CN115960888B - 一种dna保存液 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种DNA保存液，属于生物技术领域。本发明的DNA保存液中通过添加赖氨酸、三磷酸腺苷(ATP)和λ噬菌体DNA中的一种或多种作为保护剂，能够有效提升低浓度DNA在各温度条件条件下的保存时长。

Description

一种DNA保存液

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种DNA保存液。

背景技术

DNA为大分子双螺旋结构，高浓度的DNA十分稳定，可长期存储于低温环境中，如-20℃，相较于高浓度DNA，低浓度的DNA的保存具有较大的难度，其主要原因来源于管材的吸附、核酸酶降解、二价阳离子打断等。其后果是低浓度DNA在长期保存中有效浓度下降，进而导致定量、建库等下游反应难以进行。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的不足，提供一种DNA保存液，其能够适用于保存低浓度的DNA样本，在一定时间后能够有效扩增。

本申请的第一方面提供一种DNA保存液，所述保存液包含Tris(三羟甲基氨基甲烷)、EDTA(乙二胺四乙酸)和添加剂，所述添加剂是赖氨酸、三磷酸腺苷(ATP)、λ噬菌体DNA中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述添加剂是赖氨酸、三磷酸腺苷(ATP)、λ噬菌体DNA中的一种或两种或三种。

在一些实施方案中，所述Tris的浓度是10-100mM，优选10-60mM，包括所述范围内的10mM，15mM，20mM，25mM，30mM，32mM，35mM，38mM，40mM，42mM，45mM，48mM，50mM，52mM，55mM，58mM和60mM。

在一些实施方案中，所述EDTA的浓度是1-20mM，优选1-10mM，包括所述范围内的1mM，2mM，3mM，4mM，5mM，6mM，7mM，8mM，9mM和10mM。

在一些实施方案中，所述赖氨酸的浓度是1-20mM，优选1-10mM，包括所述范围内的1mM，2mM，3mM，4mM，5mM，6mM，7mM，8mM，9mM和10mM。

在一些实施方案中，所述ATP的浓度是1-100μM，优选10-80μM，包括所述范围内的10μM，15μM，20μM，25μM，30μM，32μM，35μM，38μM，40μM，42μM，45μM，48μM，50μM，52μM，55μM，58μM，60μM，65μM，70μM，75μM和80μM。

在一些实施方案中，所述λ噬菌体DNA的浓度是1-20μM，优选1-10μM，包括所述范围内的1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM和10μM。

在一些实施方案中，所述保存液包含10-100mM Tris，1-20mM EDTA，1-20mM赖氨酸，1-100μMATP和1-20μMλ噬菌体DNA；优选地，所述保存液包含10-60mM Tris，1-10mMEDTA，1-10mM赖氨酸，10-80μMATP和1-10μMλ噬菌体DNA；优选地，所述保存液包含30-60mMTris，5-10mM EDTA，5-10mM赖氨酸，30-50μMATP和5-10μMλ噬菌体DNA；优选地，所述保存液包含30mM Tris，5mM EDTA，5mM赖氨酸，30μMATP和5μMλ噬菌体DNA。

在一些实施方案中，所述保存液的PH是例如7-9，优选7.5-8.5，更优选8。

本申请的第二方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包含第一方面所述的DNA保存液。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包括其他辅助试剂例如核酸提取试剂。

本申请的第三方面提供第一方面所述的DNA保存液或第二方面所述的试剂盒在保存DNA中的应用。

本申请所述的保存DNA是指稳定储存DNA，即利用qPCR检测所述DNA的靶标基因能够有效扩增。

本申请的第四方面提供一种保存DNA的方法，所述方法包括：(1)获得DNA；(2)将所述DNA置于第一方面所述的保存液中进行保存。

在一些实施方案中，所述DNA是单链DNA或双链DNA中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述DNA来自感兴趣的物种，例如包括但不限于真核生物或原核生物，例如动物、植物或微生物，例如灵长动物、啮齿动物、种子植物、孢子植物、细菌、真菌或病毒，又例如人、小鼠、大鼠、食蟹猴、兔、犬、猫、牛、马、羊、猪、水稻、拟南芥、大肠杆菌、酵母菌和噬菌体。

在一些实施方案中，所述DNA是由人工合成所得或由提取所得，包括但不限于本领域一切已知的提取方法。

在一些实施方案中，所述保存温度可以是-40℃～40℃，优选-20～37℃；所述保存时间是0-30周，优选0-25周，优选0-20周；更优选-20～37℃保存0-20周，最优选-20～37℃保存0-16周。

