍結乾燥した。
血液をスポットしたFTAを、シクロデキストリンを含有するか又は含有しない核酸増幅試薬ケークとともにウェルに添加した。標準物質及び試料を適切なウェルに添加した。プレートを1000rpmで1分間遠心し、密封した。PCRは、MJ Research PTC−200サーモサイクラーで製造業者の取扱説明書に従って実行した。
Claims (30)
- 封鎖剤、ポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)を含む、核酸増幅のための乾燥試薬組成物。
- 前記封鎖剤がシクロデキストリンである、請求項1記載の乾燥試薬組成物。
- 前記シクロデキストリンが、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、6−O−α−D−マルトシル−βシクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン及び2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン並びにそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項2記載の乾燥試薬組成物。
- 前記シクロデキストリンがα−シクロデキストリンである、請求項2又は請求項3記載の乾燥試薬組成物。
- 1以上のプライマーをさらに含む、請求項1乃至請求項4のいずれか1項記載の乾燥試薬組成物。
- 賦形剤混合物をさらに含む、請求項1乃至請求項5のいずれか1項記載の乾燥試薬組成物。
- 前記賦形剤混合物が、10×PCR緩衝液、フィコール70、フィコール400、メレジトース及びヌクレアーゼフリー水を含む、請求項1乃至請求項6のいずれか1項記載の乾燥試薬組成物。
- 交換緩衝液をさらに含む、請求項1乃至請求項7のいずれか1項記載の乾燥試薬組成物。
- ウシ血清アルブミン(BSA)をさらに含む、請求項1乃至請求項8のいずれか1項記載の乾燥試薬組成物。
- 前記ポリメラーゼが、OmniKlen Taq(OKT)である、請求項1乃至請求項9のいずれか1項記載の乾燥試薬組成物。
- α−シクロデキストリン、1以上のプライマー、ポリメラーゼ、dNTP、BSA、賦形剤混合物及び交換緩衝液を含む、請求項1乃至請求項10のいずれか1項記載の乾燥試薬組成物。
- 核酸増幅用の乾燥試薬組成物を製造する方法であって、
i)ポリメラーゼと封鎖剤及びdNTPとを混合して、それらの混合物を得る工程と、
ii)混合物を乾燥させて乾燥試薬組成物を形成する工程と
を含む、核酸増幅のための乾燥試薬組成物を生成するための方法。 - 工程i)の混合物が、1以上のプライマーをさらに含む、請求項12記載の方法。
- 工程i)の混合物が、賦形剤混合物をさらに含む、請求項12及び13記載の方法。
- 工程i)の混合物が、交換緩衝液をさらに含む、請求項12乃至請求項14のいずれか1項記載の方法。
- 乾燥工程が、凍結乾燥によって達成される、請求項12乃至請求項15のいずれか1項記載の方法。
- 乾燥工程の前に組成物を凍らせる工程をさらに含む、請求項12乃至請求項16のいずれか1項記載の方法。
- 核酸増幅方法であって、
i)核酸を含有する溶液を、請求項1乃至請求項11のいずれか1項記載の乾燥試薬組成物とともにインキュベートする工程と、
ii)核酸を増幅する工程と
を含む方法。 - 増幅方法がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項18記載の核酸増幅法。
- 増幅方法が、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応又は等温増幅を含む、請求項18記載の核酸増幅法。
- 工程i)の前に、水を核酸に添加することによって溶液を形成する工程をさらに含む、請求項18乃至請求項20のいずれか1項記載の方法。
- 核酸が固相支持体に固定化されている、請求項18乃至請求項21のいずれか1項記載の方法。
- 固相支持体がセルロース系マトリックスである、請求項22記載の方法。
- 固相支持体が予め打ち抜いたディスクの形態である、請求項23記載の方法。
- 固相支持体が、FTAの予め打ち抜いたディスクの形態である、請求項23記載の方法。
- 溶解試薬が固体マトリックスに組み込まれている、請求項22乃至請求項25のいずれか1項記載の方法。
- 増幅が単一の反応器で実行される、請求項18乃至請求項26のいずれか1項記載の方法。
- 検出系を用いて増幅核酸を検出及び/又は定量化する方法であって、
i)請求項18乃至請求項27のいずれか1項記載の方法を用いて核酸を増幅して増幅核酸を生成する工程と、
ii)増幅核酸を検出する工程と、
iii)所望により増幅核酸を定量化する工程と
を含む方法。 - 検出系が、PCR画像形成系である、請求項28記載の方法。
- 請求項1乃至請求項11のいずれか1項記載の乾燥試薬、及びその取扱説明書を含む、核酸増幅用キット。
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