在一些实施方案中，所述DNA在保存液中的浓度为至少1×10-⁶pM，优选至少1×10^-5pM，最优选至少1×10^-4pM，例如至少1×10^-4pM、至少1×10^-3pM、至少1×10^-2pM和至少1×10^-1pM。

本申请的第五方面提供第一方面所述的DNA保存液的制备方法，所述方法包括：

(1)无菌水溶解配方量的Tris，分别加入EDTA和赖氨酸至配方量，获得母液A；

(2)向母液A中加入λ噬菌体DNA和三磷酸腺苷(ATP)至配方量，获得DNA保存液。

在一些实施方案中，所述方法还包括调节DNA保存液的PH至7-9，优选7.5-8.5，优选8。

有益效果

本发明针对低浓度DNA的保存液进行研究，在TE缓冲液(Tris和EDTA)的基础上，通过添加赖氨酸、λ噬菌体DNA和ATP作为添加剂，能够显著提高低浓度DNA在-20℃-37℃的储存稳定性，其中当保存液中DNA浓度为10^-2pM～10^-4pM时，能够在-20℃稳定存储超过16周。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。但是，下述实施例仅仅是本发明的示例，并不代表或限制本发明的保护范围。本发明的保护范围以权利要求书为准。在以下实施例中，若无特别说明，所用试剂和耗材均购自本领域普通供应商，所用实验方法和技术手段均为本领域常规方法和手段。

实施例1

以无菌水为溶剂，配制DNA保存液1-4，具体组分及浓度如表1所示(其中λ噬菌体DNA来自Thermo Fisher Scientific公司的SD0021，其余试剂均来自本领域常规试剂厂商)：

表1

	保存液1	保存液2	保存液3	保存液4
					Tris	10mM	30mM	30mM	30mM
EDTA	1mM	3mM	3mM	3mM
					赖氨酸	0	5mM	5mM	5mM
三磷酸腺苷(ATP)	0	10μM	20μM	30μM
					λ噬菌体DNA	0	1μM	3μM	5μM

人工合成如SEQ ID NO.1所示的双链DNA：

AGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCGGACTTGTGGAGACAGCCGCTC

使用纯水稀释上述DNA至1×10^-4nM，分别按照1：10，1：100，1：1000的比例加入到1ml保存液1中，得到终浓度为1×10^-2pM、1×10^-3pM、1×10^-4pM三个低浓度DNA模板，同理，按照相同的比例将上述三个浓度的DNA分别加入保存液1-4，获得3×4个低浓度DNA模板。

将上述含有不同浓度DNA模板的保存液置于-20℃条件下分别保存1周，2周，4周，8周和16周，随后使用qPCR监控其存储稳定性，以加入样本后立即进行qPCR检测为对照。

其中qPCR扩增体系如表2所示，上下游引物和探针序列分别是：

正向引物(SEQ ID NO.2)：Primer-F：AGATTTGGACCTGCGAGCG

反向引物(SEQ ID NO.3)：Primer-R：GAGCGGCTGTCTCCACAAGT

表2：荧光定量qPCR扩增体系

a：Vazyme#Q712

根据表3程序进行qPCR扩增反应，得到三个浓度的DNA模板在不同保存液中-20℃保存后的扩增曲线Ct值如表4所示(其中“/”表示无扩增)。

表3荧光定量qPCR反应程序

表4不同保存液在-20℃保存不同时间后的qPCR扩增Ct值

如表4所示，相较于保存液1(TE溶液)，保存液2-4均在不同程度上提升了低浓度DNA(10^-2pM～10^-4pM)在-20℃条件下的稳定性，其中保存液4稳定性最佳，在10^-2pM～10^-4pMDNA浓度下，能够稳定存储超过16周，利用qPCR扩增靶标基因，灵敏度差值(与保存液1相比)小于0.5(ΔCT<0.5)。

实施例2

DNA保存液1-4的配制和低浓度DNA模板的制备同实施例1，其中每种保存液分别加入1×10^-2pM、1×10^-3pM、1×10^-4pM三个低浓度DNA，共得到4×3个低浓度DNA模板，将上述含有不同浓度DNA模板的保存液置于4℃条件下分别保存1周，2周，4周，8周和16周，随后使用qPCR监控稳定性，以加入样本后立即进行qPCR检测为对照。

qPCR扩增体系和反应程序同实施例1表2-3，得到得到三个浓度的DNA模板在不同保存液中4℃保存后的扩增曲线Ct值如表5所示(其中“/”表示无扩增)。

表5不同保存液在4℃保存不同时间后的qPCR扩增Ct值

如表5所示，相较于保存液1(TE溶液)，保存液2-4均在不同程度上提升了低浓度DNA(10^-2pM～10^-4pM)在4℃条件下的稳定性，其中保存液4稳定行最佳，在10^-2pM～10^-4pMDNA浓度下，能够稳定存储超过8周，利用qPCR扩增靶标基因，灵敏度差值值(与保存液1相比)小于0.5(ΔCT<0.5)。

实施例3

DNA保存液1-4的配制和低浓度DNA模板的制备同实施例1，其中每种保存液分别加入1×10^-2pM、1×10^-3pM、1×10^-4pM三个低浓度DNA，共得到4×3个低浓度DNA模板，将上述含有不同浓度DNA模板的保存液置于25℃条件下分别保存1周，2周，4周，8周和16周，随后使用qPCR监控稳定性，以加入样本后立即进行qPCR检测为对照。

qPCR扩增体系和反应程序同实施例1表2-3，得到三个浓度的DNA模板在不同保存液中25℃保存后的扩增曲线Ct值如表6所示(其中“/”表示无扩增)。

表6不同保存液在25℃保存不同时间后的qPCR扩增Ct值

如表6所示，相较于保存液1(TE溶液)，保存液2-4均在不同程度上提升了低浓度DNA(10^-2pM～10^-4pM)在25℃条件下的稳定性，其中保存液4稳定性最佳，在10^-2pM～10^-4pMDNA浓度下，能够稳定存储超过3周，利用qPCR扩增靶标基因，灵敏度差值值(与保存液1相比)小于0.5(ΔCT<0.5)。

实施例4

DNA保存液1-4的配制和低浓度DNA模板的制备同实施例1，其中每种保存液分别加入1×10^-2pM、1×10^-3pM、1×10^-4pM三个低浓度DNA，共得到4×3个低浓度DNA模板，将上述含有不同浓度DNA模板的保存液置于37℃条件下分别保存1周，2周，4周，8周和16周，随后使用qPCR监控稳定性，以加入样本后立即进行qPCR检测为对照。

qPCR扩增体系和反应程序同实施例1表2-3，得到得到三个浓度的DNA模板在不同保存液中37℃保存后的扩增曲线Ct值如表7所示(其中“/”表示无扩增)。

表7不同保存液在37℃保存不同时间后的qPCR扩增Ct值

如表7所示，相较于保存液1(TE溶液)，保存液2-4均在不同程度上提升了低浓度DNA(10^-2pM～10^-4pM)在37℃条件下的稳定性，其中保存液4稳定性最佳，在10^-2pM～10^-4pMDNA浓度下，能够稳定存储超过2周，利用qPCR扩增靶标基因，灵敏度差值值(与保存液1相比)小于0.5(ΔCT<0.5)。

Claims (10)

1.一种DNA保存液，所述保存液包含30mMTris(三羟甲基氨基甲烷)、3mMEDTA(乙二胺四乙酸)和添加剂，所述添加剂是5mM赖氨酸、10-30μM三磷酸腺苷(ATP)和1-5μMλ噬菌体DNA。

2.根据权利要求1所述的保存液，所述保存液的PH是7-9。

3.根据权利要求1所述的保存液，所述保存液的PH是7.5-8.5。

4.根据权利要求1所述的保存液，所述保存液的PH是8。

5.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-4任一项所述的DNA保存液。

6.权利要求1-4任一项所述的保存液或权利要求5所述的试剂盒在保存DNA中的应用。

7.一种保存DNA的方法，所述方法包括：(1)获得DNA；(2)将所述DNA置于权利要求1-4任一项所述的保存液中进行保存。

8.根据权利要求7所述的方法，所述保存是在-20～37℃保存0-16周。

9.根据权利要求7所述的方法，所述DNA在保存液中的浓度为至少1×10^-4pM。

10.权利要求1-4任一项所述的DNA保存液的制备方法，所述方法包括：(1)无菌水溶解配方量的Tris，分别加入EDTA和赖氨酸至配方量，获得母液A；(2)向母液A中加入λ噬菌体DNA和ATP至配方量，获得DNA保存液。